CN116120461B - 新型抗药抗体以及其用途 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了新型抗药抗体(具体地，抗PD‑L1/4‑1BB双特异性抗体的抗药抗体)、编码其的分离的多核苷酸、包括其的组合物以及其用途。

Description

新型抗药抗体以及其用途
技术领域
本公开总体上涉及新型抗药抗体(具体地，抗PD-L1/4-1BB双特异性抗体的抗药抗体)、其抗原结合片段以及其用途。
背景技术
抗药抗体(ADA)通常用于在药物开发过程期间检测和定量治疗性抗体。例如，ADA可以用于治疗性抗体的药代动力学测定或免疫原性测定。另外，ADA还可以用作中和抗体(NAB)以中和治疗性抗体的活性，从而减少由治疗性抗体引起的副作用(例如，细胞因子风暴)。
ATG-101是PD-L1/4-1BB双特异性抗体，其被设计成以依赖PD-L1交联的方式活化4-1BB阳性T细胞并且有效***而没有脱靶肝毒性(on-target-off-tumor livertoxicity)(参见Hui Yuwen等人,《癌症免疫疗法杂志(J Immunother Cancer)》2021；9(增刊2):A1-A1054)。在ATG-101的临床前和临床研究中，需要能够以高亲和力识别和结合ATG-101的分子来检测ATG-101，并且由此研究ATG-101的PK/PD特性。
仍需要新型抗药抗体(具体地，抗PD-L1/4-1BB双特异性抗体的抗药抗体)。
发明内容
在整个本公开中，本文使用的冠词“一个”、“一种”和“所述”是指冠词的语法宾语中的一个或多于一个(即，至少一个)。举例来说，“一种抗体”意指一种抗体或多于一种抗体。
一方面，本公开提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括：
包含在选自由以下组成的组的重链可变(VH)区序列中的任何一个内的一个或两个或三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和/或HCDR3)：SEQ ID NO:6、13、20、27、34、41、48和55；和/或
包含在选自由以下组成的组的轻链可变(VL)区序列中的任何一个内的一个或两个或三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)：SEQ ID NO:7、14、21、28、35、42、49和56。
在一些实施方式中，本公开的抗体或其抗原结合片段包括至少一个重链或轻链互补决定区(CDR)，所述CDR包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、2、3、4、NAK、5、8、9、10、11、RAN、12、15、16、17、18、AAS、19、22、23、24、25、AAS、26、29、30、31、32、STS、33、36、37、38、39、NAK、40、43、44、45、46、NAK、47、50、51、52、53、QMS和54。
在一些实施方式中，本公开的抗体或其抗原结合片段包括VH区，所述VH区包括HCDR1、HCDR2和HCDR3中的一个或两个或三个，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、2、3、8、9、10、15、16、17、22、23、24、29、30、31、36、37、38、43、44、45、50、51和52。
在一些实施方式中，本公开的抗体或其抗原结合片段包括VL区，所述VL区包括LCDR1、LCDR2和LCDR3中的一个或两个或三个，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:4、NAK、5、11、RAN、12、18、AAS、19、25、AAS、26、32、STS、33、39、NAK、40、46、NAK、47、53、QMS和54。
在一些实施方式中，本公开的抗体或其抗原结合片段包括：
i.HCDR1，所述HCDR1包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、8、15、22、29、36、43和50；
ii.HCDR2，所述HCDR2包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、9、16、23、30、37、44和51；以及
iii.HCDR3，所述HCDR3包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:3、10、17、24、31、38、45和52。
在一些实施方式中，本公开的抗体或其抗原结合片段包括：
i.LCDR1，所述LCDR1包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:4、11、18、25、32、39、46和53；
ii.LCDR2，所述LCDR2包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：NAK、RAN、AAS、AAS、STS、NAK、NAK和QMS；以及
iii.LCDR3，所述LCDR3包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:5、12、19、26、33、40、47和54。
在一些实施方式中，本公开的抗体或其抗原结合片段包括：
i.HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
ii.HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列；
iii.HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列；
iv.HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列的，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；
v.HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列；
vi.HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列；
vii.HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列；或
viii.HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本公开的抗体或其抗原结合片段包括：
i.LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如NAK所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
ii.LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如RAN所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；
