JP2022511396A - Ｃｄ４０への三価結合を伴う二重特異性抗原結合分子 - Google Patents

Ｃｄ４０への三価結合を伴う二重特異性抗原結合分子 Download PDF

Info

Publication number
JP2022511396A
JP2022511396A JP2021517821A JP2021517821A JP2022511396A JP 2022511396 A JP2022511396 A JP 2022511396A JP 2021517821 A JP2021517821 A JP 2021517821A JP 2021517821 A JP2021517821 A JP 2021517821A JP 2022511396 A JP2022511396 A JP 2022511396A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
seq
amino acid
acid sequence
binding
antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2021517821A
Other languages
English (en)
Inventor
ハーラルト デュール，
モーリッツ ラップ，
クリスティーン トランプフェラー，
パブロ ウマーニャ，
Original Assignee
エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト filed Critical エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト
Publication of JP2022511396A publication Critical patent/JP2022511396A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/66—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a swap of domains, e.g. CH3-CH2, VH-CL or VL-CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/74—Inducing cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本発明は、ＣＤ４０への三価結合及び標的細胞抗原への一価結合を伴う新規の二重特異性抗原結合分子と、これらの分子を生産する方法と、これらの分子を用いる方法と、に関する。

Description

本発明は、ＣＤ４０への三価結合と、標的細胞抗原、特に線維芽細胞活性化タンパク質（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＦＡＰ）への一価結合と、を伴う新規の二重特異性抗原結合分子に関する。本発明は更に、これらの分子を生産する方法、及びこれらを使用する方法に関する。
強力な適応免疫応答の生成中は複数の分子シグナルが必要とされる。シグナル１は、Ｔ細胞抗原受容体（Ｔ－ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＴＣＲ）が、抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ－ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ：ＡＰＣ）の表面に提示されたその同種抗原に結合することを含む。シグナル２は、共刺激受容体と、Ｔ細胞及びＡＰＣの間のそれぞれのリガンドとの係合からなる。最もよく研究されかつ最も重要な共刺激エフェクタの１つは、腫瘍壊死因子受容体（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＴＮＦＲ）ファミリメンバＣＤ４０及びそのリガンドＣＤ４０Ｌである（Ｅｌｇｕｅｔａ Ｒ．ら、「Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．」２００９年、第２２９巻、第１号、第１５２～７２頁）。ＣＤ４０を含むＴＮＦＲファミリのいくつかのメンバは、ＡＰＣ及びＴ細胞応答を維持するため最初のＴ細胞活性化後に機能し、したがって、免疫系の組織及び機能において中心的な役割を有する（Ｗａｔｔｓ Ｔ．Ｈ．（２００５年）「Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」第２３巻、第２３～６８頁）。異なる共刺激ＴＮＦＲファミリメンバの組合せは、ＡＰＣ及びＴ細胞活性化並びに生存の連続的かつ一時的な調節を可能にすることで、ＡＰＣ及びＴ細胞機能の厳密な制御を維持しながら、免疫応答を増加させる。疾患状態に応じて、共刺激ＴＮＦファミリメンバを介した刺激は疾患を増悪又は回復することができる。ＴＮＦＲファミリ共刺激分子の活性化又は遮断は、がん、感染性疾患、移植、及び自己免疫を含む複数の分野におけるいくつかの治療的応用に有望である。
いくつかの共刺激分子の中で、ＴＮＦＲファミリメンバＣＤ４０は、成熟、生存、抗原提示、サイトカイン産生、及びＡＰＣの共刺激分子の発現を誘導することによって免疫応答を誘発する際に重要な役割を果たし、その後、抗原特異的Ｔ細胞応答及び炎症性サイトカインによるＮＫ細胞活性化を駆動する。ＣＤ４０は、感染症、腫瘍、及び自己抗原に対する免疫応答を調節し、その発現は、血小板と同様に、Ｂ細胞、樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ：ＤＣ）、単球、及びマクロファージなどのＡＰＣの表面、並びに筋線維芽細胞、線維芽細胞、上皮細胞、及び内皮細胞などの非造血系起源の細胞で示されている（Ｅｌｇｕｅｔａ Ｒ．ら、「Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．」（２００９年）第２２９巻、第１号、第１５２～７２頁）。ＣＤ４０リガンドＣＤ４０Ｌは、活性化されたＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、血小板、単核球細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、及び好塩基球上で発現される（Ｃａｒｂｏｎｅ Ｅ．ら、「Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．」（１９９７年）第１８５巻、第１２号、第２０５３～２０６０頁、又はＥｌｇｕｅｔａ Ｒ．ら、「Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．」（２００９年）第２２９巻、第１号、第１５２～７２頁）．ＣＤ４０及びＣＤ４０Ｌの発現は様々な免疫刺激シグナルに応答して強く上方制御され、ＡＰＣとＣＤ４＋Ｔ細胞との間のＣＤ４０－ＣＤ４０Ｌ相互作用は、ＡＰＣ活性化及び抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の増加に寄与する（Ｂｅｖａｎ ＭＪ．、「Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．」（２０１４年）第４巻、第８号、第５９５～６０２頁）。同様の免疫刺激結果はＣＤ４０アゴニスティック抗体を用いても観察された（Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ ＲＨ及びＧｌｅｎｎｉｅ ＭＪ．、「Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．」（２０１３年）第１９巻、第５号、第１０３５～４３頁）。
Ｉ型膜貫通型受容体ＣＤ４０のその天然リガンドＣＤ４０Ｌによる係合、ＩＩ型膜貫通型タンパク質の係合、又はアゴニスティック抗体による係合は、ＣＤ４０のクラスタリングを促進し、細胞質受容体ドメインへのアダプタタンパク質の動員を誘導する。ＴＮＦ受容体関連因子（ＴＮＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ：ＴＲＡＦ）として知られるこれらのアダプタタンパク質の動員は、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ：ＭＡＰＫ）、ホスホイノシチド３キナーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３－ｋｉｎａｓｅ：ＰＩ３Ｋ）、並びに古典的（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）及び非古典的（ｎｏｎ－ｃａｎｏｎｉｃａｌ）核内因子κＢ（ＮＦκＢ）シグナル伝達経路の相乗的活性化をもたらす（Ｅｌｇｕｅｔａ Ｒ．ら、「Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．」（２００９年）第２２９巻、第１号、第１５２～７２頁）。その結果、ＡＰＣの成熟及び活性化が起こり、その後、抗原特異的Ｔ細胞応答が最大になる。最近の研究は、抗腫瘍免疫の利用におけるアゴニスティックＣＤ４０抗体の２つの異なる作用様式を示している。適応免疫系の活性化に媒介される腫瘍細胞殺傷によるその間接的な作用様式に加えて、アゴニスティックＣＤ４０抗体は、ＣＤ４０発現固形腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することによって、直接的な腫瘍細胞殺傷を誘導することができる（Ｅｌｉｏｐｏｕｌｏｓ ＡＧ．ら、「Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．」（２０００年）第２０巻、第１５号、第５５０３～１５頁）。腫瘍細胞の直接的ＣＤ４０抗体媒介殺傷は、抗ＣＤ４０抗体を介したＣＤ４０係合により同時に活性化されたＡＰＣによって処理及び提示され得る腫瘍抗原の供給源を提供することができ、次いで、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞を誘導することができる、内因性ワクチン接種として知られる仮定機序である。ＣＤ４０係合が効率的な抗がん免疫応答を開始し得ることを考えると、アゴニスティックＣＤ４０抗体は、単剤及び化学療法との併用の両方で様々な前臨床腫瘍モデルにおいて成功裏に使用されている（Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ ＲＨ及びＧｌｅｎｎｉｅ ＭＪ．、「Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．」（２０１３年）第１９巻、第５号、第１０３５～４３頁）。
現在までに６種類のＣＤ４０ ｍＡｂが臨床試験で検討されている：Ｃｈｉ Ｌｏｂ ７／４（ＣＤ４０アゴニスティックＩｇＧ１キメラｍＡｂ；Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＵＫ；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ Ｆ．ら、「Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ．」（２０１３年）第２巻、第２２９～４０頁）、ＡＤＣ１０１３（完全ヒト、ＣＤ４０アゴニスティックＩｇＧ１抗体；Ａｌｌｉｇａｔｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ及びＪｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ；Ｍａｎｇｓｂｏ ＳＭ．ら、「Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．」（２０１５年３月１日）第２１巻、第５号、第１１１５～２６頁）、ＡＰＸ－００５（完全ヒト化、ＣＤ４０アゴニスティックＩｇＧ１ ｍＡｂ；Ａｐｅｘｉｇｅｎ；Ｂｊｏｒｃｋ Ｐ．ら、「Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｃａｎｃｅｒ．」（２０１５年）第３巻、付録２号、第１９８頁）、ＳＥＡ－ＣＤ４０（ＣＤ４０アゴニスティックＩｇＧ１キメラｍＡｂ；Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ；Ｇａｒｄａｉ ＳＪ．ら、「ＡＡＣＲ １０６ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ」（２０１５年４月１８～２２日）、概説２４７２頁）、並びにＲＯ７００９７８９（完全ヒト、ＣＤ４０超アゴニスティックＩｇＧ２ ｍＡｂ）は第Ｉ相臨床試験で検討され、ダセツズマブ（ＣＤ４０部分的アゴニスティックＩｇＧ１キメラｍＡｂ；Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ；Ｋｈｕｂｃｈａｎｄａｎｉ Ｓ．ら、「Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ．」（２００９年）第１０巻、第５７９～８７頁）は第ＩＩ相臨床試験で検討されている。これらの研究の適格患者は、固形腫瘍、古典的ホジキンリンパ腫（Ｈｏｄｇｋｉｎ ｌｙｍｐｈｏｍａ：ＨＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ｄｉｆｆｕｓｅ ｌａｒｇｅ Ｂ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ：ＤＬＢＣＬ）、又は低悪性度リンパ腫（濾胞性リンパ腫を含む）を有する。補体依存性細胞傷害性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＣＭＣ）又は抗体依存性細胞傷害性（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＡＤＣＣ）を介したＣＤ４０＋腫瘍細胞のＦｃ依存性細胞傷害から、抗腫瘍Ｔ細胞応答を誘導するＡＰＣ活性化並びに腫瘍及び腫瘍間質を枯渇させるマクロファージ活性化までの多様な活性が、これらのＣＤ４０アゴニスティック抗体について示されている。これまでのところ、この観察された不均一性について決定的な説明はされていない。しかしながら、最近の研究は、この作用様式の多様性は、少なくとも部分的には、エピトープ特異性、アイソタイプ、又はＦｃ：ＦｃγＲ相互作用における抗ＣＤ４０抗体の相違によって説明され得ることを示している。例えば、インビボでのＣＤ４０アゴニスティック抗体には、ＴＮＦＲスーパーファミリの他のアポトーシス誘導性又は免疫調節性メンバに特異的なアゴニスティック抗体に関して記載されているように、標的細胞上のそのＦａｂ断片に結合したＣＤ４０を、標的細胞以外の細胞上のそのＦｃ断片に結合したＦｃγ受容体に架橋することが必要なようである（Ｄａｈａｎ Ｒ．、「Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ．」（２０１６年６月１３日）第２９巻、第６号、第８２０～３１頁；Ｌｉ Ｆ．及びＲａｖｅｔｃｈ Ｊ．Ｖ．「Ｓｃｉｅｎｃｅ」（２０１１年）第３３３巻、第１０３０～１０３４頁；Ｔｅｎｇ Ｍ．Ｗ．ら、「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」（２００９年）第１８３巻、第１９１１～１９２０頁）。提案された機序には、強力なインビボ効力を達成するための、Ｆｃγ受容体を介した標的細胞上のＣＤ４０膜貫通分子のクラスタリング、及びその後の増強されたＣＤ４０シグナル伝達が含まれる。
アゴニスティックＣＤ４０抗体の臨床開発は有望な初期結果を提示した。最初の臨床試験ＣＰ－８７０，８９３では進行がん患者に対する臨床的有効性が示された。進行がん患者２９例中４例は、ＣＰ－８７０，８９３の単回静脈内注入後に部分反応を示した（Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ ＲＨ．、「Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．」（２００７年３月１日）第２５巻、第７号、第８７６～８３頁）。ＣＰ－８７０，８９３を１年半にわたって９回投与した４例中の１例は、５年以上完全寛解を維持した。しかしながら、ＣＰ－８７０，８９３の最も一般的な副作用は、サイトカイン放出症候群及び血栓塞栓症であるため、投与スケジュール及び投与経路は、１４０人以上の患者を対象とした第１相臨床試験の結合データを使用したため、限定的な臨床的有効性しか示さず、かつ抗体の局所投与が示唆されなかった（Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ ＲＨ、Ｇｌｅｎｎｉｅ Ｍ、「Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．」（２０１３年）第１９巻、第５号、第１０３５～１０４３頁）。単剤応答の欠如は、用量制限毒性（例えば、サイトカイン放出症候群）をもたらす、広いＣＤ４０発現によって引き起こされる重度のオンターゲット／オフ腫瘍（ｏｎ ｔａｒｇｅｔ／ｏｆｆ ｔｕｍｏｒ）効果に部分的に起因する。ＣＤ４０が腫瘍特異的標的により架橋された場合にＡＰＣを特異的に活性化するアゴニスティックＣＤ４０抗体の開発は、副作用を低減することができ、用量制限を低減することができる、効率的で長期持続する抗がん免疫を生成する可能性のある新しい治療選択肢を提供する。
利用可能な前臨床及び臨床データは、がんに対する効果的な内因性免疫応答を誘導し、かつ増強することができるＣＤ４０の効果的なアゴニストへの臨床的なニーズが高いことを、明確に示している。しかしながら、この効果が単一の細胞型に限定される、又は単一の機序を介して作用することはほとんどなく、細胞間及び細胞内シグナル伝達機序を解明するために設計された研究によって、複雑さのレベルが増大していることが明らかにされている。既知のＣＤ４０抗体は、サイトカイン放出症候群及び血小板／内皮細胞活性化などの用量制限毒性のために比較的低用量でのみ投与することができ、これにより標的ＡＰＣ上の経路の不充分な活性化及び狭い治療域がもたらされる。したがって、好ましくは単一の細胞型に作用する「標的化」アゴニストが必要性とされる。
本発明は、ＣＤ４０及び標的細胞抗原に特異的に結合することができる新規の二重特異性抗原結合分子に関する。他のＴＮＦファミリメンバと同様に、インビボ及びインビトロでのＣＤ４０Ｌの活性はホモ三量体立体配置を必要とし、多くの証拠は生物活性がＣＤ４０の高次クラスタリングに依存することを示唆している。したがって、アゴニスティックＣＤ４０抗体について、特異的結合が可能であり、したがって三量体ＣＤ４０リガンドとして類似の生物活性を示す３つの部分を含む分子を作製することもまた有利であり得る。本発明の抗原結合分子は、腫瘍特異的標的又は腫瘍関連標的へ好ましく結合可能な部分と、ＣＤ４０へのアゴニスティック結合が可能な３つの部分とを組み合わせる。ここで、ＣＤ４０を介するＡＰＣの活性化は、標的細胞抗原、例えば腫瘍間質細胞上で発現されるＦＡＰを介する架橋によって得られ、また潜在的には、二次リンパ組織において中間的に発現されるＦＡＰを介することでも得られる。二重特異性抗原結合分子のＦＡＰ依存性架橋は、ＣＤ４０発現細胞の活性化を腫瘍組織に限定し、また潜在的に、腫瘍灌流リンパ節（ｔｕｍｏｒ－ｄｒａｉｎｉｎｇ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅ）のような二次リンパ組織にも限定する。ＣＤ４０に、及びＣＴＬＡ－４又はＰＤ－１などの活性化Ｔ細胞上の免疫チェックポイント受容体に特異的に結合することができる二重特異性抗原結合分子とは対照的に、ＦＡＰなどの腫瘍標的を標的とすることにより、線維芽細胞が他の組織と比較してＦＡＰのレベルの増加を発現する、主に腫瘍間質及び腫瘍灌流リンパ節におけるＣＤ４０媒介ＡＰＣ活性化が可能になる。したがって、本発明の抗原結合分子は、ＦｃγＲ架橋の必要性を克服することで副作用を低減しながら、効果的であるだけでなく、所望の部位において極めて選択的にＣＤ４０受容体をトリガすることができる。
本発明は、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリメンバＣＤ４０に特異的に結合することができる３つの部分（抗原結合ドメイン）を、標的細胞抗原を標的とする少なくとも１つの抗原結合側と組み合わせた、二重特異性抗原結合分子に関する。これらの二重特異性抗原結合分子は、標的細胞抗原に対するそれらの結合能のために、標的細胞抗原が発現される部位で共刺激ＣＤ４０受容体を好ましくは活性化するので、有利である。
本発明は、したがって、
（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片と、
（ｂ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片と、
（ｃ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる第３のＦａｂ断片と、
（ｄ）安定した会合が可能な、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインであって、ここで、第２のＦａｂ断片（ｂ）がＶＨ－ＣＨ１鎖のＣ末端にて第１のＦａｂ断片（ａ）のＶＨ－ＣＨ１鎖のＮ末端に融合し、これは転じて、そのＣ末端にて第１のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合し、第３のＦａｂ断片（ｃ）が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端にて第２のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合する、Ｆｃドメインと、
（ｅ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるクロスｆａｂ断片であって、ここで、クロスｆａｂ断片がＦｃドメインサブユニットの１つのＣ末端に融合されている、クロスｆａｂ断片と、を含む、ＣＤ４０に三価結合する二重特異性抗原結合分子に関する。
一態様では、本発明は、
（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片と、
（ｂ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片と、
（ｃ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる第３のＦａｂ断片と、
（ｄ）安定した会合が可能な、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインであって、ここで、第２のＦａｂ断片（ｂ）がＶＨ－ＣＨ１鎖のＣ末端にて第１のＦａｂ断片（ａ）のＶＨ－ＣＨ１鎖のＮ末端に融合し、これは転じて、そのＣ末端にて第１のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合し、第３のＦａｂ断片（ｃ）が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端にて第２のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合する、Ｆｃドメインと、
（ｅ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるクロスｆａｂ断片であって、ここで、クロスｆａｂ断片がＦｃドメインサブユニットの１つのＣ末端に融合されている、クロスｆａｂ断片と、からなる、ＣＤ４０に三価結合する二重特異性抗原結合分子を提供する。
一態様では、二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片と、
（ｂ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片と、
（ｃ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる第３のＦａｂ断片と、
（ｄ）安定した会合が可能な、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインであって、ここで、第２のＦａｂ断片（ｂ）がＶＨ－ＣＨ１鎖のＣ末端にて第１のＦａｂ断片（ａ）のＶＨ－ＣＨ１鎖のＮ末端に融合し、これは転じて、そのＣ末端にて第１のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合し、第３のＦａｂ断片（ｃ）が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端にて第２のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合する、Ｆｃドメインと、
（ｅ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるクロスｆａｂ断片であって、ここで、クロスｆａｂ断片が第２のＦｃドメインサブユニットのＣ末端に融合されている、クロスｆａｂ断片と、からなる。
一態様では、二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片と、
（ｂ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片と、
（ｃ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる第３のＦａｂ断片と、
（ｄ）安定した会合が可能な、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインであって、ここで、第２のＦａｂ断片（ｂ）が第１のＦａｂ断片（ａ）のＶＨ－ＣＨ１鎖のＮ末端にペプチドリンカを介してＶＨ－ＣＨ１鎖のＣ末端で融合し、これは転じて、そのＣ末端にて第１のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合し、第３のＦａｂ断片（ｃ）が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端にて第２のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合する、Ｆｃドメインと、
（ｅ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるクロスｆａｂ断片であって、ここで、クロスｆａｂ断片が第２のＦｃドメインサブユニットのＣ末端にペプチドリンカを介して融合されている、クロスｆａｂ断片と、からなる。
一態様では、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する。一態様では、ＣＤ４０に特異的に結合することができる第１、第２、及び第３のＦａｂ断片は、ＣＤ４０に特異的に結合することができる同一の抗原結合ドメインを含む。
更なる態様では、標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合することができる抗原結合ドメインである、二重特異性抗原結合分子が提供される。特に、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する。したがって、一態様では、本発明は、ＣＤ４０に特異的に結合することができる３つの抗原結合ドメインと、ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと、を含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。
一態様では、本発明は、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び（ｉｖ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（ｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（ｖｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（ｉｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び（ｉｖ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（ｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（ｖｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。
更なる態様では、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号９のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号１０のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）配列番号１７のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号１８のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、本明細書で上記に定義されるような二重特異性抗原結合分子が提供される。
特に、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）とを含むか、又は
（ｂ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）とを含む、本明細書で上記に定義されるような二重特異性抗原結合分子が提供される。
更なる態様では、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（ｉｉ）配列番号２０、配列番号２７、及び配列番号２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び（ｉｖ）配列番号２２、配列番号２９、及び配列番号３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（ｖ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（ｖｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
別の態様では、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、及び配列番号３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、
（ｉｉ）配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、及び配列番号４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）と、を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
更に、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、
（ｂ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、
（ｃ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｄ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号４１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
更なる態様では、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの各々が、（ｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（ｉｉ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（ｉｉｉ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）、及び（ｉｖ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（ｖ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（ｖｉ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
更に別の態様では、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの各々が、
（ｉ）配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、及び配列番号５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、
（ｉｉ）配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、及び配列番号６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）と、を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
更に、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの各々が、
（ｉ）配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、及び配列番号６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、
（ｉｉ）配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、及び配列番号７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）と、を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
特に、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの各々が、
（ａ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５７のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｂ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｃ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５９のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｄ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６０のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｅ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５７のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｆ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｇ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５９のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｈ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６０のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｉ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５７のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｊ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｋ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５９のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｌ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６０のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｍ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５７のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｎ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｏ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５９のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｐ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
より具体的には、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの各々が、配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号５７のアミノ酸配列を含むＶＬと、を含む、二重特異性抗原結合が提供される。
更なる態様では、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの各々が、
（ａ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６７のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｂ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６７のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｃ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６７のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｄ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６７のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｅ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｆ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｇ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｈ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６９のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｊ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６９のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｋ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号７０のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｌ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号７０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
より具体的には、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの各々が、配列番号６１のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６７のアミノ酸配列を含むＶＬを含むか、又は、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号６４のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６７のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、二重特異性抗原結合が提供される。
更に、
（ｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）及び配列番号５７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）をそれぞれ含む、ＣＤ４０に特異的に結合することができる３つの抗原結合ドメインと、
（ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、ＦＡＰに特異的に結合することができる１つの抗原結合ドメインと、を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
特定の一態様では、二重特異性抗原結合分子は、（ｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）及び配列番号５７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）をそれぞれ含む、ＣＤ４０に特異的に結合することができる３つの抗原結合ドメインと、（ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、ＦＡＰに特異的に結合することができる１つの抗原結合ドメインと、を含む。
別の特定の態様では、二重特異性抗原結合分子は、（ｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）及び配列番号５７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）をそれぞれ含む、ＣＤ４０に特異的に結合することができる３つの抗原結合ドメインと、（ｉｉ）配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、ＦＡＰに特異的に結合することができる１つの抗原結合ドメインと、を含む。
一態様では、二重特異性抗原結合分子は、ヒト化抗体又はキメラ抗体である。更なる態様では、二重特異性抗原結合分子は、ＩｇＧ Ｆｃ領域、特にＩｇＧ１ Ｆｃ領域又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含む。特に、Ｆｃ領域は、Ｆｃ受容体及び／又はエフェクタ機能に対する抗体の結合親和性を低減する、１つ以上のアミノ酸置換を含む。特定の態様では、Ｆｃ領域が、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を伴うヒトＩｇＧ１サブクラスの領域である、二重特異性抗原結合分子が提供される。
別の態様では、ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅｓ）法に従って、Ｆｃ領域の第１のサブユニットはノブを含み、Ｆｃ領域の第２のサブユニットはホールを含む、本明細書で上記に定義されるような二重特異性抗原結合分子が提供される。特に、（ｉ）Ｆｃ領域の第１のサブユニットはアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含み、Ｆｃ領域の第２のサブユニットはアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、及びＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含むか、又は（ｉｉ）Ｆｃ領域の第１のサブユニットはアミノ酸置換Ｋ３９２Ｄ及びＫ４０９Ｄ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含み、Ｆｃ領域の第２のサブユニットはアミノ酸置換Ｅ３５６Ｋ及びＤ３９９Ｋ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。より具体的には、Ｆｃ領域の第１のサブユニットはアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含み、Ｆｃ領域の第２のサブユニットはアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、及びＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
別の特定の態様では、ＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片の１つ以上が、１２３位（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）におけるアミノ酸のアルギニン（Ｒ）及び／又は１２４位（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）におけるアミノ酸のリジン（Ｋ）を含むＣＬドメインと、１４７位（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）におけるアミノ酸のグルタミン酸（Ｅ）及び／又は２１３位（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）におけるアミノ酸のグルタミン酸（Ｅ）を含むＣＨ１ドメインと、を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
本発明の別の態様によれば、本明細書にて上述した二重特異性抗原結合分子をコードする単離核酸が提供される。本発明は更に、ベクタ、特に、本発明の単離核酸と、単離核酸又は本発明の発現ベクタを含む宿主細胞と、を含む発現ベクタを提供する。いくつかの態様では、宿主細胞は、真核細胞、特に哺乳動物細胞である。
別の態様では、二重特異性抗原結合分子の発現に好適な条件下において上記の宿主細胞を培養することと、二重特異性抗原結合分子を単離することと、を含む、本明細書にて上述した二重特異性抗原結合分子の生産方法が提供される。本発明はまた、本発明の方法によって生産されたＣＤ４０及びＦＡＰに特異的に結合する二重特異性抗原結合分子も包含する。
本発明は更に、本明細書にて上述した二重特異性抗原結合分子と、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物を提供する。
医薬として使用するための、本明細書にて上述した二重特異性抗原結合分子、又は、二重特異性抗原結合分子を含む医薬組成物もまた、本発明に包含されている。
一態様では、
（ｉ）ＣＤ４０発現抗原提示細胞（ＡＰＣ）による、免疫刺激の誘導において、
（ｉｉ）腫瘍特異的Ｔ細胞応答を刺激することにおいて、
（ｉｉｉ）腫瘍細胞のアポトーシスを引き起こすことにおいて、
（ｉｖ）がんの治療において、
（ｖ）がんの進行を遅らせることにおいて、
（ｖｉ）がんを患う患者の生存を延長することにおいて、
（ｖｉｉ）感染症の治療において、使用するための、本明細書にて上述した二重特異性抗原結合分子又は本発明の医薬組成物が提供される。
特定の態様では、がんの治療で使用するための、本明細書にて上述した二重特異性抗原結合分子、又は本発明の医薬組成物が提供される。別の特定の態様では、本発明は、がん免疫療法で使用するための化学療法剤、放射線、及び／又は他の薬剤と併用して投与される、がんの治療で使用するための、本明細書にて上述した二重特異性抗原結合分子を提供する。別の態様では、細胞傷害Ｔ細胞活性を上方制御又は延長する際に使用するための、本明細書にて上述した二重特異性抗原結合分子又は本発明の医薬組成物が提供される。
更なる態様では、本発明は、個体における腫瘍細胞の増殖の阻害方法であって、当該個体に有効量の、本明細書にて上述した二重特異性抗原結合分子、又は本発明の医薬組成物を投与して、当該腫瘍細胞の増殖を阻害することを含む、方法を提供する。別の態様では、本発明は、個体におけるがんを治療又は遅延する方法であって、有効量の本明細書にて上述した二重特異性抗原結合分子又は本発明の医薬組成物を該個体に投与することを含む、方法を提供する。
また、疾患の治療を必要とする個体での、疾患の治療のための医薬を製造するための、特にがんの治療のための医薬の製造のための、本明細書にて上述した二重特異性抗原結合分子の使用と、個体における疾患の治療方法と、であって、治療的有効量である本発明の二重特異性抗原結合分子を薬学的に許容される形態で含む組成物を該個体に投与することを含む、方法も提供される。特定の態様では、疾患は、がんである。上記態様のいずれかにおいて、個体は、哺乳動物、特にヒトである。
図１Ａ～図１Ｆは、ヒトＣＤ４０及びＦＡＰに特異的に結合する二重特異性抗原結合分子の概略図を示す。図１Ａは、クロスオーバＦａｂ断片として１つのＦＡＰ（２１２）結合部分と結合した２つのＣＤ４０結合部分からなる、２＋１フォーマットの二重特異性ＦＡＰ－ＣＤ４０抗体の概略図を示す。ここで、ＶＬ－ＣＨ１鎖は、Ｆｃノブ鎖（ＣＤ４０では二価、ＦＡＰでは一価）のＣ末端で融合されている。図１Ｂは、クロスオーバＦａｂ断片として１つのＦＡＰ（４Ｂ９）結合部分と結合した２つのＣＤ４０結合部分からなる、２＋１フォーマットの二重特異性ＦＡＰ－ＣＤ４０抗体の概略図を示す。ここで、ＶＨ－Ｃカッパ鎖は、Ｆｃノブ鎖（ＣＤ４０では二価、ＦＡＰでは一価）のＣ末端で融合されている。図１Ｃは、クロスオーバＦａｂ断片として１つのＦＡＰ（２１２）結合部分と結合した３つのＣＤ４０結合部分からなる、３＋１フォーマットの二重特異性ＦＡＰ－ＣＤ４０抗体の概略図を示す。ここで、ＶＬ－ＣＨ１鎖は、Ｆｃノブ鎖（ＣＤ４０では三価、ＦＡＰでは一価）のＣ末端で融合されている。図１Ｄは、クロスオーバＦａｂ断片として１つのＦＡＰ（４Ｂ９）結合部分と結合した３つのＣＤ４０結合部分からなる、３＋１フォーマットの二重特異性ＦＡＰ－ＣＤ４０抗体の概略図を示す。ここで、ＶＨ－Ｃカッパ鎖は、Ｆｃノブ鎖（ＣＤ４０では三価、ＦＡＰでは一価）のＣ末端で融合されている。図１Ｅは、クロスオーバＦａｂ断片として１つのＦＡＰ（２１２）結合部分と結合した４のＣＤ４０結合部分からなる、４＋１フォーマットの二重特異性ＦＡＰ－ＣＤ４０抗体の概略図を示す。ここで、ＶＬ－ＣＨ１鎖は、Ｆｃノブ鎖（ＣＤ４０では四価、ＦＡＰでは一価）のＣ末端で融合されている。図１Ｆは、クロスオーバＦａｂ断片として１つのＦＡＰ（４Ｂ９）結合部分と結合した４つのＣＤ４０結合部分からなる、４＋１フォーマットの二重特異性ＦＡＰ－ＣＤ４０抗体の概略図を示す。ここで、ＶＨ－Ｃカッパ鎖は、Ｆｃノブ鎖（ＣＤ４０では四価、ＦＡＰでは一価）のＣ末端で融合されている。 図２Ａ及び図２Ｂは、ＦＡＰクローン４Ｂ９及び２８Ｈ１と競合して、トランスフェクトされたＨＥＫ細胞上に発現したヒトＦＡＰに対する免疫化誘導ＦＡＰクローンの細胞結合を示す。図２Ａは、全ての試験されたハイブリドーマ由来マウスクローン（２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、及び２１８称する）が、抗ＦＡＰ抗体４Ｂ９との結合について競合しなかったことを示す。図２Ｂは、同じクローンが抗ＦＡＰ抗体２８Ｈ１との結合について競合しなかったことを示す。ＭＦＩはフローサイトメトリにより測定した。ｘ軸はＦＡＰ抗体の濃度を示す。 図３Ａ及び図３Ｂは、抗ＦＡＰクローンの結合特性が、ＦｃドメインにＣ末端融合された際に失われないかどうかを決定するために作成された、抗体コンストラクトの概略図を示す。図３Ａは、Ｆｃノブ鎖及びＦｃホール鎖を含むコンストラクトを示す。ここで、ＶＨドメインはＦｃノブ鎖のＣ末端に融合し、ＶＬドメインはＦｃホール鎖のＣ末端に融合する（Ｃ末端ＶＨ／ＶＬ融合）。図３Ｂは、Ｆｃノブ鎖及びＦｃホール鎖を含むコンストラクトを示す。ここで、全Ｆａｂは、そのＶＨドメインとＦｃノブ鎖のＣ末端とが融合している（Ｃ末端Ｆａｂ融合）。 図３Ｃは、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：ＳＰＲ）に基づくアッセイを用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置上で行ったエピトープビニングのための設定を示す（例えば、１．９を参照）。 図４は、ＦＡＰ（２１２）又はＦＡＰ（４Ｂ９）を標的とした一価フォーマットのヒト四価、三価、又は二価抗ＣＤ４０抗体の、ヒトＦＡＰポジティブＮＩＨ／３Ｔ３細胞への結合を示す。トランスジェニック改変マウス胎仔線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈＦＡＰ細胞株は、高レベルのヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ：ｈｕＦＡＰ）を発現する。ＦＡＰ結合部分を有する示された全ての抗ＣＤ４０抗原結合分子は、ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈＦＡＰ細胞に効率的に結合するが、ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰ細胞に対するそれらの結合強度（ＥＣ５０値及びシグナル強度）はわずかに変動する。二次検出抗体として使用されるフィコエリトリン（ＰＥ）標識抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ｀）２断片の蛍光強度中央値（ｍｅｄｉａｎ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ：ＭＦＩ）として、結合を示す。ＭＦＩをフローサイトメトリによって測定し、ブランク対照のＭＦＩを差し引くことによってベースラインを補正した。ｘ軸は抗体コンストラクトの濃度を示す。 図５は、ＦＡＰ（２１２）又はＦＡＰ（４Ｂ９）を標的とした一価フォーマットのヒト四価、三価、又は二価抗ＣＤ４０抗体の、ヒトＣＤ４０の高い表面発現レベルを有する初代ヒトＢ細胞への結合を示す。示された全てのコンストラクトはＣＤ４０に結合するが、ＣＤ４０ポジティブＢ細胞に対するそれらの結合強度（ＥＣ５０値及びシグナル強度）は変動する。二価の抗ＣＤ４０抗体は、そのＦＡＰ結合部分に関係なく、四価の抗ＣＤ４０抗体と比較して、より高い結合プラトに達する。三価の抗ＣＤ４０抗体の結合プラトは、二価の抗ＣＤ４０抗体と比較して低いが、四価の抗ＣＤ４０抗体と比較して高い。細胞表面タンパク質への抗ＣＤ４０抗体の結合を、フィコエリトリン（ＰＥ）にコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ｀）２断片により、ＦＡＣＳ分析を用いて検出した。ＭＦＩをフローサイトメトリによって測定し、ブランク対照のＭＦＩを差し引くことによってベースラインを補正した。ｘ軸は抗体コンストラクトの濃度を示す。 図６Ａは、ＦＡＰでコーティングされたＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（図６Ａ）の存在下での２日間のインキュベーション後における、一価のＦＡＰ（２１２）、又はＦＡＰ（４Ｂ９）を標的とするヒト四価、三価、又は二価抗ＣＤ４０コンストラクトによるヒトＤａｕｄｉ細胞のインビトロ活性化を示す。 図６Ｂは、ＦＡＰでコーティングされていないＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（図６Ｂ）の存在下での２日間のインキュベーション後における、一価のＦＡＰ（２１２）、又はＦＡＰ（４Ｂ９）を標的とするヒト四価、三価、又は二価抗ＣＤ４０コンストラクトによるヒトＤａｕｄｉ細胞のインビトロ活性化を示す。ＦＡＰでコーティングされたビーズでは、ＦＡＰに対する一価の二重特異性抗体は全て、Ｂ細胞活性化マーカ発現ＣＤ７０の増加を誘導した。２＋１フォーマットの二重特異性ＦＡＰ－ＣＤ４０抗体によるＢ細胞活性化マーカ上方制御は、それらのＦＡＰ結合部分に関係なく、３＋１又は４＋１フォーマットの二重特異性ＦＡＰ－ＣＤ４０抗体により誘導される上方制御と比較して高かった。ＦＡＰ（非コーティング化ビーズ）の非存在下では、示されたＦＡＰを標的とする二価のＣＤ４０に対する二重特異性抗体でＣＤ７０の増加は観察されず、一方で三価又は四価のＣＤ４０結合分子はＣＤ７０の上方制御を誘導したが、その程度はＦＡＰの存在下よりも低かった。示されている抗体価測定された抗体との２日間のインキュベーション後の、ＣＤ７０ポジティブの活力あるＤａｕｄｉ細胞の百分率を示す。ｘ軸は抗体コンストラクトの濃度を示す。 図７Ａは、ＦＡＰでコーティングされたＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（図７Ａ）の存在下での２日間のインキュベーション後における、一価のＦＡＰ（２１２）、又はＦＡＰ（４Ｂ９）を標的とするヒト四価、三価、又は二価抗ＣＤ４０コンストラクトによるヒトＢ細胞のインビトロ活性化を示す。 図７Ｂは、ＦＡＰでコーティングされていないＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（図７Ｂ）の存在下での２日間のインキュベーション後における、一価のＦＡＰ（２１２）、又はＦＡＰ（４Ｂ９）を標的とするヒト四価、三価、又は二価抗ＣＤ４０コンストラクトによるヒトＢ細胞のインビトロ活性化を示す。ＦＡＰでコーティングされたビーズでは、ＦＡＰに対する一価の二重特異性抗体は全て、Ｂ細胞活性化マーカ発現ＣＤ８６の増加を誘導した。低い抗体濃度では、２＋１フォーマットの二重特異性ＦＡＰ－ＣＤ４０抗体によるＢ細胞活性化マーカ上方制御は、それらのＦＡＰ結合部分に関係なく、３＋１又は４＋１フォーマットの二重特異性ＦＡＰ－ＣＤ４０抗体により誘導される上方制御と比較してわずかに低かった。ＦＡＰ（非コーティング化ビーズ）の非存在下では、二重特異性抗原結合分子によるＣＤ８６発現の増加は全く又はほとんど観察されなかった。示されている抗体価測定された抗体との２日間のインキュベーション後の、ＣＤ８６ポジティブの活力あるＢ細胞の百分率を示す。ｘ軸は抗体コンストラクトの濃度を示す。 図８Ａは、ＦＡＰの存在下（図８Ａ）において、ＦＡＰを標的とする抗ＣＤ４０結合分子によって活性化されたＯＶＡパルス化ＤＣのＴ細胞プライミングを示す。 図８Ｂは、ＦＡＰの非存在下（図８Ｂ）において、ＦＡＰを標的とする抗ＣＤ４０結合分子によって活性化されたＯＶＡパルス化ＤＣのＴ細胞プライミングを示す。ｈｕＣＤ４０トランスジェニックマウスから単離し、ＤＥＣ２０５－ＯＶＡコンジュゲートで処理し、ＦＡＰ依存性二重特異性抗ＣＤ４０抗体及びＦＡＰコーティングビーズで刺激したＤＣは、抗原特異的Ｔ細胞の強い増殖を誘導した。対照的に、ＦＡＰ（非コーティング化ビーズ）の非存在下では、ＦＡＰ標的化抗ＣＤ４０抗体で刺激したＤＣによるＴ細胞増殖は誘導されなかった。２つ、３つ、又は４つのＣＤ４０と、１つのＦＡＰ（２１２）又はＦＡＰ（４Ｂ９）結合部分とを有するヒト二重特異性抗原結合分子で刺激したＤＣにより誘導されたＴ細胞増殖は、同等であった。ＤＥＣ２０５－ＯＶＡコンジュゲートの代わりに大量のＳＩＩＮＦＥＫＬでパルス化ＤＣは強いＴ細胞増殖を誘導した。ＯＶＡ（図８Ａ及び８Ｂ）の存在下において、示されている抗体価測定された抗体でプレインキュベートしたｈｕＣＤ４０ ｔｇ ＤＣと共培養された、増殖性（ＣＦＳＥ－低）の活力あるＣＦＳＥ－標識マウスＣＤ３＋ＣＤ８＋ＯＴ－１Ｔ細胞の百分率を示す。ｘ軸は抗体コンストラクトの濃度を示す。
定義
他の意味であると定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野で一般的に使用されるのと同じ意味を有する。本明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用され、適切な場合にはいつでも、単数形で使用される用語は、複数形も含み、その逆に、複数形で使用される用語は、単数形も含む。
本明細書で使用される場合、用語「抗原結合分子」とは、最も広い意味で、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、抗体、抗体断片及びスキャフォールド抗原結合タンパク質である。
本明細書で使用される場合、用語「標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメイン」、又は「標的細胞抗原に特異的に結合することができる部分」とは、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を意味する。一態様では、抗原結合ドメインは、その標的細胞抗原を介してシグナル伝達を活性化することが可能である。特定の態様では、抗原結合ドメインは、標的部位、例えば、特定の種類の腫瘍細胞、又は抗原決定基を有する腫瘍間質に結合する構成要素（例えば、ＣＤ４０アゴニスト）を指令することができる。標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、本明細書で更に定義される抗体及びその断片を含む。更に、標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、本明細書で更に定義されるスキャフォールド抗原結合タンパク質、例えば、設計された反復タンパク質又は設計された反復ドメインに基づく結合ドメイン（例えば、国際公開第２００２／０２０５６５号を参照のこと）を含む。
抗体又はその断片に関連して、用語「標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメイン」とは、抗原の一部又は全てに特異的に結合し、かつ相補性である領域を含む分子の一部を意味する。特異的抗原結合が可能な抗原結合ドメインは例えば、１つ以上の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）により、提供されることができる。具体的には、特異的抗原結合が可能な抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。別の態様では、「標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメイン」はまた、Ｆａｂ断片又はクロスＦａｂ断片であってもよい。
本明細書における用語「抗体」とは、最も広い意味で使用され、種々の抗体構造を包含し、限定されないが、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性抗体及び多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、並びに抗体断片を含む。
用語「モノクローナル抗体」とは、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集合から得られる抗体を指し、すなわち、集合に含まれる個々の抗体が、同一であり、かつ／又は同じエピトープに結合するが、但し、例えば、天然に存在する変異又はモノクローナル抗体製剤の製造中に生じる変異を含む、可能な変異体抗体は除く。そのような変異体は、一般的に少量で存在する。異なる決定基（エピトープ）に対して異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体の調製と比べて、モノクローナル抗体の調製における各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対するものである。
用語「単一特異性」抗体とは、本明細書で使用される場合、同じ抗原の同じエピトープにそれぞれ結合する１つ以上の結合部位を有する抗体を示す。用語「二重特異性」とは、抗原結合分子が、少なくとも２つの別個の抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。典型的には、二重特異性抗原結合分子は、２つの抗原結合部位を含み、それぞれが異なる抗原決定基に対して特異的である。ある特定の実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、２つの抗原決定基（特に、２つの別個の細胞で発現する２つの抗原決定基）に同時に結合することができる。本明細書中に記載されるような二重特異性抗原結合分子はまた、多重特異性抗体の一部を形成することもできる。
本出願の中で用いられる用語「価」とは、１つの異なる抗原決定基に対して特異的である抗原結合分子内で、１つの異なる抗原決定基に対して特異的な結合部位が特定の数、存在することを意味する。そのため、用語「二価」、「三価」、「四価」、及び「六価」とは、抗原結合分子において、それぞれ特定の抗原決定基に対して特異的な、２つの結合ドメイン、３つの結合ドメイン、４つの結合ドメイン、及び６つの結合ドメインが存在することを意味する。本発明の特定の態様では、本発明にかかる二重特異性抗原結合分子は、特定の抗原決定基に対して一価であることができ、このことは、これらが該抗原決定基に対して１つのみの結合部位を有することを意味するか、又はこれらが特定の抗原決定基に対して二価、三価、若しくは四価であることができ、そしてこのことは、これらが該抗原決定基に対してそれぞれ２つの結合部位、３つの結合部位、若しくは４つの結合部位を有することを意味する。
