JPH0355108B2

JPH0355108B2 -

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Publication number: JPH0355108B2
Application number: JP63079681A
Authority: JP
Priority date: 1988-03-31
Filing date: 1988-03-31
Publication date: 1991-08-22
Also published as: JPH01252290A

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野本発明は、モルヒネ様鎮痛作用を示すペプチド
であるロイシンエンケフアリン（チロシンTyr−
グリシンGly−グリシンGly−フエニルアラニン
Phe−ロイシンLeuの５個のアミン酸配列よりな
るペプチド、以下、LEKと略す。）を含む融合タ
ンパク質を大量に生産可能とする新規組換えプラ
スミドpLEK1、pLEK1を含有する大腸菌、LEK
を酵素のカルボキシ末端側に有するジヒドロ葉酸
還元酵素−LEK融合タンパク質（以下、DHFR
−LEKと略す。）、DHFR−LEKの分離精製方法、
およびLEKの製造方法に関するものである。本
発明の新規組換えプラスミドpLEK1は、第１図
において示されるDNA配列を有する。本発明は、
発酵工業、医薬品工業等の分野に好適である。従来の技術 LEKは、モルヒネ様鎮痛作用を示す内因性ペ
プチドとして知られ、習慣性のない鎮痛剤または
麻酔薬としての利用が期待される興味深い生理活
性ペプチドである。本発明の技術的背景としては、いわゆる遺伝子
操作技術がある。遺伝子操作を利用した効率のよ
いLEKの製造方法としては、本発明者らが開発
した枯草菌のジヒドロ葉酸還元酵素（以下、
DHFRと略す。）遺伝子を利用する方法（特開昭
63−102698号公報）があるだけで、他には知られ
ていない。枯草菌のDHFR遺伝子を利用した方
法は、枯草菌由来のDHFR遺伝子の大腸菌での
発現効率を高め、DHFR遺伝子中のEcoRI切断部
位に化学合成LEK遺伝子を導入し、枯草菌由来
のDHFR（以下、DHFR_bsと略す。）のカルボキシ
末端側にLEKが融合した融合タンパク質として、
大腸菌に生産させ（特開昭63−87981号公報、特
開昭63−102696号公報）、融合タンパク質を分離
精製した後、カルボキシ末端側のLEKを特異的
に切断し、高速液体クロマトグフイー（以下、
HPLCと略す。）を用いて分離精製することを骨
子とする方法である。この方法の問題点は、大腸
菌で作られるDHFR_bs−LEKの菌体内蓄積量が、
菌体タンパク質のせいぜい数パーセントであり、
生産効率上改善すべき点があることである。一方、既に、本発明者らは、大腸菌由来の
DHFR遺伝子に関しては、その遺伝子の改変の
結果、異種遺伝子発現用プラスミドベクター
pTP70−１（特開昭63−46193号公報）及び
pTP104−４（特願昭62−302157）と、それら発
現ベクターを利用した融合遺伝子の作成方法（特
開平１−144992号公報）を開発している。これら
の方法を利用した場合、融合遺伝子の発現の結果
得られる融合タンパク質の大腸菌菌体の蓄積量
は、全菌体タンパク質の約20％が期待される。し
かしながら、LEKの生産に上記発現ベクターを
用いた例はない。発明の目的本発明の目的は、生産効率の面で問題のあつた
DHFR_bs遺伝子を用いたLEKの生産方法を改善
し、遺伝子操作を利用した効率のよいLEKの生
産方法を開発することにある。既に、本発明者らは(1)大腸菌のDHFRのカル
ボキシ末端側の配列を変化させても、枯草菌の
DHFRと同様に酵素活性が失われないこと、(2)
大腸菌のDHFRのカルボキシ末端側に異種ペプ
チドを融合させることを可能とするプラスミドベ