iii.LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如AAS所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列；
iv.LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如AAS所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列；
v.LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如STS所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列；
vi.LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如NAK所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列；
vii.LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如NAK所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列；或
viii.LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列，所述LCDR2括如QMS所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本公开的抗体或其抗原结合片段包括包含在选自由以下组成的组的VH/VL氨基酸序列对内的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及LCDR1、LCDR2和LCDR3：SEQ IDNO:6和7、13和14、20和21、27和28、34和35、41和42、48和49、以及55和56。
在一些实施方式中，本公开的抗体或其抗原结合片段包括：
i.HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如NAK所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
ii.HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQID NO:10所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如RAN所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；
iii.HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如AAS所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列；
iv.HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQID NO:24所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如AAS所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列；
v.HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQID NO:31所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如STS所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列；
vi.HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQID NO:38所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如NAK所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列；
vii.HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如NAK所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列；或
viii.HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如QMS所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本公开的抗体或其抗原结合片段包括VH区，所述VH区具有如SEQ ID NO:6、13、20、27、34、41、48和55所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:6、13、20、27、34、41、48和55具有至少80％序列同一性的同源序列。
在一些实施方式中，本公开的抗体或其抗原结合片段包括VL区，所述VL区具有如SEQ ID NO:7、14、21、28、35、42、49和56所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7、14、21、28、35、42、49和56具有至少80％序列同一性的同源序列。
在一些实施方式中，本公开的抗体或其抗原结合片段包括VH/VL氨基酸序列对，所述氨基酸序列对选自由以下组成的组：SEQ ID NO:6和7、13和14、20和21、27和28、34和35、41和42、48和49、以及55和56。
在一些实施方式中，本公开的抗体或其抗原结合片段进一步包括一个或多个氨基酸残基取代或修饰，但仍保留对ATG-101的特异性结合亲和力。在一些实施方式中，所述取代或修饰中的至少一个处于所述VH区或所述VL区的一个或多个CDR序列中。在一些实施方式中，所述取代或修饰中的至少一个处于所述VH区或所述VL区的一个或多个非CDR序列中。在一些实施方式中，本公开的抗体或其抗原结合片段进一步包括一个或多个非天然氨基酸(NNAA)取代。在一些实施方式中，所述NNAA能够被缀合。
在一些实施方式中，本公开的抗体或其抗原结合片段能够与ATG-101的PD-L1结合部分和/或4-1BB结合部分特异性结合，如通过ELISA测定所测量的。在一些实施方式中，本公开的抗体或其抗原结合片段与ATG-101竞争结合PD-L1和/或4-1BB。
另一方面，本公开提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与如上所述的抗体或抗原结合片段竞争结合ATG-101。
