KR101041986B1

KR101041986B1 - 인간 인터루킨-2의 대량 생산을 위한 신규한 균주

Info

Publication number: KR101041986B1
Application number: KR1020080021161A
Authority: KR
Inventors: 이성희; 우구; 백영준; 유대근; 명현호; 이혁준
Original assignee: (주)한국비엠아이
Priority date: 2008-03-06
Filing date: 2008-03-06
Publication date: 2011-06-16
Also published as: KR20090095927A

Abstract

본 발명은 생리활성 물질인 인터루킨-2를 대장균에서 대량생산하는 방법에 관한 것이다. 천연의 인터루킨-2 유전자의 5' 말단 염기서열 중 1번 아미노산인 알라닌을 제거하고, 125번째 아미노산인 씨스테인을 세린으로 치환하였으며, IL-2구조유전자 내의 유사 리보솜 부착부위를 제거하여 천연 IL-2를 포함하는 발현 균주에 비해 현저히 향상된 발현율을 보이는 균주를 얻었다. 또한 이중 발현 균주를 제조하여 대장균 내에서 메치오닌아미노펩티다아제로 N-말단 메치오닌이 제거된 인터루킨-2을 대량으로 생산할 수 있다. 대량 생산된 인터루킨-2는 신장세포암 및 악성피부암의 임상적 치료와 인터루킨-2에 의해 유도되는 인체 내 면역성 강화를 응용하는 연구 분야 등에 활용도가 매우 높다.

대장균, IL-2, 유전자 변형, 메치오닌 아미노펩티다아제, 대량생산

Description

인간 인터루킨-2의 대량 생산을 위한 신규한 균주{Production method of host microorganism having high yield productivity of recombinant human active protein}

인터루킨(Interleukin)은 싸이토카인(cytokine) 중의 하나이다. 싸이토카인은 면역 기능을 조절하기 위해 관련 세포를 증식(proliferation) 시키거나 분화(differentiation) 시키기 위해 특정 세포들에서 분비되는 단백질이며, 이를 통해 다른 세포들과 의사소통을 한다. 면역반응에 필요한 세포들인 APC, T-cell, 그리고 B-cell 등은 부분적으로는 세포와 세포의 접촉을 통해 상호작용 하지만 대부분 싸이토카인을 통해서 상호작용을 한다. 이런 싸이토카인 중의 하나인 인터루킨-2는 1976년 Morgane등에 의해 처음으로 발견되었으며 초기에는 그 발견된 초기 기능에 따라 T 세포 성장인자로 불렸다. 그 후 많은 노력에 의하여 인터루킨-2의 구조, 기능 및 생성의 조건이 밝혀져 왔다.

생리적 조건 하에서 인터루킨-2는 표면항원 CD-4를 발현하는 T세포에서 주로 생산된다. 이들의 생산은 마이토젠(mitogen) 또는 엘러젠(allergen)에 의한 T 세포의 활성화에 의해 유도된다. (Farrar J.J. 등 J. immunol. 125, 793-798, 1980) 몇, 몇 2차 자극이 인터루킨-2의 최대 생산을 위해 요구 된다. 휴지기 세포는 인터루킨-2를 생산할 수 없다. 인터루킨-2의 in vitro 합성은 덱사메타손(dexamethasone) 이나 싸이클로스포린 A(Cyclosporin A)에 의해서 억제 된다(Lillehoj H.S. 등 J. Immunol. 133, 244-250, 1984). 형질 전환된(transformed) T 세포, B 세포, 임파구 암세포, LAK 세포 그리고 NK 세포 들도 인터루킨-2를 분비한다.

Morgan 등에 의하면 인터루킨-2는 T 세포에 성장 및 분화를 유발시키는 일차적인 인자이다. 특히 인터루킨-2는 항원에 의해 자극된 T-helper 세포의 증식을 야기시킨다(Volkman D.J. 등 J. Immunol. 134, 4237-4243, 1985). 또한, 인터루킨-2는 항원에 의해 자극된 cytotoxic T 세포의 증식을 야기시키며 그 세포의 세포독성(cytotoxicity)를 더욱 강하게 한다(Herris D.T. 등 J. immunol. 140, 927-937, 1988). 즉 인터루킨-2는 T 세포의 분화를 촉진시켜 원조 T 세포가 여러 종류의 다양한 기능을 갖는 활성화된 T 세포군으로 분화하는 것을 야기시킨다. 이러한 인터루킨-2의 기능은 프로락틴(Prolactin) 같은 호르몬들에 의해 조절된다(Cleavenger C.V. 등 PNAS 87, 6460-6464, 1990). 인터루킨-2는 또한 활성화된 B 세포의 증식을 촉진시키며 이때 인터루킨-4 같은 다른 싸이토카인의 도움이 필요하다(Nonoyama S. 등 Clin. Immunol. Immunopathol. 72, 373-379, 1994). 이러한 인터루킨-2의 T 세포와 B 세포에 대한 조절 기능 때문에 인터루킨-2는 면역 반응의 주 조절자(central regulator)로서의 역할을 수행 한다. 또한 인터루킨-2는 자신이 직접 면역반응에 관련된 세포들의 분화와 증식에 작용 할 뿐만 아니라 다른 싸이토카인들의 합성 및 분비를 유도 함으로서 면역반응 조절자로서의 기능을 수행한다. 예를 들면 인터루킨-2는 감마 인터페론의 합성을 자극하며, 인터루킨-1, TNF-alpha, 그리고 TNF-beta의 분비를 촉진시킨다(Herrman F. 등 Clin. Exp. Immunol. 77, 97-100, 1989). 인터루킨-2의 또 다른 주요한 기능은 암 세포를 죽일 수 있는 싸이토카인들의 분비를 촉진시키는 것이다(anti-tumor activity)(Krishnaraj R. 등 Immuno. Lett. 50, 59-63, 1996)