クターpTP104−４（特開平１−144979号公報）
を構築していること、(4)pTP104上の改変DHFR
遺伝子は大腸菌で効率良く発現すること、を明ら
かにしている。本発明者らは、上記の知見を利用し、鋭意研究
の結果、pTP104−４を用いて、LEK遺伝子を
DHFRと融合させて発現することにより、効率
のよいDHFR−LEKの生産を行うことができる
ことを明らかにし、その結果に従つて、本発明を
完成させた。発明の構成本発明は、(1)DHFR−LEKの大量発現を可能
にする新規組換えプラスミドpLEK1、(2)pLEK1
を含有する大腸菌菌体、(3)pLEK1を含有する大
腸菌が生産するDHFR−LEK、(4)pLEK1を含有
する大腸菌からのDHFR−LEK分離精製、およ
び(5)DHFR−LEKを用いたLEKの製造方法、の
発明により構成される。 (1) 新規組換えプラスミドpLEK1 第１図は、本発明のpLEK1の全塩基配列を
示している。図は、２本鎖環状DNAのうち片
方のDNA鎖配列だけを、プラスミド中に唯一
存在する制限酵素ClaIの切断認識部位、5′−
ATCGAT−3′の最初の”Ａ”を１番として数
えて、5′末端から3′末端の方向に記述してい
る。本発明のpLEK1は、新規な組換えプラス
ミドである。pLEK1は、4207塩基対の大きさ
であり、宿主である大腸菌にトリメトプリムお
よびアンピシリン耐性を付与することができ
る。pLEK1は、pTP104−４のBamHI及び
SalI切断によつて得られる大きい方の4173塩基
対のDNA断片と、LEKを暗号化する配列を含
む34塩基対の化学合成DNAが結合した構造を
していてる。第１図において、533番目から566
番目迄の配列が化学合成DNA由来の配列であ。
それ以外の配列がpTP104−４由来の配列であ
る。化学合成したDNAの配列には、制限酵素
MluIの認識切断部位、5′−ACGCGT−3′（第１
図の560番目から565番目までの配列）、を含ま
せてある。pTP104−４由来の部分には、MluI
部位が存在しない。pLEK1のBamHI部位（第
１図の532番目から537番目までの配列）から
MluI部位までの配列を他の配列に置き換える
ことにより、方向を定めて異種DNAの導入を
行い、DHFR遺伝子との融合遺伝子を容易に
作成することができる。第１図の57番目から557番目まで配列は、
DHFRのカルボキシ末端側にLEKがメチオニ
ンを介して結合したDHFR−LEKを暗号化し
ている。 DHFR−LEKを暗号化する配列の上流には、
DHFR−LEK遺伝子の発現を効率良く行わせ
る配列が存在する（特開昭63−46193号公報）。
即ち、43番目から50番目までの配列がSD配列
と呼ばれるもので、効率の良い翻訳に、また、
4165番目から4193番目までが、コンセンサス転
写プロモーターであり、効率の良い転写に貢献
する。このことから、pLEK1は、大腸菌に導
入された場合、多量のDHFR−LEKを作る。
作られたDHFR−LEKは、菌体内に可溶性の
状態で、菌体タンパク質の約20％程度蓄積す
る。このことによつて、pLEK1を有する大腸
菌はトリメトプリム耐性を示すようになる。ま
た、pLEK1は、pTP104−４由来の、アンプシ
リンに対して耐性を付与する遺伝子を有してい
る。このことから、pLEK1が導入された大腸
菌は、アンピシリン耐性をも示す。pLEK1は、
大腸菌に導入されて安定状態に保たれ、
pLEK1を含有する大腸菌は、微工研に
FERMBP−1818として寄託されている。このような特長を有するpLEK1は、実施例
１に従つて作成することができるが、組換えプ
ラスミドの作成方法によつて本発明が制限され
るものではない。 (2) pLEK1を含有する大腸菌 pLEK1を含有する大腸菌は、トリメトプリ
ム及びアンピシリンに対して耐性を示す。
pLEK1を含有する大腸菌は、pLEK上の
DHFR−LEK遺伝子の効率のよい発現の結果、