在一些实施方式中，本公开的抗体或其抗原结合片段是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方式中，本公开的抗体或其抗原结合片段是标记的抗体、二价抗体、抗独特型抗体或融合蛋白。
在一些实施方式中，本公开的抗体或其抗原结合片段是双功能抗体(diabody)、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv’)、二硫键稳定的双功能抗体(ds diabody)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(二价双功能抗体)、骆驼化单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体或二价结构域抗体。
在一些实施方式中，本公开的抗体或其抗原结合片段进一步包括Fc区。在一些实施方式中，所述Fc区是人免疫球蛋白(Ig)的Fc区。在一些实施方式中，所述Fc区是人IgG的Fc区。在一些实施方式中，所述Fc区源自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些实施方式中，所述Fc区包括选自由SEQ ID NO:75-78组成的组的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本公开的抗体或其抗原结合片段的所述轻链是λ轻链或κ轻链。
在一些实施方式中，本公开的抗体或其抗原结合片段是双特异性或多特异性抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，本公开的抗体或其抗原结合片段能够与ATG-101的PD-L1结合部分和4-1BB结合部分特异性结合。
在一些实施方式中，本公开的抗体或其抗原结合片段包括：
i.包含在选自由以下组成的组的重链可变(VH)区序列中的任何一个内的重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和/或HCDR3)中的一个或两个或三个：SEQ ID NO:6、13、20和27；
ii.包含在选自由以下组成的组的重链可变(VH)区序列中的任何一个内的一个或两个或三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和/或HCDR3)：SEQ ID NO:34、41、48和55；
iii.包含在选自由以下组成的组的轻链可变(VL)区序列中的任何一个内的一个或两个或三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和/或LCDR3)：SEQ ID NO:7、14、21和28；以及
iv.包含在选自由以下组成的组的轻链可变(VL)区序列中的任何一个内的一个或两个或三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和/或LCDR3)：SEQ ID NO:35、42、49和56。
在一些实施方式中，本公开的抗体或其抗原结合片段包括：
i.HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如NAK所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如STS所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列；
ii.HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQID NO:3所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如NAK所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如NAK所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ IDNO:40所示的氨基酸序列；
iii.HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQID NO:3所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如NAK所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ IDNO:5所示的氨基酸序列，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如NAK所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列；
iv.HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQID NO:3所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如NAK所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如QMS所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ IDNO:54所示的氨基酸序列；
v.HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ IDNO:10所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如RAN所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如STS所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列；
vi.HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQID NO:10所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如RAN所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ IDNO:39所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如NAK所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQID NO:40所示的氨基酸序列；
vii.HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQID NO:10所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如RAN所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ IDNO:46所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如NAK所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQID NO:47所示的氨基酸序列；