천연 원료로부터 분리 정제된 인간 인터루킨-2는 당쇄화(glycosylation), 등전점(isoelectric point) 그리고 분자량에 있어서 매우 다양 했다(Wlete 등; J. Exp. Med. 156, 454-464 1982). 그러나 얻을 수 있는 양의 한계로 그 분자적인 특징에 대한 연구는 매우 제한적이었다 1980년대 초 유전공학 기법을 이용한 인터루킨-2 유전자 클로닝(Taniguchi 등: nature 302, 305-310 1983) 및 이를 이용한 유전자재조합 인터루킨-2의 생산은 인터루킨-2에 대한 많은 물리화학적 정보 수집 및 생물학적 기능 및 그 메커니즘을 규명 할 수 있게 했다. 씨스테인 아미노산의 다른 아미노산들로의 치환 연구 및 카르복시 말단의 절단 돌연변이 연구들로부터 인터루킨-2의 구조와 기능의 상관 관계가 밝혀졌다(Wang 등; Science 224, 1431-1433 1984). 이들 연구들로부터 인터루킨-2의 산업적 대량생산에 관련된 많은 정보들이 밝혀졌다. 예를 들면 첫번째 아미노산의 제거가 그 기능과 무관하며 125번째 씨스테인 아미노산은 세린 아미노산으로 치환되어도 그 기능에 영향을 주지 않는다. 이런 사실들을 기초로 하여 인터루킨의 약으로서의 임상적 사용에 대한 연구가 진행 되었다

최초로 인터루킨-2의 임상적 사용을 위한 유전자재조합 인터루킨-2의 기술개발은 미국의 씨터스사(CETUS)에서 이루어 졌으며 이것은 E. Coli 에서 생산된 인터루킨-2 유도체(des-alanyl 125ser-인터루킨-2)로써 첫번째 아미노산인 알라닌 유전자가 제거되고 125번 아미노산인 시스테인이 세린으로 치환된 형태이다(Kolitz J.E. 등 J. Biol. Response Mod. 6, 412-429, 1987) 이것을 이용한 임상적 연구 결과를 요약하면 다음과 같다. 인터루킨-2는 다양한 형태의 암세포에 대해 의미 있는 항암 활성을 나타낸다. 이것은 인터루킨-2가 어떤 특정 형태의 암세포만을 공격하는 T 세포의 분화 및 특정 세포 종의 확대(clonal expansion)을 보조하기 때문이다. 인터루킨-2는 전통적인 치료방법에 대해 반응을 보이지 않는 암 환자에 대한 치료제로서 사용량이 점점 증가 되고 있다. 인터루킨-2의 체계적 투여를 포함하는 복합 처방(combination therapy)은 어떠한 표준 치료도 할 수 없었던 전이성 신장 세포암(metastatic renal cell carcinoma) 환자 중 30%에 대해서 long-term remission 효과를 보였다(Von der Maase H. 등 European J. Cancer 27, 1583-1589, 1991). 긍정적 임상효과가(objective and long-lived clinical response) 악성 피부암(melanoma) 또는 급성 골수암(acute myeloid leukemia) 환자들 일부에서 보고되었다(Flaherty L.E. 등 Cancer 65, 2471-2477, 1990). 인터루킨-2의 항암 작용에 대한 보다 객관적인 평가를 위해 그리고 여러 복합치료(combination therapy)에 있어서 인터루킨-2의 역할을 규명하고 각각의 암 형태에 대한 최선의 치료 방법을 확인하기 위해 좀더 객관적인 임상시험이 요구되었다. 인간에서 얻어진 치료 결과는 실험동물에서 얻어진 것보다 약하며, 특정 형태의 암에 대해서 더 선택적으로 작용했다. 그리고 연속적인 인터루킨-2 정맥 투여(continuous intravenous infusion)를 받은 전이성 대장암(metastatic colorectal carcinoma) 환자들에 대한 비교 연구가 수행되었으며 이 연구는 C-reactive protein(CRP)의 혈청 농도를 측정 함으로써 암 환자의 인터루킨-2 치료에 대한 반응성 정도 여부를 알 수 있다는 것을 암시했다(Schmidt-Wolf I.G. 등 Br. J. Cancer 81, 1009-1016, 1999; Canag A.E. 등 J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 18, 253-262, 1995). 인터루킨-2는 B 세포와 거식세포를 포함한 세포면역 시스템의 다른 구성요소에 대한 부가적인 효과를 가지며 TNF-alpha, TNF-beta, 그리고 IFN-gamma를 포함한 다른 용해성 중재인자들의 분비를 유도한다. 이들 인터루킨-2의 기능은 그 들의 항암 활성뿐만 아니라 그것의 용량 의존적 독성에도 기여한다. 실제로 몇, 몇 연구는 저용량 IL-2 투여가 독성 부작용 없이 암에 대해서 매우 효과적이라는 것을 입증하였다(Margolin K.A. 등 J. Clin. Oncol. 7, 486-498, 1989; Smith K.A. 등 Blood 81, 1414-1423, 1993). 인터루킨-2-Toxin 단백질 키메라는 현재 암의 치료에 대해 시험 중에 있다(cytokine fusion toxin)(Foss F.M. 등 Blood 84, 1765-1774, 1994). 기능성 있는 인터루킨-2 유전자의 투여에 의한 암에 대한 면역성을 증가시키기 위해 많은 방법들이 의욕적으로 연구되고 있다(cytokine gene transfer)(Gansbacher B. 등 J. Exp. Med. 172, 1217-1224, 1990; Gastle G. 등 Cancer Res. 52, 6229-6236, 1992). 정교한 기술에 의해 조작된 암 세포에 의한 인터루킨-2의 발현 및 분비 증가가 T 세포의 활성화를 유도하고 그러므로 암과 암의 전이의 치료에 대한 방향을 제공할 것이 기대된다. 손상된 인터루킨-2를 갖는 세포성 면역결핍은 인터루킨-2의 매일 접종에 의해 성공적으로 치유된 다(Gambacort-Passerini C. 등 J. Immunother. 13, 43-48, 1993). 인터루킨-2는 또한 B 세포에 대한 T helper 세포의 부족에 의해 야기된 항체 결핍을 가진 환자에 효과적이다(Polmer P.A. 등 European J. Cancer 288, 1038-1044, 1992). 수 많은 질병들이 인터루킨-2나 그 수용체의 이상 발현과 관련된다고 보고되어 왔다 예를 들면 Hodgkin's disease, Graft-versus-Host reaction(Tanaka J. Leuk. Lymphoma 19, 281-287, 1995), multiple sclerosis(Ferrarini A.M. 등 J. Neuroimmunol. 86, 13-19, 1998), rheumatoid arthritis(Russell A.S. 등 J. Rhematol. 24, 1045-1050, 1997), systemic lupus erythematosis(Buchan G. 등 Clin. Exp. Immunol. 71, 295-301, 1988), type-1 diabetes(Giordano C. 등 Diabetes Res. 8, 135-138, 1988), lepromatous leprosy(Moubasher A.D. 등 Int. J. Dermatol. 37, 733-740, 1998), AIDS(Ebert E.C. 등 Clin. Immunol. Immunopathol. 37, 283-297, 1985), immunodeficiency syndrome, severe burn traumas, 그리고 allogenic bone marrow transplantation 등 이다. 실제로 상기 많은 질병들에 대해서 인터루킨-2 단독 혹은 다른 약물과의 복합 투여 연구가 활발하게 진행되고 있으며 이 중 많은 경우에 있어 긍정적인 결과가 기대 된다.