DHFR−LEKを菌体内に可溶性の状態で大量
に蓄積する。pLEK1を含有する大腸菌をYT＋
Ap倍地（倍地1l中に、５ｇのNaCl、８ｇのト
リプトン、５ｇのイーストエキス、及び50mgの
オリピシリンナトリウムを含む液体倍地）を用
いて、37℃で定常期まで培養した場合、蓄積す
るDHFR−LEKは、菌体タンパク質の約20％
に達する。培養菌体は、リン酸緩衝液などの適
当な緩衝液に懸濁し、フレンチプレス法もしく
は音波破砕法で破砕し、これを遠心分離法によ
り上清と沈澱に分離した場合、ほとんど全ての
DHFR−LEKは上清中に回収される。pLEK1
を含有する大腸菌は、微工研にFERMBP−
1818として寄託されている。 (3) DHFR−LEK 第２図は、DHFR−LEKを暗号化する部分
のDNA配列とそれから作られると予想される
タンパク質のアミノ酸配列を示している。
DHFR−LEKは、167アミノ酸よりなる新規な
タンパク質である。アミノ末端側から数えて、
１から159番目までの配列が、大腸菌の野生型
DHFRに１箇所アミノ酸置換置換が起こつた
（Cys−152（wild type）→Glu−152）配列であ
り、162番目から167番目までがLEKの配列で
ある。LEKの配列の直前のアミノ酸はメチオ
ニン（Met）である。このことにより、DHFR
−LEKをブロムシアン処理することにより、
LEKを特異的に切り出すことができる。160番
目のイソロイシンlleと161番目のアルギニン
Argは、pTP140−４のBamHI部位にLEKを
暗号化するDNAを導入する際に、遺伝暗号の
読み取り枠を合わせるために生じた配列であ
る。pTP104−４が作るDHFRは、162個のア
ミノ酸よりなり、第２図のDHFR−LEKのア
ミノ酸配列のうち、アミノ末端側から数えて、
１から160番目までの配列に、Gln−lleの２個
のアミノ酸配列が結合した配列をしている。
DHFR−LEKの分子量は、18963である。 DHFR−LEKは、DHFRのカルボキシ末端
側に、LEKが融合した構造をしているにもか
かわらず、DHFR酸素活性を有する。このた
め、大腸菌がDHFR−LEKを多量につくると、
DHFRの阻害剤であり、抗細菌剤であるトリ
メトプリムに対して、耐性を示すようになる。 (4) DHFR−LEKの分離精製本発明のDHFR−LEKの分離精製法は、
菌体の培養、菌体の破砕、DEAE−トヨパ
ールカラム処理、メソトリキセート
（MTX）結合アフイニテイクロマトグラフイ
ー、およびDEAE−トヨパールカラムクロマ
トグラフイーの過程より成り立つている。菌体の培養 pLEK1を含有する大腸菌の培養は、YT＋
Ap倍地（倍地１中に、５ｇのNaCl、８ｇ
のトリプトン、５ｇ、イーストエキスおよび
50mgアンピシリンナトリウムを含む液体倍
地。）で培養することができる。倍地として
は、この地にST＋Ap倍地（倍地１中に、
２ｇのグルコース、１ｇのリン酸２カリウ
ム、５ｇのポリペプトン、５ｇのイーストエ
キスおよび50mgのアンピシリンナトリウムを
含む液体倍地。）など、菌体が成長する倍地
であれば、どの様な倍地でも用いることがで
きるが、調べた限りでは、DHFR−LEKの
生産にはYT＋Ap倍地が最適であつた。 pLEK1を含有する大腸菌を、倍地に接触
し、37℃で対数成長期の後期もしくは定常期
まで培養する。培養温度により菌体中の
DHFR−LEKの蓄積量が変動し、調べた限
りでは、培養温度が高いほど蓄積量が大であ
つた。培養した菌体は、5000回転／分の遠心
分離により集める。倍地１より湿重量２か
ら４ｇの菌体が得られる。集菌およびこれ以後の操作は、特に断わら
ない限り低温（０から10℃の間、４℃が望ま
しい）で行う。菌体の破砕培養して得られた菌体を、湿重量の３倍の
緩衝液１（0.1ｍＭエチレンジアミン４酢酸
ナトリウム（EDTA）を含む10ｍＭリン酸
カリウム緩衝液、PH7.0）に懸濁し、フレン