用語「完全長抗体」、「インタクト抗体」、及び「全抗体」とは、天然抗体構造に実質的に類似した構造を有する抗体を指すために、本明細書で相互に置き換え可能に用いられる。「天然抗体」とは、様々な構造を有する、天然に発生する免疫グロブリン分子を意味する。例えば、天然ＩｇＧクラス抗体は、約１５０，０００ダルトンのヘテロテトラマー糖タンパク質であり、ジスルフィド結合した２つの軽鎖と２つの重鎖とから構成される。Ｎ末端からＣ末端まで、各重鎖は、可変領域（ＶＨ）（可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる）と、続いて３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）（重鎖定常領域とも呼ばれる）と、を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、それぞれの軽鎖は、可変領域（ＶＬ）（可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる）と、続いて軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）（軽鎖定常領域とも呼ばれる）を有する。抗体の重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５種類の１つに割り当てられてもよく、これらのいくつかは、例えば、γ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）などのサブタイプへ更に分けられてもよい。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２種類の１つに割り当てられてもよい。
「抗体断片」は、インタクト抗体が結合する抗原に結合するインタクト抗体の一部を含むインタクト抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、クロスＦａｂ断片；直鎖抗体；一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び単一ドメイン抗体が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の抗体断片の総説としては、Ｈｕｄｓｏｎら、「Ｎａｔ Ｍｅｄ」第９巻、第１２９～１３４頁（２００３年）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の総説としては、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」第１１３巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク、第２６９～３１５頁（１９９４年）を参照されたく、また、国際公開第９３／１６１８５号並びに米国特許第５，５７１，８９４号及び同第５，５８７，４５８号を参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、インビボでの半減期が長くなったＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の説明については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照。ダイアボディは、二価又は二重特異性であってもよい２つの抗原結合部位を含む抗体断片であり、例えば、欧州特許第４０４，０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Ｈｕｄｓｏｎら、「Ｎａｔ Ｍｅｄ」第９巻、第１２９～１３４頁（２００３年）、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、「Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ」第９０巻、第６４４４～６４４８頁（１９９３年）を参照されたい。トリアボディ及びテトラボディもまた、Ｈｕｄｓｏｎら、「Ｎａｔ Ｍｅｄ」第９巻、第１２９～１３４頁（２００３年）に説明されている。「単一ドメイン抗体」とは、抗体の重鎖可変ドメインの全部若しくは一部、又は軽鎖可変ドメインの全部若しくは一部を含む抗体断片である。ある特定の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．（マサチューセッツウォルサム）例えば、米国特許第６，２４８，５１６Ｂ１号を参照）。抗体断片は、限定されないが、本明細書に記載されるように、インタクト抗体のタンパク質分解による消化、及び組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による産生を含め、種々の技術によって作られてもよい。
インタクト抗体のパパイン消化により、２つの同一の抗原結合断片が得られ、これは、それぞれ重鎖及び軽鎖可変ドメインと、更に、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む「Ｆａｂ」断片と呼ばれる。従って、本明細書で使用される場合、用語「Ｆａｂ断片」とは、軽鎖（ＣＬ）のＶＬドメイン及び定常ドメインを含む軽鎖断片と、重鎖のＶＨドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む抗体断片を指す。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含め、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での数個の残基の付加によって、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’断片である。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位（２つのＦａｂ断片）と、Ｆｃ領域の一部とを含む、Ｆ（ａｂ’）２断片が得られる。本発明によれば、用語「Ｆａｂ断片」は、以下で定義する「クロスＦａｂ断片」又は「クロスオーバＦａｂ断片」もまた含む。
用語「クロスＦａｂ断片」又は「ｘＦａｂ断片」又は「クロスオーバＦａｂ断片」とは、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換されたＦａｂ断片を指す。クロスオーバＦａｂ分子の２つの可能な鎖組成が可能であり、本発明の二重特異性抗体に含まれる。一方で、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変領域は、置き換わっており、すなわち、クロスオーバＦａｂ分子は、重鎖の一部として軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）で構成されるペプチド鎖と、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）で構成されるペプチド鎖と、を含む。このクロスオーバＦａｂ分子はまた、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＶＬＶＨ）とも呼ばれる。一方で、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の定常領域が置き換わっている場合、クロスオーバＦａｂ分子は、重鎖の一部として重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）で構成されるペプチド鎖と、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）で構成されるペプチド鎖と、を含む。このクロスオーバＦａｂ分子はまた、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＣＬＣＨ１）とも呼ばれる。
「一本鎖Ｆａｂ断片」又は「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）、及びリンカからなるポリペプチドであって、ここで、該抗体ドメイン及び該リンカは、Ｎ末端からＣ末端への方向で、以下の順序の１つを有する：（ａ）ＶＨ－ＣＨ１－リンカ－ＶＬ－ＣＬ、（ｂ）ＶＬ－ＣＬ－リンカ－ＶＨ－ＣＨ１、（ｃ）ＶＨ－ＣＬ－リンカ－ＶＬ－ＣＨ１、又は（ｄ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカ－ＶＨ－ＣＬ。ここで、上記リンカは、少なくとも３０アミノ酸、好ましくは３２～５０アミノ酸のポリペプチドである。該一本鎖Ｆａｂ断片は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然ジスルフィド結合によって安定化される。加えて、これらの一本鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによれば、可変重鎖の４４位及び可変軽鎖の１００位）による鎖間ジスルフィド結合の生成によって、更に安定化されるだろう。
「クロスオーバ一本鎖Ｆａｂ断片」又は「ｘ－ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカからなるポリペプチドであり、ここで、該抗体ドメイン及び該リンカは、Ｎ末端からＣ末端への方向で、以下の順序の１つを有する。（ａ）ＶＨ－ＣＬ－リンカ－ＶＬ－ＣＨ１及び（ｂ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカ－ＶＨ－ＣＬ。ここで、ＶＨとＶＬは一緒になって、ある抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、該リンカは、少なくとも３０アミノ酸のポリペプチドである。その上、これらのｘ－ｓｃＦａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによれば、可変重鎖の４４位及び可変軽鎖の１００位）による鎖間ジスルフィド結合の生成によって、更に安定化されるだろう。
「一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）」は、１０～約２５アミノ酸の短いリンカペプチドを用いて接続された、抗体の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカは、通常、可撓性のためにグリシンが豊富であり、溶解度のためにセリン又はトレオニンが豊富であり、ＶＨのＮ末端とＶＬのＣ末端とを、又はその逆で接続することができる。このタンパク質は、定常領域が除去され、リンカが導入されているが、元々の抗体の特異性を保持している。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．」第２０３巻（１９９１年）第４６～９６頁）に記載されている。その上、抗体断片は、ＶＨドメインに特徴的な（すなわち、ＶＬドメインと共に集合させることが可能な）、又はＶＬドメインに特徴的な（すなわち、機能的抗原結合部位にＶＨドメインと共に集合させることが可能な）一本鎖ポリペプチドを含み、それによって、完全長抗体の抗原結合特性を与えることができる。
「スキャフォールド抗原結合タンパク質」は、当該技術分野で既知であり、例えばフィブロネクチン及び設計アンキリンリピートタンパク質（ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＤＡＲＰｉｎ）は、抗原結合ドメインの代替的なスキャフォールドとして使用されてきた。例えば、Ｇｅｂａｕｅｒ及びＳｋｅｒｒａ、「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ａｓ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．」、「Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ」第１３巻、第２４５～２５５頁（２００９年）及びＳｔｕｍｐｐら、「Ｄａｒｐｉｎｓ：Ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．」、「Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ」第１３巻、第６９５～７０１頁（２００８年）を参照されたい。本発明の一態様では、スキャフォールド抗原結合タンパク質は、ＣＴＬＡ－４（エビボディ）、リポカリン（アンチカリン）、プロテインＡ由来分子、例えば、プロテインＡのＺ－ドメイン（アフィボディ）、Ａ－ドメイン（アビマ／マキシボディ）、血清トランスフェリン（トランスボディ）；設計アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、抗体軽鎖又は重鎖の可変ドメイン（単一ドメイン抗体、ｓｄＡｂ）、抗体重鎖の可変ドメイン（ナノボディ、ａＶＨ）、ＶＮＡＲ断片、フィブロネクチン（アドネクチン）、Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン）；新規抗原受容体β－ラクタマーゼの可変ドメイン（ＶＮＡＲ断片）、ヒトγ－クリスタリン又はユビキチン（アフィリン分子）；ヒトプロテアーゼ阻害剤のクニッツ型ドメイン、ミクロボディ、例えば、ノッチンファミリ由来のタンパク質、ペプチドアプタマ及びフィブロネクチン（アドネクチン）からなる群から選択される。ＣＴＬＡ－４（細胞傷害Ｔリンパ球関連抗原４）は、主にＣＤ４＋Ｔ細胞で発現するＣＤ２８ファミリ受容体である。その細胞外ドメインは、可変ドメイン様のＩｇ折りたたみを有する。抗体のＣＤＲに対応するループは、異なる結合特性を与えるために、異種配列と置換されてもよい。異なる結合特異性を有するように操作されたＣＴＬＡ－４分子も、エビボディとして知られている（例えば、米国特許第７１６６６９７Ｂ１号）。エビボディは、抗体（例えば、ドメイン抗体）の単離された可変領域とほぼ同じ大きさである。更なる詳細については、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ」第２４８巻、第１～２号、第３１～４５頁（２００１年）を参照のこと。リポカリンは、ステロイド、ビリン、レチノイド及び脂質などの小さな疎水性分子を運ぶ細胞外タンパク質のファミリである。リポカリンは、剛性βシート二次構造を有し、円錐構造の開放端に多くのループがあり、このループは、異なる標的抗原に結合するように操作することができる。アンチカリンは、１６０～１８０アミノ酸の大きさであり、リポカリンから誘導される。更なる詳細については、「Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ」第１４８２巻、第３３７～３５０頁（２０００年）、米国特許第７２５０２９７Ｂ１号及び米国特許出願公開第２００７０２２４６３３号を参照。アフィボディは、抗原に結合するように操作することが可能な、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのプロテインＡに由来するスキャフォールドである。ドメインは、およそ５８アミノ酸の３つの螺旋形の束からなる。ライブラリは、表面残基のランダム化によって作られている。更なる詳細については、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．」（２００４年）第１７巻、第４５５～４６２頁及び欧州特許出願公開第ＥＰ１６４１８１８Ａ１号を参照されたい。アビマは、Ａドメインスキャフォールドファミリに由来する複数ドメインタンパク質である。およそ３５アミノ酸の天然ドメインは、規定のジスルフィド結合した構造に適合する。多様性は、Ａ－ドメインのファミリによって示される天然の変動のシャッフリングによって作られる。更なる詳細については、「Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」第２３巻、第１２号、第１５５６～１５６１頁（２００５年）及び「Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇｓ」第１６巻、第６号、第９０９～９１７頁（２００７年６月）を参照されたい。トランスフェリンは、単量体血清輸送糖タンパク質である。トランスフェリンは、許容状態の表面ループへのペプチド配列の挿入によって異なる標的抗原に結合するように操作可能である。操作されたトランスフェリンスキャフォールドの例としては、トランスボディが挙げられる。更なる詳細については、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ」第２７４巻、第２４０６６～２４０７３頁（１９９９年）を参照されたい。設計アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）は、細胞骨格の内在性膜タンパク質の接着に介在するタンパク質のファミリであるアンキリンに由来する。単一のアンキリンリピートは、２つのα螺旋とβターンとからなる３３残基のモチーフである。単一のアンキリンリピートは、各反復の第１のα螺旋及びβターンの中の残基をランダム化することによって異なる標的抗原に結合するように操作することができる。その結合界面は、モジュールの数を増やすことによって、増加させることができる（親和性成熟方法）。更なる詳細については、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」第３３２巻、第４８９～５０３頁（２００３年）、「ＰＮＡＳ」第１００巻、第４号、第１７００～１７０５頁（２００３年）、及び「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」第３６９巻、第１０１５～１０２８頁（２００７年）、並びに米国特許出願公開第２００４０１３２０２８Ａ１号を参照されたい。単一ドメイン抗体は、一本の単量体性可変抗体ドメインからなる抗体断片である。第１の単一ドメインは、ラクダ由来の抗体重鎖の可変ドメインに由来した（ナノボディ又はＶＨＨ断片）。更に、単一ドメイン抗体との用語は、自律的なヒト重鎖可変ドメイン（ａＶＨ）又はサメ由来ＶＮＡＲ断片を含む。フィブロネクチンは、抗原に結合するように操作可能なスキャフォールドである。アドネクチンは、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）の１５反復単位の１０番目のドメインの天然アミノ酸配列を有する骨格からなる。βサンドイッチの片方の端にある３つのループを、アドネクチンが目的の治療標的を特異的に認識することができるように操作することができる。更なる詳細については、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．」第１８巻、第４３５～４４４頁（２００５年）、米国特許出願公開第２００８０１３９７９１号、国際公開第２００５０５６７６４号、及び米国特許第６８１８４１８Ｂ１号を参照されたい。ペプチドアプタマは、定常スキャフォールドタンパク質、典型的には、活性部位に挿入される拘束された可変ペプチドループを含むチオレドキシン（ＴｒｘＡ）からなるコンビナトリアル認識分子である。更なる詳細については、「Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．」第５巻、第７８３～７９７頁（２００５年）を参照されたい。ミクロボディは、３～４のシステイン架橋を含む、２５～５０アミノ酸長の天然に存在するミクロタンパク質に由来し、ミクロタンパク質の例としては、ＫａｌａｔａＢＩ、コノトキシン及びノッチンが挙げられる。ミクロタンパク質は、ミクロタンパク質の全体的な折りたたみに影響を与えることなく、２５アミノ酸までを含むように操作することができるループを有する。操作されたノッチンドメインの更なる詳細については、国際公開第２００８０９８７９６号を参照されたい。
参照分子と「同じエピトープに結合する抗原結合分子」は、競合アッセイにおいて、参照分子のその抗原に対する結合を５０％以上ブロックする抗原結合分子を指し、逆に、参照分子は、競合アッセイにおいて、抗原結合分子のその抗原に対する結合を５０％以上ブロックする。
用語「抗原結合ドメイン」又は「抗原結合部位」とは、抗原の一部又は全てに特異的に結合し、かつ相補性である領域を含む抗原結合分子の一部を意味する。抗原が大きい場合、抗原結合分子は、抗原の特定の部分のみに結合してもよく、この部分は、エピトープと呼ばれる。抗原結合ドメインは、例えば、１つ以上の可変ドメイン（可変領域とも呼ばれる）によって与えられてもよい。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）と、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）とを含む。
本明細書で使用される場合、用語「抗原決定基」とは、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分－抗原複合体を形成する、抗原結合部分が結合するポリペプチド高分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続伸長部又は異なる領域の非連続アミノ酸から構成される配座構成）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面上に、ウイルス感染した細胞の表面上に、他の罹患した細胞の表面上に、免疫細胞の表面上に、血清中で遊離して、及び／又は細胞外マトリックス（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ：ＥＣＭ）内に認めることができる。本明細書の抗原として有用なタンパク質は、哺乳動物、例えば、霊長類（例えばヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）を含め、任意の脊椎動物源由来の任意の天然形態のタンパク質であってもよい。特定の実施形態では、抗原は、ヒトタンパク質である。本明細書にて特定のタンパク質について言及される場合、この用語は、「完全長」の未処理のタンパク質、及び細胞の処理から得られるタンパク質の任意の形態を包含する。この用語は、タンパク質の天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。
「特異的に結合する」とは、その結合が抗原選択性であり、望ましくない相互作用又は非特異的な相互作用とは判別できることを意味する。抗原結合分子が特定の抗原に結合する能力は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者に周知の他の技術、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ装置で分析される）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄら、「Ｇｌｙｃｏ Ｊ」第１７巻、第３２３～３２９頁（２０００年））、及び従来の結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ、「Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｓ」第２８巻、第２１７～２２９頁（２００２年））によって測定することができる。一実施形態では、無関係なタンパク質に対する抗原結合分子の結合度は、例えばＳＰＲによって測定される抗原に対する抗原結合分子の結合の約１０％未満である。ある特定の実施形態では、抗原に結合する分子は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば、１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）である。
「親和性」又は「結合親和性」は、分子の単一の結合部位（例えば、抗体）と、その結合パートナ（例えば、抗原）との間の非共有結合性相互作用の合計強度を指す。特に示されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバ間の１：１相互作用を反映する特異的結合親和性を指す。分子Ｘのその結合パートナＹに対する親和性は、一般的に、解離定数（Ｋｄ）によって表すことができ、脱離速度定数と解離速度定数と（それぞれ、ｋｏｆｆ及びｋｏｎ）の比である。したがって、速度定数の比率が同じままである限り、等価の親和性は、異なる速度定数を含むことができる。親和性は、本明細書に記載するものを含め、当該技術分野で一般的な方法によって測定することができる。親和性を測定する特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
「親和性成熟」抗体とは、変化を有しない親抗体と比較して、１つ以上の相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ）において１つ以上の変化を有し、かかる改変によって抗原に対する抗体の親和性を改善する、抗体を指す。
「標的細胞抗原」とは、本明細書で使用する場合、標的細胞、特に、がん細胞又は腫瘍間質細胞などの腫瘍内の標的細胞の表面に提示された抗原決定基を意味する。したがって、標的細胞抗原は、腫瘍関連抗原である。特に、標的細胞抗原は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、又はＰＤ－Ｌ１などの活性化Ｔ細胞上の免疫チェックポイント受容体を含まない。ある特定の実施形態では、標的細胞抗原は、腫瘍細胞の表面上の抗原である。一態様では、腫瘍標的細胞抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、がん胎児性抗原（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ：ＣＥＡ）、黒色腫随伴コンドロイチンサルフェートプロテオグリカン（Ｍｅｌａｎｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ Ｓｕｌｆａｔｅ Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ：ＭＣＳＰ）、上皮成長因子受容体（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＥＧＦＲ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３３からなる群から選択される。特に、腫瘍標的細胞抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である。
プロリルエンドペプチダーゼＦＡＰ又はセプラーゼ（ＥＣ３．４．２１）としても知られている、用語「線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）」とは、特に断りのない限り、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）、並びに齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源に由来する、任意の天然ＦＡＰを意味する。この用語は、「完全長」の、未処理ＦＡＰ、及び、細胞内での処理によりもたらされる任意の形態のＦＡＰを包含する。この用語はまた、ＦＡＰの天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。一実施形態では、本発明の抗原結合分子は、ヒト、マウス、及び／又はカニクイザルＦＡＰに特異的に結合可能である。ヒトＦＡＰのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）寄託番号Ｑ１２８８４（バージョン１４９、配列番号２）、又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００４４５１．２にて示されている。ヒトＦＡＰの細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ：ＥＣＤ）は、アミノ酸２６～７６０位まで伸びている。Ｈｉｓタグ化したヒトＦＡＰ ＥＣＤのアミノ酸配列は、配列番号９２に示されている。マウスＦＡＰのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ９７３２１（バージョン１２６、配列番号９３）、又はＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿０３２０１２．１に示されている。マウスＦＡＰの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、アミノ酸２６～７６１位まで伸びている。配列番号９４は、Ｈｉｓタグ化されたマウスＦＡＰ ＥＣＤのアミノ酸を示す。配列番号９５は、Ｈｉｓタグ化されたカニクイザルＦＡＰ ＥＣＤのアミノ酸を示す。好ましくは、本発明の抗ＦＡＰ結合分子はＦＡＰの細胞外ドメインに結合する。
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」とは、抗原に対する抗原結合分子の結合に関与する抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、概して、類似の構造を有しており、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ：ＦＲ）と、３つの超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ：ＨＶＲ）とを含む。例えば、Ｋｉｎｄｔら、「Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」第６版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、第９１頁（２００７年）を参照されたい。抗原結合特異性を与えるために、単一のＶＨ又はＶＬドメインで充分な場合がある。
本明細書で使用する場合、用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」とは、配列内で超可変可能であり、抗原結合特異性を決定する、抗体可変ドメインの領域、例えば「相補性決定領域」（ＣＤＲ）のそれぞれを意味する。
一般的に、抗体は、６個のＣＤＲを含み、ＶＨに３個（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３）、ＶＬに３個（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３）含む。本明細書における例示的なＣＤＲとしては、
（ａ）アミノ酸残基２６－３２（Ｌ１）、５０－５２（Ｌ２）、９１－９６（Ｌ３）、２６－３２（Ｈ１）、５３－５５（Ｈ２）及び９６－１０１（Ｈ３）で生じる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」第１９６巻、第９０１～９１７頁（１９８７年））；
（ｂ）アミノ酸残基２４－３４（Ｌ１）、５０－５６（Ｌ２）、８９－９７（Ｌ３）、３１－３５ｂ（Ｈ１）、５０－６５（Ｈ２）及び９５－１０２（Ｈ３）に存在するＣＤＲ（Ｋａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、アメリカ国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ（１９９１年））；並びに
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ－３６（Ｌ１）、４６－５５（Ｌ２）、８９－９６（Ｌ３）、３０－３５ｂ（Ｈ１）、４７－５８（Ｈ２）及び９３－１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍら、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」第２６２巻、第７３２～７４５頁（１９９６年））が挙げられる。
特に指示がない限り、ＣＤＲは、上記のＫａｂａｔらに従い決定される。当業者は、ＣＤＲの表記は、上記Ｃｈｏｔｈｉａ、上記ＭｃＣａｌｌｕｍ、又は、任意の他の、科学的に認可された命名システムに従い決定することができることを理解するであろう。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、概して、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４の４つのＦＲドメインからなる。したがって、ＣＤＲ及びＦＲ配列は、一般に、ＶＨ（又はＶＬ）において次の配列において現れる：ＦＲ１－ＣＤＲ－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－ＣＤＲ－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－ＣＤＲ－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４。
用語「キメラ」抗体とは、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の源又は種に由来する一方で、重鎖及び／又は軽鎖の残部が異なる源又は種に由来する抗体を意味する。
抗体の「クラス」とは、その重鎖によって保有される定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体には５つの主なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭであり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に更に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
本出願で使用される用語「ヒト由来の定常領域」又は「ヒト定常領域」とは、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、若しくはＩｇＧ４のヒト抗体の定常重鎖領域、及び／又は定常軽鎖カッパ若しくはラムダ領域を示す。かかる定常領域は当該技術分野で公知であり、例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、アメリカ国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ（１９９１年）に記載されている（また、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇ．及びＷｕ，Ｔ．Ｔ．、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．」第２８巻（２０００年）第２１４～２１８頁；Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」第７２巻（１９７５年）第２７８５～２７８８頁も参照されたい）。本明細書で特に明記されない限り、定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、アメリカ国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ（１９９１年）、「ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ」第９１～３２４２頁に記載されるような、ＥＵ番号付けシステム（ＫａｂａｔのＥＵインデックスとも呼ばれる）に従う。
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基と、ヒトＦＲ由来のアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を指す。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むものであり、それにおいて、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが非ヒト抗体のものに相当し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト抗体のものに相当する。ヒト化抗体は、場合により、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。ある抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。本発明に包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、特に、Ｃ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合という観点で、本発明に係る特性を作り出すために、定常領域が、元々の抗体の定常領域から更に修飾されるか、又は変更されているものである。
「ヒト」抗体とは、ヒト若しくはヒト細胞により作製した、又はヒト抗体レパートリ若しくは他のヒト抗体コード化配列を利用した、非ヒト源由来の抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、詳細には非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。
用語「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」とは、本明細書において、定常領域の少なくとも一部を含む抗体重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域と可変Ｆｃ領域とを含む。ＩｇＧ Ｆｃ領域は、ＩｇＧ ＣＨ２ドメインと、ＩｇＧ ＣＨ３ドメインとを含む。ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は、通常、おおよそのアミノ酸２３１位のアミノ酸残基から、おおよそのアミノ酸３４０位のアミノ酸残基まで延びている。一実施形態では、炭水化物鎖は、ＣＨ２ドメインに接続している。本明細書におけるＣＨ２ドメインは、天然配列ＣＨ２ドメイン又は変異体ＣＨ２ドメインであってもよい。「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域中のＣＨ２ドメインに対してＣ末端に残基の伸長部を含む（すなわち、ＩｇＧのおおよその３４１位のアミノ酸残基から、おおよその４４７位のアミノ酸残基まで）。本発明のＣＨ３領域は、天然配列ＣＨ３ドメイン又は変異体ＣＨ３ドメインであってもよい（例えば、その１つの鎖に導入された「突起部」（「ノブ」）を有し、その他の鎖に対応する導入された「空洞」（「ホール」）を有するＣＨ３ドメイン、本明細書に参考として明確に組み込まれる米国特許第５，８２１，３３３号を参照）。そのような変異体ＣＨ３ドメインを使用して、本明細書に記載される２つの同一ではない抗体重鎖のヘテロ二量体化を促進してもよい。一態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端までに及ぶ。しかし、宿主細胞によって産生される抗体は、重鎖のＣ末端から１つ以上、特に１つ又は２つのアミノ酸の翻訳後開裂を受けてもよい。したがって、完全長重鎖をコードする特定の核酸分子の発現によって、宿主細胞によって産生する抗体は、完全長重鎖を含んでいてもよく、又は全長重鎖の開裂した変異体を含んでいてもよい。これは、重鎖の最終的な２つのＣ末端アミノ酸がグリシン（Ｇ４４６）及びリジン（Ｋ４４７、ＥＵ番号付けシステム）である場合であってもよい。したがって、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）、又はＣ末端グリシン（Ｇｌｙ４４６）及びリジン（Ｌｙｓ４４７）が存在してもよく、又は存在していなくてもよい。Ｆｃ領域を含む重鎖のアミノ酸配列は本明細書において、別様に示されない場合、Ｃ末端グリシン－リジンジペプチドを含まずに表される。一態様では、本発明に従った抗体に含まれる、本明細書で明記したＦｃ領域を含む重鎖は、更なるＣ末端グリシン－リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＥＵ番号付けシステム）を含む。一態様では、本発明に従った抗体に含まれる、本明細書で明記したＦｃ領域を含む重鎖は、更なるＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＥＵインデックスに従った番号付け）を含む。本明細書で特に明記されない限り、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、アメリカ国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ（１９９１年）において説明されるような、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムによる。
「ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ）」技術は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、同第７，６９５，９３６号、Ｒｉｄｇｗａｙら、「Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ」第９巻、第６１７～６２１頁（１９９６年）、及びＣａｒｔｅｒ、「Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ」第２４８巻、第７～１５頁（２００１年）に記載されている。一般的に、この方法は、第１のポリペプチドの界面にある突起部（「ノブ」）と、第２のポリペプチドの界面にある空洞（「ホール」）とを導入することを含み、その結果、突起部が、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨害するように空洞内に位置することができる。突起部は、第１のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と交換することによって構築される。突起部と同一又は同様の大きさの相補性空洞が、大きなアミノ酸側鎖を、より小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はトレオニン）と置き換えることによって、第２のポリペプチドの界面に作られる。突起部及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を変えることによって、例えば、部位特異的変異導入法によって、又はペプチド合成によって作り出すことができる。具体的な実施形態では、ノブ修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのうち１つにアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、ホール修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのうち他方の１つにアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む。更に具体的な実施形態では、ノブ修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは更にアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃを含み、ホール修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは更にアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃを含む。これら２つのシステイン残基の導入によって、Ｆｃ領域の２つのサブユニット間にジスルフィド架橋が生成し、それにより、二量体を更に安定化する（Ｃａｒｔｅｒ、「Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ」第２４８巻、第７～１５頁（２００１年））。
「免疫グロブリンのＦｃ領域に等価な領域」は、天然に存在する免疫グロブリンのＦｃ領域の対立遺伝子変異体及び置換、付加又は欠失を生じるが、エフェクタ機能（例えば、抗体依存性細胞傷害）に介在する免疫グロブリンの能力を実質的に低下させない変更を有する変異体を含むことが意図される。例えば、１つ以上のアミノ酸は、生体機能を実質的に失うことなく、免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端又はＣ末端から欠失されていてもよい。そのような変異体は、活性に対して最小限の影響を有するように、当該技術分野で知られた一般的な規則に従って選択することができる（例えば、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」第２４７巻、第１３０６～１０頁（１９９０年）を参照）。
用語「エフェクタ機能」とは、抗体のＦｃ領域に帰属可能な生体活性を指し、抗体アイソタイプによって変わる。抗体エフェクタ機能の例としては、以下のものが挙げられる。すなわち、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ：ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の低下調節、及びＢ細胞活性化である。
Ｆｃ受容体結合に依存したエフェクタ機能は、抗体のＦｃ領域と、造血細胞における専用の細胞表面受容体である、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）との相互作用により媒介されることができる。Ｆｃ受容体は免疫グロブリンスーパーファミリに属し、免疫複合体のファゴサイトーシスによる、抗体で覆われた病原体の除去、並びに、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）による、赤血球、及び対応する抗体で覆われた他の細胞標的（例えば腫瘍細胞）の溶解の両方を媒介することが示されている（例えば、Ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｊ．Ｇ．及びＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ｌ．、「Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．」第４９巻（１９９１年）第５１１～５２４頁を参照のこと）。ＦｃＲは、免疫グロブリンアイソタイプに対するその特異性により定義される：ＩｇＧ抗体に対するＦｃ受容体は、ＦｃγＲと呼ばれる。Ｆｃ受容体結合は、例えばＲａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．、及びＫｉｎｅｔ，Ｊ．Ｐ．「Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」第９巻（１９９１年）第４５７～４９２頁；Ｃａｐｅｌ，Ｐ．Ｊ．ら、「Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ」第４巻（１９９４年）第２５～３４頁；ｄｅ Ｈａａｓ，Ｍ．ら、「Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．」第１２６巻（１９９５年）第３３０～３４１頁；及び、Ｇｅｓｓｎｅｒ，Ｊ．Ｅ．ら、「Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．」第７６巻（１９９８年）第２３１～２４８頁に記載されている。
ＩｇＧ抗体（ＦｃγＲ）のＦｃ領域に対する受容体の架橋は、ファゴサイトーシス、抗体依存性細胞傷害、及び炎症性メディエータの放出、並びに、免疫複合体のクリアランス及び抗体産生の制御を含む、多種多様のエフェクタ機能を引き起こす。ヒトにおいて、３クラスのＦｃγＲが特性決定されており、これらは以下のとおりである。
－ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）は、単量体ＩｇＧに高い親和性で結合し、マクロファージ、単球、好中球、及び好酸球にて発現する。アミノ酸残基Ｅ２３３～Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、及びＰ３２９（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従った番号付け）の少なくとも１つにおける、Ｆｃ領域ＩｇＧ内での修飾によって、ＦｃγＲＩへの結合が低下する。ＩｇＧ１及びＩｇＧ４に置換された、２３３～２３６位におけるＩｇＧ２残基は、ＦｃγＲＩへの結合を１０３倍低下させ、抗体により感作される赤血球に対するヒト単核細胞応答を取り除いた（Ａｒｍｏｕｒ，Ｋ．Ｌ．ら、「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」第２９巻（１９９９年）第２６１３～２６２４頁）。
－ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）は、複合体化ＩｇＧに中程度から低度の親和性で結合し、幅広く発現する。受容体は、２つのサブタイプ：ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢに分けることができる。ＦｃγＲＩＩＡは主に、殺傷に関与する多くの細胞（例えばマクロファージ、単球、好中球）にて発見され、殺傷プロセスを活性化可能であるようである。ＦｃγＲＩＩＢは、阻害プロセスで役割を果たすようであり、Ｂ細胞、マクロファージ、並びに肥満細胞及び好酸球で発見されている。Ｂ細胞上では、ＦｃγＲＩＩＢは、免疫グロブリン産生、及び、例えばＩｇＥクラスへのアイソタイプ切り替えを更に抑制する機能を有するようである。マクロファージ上では、ＦｃγＲＩＩＢは、ＦｃγＲＩＩＡによって媒介されるように、ファゴサイトーシスを阻害する役割を果たす。好酸球及び肥満細胞上において、Ｂ形態は、ＩｇＥの、その個別の受容体への結合による、これらの細胞の活性化の抑制を補助し得る。ＦｃγＲＩＩＡに対する結合の低下は、例えば、少なくとも、アミノ酸残基Ｅ２３３～Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｒ２９２、及びＫ４１４（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従った番号付け）の１つにおいて変異を有するＩｇＧ Ｆｃ領域を含む抗体に対して発見されている。
－ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）はＩｇＧに、中程度～低度の親和性で結合し、２つの種類として存在する。ＦｃγＲＩＩＩＡはＮＫ細胞、マクロファージ、好酸球、並びにいくつかの単球及びＴ細胞上で発見されており、ＡＤＣＣを媒介する。ＦｃγＲＩＩＩＢは、好中球上で非常に発現する。ＦｃγＲＩＩＩＡに対する結合の低下は、例えば、少なくとも、アミノ酸残基Ｅ２３３～Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｓ２３９、Ｅ２６９、Ｅ２９３、Ｙ２９６、Ｖ３０３、Ａ３２７、Ｋ３３８、及びＤ３７６（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従った番号付け）の１つにおいて変異を有するＩｇＧ Ｆｃ領域を含む抗体に対して発見されている。
Ｆｃ受容体に対する、ヒトＩｇＧ１上での結合部位のマッピング、上述した変異部位、並びにＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＡへの結合を測定する方法は、Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」第２７６巻（２００１年）第６５９１～６６０４頁に記載されている。
用語「ＡＤＣＣ」又は「抗体依存性細胞傷害」とは、Ｆｃ受容体結合により媒介される機能であり、エフェクタ細胞の存在下における、本明細書で報告される抗体による、標的細胞の溶解を意味する。ＡＤＣＣを媒介する初期工程を誘発する抗体の能力は、ＦｃγＲＩ及び／若しくはＦｃγＲＩＩＡ又は（本質的にＦｃγＲＩＩＩＡを発現する）ＮＫ細胞を組み換えにより発現する細胞といった、Ｆｃγ受容体を発現する細胞への、抗体の結合を測定することにより調査される。特に、ＮＫ細胞上でのＦｃγＲへの結合が測定される。
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃ領域による係合の後に、エフェクタ機能を発揮するために受容体を含む細胞を刺激するシグナル伝達事象を誘発するＦｃ受容体である。活性化Ｆｃ受容体として、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が挙げられる。特定の活性化Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ０８６３７、バージョン１４１を参照）。
用語「ＣＤ４０」とは、本明細書で使用される場合、特に断りのない限り、霊長類（例えばヒト）並びに齧歯類（例えばマウス及びラット）等の哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源の任意の天然ＣＤ４０を意味する。この用語は、「完全長」の、未処理ＣＤ４０、及び、細胞内での処理によりもたらされる任意の形態のＣＤ４０を包含する。この用語は、ＣＤ４０の天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。例示的なヒトＣＤ４０のアミノ酸配列を配列番号１（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ２５９４２、バージョン２００）に示し、例示的なマウスＣＤ４０のアミノ酸配列を配列番号１４６（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ２７５１２、バージョン１６０）に示す。ＣＤ４０抗原は、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ－Ｒ）ファミリに属する５０ｋＤａ細胞表面糖タンパク質である（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら（１９８９年）「ＥＭＢＯ Ｊ．」第８巻、第１４０３～１０頁）。ＣＤ４０は、Ｂリンパ球、樹状細胞、単球、マクロファージ、胸腺上皮、内皮細胞、線維芽細胞、及び平滑筋細胞を含む、多くの正常及び腫瘍細胞型において発現される。ＣＤ４０は全てのＢリンパ腫及び全ての固形腫瘍の７０％で発現し、ＩＦＮ－γ及びＧＭ－ＣＳＦなどの成熟シグナルにより抗原提示細胞（ＡＰＣ）で上方制御される。ＣＤ４０活性化はまた、機能的樹状細胞（ＤＣ）への単球の分化を誘導し、ＡＰＣ－ＣＤ４０誘導サイトカインを介してＮＫ細胞の細胞溶解活性を増強する。このようにＣＤ４０は、ＡＰＣの成熟、ヘルパサイトカインの分泌、共刺激分子の上方制御、及びエフェクタ機能の増強を誘導することにより、免疫応答の開始及び増強に不可欠な役割を果たす。
用語「ＣＤ４０アゴニスト」とは、本明細書において使用される場合、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用を刺激する任意の部分を含む。この文脈において使用されるＣＤ４０は、好ましくはヒトＣＤ４０を指し、したがって、ＣＤ４０アゴニストは、好ましくはヒトＣＤ４０のアゴニストである。典型的には、この部分はアゴニストＣＤ４０抗体又は抗体断片である。
用語「抗ＣＤ４０抗体」、「抗ＣＤ４０」、「ＣＤ４０抗体」、及び「ＣＤ４０に特異的に結合する抗体」とは、抗体がＣＤ４０の標的化において、診断及び／又は治療剤として有用であるような充分な親和性を有して、ＣＤ４０に結合可能である抗体を意味する。一態様では、抗ＣＤ４０抗体が無関係の、非ＣＤ４０タンパク質に結合する程度は、例えばラジオイムノアッセイ（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＲＩＡ）又はフローサイトメトリ（ＦＡＣＳ）により測定すると、ＣＤ４０に対する抗体の結合の約１０％未満である。ある特定の実施形態では、ＣＤ４０に結合する抗体は、解離定数（ＫＤ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０－６Ｍ以下、例えば１０－６８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば１０－８Ｍ～１０－１０Ｍ）である。
用語「ペプチドリンカ」とは、１つ以上のアミノ酸、典型的には、約２～２０のアミノ酸を含むペプチドを指す。ペプチドリンカは、当該技術分野で知られているか、又は本明細書に記載される。好適な、非免疫原性リンカペプチドは例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカであり、式中、「ｎ」は一般に、１～１０、典型的には２～４、特に２の数字である。すなわち、ペプチドは、ＧＧＧＧＳ（配列番号９６）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９７）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号９８）、及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号９９）からなる群から選択されるが、配列ＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号１００）、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号１０１）、（Ｇ４Ｓ）４（配列番号１０２）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号１０３）、ＧＳＧＳＧＮＧＳ（配列番号１０４）、ＧＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号１０５）、ＧＧＳＧＳＧ（配列番号１０６）、ＧＧＳＧ（配列番号１０７）、ＧＧＳＧＮＧＳＧ（配列番号１０８）、ＧＧＮＧＳＧＳＧ（配列番号１０９）、及びＧＧＮＧＳＧ（配列番号１１０）もまた含む。特に目的のペプチドリンカは、（Ｇ４Ｓ）（配列番号９６）、（Ｇ４Ｓ）２又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９７）、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号９８）、及び（Ｇ４Ｓ）４（配列番号９９）である。
用語「アミノ酸」とは、本明細書中で使用される場合、アラニン（三文字表記：ａｌａ、一文字表記）Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む、天然に存在するカルボキシα－アミノ酸の群を示す。
「融合した」、又は「接続された」とは、構成成分（例えば、抗体のＦｃドメイン及びＦａｂ断片）が直接、又は１つ以上のペプチドリンカを介してのいずれかで、ペプチド結合により結合されていることを意味する。
参照ポリペプチド（タンパク質）配列に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列をアラインメントし、最大の配列同一性率を達成するために、必要ならばギャップを導入した後、配列同一性の一部として任意の保存的置換を考慮せずに、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基の割合であると定義される。アミノ酸配列同一性率を決定するためのアラインメントは、当該技術分野の技術の範囲内にある種々の様式で、例えば、公的に入手可能なコンピュータソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ．ＳＡＷＩ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを用いて達成することができる。当業者は、比較される配列の完全長にわたって最大整列度を達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含め、配列を整列させるのに適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書での目的のために、アミノ酸配列同一性（％）の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．の著作であり、ソースコードは、ユーザ文書と共に米国著作権庁（Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ Ｏｆｆｉｃｅ、ワシントンＤ．Ｃ．、２０５５９）に提出されて、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）から公的に入手可能であるか、又はソースコードからコンパイルされてもよい。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄを含めたＵＮＩＸオペレーティングシステムで使用する場合はコンパイルするべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ－２プログラムによって設定され、変動しない。ＡＬＩＧＮ－２がアミノ酸配列比較に用いられる状況下で、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、又はそれに対する所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、又はそれに対するある特定のアミノ酸配列同一性％を有するか、又は含む所与のアミノ酸配列Ａと表現され得る）は、以下のように計算される：
１００×分数Ｘ／Ｙ
（式中、Ｘは、配列整列プログラムＡＬＩＧＮ－２によって、そのプログラムのＡとＢとのアラインメントにおいて完全な一致としてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である）。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一性（％）は、Ａに対するＢのアミノ酸配列同一性（％）と等しくはならないことが理解されるだろう。特に別段明記されない限り、本明細書で使用される全てのアミノ酸配列同一性（％）の値は、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムを使用して直前の段落に記載されるように得られる。
ある特定の実施形態では、本明細書において提供する、二重特異性抗原結合分子のアミノ酸配列変異体が想到される。例えば、ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子の結合親和性、及び／又は他の生物学的性質を改善するのが望ましい場合がある。適切な修飾を、分子をコードするヌクレオチド配列に導入することにより、又はペプチド合成により、ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子のアミノ酸配列変異体を調製することができる。そのような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失、及び／又は挿入、及び／又は置換を含む。最終コンストラクトに到達するために欠失、挿入、及び置換を任意に組み合わせることができるが、但し、その最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を保有することを条件とする。置換による突然変異生成のための目的部位として、ＨＶＲ及びフレームワーク（ＦＲ）が挙げられる。保存的置換は、「好ましい置換」の見出しで表Ｂに与えられており、アミノ酸側鎖クラス（１）～（６）を参照しつつ、以下に更に記載される。アミノ酸置換は、目的の分子及び所望の活性（例えば、抗原結合の保持／向上、免疫原性の低下、又はＡＤＣＣ又はＣＤＣの向上）についてスクリーニングされた産物に導入されていてもよい。
Figure 2022511396000002
アミノ酸は、一般的な側鎖の性質に従って分類することができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバを別のクラスと交換することを伴う。