이와 같이 인터루킨-2는 현재 세계적으로 식품의약품 안전청으로부터 허가 받은 적응증인 신장 세포암 및 악성 피부암 치료 등 임상적으로 사용되고 있으며, 이외에 많은 항암 치료에 타 항암제와 병행 투여하여 임상적 효과를 높이는 등 임상적인 용도 개발 중에 있으며, 그 용도가 면역 강화에 다양하게 사용될 가능성을 뒷받 침 하고 있다..

이에 본 발명자들은 대장균에서 IL-2 단백질을 대량으로 얻기 위하여 활성화된 인간 T 세포 유래의 IL-2 유전자의 5' 말단 염기서열 중 1번 아미노산인 알라닌을 제거하고, 125번째 아미노산인 씨스테인을 세린으로 치환하였으며, IL-2구조유전자 내의 유사 리보솜 부착부위를 제거하여 천연 IL-2를 포함하는 발현 균주에 비해 현저히 향상된 발현율을 보이는 균주를 제조하였다. 또한 다른 아미노산은 변화없이 대장균 선호 코돈으로 변형시켜 대장균에서 발현시키고, 대장균 내에서 메치오닌아미노펩티다아제를 이중 클로닝하여 N-말단 메치오닌이 제거된 IL-2 단백질을 대량으로 생산할 수 있게 되어 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 신장세포암 및 악성피부암의 치료 및 면역기능을 강화시켜주는 항암제의 병행투여요법(Combination Therapy)에 의약품으로 유용하게 사용되는 IL-2 단백질을 대량 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

기존의 대장균 유전자재조합 발현단백을 의약품으로 사용하는데, 그 단위용량(dosage)는 수십ug에서 150ug(G-CSF 등)등 소량을 함유하는 것이었으므로, 대장균의 배양 수율이 낮더라도 의약품으로의 경제성은 어느 정도 확보가 되었다. 그러나, IL-2의 의약품으로의 단위용량은 1 mg으로 낮은 정제 수율은 제조원가를 높여 의약품으로서의 경제성을 낮출 수 있다. 따라서, IL-2의 대장균 유전자재조합 발현 단백의 의약품으로의 경제성을 확보하기 위해서는 고생산성 균주의 개발 및 발현과정에서 IL-2 유사 특성을 가지는 유사단백의 생산을 최소화하여, 정제 수율을 높이는 것이 필요하다.

따라서 본 발명에서는 IL-2 단백질 유전자 중 5' 말단 염기서열 중 1번 아미노산인 알라닌을 제거하고, 125번째 아미노산인 씨스테인을 세린으로 치환하였으며, 나머지 아미노산은 변화없이 대장균 선호 코돈으로 변형시켰다. 또한 구조유전자내에 존재하는 리보솜 부착 부위를 아미노산의 변화없이 침묵돌연변이 시켜 IL-2 유사단백의 발현을 제거하여 생산 수율을 높였다. 또한 고 발현된 IL-2 단백질의 N-말단 메치오닌을 제거하기 위해 IL-2 단백질를 대량생산하는 인터루킨-2 유전자를 포함하는 발현벡터와 대장균 메치오닌아미노펩티다아제 유전자를 포함하는 발현벡터를 이중 클로닝하여 고 효율로 IL-2를 생산할 수 있는 형질 전환된 대장균을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다

먼저 클론텍사의 인간 T-림포싸이트 cDNA library로부터 중합효소연쇄반응 기술을 사용하여 인터루킨-2 유전자를 함유하고 있는 cDNA를 확보하였으며, 이 과정에서 인터루킨-2의 1번째 아미노산인 알라닌을 제거할 수 있도록 시발체를 제작하여 사용하였다.

또한, 메치오닌 아미노펩티다아제 유전자를 가진 대장균(E. coli K12)에서 "분자클로닝 실험서(ED. T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Cold Spring Harbor)"에 기술된 방법을 이용하여 메치오닌 아미노펩티다아제 유전자를 클로닝하였다.

IL-2 유전자의 5' 말단과 3' 말단에 대응하는 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, 이하 PCR이라 함)용 시발체를 고안 합성한다. 5'말단부의 시발체는 대장균 발현벡터로 클로닝이 용이하도록 제한효소 인지부위가 존재하도록 하고, 이에 대응하는 3' 말단부의 시발체는 종료 코돈과 제한효소 인지부위를 삽입하여 시작 코돈으로부터 단백질이 합성되어 인위적으로 삽입한 종료 코돈에서 단백질 합성이 완료되도록 한다. 이들 시발체들과 주형으로 상기에서 합성한 인간 T 세포 cDNA를 이용하여 PCR에 의해 IL-2 유전자를 증폭시킨다. 이 과정에서 IL-2 유전자의 5'말단부의 첫번째 아미노산인 알라닌(Alanine)을 제거되어 첫번째 아미노산이 프로린(Proline)이 되도록, 시발체를 고안 제작하였다.

상기와 같이 증폭된 IL-2 유전자를 제한효소로 절단하여 얻어진 유전자 단편을 대장균 발현벡터 pT7 벡터를 위에서 IL-2유전자를 자른 동일한 제한효소로 절단하고, 삽입하여 IL-2 유전자를 함유하는 대장균 발현벡터 pT7 des-Ala IL-2 발현 벡터를 제작한다.