viii.HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如RAN所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ IDNO:53所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如QMS所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQID NO:54所示的氨基酸序列；
ix.HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQID NO:17所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如AAS所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ IDNO:32所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如STS所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQID NO:33所示的氨基酸序列；
x.HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQID NO:17所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如AAS所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ IDNO:39所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如NAK所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQID NO:40所示的氨基酸序列；
xi.HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQID NO:17所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如AAS所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ IDNO:46所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如NAK所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQID NO:47所示的氨基酸序列；
xii.HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如AAS所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ IDNO:53所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如QMS所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQID NO:54所示的氨基酸序列；
xiii.HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如AAS所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ IDNO:32所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如STS所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQID NO:33所示的氨基酸序列；
xiv.HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如AAS所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ IDNO:39所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如NAK所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQID NO:40所示的氨基酸序列；
xv.HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQID NO:24所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如AAS所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ IDNO:46所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如NAK所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQID NO:47所示的氨基酸序列；或
xvi.HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如AAS所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ IDNO:53所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如QMS所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQID NO:54所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本公开的抗体或其抗原结合片段与一个或多个缀合物部分连接。在一些实施方式中，所述缀合物部分包括清除改性剂、化学治疗剂、毒素、放射性同位素、镧系元素、可检测标记(例如，发光标记、荧光标记、酶底物标记)、DNA烷基化剂、拓扑异构酶抑制剂、微管蛋白结合剂、纯化部分或其它抗癌药物。在一些实施方式中，所述缀合物部分直接或通过连接子共价连接。
另一方面，本公开提供了一种组合物，所述组合物包括本公开的抗体或其抗原结合片段以及一种或多种载体。
另一方面，本公开提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括本公开的抗体或其抗原结合片段、跨膜区以及细胞内信号区。在一些实施方式中，所述跨膜区包括CD3、CD4、CD8或CD28的跨膜区。在一些实施方式中，所述细胞内信号区选自由以下组成的组：CD3、FccRI、CD27、CD28、CD137、CD134、MyD88、CD40、CD278、TLR或其组合的细胞内信号区序列。在一些实施方式中，所述嵌合抗原受体的抗原结合片段是scFv。