用語「アミノ酸配列変異体」とは、親抗原結合分子（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基中にアミノ酸置換が存在する実質的な変異体を含む。一般的に、更なる試験のために選択され、得られた変異体は、親抗原結合分子と比較して、特定の生物学的特性の修飾（例えば、改良）（例えば、親和性の増加、免疫原性の低下）を有し、及び／又は親抗原結合分子の特定の生物学的特性を実質的に保持しているだろう。例示的な置換変異体は、親和性成熟した抗体であり、例えば、本明細書に記載されるようなファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用い、簡便に生成されてもよい。簡単に述べれば、１つ以上のＨＶＲ残基は、変異しており、ファージディスプレイされ、特定の生体活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされた変異体抗原結合分子である。ある特定の実施形態では、置換、挿入又は欠失は、そのような変更が、抗原結合分子が抗原に結合する能力を実質的に減らさない限り、１つ以上のＨＶＲ内で起こってもよい。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的変更（例えば、本明細書に提供される保存的置換）が、ＨＶＲ中に作られてもよい。変異を標的とし得る抗体の残基又は領域の同定のための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ及びＷｅｌｌｓ（１９８９年）「Ｓｃｉｅｎｃｅ」第２４４巻、第１０８１～１０８５頁によって記載されるように、「アラニンスキャンニング突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、抗体と抗原との相互作用が影響を受けるかどうかを決定するために、残基又は標的残基群（例えば、荷電残基、例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＧｌｕ）が同定され、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）によって置き換えられる。更なる置換が、初期置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置に導入されてもよい。これに代えて、又はこれに加えて、抗体と抗原との間の接触点を同定するための、抗原－抗原結合分子複合体の結晶構造。そのような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的とされるか、又は除去されてもよい。変異体をスクリーニングして、それらが所望の性質を含有するかどうかを決定してもよい。
アミノ酸配列挿入として、１個の残基から１００個以上の残基を含むポリペプチドまでの長さ範囲のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端の融合、並びに１個又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する、本発明の二重特異性抗原結合分子が挙げられる。分子の他の挿入変異体としては、二重特異性抗原結合分子の血清半減期を増加させる、Ｎ又はＣ末端の、ポリペプチドへの融合が挙げられる。
ある特定の態様では、本明細書において提供する二重特異性抗原結合分子が改変され、抗体がグリコシル化される程度が増加又は低下される。１つ以上のグリコシル化部位が作製される、又は取り除かれるように、アミノ酸配列を改変することにより、分子のグリコシル化変異体を便利に入手することができる。ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子がＦｃ領域を含む場合において、Ｆｃ領域に付着した炭水化物を改変することができる。哺乳動物細胞によって産生された天然抗体は、典型的には、Ｎ結合によってＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に一般に結合される分岐状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔら、「ＴＩＢＴＥＣＨ」第１５巻、第２６～３２頁（１９９７年）を参照されたい。オリゴ糖には、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分岐型オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースが含まれ得る。いくつかの実施形態では、特定の改善された性質を有する変異体を作製するために、ＴＮＦファミリリガンド三量体含有抗原結合分子内でオリゴ糖の修飾を行うことができる。一態様では、Ｆｃ領域に（直接又は間接的に）結合したフコースを欠く炭水化物構造を有する、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の変異体が提供される。このようなフコシル化変異体は、改良されたＡＤＣＣ機能を有していてもよい。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）又は米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（協和発酵バイオ株式会社）を参照。別の態様では、バイセクトオリゴ糖を含む、例えば、Ｆｃ領域に結合した二分枝オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃにより二分割されている、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の変異体が提供される。このような変異体は、フコシル化の低下及び／又はＡＤＣＣ機能の向上を有していてもよく、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Ｊｅａｎ－Ｍａｉｒｅｔら）、米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａら）及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Ｕｍａｎａら）を参照のこと。Ｆｃ領域に接続したオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を有する変異体も提供される。このような抗体変異体は、改良されたＣＤＣ機能を有する場合があり、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号（Ｐａｔｅｌら）、国際公開第１９９８／５８９６４号（Ｒａｊｕ、Ｓ．）及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Ｒａｊｕ、Ｓ．）に記載される。
ある特定の態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のシステイン操作された変異体、例えば、分子の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている「チオＭＡｂ」を作成することが望ましい場合がある。特定の態様では、置換された残基は、分子の利用しやすい部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基を抗体の接触可能部位に位置させ、これを使用して抗体を他の部分、例えば薬物部分又はリンカ－薬物部分にコンジュゲートしてイムノコンジュゲートを作り出すことができる。ある特定の態様では、任意の１つ以上の以下の残基をシステインで置換してよい：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）、重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）、及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン操作された抗原結合分子は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されるように作成されてもよい。
用語「ポリヌクレオチド」とは、単離核酸分子又はコンストラクト、例えばメッセンジャＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来ＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、従来のホスホジエステル結合又は従来の結合以外の結合（例えば、アミド結合、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）中に見出されるもの）を含んでいてもよい。用語「核酸分子」とは、ポリヌクレオチド中に存在する、任意の１つ以上の核酸セグメント、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。
「単離」核酸分子又はポリヌクレオチドとは、その天然環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡ、又はＲＮＡを意図している。例えば、ベクタにおいて含有されるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されていると考えられる。単離されたポリヌクレオチドの更なる例としては、異種性宿主細胞において維持された組換えポリヌクレオチド、又は溶液中の精製された（部分的に又は実質的に）、ポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたポリヌクレオチドは、元々ポリヌクレオチド分子を含有する細胞において含有されているポリヌクレオチド分子を含むが、ポリヌクレオチド分子は、染色体外に存在するか、又はその天然の染色***置とは異なる染色***置に存在する。単離されたＲＮＡ分子は、インビボ又はインビトロでの本発明のＲＮＡ転写物、及びポジティブ及びネガティブの鎖形態、二本鎖形態を含む。本発明による単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、合成によって産生されるこのような分子を更に含む。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモータ、リボソーム結合部位、又は転写ターミネータなどの調節要素であってもよく、又は調節エレメントを含んでいてもよい。
本発明の参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも、例えば９５％「同一の」ヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドとは、このポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、ポリヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列の１００ヌクレオチド当たり５個までの点変異を含んでいてもよいことを除けば、参照配列に対して同一であることを意図している。言い換えると、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列内のヌクレオチドの５％までが、欠失していてもよく、若しくは別のヌクレオチドで置換されていてもよく、又は参照配列内の全ヌクレオチドの５％までが、参照配列内へと挿入されていてもよい。参照配列のこれらの変更は、参照ヌクレオチド配列の５’末端位置若しくは３’末端位置で、又は、５’末端位置と３’末端位置との間の、参照配列内の残基間で個々においてか若しくは参照配列内での１つ以上の連続した基においてかのいずれかに点在しているどこかで起こってもよい。実際の様式として、任意の特定のポリヌクレオチド配列が、本発明のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、既知のコンピュータプログラム、例えば、ポリペプチドについて上に記載したもの（例えば、ＡＬＩＧＮ－２）を用いて、従来通りに決定することができる。
用語「発現カセット」とは、標的細胞内での特定の核酸の転写を可能にする一連の指定された核酸エレメントを含む、組換え的に又は合成的に作製されたポリヌクレオチドを指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片へと組み込むことができる。典型的には、発現ベクタの組換え発現カセット部分は、配列の中でも特に、転写される核酸配列と、プロモータとを含む。ある特定の実施形態では、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む。
用語「ベクタ」又は「発現ベクタ」とは、「発現コンストラクト」と同義であり、それが標的細胞内で動作可能に会合された特定の遺伝子を導入し、その発現を指示するために使用されるＤＮＡ分子を指す。本用語は、自己複製する核酸構造としてのベクタ、及びベクタが導入された宿主細胞のゲノム内へと組み込まれたベクタを含む。本発明の発現ベクタは、発現カセットを含む。発現ベクタによって、安定したｍＲＮＡの多量の転写が可能となる。いったん発現ベクタが標的細胞内に入ると、リボ核酸分子又は遺伝子によってコードされたタンパク質は、細胞の転写機構及び／又は翻訳機構によって産生される。一実施形態では、本発明の発現ベクタは、本発明の二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」とは、互換的に使用され、このような細胞の子孫を含む、外因性核酸が導入された細胞を指す。宿主細胞には、初代形質転換細胞及び継代数にかかわらずこれに由来する子孫を含む、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれる。子孫は、親細胞の核酸含有量と完全に同一でなくてもよいが、変異を含んでいてもよい。元の形質転換細胞でスクリーニング又は選択されるのと同じ機能又は生物活性を有する突然変異体子孫が本明細書に含まれる。宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子を作製するために使用され得る任意の型の細胞系である。宿主細胞としては、培養細胞、例えば、哺乳動物培養細胞、例えば、ほんの数例を挙げると、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞又はハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び植物細胞が挙げられるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織に含まれる細胞も含まれる。
薬剤の「有効量」は、投与された細胞又は組織中で生理的変化をもたらすのに必要な量を指す。
薬剤、例えば医薬組成物の「治療的有効量」は、所望の治療的又は予防的結果を達成するのに必要な投与量及び期間で有効な量を指す。薬剤の治療的有効量は、例えば、疾患の副作用を除去し、低下させ、遅延させ、最小限にし、又は予防する。
「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられるが、これらに限定されない。特に、個体又は対象は、ヒトである。
用語「医薬組成物」とは、そこに含有される有効成分の生物活性が有効になるのを可能にするような形態であり、製剤が投与される対象にとって許容できないほど毒性である追加の成分を含有しない調製物を指す。
「薬学的に許容される担体」とは、有効成分以外の医薬組成物中の成分であって、対象にとって非毒性である成分を指す。薬学的に許容される賦形剤として、限定されないが、緩衝液、安定剤、又は防腐剤が挙げられる。
用語「添付文書」とは、治療用製品の適応症、使用法、投与量、投与、併用療法、禁忌及び／又は使用に関する警告についての情報を含む、治療用製品の市販のパッケージに慣習的に含まれる説明書を指すために使用される。
本明細書で使用される場合、「治療」（及び「治療する」又は「治療すること」などのその文法的変形）は、治療している個体の自然経過を変化させようとする臨床的介入を指し、臨床病理学の予防のため又はその経過中に行うことができる。望ましい治療効果には、疾患の発生又は再発の予防、症状の緩和、疾患の任意の直接的又は間接的病理学的帰結の減弱、転移の予防、疾患の進行速度の減少、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後改善が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明の分子を使用して、疾患の発生を遅らせるか、又は疾患の進行を遅らせる。
用語「がん」とは、本明細書で使用される場合、リンパ腫、リンパ性白血病、肺がん、非小細胞肺（ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ：ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頚部がん、皮膚若しくは眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部のがん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、結腸がん、乳がん、子宮がん、卵管がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膣がん、外陰がん、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓若しくは尿管がん、腎細胞がん、腎盂がん、中皮腫、肝細胞がん、胆道がん、中枢神経系（ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ：ＣＮＳ）新生物、脊椎軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮がん、下垂体腺腫及びユーイング肉腫（上記がんのいずれかの難治性型、又は上記がんの１つ以上の組合せを含む）などの増殖性疾患を指す。
用語「化学療法剤」とは、本明細書で使用される場合、がんの治療に有用な化学化合物を指す。一態様では、化学療法剤は、代謝拮抗剤である。一態様では、代謝拮抗剤は、アミノプテリン、メトトレキサート、ペメトレキセド、ラルチトレキセド、クラドリビン、クロファラビン、フルダラビン、メルカプトプリン、ペントスタチン、チオグアニン、カペシタビン、シタラビン、フルオロウラシル、フロクスウリジン、及びゲムシタビンからなる群から選択される。特定の一態様では、代謝拮抗剤は、カペシタビン又はゲムシタビンである。別の態様では、代謝拮抗剤は、フルオロウラシルである。一態様では、化学療法剤は、微小管形成に影響を及ぼす薬剤である。一態様では、微小管形成に影響を及ぼす薬剤は、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、タキソテール、エトポシド、及びテニポシドからなる群から選択される。別の態様では、化学療法剤は、シクロホスファミドなどのアルキル化剤である。一態様では、化学療法剤は、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤などの細胞傷害性抗生物質である。一態様では、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤は、ドキソルビシンである。
本発明の二重特異性抗体
本発明は、製造可能性、安定性、結合親和性、生物活性、標的化効率、減少した毒性、患者に与えることができる拡大した投与量範囲、及びそれによりおそらく増強した有効性などの、特に有利な特性を有する新規の二重特異性抗原結合分子を提供する。
例示的二重特異性抗原結合分子
本発明は、
（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる３つの抗原結合ドメインと、
（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる１つの抗原結合ドメインと、
（ｃ）安定に会合することができる第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃ領域と、を含む、ＣＤ４０に三価結合する二重特異性抗原結合分子を提供する。
一態様では、
（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片と、
（ｂ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片と、
（ｃ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる第３のＦａｂ断片と、
（ｄ）安定した会合が可能な、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインであって、ここで、第２のＦａｂ断片（ｂ）がＶＨ－ＣＨ１鎖のＣ末端にて第１のＦａｂ断片（ａ）のＶＨ－ＣＨ１鎖のＮ末端に融合し、これは転じて、そのＣ末端にて第１のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合し、第３のＦａｂ断片（ｃ）が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端にて第２のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合する、Ｆｃドメインと、
（ｅ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるクロスｆａｂ断片であって、ここで、クロスｆａｂ断片がＦｃドメインサブユニットの１つのＣ末端に融合されている、クロスｆａｂ断片と、を含む、ＣＤ４０に三価結合する二重特異性抗原結合分子が提供される。
特定の態様では、これらの二重特異性抗原結合分子は、ＣＤ４０への標的化アゴニスト結合を特徴とする。特に、二重特異性抗原結合分子は、腫瘍関連標的細胞抗原に対して標的化されたＣＤ４０アゴニストである。別の特定の態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、エフェクタ機能を低減する突然変異を含む、安定に会合することができる第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃ領域を含む。エフェクタ機能を低減又は廃止する突然変異を含むＦｃ領域の使用によって、Ｆｃ受容体を介した架橋による非特異的アゴニズムが防止され、ＣＤ４０＋細胞のＡＤＣＣが防止される。二重特異性抗原結合分子は、天然ＣＤ４０リガンドがホモ三量体立体配置で結合するようにＣＤ４０に三価で結合しているために、これらは最適な生物活性を有するはずである。
一態様では、
（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片と、
（ｂ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片と、
（ｃ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる第３のＦａｂ断片と、
（ｄ）安定した会合が可能な、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインであって、ここで、第２のＦａｂ断片（ｂ）がＶＨ－ＣＨ１鎖のＣ末端にて第１のＦａｂ断片（ａ）のＶＨ－ＣＨ１鎖のＮ末端に融合し、これは転じて、そのＣ末端にて第１のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合し、第３のＦａｂ断片（ｃ）が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端にて第２のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合する、Ｆｃドメインと、
（ｅ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるクロスｆａｂ断片であって、ここで、クロスｆａｂ断片がＦｃドメインサブユニットの１つのＣ末端に融合されている、クロスｆａｂ断片と、からなる、ＣＤ４０に三価結合する二重特異性抗原結合分子が提供される。
特に、
（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片と、
（ｂ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片と、
（ｃ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる第３のＦａｂ断片と、
（ｄ）安定した会合が可能な、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインであって、ここで、第２のＦａｂ断片（ｂ）が第１のＦａｂ断片（ａ）のＶＨ－ＣＨ１鎖のＮ末端にペプチドリンカを介してＶＨ－ＣＨ１鎖のＣ末端で融合し、これは転じて、そのＣ末端にて第１のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合し、第３のＦａｂ断片（ｃ）が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端にて第２のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合する、Ｆｃドメインと、
（ｅ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるクロスｆａｂ断片であって、ここで、該クロスｆａｂ断片がペプチドリンカを介してＦｃドメインサブユニットの１つのＣ末端に融合されている、クロスｆａｂ断片と、からなる、二重特異性抗原結合分子が提供される。一態様では、標的細胞抗原に特異的に結合することができるクロスｆａｂ断片は、ＣＨ１及びＣＬドメインが交換され、ＶＨ－ＣＬ鎖がペプチドリンカを介してＦｃドメインサブユニットのうちの１つのＣ末端に融合されているクロスｆａｂ断片である。
別の態様では、標的細胞抗原に特異的に結合することができるクロスｆａｂ断片は、ＶＨドメイン及びＶＬドメインが交換され、ＶＬ－ＣＨ１鎖がペプチドリンカを介してＦｃドメインサブユニットのうちの１つのＣ末端に融合されているクロスｆａｂ断片である。
更に、本明細書に記載の二重特異性抗原結合分子は、ＣＤ４０に特異的に結合することができる従来の抗体に対して、典型的にはがん細胞又は腫瘍間質である標的細胞で免疫応答を選択的に誘発するという利点を有する。一態様では、腫瘍関連標的細胞抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、黒色腫随伴コンドロイチンサルフェートプロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３３からなる群から選択される。
特定の態様では、腫瘍関連標的細胞抗原は、ＦＡＰである。したがって、一態様では、本発明は、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号２のアミノ酸配列を含むか又は配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する、二重特異性抗原結合分子を提供する。
これらの二重特異性抗原結合分子は、ＣＤ４０へのＦＡＰ標的化アゴニスティック結合を特徴とする。ＦＡＰ発現細胞の存在下では、二重特異性抗原結合分子は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を活性化する、ヒトＢ細胞（実施例５．１．２）、ヒトＤａｕｄｉ細胞（実施例５．１．１）、及びヒト単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）を活性化することができる。
ＦＡＰ結合部分は、その全体が参照により含まれている、国際公開第２０１２／０２００６号に記載されている。一態様では、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び（ｉｖ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（ｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（ｖｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（ｉｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び（ｉｖ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（ｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（ｖｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
別の態様では、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号９のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号１０のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）配列番号１７のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号１８のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
一態様では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）とを含む、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインを含む。
別の態様では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ０）と、配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）とを含む、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインを含む。
別の態様では、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（ｉｉ）配列番号２０、配列番号２７、及び配列番号２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び（ｉｖ）配列番号２２、配列番号２９、及び配列番号３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（ｖ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（ｖｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
一態様では、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、及び配列番号３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、
（ｉｉ）配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、及び配列番号４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）と、を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
更なる態様では、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、
（ｂ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、
（ｃ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｄ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号４１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
特定の一態様では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）とを含む、ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインを含む。
更なる態様では、二重特異性抗原結合分子は、ＣＤ４０に特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片、第２のＦａｂ断片、及び第３のＦａｂ断片を含み、ここで、第１、第２、及び第３のＦａｂ断片は、ＣＤ４０に特異的に結合することができる同一の抗原結合ドメインを含む。
一態様では、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの各々が、（ｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（ｉｉ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（ｉｉｉ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）、及び（ｉｖ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（ｖ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（ｖｉ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
一態様では、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの各々が、配列番号４９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、配列番号５０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）とを含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
一態様では、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの各々が、
（ｉ）配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、及び配列番号５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、
（ｉｉ）配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、及び配列番号６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）と、を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
更なる態様では、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの各々が、
（ｉ）配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、及び配列番号６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、
（ｉｉ）配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、及び配列番号７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）と、を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
一態様では、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの各々は、
（ａ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５７のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｂ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｃ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５９のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｄ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６０のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｅ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５７のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｆ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｇ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５９のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｈ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６０のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｉ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５７のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｊ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｋ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５９のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｌ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６０のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｍ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５７のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｎ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｏ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５９のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｐ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
特定の態様では、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの各々が、配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号５７のアミノ酸配列を含むＶＬと、を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
更に別の態様では、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの各々が、
（ａ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６７のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｂ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６７のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｃ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６７のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｄ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６７のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｅ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｆ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｇ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｈ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６９のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｊ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６９のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｋ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号７０のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｌ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号７０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
特定の態様では、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの各々が、配列番号６１のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６７のアミノ酸配列を含むＶＬを含むか、又は、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの各々が、配列番号６４のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６７のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
ＣＤ４０及びＦＡＰへの結合を伴う二重特異性抗原結合分子
別の態様では、
（ｉ）配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、及び配列番号５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、及び配列番号６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）とをそれぞれ含む、ＣＤ４０に特異的に結合することができる３つの抗原結合ドメインと、
（ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、ＦＡＰに特異的に結合することができる１つの抗原結合ドメインと、である、本明細書中の上記で定義されたような二重特異性抗原結合分子が提供される。
更なる態様では、
（ｉ）配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、及び配列番号６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、及び配列番号７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）とをそれぞれ含む、ＣＤ４０に特異的に結合することができる３１つの抗原結合ドメインと、
（ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、ＦＡＰに特異的に結合することができる１つの抗原結合ドメインと、を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
別の態様では、
（ｉ）配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、及び配列番号５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、及び配列番号６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）とをそれぞれ含む、ＣＤ４０に特異的に結合することができる３つの抗原結合ドメインと、
（ｉｉ）配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、及び配列番号３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、及び配列番号４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）とを含む、ＦＡＰに特異的に結合することができる１つの抗原結合ドメインと、を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
更なる態様では、
（ｉ）配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、及び配列番号６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、及び配列番号７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）とをそれぞれ含む、ＣＤ４０に特異的に結合することができる３１つの抗原結合ドメインと、
（ｉｉ）配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、及び配列番号３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、及び配列番号４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）とを含む、ＦＡＰに特異的に結合することができる１つの抗原結合ドメインと、を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
特定の態様では、
（ｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）及び配列番号５７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）をそれぞれ含む、ＣＤ４０に特異的に結合することができる３つの抗原結合ドメインと、
（ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、ＦＡＰに特異的に結合することができる１つの抗原結合ドメインと、を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
ヘッド・トゥ・テール（ｈｅａｄ－ｔｏ－ｔａｉｌ）フォーマット（３＋１）の二重特異性抗原結合分子
別の態様では、
（ａ）Ｎ末端に融合されたＣＤ４０に特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片のＶＨ－ＣＨ１鎖、任意にペプチドリンカを介してＣＤ４０に特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片のＶＨ－ＣＨ１鎖、及びＦｃ領域サブユニット、を含む重鎖と、
（ｂ）ＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＨ－ＣＨ１ドメイン、Ｆｃ領域サブユニット、及び任意にペプチドリンカを介してＦｃ領域サブユニットのＣ末端に融合されたＦＡＰに特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＬ－ＣＨ１鎖を含む、重鎖と、
（ｃ）各軽鎖がＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＬドメイン及びＣＬドメインを含む、３つの軽鎖と、
（ｄ）ＦＡＰに特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＨドメイン及びＣＬドメインを含む、軽鎖と、を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
特定の一態様では、ペプチドリンカは、ＧＧＧＧＳ（配列番号９６）ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９７）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号９８）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号９９）、ＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号１００）、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号１０１）、（Ｇ４Ｓ）４（配列番号１０２）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号１０３）、ＧＳＧＳＧＮＧＳ（配列番号１０４）、ＧＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号１０５）、ＧＧＳＧＳＧ（配列番号１０６）、ＧＧＳＧ（配列番号１０７）、ＧＧＳＧＮＧＳＧ（配列番号１０８）、ＧＧＮＧＳＧＳＧ（配列番号１０９）、及びＧＧＮＧＳＧ（配列番号１１０）から選択される。特に目的のペプチドリンカは、（Ｇ４Ｓ）（配列番号９６）、（Ｇ４Ｓ）２又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９７）、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号９８）、及び（Ｇ４Ｓ）４（配列番号９９）である。
特定の一態様では、
（ａ）Ｎ末端に融合されたＣＤ４０に特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片のＶＨ－ＣＨ１鎖、ペプチドリンカを介して配列番号９６又は配列番号９７のアミノ酸配列によりＣＤ４０に特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片のＶＨ－ＣＨ１鎖、及びＦｃ領域サブユニット、を含む重鎖と、
（ｂ）ＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＨ－ＣＨ１ドメイン、Ｆｃ領域サブユニット、及び配列番号９９のペプチドリンカを介してＦｃ領域サブユニットのＣ末端に融合されたＦＡＰに特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＬ－ＣＨ１鎖を含む、重鎖と、
（ｃ）各軽鎖がＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＬドメイン及びＣＬドメインを含む、３つの軽鎖と、
（ｄ）ＦＡＰに特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＨドメイン及びＣＬドメインを含む、軽鎖と、を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
特に、配列番号７９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号８０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号７８のアミノ酸配列をそれぞれ含む３つの軽鎖と、配列番号７７のアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
別の態様では、
（ａ）Ｎ末端に融合されたＣＤ４０に特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片のＶＨ－ＣＨ１鎖、任意にペプチドリンカを介してＣＤ４０に特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片のＶＨ－ＣＨ１鎖、及びＦｃ領域サブユニット、を含む重鎖と、
（ｂ）ＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＨ－ＣＨ１ドメイン、Ｆｃ領域サブユニット、及び任意にペプチドリンカを介してＦｃ領域サブユニットのＣ末端に融合されたＦＡＰに特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＨ－ＣＬ鎖を含む、重鎖と、
（ｃ）各軽鎖がＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＬドメイン及びＣＬドメインを含む、３つの軽鎖と、
（ｄ）ＦＡＰに特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＬドメイン及びＣＨ１ドメインを含む、軽鎖と、を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
特定の一態様では、
（ａ）Ｎ末端に融合されたＣＤ４０に特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片のＶＨ－ＣＨ１鎖、ペプチドリンカを介して配列番号９６又は配列番号９７のアミノ酸配列によりＣＤ４０に特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片のＶＨ－ＣＨ１鎖、及びＦｃ領域サブユニット、を含む重鎖と、
（ｂ）ＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＨ－ＣＨ１ドメイン、Ｆｃ領域サブユニット、及び配列番号９９のペプチドリンカを介してＦｃ領域サブユニットのＣ末端に融合されたＦＡＰに特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＨ－ＣＬ鎖を含む、重鎖と、
（ｃ）各軽鎖がＣＤ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＬドメイン及びＣＬドメインを含む、３つの軽鎖と、
（ｄ）ＦＡＰに特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＬドメイン及びＣＨドメインを含む、軽鎖と、を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
特に、配列番号８３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号８４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号８２のアミノ酸配列をそれぞれ含む３つの軽鎖と、配列番号８１のアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクタ機能を低減するＦｃドメイン修飾
本発明の二重特異性抗原結合分子は、安定した会合が可能な、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを更に含む。
ある特定の態様では、１つ以上のアミノ酸修飾は、本明細書で提示される抗体のＦｃ領域に導入されてもよく、それにより、Ｆｃ領域変異体を作成する。Ｆｃ領域変異体は、１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含み得る。
Ｆｃドメインは、本発明の二重特異性抗体に、標的組織への良好な蓄積に寄与する長い血清半減期、望ましい組織－血液分布比を含め、望ましい薬物動態特性を与える。しかし、同時に、好ましい抗原を含む細胞ではなく、Ｆｃ受容体を発現する細胞に対する本発明の二重特異性抗体の望ましくない標的化を引き起こす場合がある。したがって、特定的な実施形態では、本発明の二重特異性抗体のＦｃドメインは、天然ＩｇＧ Ｆｃドメイン、特に、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４ ドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクタ機能の低下を示す。より具体的には、ＦｃドメインはＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。
１つのこのような態様では、Ｆｃドメイン（又は上記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）は、天然ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（又は天然ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の５０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満の結合親和性を示し、及び／又は天然ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（又は天然ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）と比較して、５０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満のエフェクタ機能を示す。一態様では、Ｆｃドメイン（又は上記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）は、Ｆｃ受容体に実質的に結合せず、及び／又はエフェクタ機能を誘発しない。特定の態様では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。特定の態様では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａであり、最も特定的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一態様では、Ｆｃ受容体は、阻害性Ｆｃ受容体である。特定の態様では、Ｆｃ受容体は、阻害性ヒトＦｃγ受容体、より具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＢである。一態様では、エフェクタ機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びサイトカイン分泌のうち１つ以上である。特定の態様では、エフェクタ機能は、ＡＤＣＣである。一態様では、Ｆｃドメインのドメインは、天然ＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対して実質的に同様の結合親和性を示す。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合は、Ｆｃドメイン（又は該Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）が、天然ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（又は天然ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）と比較して、ＦｃＲｎに対して約７０％より大きく、特に約８０％より大きく、より特定的には約９０％より大きい結合親和性を示す場合に達成される。
特定の態様では、Ｆｃドメインは、操作されていないＦｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性が低下し、及び／又はエフェクタ機能が低下するように操作される。特定の態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性及び／又はエフェクタ機能を下げる１つ以上のアミノ酸変異を含む。典型的には、Ｆｃドメインの２つのサブユニットそれぞれに、同じ１つ以上のアミノ酸変異が存在する。一態様では、アミノ酸変異は、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を下げる。別の態様では、アミノ酸変異は、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を、少なくとも２分の１、少なくとも５分の１、又は少なくとも１０分の１に下げる。一態様では、操作されたＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子は、操作されていないＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の２０％未満、特に１０％未満、より特定的には５％未満を示す。特定の態様では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。別の態様では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体は、阻害性Ｆｃ受容体である。特定の態様では、Ｆｃ受容体は、阻害性ヒトＦｃγ受容体、より具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＢである。いくつかの態様では、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。特定の態様では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａであり、最も特定的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである。好ましくは、これらそれぞれの受容体に対する結合が低下する。いくつかの態様では、補体成分に対する結合親和性（具体的には、Ｃ１ｑに対する結合親和性）も低下する。一態様では、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性は、低下しない。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合（すなわち、上記受容体に対するＦｃドメインの結合親和性の保護）は、Ｆｃドメイン（又は上記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子）が、ＦｃＲｎに対するＦｃドメインの操作されていない形態（又はＦｃのこの操作されていない形態を含む本発明の二重特異性抗原結合分子）の結合親和性の約７０％を超える結合親和性を示す場合に達成される。Ｆｃドメイン、又は上記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子は、このような親和性の約８０％より大きく、更に約９０％より大きい親和性を示してもよい。ある特定の実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、操作されていないＦｃドメインと比較して、エフェクタ機能が低下するように操作される。エフェクタ機能の低下としては、限定されないが、以下の１つ以上が挙げられ得る：補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低下、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低下、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）の低下、サイトカイン分泌の低下、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの低下、ＮＫ細胞に対する結合の低下、マクロファージに対する結合の低下、単球に対する結合の低下、多形核細胞に対する結合の低下、直接的なシグナル伝達誘発性アポトーシスの低下、樹状細胞成熟の低下、又はＴ細胞プライミングの低下。
エフェクタ機能が低下した抗体としては、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の１つ以上の置換を有するものが挙げられる（米国特許第６，７３７，０５６号）。このようなＦｃ突然変異体には、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体を含む、アミノ酸２６５位、２６９位、２７０位、２９７位、及び３２７位の２つ以上での置換を有するＦｃ突然変異体が含まれる（米国特許第７，３３２，５８１号）。ＦｃＲへの結合が向上又は低下した特定の抗体変異体について記載されている。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号、国際公開第２００４／０５６３１２号、及びＳｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」第２７６巻（２００１年）第６５９１～６６０４頁）。