또한, IL-2 단백에는 3개의 시스테인(Cystein)이 있는데, 그중에 125번째 아미노산인 시스테인은 2차 구조형성에 참여하지 않기 때문에 IL-2의 활성에 영향을 주지 않고, 대장균 내에서 IL-2가 발현된 후 정제과정에서 IL-2 단백의 2차 구조를 형성 시키기 위해 산화와 환원과정 중 원치 않는 이황화결합이 이루어지지 않게 세린(serine)으로 치환하기 위해 125번째 아미노산의 부위의 시발체를 시스테인에서 세린으로 치환되게 제작하여 포인트뮤테이션을 한 후, pET22b벡터로 클로닝하여 pET22b des-Ala ₁₂₅Ser IL-2를 제작 증폭시킨다.

또한, IL-2 구조유전자(서열번호 1)의 23번째에는 개시 코돈이며, 메치오닌 아미노산 서열인 "ATG" 염기 서열이 있고, 그 염기서열 8번째 아미노산 앞인 15번째 아미노산의 염기서열이 "GGAGC"가 있으며, 이 서열은 리보솜 부착 부위(RBS, Ribosome Binding Site)가 존재한다. 이로 인해서, 발현되는 IL-2 단백이 5'전단부에 22개의 아미노산이 절단된 조각 단백이 만들어지며, 이 조각 단백이 정제과정에서 잘 제거되지 않아서 이의 제거를 위해 정제 수율이 아주 낮아진다. 그래서, IL-2 구조유전자 15번째 아미노산의 염기 서열이 바뀌지 않으면서 유전자 염기서열 "GGAGC"를 "GGAAC"로 변형(서열번호 3)하는 침묵 돌연변이를 하도록 pET22b des-Ala ₁₂₅Ser Hu IL-2(벡터 명 ; pET22b BMIL2) 를 제작 증폭시킨다.

이와 같이 제조된 IL-2 발현벡터를 이용하여 적당한 숙주 미생물, 예를 들면 대장균 균주 E. coli BL21 등에 형질 전환시킨다.

다른 한편, 대장균 내에서 발현된 IL-2 단백의 N-말단의 첫번째 아미노산이 메치오닌을 제거하기 위한 메치오닌아미노펩티다아제를 발현하는 벡터를 만들기 위해서 대장균 E. coli K12의 유전자로부터 중합효소연쇄반응 기술을 사용하여 메치오닌아미노펩티다아제 유전자를 함유하고 있는 DNA를 확보하였다.

메치오닌아미노펩티다아제의 염기서열 정보(Journal of Bacterilogy Feb. Vol 169. No.2, 1987. p.751-757)로부터 메치오닌아미노펩티다아제 유전자의 5' 말단과 3' 말단에 대응하는 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, 이하 PCR이라 함)용 시발체를 고안 합성한다. 5'말단부의 시발체는 대장균 발현벡터로 클로닝이 용이하도록 제한효소 인지부위가 존재하도록 하고, 이에 대응하는 3' 말단부의 시발체는 종료코돈과 제한효소 인지부위를 삽입하여 시작 코돈으로부터 단백질이 합성되어 인위적으로 삽입한 종료 코돈에서 단백질 합성이 완료되도록 한다.

상기와 같이 증폭된 메치오닌아미노펩티다아제 유전자를 제한효소로 절단하여 얻어진 유전자 단편을 대장균 발현벡터 pSTV29 벡터에 클로닝하여 메치오닌아미노펩티다아제 유전자를 함유하는 대장균 발현벡터 pSTV29 MAP 발현 벡터를 제작한다.

만들어진 pSTV29 MAP 발현벡터를 IL-2 유전자로 클로닝된 pET22b BMIL2로 형질 전환된 E. coli BL21pET22b BMIL2에 재차 형질 전환하여 하나의 대장균 내에 두 개의 벡터를 가지게 하는 형질전환 대장균을 제작하였다(균주명 ; 대장균 pBMIL2(기탁번호 ; KCTC11284BP))

이렇게 형질 전환된 대장균 균주는, IL-2의 발현을 위해 적당한 배지, 예를 들면 엠피실린 및 클로람페니콜 함유 액체 루리아 배지를 이용하여 소량 배양한 후 M9 배지를 이용하여 대량 배양한다. 배양액 중에 발현, 분비된 IL-2는 적절한 정제 과정을 거쳐 대량으로 얻을 수 있다.

이하, 하기 실시 예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 단, 하기 실시 예들은 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 이들 만으로 한정되는 것은 아니다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따르면 천연의 인터루킨-2 유전자의 5' 말단 염기서열 중 첫번째 아미노산을 제거하고, 125번째 아미노산을 씨스테인에서 세린으로 바꾸고, IL-2구조유전자 내의 리보좀 부착 부위의 유전자를 변형시켜, 대장균 내에서 발현 시, 원하지 않는 조각 인터루킨-2 생성을 하지 않고, 천연의 인터루킨-2 보다 발현율이 현저히 향상된다. 따라서, 본 발명의 생산 방법으로 IL-2를 효율적으로 대량 생산할 수 있으며, 이와 같이 대량생산된 인터루킨-2는 신장세포암 및 악성피부암의 임상적 치료와 인터루킨-2에 의해 유도되는 인체 내 면역성 강화을 응용하는 연구 분야 등에 유용하게 이용될 수 있다.

＜실시예 1＞ IL-2 유전자의 증폭 및 이를 함유하는 대장균 발현벡터 제조

(단계 1) 클론텍사의 인간 T-림포사이트(Lymphocyte) cDNA Library로부터 IL-2 유전자를 증폭시키기 위해 다음과 같은 시발체들을 핵산합성기(DNA Synthesizer, Applied Biosystems Inc., 미국)를 이용하여 합성하였다. 이때, IL-2의 첫번째 아미노산인 알라닌(Alanine)을 제거하기 위해서 시발체를 고안하였다.