另一方面，本公开提供了一种嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体被移植到同种异体细胞、自体细胞或异种细胞。
另一方面，本公开提供了一种嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体被移植到免疫效应细胞。
另一方面，本公开提供了一种嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体被移植到T细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞或肿瘤浸润淋巴细胞。
另一方面，本公开提供了一种组合物，其包含本申请所述的抗体或其抗原结合片段或者嵌合抗原受体，以及一种或多种载体。
另一方面，本公开提供了一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码本公开的抗体或其抗原结合片段和/或本公开的嵌合抗原受体。
另一方面，本公开提供了一种载体，所述载体包括本公开的分离的多核苷酸。
另一方面，本公开提供了一种宿主表达***，所述宿主表达***包括本公开的载体或具有整合到其基因组中的本公开的多核苷酸。在一些实施方式中，本公开的宿主表达***是微生物、酵母或哺乳动物细胞，其中所述微生物选自由大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)组成的组，任选地，其中所述酵母是酵母菌属(Saccharomyces)，并且任选地，其中所述哺乳动物细胞选自由以下组成的组：COS、CHO-S、CHO-K1、HEK-293和3T3细胞。
另一方面，本公开提供了一种病毒，所述病毒包括本公开的载体。
另一方面，本公开提供了一种表达本公开的抗体或其抗原结合片段或嵌合抗原受体的方法，所述方法包括在表达本公开的抗体或其抗原结合片段或本公开的嵌合抗原受体的条件下培养本公开的宿主表达***。
另一方面，本公开提供了一种检测样品中抗PD-L1抗体、抗4-1BB抗体或双特异性PD-L1/4-1BB抗体的存在或量的方法，所述方法包括使所述样品与本公开的抗体或其抗原结合片段和/或本公开的组合物和/或本公开的嵌合抗原受体接触以及确定所述样品中抗PD-L1抗体、抗4-1BB抗体或双特异性PD-L1/4-1BB抗体的存在或量。在一些实施方式中，所述方法是非诊断方法。在一些实施方式中，所述方法是诊断方法。在一些实施方式中，所述方法用于抗PD-L1抗体、抗4-1BB抗体或双特异性PD-L1/4-1BB抗体的药代动力学测定、抗药测定或中和测定。在一些实施方式中，所述方法用于ATG-101的药代动力学测定、抗药测定或中和测定。
另一方面，本公开提供了一种减轻通过向受试者施用抗PD-L1抗体、抗4-1BB抗体或双特异性PD-L1/4-1BB抗体引起的副作用的方法，所述方法包括向所述受试者施用本公开的抗体或其抗原结合片段和/或本公开的组合物和/或本公开的嵌合抗原受体。在一些实施方式中，所述副作用是细胞因子风暴。在一些实施方式中，所述抗PD-L1抗体、所述抗4-1BB抗体或所述双特异性PD-L1/4-1BB抗体施用于所述受试者以预防或治疗与PD-L1和/或4-1BB相关的疾病、病症或病状。
在一些实施方式中，所述与PD-L1和/或4-1BB相关的疾病、病症或病状是癌症。在一些实施方式中，所述癌症是实体瘤或血液肿瘤。在一些实施方式中，所述与PD-L1和/或4-1BB相关的疾病、病症或病状选自由以下组成的组：肺癌(例如，非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)(肺腺癌或肺鳞状细胞癌)、腹膜癌、类癌、骨癌、胰腺癌、原始性神经外胚层瘤、皮肤癌、胆囊癌、头颈癌、鳞状细胞癌、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、***癌、膀胱癌(例如，尿路上皮癌)、肛区癌(例如，***鳞状细胞癌)、胃癌(gastric or stomach cancer)(例如，胃肠癌)、食道癌、结肠癌、乳腺癌、子宫癌、肝癌(例如，肝母细胞癌、肝细胞性肝癌/肝细胞瘤或肝癌)、胆管癌、肉瘤、结直肠癌、输卵管癌、唾液腺癌、子***、子宫内膜癌或子宫癌、骨肉瘤、***癌、***癌、食管癌、小肠癌、内分泌***癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、鼻咽癌、软组织肉瘤、真性红细胞增多、尿道癌、***癌、肾脏或尿道癌(例如，肾脏横纹肌样瘤)、皮肤T细胞淋巴癌、成神经管细胞瘤、肾胚细胞瘤、骨髓增生异常综合征、慢性和非慢性骨髓增殖性病症、脉络丛***状瘤、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经***(CNS)赘生物、软组织肉瘤(例如，横纹肌肉瘤、纤维肉瘤、卡波济氏肉瘤(Kaposi's sarcoma))、脊髓轴肿瘤、胶质瘤(例如，室管膜瘤、星形细胞瘤、间变型星形细胞瘤、少突神经胶质瘤)、眼癌(例如，视网膜母细胞瘤)、脑干胶质瘤或如少突星形细胞瘤等混合胶质瘤、脑瘤(例如，成胶质细胞瘤/多形性成胶质细胞瘤(GBM)、非成胶质细胞瘤脑瘤或脑膜瘤)、皮肤或眼内黑色素瘤、血小板增多、间皮瘤、蕈样肉芽肿、塞扎里综合征(Sezary syndrome)、原发性骨髓纤维化、孤立性浆细胞瘤、前庭神经鞘瘤、尤因氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、软骨肉瘤、MYH相关息肉病、垂体腺瘤、小儿癌症，如小儿肉瘤(例如，神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤)，血液学癌症、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、非霍奇金氏淋巴瘤、白血病(例如，淋巴细胞/成淋巴细胞白血病)、慢性或急性白血病、肥大细胞白血病、淋巴细胞淋巴瘤、原发性CNS淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性髓系白血病(CML)、急性髓系白血病(AML)、慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病(HCL)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt'slymphoma，BL)、多发性骨髓瘤(例如，复发性或难治性多发性骨髓瘤)、T细胞或B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)(例如，复发性或难治性套细胞淋巴瘤)、恶性黑色素瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、由滤泡性淋巴瘤引起的DLBCL、高级B细胞淋巴瘤、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤(FL)和原发性纵隔B细胞淋巴瘤。