本発明の一態様では、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の位置にアミノ酸置換を含む。いくつかの態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（「ＬＡＬＡ」）を含む。１つのこのような実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。一態様では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位にアミノ酸置換を含む。より具体的な態様では、アミノ酸置換は、Ｐ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである。一実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位にアミノ酸置換を含み、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓからなる群から選択される更なるアミノ酸置換を含む。より特定的な実施形態では、Ｆｃドメインは、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含む（「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」）。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」の組合せは、ＰＣＴ出願国際公開第２０１２／１３０８３１Ａ１号に記載されるように、ヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインのＦｃγ受容体の結合をほとんど完全になくす。該文献はまた、このような変異体Ｆｃドメインを調製する方法及びＦｃ受容体の結合又はエフェクタ機能などの特性を決定する方法も記載する。かかる抗体は、突然変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを有する、又は突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇを有するＩｇＧ１である（ＫａｂａｔらのＥＵインデックスによる番号付け、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、アメリカ国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ、１９９１年）。
一態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。より具体的な実施形態では、Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８（Ｋａｂａｔ番号付け）にアミノ酸置換、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。より具体的な実施形態では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＳ２２８Ｐ及びＰ３２９Ｇを含む、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。このアミノ酸置換は、インビボでのＩｇＧ４抗体のＦａｂアーム交換を減少させる（Ｓｔｕｂｅｎｒａｕｃｈら、「Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ」第３８巻、第８４～９１頁（２０１０年）を参照のこと）。
半減期が長くなり、新生児Ｆｃ受容体に対する結合が向上した抗体は、胎児に対する成熟ＩｇＧの移動を担い（Ｇｕｙｅｒ，Ｒ．Ｌ．ら、「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」第１１７巻（１９７６年）第５８７～５９３頁及びＫｉｍ，Ｊ．Ｋ．ら、「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」第２４巻（１９９４年）第２４２９～２４３４年）、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を向上する１つ以上の置換基を有するＦｃ領域を含む。そのようなＦｃ変異体としては、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４のうち１つ以上における置換、例えばＦｃ領域残基４３４の置換を伴う変異体が挙げられる（米国特許第７，３７１，８２６号）。Ｆｃ領域変異体の他の例に関して、Ｄｕｎｃａｎ，Ａ．Ｒ．及びＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．、「Ｎａｔｕｒｅ」第３２２巻（１９８８年）第７３８～７４０頁；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；及び国際公開第９４／２９３５１号も参照されたい。
Ｆｃ受容体に対する結合は、例えば、ＥＬＩＳＡによって、又はＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な装置と組換え発現によって得られ得るＦｃ受容体を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、容易に決定することができる。適切なこのような結合アッセイを本明細書に記載する。あるいは、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメイン又はＦｃドメインを含む細胞活性化二重特異性抗原結合分子の結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株（例えば、ＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞）を用いて評価されてもよい。Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子のエフェクタ機能は、当該技術分野において既知の方法により測定することができる。ＡＤＣＣを測定するのに適したアッセイを本明細書に記載する。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの他の例は、米国特許第５，５００，３６２号、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ」第８３巻、第７０５９～７０６３頁（１９８６年）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ」第８２巻、第１４９９～１５０２頁（１９８５年）、米国特許第５，８２１，３３７号、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、「Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ」第１６６巻、第１３５１～１３６１頁（１９８７年）に記載される。あるいは、非放射性アッセイ方法を使用してもよい（例えば、フローサイトメトリ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）のためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害アッセイ、及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン））。そのようなアッセイに有用なエフェクタ細胞としては、末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ：ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ：ＮＫ）細胞が挙げられる。これに代えて、又はこれに加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら、「Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ」第９５巻、第６５２～６５６頁（１９９８年）に開示されるような動物モデルにおいて評価されてもよい。
以下の章は、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクタ機能を低下させるＦｃドメイン修飾を含む、本発明の二重特異性抗原結合分子の好ましい態様を記載する。一態様では、本発明は、二重特異性抗原結合分子（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと、（ｃ）安定に会合することができる第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメイン（ＦｃドメインがＦｃ受容体、特にＦｃγ受容体に対する抗体の結合親和性を減少させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む）とに関する。別の態様では、本発明は、（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと、（ｂ）ＦＡＰに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと、（ｃ）安定に会合することができる第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、を含む二重特異性抗原結合分子であって、ここで、Ｆｃドメインがエフェクタ機能を低減する１つ以上のアミノ酸置換を含む、二重特異性抗原結合分子に関する。特定の態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を有する、ヒトＩｇＧ１サブクラスのＦｃドメインである。
ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメイン修飾
本発明の二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの片方又はもう一方に融合した異なる抗原結合部位を含み、そのため、Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、２つの非同一ポリペプチド鎖に含まれていてもよい。これらのポリペプチドの組換え同時発現及びその後の二量体化によって、２つのポリペプチドのいくつかの可能な組合せが生じる。組換え産生における本発明の二重特異性抗原結合分子の収率及び純度を高めるために、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインに、所望なポリペプチドの会合を促進する修飾を導入することが有利である。
したがって、特定の態様では、本発明は、（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメイン、及び（ｃ）安定した会合が可能な、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含み、Ｆｃドメインが、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む二重特異性抗原結合分子に関する。ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインの２つのサブユニット間の最も長いタンパク質－タンパク質相互作用の部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン内にある。したがって、一態様では、該修飾は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインの中にある。
具体的な態様では、該修飾は、いわゆる「ノブ・イントゥ・ホール」修飾であり、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの１つに「ノブ」修飾と、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの他の１つに「ホール」修飾とを含む。したがって、本発明は、（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと、（ｃ）安定に会合することができる第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、を含む二重特異性抗原結合分子であって、ここで、ノブ・イントゥ・ホール法により、Ｆｃドメインの第１のサブユニットがノブを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットがホールを含む、二重特異性抗原結合分子に関する。特定の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵ番号付け）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＹ４０７Ｖを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
ノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、米国特許第７，６９５，９３６号、Ｒｉｄｇｗａｙら、「Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ」第９巻、第６１７～６２１頁（１９９６年）及びＣａｒｔｅｒ、「Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ」第２４８巻、第７～１５頁（２００１年）に記載される。一般的に、この方法は、第１のポリペプチドの界面にある突起部（「ノブ」）と、第２のポリペプチドの界面にある空洞（「ホール」）とを導入することを含み、その結果、突起部が、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨害するように空洞内に位置することができる。突起部は、第１のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と交換することによって構築される。突起部と同一又は同様の大きさの相補性空洞が、大きなアミノ酸側鎖を、より小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はトレオニン）と置き換えることによって、第２のポリペプチドの界面に作られる。
したがって、一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より大きな側鎖容積を有するアミノ酸残基と置き換わり、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞内で位置換え可能な第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に突起を生成し、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より小さな側鎖容積を有するアミノ酸残基と置き換わり、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に空洞を生成し、その中で、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起が位置換え可能である。突起部及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を変えることによって、例えば、部位特異的変異導入法によって、又はペプチド合成によって作り出すことができる。特定の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のトレオニン残基が、トリプトファン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニット（のＣＨ３ドメイン）において、４０７位のチロシン残基は、バリン残基と置き換わっている（Ｙ４０７Ｖ）。一態様では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、更に、３６６位のトレオニン残基が、セリン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基が、アラニン残基と置き換わっている（Ｌ３６８Ａ）。
なお更なる態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、更に、３５４位のセリン残基が、システイン残基と置き換わっており（Ｓ３５４Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、更に、３４９位のチロシン残基が、システイン残基と置き換わっている（Ｙ３４９Ｃ）。これら２つのシステイン残基の導入によって、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間にジスルフィド架橋が生成し、二量体を更に安定化する（Ｃａｒｔｅｒ（２００１年）「Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ」第２４８巻、第７～１５頁）。特定の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵ番号付け）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＹ４０７Ｖを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
代替的な態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾は、例えばＰＣＴ公開である国際公開第２００９／０８９００４号に記載されるように、静電ステアリング効果を媒介する修飾を含む。一般的に、この方法は、２つのＦｃドメインサブユニットの界面に、ホモ二量体生成が静電的に望ましくないが、ヘテロ二量体化が静電的に望ましいように、帯電したアミノ酸残基による１つ以上のアミノ酸残基の置き換えを含む。
本明細書に報告されるような二重特異性抗体の重鎖のＣ末端は、アミノ酸残基ＰＧＫで終わる完全なＣ末端であってもよい。重鎖のＣ末端は、Ｃ末端アミノ酸残基のうち１つ又は２つが除去された、短くなったＣ末端であってもよい。好ましい一態様では、重鎖のＣ末端は、ＰＧで終わる短くなったＣ末端である。本明細書に報告される全ての態様のうちの一態様では、本明細書に明記されるＣ末端のＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む二重特異性抗体は、Ｃ末端グリシン－リジンジペプチドを含む（Ｇ４４６及びＫ４４７、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。本明細書に報告される全ての態様のうちの一実施形態では、本明細書に明記されるＣ末端のＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む二重特異性抗体は、Ｃ末端グリシン残基を含む（Ｇ４４６、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
Ｆａｂドメインの修飾
一態様では、本発明は、（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片と、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片と、（ｃ）安定に会合することができる第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、を含む二重特異性抗原結合分子であって、ここで、Ｆａｂ断片の一方で、可変ドメインＶＨ及びＶＬ、又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬが交換されている、二重特異性抗原結合分子に関する。二重特異性抗体は、Ｃｒｏｓｓｍａｂ技術に従って調製される。
１つの結合アームにドメインの置き換え／交換を有する多重特異性抗体（ＣｒｏｓｓＭａｂ ＶＨ－ＶＬ又はＣｒｏｓｓＭａｂ ＣＨ－ＣＬ）は、国際公開第２００９／０８０２５２号及びＳｃｈａｅｆｅｒ，Ｗ．ら、「ＰＮＡＳ」第１０８巻（２０１１年）第１１１８７～１１９１号に記載される。これらの多重特異性抗体は、明確に、第１の抗原に対する軽鎖と、第２の抗原に対する誤った重鎖のミスマッチにより生じる副産物を減らす（このようなドメインの置き換えがない手法と比較した場合）。
一態様では、本発明は、（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片と、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片と、（ｃ）安定に会合することができる第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、を含む二重特異性抗原結合分子であって、ここで、Ｆａｂ断片の一方で、ＣＨ１ドメインが軽鎖の一部となり、ＣＬドメインが重鎖の一部となるように、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換えられている、二重特異性抗原結合分子に関する。より具体的には、標的細胞抗原に特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片において、ＣＨ１ドメインが軽鎖の一部となり、ＣＬドメインが重鎖の一部となるように、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は互いに置き換えられている。
特定の態様では、本発明は、（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片と、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片と、を含む二重特異性抗原結合分子であって、ここで、ＣＨ１ドメインが軽鎖の一部となり、ＣＬドメインが重鎖の一部となるように、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換えられている、二重特異性抗原結合分子に関する。このような分子は、一価二重特異性抗原結合分子と呼ばれる。
別の態様では、本発明は、（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片及びＦｃドメインを含む抗体の２つの軽鎖及び２つの重鎖と、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つの追加のＦａｂ断片と、を含む二重特異性抗原結合分子であって、ここで、該追加のＦａｂ断片がそれぞれ、ペプチドリンカを介して（ａ）の重鎖のＣ末端に接続されている、二重特異性抗原結合分子に関する。特定の態様では、追加のＦａｂ断片は、ＶＨドメインが軽鎖の一部となり、ＶＬドメインが重鎖の一部となるように、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられている、Ｆａｂ断片である。
よって、特定の態様では、本発明は、（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片及びＦｃドメインを含む抗体の２つの軽鎖及び２つの重鎖と、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つの追加のＦａｂ断片と、を含む二重特異性抗原結合分子であって、ここで、該標的細胞抗原に特異的に結合することができる２つの追加のＦａｂ断片が、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられており、ＶＬ－ＣＨ鎖がそれぞれ、ペプチドリンカを介して（ａ）の重鎖のＣ末端に接続されているクロスオーバＦａｂ断片である、二重特異性抗原結合分子を含む。
別の態様では、正確なペアリングを更に改善するために、（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片と、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片と、（ｃ）安定に会合することができる第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、を含む二重特異性抗原結合分子は、異なる荷電アミノ酸置換（いわゆる「荷電残基」）を含むことができる。これらの修飾は、交差しているか、又は交差していないＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインに導入される。特定の態様では、本発明は、ＣＬドメインの１つにおいて、１２３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）で置換されており、及び／又は１２４位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がリジン（Ｋ）で置換されており、ここで、ＣＨ１ドメインの１つにおいて、１４７位（ＥＵ番号付け）、及び／又は２１３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）で置換されている。二重特異性抗原結合分子に関する。
ポリヌクレオチド
本発明は更に、本明細書に記載した二重特異性抗原結合分子、又はその断片をコードする単離核酸を提供する。
本発明の二重特異性抗原結合分子をコードする単離ポリヌクレオチドは、完全な抗原結合分子をコードする単一のポリヌクレオチドとして発現されてもよく、又は同時発現される複数の（例えば、２つ以上の）ポリヌクレオチドとして発現されてもよい。一緒に発現するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合又は他の手段を介して会合し、機能的な抗原結合分子を形成してもよい。例えば、免疫グロブリンの軽鎖部分は、免疫グロブリンの重鎖部分由来の別個のポリヌクレオチドによってコードされてもよい。同時発現する場合、重鎖ポリペプチドは、軽鎖ポリペプチドと会合し、免疫グロブリンを形成する。
いくつかの態様では、単離ポリヌクレオチドは、本明細書に記載する本発明に係る二重特異性分子に含まれるポリペプチドをコードする。
一態様では、本発明は、（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと、（ｂ）標的細胞抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインと、（ｃ）安定に会合することができる第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、を含む二重特異性抗原結合分子をコードする単離ポリヌクレオチドに関する。
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチド又は核酸は、ＤＮＡである。他の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡであり、例えば、メッセンジャＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。本発明のＲＮＡは、一本鎖又は二本鎖であってもよい。
組換え方法
本発明の二重特異性抗原結合分子は例えば、組換え産生により入手することができる。組換え産生のために、二重特異性抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを提供する。二重特異性抗原結合分子をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを単離して、宿主細胞で更にクローニング及び／又は発現するために、１つ以上のベクタに挿入する。このようなポリヌクレオチドは、従来の手順を用い、容易に単離され、配列決定されてもよい。本発明の一態様では、本発明のポリヌクレオチドの１つ以上を含むベクタ、好ましくは発現ベクタを提供する。当業者に周知の方法を用いて、適切な転写／翻訳制御シグナルに従い、二重特異性抗原結合分子（断片）のコード配列を含有する発現ベクタを構築することができる。これらの方法としては、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術及びインビボ組換え／遺伝子組換えが挙げられる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、「ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク（１９８９年）；及びＡｕｓｕｂｅｌら、「ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ」、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ及び Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク（１９８９年）に記載の技術を参照されたい。発現ベクタは、プラスミド、ウイルスの一部であってもよく、又は核酸断片であってもよい。発現ベクタは、プロモータ及び／又は他の転写若しくは翻訳制御エレメントと動作可能に会合した、二重特異性抗原結合分子又はそのポリペプチド断片（すなわち、コード領域）をコードするポリヌクレオチドをクローニングする発現カセットを含む。本明細書で使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないものの、コード領域の一部とみなすことができるが、存在する場合、任意の隣接配列、例えばプロモータ、リボソーム結合部位、転写ターミネータ、イントロン、５’及び３’非翻訳領域などはコード領域の一部ではない。２つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチド構築物中に例えば、単一のベクタ上に存在していてもよく、又は別個のポリヌクレオチドコンストラクト中に例えば別個の（異なる）ベクタ上に存在していてもよい。更に、任意のベクタは、単一のコード領域を含んでいてもよく、又は２つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクタは、１つ以上のポリペプチドをコードしてもよく、翻訳後又は翻訳と同時に、タンパク質分解による開裂によって、最終的なタンパク質へと分離される。更に、本発明のベクタ、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明の二重特異性抗原結合分子、若しくはそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド、又はその変異体若しくは誘導体に融合している、又は非融合であるいずれかの、異種コード領域をコードすることができる。異種コード領域は、限定されないが、分泌シグナルペプチド又は異種機能ドメインなどの特殊エレメント又はモチーフを含む。作動可能な会合は、ある遺伝子産物（例えば、ポリペプチド）のコード領域が、制御配列の影響下又は制御下で、遺伝子産物の発現を行うような様式で、１つ以上の制御配列と会合する。２つのＤＮＡ断片（例えば、ポリペプチドコード領域及びこれに関連するプロモータ）は、プロモータ機能の導入によって、所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写が起こる場合、２つのＤＮＡ断片間の結合の性質が、遺伝子産物の発現を試行する発現制御配列の能力を妨害しないか、又はＤＮＡテンプレートを転写する能力を妨害しない場合、「作動可能に会合する」。したがって、プロモータ領域は、プロモータが核酸の転写を行うことが可能な場合、ポリペプチドをコードする核酸と作動可能に会合していてもよい。プロモータは、所定の細胞内でのＤＮＡの実質的な転写のみに指向する細胞特異的なプロモータであってもよい。プロモータ以外の他の転写制御エレメント、例えば、エンハンサ、オペレータ、転写停止シグナルは、細胞特異的な転写に指向するために、ポリヌクレオチドに作動可能に会合してもよい。
適切なプロモータ及び他の転写制御領域は、本明細書に開示される。種々の転写制御領域が当業者に知られている。これらとしては、限定されないが、脊椎動物細胞内で機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモータ及びエンハンサセグメント（例えば、最初期プロモータ、イントロン－Ａと組み合わせる）、シミアンウイルス４０（例えば、初期プロモータ）及びレトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス）が挙げられる。他の転写制御領域としては、脊椎動物遺伝子から誘導されるもの、例えば、アクチン、ヒートショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギａ－グロビン、及び真核細胞において遺伝子発現を制御することが可能な他の配列が挙げられる。更なる適切な転写制御領域としては、組織特異的なプロモータ及びエンハンサ、及び誘発性プロモータ（例えば、プロモータ誘発性テトラサイクリン）が挙げられる。同様に、種々の翻訳制御エレメントは、当業者に知られている。これらとしては、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び停止コドン、ウイルス系から誘導されるエレメント（特に、内部リボソーム侵入部位、すなわちＩＲＥＳ、ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる）が挙げられる。発現カセットは、例えば、複製の起源及び／又は染色体組込みエレメント、例えば、レトロウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）末端逆位配列（ＩＴＲ）などの他の特徴も含んでいてもよい。
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、分泌又はシグナルペプチドをコードする更なるコード領域と会合してもよく、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指向する。例えば、二重特異性抗原結合分子又はそのポリペプチド断片の分泌が所望される場合、シグナル配列をコードするＤＮＡを、本発明の二重特異性抗原結合分子、又はそのポリペプチド断片をコードする核酸の上流に配置することができる。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、シグナルペプチド又は分泌リーダ配列を有しており、これらは、粗い小胞体を通って成長したタンパク質鎖が外に出始めると、成熟タンパク質からは開裂する。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが、一般的に、ポリペプチドのＮ末端に融合するシグナルペプチドを有しており、ポリペプチドの分泌した形態又は「成熟」形態を生成するために、翻訳されたポリペプチドから開裂することを知っている。ある特定の実施形態では、天然シグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチドが使用されるか、又は作動可能に会合するポリペプチドの分泌を指向する能力を保持する配列の機能性誘導体が使用される。又は、異種哺乳動物シグナルペプチド、又はその機能性誘導体を使用してもよい。例えば、野生型リーダ配列をヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔｉｓｓｕｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ：ＴＰＡ）又はマウスβ－グルクロニダーゼのリーダ配列で置換してもよい。
後での精製（例えば、ヒスチジンタグ）を容易にする、又は、融合タンパク質の標識を補助するために使用可能な、短いタンパク質配列をコードするＤＮＡを、本発明の二重特異性抗原結合分子、又はそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドの中に、又はその末端に含めることができる。
本発明の更なる態様では、本発明の１つ以上のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。ある特定の態様では、本発明の１つ以上のベクタを含む宿主細胞を提供する。ポリヌクレオチド及びベクタは、それぞれポリヌクレオチド及びベクタに関連して本明細書に記載する特徴のいずれかを単独で、又は組み合わせて組み込んでもよい。一態様では、宿主細胞は、本発明の本発明の二重特異性抗原結合分子（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクタを含む（例えば、これにより形質転換されている、又はこれがトランスフェクトされている）。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」との用語は、本発明の融合タンパク質又はその断片を生成するように操作することが可能な任意の種類の細胞系を指す。抗原結合分子を複製し、発現を補助するのに適した宿主細胞は、当該技術分野で周知である。このような細胞は、適切な場合、特定の発現ベクタを用いてトランスフェクトされるか、又は形質導入されてもよく、大規模発酵機に接種するために大量のベクタを含む細胞を成長させ、臨床用途に充分な量の抗原結合分子を得ることができる。適切な宿主細胞としては、原核微生物（例えば、大腸菌）又は種々の真核生物細胞、例えば、チャイニーズハムスタ卵巣細胞（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌ：ＣＨＯ）、昆虫細胞などが挙げられる。例えば、ポリペプチドは、特にグリコシル化が必要とされない場合には、細菌内で産生されてもよい。発現後、ポリペプチドを細菌細胞ペーストから可溶性画分で単離し、更に精製することができる。原核生物に加え、真核生物の微生物、例えば、糸状菌又は酵母は、ポリペプチドをコードするベクタに適切なクローニング又は発現の宿主であり、グリコシル化経路が「ヒト化」された真菌株及び酵母株を含み、部分的又は完全にヒトグリコシル化パターンを有するポリペプチドを産生する。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ、「Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ」第２２巻、第１４０９～１４１４頁（２００４年）及びＬｉら、「Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ」第２４巻、第２１０～２１５頁（２００６年）を参照。
（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞も、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。数多くのバキュロウイルス株が同定されており、特に、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、これを昆虫細胞と組み合わせて使用してもよい。植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、及び同第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物で抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載している）を参照されたい。脊椎動物細胞も、宿主として使用されてもよい。例えば、懸濁物中で成長するように適合した哺乳動物細胞株が有用な場合がある。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胎児性腎株（例えば、Ｇｒａｈａｍら、「Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．」、第３６巻、第５９頁（１９７７年）に記載される２９３又は２９３Ｔ細胞）；ベビーハムスタ腎細胞（ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ：ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ、「Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ．」、第２３巻、第２４３～２５１頁（１９８０年）に記載されるＴＭ４細胞；サル腎細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳がん腫瘍細胞（ＭＭＴ ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞、例えば、Ｍａｔｈｅｒら、「Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．」、第３８３巻、第４４～６８頁（１９８２年）に記載されるもの、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞を含む、チャイニーズハムスタ卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂら、「Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ」第７７巻、第４２１６頁（１９８０年））、骨髄腫細胞株、例えば、ＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３、及びＳｐ２／０が挙げられる。タンパク質産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞株の総説としては、例えば、Ｙａｚａｋｉ及びＷｕ、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」第２４８巻（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、ニュージャージー州トトワ）第２５５～２６８頁（２００３年）を参照のこと。宿主細胞としては、培養細胞、例えば、ほんの数例を挙げると、哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞が挙げられるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織に含まれる細胞も含まれる。一実施形態では、宿主細胞は、真核細胞であり、好ましくは、哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスタ卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞又はリンパ球細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。これらの系において外来遺伝子を発現させる標準的な技術は、当該技術分野で既知である。免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖のいずれかを含むポリペプチドを発現する細胞を組み換えて、他方の免疫グロブリン鎖を発現して、発現した生成物が、重鎖及び軽鎖の両方を有する免疫グロブリンとなるようにすることができる。
一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子、又はそのポリペプチド断片の作製方法であって、本発明の二重特異性抗原結合分子、又はそのポリペプチド断片を発現するのに好適な条件下にて、本明細書において提供するように、本発明の二重特異性抗原結合分子、又はそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養することと、本発明の二重特異性抗原結合分子、又はそのポリペプチド断片を、宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から回収することと、を含む、方法を提供する。
本明細書に記載のとおりに調製される本発明の二重特異性分子は、高速液体クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、親和性クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィなどの、当該技術分野にて周知の技術により精製することができる。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には、正味の電荷、疎水性、親水性などの因子に依存し、当業者には明らかである。親和性クロマトグラフィ精製のために、二重特異性抗原結合分子が結合する抗体、リガンド、受容体、又は抗原を使用することができる。例えば、本発明の融合タンパク質を親和性クロマトグラフィ精製するために、プロテインＡ又はプロテインＧを含むマトリックスを使用することができる。連続したプロテインＡ又はＧの親和性クロマトグラフィ及びサイズ排除クロマトグラフィを用いて、実施例にて本質的に記載しているように、抗原結合分子を単離することができる。二重特異性抗原結合分子又はその断片の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィなどを含む、多種多様の周知の分析技術のいずれかにより測定することができる。例えば、実施例に記載されるように発現される二重特異性抗原結合分子は、還元又は非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって実証されるように、インタクトであり、適切に組み立てられていることが示された。
アッセイ
本明細書で提供される抗原結合分子を、当該技術分野で公知の種々のアッセイによって、その結合特性及び／又は生物活性について特徴を明らかにすることができる。特に、これらを、実施例でより詳細に記載されるアッセイによって特徴を明らかにする。
１．結合アッセイ
本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子と対応する標的発現細胞との結合は、例えば、ヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を発現するマウス線維芽細胞株及びフローサイトメトリ（ＦＡＣＳ）分析を用いることによって評価することができる。本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子とＣＤ４０との結合は、実施例２．２．８に記載されるラージ細胞を用いることによって決定することができる。
２．活性アッセイ
本発明の二重特異性抗原結合分子を生物活性について試験する。生物活性には、二重特異性抗原結合分子の有効性及び特異性が含まれ得る。有効性及び特異性は、標的抗原の結合でＣＤ４０受容体を通したアゴニストシグナル伝達を示すアッセイによって実証される。更に、二重特異性抗原結合分子とインキュベートした樹状細胞（ＤＣ）を用いて、インビトロＴ細胞プライミングアッセイを行う。
医薬組成物、製剤、及び投与経路
更なる態様では、本発明は、例えば以下の治療方法のいずれかで使用するための、本明細書において提供する二重特異性抗原結合分子のいずれかを含む医薬組成物を提供する。一実施形態では、医薬組成物は、本明細書において提供する二重特異性抗原結合分子のいずれか、及び少なくとも１種の薬学的に許容される担体を含む。別の実施形態では、医薬組成物は、本明細書において提供する二重特異性抗原結合分子のいずれかと、例えば後述する少なくとも１種の追加の治療剤とを含む。
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤に溶解又は分散した、治療的有効量の１種以上の二重特異性抗原結合分子を含む。「薬学的に又は薬理的に許容される」という句は、使用される投与量及び濃度でレシピエントにとって一般的に非毒性である、すなわち、例えば必要に応じてヒトなどの動物に投与した場合に、有害な、アレルギー性の、又は他の都合の悪い反応をもたらさない分子実体及び組成物を指す。本発明に従った少なくとも１種の二重特異性抗原結合分子、及び任意に追加の有効成分を含有する医薬組成物の調製は、参照により本明細書に組み込まれている「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１８版（Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０年）により例示されているように、本開示の見地から当業者に既知であろう。特に、組成物は、凍結乾燥製剤又は水溶液である。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、当業者に既知であろうあらゆる全ての溶媒、緩衝剤、分散媒、コーティング剤、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、塩、安定剤、及びこれらの組合せを含む。
非経口組成物としては、注射、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内、又は腹腔内注射により投与されるように設計されているものが挙げられる。注射のために、本発明の二重特異性抗原結合分子は水溶液中で、好ましくは、ハンクス溶液、リンゲル液、又は生理食塩水緩衝液などの、生理学的に適合性の緩衝剤中で製剤化することができる。溶液は、配合剤、例えば、懸濁剤、安定化剤、及び分散剤を含有していてもよい。あるいは、二重特異性抗原結合分子は使用前に、好適なビヒクル、例えば発熱性物質除去水と共に構成するための、粉末形態であることができる。滅菌注射可能溶液は、必要な場合には以下に列挙する種々の他の成分と共に、本発明の抗原結合分子を必要な量で、適切な溶媒に組み込むことによって調製される。滅菌性は、例えば、滅菌ろ過膜を通したろ過によって容易に達成され得る。一般的に、分散物は、種々の滅菌した有効成分を、塩基性分散媒体及び／又は他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液、懸濁物、又は乳化物を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、既に滅菌濾過した液体媒体から有効成分と任意の更なる所望な成分の粉末が得られる減圧乾燥又は凍結乾燥技術である。液体媒体は、必要な場合には適切に緩衝化するべきであり、注射する前に、充分な食塩水又はグルコースで液体希釈剤をまず等張性にする。組成物は、製造条件及び保存条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の混入作用から保護されなければならない。エンドトキシン汚染を安全なレベルに最小限に、例えば、０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満に維持すべきであることが認識されるだろう。適切な薬学的に許容される賦形剤としては、限定されないが、緩衝液、例えば、ホスフェート、シトレート及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド；ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルパラベン又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；単糖類、二糖類及び他の炭水化物、グルコース、マンノース又はデキストリンを含む；キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖類、例えば、ショ糖、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩を形成する対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。水性注射懸濁物は、懸濁物の粘度を上げる化合物（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストランなど）を含んでいてもよい。場合により、懸濁物は、適切な安定剤、又は高度に濃縮した溶液の調製を可能にするために、化合物の溶解度を高める薬剤も含んでいてもよい。更に、活性化合物の懸濁物は、適切な油注射懸濁物として調製されてもよい。適切な親油性溶媒又はビヒクルとしては、脂肪族油（例えば、ゴマ油）、又は合成脂肪酸エステル（例えば、エチルクリート（ｅｔｈｙｌ ｃｌｅａｔ）又はトリグリセリド）又はリポソームが挙げられる。
有効成分はまた、例えば、コアセルベーション技術によって、又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース若しくはゼラチンマイクロカプセル及びポリ－（メチルメタクリレート）マイクロカプセルにより、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロ乳濁液、ナノ粒子、及びナノカプセル）内、又はマクロ乳濁液中にも取り込まれ得る。このような技術は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（第１８版、Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０年）に開示されている。徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の適切な例としては、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、例えば、フィルム又はマイクロカプセルなどの成型物品の形態である。特定の実施形態では、注射可能組成物の持続性吸収は、吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、又はこれらの組合せ）の組成物での使用によってもたらされてもよい。
本明細書における例示的な薬学的に許容される賦形剤は、更に、間質性薬物分散剤、例えば、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）を含む。特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、ｒＨｕＰＨ２０を含め、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載される。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰを、１つ以上の更なるグリコサミノグリカナーゼ（例えば、コンドロイチナーゼ）と合わせる。
例示的な凍結乾燥した抗体製剤は、米国特許第６，２６７，９５８号に記載される。水性抗体製剤としては、米国特許第６，１７１，５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されるものが挙げられ、後者の製剤は、酢酸ヒスチジン緩衝液を含む。
前述した組成物に加えて、抗原結合分子をデポー調製物として製剤化することも可能である。このような長く作用する製剤は、移植によって（例えば、皮下若しくは筋肉内）、又は筋肉内注射によって投与されてもよい。それゆえに、例えば融合タンパク質は、好適なポリマー若しくは疎水性材料（例えば、許容されるオイルの乳剤エマルションとして）又はイオン交換樹脂と共に、又は例えば、低溶解性の塩等の難溶性誘導体として製剤化してよい。
本発明の二重特異性抗原結合分子を含む医薬組成物は、従来の混合、溶解、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥プロセスにより製造することができる。医薬組成物は、１つ以上の生理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤又はタンパク質を医薬として使用可能な製剤へと加工するのを容易にする補助剤を用い、従来の様式で配合されてもよい。適切な製剤は、選択する投与経路によって変わる。
二重特異性抗原結合分子は、遊離酸又は塩基、中性又は塩形態で、組成物に配合されることができる。薬学的に許容される塩は、遊離酸又は塩基の生物活性を実質的に保持する塩類である。薬学的に許容される塩としては、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基と形成される酸付加塩、又は塩酸若しくはリン酸などの無機酸と形成されるか、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸若しくはマンデル酸などの有機酸と形成される塩が挙げられる。遊離カルボキシル基と形成される塩も、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムの水酸化物又は水酸化第二鉄などの無機塩基から誘導されてもよく、又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン若しくはプロカインなどの有機塩基から誘導されてもよい。医薬塩は、対応する遊離塩基形態よりも、水及び他のプロトン性溶媒に溶けやすい傾向がある。
本明細書における組成物は、治療される特定の徴候に必要な１種類より多い有効成分も含んでいてもよく、好ましくは、互いに有害な影響を与えない相補的な活性を有するものを含んでいてもよい。かかる有効成分は、意図される目的に有効な量で組み合わせて好適に存在する。
インビボ投与に使用される製剤は一般に、滅菌される。滅菌性は、例えば、滅菌ろ過膜を通したろ過によって容易に達成され得る。
治療方法及び組成物
本明細書において提供する二重特異性抗原結合分子のいずれかを、治療方法にて使用することができる。治療方法で使用するために、本発明の二重特異性抗原結合分子を、良好な医事に一致する様式で製剤化、用量化、及び投与することができる。これに関連して考慮すべき要因としては、治療される特定の疾患、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療従事者に既知である他の要因が挙げられる。
一態様では、医薬として使用するための、本発明の二重特異性抗原結合分子が提供される。
更なる態様では、（ｉ）ＣＤ４０＋抗原提示細胞（ＡＰＣ）による免疫刺激を誘導する、（ｉｉ）腫瘍特異的Ｔ細胞応答を刺激する、（ｉｉｉ）腫瘍細胞のアポトーシスを引き起こす、（ｉｖ）がんを治療する、（ｖ）がんの進行を遅延させる、（ｖｉ）がんを患っている患者の生存を延長する、（ｖｉｉ）感染症を治療するのに使用するための、本発明の二重特異性抗原結合分子が提供される。特定の態様では、疾患の治療で使用するための、特に、がんの治療で使用するための、本発明の二重特異性抗原結合分子が提供される。
ある特定の態様では、治療方法で使用するための、本発明の二重特異性抗原結合分子を提供する。一態様では、本発明は、疾患の治療を必要とする個体における、病気の治療で使用するための、本明細書に記載した二重特異性抗原結合分子を提供する。ある特定の態様では、本発明は、疾患を有する個体の治療方法であって、治療的有効量の二重特異性抗原結合分子を個体に投与することを含む方法で使用するための二重特異性抗原結合分子を提供する。特定の態様において、治療される疾患は、がんである。治療が必要な対象、患者又は個体は、典型的には哺乳動物であり、より具体的にはヒトである。
一態様では、（ｉ）ＣＤ４０＋抗原提示細胞（ＡＰＣ）による免疫刺激を誘導する、（ｉｉ）腫瘍特異的Ｔ細胞応答を刺激する、（ｉｉｉ）腫瘍細胞のアポトーシスを引き起こす、（ｉｖ）がんを治療する、（ｖ）がんの進行を遅延させる、（ｖｉ）がんを患っている患者の生存を延長する、又は（ｖｉｉ）感染症を治療する方法であって、ここで、治療的有効量の本発明の二重特異性抗原結合分子を、それを必要とする個体に投与することを含む、方法が提供される。
更なる態様では、本発明は、疾患の治療を必要とする個体における、疾患の治療のための医薬の製造又は調製における、本発明の二重特異性抗原結合分子の使用を提供する。一態様では、医薬は、疾患を有する個体に、治療的有効量の医薬を投与することを含む、疾患の治療方法で使用するためのものである。ある特定の態様では、治療される疾患は、増殖性障害、特にがんである。がんの例としては、膀胱がん、脳腫瘍、頭頸部がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、肛門がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平細胞がん腫、骨がん及び腎臓がんが挙げられるが、これらに限定されない。がんの他の例としては、がん、リンパ腫（例えば、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫）、芽腫、肉腫、及び白血病が挙げられる。本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体を使用して治療可能な、その他の細胞増殖性疾患としては、腹部、骨、***、消化系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、脳下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、神経系（中枢及び末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部領域及び泌尿生殖器系に位置する新生物が挙げられるが、これらに限定されない。前がん状態又は病変及びがん転移も含まれる。ある特定の実施形態では、がんは、腎細胞がん、皮膚がん、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、脳腫瘍、頭頸部がんからなる群から選択される。多くの場合において、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体は治癒をもたらし得ないが、効果をもたらし得ることを当業者は速やかに理解する。いくつかの態様では、いくらかの効果を有する生理学的変化もまた、治療上有益であるとみなされる。したがって、いくつかの態様では、生理学的変化をもたらす本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体量を、「有効量」、又は「治療的有効量」とみなす。
疾患を予防又は治療するため、（単独で又は１種若しくは複数の他の追加の治療剤と組み合わせて使用する場合）本発明の二重特異性抗原結合分子の適切な投与量は、治療される疾患の種類、投与経路、患者の体重、具体的な分子、疾患の重症度及び経過、本発明の二重特異性抗原結合分子を予防目的で投与するか治療目的で投与するか、以前の又は同時の治療介入、患者の臨床歴並びに二重特異性抗原結合分子に対する反応、並びに担当医の裁量に依存する。投与に責任を持つ施術者はいずれにせよ、組成物中の有効成分の濃度、及び個々の対象での適切な用量を決定する。単回又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むが、これらに限定されない様々な投薬スケジュールが、本明細書では企図される。
本発明の二重特異性抗原結合分子は患者に１回、又は連続治療にわたって好適に投与される。疾患の種類及び重症度に応じ、例えば、一度以上の個別投与、又は連続点滴に関わらず、約１μｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）の二重特異性抗原結合分子が、患者への投与への最初の候補投与量となることができる。１つの典型的な日用量は、上で言及した因子に応じて、約１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であってもよい。数日間又はそれ以上にわたる反復投与において、状態に応じ、治療は通常、疾患症状の所望の抑制が生じるまで続けられる。本発明の二重特異性抗原結合分子の、１つの例示的な用量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。他の例では、用量はまた、投与当たり、約１μｇ／ｋｇ体重、約５μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ／ｋｇ体重、約２００μｇ／ｋｇ体重、約３５０μｇ／ｋｇ体重、約５００μｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ／ｋｇ体重、約５ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約２００ｍｇ／ｋｇ体重、約３５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５００ｍｇ／ｋｇ体重から約１０００ｍｇ／ｋｇ体重まで、又はもっと多く、又はその間の誘導可能な任意の範囲を含んでいてもよい。本明細書に列挙される数から誘導可能な範囲の例では、約０．１ｍｇ／ｋｇ／体重～約２０ｍｇ／ｋｇ／体重、約５μｇ／ｋｇ／体重～約１ｍｇ／ｋｇ／体重などが、上述の数に基づいて投与されてもよい。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ（又はこれらの任意の組合せ）の１回以上の投薬を患者に投与してもよい。このような用量を、断続的に、例えば、毎週、又は３週間ごとに投与してもよい（例えば、患者は、約２～約２０回、又は例えば約６回の融合タンパク質の投薬を受ける）。特定の態様では、二重特異性抗原結合分子は３週間に１回投与される。最初の多めの投与量、それに続く１回以上の量の少ない用量を投与してよい。しかしながら、他の投与レジメンが有用であってもよい。この療法の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易に監視される。