시발체 ECOR1IL-2 [5'-CTCGAATCCATGCCTACTTCAAGTTCTACA-3'](서열번호 5)는 제한효소 EcoR1 인지 부위(밑줄친 부분)를 갖고 IL-2의 1번째 아미노산 부터 6번째 아미노산을 코딩하는 염기서열을 갖도록 고안하였고;시발체 IL-2BAMH1 [5'-TCAACACTGACTTGAGGATCCGAGCTC-3'](서열번호 6)는 제한효소 BamH1 인지 부위(밑줄 친 부분)와 종료 전 4개의 아미노산과 IL-2 종료 코돈 갖도록 고안하였다.

(단계 2) 단계 1에서 제조한 시발체로 cDNA로부터 IL-2 유전자를 증폭

IL-2 유전자를 증폭하기 위해 다음과 같이 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 반응튜브에 단계 1에서 얻은 2 ㎍의 시발체 ECOR1IL-2, 2 ㎍의 시발체 IL-2BAMH1을 넣고 주형으로 활성화된 인간 T 세포 cDNA 1 ng을 넣은 다음, 10 ㎕의 10 배 중합 완충용액(500 mM KCl, 100 mM 트리스-HCl, pH 9.0, 1 % 트리톤 X-100, 2.5 mM MgCl₂), 10 ㎕의 2 mM dNTP(각 2 mM dGTP, 2 mM dATP, 2 mM dCTP, 2 mM dTTP), 2.5 단위체의 Taq 중합효소를 가하고 증류수를 가하여 총 부피를 100 ㎕로 한 후, 95 ℃에서 1 분(변성 단계), 55 ℃에서 40 초(담금 단계), 72 ℃에서 2 분(중합 단계)의 조건으로 PCR을 40 회 실시하였다. 이로부터 얻은 PCR 산물을 7 % 아크릴아마이드 젤에서 분리한 결과 약 408 염기쌍의 핵산이 증폭되었음을 확인하였고, 유전자를 Qiagen 사의 PCR purification kit(Cat No. 28104)로 정제하였다. 이하 이 핵산 단편을 '단편 IL-2' 이라 한다.

(단계 3) 단편 IL-2를 유전자 조작하기 쉽게 하기 위해서, 단편 IL-2 유전자를 pT7에 클로닝

pT7(pT7Blue, Novagen 69820-3) 2ug을 제한효소 EcoR1과 BamH1 으로 NEB완충용액에서 절단하였고, 절단된 pT7 유전자를 Qiagen 사의 PCR purification kit(Cat No. 28104)로 정제하였다.

또한, 단계2에서 만들어진 단편 IL-2 2ug을 제한효소 EcoR1과 BamH1 으로 NEB완충용액에서 절단하였고, 절단된 IL-2 유전자를 Qiagen 사의 PCR purification kit(Cat No. 28104)로 정제하였다

접합반응 튜브에서 상기에서 얻은 ECOR1pT7BAMH1 유전자 100ng과 ECOR1IL-2BAMH1 유전자 100ng을 넣고, 2uL의 X10접합반응용액, 2유니트의 T4 DNA 리가아제와 총 부피가 20uL가 되게 증류수를 가한 다음, 16℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 대장균 DH5α에 형질전환시켜 첫번째 아미노산인 알라닌이 없는 IL-2 유전자를 함유하는 대장균 발현벡터 pT7 des-Ala IL-2를 얻었다.

pT7 des-Ala IL-2로 형질 전환된 대장균을 배양하여 대량으로 플라스미드를 배양 추출한 후, 자동화 DNA 시이퀀스(DNA SEQUENCER 3700, Applied Biosystems Inc., U.S.A.)를 이용하여 IL-2 유전자의 염기서열을 확인하였다.

(단계 4) 단편 IL-2의 125번째 아미노산인 시스테인을 세린으로 돌연변이

단계3에서 얻어진 pT7 des-Ala IL-2 의 125번째 아미노산인 씨스테인을 대장균 내 IL-2 단백 발현 후 정제 과정에서 씨스테인이 원하지 않는 IL-2 단백간의 이황화 결합이나, 구조 단백 내의 다른 씨스테인과 결합하여 천연형 IL-2와 다른 3차 구조를 가지지 않게 하기 위해서, 세린으로 변경하기 위해서 시발체를 제작하였다. 제작된 순방향 시발체 Ser125IL-2f 는 5'-TTT TCT CAG AGC ATC TCA -3'(서열번호 11)로서 125번 씨스테인 코돈인 "TGC"를 "AGC"로 변환한 것이고, 이의 역방향 시발체 Ser125IL-2r은 5'-GAT GCT CTG AGA AAA-3'(서열번호 12)으로 고안하였다..

위의 시발체를 이용하여 pT7 des-Ala IL-2로부터 pT7 des-Ala ₁₂₅SerIL-2 유전자를 증폭하기 위해 다음과 같이 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 반응튜브에 단계 2에서 얻은 2 ㎍의 순방향 시발체 Ser125IL-2f, 역방향 시발체 SerIL-2r 2 ㎍를 넣고 주형으로 pT7 des-Ala IL-2 1 ng을 넣은 다음, 10 ㎕의 10 배 중합 완충용액(500 mM KCl, 100 mM 트리스-HCl, pH 9.0, 1 % 트리톤 X-100, 2.5 mM MgCl₂), 10 ㎕의 2 mM dNTP(각 2 mM dGTP, 2 mM dATP, 2 mM dCTP, 2 mM dTTP), 2.5 단위체의 Taq 중합효소를 가하고 증류수를 가하여 총 부피를 100 ㎕로 한 후, 95 ℃에서 1 분(변성 단계), 55 ℃에서 40 초(담금 단계), 72 ℃에서 2 분(중합 단계)의 조건으로 PCR을 40 회 실시하였다. 이로부터 얻은 PCR 산물을 유전자를 Qiagen 사의 PCR purification kit(Cat No. 28104)로 정제하였다. 이하 이 핵산 단편을 "pT7 des-Ala ₁₂₅SerIL-2" 이라 하고, 자동화 DNA 시이퀀스(DNA SEQUENCER 3700, Applied Biosystems Inc., U.S.A.)를 이용하여 IL-2 유전자의 125번째 아미노산 염기서열이 바뀐 것을 확인하였다.