チプレスを用いて菌体を破砕する。菌体破砕
液を5000回転、10分間遠心分離し、上清を得
る。さらに、上清を、35000回転、１時間超
遠心分離し、上清を得る（無細胞抽出液）。 DEAE−トヨパールカラム処理この操作は、次の精製過程の前処理の目的
で行う。無細胞抽出液を、あらかじめ0.1M
のKClを含む緩衝液１で平衡化したDEAEト
ヨパールカラムにかけ、0.1MのKClを含む
緩衝液１でカラムを洗う。酵素の溶出は、
0.3MのKClを含む緩衝液１を用いて行う。
溶出液を一定量ずつフラクシヨンコレクター
を用いて分画する。分画した溶出液について
DHFR活性を測定し、酵素活性が含まれる
画分を集める。 MTX結合アフイニテイクロマトグラフイ
ー上記の操作により得られた酵素液を、あら
かじめ緩衝液１で平衡化したMTX結合
Sepharoseアフイニテイカラムに吸着させ
る。吸着後、1MのKClを含む緩衝液２（0.1
ｍＭ EDTAを含む10ｍＭリン酸カリウム
緩衝液、PH8.5）で洗う。洗いは、カラムか
らの溶出液の280nｍの吸光度を測定し、吸
光度が0.1以下になるまで同緩衝液を流し続
ける。酵素の溶出は、1MのKClと３ｍＭの
葉酸を含む緩衝液２を用いて行い、溶出液を
一定量ずつフラクシヨンコレクターを用いて
分画する。分画した溶出液についてDHFR
活性を測定し、酵素活性が含まれる画分を集
める。得られた酵素液を、緩衝液１に対し
て、３回透析する。この段階で、純度90％以
上のDHFR−LEKが得られる。 DEAE−トヨパールカラムクロマトグラフ
イー透析した酵素液を、あらかじめ緩衝液１で
平衡化したDEAE−トヨパールカラムに吸着
させる。吸着後、0.1KClを含む緩衝液１で
洗う。洗いは、カラムからの溶出液の280n
ｍの吸光度を測定し、吸光度が0.01以下にな
るまで同緩衝液を流し続ける。酵素の溶出
は、緩衝液１を用いて0.1Mから0.3MのKCl
の直線濃度勾配を用いて行い、溶出液を一定
量ずつフラクシヨンコレクターを用いて分画
する。分画した溶出液について280nｍの吸
光度とDHFR活性を測定する。酵素活性／
280nｍの吸光度の値が、一定な画分を集め
る。以上の操作により、DHFR−LEKの高度
精製均一化を、再現性良く行うことができ
る。本発明に従うと、DHFR−LEKの精製は、
培養を含めて一週間以内に行うことができ、
回収率50％以上で、均一な酵素標品を得るこ
とができる。 DHFR酵素活性は、反応液（0.05ｍＭのジ
ヒドロ葉酸、0.06ｍＭのNADPH、12ｍＭの
２−メルカプトエタノール、50ｍＭのリン酸
緩衝液（PH7.0））を、１mlのキユベツトと
り、これに酵素液を加え、340nｍの吸光度
の時間変化を測定することにより行う。酵素
１ユニツトは、上記反応条件において、１分
間に１マイクロモルのジヒドロ葉酸を還元す
るのに必要な酵素量として定義する。この測
定は、分光光度計を用いて容易に行うことが
できる。 (5) DHFR−LEKを用いたLEKの製造精製したDHFR−LEKを凍結乾燥し、これ
に１から10mgタンパク質／mlとなるように７％
蟻酸を加え、溶かした後、タンパク質量の約20
倍量の結晶ブロムシアンを加え密栓し、窒素雰
囲気下、室温で撹拌しながら24時間反応させ
る。反応液を10倍の水で希釈した後、凍結乾燥
し過剰の試薬を除く。乾燥試料を１から10mgタ
ンパク質／mlとなるように30％酢酸に溶かす。
溶かした試料をHPLC装置（島津LC−4A、
inertsil−ODSカラム）を用いて、0.1％トリフ
ルオロ酢酸中、15％から50％のアセトニトリル
の濃度勾配を用いて溶出・分離することができ
る。溶出物は、220nｍにおける吸光度を測定
することにより検出することができる。第３図
は、ブロムシアン処理したDHFR−LEK試料
の高速液体クロマトグラムを示している。試料
注入後17分のピークがLEKである。このピー