本発明の二重特異性抗原結合分子は一般に、意図する目的を達成するのに有効な量で使用される。疾患状態を治療又は予防するのに使用するため、本発明の二重特異性抗原結合分子、又はその医薬組成物は、治療的有効量で投与される、又は適用される。治療的有効量の決定は、特に、本明細書に与えられる詳細な開示の観点で、充分に当業者の能力の範囲内である。全身投与の場合、治療的有効用量は、インビトロアッセイ、例えば、細胞培養アッセイから最初に概算することができる。次いで、細胞培養物で決定されるようなＩＣ５０を含む血中濃度範囲を達成するために、用量を動物モデルで配合してもよい。このような情報を使用し、ヒトにおける有用な用量を更に正確に決定することができる。初期用量も、インビボデータから、例えば、動物モデルから、当該技術分野で周知の技術を用いて概算することができる。当業者は、動物のデータに基づきヒトへの投与を速やかに最適化することができる。
投与量及び感覚を個々に調節して、治療効果を維持するのに充分な、本発明の二重特異性抗原結合分子の血漿レベルを提供することができる。注射による投与に有用な通常の患者用量は、約０．１～５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．１～１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。治療に有効な血漿レベルは、各日に複数回の用量を投与することによって達成されてもよい。血漿中のレベルは、例えば、ＨＰＬＣによって測定されてもよい。局所投与又は選択的な取り込みの場合、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の効果的な局所濃度は、血漿濃度のとは関係し得ない。当業者は、過度な実験を行うことなく、治療に有効な局所用量を最適化することができる。
本明細書で記載される、本発明の二重特異性抗原結合分子の治療に有効な用量は一般に、実質的な毒性を引き起こすことなく治療効果を提供する。融合タンパク質の毒性及び治療有効性は、細胞培養物又は実験動物における標準的な医薬手順によって決定することができる。細胞培養アッセイ及び動物実験を使用し、ＬＤ５０（集団の５０％が致死に至る用量）及びＥＤ５０（集団の５０％が治療に有効である用量）を決定することができる。毒性と治療効果との間の投薬比は、治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指数を示す二重特異性抗原結合分子が好ましい。一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体は、高い治療指数を示す。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られるデータを、ヒトでの使用に適した投与範囲を配合する際に使用することができる。投与量は、好ましくは毒性がほとんど又は全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、例えば、使用される投与量、利用される投与経路、対象の状態などの種々の因子に依存して、この範囲内で変動してもよい。実際の製剤、投与経路及び投薬量は、患者の状態という観点で個々の医師によって選択されてもよい（例えば、その全体が本明細書に参考として組み込まれる、Ｆｉｎｇｌら、（１９７５年）「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」第１章第１頁を参照されたい）。
本発明の融合タンパク質で処置される患者の主治医は、毒性、臓器不全などに起因して、どのように、いつ投与を中止するか、中断するか、又は調整するかを知っている。逆に、主治医は、臨床応答が充分ではない場合（毒性を生じずに）、治療をもっと高レベルにするように調整することも知っている。目的の疾患の管理において投与される投薬量の大きさは、治療される状態の重篤度、投与経路などに伴って変動する。状態の重篤度は、例えば、部分的には、標準的な診断評価方法によって評価されてもよい。更に、用量と、おそらく投薬頻度は、個々の患者の年齢、体重及び応答によっても変わる。
他の薬剤及び治療
本発明の二重特異性抗原結合分子は、療法における１種以上の他の薬剤と組み合わせて投与することができる。例えば、本発明の本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体は、少なくとも１種の追加の治療剤と同時に投与することができる。用語「治療剤」とは、このような治療を必要とする個体の症状又は疾患を治療するために投与することができる任意の薬剤を包含する。このような更なる治療剤は、治療される特定の適応症に適した任意の有効成分を含んでいてもよく、好ましくは、互いに有害な影響を与えない相補的な活性を有するものを含んでいてもよい。ある特定の実施形態では、更なる治療剤は、別の抗がん剤、例えば、微小管破壊剤、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡインターカレータ、アルキル化剤、ホルモン治療、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化剤、又は抗血管形成剤である。ある特定の態様では、更なる治療剤は、免疫制御剤、細胞増殖抑制剤、細胞接着の阻害剤、細胞傷害剤若しくは細胞増殖抑制、細胞アポトーシスの活性化剤、又はアポトーシス誘発因子に対する細胞の感度を高める薬剤である。
したがって、二重特異性抗原結合分子が、化学療法剤、放射線及び／又はがん免疫療法に使用するための他の薬剤と組み合わせて投与される、がんの治療に使用するための、本発明の二重特異性抗原結合分子又はこれらを含む医薬組成物が提供される。
このような他の薬剤は、適切には、意図する目的にとって有効な量で組み合わせた状態で存在する。このような他の薬剤の有効量は、使用される融合タンパク質の量、障害又は処置の種類、上述の他の因子に依存する。本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体は通常、本明細書に記載される同一用量及び投与経路、若しくは本明細書で記載される１～９９％の用量、又は実験的／臨床的に適切と測定される任意の用量及び任意の経路で使用される。
上述したこのような併用療法は、併用投与（２つ以上の治療薬が同一又は個別の組成物に含まれる）、及び個別投与を包含し、個別投与において、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の投与は、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、これと同時、及び／又はこの後に生じることができる。
製造品
本発明の別の態様では、上述の障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な材料を含有する製造品が提供される。製造品は、容器と、容器に挿入されるか、又は容器に付随するラベル若しくはパッケージ添付文書とを備えている。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、注射器、ＩＶ溶液バッグ等が含まれる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの種々の材料から作られてもよい。容器は、組成物をそれ自身で、又は状態を治療し、予防し、及び／又は診断するのに有効な別の組成物と組み合わせて保持しており、滅菌アクセス口を有していてもよい（例えば、容器は、皮下注射針によって穿孔可能なストッパを有する静脈内溶液袋又はバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１種の活性剤は、本発明の二重特異性抗原結合分子である。
ラベル又は添付文書は、組成物が、選択される病態を治療するために使用されることを示す。更に、製造品は、（ａ）製造品中に含有され、本発明の二重特異性抗原結合分子を含む組成物を含む第１の容器、及び、（ｂ）製造品中に含有され、更なる細胞傷害性又は別の治療剤を含む組成物を含む第２の容器を含んでよい。製造品は、本発明のこの実施形態では、その組成物を特定の状態を治療するために使用可能であることを示すパッケージ添付文書を更に備えていてもよい。
あるいは、又は加えて、製造品は、医薬的に許容される緩衝液、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル溶液、及びデキストロース溶液を含む第２の（又は第３の）容器を更に備えていてもよい。製造品は、他の緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針、及びシリンジを含む、商業的観点及びユーザの観点から望ましい他の材料を更に含み得る。
Figure 2022511396000003
Figure 2022511396000004
Figure 2022511396000005
Figure 2022511396000006
Figure 2022511396000007
Figure 2022511396000008
Figure 2022511396000009
Figure 2022511396000010
Figure 2022511396000011
Figure 2022511396000012
以下の番号付けした段落（パラグラフ）は、本発明の態様を記載する：
１．二重特異性抗原結合分子であって、
（ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片と、
（ｂ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片と、
（ｃ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる第３のＦａｂ断片と、
（ｄ）安定した会合が可能な、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインであって、ここで、第２のＦａｂ断片（ｂ）がＶＨ－ＣＨ１鎖のＣ末端にて第１のＦａｂ断片（ａ）のＶＨ－ＣＨ１鎖のＮ末端に融合し、これは転じて、そのＣ末端にて第１のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合し、第３のＦａｂ断片（ｃ）が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端にて第２のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合する、Ｆｃドメインと、
（ｅ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるクロスｆａｂ断片であって、ここで、該クロスｆａｂ断片が該Ｆｃドメインサブユニットの１つのＣ末端に融合されている、クロスｆａｂ断片と、を含む、二重特異性抗原結合分子。
２．標的細胞抗原に特異的に結合することができる該クロスｆａｂ断片が、該第２のＦｃドメインサブユニットのＣ末端に融合する、パラグラフ１に記載の二重特異性抗原結合分子。
３．標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合することができる抗原結合ドメインである、パラグラフ１又は２に記載の二重特異性抗原結合分子。
４．ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び（ｉｖ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（ｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（ｖｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（ｉｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び（ｉｖ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（ｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（ｖｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、パラグラフ１～３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
５．ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号９のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号１０のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）配列番号１７のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号１８のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、パラグラフ１～４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
６．ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（ｉｉ）配列番号２０、配列番号２７、及び配列番号２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び（ｉｖ）配列番号２２、配列番号２９、及び配列番号３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（ｖ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（ｖｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、パラグラフ１～３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
７．ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、及び配列番号３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、
（ｉｉ）配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、及び配列番号４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）と、を含む、パラグラフ１～３又は６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
８．ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、
（ｂ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、
（ｃ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｄ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号４１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、パラグラフ１～３又は６又は７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
９．ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの各々が、（ｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（ｉｉ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（ｉｉｉ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）、及び（ｉｖ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（ｖ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（ｖｉ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）を含む、パラグラフ１～８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１０．ＣＤ４０に特異的に結合することができる該抗原結合ドメインの各々が、
（ｉ）配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、及び配列番号５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、
（ｉｉ）配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、及び配列番号６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）と、を含む、パラグラフ１～９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１１．ＣＤ４０に特異的に結合することができる該抗原結合ドメインの各々が、
（ｉ）配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、及び配列番号６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、
（ｉｉ）配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、及び配列番号７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）と、を含む、パラグラフ１～９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１２．ＣＤ４０に特異的に結合することができる該抗原結合ドメインの各々が、
（ａ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５７のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｂ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｃ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５９のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｄ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６０のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｅ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５７のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｆ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｇ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５９のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｈ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６０のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｉ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５７のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｊ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｋ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５９のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｌ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６０のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｍ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５７のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｎ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｏ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５９のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｐ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、パラグラフ１～１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１３．ＣＤ４０に特異的に結合することができる該抗原結合ドメインの各々が、配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号５７のアミノ酸配列を含むＶＬと、を含む、パラグラフ１～１０又は１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１４．ＣＤ４０に特異的に結合することができる該抗原結合ドメインの各々が、
（ａ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６７のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｂ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６７のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｃ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６７のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｄ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６７のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｅ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｆ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｇ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｈ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６９のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｊ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６９のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｋ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号７０のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｌ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号７０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、パラグラフ１～９又は１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１５．ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの各々が、配列番号６１のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６７のアミノ酸配列を含むＶＬを含むか、又は、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号６４のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６７のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、パラグラフ１～９又は１１又は１４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１６．以下、
（ｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）及び配列番号５７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）をそれぞれ含む、ＣＤ４０に特異的に結合することができる３つの抗原結合ドメインと、
（ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、ＦＡＰに特異的に結合することができる１つの抗原結合ドメインと、を含むパラグラフ１～９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１７．該Ｆｃ領域が、ＩｇＧ、特にＩｇＧ１ Ｆｃ領域又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり、ここで、該Ｆｃ領域が、Ｆｃ受容体及び／又はエフェクタ機能に対する該抗体の結合親和性を低減する１つ以上のアミノ酸置換を含む、パラグラフ１～１６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１８．該Ｆｃ領域が、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔによるＥＵ番号付け）を伴うヒトＩｇＧ１サブクラスの領域である、パラグラフ１～１７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１９．ノブ・イントゥ・ホール法に従って、該Ｆｃ領域の該第１のサブユニットがノブを含み、該Ｆｃ領域の該第２のサブユニットがホールを含む、パラグラフ１～１８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
２０．該Ｆｃ領域の該第１のサブユニットがアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＫａｂａｔによるＥＵ番号付け）を含み、該Ｆｃ領域の該第２のサブユニットがアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、及びＹ４０７Ｖ（ＫａｂａｔによるＥＵ番号付け）を含む、パラグラフ１～１９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
２１．パラグラフ１～２０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子をコードする、単離された核酸。
２２．パラグラフ２１に記載の単離された核酸を含む、発現ベクタ。
２３．パラグラフ２１に記載の単離された核酸又はパラグラフ２２に記載の発現ベクタを含む、宿主細胞。
２４．二重特異性抗原結合分子を生産する方法であって、該二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下においてパラグラフ２３に記載の宿主細胞を培養することと、該二重特異性抗原結合分子を単離することと、を含む、方法。
２５．パラグラフ１～２０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子と、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
２６．医薬として使用するための、請求項１～２０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子又はパラグラフ２５に記載の医薬組成物。
２７．以下、
（ｉ）ＣＤ４０発現抗原提示細胞（ＡＰＣ）による、免疫刺激の誘導において、
（ｉｉ）腫瘍特異的Ｔ細胞応答を刺激することにおいて、
（ｉｉｉ）腫瘍細胞のアポトーシスを引き起こすことにおいて、
（ｉｖ）がんの治療において、
（ｖ）がんの進行を遅らせることにおいて、
（ｖｉ）がんを患う患者の生存を延長することにおいて、
（ｖｉｉ）感染症の治療において、使用するための、請求項１～２０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子又はパラグラフ２５に記載の医薬組成物。
２８．がんの治療で使用するための、請求項１～２０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子又はパラグラフ２５に記載の医薬組成物。
２９．がんの治療のための医薬の製造における、請求項１～２０のいずれか一項に二重特異性抗原結合分子又はパラグラフ２５に記載の医薬組成物の使用。
３０．がんを有する個体を治療する方法であって、有効量である請求項１～２０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子又はパラグラフ２５に記載の医薬組成物を該個体に投与することを含む、方法。
３１．該二重特異性抗原結合分子が、がん免疫療法で使用するために、化学療法剤、放射線、及び／又は他の薬剤と組み合わせて投与される、がんの治療で使用するためのパラグラフ１～２０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子又はパラグラフ２５に記載の医薬組成物。
以下は、本発明の方法及び組成物の例である。先に与えた一般的な説明を考慮すると、種々の他の実施形態が実施されてもよいことは理解される。
組換えＤＮＡ技術
標準的な方法を使用して、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバ（１９８９年）において説明されるように、ＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬は、製造元の説明書によって使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、以下に与えられる：Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、（１９９１年）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」第５版、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、第９１～３２４２頁。
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、二本鎖配列決定によって決定した。
遺伝子の合成
所望の遺伝子セグメントは、適切なテンプレートを使用したＰＣＲによって生じたか、又はＧｅｎｅａｒｔ ＡＧ（レーゲンスブルク、ドイツ）によって、合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ産物から自動遺伝子合成によって合成した。正確な遺伝子配列が利用できない場合においては、最も近い相同物の配列に基づきオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、適切な組織に由来するＲＮＡから、ＲＴ－ＰＣＲにより遺伝子を単離した。単一の制限エンドヌクレアーゼ開裂部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準的なクローニング／配列決定ベクタ内へとクローニングした。プラスミドＤＮＡを形質転換細菌から精製し、濃度をＵＶ分光法によって測定した。サブクローニングした遺伝子断片のＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクタ内へのサブクローニングを可能にする適切な制限部位を用いて設計した。全てのコンストラクトは、真核細胞における分泌のためのタンパク質を標的とするリーダペプチドについてコードする５’末端ＤＮＡ配列を用いて設計した。
タンパク質精製
タンパク質は、標準プロトコルに言及される、フィルタにかけた細胞培養物上清から精製した。簡潔に述べると、抗体を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し、ＰＢＳで洗浄した。抗体の溶離は、ｐＨ２．８で達成され、その後、試料を即時中和した。凝集したタンパク質は、ＰＢＳ中での、又は２０ｍＭ ヒスチジン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中でのサイズ排除クロマトグラフィ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって、単量体抗体から分離した。単量体抗体画分をプールし、例えばＭＩＬＬＩＰＯＲＥ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（３０ＭＷＣＯ）遠心濃縮機を用いて濃縮し（必要であれば）、冷凍し、－２０℃又は－８０℃で保存した。試料の一部を、例えばＳＤＳ－ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィ（ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＳＥＣ）又は質量分析によるその後のタンパク質分析及び分析性質決定に供した。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ－Ｃａｓｔゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造元の説明書により使用した。特に、１０％又は４～１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ－ＴＲＩＳ Ｐｒｅ－Ｃａｓｔゲル（ｐＨ６．４）、及びＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ（還元型ゲル、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）抗酸化剤泳動用緩衝液助剤を添加）又はＭＯＰＳ（非還元型ゲル）泳動用緩衝液を使用した。
ＣＥ－ＳＤＳ
二重特異性抗体及び対照抗体の純度、抗体完全性、及び分子量を、マイクロ流体Ｌａｂｃｈｉｐ技術（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、米国）を用いるＣＥ－ＳＤＳにより分析した。５μＬのタンパク質溶液を、ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔを用いて、製造会社の使用説明書に従って、ＣＥ－ＳＤＳ分析用に調製し、ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｃｈｉｐを用いてＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩシステムで分析した。ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸソフトウェアを用いてデータを解析した。
分析用サイズ排除クロマトグラフィ
抗体の凝集及びオリゴマー状態を測定するためのサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を、ＨＰＬＣクロマトグラフィにより実施した。簡単に述べれば、プロテインＡ精製抗体を、Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ １１００システムの３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）におけるＴｏｓｏｈ ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷカラムに、又はＤｉｏｎｅｘ ＨＰＬＣ－Ｓｙｓｔｅｍの２×ＰＢＳにおけるＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。溶出したタンパク質をＵＶ吸光度及びピーク面積の積分によって定量した。ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ １５１－１９０１を標準物質として供した。
質量分析
このセクションは、その正しいアセンブリに重点をおいて、ＶＨ／ＶＬ又はＣＨ／ＣＬ交換（ＣｒｏｓｓＭａｂ）を有する多重特異性抗体の性質決定を記載する。予想される一次構造を、脱グリコシルしたインタクトＣｒｏｓｓＭａｂ及び脱グリコシル／ＦａｂＡＬＡＣＴＩＣＡ、又は代替として、脱グリコシル／ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮ消化ＣｒｏｓｓＭａｂのエレクトロスプレーイオン化質量分析（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＥＳＩ－ＭＳ）により分析した。
ＣｒｏｓｓＭａｂを、リン酸緩衝液又はＴｒｉｓ緩衝液中、タンパク質濃度１ｍｇ／ｍＬで、３７℃で１７時間までの時間、Ｎ－グリコシダーゼＦを用いて脱グリコシル化した。ＦａｂＡＬＡＣＴＩＣＡ又はＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮ（Ｇｅｎｏｖｉｓ ＡＢ；Ｓｗｅｄｅｎ）消化を、１００μｇ脱グリコシルＣｒｏｓｓＭａｂと共に、そのベンダにより供給された緩衝液において実施した。質量分析の前に、試料を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのＨＰＬＣによって脱塩した。合計質量は、ＴｒｉＶｅｒｓａ ＮａｎｏＭａｔｅ ｓｏｕｒｃｅ（Ａｄｖｉｏｎ）が取り付けられたｍａＸｉｓ ４Ｇ ＵＨＲ－ＱＴＯＦ ＭＳシステム（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｋ）でのＥＳＩ－ＭＳによって測定された。
実施例１
線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に対する新規抗体の生成
１．１ マウスの免疫化
Ｂａｌｂ／ｃ及びＮＭＲＩマウスを免疫化に使用した。ＡＡＡＬＡＣｉ公認の動物施設において、付属資料Ａ「Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ａｃｃｏｍｍｏｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃａｒｅ ｏｆ ａｎｉｍａｌｓ」に従って動物を飼育した。全ての動物免疫化プロトコル及び実験は、オーバーバイエルン行政府（Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ ｏｆ Ｕｐｐｅｒ Ｂａｖａｒｉａ）により承認され（許可番号５５．２－１－５４－２５３１－１９－１０）、ドイツ動物保護法並びに欧州議会及び理事会指令２０１０／６３に従って実施された。６～８週齢のＢａｌｂ／ｃ及びＮＭＲＩマウス（ｎ＝５）を、Ｈｉｓタグ（配列番号９３）に共有結合したヒト線維芽細胞活性化タンパク質α（アミノ酸２７～７５９；受託番号ＮＰ＿００４４５１）の組換え産生細胞外ドメインにより４回免疫化した。各免疫化の前に、マウスを酸素とイソフルランとのガス混合物で麻酔した。初回免疫化のために、ＰＢＳに溶解した３０μｇのタンパク質（ｐＨ７．４）を等量のＣＦＡ（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ、＃２６３８１０）と混合し、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。別のＡｂｉｓｃｏアジュバント中に乳化したタンパク質１０μｇを６週目に皮下（ｓ．ｃ．）投与した。アジュバントを含まない５μｇタンパク質の３回目の腹腔内投与を１０週目に行った。最後に、ハイブリドーマ技術を用いた抗体開発のための脾臓細胞の調製の３日前に、マウスを、５０μｇのタンパク質を含む静脈内（ｉ．ｖ．）追加免疫に供した。血清を、ＥＬＩＳＡにより抗原特異的総ＩｇＧ抗体産生について試験した。最後の免疫化の３日後に、マウスを安楽死させ、脾臓を無菌的に単離し、ハイブリドーマ生成のために調製した。マウスリンパ球を単離し、ＰＥＧベースの標準プロトコルを用いてマウス骨髄腫細胞株と融合させて、ハイブリドーマを作製した。得られたハイブリドーマ細胞を、平底９６ウェルマイクロタイタプレート中におよそ１０４でプレーティングし、続いて選択培地中で約２週間インキュベーションし、その後、抗原特異的抗体の産生についてスクリーニングした。一度広範なハイブリドーマ増殖が起こると、抗体を分泌するハイブリドーマは再増殖される。ハイブリドーマ上清を、ＥＬＩＳＡにより組換えヒト線維芽細胞活性化タンパク質α（ｈｕＦＡＰ）への特異的結合についてスクリーニングし、続いてＢｉａｃｏｒｅ測定を用いて組換えｈｕＦＡＰに対する動態結合パラメータを評価した。
ハイブリドーマの培養：生成したｍｕＭＡｂハイブリドーマを、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号３５０５０－０３８）、１ｍＭ Ｎａ－Ｐｙｒｕｖａｔ（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１１３６０－０３９）、１×ＮＥＡＡ（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１１１４０－０３５）、１０％ＦＣＳ（ＰＡＡ、カタログ番号Ａ１５－６４９）、１×ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１０７４４４０）、１×Ｎｕｔｒｉｄｏｍａ ＣＳ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１３６３７４３）、５０μＭメルカプトエタノール（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号３１３５０－０１０）、及び５０Ｕ／ｍＬ ＩＬ６マウス（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１ ４４４ ５８１）により３７℃及び５％ＣＯ２で充填した、ＲＰＭＩ１６４０（ＰＡＮ、カタログ番号（Ｃａｔ．Ｎｏ．）ＰＯ４－１７５００）中において培養した。
１．２ ＦＡＰクローン４Ｂ９及び２８Ｈ１に対する抗ｈｕＦＡＰ抗体の競合的細胞結合
得られたクローンの結合挙動をＦＡＰクローン４Ｂ９と比較して試験した。ＦＡＰクローン４Ｂ９及び２８Ｈ１の生成及び調製は、国際公開第２０１２／０２０００６Ａ２号に記載されており、参照により本明細書に組み込まれている。マウスＦＡＰクローンがクローン４Ｂ９及び２８Ｈ１のような異なるエピトープを認識するかどうかを決定するために、トランスフェクトされたＨＥＫ細胞上に発現したヒトＦＡＰとの競合的結合を実施した。
簡単に述べれば、標的細胞を、細胞解離緩衝液で収穫し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％ＦＣＳ＋５ｍＭ ＥＤＴＡ＋０．２５％アジ化ナトリウム）で洗浄し、９６－Ｕ底プレート（１×１０５細胞／ウェル）に播種した。非標識一次抗ヒトＦＡＰ抗体（ｍｕ ＩｇＧ１）を細胞に加え（最終濃度６０μｇ／ｍＬ～０．２μｇ／ｍＬ；１：３希釈）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識抗ＦＡＰ抗体４Ｂ９又は２８Ｈ１（最終濃度２０μｇ／ｍＬ）を添加する前に、４℃で２０分間インキュベートした。４℃で３０分間のインキュベーション後、細胞を洗浄し、固定し、ＡＦ６４７標識クローン４Ｂ９及び２８Ｈ１の蛍光シグナル強度を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳＱｕａｎｔを用いて測定した。
図２Ａ及び図２Ｂで見られるように、１０個のハイブリドーマ由来マウス抗体が、抗ＦＡＰ抗体４Ｂ９又は２８Ｈ１との結合について競合しなかったことが特定された（名前付きクローン２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、及び２１８）。
１．３ 抗ｈｕＦＡＰマウス抗体の標的結合特異性
線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ、ＦＡＰ－α、セプラーゼ）は、プロリルオリゴペプチダーゼのファミリに属するＩＩ型膜貫通セリンプロテアーゼである。このファミリは、プロリン残基の後に優先的にペプチドを開裂するセリンプロテアーゼを含む。ヒトプロテオームで発現するこのファミリの他の重要なメンバは、プロリルオリゴペプチダーゼ（ｐｒｏｌｙｌ ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ：ＰＲＥＰ）及びジペプチジルペプチダーゼ（ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ：ＤＰＰ）である。ＤＰＰ－ＩＶはＦＡＰに最も近いホモログである。ＦＡＰとは対照的に、ＤＰＰ－ＩＶは遍在的に発現され、Ｔ細胞共刺激、ケモカイン生物学、グルコース代謝、及び腫瘍形成などの様々な生物学的プロセスにおける役割を果たしており、したがって、所望の抗ヒトＦＡＰ抗体はヒトＤＰＰ－ＩＶに結合すべきではない。
ヒトＦＡＰ及びヒトＤＰＰ－ＩＶへの結合は、ヒトＦＡＰ又はヒトＤＰＰＩＶトランスフェクトＨＥＫ細胞を用いたフローサイトメトリによって決定した。簡単に述べれば、標的細胞を、細胞解離緩衝液で収穫し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％ＦＣＳ＋５ｍＭ ＥＤＴＡ＋０．２５％アジ化ナトリウム）で洗浄し、９６－Ｕ底プレート（１×１０５細胞／ウェル）に播種した。非標識一次抗体を細胞に加え（最終濃度１０μｇ／ｍＬ）、３０分間４℃でインキュベートした。洗浄後、細胞を、ヤギ抗マウスＩｇＧ－ＰＥ Ｆ（ａｂ’）２（セロテック）により３０分間４℃で暗所においてインキュベートした。その後、細胞を洗浄し、固定し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ（商標）ＩＩを用いて測定した。１０種のハイブリドーマ由来抗ヒトＦＡＰ抗体のいずれに対しても、ヒトＤＰＰ－ＩＶへの非特異的結合は検出されなかった。
１．４ ｈｕＩｇＧ１＿ＬＡＬＡ＿ＰＧフォーマットにおける抗ｈｕＦＡＰ抗体の作製
新しい抗ｈｕＦＡＰ抗体のＤＮＡ配列を、標準的な配列決定法で決定した。ＶＨ及びＶＬドメインに基づき、新しい抗ＦＡＰ抗体を、国際公開第２０１２／１３０８３１Ａ１号に記載されている方法に従って、Ｆｃγ受容体への結合を阻害するエフェクタサイレントＦｃ（Ｐ３２９Ｇ；Ｌ２３４、Ｌ２３５Ａ）を用いてｈｕＩｇＧ１抗体として発現させた。詳細には、異なるペプチド鎖をコードする発現ベクタの懸濁培養で増殖したＨＥＫ２９３－Ｆ細胞への一過性トランスフェクションにより、抗体を発現させた。ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）へのトランスフェクションを、細胞供給会社の使用説明書に従って、抗体ベクタのＭａｘｉｐｒｅｐ（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）の調製物、Ｆ１７に基づいた培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）、ＰＥＩｐｒｏ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ）、及び無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中１～２百万個の生細胞／ｍＬの細胞の初濃度を用いて、実施した。細胞培養物上清を、振盪フラスコ又は撹拌発酵槽における７日間の培養後、１４０００ｇで３０分間での遠心分離により収穫し、０．２２μｍフィルタにかけた。
ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン）クロマトグラフィを用いる親和性クロマトグラフィにより、細胞培養物上清から抗体を精製した。簡単に述べれば、滅菌濾過された細胞培養物上清を、ＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭ Ｎａ２ ＨＰＯ４、１ｍＭ ＫＨ２ ＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、及び２．７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）と平衡したＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ樹脂上に捕捉し、平衡緩衝液で洗浄し、２５ｍＭクエン酸塩（ｐＨ３．０）で溶出した。１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）で中和した後、凝集したタンパク質は、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中におけるサイズ排除クロマトグラフィ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって、単量体抗体種から分離した。単量体タンパク質画分をプールし、例えば、必要であればＭＩＬＬＩＰＯＲＥ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（３０ＫＤ ＭＷＣＯ）遠心濃縮機を用いて濃縮し（必要な場合）、－８０℃で保存した。試料アリコートを、例えば、ＣＥ－ＳＤＳ、サイズ排除クロマトグラフィ、質量分析、及びエンドトキシン決定による、次の特性評価に用いた。
１．５ 抗ｈｕＦＡＰ抗体の細胞結合
ヒトＩｇＧ１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＦｃによるヒトＦＡＰへの抗ＦＡＰ抗体の結合を、ヒトＦＡＰトランスフェクトＨＥＫ細胞を用いたフローサイトメトリによって決定した。簡単に述べれば、標的細胞を、細胞解離緩衝液で収穫し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％ＦＣＳ＋５ｍＭ ＥＤＴＡ＋０．２５％アジ化ナトリウム）で洗浄し、９６－Ｕ底プレート（１×１０５細胞／ウェル）に播種した。非標識一次抗体を細胞に加え（最終濃度１０μｇ／ｍＬ～０．６４ｎｇ／ｍＬ；１：５希釈）、３０分間４℃でインキュベートした。洗浄後、細胞を、ＰＥ－コンジュゲートされたＡｆｆｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）により３０分間４℃で暗所においてインキュベートした。その後、細胞を洗浄し、固定し、ＢＤ ＦＡＣＳ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（商標）を用いて測定した。
全ての抗ＦＡＰ抗体は、以前に見られたように、ヒトＦＡＰと同様の結合を示した。選択した結合体のＥＣ５０値を以下の表１に示す。
Figure 2022511396000013
１．６ 抗ｈｕＦＡＰ抗体の細胞内部移行
ヒトＦＡＰトランスフェクトＨＥＫ細胞を標的として用いて、ＦＡＰ結合体の内部移行を決定した。簡単に述べれば、標的細胞を、細胞解離緩衝液で収穫し、冷ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％ＦＣＳ＋５ｍＭ ＥＤＴＡ＋０．２５％アジ化ナトリウム）で洗浄し、冷ＦＡＣＳ緩衝液中１．５×１０６細胞／ｍＬで再懸濁した。細胞を１５ｍＬチューブ（各チューブは２ｍＬ中に３ｘ１０６細胞を含有）に分配した。２ｍＬの抗ヒトＦＡＰ抗体溶液を細胞に加え（最終濃度２０μｇ／ｍＬ）、４５分間４℃でインキュベートした。その後、細胞を洗浄し、冷ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、時点「０」の細胞を９６Ｕ底プレート（１．５×１０５細胞／ウェル）へただちに播種し、４℃で維持したが、一方で、他の全ての細胞は遠心分離し、１０％ＦＣＳ及び１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（１．５×１０６細胞／ｍＬ）を含有する温ＲＰＭＩ１６４０培地中に再懸濁し、加湿インキュベータ内で３７℃にシフトした（５％ＣＯ２）。各指示時点の後、１００μＬ／チューブの細胞懸濁液をプレートに移し、直ちに冷ＦＡＣＳ緩衝液で冷却し、全ての時点が収集されるまで冷蔵庫で保存した。全ての時点の収集後、細胞を冷ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、ＰＥ標識二次抗体により３０分間４℃でインキュベートした。その後、細胞を洗浄し、固定し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ（商標）ＩＩを用いて測定した。
標識された二次抗体によって引き起こされるシグナルは、経時的にほぼ一定であり、これは、抗体の損失が経時的に観察されず、試験された抗ｈｕＦＡＰ抗体のいずれも内部移行されなかったことを意味する。
１．７ 抗ｈｕＦＡＰ抗体の結合動態
ヒトＦＡＰの結合動態を評価するために、ビオチン化ヒトＦＡＰを、製造会社の使用説明書に従ってＢｉａｃｏｒｅ Ｃａｐｔｕｒｅ ＣｈｉｐシリーズＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、２８－９２０２－３４）に固定化し、およそ２０レゾナンスユニット（ＲＵ）の表面密度を得た。泳動用及び希釈緩衝液として、ＨＢＳ－Ｐ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４、０．０５％界面活性剤Ｐ２０）を使用した。抗ｈｕＦＡＰ Ｆａｂ（３．７～３００ｎＭ、１：３希釈）の希釈系列を、それぞれ１２０秒間連続的に注入し、１８００秒間流量３０μＬ／分（単サイクル動態）で解離をモニタした。６Ｍグアニジン－ＨＣｌ、０．２５Ｍ ＮａＯＨを１２０秒間注入することにより、表面を再生した。バルク屈折率差は、ブランク注入を差し引くことによって、及び捕捉されたヒトＦＡＰなしで対照フローセルから得られた応答を差し引くことによって、補正した。Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェア内の１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルを用いて、曲線適合を行った。親和性データを以下の表２に示す。
Figure 2022511396000014
１．８ 抗ｈｕＦＡＰクローンのフォーマット依存性結合
ＦｃドメインにＣ末端融合した際に抗ＦＡＰクローンの結合特性が失われないかどうかを決定するために、コンストラクトは、ＶＨドメインがＦｃノブ鎖のＣ末端に融合され、ＶＬドメインがＦｃホール鎖のＣ末端に融合される、Ｆｃノブ鎖及びＦｃホール鎖を含み（図３Ａ、Ｃ末端ＶＨ／ＶＬ融合）、並びにコンストラクトは、Ｆａｂ全体がＦｃノブ鎖のＣ末端にそのＶＨドメインで融合されている、Ｆｃノブ鎖及びＦｃホール鎖を含む（図３Ｂ、Ｃ末端Ｆａｂ融合）。Ｆｃノブ鎖は配列番号９０のアミノ酸配列を有し、Ｆｃホール鎖は配列番号９１のアミノ酸配列を有する。
抗体と比較した、ビオチン化組換えヒトＦＡＰ及びビオチン化組換えカニクイザルＦＡＰに対するコンストラクトの親和性を、以下の表３に示す。
Figure 2022511396000015
ＦＡＰをトランスフェクトしたＨＥＫ細胞へのコンストラクトの細胞結合もまた、本明細書にて上述したように決定されている。ＥＣ５０値を表４に示す。全ての抗ＦＡＰ抗体のＣ末端融合コンストラクトはヒト及びカニクイザルＦＡＰに結合することができたが、全ＦａｂがそのＶＨドメインによりＦｃノブ鎖のＣ末端と融合したコンストラクトは、ＶＨドメインがＦｃノブ鎖のＣ末端と融合され、ＶＬドメインがＦｃホール鎖のＣ末端と融合されたコンストラクトよりも優れていた。
Figure 2022511396000016
１．９ Ｂｉａｃｏｒｅによって決定される抗ヒトＦＡＰクローンの競合的結合
エピトープビニングを、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づくアッセイを用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置上で行った。ＦＡＰ抗原を固定化抗Ｈｉｓ抗体により捕捉した。第１の工程では、ＦＡＰ結合体を飽和するまで注入した。続いて、第２のＦＡＰ結合体を注入した。アッセイ設計を図３Ｃで概略的に示す。第２の抗体の添加後の結合シグナルの増加は、第１の抗体とは異なるエピトープへのその結合を示す。更なる結合は、第１及び第２の抗体が同じエピトープ領域を認識するとは示さなかった。
濃度２０μｇ／ｍＬの抗Ｈｉｓ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅキット２８－９９５０－５６）を、アミンカップリング（ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅキットＢＲ－１０００－５０）によりＣＭ５センサチップ（ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅＢＲ－１００５－３０）の表面に固定化した。注入時間は、１０μＬ／分の流量で６００秒として、一方を参照フローセルとして使用し、一方を活性フローセルとして使用した２つのフローセルで１２０００応答単位（ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｕｎｉｔ：ＲＵ）を得た。泳動用緩衝液は、ＨＢＳ－Ｎ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ－１００６－７０）であった。測定には、ＰＢＳ－Ｐ＋（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、２８－９９５０－８４）を泳動用及び希釈緩衝液として使用した。フローセル温度を２５℃に、試料コンパートメントを１２℃に設定した。全実施での流量は１０μＬ／分とした。
ＨｉｓタグＦＡＰ抗原を２０μｇ／ｍＬの濃度で１８０秒間活性フローセル上に捕捉した。第１及び第２の抗体（ＦＡＰ－結合体）を連続的に注入し、それぞれ１２０秒間、両フローセルにわたって１０μｇ／ｍＬの濃度で注入した。各サイクル後、表面を１０ｍＭグリシンｐＨ１．５で６０秒間再生した（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ－１００３－５４）。
結果を以下の表５に示す。
Figure 2022511396000017
このようにして、３つのエピトープビンを同定した。要求されたように、抗ＦＡＰ抗体はいずれも、抗体４Ｂ９（エピトープビン１）との結合について競合しなかった。抗体２１０、２１１、２１２、及び２１４は、結合について互いに競合し、したがって、１つの群（エピトープビン３）を形成したが、一方で抗体２０９は、他の抗体（エピトープビン２）との結合について競合しなかった。
１．９ 抗ＦＡＰ抗体の熱安定性評価
試料を、２０ｍＭヒスチジン／塩化ヒスチジン、１４０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中１ｍｇ／ｍＬの濃度で調製し、０．４μｍフィルタプレートを通しての遠心分離により光学３８４ウェルプレートへ移し、パラフィンオイルで覆った。試料を２５℃から８０℃へ０．０５℃／分の率で加熱しながら、流体力学半径を、ＤｙｎａＰｒｏプレートリーダ（Ｗｙａｔｔ）における動力学的光散乱により繰り返し、測定した。あるいは、試料を１０μＬマイクロキュベットアレイへ移し、それらを２５℃から９０℃へ０．１℃／分の率で加熱しながら、静的光散乱データ及び２６６ｎｍレーザでの励起による蛍光データをＯｐｔｉｍ１０００装置（Ａｖａｃｔａ Ｉｎｃ．）で記録した。凝集開始温度（Ｔａｇｇ）は、流体力学半径（ＤＬＳ）又は散乱光強度（Ｏｐｔｉｍ１０００）が増加し始める温度として定義される。融解温度は、蛍光強度対波長を示すグラフにおける屈曲点として定義される。選択した抗ＦＡＰ抗体の凝集開始温度を表６に示す。
Figure 2022511396000018
抗ＦＡＰクローン２１２は、それが抗体４Ｂ９としてヒトＦＡＰと同等の高い親和性で結合し、発生に対して好ましい特性を示したので、ヒト化のために選択された。その配列のインシリコ分析は、唯一の予測分解ホットスポット（４０１位におけるＴｒｐ）を示した。マウスクローン２１２の配列を表７に示す。
Figure 2022511396000019
１．１０ 抗ＦＡＰクローンのヒト化２１２
１．１０．１ 方法
適切なヒト受容体フレームワークを、マウス入力配列（可変部分に切り取られる）に対するヒトＶ及びＪ領域配列のＢＬＡＳＴｐデータベースを照会することにより同定した。ヒト受容体フレームワークの選択のための選択的基準は、配列相同性、同一、又は類似のＣＤＲ長、及びヒト生殖系列の推定頻度であるが、ＶＨ－ＶＬドメイン界面でのある種のアミノ酸の保存でもあった。生殖系列同定段階の後、マウス入力配列のＣＤＲをヒト受容体フレームワーク領域に移植した。これらの最初のＣＤＲ移植片と親抗体との間の各アミノ酸の相違は、それぞれの可変領域の構造的完全性に対する可能性のある影響について評価され、親配列に対する「逆突然変異」は、適切と考えられるならばいつでも導入された。構造評価は、親抗体、及びＢｉｏｖｉａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、バージョン１７Ｒ２を用いて実装した、自社抗体構造相同性モデリングプロトコルにより作製した、ヒト化変異体の両方のＦｖ領域相同性モデルに基いた。いくつかのヒト化変異体において、「正突然変異」、すなわち、親結合体の所与のＣＤＲ位置で生じる元のアミノ酸を、ヒト受容体生殖系列の等価位置で見出されるアミノ酸に変化させるアミノ酸交換が含まれた。その目的は、免疫原性リスクを更に低減するために、ヒト化変異体（フレームワーク領域を超えて）の全体的なヒト特性を増加させることである。
対のＶＨ及びＶＬヒト化変異体のＶＨ－ＶＬドメイン配向を予測するために、自社開発のインシリコツールを使用した（国際公開第２０１６／０６２７３４号を参照のこと）。その結果を、親結合体の予測されたＶＨ－ＶＬドメイン配向と比較して、元の抗体と幾何学的に近いフレームワーク組合せについて選択した。その理論的根拠は、結合特性に有害な影響を及ぼす可能性のある２つのドメインの対合における破壊的変化をもたらす可能性のある、ＶＨ－ＶＬ界面領域における可能性のあるアミノ酸交換を検出することである。
１．１０．２ 受容体フレームワークの選択及びその適合
次の受容体フレームワークを選択した。
Figure 2022511396000020
ＣＤＲ３後のフレームワーク領域を、ヒトＩＧＨＪ生殖系列ＩＧＨＪ６＊０１／０２（ＹＹＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ）（配列番号１１１）、及びヒトＩＧＫＪ生殖系列ＩＧＫＪ４＊０１／０２（ＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ）（配列番号１１２）から適合させた。受容体フレームワークに関連した部分は、下線で示されている。
構造的考慮に基づいて、ヒト受容体フレームワークから親結合体におけるアミノ酸への逆突然変異を、Ｈ４３位（Ｑ＞Ｋ）、Ｈ４４位（Ｇ＞Ｓ）、Ｈ４８位（Ｍ＞Ｉ）、Ｈ７１位（Ｒ＞Ｉ）、Ｈ７３位（Ｔ＞Ｋ）、Ｈ９３位（Ａ＞Ｔ）［ＶＨ１］、Ｈ４９位（Ｓ＞Ｇ）、Ｈ７１位（Ｒ＞Ｉ）、Ｈ７３位（Ｎ＞Ｋ）、Ｈ７８位（Ｌ＞Ａ）、Ｈ９３位（Ａ＞Ｔ）、Ｈ９４位（Ｋ＞Ｒ）［ＶＨ２］、Ｌ３６位（Ｙ＞Ｆ）、Ｌ４３位（Ａ＞Ｐ）、Ｌ８７位（Ｙ＞Ｆ）［ＶＬ１］、及びＬ３６位（Ｙ＞Ｆ）、Ｌ４２位（Ｋ＞Ｑ）、Ｌ４３位（Ａ＞Ｐ）、Ｌ８５位（Ｔ＞Ｍ）、Ｌ８７位（Ｙ＞Ｆ）［ＶＬ２］に導入した。
更に、Ｈ６０位（Ｎ＞Ａ）、Ｈ６４位（Ｋ＞Ｑ）［ＶＨ１］、Ｈ６０位（Ｎ＞Ａ）、Ｈ６１位（Ｑ＞Ｄ）、Ｈ６２位（Ｋ＞Ｓ）、Ｈ６３位（Ｆ＞Ｖ）［ＶＨ２］、Ｌ３３位（Ｉ＞Ｌ）、Ｌ３４位（Ｎ＞Ａ）［ＶＬ１］、及びＬ２７ｂ位（Ｖ＞Ｉ）、Ｌ３３位（Ｉ＞Ｌ）［ＶＬ２］を、正突然変異のための有望な候補として同定した。全ての位置はＫａｂａｔ ＥＵ番号付けスキームで得られる。
Figure 2022511396000021
注：逆突然変異は頭にｂがつき、正突然変異は頭にｆがつき、例えばｂＭ４８Ｉとは、メチオニンからイソロイシンの４８位（Ｋａｂａｔ）における逆突然変異（ヒト生殖系列アミノ酸から親抗体アミノ酸）を示す。
受容体フレームワークに基づくヒト化ＦＡＰ抗体の得られたＶＨ及びＶＬドメインは、以下の表１０で見ることができる。
Figure 2022511396000022
Figure 2022511396000023
１．１０．３ 新しいヒト化抗ＦＡＰ Ｆａｂ
ＶＨ及びＶＬの新しいヒト化変異体に基づいて、新しい抗ＦＡＰ Ｆａｂが発現された。
Figure 2022511396000024
クローン２１２に基づく新しいヒト化抗ＦＡＰ変異体の親和性を、抗ＦＡＰ抗体４Ｂ９と比較して分析した。更に、ヒト化変異体のヒト性（ｈｕｍａｎｎｅｓｓ）を計算し、その凝集開始温度を測定した。