(단계 5) des-Ala ₁₂₅SerIL-2를 생산벡터인 pET22b 플라스미드에 클로닝

pET22b(Novagen Cat. No. 69744-3) 2ug을 제한효소 Nde1과 BamH1 으로 NEB완충용액에서 절단하였고, 절단된 pET22b 유전자를 Qiagen 사의 PCR purification kit(Cat No. 28104)로 정제하였다.

또한, 단계4에서 만들어진 pT7 des-Ala ₁₂₅SerIL-2을 IL-2 구조 유전자 양끝 단에 Nde1 및 BamH1 제한효소 부위를 갖게 시발체를 제조하여 유전자를 증폭하였다. 시발체 NDE1IL-2 5'-CAT ATG CCT ACT TCA AGT TCT ACA-3'(서열번호 7)와 시발체 IL-2BAMH1 5'-ATC TCA ACA CTG ACT TGA GGA TCC-3'(서열번호 8)으로 고안하였다.

반응튜브에 2 ug의 시발체 NDE1IL-2, 2 ㎍의 시발체 IL-2BamH1을 넣고 주형으로 pT7 des-Ala ₁₂₅SerIL-2 1 ng을 넣은 다음, 10 ㎕의 10 배 중합 완충용액(500 mM KCl, 100 mM 트리스-HCl, pH 9.0, 1 % 트리톤 X-100, 2.5 mM MgCl₂), 10 ㎕의 2 mM dNTP(각 2 mM dGTP, 2 mM dATP, 2 mM dCTP, 2 mM dTTP), 2.5 단위체의 Taq 중합효소를 가하고 증류수를 가하여 총 부피를 100 ㎕로 한 후, 95 ℃에서 1 분(변성 단계), 55 ℃에서 40 초(담금 단계), 72 ℃에서 2 분(중합 단계)의 조건으로 PCR을 40 회 실시하였다. 이렇게 얻어진 NDE1 des-Ala ₁₂₅SerIL-2BAMH1 유전자를 Qiagen 사의 PCR purification kit(Cat No. 28104)로 정제하였다.

위의 NDE1 des-Ala ₁₂₅SerIL-2BAMH1 PCR 유전자 2ug을 제한효소 Nde1 및 BamH1로 NEB완충용액에서 절단하였고, 절단된 des-Ala ₁₂₅SerIL-2 유전자를 Qiagen 사의 PCR purification kit(Cat No. 28104)로 정제하였다.

이후, 접합반응 튜브에서 상기에서 제한효소로 절단하여 얻어진 NDE1pET22bBAMH1 유전자 100ng과 NDE1 des-Ala ₁₂₅SerIL-2BAMH1 유전자 100ng을 넣고, 2uL의 X10접합반응용액, 2유니트의 T4 DNA 리가아제와 총부피가 20uL가 되게 증류수를 가한 다음, 16℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 대장균 DH5α에 형질 전환시켜 IL-2 유전자를 함유하는 대장균 발현벡터 pET22b des-Ala ₁₂₅SerIL-2를 얻었다.

(단계6) 단편 des-Ala ₁₂₅SerIL-2 구조 유전자 중 리보솜 부착 부위 유전자의 침묵 돌연변이

단계5에서 얻어진 pET22b des-Ala IL-2 의IL-2 구조 유전자 중 22번째 아미노산이 개시유전자인 메치오닌인데, 이 메치오닌 유전자의 7∼8번째 앞의 코돈에 리보솜 부착 부위(RBS2)가 존재해서 대장균 내에서 IL-2 단백이 발현되는 과정에서 1번째 메치오닌 전단부에 리보솜이 부착하여 단백 합성을 해야 하나, 일부 리보솜이 구조유전자 안의 리보솜 부착 부위(RBS2)에 부착하여 단백합성을 하여서, 정상적인 IL-2 단백이 만들어지지 않고, 조각난 IL-2 단백을 합성하여 생산 수율 및 정제 수율을 낮추게 되어서, 이 리보솜 부착 부위(RBS2)를 아미노산 서열은 변경하지 않게 하며, 염기 서열을 바꾸었다. 즉, 14번째 아미노산인 글루탐산(Glu) 코돈인 GAG를 동일한 글루탐산 코돈인 GAA로 바꾸는 것이다. 바꾸기 전 구조유전자는 5'-ATG CCT(1번코돈) ∼11번코돈-CAA CTG GAG CAT TTA CTG CTG GAT TTA CAG ATG(22번코돈)-23번코돈∼TGA-3'을 5'-ATG CCT(1번코돈) ∼11번코돈-CAA CTG GAA CAT TTA CTG CTG GAT TTA CAG ATG(22번코돈)-23번코돈∼TGA-3'으로 변경하려고, 정방향 시발체 RBS2IL-2f를 5'-CTA CAA CTG GA A CAT TTA CTG CTG GAT TTA CAG-3'(서열번호 9)으로 고안하였고, 역방향 시발체 RBS2IL-2r을 5'-CAG TAA ATG T TC CAG TTG TAG CTG TGT TTT CTT-3'(서열번호 10)이다.

위의 시발체를 이용하여 pET22b des-Ala ₁₂₅SerIL-2로부터 RBS2가 변형된 IL-2 유전자를 증폭하기 위해 다음과 같이 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 반응튜브에 단계 2에서 얻은 정방향 시발체 RBS2IL-2f 2 ug, 역방향 시발체 RBS2IL-2r 2 ug를 넣고 주형으로 pET22b des-Ala ₁₂₅SerIL-2 1 ng을 넣은 다음, 5 uL의 10 배 폴리머라제 완충용액, 4uL의 10 mM dNTP, 2.5 단위체의 pfu폴리머라제를 가하고 증류수를 가하여 총 부피를 50uL 한 후, 95 ℃에서 30초(변성 단계), 55 ℃에서 60 초(담금 단계), 68 ℃에서 11 분(중합 단계)의 조건으로 PCR을 12 회 실시하였다. 이로부터 얻은 PCR 산물에 RBS2를 함유하는 주형 유전자를 제한효소 DPN1(제한효소 부위 5'-GA TC-3')으로 절단하였다. 이렇게 PCR이 끝난 유전자를 Qiagen 사의 PCR purification kit(Cat No. 28104)로 정제하였다. 이하 이 핵산 단편을 ' pET22b des-Ala ₁₂₅SerIL-2RBS2' 라 하고, 자동화 DNA 시이퀀스(DNA SEQUENCER 3700, Applied Biosystems Inc., U.S.A.)를 이용하여 IL-2 구조유전자의 14번째 코돈이 GAA로 바뀐 것을 확인하였다. 이렇게 만들어진 발현벡터를 pET22b BMIL2라 하였다(서열6).