ク画分を分離する。分離した溶出液をエバホレ
ーターで乾燥後、少量の水を加え凍結乾燥し溶
媒を除き、LEKを得ることができる。また、
得られたペプチドを酸加水分解後、アミノ酸分
析することによりアミノ酸組成を確かめること
ができる。本発明の実施例においては、３の倍地から
湿重量約８ｇの菌体が得られ、この菌体（計算
上、約87.3mgのDHFR−LEK、約2.6mgのLEK
を含む。）から、約43mgのDHFR−LEK（収率、
50.6％、計算上約1.26mgのLEKを含む。）を精
製して得ることができ、10mgのDHFR−LEK
をブロムシアン分解後、HPLCで分離・精製す
ることにより、約0.16mgのLEKを得ることがで
きた。次に本発明の実施例および参考例を示す。実施例１ pLEK1の作成 LEKを暗号化するDNAとしては、１ 5′−
GATCCGTATGTACGGTGGTTTCCTGTA
ＡＣＧＣＧＴＧ−3′ ２５−
TCGACACGCGTTACAGGAAACCACCGT
ＡＣＡＴＡＣＧ−3′ の２本の34ヌクレオチドからなるDNAをホスホ
アミダイト法に従つて化学合成し、精製後、ポリ
ヌクレオチドキナーゼを用いて、各DNAの5′末
端をリン酸化した。リン酸化したDNAを約0.1ml
（約0.01μｇのDNAを含んでいる。）ずつ取り、こ
れを60℃でインキユベートすることによつて両
DNAをアニールさせた（これをDNA1と呼ぶ）。約1μｇのpTP104−４を、BamHI及びSalIで切
断した後、アルカリホスフアターゼ処理をした。
アルカリホスフアターゼ処理したDNAをフエノ
ール処理することにより、共存する酵素タンパク
質を変性除去し、その後エタノールでDNAを沈
澱させた。沈澱したDNAを70％エタノールで洗
つた後、エタノールを除き、減圧下に沈澱を乾燥
させた。BamHI及びSalIによるDNAの切断、ア
ルカリホスフアターゼ処理、フエノール処理、お
よびエタノール沈澱の各操作は、いずれも、
“Molecular Cloning Ａ Loboratory Manual”
（T.Maniatis.E.Fritsch、J.SambrooK、eds.Cold
Spring Harbor Laboratory（1982）、以下、文献
１と呼ぶ。）に記載している方法に従つて行つた。
乾燥させたDNAを50μのリガーゼ用反応液
（10ｍＭ Tris−HCl、PH7.4、５ｍＭ MgCl₂、
10ｍＭジチオトレイトール、５ｍＭ ATP）に
溶解後、5μのDNA1を加え、これに１ユニツ
トのT4−DNAリガーゼを加えて、10℃で、14時
間DNAの連結反応を行わせた。この反応物を、
形質転換法（transformation method、上記文献
１に記載）に従つて、大腸菌に取り込ませた。こ
の処理をした菌体を、50mg／mlのアンピシリンナ
トリウムおよび10mg／mlのトリメトプリムを含む
栄養寒天倍地（倍地１中に、２ｇのグルコー
ス、１ｇのリン酸２カリウム、５ｇのイーストエ
キス、５ｇのボリペプトン、15ｇの寒天を含む。）
上に塗布し、37℃で24時間培養することにより、
約15個のコロニーを得ることができた。これらの
コロニーから適当に８個選び、1.5mlのYT＋Ap
倍地（倍地１中に、５ｇのNaCl、５ｇのイー
ストエキス、８ｇのトリプトン、50mgのアンピシ
リンナトリウムを含む。）で、37℃、１晩、菌体
を培養した。培養液を、各々エツペンドルフ遠心
管にとり、12000回転／分で10分間遠心分離し、
菌体を沈澱として集めた。これに、0.1mlの電流
泳動用サンプル調製液（0.0625MのTris−HCl、
PH6.8、２％のラウリル硫酸ナトリウム（SDS）、
10％のグリセリン、５％の２−メルカプトエタノ
ール、0.001％のブロムフエーノルプルーを含
む。）を加え、菌体を懸濁し、これを沸騰水中に
５分間保ち、菌体を溶かした。この処理をしたサ
ンプルをSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法（U.K.Lammlｉ；Nature、Vol.227、p680
（1970））に従つて分析した。標準サンプルとして
pTP104−４を含有する大腸菌に同様の処理をし
たもの、および分子量マーカーとしてラクトアル
ブミン（分子量14200）、トリプシンインヒビター
（分子量20100）、トリプシノーゲン（分子量
24000）、カルボニツクアンヒドラーゼ（分子量
29000）、グリセロアルデヒド３−リン酸デヒドロ
ゲナーゼ（分子量36000）、卵アルブミン（分子量
45000）および牛血清アルブミン（分子量66000）
を含むサンプルをポリアクリルアミド濃度の10か
ら20％濃度勾配ゲルで泳動した。その結果、８個
のコロニーのうち、７個ではpTP104−４の
DHFRのバンドが消失し、それより明らかに分
子量が大きくなつたタンパク質（分子量約22000
と推定される。）を新たに生産していること、残
りの１個のコロニーは、pTP104−４のDHFRと
ほぼ同じ大きさのタンパク質を生産すること、
pT104−４のDHFR（分子量18379）は、この条件
で分子量約21000のタンパク質として泳動するこ
とが明らかになつた。分子量の大きい新たなタン
パク質を生産するコロニーのうちから適当に一つ
選び、これをYT＋Ap倍地で培養し、Tanakaと
Weisblumの方法（T.Tanaka、B.Wejsblum；J.
Bacteriogy、vol.121、p.354（1975））に従つて、
プラスミドを調製した。得られたプラスミドを
pLEK1と名づけた。pLEK1は、pTP104−４の
BamHIとSalI部位の間の配列が合成DNAと置き
換わつた構造をしているはずである。合成DNA
には、制限酵素MluIで切断認識される配列、
5′−ACGCGT−3′が含まれているので、MluIで
pLEK1の切断を試みたところ、確かに切断され
た。また、pLEK1のEcoRI（第１図の471−476番
目の配列）とPvu（第１図の1563−1568番目の
配列）による切断によつて得られる約11100ヌク
レオチド長のDNAについて、M13フアージを用
いたジデオキシ法（J.Messing；Mehtods in
Enzymology、vol.101、ｐ、20（1983）に従つて、
EcoRからPvuの方向に塩基配列を決定した。
その結果、第１図の示すpLEK1の全塩基配列の
471番目から約850番目迄の配列が確かめられた。 pTP104−４の塩基配列は、本発明者らによつ
て明らかにされている（特開平１−144979号公
報）。pLEK1のBamH−Salの配列は、
pTP104−４のBamH−Salの間の294ヌクレ
オチド長の配列が、LEKを暗号化する配列とし
て設計・合成した34ヌクレオチド長の配列に置き
換わつた配列であつた。また、pLEK1のBamH−SalI切断によつて
得られる約4.2キロ塩基対のDNAは、EcoR、
Pst、Hind、Hpa、Aat、Pvu、Bgl
、およびClaを用いた制限酵素による切断実
験の結果、pTP104−４のBamH−SalI切断に
よつて得られる約4.2キロ塩基対のDNAと全く同
一であることが示された。以上の結果からpLEK1の全塩基配列が第１図
に示した配列であることが決められた。実施例２ pLEK1を含有する大腸菌が作るDHFR−LEK pLEK1を含有する大腸菌が作るDHFR−LEK
のアミノ酸配列は、DHFR−LEK遺伝子の塩基
配列から予想することができる。第１図の57番目
から557番目の配列がDHFR−LEKを暗号化して
いることから、トリプレツト暗号表を用いて、ア
ミノ酸配列を推定した。その結果第２図に示すア
ミノ酸配列が得られた。pLEK1を含有する大腸
菌から、DHFR−LEKを分離精製し、精製した
タンパク質を用いて、以下のように確認した。 DHFR−LEKの精製Ａ用いた菌体量：湿重量８ｇＢ酵素精製表（表における精製過程は無細胞