Figure 2022511396000025
１．１１ ＦｃＲｎ／ヘパリン結合及びインシリコ電荷分布
ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中における抗体４Ｂ９及びＰ１ＡＥ１６８９の電荷分布を、インシリコモデルで計算した。このモデルによれば、４Ｂ９は大きなポジティブパッチを有し、これはヘパリン結合の増加と時に相関する。Ｐ１ＡＥ１６８９は、一方で、弱いヘパリン相互作用を示唆し得る大きなネガティブ電荷パッチを示す。
これらの予測は、ヘパリン親和性カラム及びｐＨ勾配と同様に、ＦｃＲｎ親和性カラム及びｐＨ勾配を用いる両抗体のクロマトグラフィによって確認された。国際公開第２０１５／１４０１２６号は、ＦｃＲｎ親和性クロマトグラフィカラムで決定された保持時間に基づき抗体のインビボ半減期を予測するための方法を開示しているが、ヘパリン結合は、細胞表面構造との非特異的相互作用と相関する。
実施例２
抗ＣＤ４０抗体Ｓ２Ｃ６のヒト化変異体の作製及び産生
２．１ 抗ＣＤ４０抗体Ｓ２Ｃ６のヒト化変異体の作製
２．２．１ 方法
配列番号５１のＶＨ及び配列番号５２のＶＬを含む抗ＣＤ４０結合体Ｓ２Ｃ６のヒト化中の好適なヒト受容体フレームワークの同定のために、２つの方法の組合せを使用した。一方においては、高い配列相同性を有する受容体フレームワークを探索し、このフレームワーク上にＣＤＲをグラフトし、どの逆突然変異を構想できるかを評価することによる、古典的手法をとった。より明確には、同定されたフレームワークの親抗体との各アミノ酸の違いを、その結合体の構造的完全性への影響について判断し、親配列への逆突然変異を、適切な場合はいつでも導入した。構造評価は、親抗体、及び、Ｂｉｏｖｉａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、バージョン４．５を使用して実装した、自社抗体構造相同性モデリングツールにより作製したそのヒト化版の両方のＦｖ領域相同性モデルに基いた。
他方では、自社開発されたインシリコツールを使用して、ヒト化型のＶＨドメイン及びＶＬドメインのお互いへの配向を予測した（参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１６０６２７３４号を参照のこと）。その結果を、親結合体の予測されたＶＨ－ＶＬドメイン配向と比較して、出発抗体と幾何学的に近いフレームワーク組合せについて選択した。理論的根拠は、その２個のドメインのペアリングの破壊的変化をもたらし得るＶＨ－ＶＬ接触面領域における、可能性のあるアミノ酸交換を検出することである。
２．２．２ 受容体フレームワークの選択及びその適合
２つの異なる受容体フレームワークを、下記の表１６及び表１８に記載されているように選択した。
Figure 2022511396000026
ＣＤＲ３後のフレームワーク領域を、ヒトＩＧＨＪ生殖系列ＩＧＨＪ６＊０１／０２（ＹＹＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ）（配列番号１１３）、及びヒトＩＧＫＪ生殖系列ＩＧＫＪ４＊０１／０２（ＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ）（配列番号１１４）から適合させた。受容体フレームワークに関連した部分は、下線で示されている。
構造的考慮に基づいて、ヒト受容体フレームワークから親結合体におけるアミノ酸への逆突然変異を、ＶＨ領域のＨ４３位（Ｑ＞Ｋ）、Ｈ４４位（Ｇ＞Ｓ）、Ｈ６９位（Ｍ＞Ｌ）、Ｈ７１位（Ｒ＞Ｖ）、Ｈ７３位（Ｔ＞Ｋ）、Ｈ８８位（Ｖ＞Ａ）、及びＨ１０５位（Ｑ＞Ｈ）と、ＶＬ領域のＬ２位（Ｉ＞Ｖ）、Ｌ４位（Ｍ＞Ｖ）、Ｌ８７位（Ｙ＞Ｆ）、及びＬ１０４位（Ｖ＞Ｌ）に導入した。一変異体では、突然変異Ｔ７０Ｓ（ＶＨ）は、この位置でのわずかに多い親水性残基の効果を検討するために含まれた。
全ての変異体は、推定される開発可能性ホットスポット（アスパラギン脱アミド）に取り組むために、Ｎ５４Ａ突然変異（ＶＨ）を含む。全ての位置はＫａｂａｔ ＥＵ番号付けスキームで得られる。
以下の表１４に、ヒト化変異体ＶＨ－ＶＬペアリングマトリックスを示す。
Figure 2022511396000027
突然変異Ｎ５４Ａは全てのＶＨ変異体に適用され、明示的に言及されていない。逆突然変異は頭にｂがつき、正突然変異は頭にｆがつき、その他の突然変異は頭にｘがつく。
Figure 2022511396000028
ＣＤＲ３後のフレームワーク領域を、ヒトＩＧＨＪ生殖系列ＩＧＨＪ６＊０１／０２（ＹＹＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ）（配列番号１１５）、及びヒトＩＧＫＪ生殖系列ＩＧＫＪ４＊０１／０２（ＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ）（配列番号１１６）から適合させた。受容体フレームワークに関連した部分は、下線で示されている。
構造的考慮に基づいて、ヒト受容体フレームワークから親結合体におけるアミノ酸への逆突然変異を、ＶＨ領域のＨ４４位（Ｇ＞Ｓ）、Ｈ４９位（Ｓ＞Ｇ）、Ｈ７１位（Ｒ＞Ｖ）、Ｈ７８位（Ｌ＞Ａ）、Ｈ９４位（Ｋ＞Ｒ）、及びＨ１０５位（Ｑ＞Ｈ）と、ＶＬ領域のＬ４２位（Ｋ＞Ｑ）、Ｌ４３位（Ａ＞Ｓ）、及びＬ８７位（Ｙ＞Ｆ）に導入した。更に、ＣＤＲ－Ｈ２における４つの位置を、正突然変異のための有望な候補、すなわち、全体的なヒト特性を増加させるための親結合体からヒト受容体生殖系列へのアミノ酸交換として、つまり、Ｈ６０（Ｎ＞Ｇ）、Ｈ６１（Ｑ＞Ｄ）、Ｈ６２（Ｋ＞Ｓ）、及びＨ６３（Ｆ＞Ｖ）を同定した。
全ての変異体は、推定される開発可能性ホットスポット（アスパラギン脱アミド）に取り組むために、Ｎ５４Ａ突然変異（ＶＨ）を含む。全ての位置はＫａｂａｔ ＥＵ番号付けスキームで得られる。
以下の表１６に、ヒト化変異体ＶＨ－ＶＬペアリングマトリックスを示す。
Figure 2022511396000029
逆突然変異は頭にｂがつき、正突然変異は頭にｆがつく。
２．２．３ 得られたヒト化ＣＤ４０抗体のＶＨ及びＶＬドメイン
受容体フレームワーク１に基づくヒト化ＣＤ４０抗体の得られたＶＨドメイン及びＶＬドメインは以下の表１７で見ることができ、受容体フレームワーク２に基づくヒト化ＣＤ４０抗体の得られたＶＨドメイン及びＶＬドメインは以下の表１８に列挙される。
Figure 2022511396000030
Figure 2022511396000031
２．２．４ ｈｕＩｇＧ１＿ＬＡＬＡ＿ＰＧフォーマットの新しいヒト化ＣＤ４０抗体
ＶＨ及びＶＬの新しいヒト化変異体に基づき、新しいＣＤ４０抗体を、国際公開第２０１２／１３０８３１Ａ１号に記載されている方法に従って、Ｆｃγ受容体への結合を阻害するエフェクタサイレントＦｃ（Ｐ３２９Ｇ；Ｌ２３４、Ｌ２３５Ａ）を用いてｈｕＩｇＧ１抗体として発現させた。
Figure 2022511396000032
ヒトＩｇＧ１＿ＬＡＬＡＰＧ抗体としてのヒト化ＣＤ４０抗体の例示的完全長配列を表２０で見ることができる。
Figure 2022511396000033
Figure 2022511396000034
２．２．５ ｈｕＩｇＧ１＿ＬＡＬＡ＿ＰＧフォーマットの新しいヒト化ＣＤ４０抗体の産生
異なるペプチド鎖をコードする発現ベクタの懸濁培養で増殖したＨＥＫ２９３－Ｆ細胞への一過性トランスフェクションにより、抗体を発現させた。ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）へのトランスフェクションを、細胞供給会社の使用説明書に従って、抗体ベクタのＭａｘｉｐｒｅｐ（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）の調製物、Ｆ１７に基づいた培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）、ＰＥＩｐｒｏ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ）、及び無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中１～２百万個の生細胞／ｍＬの細胞の初濃度を用いて、実施した。細胞培養物上清を、振盪フラスコ又は撹拌発酵槽における７日間の培養後、１４０００ｇで３０分間での遠心分離により収穫し、０．２２μｍフィルタにかけた。
ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン）クロマトグラフィを用いるプロテインＡ親和性クロマトグラフィにより、細胞培養物上清から二重特異性抗体を精製した。簡単に述べれば、滅菌濾過された細胞培養物上清を、ＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭ Ｎａ２ ＨＰＯ４、１ｍＭ ＫＨ２ ＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、及び２．７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）と平衡したＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ樹脂上に捕捉し、平衡緩衝液で洗浄し、２５ｍＭクエン酸塩（ｐＨ３．０）で溶出した。１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ９．０での中和後、凝集したタンパク質を、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中のサイズ排除クロマトグラフィ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により単量体抗体種から分離した。単量体タンパク質画分をプールし、例えば、必要であればＭＩＬＬＩＰＯＲＥ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（３０ＫＤ ＭＷＣＯ）遠心濃縮機を用いて濃縮し（必要な場合）、－８０℃で保存した。試料アリコートを、例えば、ＣＥ－ＳＤＳ、サイズ排除クロマトグラフィ、質量分析、及びエンドトキシン決定による、次の特性評価に用いた。
異なるヒト化ＣＤ４０抗体についての産生収量は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）クロマトグラフィを用いる分取親和性クロマトグラフィ後の収量から計算された力価値として、表２１に示す。
最終精製工程後のその分子の純度及び分子量を、還元剤の存在下及び非存在下において、ＣＥ－ＳＤＳ分析により分析した。Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）を製造会社の使用説明書に従って使用した。
その分子の凝集体含有量を、２５ｍＭリン酸カリウム、１２５ｍＭ塩化ナトリウム、２００ｍＭ Ｌ－アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３、ｐＨ６．７泳動用緩衝液において、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ分析用サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて、２５℃で分析した。
全ての抗体を直接比較するために、静的光散乱（Ｓｔａｔｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ：ＳＬＳ）及び印加した温度応力に応じた固有タンパク質蛍光を測定することによって、熱安定性を監視した。１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度である３０μｇのフィルタにかけたタンパク質試料を、２連でＯｐｔｉｍ ２機器（Ａｖａｃｔａ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌｔｄ）に適用した。温度を０．１℃／分で２５℃から８５℃に傾斜して、半径及び総散乱強度を回収した。固有タンパク質蛍光を決定するために、試料を２６６ｎｍで励起させ、発光を２７５ｎｍ～４６０ｎｍで回収した。全ての抗体について、凝集温度（Ｔａｇｇ）は６４℃～６９℃の間であった。これらは下記の表２１及び表２２中に示す。
異なるフレームワークを有するヒト化ＣＤ４０抗体についての産生収量は、下記の表２１又は表２２に示されている。
Figure 2022511396000035
Figure 2022511396000036
２．２．６ 組換えヒト及びカニクイザルＣＤ４０細胞外ドメインタンパク質の作製
以下のコンストラクトをクローニングし、ＨＥＫ２９３細胞における一過性トランスフェクションにより発現させた：
（１）Ｃ末端Ｈｉｓ－ＡｖｉＴａｇ（商標）タグを有するヒトＣＤ４０細胞外ドメイン（配列番号１のアミノ酸２１～１９３、ＮＣＢＩ寄託番号ＮＰ＿００１２４１）（配列番号２６６）
（２）Ｃ末端Ｈｉｓ－ＡｖｉＴａｇ（商標）タグを有する、カニクイザル（ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＣＤ４０細胞外ドメイン（アミノ酸２１～１９３、カニクイザルＣＤ４０細胞外ドメイン配列をＲｏｃｈｅカニクイザルｃＤＮＡデータベース（未公開データ）から取得した）（配列番号２６７）。
結合分析のためのＣＤ４０細胞外ドメイン抗原を、遺伝子合成（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ＧｍｂＨ ｓｅｒｖｉｃｅ、ドイツ）により作製し、標準クローニング手順を用いて、固有の制限部位を介してＲｏｃｈｅのインハウス発現ベクタへクローニングした。全てのコンストラクトのクローニングを配列決定により検証した。全ての抗原はＣＭＶプロモータの調節下で発現した。ＣＤ４０細胞外ドメインコンストラクトの一過性発現では、懸濁培養系のＨＥＫ２９３－Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国）にそれぞれのプラスミドをトランスフェクトした。一般的に、約２×１０６個の細胞／ｍＬにおけるＨＥＫ２９３－Ｆ細胞１Ｌに、製造会社の使用説明書に従って、ＰＥＩｐｒｏトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ、ドイツ）により複合体形成させた合計５００μｇのプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクション後、ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞を６日間インキュベートした。その後、細胞を遠心分離により収穫し、タンパク質を含有する上清を、０．２２μｍ減圧濾過システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてフィルタにかけた。Ｈｉｓ－ＡｖｉＴａｇ（商標）タグ付きタンパク質を、完全Ｈｉｓ－Ｔａｇ樹脂（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いるＩＭＡＣ親和性クロマトグラフィにより精製した。５０ｍＭ Ｎａ２ ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０での洗浄後、Ｈｉｓ－ＡｖｉＴａｇ（商標）融合タンパク質を、５００ｍＭイミダゾールを追加した洗浄緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて溶出した。凝集したタンパク質は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４におけるサイズ排除クロマトグラフィ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により、単量体融合タンパク質から分離した。単量体タンパク質画分をプールし、例えば、必要であればＭＩＬＬＩＰＯＲＥ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（１０ＫＤ ＭＷＣＯ）遠心濃縮機を用いて濃縮し（必要な場合）、－８０℃で保存した。試料アリコートを、例えば、ＣＥ－ＳＤＳ、サイズ排除クロマトグラフィ、及び質量分析による、次の特性評価に用いた。
ＣＤ４０細胞外ドメインのビオチン化：
Ｃ末端ＡｖｉＴａｇ（商標）を含有するヒト又はカニクイザルＣＤ４０細胞外ドメインコンストラクトの酵素部位特異的ビオチン化を、製造会社の使用説明書に従ってＢｉｒＡビオチン－タンパク質リガーゼキット（Ａｖｉｄｉｔｙ ＬＬＣ、米国）を用いることにより実施した。簡単に述べれば、ＢｉｏｍｉｘＡ（１０×濃度：０．５Ｍビシン緩衝液、ｐＨ８．３）及びＢｉｏｍｉｘＢ（１０×濃度：１００ｍＭ ＡＴＰ、１００ｍＭ ＭｇＯＡｃ、５００μＭ ｄ－ビオチン）の１／１０体積を、ＡｖｉＴａｇ（商標）含有タンパク質に加え、続いて、１０ｎｍｏｌタンパク質当たり２．５μｇのＢｉｒＡリガーゼを加えた。その反応混合物を３０℃で１時間インキュベートし、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ ｐｒｅｐａｃｋｅｄ ＨｉＬｏａｄカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン）におけるサイズ排除クロマトグラフィにより精製した。
２．２．７ ヒト／カニクイザルＣＤ４０結合表面プラズモン共鳴スペクトロスコピアッセイ
捕捉システム（１０μｇ／ｍＬヤギ抗ヒトＦ（ａｂ）’２；注文コード：２８９５８３２５；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ、スウェーデン）の約１２０００レゾナンスユニット（ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｕｎｉｔ：ＲＵ）を、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅにより供給されたアミンカップリングキットを用いることにより、ｐＨ５．０においてＣＭ５チップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＢＲ－１００５－３０）上にカップリングした。試料及びシステムの緩衝液は、ＰＢＳ－Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水）ｐＨ７．４であった。フローセルは２５℃に設定され（試料ブロックは１２℃に設定）、泳動用緩衝液で２回プライミングされた。抗体は、５０ｎＭ溶液を５μＬ／分の流量で３０秒間注射することにより捕捉された。３００ｎＭから開始し、１：３希釈での溶液中様々な濃度でのヒトＣＤ４０細胞外ドメイン又はカニクイザルＣＤ４０細胞外ドメインを、３０μＬ／分の流量で３００秒間注射することにより、会合を測定した。解離相を、試料溶液から泳動用緩衝液へ切り換えることにより引き起こして、１２００秒間までモニタした。グリシンｐＨ２．１溶液での３０μＬ／分の流量、６０秒間の洗浄により表面を再生させた。バルク屈折率差を、ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２表面から得られた応答を差し引くことにより補正した。ブランク注射もまた差し引かれる（＝二重参照）。見かけのＫＤ及び他の動力学的パラメータの計算について、Ｌａｎｇｍｕｉｒ １：１モデルを用いた。見かけのＫｄを、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｂ４０００評価ソフトウェア（バージョン１．１）を用いて計算した。
２．２．８ ＣＤ４０特異的ヒト化抗体の性質決定のための細胞結合アッセイ
ＣＤ４０ポジティブ細胞（Ｒａｊｉ細胞）を、トリプシンを用いて培養ボトルから剥離し、Ｃａｓｙ細胞カウンタを用いてカウントした。４℃でのペレット化後、細胞をＦＡＣＳ緩衝剤（ＰＢＳ中２．５％ＦＣＳ）中に再懸濁し、２．０Ｅ＋０６個の細胞／ｍＬに調整し、９６ウェルＰＰ Ｖ底プレート（２５μＬ／ウェル＝５．０Ｅ＋０４Ｚｅｌｌｅｎ／ウェル）に分配した。
ＣＤ４０特異的抗体をＦＡＣＳ緩衝液中２０μｇ／ｍＬに調整し、１０μｇ／ｍＬの最終濃度を生じた。２０μＬを２５μＬ細胞懸濁液へ加え、４℃で１時間インキュベートした。その後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液において２回洗浄した。洗浄後、細胞を、二次抗体（＜ｈｕＩｇＧ＞－Ａｌｅｘａ４８８、ｃ＝１０μｇ／ｍＬ）を含有する５０μＬ ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、４℃で１時間インキュベートした。その後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液において２回洗浄し、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ（ＢＤ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いる測定のために７０μＬ／ウェルＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。
表２３には、ヒト化ＣＤ４０抗体のＣＤ４０発現細胞（Ｒａｊｉ細胞）との親和性（Ｂｉａｃｏｒｅにより測定）及び細胞結合が示されている。
Figure 2022511396000037
２．２．９ ＵＨＲ－ＥＳＩ－ＱＴＯＦ質量分析による抗体の性質決定
試料を、２％ギ酸（ｖ／ｖ）を含む４０％アセトニトリルを用いるＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ ５×２５０ｍｍカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、フライブルク、ドイツ）上でのＨＰＬＣにより脱塩した。総質量を、ＴｒｉＶｅｒｓａ ＮａｎｏＭａｔｅソース（Ａｄｖｉｏｎ、Ｉｔｈａｃａ、ＮＹ）を備えたｍａＸｉｓ ４Ｇ ＵＨＲ－ＱＴＯＦ ＭＳシステム（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｋ、ブレーメン、ドイツ）におけるＵＨＲ－ＥＳＩ－ＱＴＯＦ ＭＳにより決定した。データ収集を９００～４０００ｍ／ｚ（ＩＳＣＩＤ：０．０ｅＶ）において行った。生の質量スペクトルを評価し、自社開発されたソフトウェアツールを用いて個々の相対モル質量へ変換した。
２．２．１０ 抗体の熱安定性評価
試料を、２０ｍＭヒスチジン／塩化ヒスチジン、１４０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中１ｍｇ／ｍＬの濃度で調製し、０．４μｍフィルタプレートを通しての遠心分離により光学３８４ウェルプレートへ移し、パラフィンオイルで覆った。試料を２５℃から８０℃へ０．０５℃／分の率で加熱しながら、流体力学半径を、ＤｙｎａＰｒｏプレートリーダ（Ｗｙａｔｔ）における動力学的光散乱により繰り返し、測定した。あるいは、試料を１０μＬマイクロキュベットアレイへ移し、それらを２５℃から９０℃へ０．１℃／分の率で加熱しながら、静的光散乱データ及び２６６ｎｍレーザでの励起による蛍光データをＯｐｔｉｍ１０００装置（Ａｖａｃｔａ Ｉｎｃ．）で記録した。凝集開始温度は、流体力学半径（ＤＬＳ）又は散乱光強度（Ｏｐｔｉｍ１０００）が増加し始める温度として定義される。融解温度は、蛍光強度対波長を示すグラフにおける屈曲点として定義される。
実施例３
３＋１フォーマットでＣＤ４０及びＦＡＰを標的化する二重特異性抗原結合分子の作製及び産生
３．１ ＣＤ４０と線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を標的とする二重特異性抗原結合分子の作製
３＋１フォーマットの二重特異性ＣＤ４０－ＦＡＰ抗体を以下のように調製した：第１の重鎖は、ＦｃドメインのＮ末端に接続されたＣＤ４０に結合する２つのＦａｂ断片の２つのＶＨ－ＣＨ１断片を含んでいた。第２の重鎖は、ＦｃドメインのＮ末端に接続したＣＤ４０に結合する第３のＦａｂ断片のＶＨ－ＣＨ１断片と、ＦｃドメインのＣ末端に接続したＦＡＰに結合するクロスＦａｂ断片のＶＨ－Ｃカッパ又はＶＬ－ＣＨ１断片と、を含んでいた。分子は更に、ＣＤ４０に結合する３つの軽鎖と、ＦＡＰに結合するクロスフォーマットの更なる軽鎖を含んでいた（図１Ｃ及び図１Ｄ）。比較のために、二重特異性ＣＤ４０－ＦＡＰ抗体を、ＦｃのＣ末端で１つのＦＡＰ結合部分と結合した２つのＣＤ４０結合部分からなる２＋１フォーマット（図１Ａ及び図１Ｂ）で、又はＦｃのＣ末端で１つのＦＡＰ結合部分と結合した４つのＣＤ４０結合部分からなる４＋１フォーマット（図１Ｅ及び図１Ｆ）で調製した。二重特異性ＣＤ４０－ＦＡＰ抗体は、新しい抗ＦＡＰクローン２１２（図１Ａ、図１Ｃ、及び図１Ｅ）、又はＦＡＰクローン４Ｂ９（図１Ｂ、図１Ｄ、及び図１Ｆ）を含んでいた。ＦＡＰ結合体２８Ｈ１及び４Ｂ９の作製及び調製は、国際公開第２０１２／０２０００６Ａ２号に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれている。３＋１、４＋１、及び２＋１分子を作製するために、ノブ・イントゥ・ホール技術を使用してヘテロ二量体化を達成した。Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異は第１の重鎖ＨＣ１（Ｆｃノブ重鎖）に導入し、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ突然変異は第２の重鎖ＨＣ２（Ｆｃホール重鎖）に導入した。二重特異性のフォーマットに関係なく、全ての場合において、国際公開第２０１２／１３０８３１Ａ１号に記載された方法に従って、Ｆｃγ受容体との結合を抑止するために、エフェクタサイレントＦｃ（Ｐ３２９Ｇ；Ｌ２３４、２３４Ａ）が使用される。二重特異性分子の配列を表２４に示す。
全ての遺伝子は、ＣＭＶプロモータエンハンサ断片と組み合わされたＭＰＳＶコアプロモータからなるキメラＭＰＳＶプロモータの調節下で一過性に発現する。発現カセットはまた、ｃＤＮＡの３’末端に合成ポリＡシグナルを含む。発現ベクタはまた、ＥＢＮＡ（エプスタイン・バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ）核内抗原）含有宿主細胞におけるエピソーム複製のためのｏｒｉＰ領域も含有する。
Figure 2022511396000038
Figure 2022511396000039
Figure 2022511396000040
Figure 2022511396000041
Figure 2022511396000042
Figure 2022511396000043
Figure 2022511396000044
Figure 2022511396000045
Figure 2022511396000046
Figure 2022511396000047
Figure 2022511396000048
３．２ ＦＡＰ及びＣＤ４０を標的化する二重特異性抗原結合分子の産生
線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）及びＣＤ４０を標的化する二重特異性抗原結合分子を、４つの異なるペプチド鎖をコードする発現ベクタの、懸濁培養で増殖したＨＥＫ細胞への一過性トランスフェクションにより発現させた。ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へのトランスフェクションを、細胞供給会社の使用説明書に従って、抗体ベクタのＭａｘｉｐｒｅｐ（Ｑｉａｇｅｎ）の調製物、Ｆ１７培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）、Ｐｅｉｐｒｏ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ）、及び無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中１～２百万個の生細胞／ｍＬの細胞の初濃度を用いて、実施した。細胞培養物上清を、振盪フラスコ又は撹拌発酵槽における７日間の培養後、１４０００ｇで３０分間での遠心分離により収穫し、０．２２μｍフィルタにかけた。
ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン）クロマトグラフィを用いる親和性クロマトグラフィにより、細胞培養物上清から抗体を精製した。簡単に述べれば、滅菌濾過された細胞培養物上清を、ＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭ Ｎａ２ ＨＰＯ４、１ｍＭ ＫＨ２ ＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、及び２．７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）と平衡したＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ樹脂上に捕捉し、平衡緩衝液で洗浄し、２５ｍＭクエン酸塩（ｐＨ３．０）で溶出し、続いて１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ９．０で中和した。プロテインＡ精製後に受け取った製品品質に応じて、ブチル－セファロース４ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン）樹脂を用いる疎水性相互作用クロマトグラフィ（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＨＩＣ）精製工程が含まれた。ＨＩＣ精製の前に、タンパク質をＨＩＣ平衡緩衝液に対して透析した。ＨＩＣ精製は、平衡／洗浄緩衝液として４０ｍＭ酢酸塩、１．５Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ５．５）、及び溶出緩衝液として４０ｍＭ酢酸塩（ｐＨ５．５）を用いて行い、直線勾配を精製に適用した。続いて、凝集したタンパク質は、２０ｍＭ ヒスチジン、１４０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中でのサイズ排除クロマトグラフィ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって、単量体抗体種から分離した。単量体タンパク質画分をプールし、例えば、必要であればＭＩＬＬＩＰＯＲＥ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（３０ＫＤ ＭＷＣＯ）遠心濃縮機を用いて濃縮し（必要な場合）、－８０℃で保存した。試料アリコートを、例えば、ＣＥ－ＳＤＳ、サイズ排除クロマトグラフィ、質量分析、及びエンドトキシン決定による、次の特性評価に用いた。調製した二重特異性抗体の産生収量及び品質を以下の表２５に示す。
Figure 2022511396000049
実施例４
ＣＤ４０及びＦＡＰを標的化する二重特異性抗原結合分子の性質決定
４．１ ヒトＦＡＰ発現マウス線維芽細胞への結合
細胞表面ＦＡＰへの結合を、ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン１９を発現するヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ｈｕＦＡＰ）を用いて試験した。ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン１９は、発現ベクタｐＥＴＲ４９２１によりマウス胎仔線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５８）をトランスフェクションすることで作製して、１．５μｇ／ｍＬ以下のピューロマイシン選択ｈＦＡＰを発現させた。
ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰを、１０％ウシ胎仔血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１６１４０、ロット番号１７９７３０６Ａ）を追加した１×ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ：ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号４２４３０－０２５）で培養した。ＦＡＰ発現細胞の選択のために、培地へ１．５μｇ／ｍＬピューロマイシン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号Ａ１１１３８－０３）を加えた。ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈＦＡＰ細胞を、酵素を含まない細胞解離緩衝液（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１３１５１０１４）を用いることにより、フラスコから取り出した。０．３×１０５個のＮＩＨ／３Ｔ３－ｈＦＡＰクローン１９細胞を、１０％ＦＢＳを有する１×ＤＭＥＭ ２００μＬ中で、丸底９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－ｏｎｅ、ＣＥＬＬＳＴＡＲ、カタログ番号６５０１８５）の各ウェルへ加えた。プレートを１７００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を弾き飛ばした。細胞を、４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００－４２２２－２６）２００μＬにより１回洗浄した。示された濃度範囲で二重特異性抗原結合分子（一次抗体）又はアイソタイプ対照抗体ＤＰ４７を含有する５０μＬ／ウェルで４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液中に、全ての試料を再懸濁し（２連）、４℃で１２０分間インキュベートした。その後、細胞を２００μＬで４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した。細胞を更に、Ｒ－フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート型ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－１１６－０９８）二次抗体を含有する、２５μＬ／ウェルで４℃の冷二次抗体溶液（二次抗体の１：５０希釈溶液）で染色し、暗闇中において４℃で６０分間インキュベートした。細胞を、２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、０．２μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１０２３６２７６００１）を含有する８５μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、同日、５レーザＬＳＲ－Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを含む）を用いて捕捉した。データ解析はＦｌｏｗＪｏバージョン１０ソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ）を用いて実施した。
図４に示されているように、ＦＡＰについて一価の二重特異性抗体は、ヒトＦＡＰ発現標的細胞と結合する。したがって、ＦＡＰ標的化抗ＣＤ４０抗原結合分子だけが直接的な腫瘍標的化特性を示す。四価、三価、及び二価の抗ＣＤ４０コンストラクトの、Ｃ末端ＦＡＰ（２１２）又はＦＡＰ（４Ｂ９）結合体によるヒトＦＡＰへのとの結合親和性は同等である。最も強いＦＡＰ結合は、ＦＡＰ（４Ｂ９）結合部分（Ｐ１ＡＥ２４８７）を持つ２＋１フォーマットで観察された。アイソタイプ対照抗体ＤＰ４７のＮＩＨ／３Ｔ３－ｈＦＡＰ細胞への結合は検出されなかった。異なる二重特異性抗体について測定したＥＣ５０値を以下の表２６に示す。
Figure 2022511396000050
４．２ ヒトＣＤ４０発現初代Ｂ細胞への結合
細胞表面ＣＤ４０への結合は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離したヒト初代Ｂ細胞を用いて試験した。ＰＢＭＣを単離するために、Ｓｔｉｆｔｕｎｇ Ｚｕｒｃｈｅｒ Ｂｌｕｔｓｐｅｎｄｅｄｉｅｎｓｔ ＳＲＫからバフィコートを得た。５０ｍＬのバフィコートを、同じ容量のＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１００１００２３）中に希釈した。５０ｍＬのポリプロピレン遠心分離チューブ（ＴＰＰ、カタログ番号９１０５０）に１５ｍＬのＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０７８５１）を供給し、チューブ当たり２５ｍＬのバフィコート／ＰＢＳ溶液をＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）の上に注意深く積層させた。チューブを、２０００ｒｐｍで２４分間、室温において低加速及び中断なしで遠心分離した。その後、ＰＢＭＣを界面から収集し、ＰＢＳで３回洗浄し、１０ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁し、細胞をＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ細胞カウンタＡｃ・Ｔ（商標）５ｄｉｆｆ ＯＶ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、カタログ番号６６０５５８０）で細胞型及び細胞数について分析した。ＰＢＭＣからＢ細胞を単離する前に、ＣＤ１４ポジティブ細胞をＣＤ１４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０－０５０－２０１）で磁気標識し、続いてａｕｔｏＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０－０９２－５４５）で単離することによって、ＣＤ１４ポジティブ画分を除去した。ＣＤ１４ネガティブ画分を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂ細胞単離キットＩＩ（カタログ番号１３０－０９１－１５１）及びａｕｔｏＭＡＣＳ（登録商標）分離によりその後のＢ細胞単離に使用した。０．３ｘ１０５Ｂ細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）ペニシリンストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１５０７０－０６３）、１％（ｖ／ｖ）Ｌ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２５０３０－０２４）、１％（ｖ／ｖ）ナトリウム－ピルビン酸（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１３６０－０３９）、１％（ｖ／ｖ）ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１１４０－０３５）、及び５０μＭ β－メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号３１３５０－０１０）を供給した、ロズウェルパーク記念研究所培地（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｍｅｄｉｕｍ：ＲＰＭＩ）１６４０（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号３１８７０－０２５）からなる２００μＬのＲ１０培地を、丸底９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－ｏｎｅ、ＣＥＬＬＳＴＡＲ、カタログ番号６５０１８５号）の各ウェルへ加えた。プレートを１７００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を弾き飛ばした。細胞を、４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００－４２２２－２６）２００μＬにより１回洗浄した。示された濃度範囲で二重特異性抗原結合分子（一次抗体）又はアイソタイプ対照抗体ＤＰ４７を含有する５０μＬ／ウェルで４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液中に、全ての試料を再懸濁し（２連）、４℃で１２０分間インキュベートした。その後、細胞を２００μＬで４℃の冷ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した。細胞を更に、Ｒ－フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート型ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－１１６－０９８）二次抗体を含有する、２５μＬ／ウェルで４℃の冷二次抗体溶液（二次抗体の１：５０希釈溶液）で染色し、暗闇中において４℃で６０分間インキュベートした。細胞を、２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、０．２μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１０２３６２７６００１）を含有する８５μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、同日、５レーザＬＳＲ－Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを含む）を用いて捕捉した。データ解析はＦｌｏｗＪｏバージョン１０ソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ）を用いて実施した。
図５で示されるように、示された全てのクローンはＣＤ４０に結合するが、ＣＤ４０ポジティブＢ細胞に対するそれらの結合強度（ＥＣ５０値及びシグナル強度）は変動する。これらのＦＡＰ結合部分に関係なく、二価の抗ＣＤ４０抗体は、四価の抗ＣＤ４０抗体と比較して、より高いＥＣ５０レベルを示し、より高い結合プラトに到達する。これは、抗体当たりのＣＤ４０結合部位の占有率が高いこと、及び二価のＣＤ４０フォーマットと比較して四価の結合力が増加することによって説明される。三価の抗ＣＤ４０抗体は、二価の抗ＣＤ４０抗体と比較して結合プラトが低いが、四価の抗ＣＤ４０抗体と比較して結合プラトが高い。ネガティブ対照抗体のＢ細胞への結合は検出されなかった。異なる二重特異性抗体について測定したＥＣ５０値を以下の表２７に示す。
Figure 2022511396000051
実施例５
ＦＡＰ標的化抗ヒトＣＤ４０結合分子の機能的性質
５．１ ＦＡＰ標的化抗ヒトＣＤ４０結合分子によるヒトＢ細胞のＣＤ４０媒介性活性化
ＣＤ４０の連結は、Ｂ細胞及び樹状細胞（ＤＣ）の成熟及び活性化を誘導し、これらの細胞型の生存を促進する。ＣＤ４０シグナル伝達により、サイトカイン産生と、Ｂ細胞及びＤＣの表面上での共刺激分子発現とが増加する（Ｓ．Ｑｕｅｚａｄａら、「Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．」（２００４年）第２２巻、第３０７～３２８頁；Ｓ．Ｄａｎｅｓｅら、「Ｇｕｔ．」（２００４年）第５３巻、第１０３５～１０４３頁；Ｇ．Ｂｉｓｈｏｐら、「Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ．」（２００７年）第５９７巻、第１３１～１５１頁）。
異なるＦＡＰ依存性抗ＣＤ４０抗体のアゴニスティック特性及びＦＡＰ特異性を試験するために、ヒトバフィコートから得られたＤａｕｄｉ細胞又は初代Ｂ細胞を、ＦＡＰコーティング化ビーズの存在下におけるＦＡＰ依存性アゴニスティック抗ヒトＣＤ４０抗体でインキュベートし、Ｂ細胞活性化をＦＡＣＳにより測定した。
５．１．１．抗原の供給源としてＦＡＰコーティングＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を用いる、ＦＡＰ標的化抗ヒトＣＤ４０結合分子によるヒトＤａｕｄｉ細胞の活性化
ヒトＣＤ４０（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２１３）の高発現レベルを有するヒトＢリンパ芽球細胞株である、１ｘ１０５Ｄａｕｄｉ細胞を、９６ウェル平底プレートの１ウェル当たり１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１６１４０、ロット番号１７９７３０６Ａ）を補充した１×ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号４２４３０－０２５）１００μＬで加えた。ストレプトアビジンＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１１２０５Ｄ）を、製造会社の使用説明書に従って、ビオチン化ヒトＦＡＰ（自社製造）でコーティングし（６．５×１０４個のビーズ：０．０１μｇのタンパク質の結合能）、１０％ＦＢＳを有する５０μＬの１×ＤＭＥＭにおいて２：１のビーズ：細胞の比でＤａｕｄｉ細胞へ加えた。対照として、非コーティング化ビーズを、Ｄａｕｄｉ細胞に加えた。ＦＡＰ標的化抗ヒトＣＤ４０抗体を、１０％ＦＢＳ培地を有する５０μＬの１×ＤＭＥＭ中でＤａｕｄｉ細胞に６．７ｎＭ～０．００３ｎＭからまでの範囲の濃度（３×希釈系列）で加えた。ポジティブ対照として、ＦＡＰ依存性アゴニスティック抗ヒトＣＤ４０抗体ＳＧＮ－４０（ＩｇＧ１、ＩＮＮ：ダセツズマブ）を使用した。抗体はＣＤ４０に対して二価である。ＳＧＮ－４０抗体は生物活性のためにＦｃ受容体架橋を必要とすることが文献に記載されているため（Ｃ．Ｌａｗら、「Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ」（２００５年）第６５巻、第８３３１～８３３８頁）、この抗体をＤａｕｄｉ細胞へと加える前に、架橋ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ断片特異的Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－００６－００８）により３０分間インキュベートした。４８時間後、細胞を、９６ウェル丸底プレートへ移し、ＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳ中３μｇ／ｍＬのＦｃ受容体ブロッキングマウスＩｇＧアイソタイプ対照（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１０４００Ｃ）５０μＬでインキュベートした。４℃で１５分間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の蛍光標識抗体の混合物５０μＬを細胞へ加えた。以下の蛍光標識抗体を用いた：抗ヒトＣＤ８３ ＢＶ４２１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＨＢ１５ｅ、カタログ番号３０５３２４）、抗ヒトＣＤ８０ ＢＶ６０５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＬ３０７．４、カタログ番号５６３３１５）、抗ＨＬＡ－ＡＢＣ ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＧ４６－２．６、カタログ番号５５５５５２）、抗ヒトＣＤ１４ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＨＣＤ１４、カタログ番号３２５６２２）、抗ヒトＣＤ３ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＵＣＨＴ１、カタログ番号３００４３０）、抗ヒトＣＤ７０ ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローン１１３－１６、カタログ番号３５５１０４）、抗ヒトＣＤ８６ ＰＥ－ＣＦ５９４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＦＵＮ－１、カタログ番号５６２３９０）、抗ＨＬＡ－ＤＲ ＡＰＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＧ４６－６、カタログ番号５５９８６６）、及び抗ヒトＣＤ１９ ＡＰＣ－Ｈ７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＳＪ２５Ｃ１、カタログ番号５６０１７７）。生細胞と死細胞とを区別するために、生死判別色素Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ（商標）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２３１０２）を抗体混合物に加えた。４℃で３０分間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、２００μＬのＰＢＳ中に再懸濁した。細胞を、同日、５レーザＬＳＲ－Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡソフトウェアを含む）を用いて分析した。データ解析はＦｌｏｗＪｏバージョン１０ソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ）を用いて実施した。ＣＤ１４及びＣＤ３についてネガティブで、かつＣＤ１９についてポジティブな生細胞（ａｑｕａネガティブ）を、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、及びＣＤ８６発現について分析した。
アゴニスト抗ＣＤ４０抗体との２日間のインキュベーション後に分析されたＤａｕｄｉ細胞は、示された全ての抗体についてＣＤ７０発現の増加を示した（図６Ａ及び図６Ｂ参照）。これらの活性化マーカの上方制御は、異なるＦＡＰ標的化抗体の場合、ＦＡＰに依存した。ＦＡＰ結合部分に関係なく、２＋１フォーマットの二重特異性ＦＡＰ－ＣＤ４０抗体によるＣＤ７０上方制御は、３＋１又は４＋１フォーマットの二重特異性ＦＡＰ－ＣＤ４０抗体により誘導される上方制御と比較して高かった。ＦＡＰの非存在下（非コーティング化ビーズ）において、示されたＣＤ４０に対する二価の二重特異性抗体に関してＣＤ７０の増加は観察されず、一方で、三価又は四価のＣＤ４０結合分子はＣＤ７０の上方制御を誘導したが、ＦＡＰの存在下よりも程度は低かったことから、Ｄａｕｄｉ細胞における三価及び四価のＣＤ４０結合体のＦＡＰ非依存性のＣＤ４０活性化は低いが検出可能であることが示された。
５．１．２ 抗原の供給源としてＦＡＰコーティングＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を用いる、ＦＡＰ標的化抗ヒトＣＤ４０結合分子によるヒトＢ細胞の活性化
セクション0に記載されているように、Ｂ細胞をバフィコートから単離し、１００μＬのＲ１０培地中１×１０５個のＢ細胞を９６ウェル平底プレートのウェル毎加えた。ストレプトアビジンＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１１２０５Ｄ）を、製造会社の使用説明書に従って、ビオチン化ヒトＦＡＰ（自社製造）でコーティングし（６．５×１０４個のビーズ：０．０１μｇのタンパク質の結合能）、５０μＬのＲ１０培地において２：１のビーズ：細胞の比でＢ細胞へ加えた。対照として、非コーティング化ビーズをＢ細胞に加えた。ＦＡＰ標的化抗ヒトＣＤ４０抗体（セクション0に記載）を、５０μＬのＲ１０培地中でＢ細胞へ加えた。２日後、Ｂ細胞を、実施例５．１．１で特定化された染色及び分析手順に従い、ＦＡＣＳにより分析した。
アゴニスト抗ＣＤ４０抗体との２日間のインキュベーション後に分析されたＢ細胞は、示された全ての抗体についてＣＤ８６発現の増加を示した（図７Ａ及び図７Ｂ参照）。ＣＤ８６の上方制御は、異なるＦＡＰ標的化抗体では、ＦＡＰに依存した。異なる示された抗体によって誘導された最大ＣＤ８６発現レベルは同等であった。より低い抗体濃度では，３＋１及び４＋１フォーマットは、それらのＦＡＰ結合部分に関係なく、ＦＡＰ（２１２）又はＦＡＰ（４Ｂ９）結合部分を有する２＋１フォーマットと比較して、わずかに高いＢ細胞活性化を誘導した。
５．２．ＦＡＰ標的化抗ＣＤ４０結合分子によるＤＣのＣＤ４０媒介活性化、及びその後のＴ細胞のプライミング
ＦＡＰ依存性抗ヒトＣＤ４０抗体によって活性化された、効率的にＴ細胞をプライミングするＤＣの能力を実証するために、インビトロＴ細胞プライミングアッセイを確立した。これらのアッセイについて、ヒトＣＤ４０受容体を発現するトランスジェニックマウス（ｈｕＣＤ４０ｔｇマウス；類似したヒト及びマウスＣＤ４０受容体発現パターンを有するマウス；Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド；Ｔａｃｏｎｉｃにより作製）の脾臓由来のＤＣを単離し、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド又はオボアルブミン（ＯＶＡ；ＤＥＣ－２０５受容体媒介性抗原取込み））のいずれかでパルス化し、異なるアゴニスティック抗ヒトＣＤ４０抗体でインキュベートした。二重特異性抗原結合分子のＦＡＰ依存性を示すために、ＦＡＰコーティング化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を介してＦＡＰを供給した。２４時間後、ＣＤ８ポジティブＴ細胞を、ＯＴ１マウス（これらのマウスのＣＤ８ポジティブＴ細胞は、全て、Ｈ２－Ｋｂとの関連において、ＳＩＩＮＦＥＫＬを認識するトランスジェニックＴＣＲを有する；Ｃ５７ＢＬ／６－Ｔｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）１１００Ｍｊｂ／Ｃｒｌ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）の脾臓から単離し、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ：ＣＦＳＥ）標識し、パルス化されたＤＣに加えた。実験４日目に、Ｔ細胞増殖をＦＡＣＳによって分析した。
５．２．１．ＦＡＰ標的化抗ＣＤ４０結合分子により活性化された、ＯＶＡパルス化ＤＣを介してのＴ細胞プライミング
ＤＣをｈｕＣＤ４０ｔｇマウスの脾臓から単離した。脾臓ＤＣを単離するために、ｈｕＣＤ４０ｔｇマウス由来の脾臓を、カルシウム２＋（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１４０２５－０５）、２５０μＬの１０ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＤ溶液（最終濃度１ｍｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号１１０８８８６６００１）、及び１２．５μＬの１０ｍｇ／ｍＬ ＤＮａｓｅ溶液（最終濃度０．０５ｍｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄ５０２５－１５０ＫＵ、ロット番号ＳＬＢＲ０５３５Ｖ）を含む、２．２５ｍＬハンクス平衡塩類溶液（Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＨＢＳＳ）を含有する６ウェルプレートの１ウェルに入れた。２１Ｇ針（Ｂｒａｕｎ、カタログ番号４６５７５２７）を備える３ｍＬシリンジ（ＢＤ、カタログ番号３０９６５８）を用いて脾臓を膨らませ、続いて、はさみを活用して小片に引き裂いた。３７℃で２５分間のインキュベーション後、５０μＬの０．５Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ、カタログ番号Ａ４８９２．１０００）を加え、その後、３７℃で５分間の２回目のインキュベーション工程を行った。脾細胞及び小片の脾臓組織を含有する溶液を、４０μｍフィルタ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５２３４０）を通して５０ｍＬポリプロピレン遠心管へとフィルタにかけた。残りの脾臓組織小片を、３ｍＬシリンジプラグの末端でフィルタを通じて砕いた。次の工程では、５０ｍＬチューブを、室温で５分間、１５００ｒｐｍで遠心分離し、上清を捨て、赤血球を溶解させるために、脾細胞へ１ｍＬの１×細胞溶解緩衝液（蒸留水で１：１０希釈）（ＢＤ、カタログ番号５５５８９９）を加えた。室温での４分間のインキュベーション後、２０ｍＬのＲ１０を加え、続いて、室温で５分間１５００ｒｐｍにて遠心分離工程を行った。上清を除去し、脾細胞を３０ｍＬのＲ１０中に再懸濁し、細胞の数及び生存率を、自動ＥＶＥ細胞カウンタ（ＶＷＲ、カタログ番号７３４－２６７５）で決定した。ａｕｔｏＭＡＣＳ（登録商標）分離によりＤＣを単離するために、マウスＣＤ１１ｃ ＵｌｔｒａＰｕｒｅマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０－１０８－３３８）を、製造会社の使用説明書に従って使用した。その後、９６ウェル平底プレートのウェル当たり５０μＬのＲ１０中、０．２５×１０５個のＤＣを播種した。
次いで、ＤＣを、ポジティブ対照としてＤＣによる取り込み及びプロセシングを必要としない、１ｎｇ／ｍＬのＳＩＩＮＦＥＫＬ（オボアルブミン残基２５７～２６４、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ、カタログ番号ＡＳ－６０１９３－５、ロット番号１３６０６１８）でパルス化するか、又は抗原としてＯＶＡタンパク質を負荷した。Ｔｏｌｌ様受容体（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＴＬＲ）刺激非依存性様式（追加のＴＬＲ刺激は、ＤＣの高い全体的な活性化をもたらす可能性があり、そのことは、アゴニスティック抗ＣＤ４０抗体での刺激による種々の活性化状態の検出を不可能にする）でのＯＶＡ取込みを促進するために、ビオチン化抗マウスＤＥＣ２０５抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、クローンＮＬＤＣ－１４５、カタログ番号１３０－１０１－８５４）と組み合わせてＯＶＡ抗原送達試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０－０９４－６６３）を、製造会社のプロトコルに従って使用した。簡単に述べれば、ＤＣを、ＣＤ８ポジティブのクロス提示ＤＣ上に高度に発現しているＤＥＣ２０５受容体と結合するビオチン化抗体でインキュベートした（Ｍ．Ｌａｈｏｕｄら、「Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．」（２０００年）第１２巻、第５号、第７３１～７３５頁）。その後、ＯＶＡ送達試薬、ＦＩＴＣに連結された抗ビオチン抗体、及びＯＶＡを細胞に加えることで、ＯＶＡのＤＥＣ２０５受容体媒介性取り込みを引き起こした。ネガティブ対照を提供するために、ＯＶＡの添加なしに、抗ＤＥＣ２０５抗体でのみＤＣを標識した。加えて、ヒトＦＡＰコーティング化又は非コーティング化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を、５０μＬのＲ１０中で、セクション0に記載されているように、２：１のビーズ対細胞比でＤＣに加えた。次の工程では、異なるアゴニスティック抗ＣＤ４０抗体を、５０μＬのＲ１０中に６．７ｎＭ～０．０１ｎＭ（１０倍希釈系列）の範囲の濃度で加えた。この実験設定では、１つの２１２又は４Ｂ９ ＦＡＰ結合部位を含む二重特異性２＋１、３＋１、及び４＋１抗ヒトＣＤ４０抗体を、架橋ＳＧＮ－４０と比較した。
翌日、ＯＴ１マウスから脾臓ＣＤ８ポジティブ細胞を単離した。そのために、ＯＴ１マウスの脾臓を、３ｍＬのシリンジプラグの末端を５０ｍＬのチューブに入れ４０μｍフィルタを通して粉砕した。フィルタをＲ１０で洗浄し、脾細胞を１５００ｒｐｍで５分間室温において遠心分離した。１ｍＬの１×細胞溶解緩衝液（蒸留水で１：１０希釈）を細胞に加え、室温で４分間インキュベーションした後、２０ｍＬのＲ１０を加えた。チューブを１５００ｒｐｍで５分間室温において遠心分離し、上清を破棄した。脾細胞を３０ｍＬのＲ１０中に再懸濁し、細胞の数及び生存率を、自動ＥＶＥ細胞カウンタで決定した。ＣＤ８ポジティブ細胞を、マウスＣＤ８ａ＋Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０－１０４－０７５）及びａｕｔｏＭＡＣＳ（登録商標）分離を用いたネガティブ選択プロセスで、製造会社の使用説明書に従って単離した。分離後のネガティブ画分に見出されたＣＤ８ポジティブ細胞を、次いで、予め温めたＰＢＳで洗浄し、ＥＶＥ細胞カウンタで計数し、この細胞数を、予め温めたＰＢＳ中で２ｘ１０７細胞／ｍＬに調節した。１０ｍＭ ＣＦＳＥ溶液（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥ細胞増殖キット、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｃ３４５５４）を、予め温めたＰＢＳ中で５０００倍に希釈し、ＰＢＳ中に再懸濁した細胞に１：１比（ＣＦＳＥ最終濃度１μＭ）で加えた。短いボルテックスの後、細胞を室温で５分間インキュベートした。４０ｍＬの予め温めたＲ１０培地を細胞に加えることによって、標識反応を停止した。ＰＢＳでの２つの洗浄工程の後、ＣＤ８ポジティブ細胞をＲ１０中に再懸濁し、０．５ｘ１０５細胞を１００μＬのＲ１０中でパルス化ＤＣに加えた。実験４日目に、Ｔ細胞増殖をフローサイトメトリによって分析した。したがって、細胞を、９６ウェル平底プレートから９６ウェル丸底プレートへと移し、ＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳ中３μｇ／ｍＬのＦｃ受容体ブロッキングマウスＩｇＧアイソタイプ対照５０μＬでインキュベートした。４℃で１５分間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の蛍光標識抗体の混合物５０μＬを細胞へ加えた。以下の抗体を使用した：抗マウスＣＤ４ ＢＶ４２１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＧＫ１．５、カタログ番号１００４３８）、抗マウスＣＤ８６ ＢＶ７８５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＧＬ－１、カタログ番号１０５０４３）、抗Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ ＰｅｒＣｐ－Ｃｙ５．５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＭ５／１１４．１５．２、カタログ番号１０７６２６）、抗マウスＣＤ７０ ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローンＦＲ７０、カタログ番号１２－０７０１－８２）、抗マウスＣＤ３ ＰＥ－ＣＦ５９４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローン１４５－２Ｃ１１、カタログ番号５６２２８６）、抗マウスＣＤ２５ ＰＥ－Ｃｙ７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローンＰＣ６１．５、カタログ番号２５－０２５１－８２）、抗マウスＣＤ１１ｃ ＡＰＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＨＬ３、カタログ番号５６１１１９）、抗マウスＣＤ４４ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＩＭ７、カタログ番号５６０５６７）、及び抗マウスＣＤ８ ＡＰＣ－Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローン５３－６．７、カタログ番号１００７１４）。生細胞と死細胞とを区別するために、生死判別色素Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ（商標）を抗体混合物に加えた。細胞を３０分間４℃で、５０μＬの染色抗体混合物によりインキュベートした。その後、細胞をＰＢＳで二回洗浄し、２００μＬのＰＢＳ中に再懸濁し、５レーザＬＳＲ－Ｆｏｒｔｅｓｓａを用いて分析した。データ解析はＦｌｏｗＪｏバージョン１０ソフトウェアを用いて実施した。生存可能なＣＤ３及びＣＤ８ポジティブ細胞を、ＣＦＳＥシグナルと、ＣＤ２５及びＣＤ４４発現とについて分析した。
図８Ａ及び図８Ｂは、ＯＶＡ送達試薬とインキュベートし、ヒトＣＤ４０及びＦＡＰを標的とする二重特異性抗原結合分子で刺激されたＤＣが、ＣＤ８ポジティブＯＴ１ Ｔ細胞増殖を高度に増強することを示す。これらの作用はＦＡＰ依存性であった。示されたＦＡＰ依存性抗体によって誘導されたＴ細胞増殖の増加は、架橋ＣＤ４０抗体（Ｐ１ＡＤ４４７０）によって誘導された増加と比較して、わずかに低かった。２＋１、３＋１、又は４＋１の二重特異性抗ＣＤ４０抗体で刺激したＤＣにより誘導される増殖レベルと、１つのＦＡＰ（２１２）又はＦＡＰ（４Ｂ９）結合部分とは、同等であった。