在一些实施方式中，本公开的抗体或其抗原结合片段和/或本公开的组合物和/或本公开的嵌合抗原受体用于中和所述抗PD-L1抗体、所述抗4-1BB抗体或所述双特异性PD-L1/4-1BB抗体。
另一方面，本公开提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括本公开的抗体或其抗原结合片段和/或本公开的组合物和/或本公开的嵌合抗原受体。
另一方面，本公开提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括本公开的抗体或其抗原结合片段、和/或本公开的嵌合抗原受体、和/或本公开的组合物，所述试剂盒可用于检测样品中的抗PD-L1抗体、抗4-1BB抗体或双特异性PD-L1/4-1BB抗体。
另一方面，本公开提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括本公开的抗体或其抗原结合片段、和/或本公开的嵌合抗原受体、和/或本公开的组合物，所述试剂盒用于检测抗PD-L1抗体、抗4-1BB抗体或双特异性PD-L1/4-1BB抗体的抗药抗体(ADA)。
另一方面，本公开提供了一种本文所提供的抗体或其抗原结合片段、和/或本公开的嵌合抗原受体、和/或本公开的组合物在制备试剂盒中的用途，其中所述试剂盒在用于检测抗PD-L1抗体、抗4-1BB抗体或双特异性PD-L1/4-1BB抗体的抗药抗体(ADA)的方法中使用。
在一些实施方式中，所述样品选自由以下组成的组：组织切片、活检、石蜡包埋组织、体液、结肠流出物、手术切除样品、分离的血细胞、从血液中分离的细胞以及其任何组合。
在一些实施方式中，本公开的抗体或其抗原结合片段包括第一抗体或其抗原结合片段以及第二抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方式中，所述第一抗体或其抗原结合片段包括：
i.包括在选自由以下组成的组的重链可变(VH)区序列中的任何一个内的一个或两个或三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和/或HCDR3)：SEQ ID NO:6、13、20和27；以及
ii.包括在选自由以下组成的组的轻链可变(VL)区序列中的任何一个内的一个或两个或三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)：SEQ ID NO:7、14、21和28。
在一些实施方式中，所述第一抗体或其抗原结合片段包括：
i.HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如NAK所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
ii.HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQID NO:10所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如RAN所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；
iii.HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如AAS所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列；或
iv.HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQID NO:24所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如AAS所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述第二抗体或其抗原结合片段包括：
i.包括在选自由以下组成的组的重链可变(VH)区序列中的任何一个内的一个或两个或三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和/或HCDR3)：SEQ ID NO:34、41、48和55；以及
ii.包括在选自由以下组成的组的轻链可变(VL)区序列中的任何一个内的一个或两个或三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)：SEQ ID NO:35、42、49和56。
在一些实施方式中，所述第二抗体或其抗原结合片段包括：
i.HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQID NO:31所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如STS所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列；
ii.HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQID NO:38所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如NAK所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列；
iii.HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如NAK所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列；或
iv.HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQID NO:52所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如QMS所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述体液选自由以下组成的组：全血、血清、血浆、尿液、粘液、唾液、腹膜液、胸膜液、胸液、滑液、脑脊液、胸腔积液、腹腔积液以及其任何组合。
在一些实施方式中，所述双特异性PD-L1/4-1BB抗体是ATG-101。
附图说明
图1A到1F分别示出了抗体克隆10F10G7、9D6E11、27E8A8、31B6G8、50D6E10、58H6F8、63C9C12和75H9F7对ATG-101和IgG的结合亲和力。
图2A到2C示出了针对ATG-101的所选抗体克隆(10F10G7、9D6E11、27E8A8、31B6G8、50D6E10、58H6F8、63C9C12、75H9F7)对人PD-L1蛋白或人4-1BB蛋白的结合亲和力和竞争能力。小鼠IgG1用作非竞争性阴性对照。
图3示出了ATG-101的结构。
具体实施方式