抽出液、DEAE−トヨパールカラム処理、
メソトリキセート結合アフイニテイクロマトグ
ラフイー、およびDEAE−トヨパールカラム
クロマトグラフイーを表わす。

【表】 DHFR酵素活性は、反応液（0.05ｍＭのジヒド
ロ葉酸、0.06ｍＭのNADPH、12ｍＭの２−メル
カプトエタノール、50ｍＭのリン酸緩衝液（PH
7.0））を、１mlのキユベツトとり、これに酵素液
を加え、340nｍの吸光度の時間変化を測定する
ことにより行つた。酵素１ユニツトは、上記反応
条件において、１分間に１マイクロモルのジヒド
ロ葉酸を還元するのに必要な酵素量として定義し
た。得られた酵素タンパク質をSDS電気泳動法（上
記実施例に記載の方法）により分析したところ、
約22000の単一なタンパク質バンドが示され、得
られた酵素標品が均一であることが示された。分離精製したDHFR−LEKの性質精製したDHFR活性を示すタンパク質をエン
ザイムイムノアツセイにより検討したところ、
LEKに対する抗体と反応することが示された。
即ち、精製して得られたタンパク質は免疫学的に
LEKと同等の構造を有することが明らかとなつ
た。精製して得られたタンパク質のカルボキシ末端
側のアミノ酸配列を明らかにするために、カルボ
キシベプチダーゼＹを、精製タンパク質に時間を
変化させて作用させ、遊離してくるアミノ酸を定
量した（カルボキシペプチダーゼ法によるカルボ
キシ末端側のアミノ酸配列の決定法）。その結果、
−Gly−Gly−Leu（カルボキシ末端）であること
が予想された。また、精製して得られたタンパク
質を酸加水分解した後、アミノ酸分析したとこ
ろ、塩基配列の結果予想されるアミノ酸組成と一
致した結果が得られた。実施例３精製分離したDHFE−LEKからのLEKの分離実施例２で得られた精製タンパク質（約10mg、
約530nmolesのDHFR−LEK）を、凍結乾燥し、
これを２mlの70％蟻酸に溶かし、これに約200mg
のブロムシアンを加え溶かし、窒素雰囲気下、密
栓した後、室温で24時間撹拌しながら反応させ
た。反応後、20mlの水を加え、その後凍結乾燥し
た。凍結乾燥して得られた標品を、、10mlの30％
酢酸に溶かした。そのうちの、0.5ml（約26nｍ
oleのDHFR−LEKを含むはず）をとり、高速液
体クロマトグフイー装置（島津LC−4A）を用い
lnertsil−ODS5μｍカラムで分離した。溶出は0.1
％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリルの濃度勾
配（15％から50％）をかけることにより行つた。
０から２分までは、15％のアセニトリルを用い、
２分から32分までは、15％から50％のアセトニト
リルの直線濃度勾配をかけた。その結果、第３図
に示すような溶出曲線が得られた。試料注入後17
分のピーク画分を分離し、分離した溶出液をエバ
ホレーターで乾燥後、少量の水を加え凍結乾燥し
溶楳を除き、ペプチドを得た。得られたペプチド
を酸加水分解後、その1/2の容をアミノ酸分析に
用いた。その結果、チロシン、グリシン、フエニ
ルアラニン、およびロイシンがそれぞれ、7.2、
14.6、7.1および7.6nmoleずつ検出された。アミ
ノ酸組成は、LEKのそれと一致した値であり、
また分析したヘプチドは、約7.4nmole（約4.1μｇ）
のLEKを含んでいることが明らかとなつた。こ
の結果を用いると、プロムシアン処理して得られ
たサンプル0.5mlをHPLCを用いて分離すること
により、収率約5.7％（7.4x2nmole／26nmole）
でLEKを回収できること、またこの操作を20回
繰り返得すことにより、10mgのDHFR−LEKか
ら約164μｇ（4.1x2μｇx20）のLEKが得られるこ
とが示される。また、DHFR−LEKの精製の収率が約50％で
あり、DHFR−LEKからLEKの分離の収率が約