Claims (31)

  1. 二重特異性抗原結合分子であって、
    （ａ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片と、
    （ｂ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片と、
    （ｃ）ＣＤ４０に特異的に結合することができる第３のＦａｂ断片と、
    （ｄ）安定した会合が可能な、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインであって、ここで、前記第２のＦａｂ断片（ｂ）がＶＨ－ＣＨ１鎖のＣ末端にて、前記第１のＦａｂ断片（ａ）のＶＨ－ＣＨ１鎖のＮ末端に融合し、これは転じて、そのＣ末端にて前記第１のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合し、前記第３のＦａｂ断片（ｃ）が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端にて前記第２のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合する、Ｆｃドメインと、
    （ｅ）標的細胞抗原に特異的に結合することができるクロスｆａｂ断片であって、ここで、前記クロスｆａｂ断片が前記Ｆｃドメインサブユニットの１つのＣ末端に融合されている、クロスｆａｂ断片と、からなる、二重特異性抗原結合分子。
  2. 標的細胞抗原に特異的に結合することができる前記クロスｆａｂ断片が、前記第２のＦｃドメインサブユニットのＣ末端に融合する、請求項１に記載の二重特異性抗原結合分子。
  3. 標的細胞抗原に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、線維芽細胞活性化タンパク質（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＦＡＰ）に特異的に結合することができる抗原結合ドメインである、請求項１又は２に記載の二重特異性抗原結合分子。
  4. ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
    （ａ）（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び（ｉｖ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（ｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（ｖｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
    （ｂ）（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（ｉｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び（ｉｖ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（ｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（ｖｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  5. ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
    （ａ）配列番号９のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号１０のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
    （ｂ）配列番号１７のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号１８のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  6. ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（ｉｉ）配列番号２０、配列番号２７、及び配列番号２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び（ｉｖ）配列番号２２、配列番号２９、及び配列番号３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（ｖ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（ｖｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  7. ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
    （ｉ）配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、及び配列番号３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）と、
    （ｉｉ）配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、及び配列番号４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）と、を含む、請求項１～３又は６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  8. ＦＡＰに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
    （ａ）配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、
    （ｂ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、
    （ｃ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
    （ｄ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号４１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、請求項１～３又は６又は７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  9. ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの各々が、（ｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（ｉｉ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（ｉｉｉ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と、を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）、及び（ｉｖ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（ｖ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（ｖｉ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と、を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  10. ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの各々が、
    （ｉ）配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、及び配列番号５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、
    （ｉｉ）配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、及び配列番号６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）と、を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  11. ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの各々が、
    （ｉ）配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、及び配列番号６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）と、
    （ｉｉ）配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、及び配列番号７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）と、を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  12. ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの各々が、
    （ａ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５７のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｂ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｃ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５９のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｄ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６０のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｅ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５７のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｆ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｇ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５９のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｈ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６０のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｉ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５７のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｊ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｋ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５９のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｌ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６０のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｍ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５７のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｎ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｏ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５９のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｐ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  13. ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの各々が、配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号５７のアミノ酸配列を含むＶＬと、を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  14. ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの各々が、
    （ａ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６７のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｂ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６７のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｃ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６７のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｄ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６７のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｅ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｆ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｇ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｈ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６８のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６９のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｊ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６９のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｋ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号７０のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
    （ｌ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号７０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項１～９又は１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  15. ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインの各々が、配列番号６１のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６７のアミノ酸配列を含むＶＬを含むか、又は、ＣＤ４０に特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、配列番号６４のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号６７のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項１～９又は１１又は１４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  16. （ｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ４０）及び配列番号５７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ４０）をそれぞれ含む、ＣＤ４０に特異的に結合することができる３つの抗原結合ドメインと、
    （ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、ＦＡＰに特異的に結合することができる１つの抗原結合ドメインと、を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  17. 前記Ｆｃ領域が、ＩｇＧ、特にＩｇＧ１ Ｆｃ領域又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり、ここで、前記Ｆｃ領域が、Ｆｃ受容体及び／又はエフェクタ機能に対する前記抗体の結合親和性を低減する１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  18. 前記Ｆｃ領域が、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔによるＥＵ番号付け）を伴うヒトＩｇＧ１サブクラスの領域である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  19. ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅｓ）法に従って、前記Ｆｃ領域の前記第１のサブユニットがノブを含み、前記Ｆｃ領域の前記第２のサブユニットがホールを含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  20. 前記Ｆｃ領域の前記第１のサブユニットがアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＫａｂａｔによるＥＵ番号付け）を含み、前記Ｆｃ領域の前記第２のサブユニットがアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、及びＹ４０７Ｖ（ＫａｂａｔによるＥＵ番号付け）を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  21. 請求項１～２０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子をコードする、単離された核酸。
  22. 請求項２１に記載の単離された核酸を含む、発現ベクター。
  23. 請求項２１に記載の単離された核酸又は請求項２２に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  24. 二重特異性抗原結合分子を生産する方法であって、前記二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下において請求項２３に記載の宿主細胞を培養することと、前記二重特異性抗原結合分子を単離することと、を含む、方法。
  25. 請求項１～２０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子と、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
  26. 医薬として使用するための、請求項１～２０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子又は請求項２５に記載の医薬組成物。
  27. （ｉ）ＣＤ４０発現抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ－ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ：ＡＰＣ）による、免疫刺激の誘導において、
    （ｉｉ）腫瘍特異的Ｔ細胞応答を刺激することにおいて、
    （ｉｉｉ）腫瘍細胞のアポトーシスを引き起こすことにおいて、
    （ｉｖ）がんの治療において、
    （ｖ）がんの進行を遅らせることにおいて、
    （ｖｉ）がんを患う患者の生存を延長することにおいて、
    （ｖｉｉ）感染症の治療において、使用するための、請求項１～２０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子又は請求項２５に記載の医薬組成物。
  28. がんの治療で使用するための、請求項１～２０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子又は請求項２５に記載の医薬組成物。
  29. がんの治療のための医薬の製造における、請求項１～２０のいずれか一項に二重特異性抗原結合分子又は請求項２５に記載の医薬組成物の使用。
  30. がんを有する個体を治療する方法であって、有効量である請求項１～２０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子又は請求項２５に記載の医薬組成物を前記個体に投与することを含む、方法。
  31. 前記二重特異性抗原結合分子は、がん免疫療法で使用するために、化学療法剤、放射線、及び／又は他の薬剤と組み合わせて投与される、がんの治療で使用するための請求項１～２０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子又は請求項２５に記載の医薬組成物。
JP2021517821A 2018-10-01 2019-09-30 Ｃｄ４０への三価結合を伴う二重特異性抗原結合分子 Pending JP2022511396A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP18198008.7 2018-10-01
EP18198008 2018-10-01
PCT/EP2019/076342 WO2020070035A1 (en) 2018-10-01 2019-09-30 Bispecific antigen binding molecules with trivalent binding to cd40