本公开的以下描述仅旨在说明本公开的各个实施例。如此，所讨论的具体修改不应被解释为对本公开的范围的限制。对于本领域技术人员将显而易见的是，在不脱离本公开的范围的情况下，可以做出各种等同物、改变和修改，并且应当理解，此类等同实施例将被包括在本文中。在本文中引用的所有文献，包括公开出版物、专利和专利申请以全文引用的方式并入本文中。
定义
本文中使用的术语“抗体”包括与特定抗原结合的任何免疫球蛋白、单克隆抗体、多克隆抗体、多价抗体、二价抗体、单价抗体、多特异性抗体或双特异性抗体。天然的完整抗体包括两条重(H)链和两条轻(L)链。哺乳动物重链分为α、δ、ε、γ和μ，每条重链包括可变区(VH)以及第一恒定区、第二恒定区、第三恒定区以及任选地第四恒定区(分别为CH1、CH2、CH3、CH4)；哺乳动物轻链分为λ或κ，而每条轻链包括可变区(VL)以及恒定区。抗体呈“Y”型，其中Y型结构的茎部包括通过二硫键结合在一起的两条重链的第二恒定区和第三恒定区。Y的每个臂包括与单个轻链的可变区和恒定区结合的单条重链的可变区和第一恒定区。轻链和重链的可变区负责抗原结合。每条链的可变区通常含有三个高变区，称为互补决定区(CDR)(轻链CDR包括LCDR1、LCDR2、LCDR3，重链CDR包括HCDR1、HCDR2、HCDR3)。三个CDR由被称为框架区(FR)(轻链FR包括LFR1、LFR2、LFR3和LFR4，重链FR包括HFR1、HFR2、HFR3和HFR4)的侧翼段间隔开，所述框架区比CDR更加高度保守并形成支架以支撑高度可变环。重链和轻链的恒定区与抗原结合无关，但表现出多种效应功能。抗体基于其重链恒定区的氨基酸序列可以分成几类。抗体的五个主要类别或同种型是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，它们的特征分别在于存在α、δ、ε、γ和μ重链。几个主要的抗体类别被分为亚类，如IgG1(γ1重链)、IgG2(γ2重链)、IgG3(γ3重链)、IgG4(γ4重链)、IgA1(α1重链)或IgA2(α2重链)。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体涵盖其任何抗原结合片段。如本文所使用的，术语“抗原结合片段”是指由包括一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个或6个)CDR的抗体的一部分形成的抗体片段，或与抗原结合但不包括完整天然抗体结构的任何其它抗体片段。抗原结合片段的实例包括但不限于双功能抗体(diabody)、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv’)、二硫键稳定的双功能抗体(ds diabody)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(二价双功能抗体)、双特异性抗体、多特异性抗体、骆驼单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体或二价结构域抗体。抗原结合片段能够与亲本抗体结合相同的抗原或表位。
抗体的“Fab”是指由单条轻链(包括可变区和恒定区)和单条重链的可变区和第一恒定区经二硫键结合起来组成的抗体的一部分。
“Fab’”是指包括铰链区的一部分的Fab片段。
“F(ab’)2”是指Fab’的二聚体。
抗体(例如，IgG、IgA或IgD同种型)的“Fc”是指由第一重链的第二恒定结构域和第三恒定结构域通过二硫键与第二重链的第二恒定结构域和第三恒定结构域结合组成的抗体的一部分。IgM和IgE同种型抗体的Fc进一步包括第四恒定结构域。抗体的Fc部分负责多种不同的效应功能，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)，但在抗原结合中不起作用。
抗体的“Fv”是指含有完整抗原结合位点的最小抗体片段。Fv片段由单条轻链的可变区与单条重链的可变区结合组成。
“单链Fv抗体”或“scFv”是指由轻链可变区和重链可变区组成的工程化的抗体，所述轻链可变区和重链可变区直接相互连接或通过连接子(例如，肽序列)相互连接(HustonJS等人《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)》,85:5879(1988))。
“单链Fv-Fc抗体”或“scFv-Fc”是指由连接到抗体的Fc区的scFv组成的工程化抗体。
“骆驼化单结构域抗体”、“重链抗体”或“HCAb”是指含有两个VH结构域而不含有轻链的抗体(Riechmann L.和Muyldermans S.,《免疫学方法杂志(J Immunol Methods)》12月10日；231(1-2):25-38(1999)；Muyldermans S.,《生物技术杂志(J Biotechnol.)》6月；74(4):277-302(2001)；WO94/04678；WO94/25591；美国专利第6,005,079号)。重链抗体最初源自骆驼科(Camelidae)(骆驼、单峰驼和美洲驼)。虽然缺失轻链，但是骆驼化抗体有确证的抗原结合全部功能(Hamers-Casterman C.等人,《自然(Nature)》6月3日；363(6428):446-8(1993)；Nguyen VK.等人,《免疫遗传学(Immunogenetics)》4月；54(1):39-47(2002)；Nguyen VK.等人,《免疫学(Immunology)》5月；109(1):93-101(2003))。重链抗体的可变区(VHH结构域)表示由适应性免疫应答产生的最小已知抗原结合单位(Koch-Nolte F.等人,《美国实验生物学会联合会杂志(FASEB J.)》11月；21(13):3490-8电子版2007年6月15日(2007))。
“纳米抗体”是指由来自重链抗体的VHH结构域以及两个恒定结构域CH2和CH3组成的抗体片段。
“双功能抗体”、“diabody”或“dAb”包括具有两个抗原结合位点的小抗体片段，其中所述片段包括在同一条多肽链上连接的VH结构域和VL结构域(VH-VL或VL-VH)(参见例如Holliger P.等人,《美国国家科学院院刊》7月15日；90(14):6444-8(1993)；EP404097；WO93/11161)。通过使用太短以至于不允许在同一条链上的两个结构域之间配对的连接子，结构域被迫与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。所述抗原结合位点可以靶向相同或不同的抗原(或表位)。在某些实施方式中，“双特异性ds双功能抗体”是靶向两种不同抗原(或表位)的双功能抗体。
“结构域抗体”是指仅含有重链可变区或轻链可变区的抗体片段。在某些情况下，两个或更多个VH结构域由肽连接子共价接合以产生二价或多价结构域抗体。二价结构域抗体的两个VH结构域可以靶向相同或不同的抗原(或表位)。
如本文所使用的，术语“价”是指给定分子中存在指定数量的抗原结合位点。术语“单价”是指仅具有一个抗原结合位点的抗体或抗原结合片段；并且术语“多价”是指具有多个抗原结合位点的抗体或抗原结合片段。如此，术语“二价”、“四价”和“六价”分别表示抗原结合分子中存在两个抗原结合位点、四个抗原结合位点和六个抗原结合位点。在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段是二价的。