(단계 7) 대장균을 IL-2를 생산하는 균주로 형질 전환

단계 6에서 만들어진 플라스미드 pET22bBMIL2를 대장균 BL21(DE3, Novagen)에 형질전환 하였다. 이를 대장균 pET22b BMIL2라고 명하였다.

＜실시예 2＞ 메체오닌아미노펩티다제 유전자의 증폭 및 이를 함유하는 대장균 발현벡터 제조

(단계 1) 대장균 K12로부터 메체오닌아미노펩티다제 유전자를 증폭시키기 위해 다음과 같은 시발체들을 핵산합성기(DNA Synthesizer, Applied Biosystems Inc., 미국)를 이용하여 합성하였다.

순방향 시발체 EcoR1MAPf는 5'-GGA ATT CTA CCG ATA GAG TT-3'(서열번호 13)이고, 역방향 시발체 MAPrBamH1은 5'-TAG GAT CCT TAT TCG TCG TGC G-3'(서열번호 14)으로 고안하였다.

(단계 2) 단계 1에서 제조한 시발체로 대장균 유전자로부터 메체오닌아미노펩티다제 유전자를 증폭

메치오닌아미노펩티다제 유전자를 증폭하기 위해 다음과 같이 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 반응튜브에 단계 1에서 얻은 2 ug의 순방향 시발체 ECOR1MAPf, 2 ug의 역방향 시발체 MAPBAMH1r을 넣고 주형으로 활성화된 대장균 K12 유전자 1ng을 넣은 다음, 10 uL의 10 배 중합 완충용액(500 mM KCl, 100 mM 트리스-HCl, pH 9.0, 1 % 트리톤 X-100, 2.5 mM MgCl₂), 10 uL의 2 mM dNTP(각 2 mM dGTP, 2 mM dATP, 2 mM dCTP, 2 mM dTTP), 2.5 단위체의 Taq 중합효소를 가하고 증류수를 가하여 총 부피를 100 uL로 한 후, 95 ℃에서 1 분(변성 단계), 55 ℃에서 40 초(담금 단계), 72 ℃에서 2 분(중합 단계)의 조건으로 PCR을 40 회 실시하였다. 이로부터 얻은 PCR 산물 유전자를 Qiagen 사의 PCR purification kit(Cat No. 28104)로 정제하였고, 자동화 DNA 시이퀀스(DNA SEQUENCER 3700, Applied Biosystems Inc., U.S.A.)를 이용하여 MAP 유전자의 염기서열을 확인하였다. 이하 이 핵산 단편을 '단편 MAP' 이라 한다.

(단계 3) 단편 MAP 유전자를 생산 벡터인 pSTV29 플라스미드에 클로닝

pSTV29(TAKARA, Cat. No. 3332) 2ug을 제한효소 EcoR1과 BamH1 으로 NEB완충용액에서 절단하였고, 절단된 pSTV29 유전자를 Qiagen 사의 PCR purification kit(Cat No. 28104)로 정제하였다.

또한, 단계2에서 만들어진 단편 MAP2ug을 제한효소 EcoR1과 BamH1 으로 NEB완충용액에서 절단하였고, 절단된 MAP 유전자를 Qiagen 사의 PCR purification kit(Cat No. 28104)로 정제하였다

접합반응 튜브에서 상기에서 얻은 ECOR1pSTV29BAMH1 유전자 100ng과 ECOR1MAPBAMH1 유전자 100ng을 넣고, 2uL의 X10접합반응용액, 2유니트의 T4 DNA 리가아제와 총부피가 20uL가 되게 증류수를 가한 다음, 16℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 대장균 DH5α에 형질전환시켜 MAP 유전자를 함유하는 대장균 발현벡터 pSTV29MAP를 얻었다.

pSTV29MAP으로 형질전환된 대장균을 배양하여 대량으로 플라스미드를 배양 추출한 후, 자동화 DNA 시이퀀스(DNA SEQUENCER 3700, Applied Biosystems Inc., U.S.A.)를 이용하여 대장균 메치오닌아미노펩티다제 유전자의 염기서열을 확인하였다.

＜실시예 3＞ 유전자 재조합 IL-2를 대량생산하기 위한 형질전환 두 벡터 체제의 대장균의 제조

(단계 1) ＜실시예 1＞ (단계 7)에서 만들어진 유전자 재조합 IL-2를 대량생산하기 위해 형질전환된 대장균 BL21에 ＜실시예 2＞ (단계 3)에서 만들어진 pSTV29MAP 유전자를 형질전환시켜 하나의 대장균 내에 2개의 형질전환 플라스미드를 가지는 대장균 BL21의 제작을 확인하였고, 이를 "대장균 pBMIL2"라고 명명하였다(기탁번호 KCTC11284BP).

(단계2) 단계 1에서 제작된 대장균 BMIL2를 엠피실린 50ug/mL이 포함된 액체 루리아 배지 10mL에서 37℃, 12시간 동안 진탕 배양하고, 3mL을 300mL의 액체 루리아 배지에 옮겨서 OD 600nM 0.3정도 될 때 0.4mM IPTG가 되게 IPTG를 첨가하여 추가로 4시간 더 배양한 후, 세포 배양액을 원심분리기(Bekman J2-21)로 6000rpm에서 20분동안 원심분리한 후, 수거한 세포 침전물을 램리의 방법(Laemmi, nature, 227, 68(1970))에 따라 SDS의 존재 하에 4-20% 선농도 폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동하였고(도 3), 그 절편을 N-말단 시이퀀스 15개를 Edman degradation 방법(Stryer, L, Biochemistry, 4th ed, WH Freeman & Co, 1995)으로 확인한 결과, 대장균에서 발현되는 N-말단의 첫번째 아미노산인 메치오닌이 제거된 것을 확인하였다.(도 6)