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2022511396A true JP2022511396A (ja) 2022-01-31

Family

ID=63720603

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021517821A Pending JP2022511396A (ja) 2018-10-01 2019-09-30 Ｃｄ４０への三価結合を伴う二重特異性抗原結合分子

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20210292426A1 (ja)
EP (1) EP3861025A1 (ja)
JP (1) JP2022511396A (ja)
CN (1) CN112654641A (ja)
AR (1) AR116564A1 (ja)
TW (1) TW202028241A (ja)
WO (1) WO2020070035A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2022511382A (ja) * 2018-10-01 2022-01-31 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗ｆａｐクローン２１２を含む二重特異性抗原結合分子

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2019006954A (es) 2016-12-20 2019-08-01 Hoffmann La Roche Terapia de combinacion de anticuerpos biespecificos anti-cd20/anti-cd3 y agonistas de 4-1bb (cd137).
CR20190309A (es) 2017-01-03 2019-08-21 Hoffmann La Roche Moleculas de unión de3 antígeno biespecíficas que comprenden el clon 20h4.9 anti-4-1bb
CN110573528B (zh) 2017-03-29 2023-06-09 豪夫迈·罗氏有限公司 针对共刺激性tnf受体的双特异性抗原结合分子
UA128001C2 (uk) 2018-12-21 2024-03-06 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Націлені на пухлину агоністичні cd28-антигензв'язувальні молекули
WO2021127528A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Amgen Inc. Mesothelin-targeted cd40 agonistic multispecific antibody constructs for the treatment of solid tumors
AR121706A1 (es) 2020-04-01 2022-06-29 Hoffmann La Roche Moléculas de unión a antígeno biespecíficas dirigidas a ox40 y fap
CN117916261A (zh) 2020-11-16 2024-04-19 豪夫迈·罗氏有限公司 与靶向fap的cd40激动剂的组合疗法
WO2022243261A1 (en) * 2021-05-19 2022-11-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Agonistic cd40 antigen binding molecules targeting cea
WO2024062092A1 (en) * 2022-09-22 2024-03-28 Julius-Maximilians-Universität Würzburg Anti-cd40 antibody constructs with high intrinsic agonism

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008541733A (ja) * 2005-05-26 2008-11-27 シアトル ジェネティクス，インコーポレーテッド ヒト化抗ｃｄ４０抗体およびその使用方法
WO2009094391A1 (en) * 2008-01-23 2009-07-30 Xencor, Inc. Optimized cd40 antibodies and methods of using the same
WO2017060144A1 (en) * 2015-10-07 2017-04-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies with tetravalency for a costimulatory tnf receptor
WO2017205738A1 (en) * 2016-05-27 2017-11-30 Abbvie Biotherapeutics Inc. Bispecific binding proteins binding an immunomodulatory protein and a tumor antigen
WO2018144955A1 (en) * 2017-02-02 2018-08-09 Silverback Therapeutics, Inc. Construct-peptide compositions and methods of use thereof

Family Cites Families (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2 Inc Geänderte antikörper.
WO1990005144A1 (en) 1988-11-11 1990-05-17 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
JP4124480B2 (ja) 1991-06-14 2008-07-23 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫グロブリン変異体
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
DE69334255D1 (de) 1992-02-06 2009-02-12 Novartis Vaccines & Diagnostic Marker für Krebs und biosynthetisches Bindeprotein dafür
CA2163345A1 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Susan Adrienne Morgan Antibodies
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
EP0994903B1 (en) 1997-06-24 2005-05-25 Genentech, Inc. Methods and compositions for galactosylated glycoproteins
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
AU759779B2 (en) 1997-10-31 2003-05-01 Genentech Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
AUPP221098A0 (en) 1998-03-06 1998-04-02 Diatech Pty Ltd V-like domain binding molecules
DK2180007T4 (da) 1998-04-20 2017-11-27 Roche Glycart Ag Glycosyleringsteknik for antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellecytotoxicitet
US7115396B2 (en) 1998-12-10 2006-10-03 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
KR101077001B1 (ko) 1999-01-15 2011-10-26 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
KR100797667B1 (ko) 1999-10-04 2008-01-23 메디카고 인코포레이티드 외래 유전자의 전사를 조절하는 방법
WO2002020565A2 (en) 2000-09-08 2002-03-14 Universität Zürich Collections of repeat proteins comprising repeat modules
MXPA04001072A (es) 2001-08-03 2005-02-17 Glycart Biotechnology Ag Variantes de glicosilacion de anticuerpos que tienen citotoxicidad celulares dependiente de anticuerpos incrementada.
KR100988949B1 (ko) 2001-10-25 2010-10-20 제넨테크, 인크. 당단백질 조성물
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
SI2289936T1 (sl) 2002-12-16 2017-10-30 Genentech, Inc. Imunoglobulinske variante in njihove uporabe
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
EP1641818B1 (en) 2003-07-04 2008-12-03 Affibody AB Polypeptides having binding affinity for her2
AU2003275958A1 (en) 2003-08-25 2005-03-10 Pieris Proteolab Ag Muteins of tear lipocalin
LT2380911T (lt) 2003-11-05 2018-07-10 Roche Glycart Ag Antigeną surišančios molekulės, pasižyminčios padidintu fc receptoriaus surišimo afiniškumu ir efektoriaus funkcija
EP1711196A4 (en) 2003-12-05 2011-09-14 Bristol Myers Squibb Co INHIBITORS OF TYPE-2 VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR RECEPTORS
PL1791565T3 (pl) 2004-09-23 2016-10-31 Modyfikowane cysteiną przeciwciała i koniugaty
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
EP1958957A1 (en) 2007-02-16 2008-08-20 NascaCell Technologies AG Polypeptide comprising a knottin protein moiety
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
EP2235064B1 (en) 2008-01-07 2015-11-25 Amgen Inc. Method for making antibody fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
WO2012002006A1 (ja) 2010-06-29 2012-01-05 コニカミノルタエムジー株式会社 超音波診断装置及びプログラム
BR112013003361B8 (pt) 2010-08-13 2022-01-25 Roche Glycart Ag Anticorpo, composição, conjugado de anticorpo,formulação farmacêutica e uso do anticorpo
EP3590965A1 (en) 2011-03-29 2020-01-08 Roche Glycart AG Antibody fc variants
MX2016010174A (es) * 2014-02-06 2016-11-15 Hoffmann La Roche Proteinas de fusion de interleucina-10 y usos de las mismas.
BR112016023417A2 (pt) 2014-03-21 2019-04-16 F. Hoffmann-La Roche Ag predição in vitro de meia-vida in vivo
CA2960445A1 (en) 2014-10-24 2016-04-28 F.Hoffmann-La Roche Ag Vh-vl-interdomain angle based antibody humanization
CN115746143A (zh) * 2015-10-02 2023-03-07 豪夫迈·罗氏有限公司 对共刺激性tnf受体特异性的双特异性抗体
GB201611530D0 (en) * 2016-07-01 2016-08-17 Alligator Bioscience Ab Novel polypeptides
CR20190309A (es) * 2017-01-03 2019-08-21 Hoffmann La Roche Moleculas de unión de3 antígeno biespecíficas que comprenden el clon 20h4.9 anti-4-1bb

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008541733A (ja) * 2005-05-26 2008-11-27 シアトル ジェネティクス，インコーポレーテッド ヒト化抗ｃｄ４０抗体およびその使用方法
WO2009094391A1 (en) * 2008-01-23 2009-07-30 Xencor, Inc. Optimized cd40 antibodies and methods of using the same
WO2017060144A1 (en) * 2015-10-07 2017-04-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies with tetravalency for a costimulatory tnf receptor
WO2017205738A1 (en) * 2016-05-27 2017-11-30 Abbvie Biotherapeutics Inc. Bispecific binding proteins binding an immunomodulatory protein and a tumor antigen
WO2018144955A1 (en) * 2017-02-02 2018-08-09 Silverback Therapeutics, Inc. Construct-peptide compositions and methods of use thereof

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MABS, vol. 9, JPN6022024648, 2017, pages 182 - 212, ISSN: 0005104782 *
THERAPEUTIC ADVANCES IN VACCINES AND IMMUNOTHERAPY, vol. 6, JPN6022024650, 2018, pages 3 - 17, ISSN: 0005104781 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2022511382A (ja) * 2018-10-01 2022-01-31 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗ｆａｐクローン２１２を含む二重特異性抗原結合分子
JP7221379B2 (ja) 2018-10-01 2023-02-13 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗ｆａｐクローン２１２を含む二重特異性抗原結合分子

Also Published As

Publication number Publication date
US20210292426A1 (en) 2021-09-23
WO2020070035A1 (en) 2020-04-09
CN112654641A (zh) 2021-04-13
AR116564A1 (es) 2021-05-19
TW202028241A (zh) 2020-08-01
EP3861025A1 (en) 2021-08-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6997209B2 (ja) Ｃｄ４０およびｆａｐに特異的に結合することができる新規な二重特異性抗原結合分子
JP7221379B2 (ja) 抗ｆａｐクローン２１２を含む二重特異性抗原結合分子
US20210292426A1 (en) Bispecific antigen binding molecules with trivalent binding to cd40
JP6997212B2 (ja) Ｐｄ１及びｌａｇ３に特異的に結合する二重特異性抗体
JP6801006B2 (ja) Ｔｎｆファミリーリガンドトリマーとｐｄ１結合部分とを含む抗原結合分子
JP6996979B2 (ja) 三量体ｔｎｆファミリーリガンドを含む抗原結合分子
US11149083B2 (en) Antigen binding molecules comprising a TNF family ligand trimer and a Tenascin binding moiety
JP2021500898A (ja) 二重特異性２＋１コントースボディ
JP2022513495A (ja) 腫瘍標的化スーパーアゴニストｃｄ２８抗原結合分子
US11780919B2 (en) Bispecific antigen binding molecules targeting OX40 and FAP
RU2799429C2 (ru) Биспецифические антигенсвязывающие молекулы, содержащие анти-fap клон 212
WO2022243261A1 (en) Agonistic cd40 antigen binding molecules targeting cea

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20210527

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20220621

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20220913

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20221121

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20230131

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230427

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20230711

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20231010

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20240220