57％であることから、大腸菌がつくるLEKペプ
チド部分の単離収率が、約29％程度であることが
算出される。発明の効果上記のように、新規組換えプラスミドpLEK1
は、DHFR−LEKを暗号化しており、かつ
pLEK1を有する大腸菌は、DHFR−LEKを可溶
性の状態で大量に蓄積生産する。さらに、生成し
たDHFR−LEKは、DHFR酵素活性を保持して
おり、精製を容易に行うことができる。本発明の
精製法に従うことにより、DHFR−LEKの精製
を迅速に効率よく行うことができる。また、
DHFR−LEKをブロムシアン処理後、HPLCで
分離することにより、LEKを容易に単離するこ
とができる。このような性質を有することから、
本発明は、DHFR−LEKとそれを利用したLEK
の生産に有益である。また、pLEK1には、Mlu部位が新たに付け
加えられており、異種遺伝子の発現用ベクターと
して有用であると、考えられる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、pLEK1の全塩基配列を示した図で
あり、２本鎖DNAのうち片方のDNA鎖配列だけ
を、5′末端から3′末端の方向に記述している。図
中符号は、核酸塩基を表し、Ａはアデニンを、Ｃ
はシトシンを、Ｇはグアニンを、Ｔはチミンを示
している。図中番号は、pLEK1に１箇所存在す
る制限酵素Cla切断認識部位、5′−ATCGAT
−3′、の最初の”Ａ”を１番として数えた番号を
示している。第２図は、pLEK1中に存在するDHFR−LEK
を暗号化する部分の塩基配列およびタンパク質の
アミノ酸配列を示す図である。図中符号は、核酸
塩基およびアミノ酸を表し、Ａはアデニンを、Ｃ
はシトシンを、Ｇはグアニンを、Ｔはチミンを、
Alaはアラニンを、Argはアルギニンを、Asnは
アスパラギンを、Aspはアスパラギン酸を、Cys
はシステインを、Glnはグルタミンを、Gluはグ
ルタミン酸を、Glyはグリシンを、Hisはヒスチ
ジンを、Ileはイソロイシンを、Leuはロイシン
を、Lysはリジンを、Metはメチオニンを、Phe
はフエニルアラニンを、Proはプロリンを、Ser
はセリンを、Thrはトレオニンを、Trpはトリプ
トフアンを、Tyrはチロシンを、Valはバリンを
示している。図中番号は、１番目のアミノ酸であ
るメチオニンを暗号化するATGコドンの”Ａ”
を１番として数えた番号を示している。第３図は、ブロムシアン処理したDHFR−
LEK試料の高速液体クロマトグラムを示してい
る。横軸は、試料注入後の時間を分単位で、縦軸
は、220nｍの吸光度を任意単位で表現している。
矢印で示したピークがLEKの溶出ピークである。

Claims

【特許請求の範囲】１大腸菌において安定に複製され、宿主である
大腸菌にトリメトプリム耐性およびアンピシリン
耐性を与えることができ、4207塩基対の大きさを
有し、下記に示すDNA配列を有する新規組換え
プラスミドpLEK1。【表】【表】【表】【表】２ pLEK1を含有する大腸菌。３ pLEK1を含有する大腸菌が生産し、下記に
示すアミノ酸配列を有するジヒドロ葉酸還元酵素
−ロイシンエンケフアリン融合タンパク質。【表】４ pLEK1を含有する大腸菌を培養し、ジヒド
ロ葉酸還元酵素活性を目安に、ジヒドロ葉酸還元
酵素−ロイシンエンケフアリン融合タンパク質
を、培養菌体の無細胞抽出液から、イオン交換カ
ラム処理、メソトリキセート結合アフイニテイカ
ラムクロマトグラフイー、および陰イオン交換カ
ラムクロマトグラフイーを用いて精製することを
特徴とするジヒドロ葉酸還元酵素−ロイシンエン
ケフアリン融合タンパク質の分離精製方法。５ pLEK1を含有する大腸菌の生産するジヒド
ロ葉酸還元酵素−ロイシンエンケフアリン融合タ
ンパク質をブロムシアン分解法により分離した
後、ロイシンエンケフアリンを分離精製すること
を特徴とするロイシンエンケフアリンの製造方
法。