<실시예 4>

실시예 3에서 제작된 대장균 BMIL2와 실시예 1에서 만들어진 대장균 BL-IL2를 엠피실린 50ug/mL이 포함된 액체 루리아 배지 10mL에서 37℃, 12시간 동안 진탕 배양하고, 3mL을 300mL의 액체 루리아 배지에 옮겨서 OD 600nM 0.3정도 될 때 0.4mM IPTG가 되게 IPTG를 첨가하여 추가로 4시간 더 배양한 후, 세포 배양액을, 세포파쇄기(Z-plus 4KW)로 균을 파쇄하였다. 세포파쇄액을 원심분리기(Bekman J2-21)로 6000rpm에서 20분동안 원심분리한 후 침전물을 수거하였고, 침전물을 10mL의 0.01%트윈80을 포함한 10mM인산염완충액 풀고, 다시 원심분리기(Bekman J2-21)로 6000rpm에서 20분동안 원심분리한 후 침전물을 수거하였다. 수거된 침전물을 10mL의 5%SDS가 함유된 10mM 인산염완충액에 녹이고, 대장균BL-IL2와 대장균 BMIL2 각각 배양 정제한 단백을 각 웰에 3.5, 7.5, 15, 30uL씩 SDS의 존재 하에 4-20%선농도 폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동하였다. 전기영동된 겔을 Frog^TM Gel Image analyzer system 및 Alpha Znnotech Alpha Ease Fc^TM 프로그램으로 단백량을 비교하였다.(도7)

비교 결과, 대장균 pBL-IL2에서 발현된 인터루킨-2 정상 단백 및 조각 단편의 비율 평균이 각각 75.4%, 24.6% 이었고, 본 발명의 균주인 대장균 pBMIL2에서 발현된 인터루킨-2 정상 단백 및 조각 단편의 비율 평균이 각각 88.3%, 11.7%이어서, 조각 단편이 현저히 줄어들게 되었고, 인터루킨-2 정상 단백 발현율이 높아지고, 정제 수율도 향상시켜 생산성을 높일 수 있게 되었다.

<110> BMI Korea co., Ltd <120> Production method of host microorganism having high yield productivity of recombinant human active protein <130> DPP20107272KR <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 411 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> non-modified IL-2 structural gene <220> <221> CDS <222> (4)..(402) <223> IL-2 protein coding region <400> 1 cat atg cct act tca agt tct aca aag aaa aca cag cta caa ctg 45 Met Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu 1 5 10 gag cat tta ctg ctg gat tta cag atg att ttg aat gga att aat aat 93 Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn 15 20 25 30 tac aag aat ccc aaa ctc acc agg atg ctc aca ttt aag ttt tac atg 141 Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met 35 40 45 ccc aag aag gcc aca gaa ttg aaa cat ctt cag tgt cta gaa gaa gaa 189 Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu 50 55 60 ctc aaa cct ctg gag gaa gtg cta aat tta gct caa agc aaa aac ttt 237 Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe 65 70 75 cac tta aga ccc agg gac tta atc agc aat atc aac gta ata gtt ctg 285 His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu 80 85 90 gaa cta aag gga tct gaa aca aca ttc atg tgt gaa tat gct gat gag 333 Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu 95 100 105 110 aca gca acc att gta gaa ttt ctg aac aga tgg att acc ttt tct cag 381 Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln 115 120 125 agc atc atc tca aca ctg act tgaggatc c 411 Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 2 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 2 Met Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 3 <211> 411 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified IL-2 structural gene <220> <221> CDS <222> (4)..(402) <223> IL-2 protein coding region <400> 3 cat atg cct act tca agt tct aca aag aaa aca cag cta caa ctg 45 Met Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu 1 5 10 gaa cat tta ctg ctg gat tta cag atg att ttg aat gga att aat aat 93 Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn 15 20 25 30 tac aag aat ccc aaa ctc acc agg atg ctc aca ttt aag ttt tac atg 141 Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met 35 40 45 ccc aag aag gcc aca gaa ttg aaa cat ctt cag tgt cta gaa gaa gaa 189 Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu 50 55 60 ctc aaa cct ctg gag gaa gtg cta aat tta gct caa agc aaa aac ttt 237 Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe 65 70 75 cac tta aga ccc agg gac tta atc agc aat atc aac gta ata gtt ctg 285 His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu 80 85 90 gaa cta aag gga tct gaa aca aca ttc atg tgt gaa tat gct gat gag 333 Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu 95 100 105 110 aca gca acc att gta gaa ttt ctg aac aga tgg att acc ttt tct cag 381 Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln 115 120 125 agc atc atc tca aca ctg act tgaggatc c 411 Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 4 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 4 Met Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer ECOR1IL-2 <400> 5 ctcgaatcca tgcctacttc aagttctaca 30 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer IL-2BAMH1 <400> 6 tcaacactga cttgaggatc cgagctc 27 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer NDE1IL-2 <400> 7 catatgccta cttcaagttc taca 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer IL-2BAMH1 <400> 8 atctcaacac tgacttgagg atcc 24 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer RBS2IL-2f <400> 9 ctacaactgg aacatttact gctggattta cag 33 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer RBS2IL-2r <400> 10 cagtaaatgt tccagttgta gctgtgtttt ctt 33 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer Ser125IL-2f <400> 11 ttttctcaga gcatctca 18 <210> 12 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer Ser125IL-2r <400> 12 gatgctctga gaaaa 15 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer EcoR1MAPf <400> 13 ggaattctac cgatagagtt 20 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer MAPrBamH1 <400> 14 taggatcctt attcgtcgtg cg 22

Claims

서열번호 3의 염기서열로 이루어진 재조합 인터루킨-2 유전자.
청구항 1 항의 유전자를 포함하고, 도 1의 pET22b BMIL2의 개열지도로 표현되는, 발현벡터 pET22b BMIL2.
청구항 2 항의 발현벡터를 이용하여 형질전환시킨 대장균 pBMIL2 (기탁번호 KCTC11284BP).

도면

도면1

도면2

도면3

도면4

도면5

도면6

10-2011-0009067

도면7
삭제