如本文所使用的，“双特异性”抗体是指具有源自两个不同的单克隆抗体的片段并且能够与两个不同的表位结合的人工抗体。所述两个表位可以存在于同一个抗原上，或者其可以存在于两个不同的抗原上。
如本文所使用的，“多特异性”抗体是指与至少两个不同的抗原或相同抗原的至少两个不同的表位特异性结合的抗体。多特异性抗体可以与，例如，两个、三个、四个、五个或更多不同的抗原结合，或者可以与相同抗原的两个、三个、四个、五个或更多不同的表位结合。
在某些实施方式中，“scFv二聚体”是二价双功能抗体(diabody)或双特异性scFv(BsFv)，其包括二聚化的两个VH-VL(由肽连接子连接)部分，使得一个部分的VH与另一个部分的VL协作形成两个结合位点，所述两个结合位点可以靶向相同抗原(或表位)或不同抗原(或表位)。在其它实施例中，“scFv二聚体”是双特异性双功能抗体，所述双特异性双功能抗体包括相互缔合的VH1-VL2(由肽连接子连接)和VL1-VH2(也由肽连接子连接)，使得VH1和VL1协作，VH2和VL2协作，并且每个协作的配对具有不同的抗原特异性。
“dsFv”是指二硫键稳定的Fv片段，其单条轻链的可变区与单条重链的可变区之间的连接是二硫键。在一些实施方式中，“(dsFv)2”或“(dsFv-dsFv’)”包括三条肽链：两个VH部分通过肽连接子(例如，长的柔性连接子)连接，并通过二硫键分别与两个VL部分结合。在一些实施方式中，dsFv-dsFv’具有双特异性，其中每对通过二硫键配对的重链和轻链具有不同的抗原特异性。
如本文所使用的，术语“嵌合”是指具有源自一种物种的重链和/或轻链的一部分并且所述重链和/或轻链的其余部分源自另一不同物种的抗体或抗原结合片段。在说明性实例中，嵌合抗体可以包括源自人的恒定区和源自非人动物(例如小鼠)的可变区。在一些实施方式中，所述非人动物是哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、豚鼠或仓鼠。
如本文所使用的，术语“人源化”是指包括源自非人动物的CDR、源自人的FR区以及源自人的恒定区(当适用时)的抗体或抗原结合片段。本公开所提供的人源化抗体的CDR可以含有相较于其亲本抗体的CDR的突变。
如本文所使用的，术语“亲和力”是指免疫球蛋白分子(即，抗体)或其抗原结合片段与抗原之间非共价相互作用的强度。
与靶标(例如，表位)“特异性结合”(specifically binds/specific binding)的抗体或其抗原结合片段是本领域中所熟知的术语，并且用于确定这种特异性结合的方法也是本领域中所熟知的。如果分子与特定细胞或物质比其与替代性细胞或物质更频繁地、更快速地、持续时间更长地和/或亲和力更大地反应或缔合，则所述分子被称为展现出“特异性结合”。如果抗体比其与其它物质亲和力更大地、亲合性更高地、更容易地和/或持续时间更长地结合，则所述抗体与靶标“特异性地结合”。例如，与PD-L1表位特异性地结合的抗体是结合此PD-L1表位比结合其它PD-L1表位或非PD-L1表位亲和力更大地、亲合性更高地、更容易地和/或持续时间更长的抗体。通过阅读此定义还应理解，例如，与第一靶标特异性结合的抗体(或部分或表位)可以与第二靶标特异性结合或可以不与第二靶标特异性结合。如此，“特异性结合”(specific binding/specifically bind)不一定需要(尽管其可以包括)排他性的结合。通常，但不是必然地，提及结合是指特异性结合。
如本文所使用的，术语“表位”是指抗体所结合的抗原上特定的一组原子或氨基酸。如果两种抗体展现出针对抗原的竞争性结合，那么其可能结合抗原内相同或紧密相关的表位。表位可以是线性的或空间构象的(即，包括间隔开的氨基酸残基)。例如，如果抗体或抗原结合片段阻挡了参考抗体与抗原的结合至少85％、或至少90％或至少95％，那么所述抗体或抗原结合部分可以被视为与参考抗体结合相同或紧密相关的表位。
如本文所使用的，术语“氨基酸”是指含有氨基(-NH2)和羧基(-COOH)官能团以及每个氨基酸特有的侧链的有机化合物。氨基酸名称在本公开中也以标准的单字母或三字母代码表示，总结如下：
关于氨基酸序列的“保守取代”是指将氨基酸残基用不同的具有相似理化特性的侧链的氨基酸残基替代。例如，可以在具有疏水侧链的氨基酸残基(例如Met、Ala、Val、Leu和Ile)之间、具有中性亲水侧链的氨基酸残基(例如Cys、Ser、Thr、Asn和Gln)之间、具有酸性侧链的氨基酸残基(例如Asp、Glu)之间、具有碱性侧链的氨基酸残基(例如His、Lys和Arg)之间或具有芳香族侧链的氨基酸残基(例如Trp、Tyr和Phe)之间进行保守取代。如本领域中已知，保守取代通常不会引起蛋白质构象结构的显著变化，并且因此可以保留蛋白质的生物活性。
如本文所使用的，术语“同源”是指在最佳比对时与另一个序列具有至少60％(例如，至少65％、70％、75％、80％、85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或者99％)的序列同一性的核酸序列(或其互补链)或氨基酸序列。
关于氨基酸序列(或核酸序列)的“序列同一性百分比(％)”被定义为在比对序列，并且必要时引入空位以实现最大数量的相同氨基酸(或核酸)后，在候选序列中与参考序列中的氨基酸(或核酸)残基相同的氨基酸(或核酸)残基的百分比。换句话说，氨基酸序列(或核酸序列)的序列同一性百分比(％)可以通过将相对于其比较的参考序列相同的氨基酸残基(或碱基)的数目除以候选序列或参考序列(以较短者为准)中氨基酸残基(或碱基)的总数来计算。氨基酸残基的保守取代可以视为或可以不视为相同残基。可以例如使用公开可用的工具，如BLASTN、BLASTp(可在美国国家生物技术信息中心(U.S.National Center forBiotechnology Information，NCBI)的网站上获得，还参见Altschul S.F.等人,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》,215:403-410(1990)；Stephen F.等人,《核酸研究(Nucleic AcidsRes.)》,25:3389-3402(1997))、ClustalW2(可在欧洲生物信息学研究所(EuropeanBioinformatics Institute)的网站上获得，还参见Higgins D.G.等人,酶学方法(MethodsIn Enzymology),266:383-402(1996)；Larkin M.A.等人,《生物信息学(Bioinformatics)》(英国牛津),23(21):2947-8(2007)以及ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件来实现比对以确定氨基酸(或核酸)序列同一性百分比。本领域技术人员可以使用由所述工具提供的默认参数或可以根据比对的需要适当定制参数，例如通过选择合适的算法。
如本文所使用的，“效应功能”是指由抗体的Fc区与其效应子(例如，C1复合物和Fc受体)结合引起的生物活性。示例性的效应功能包括：由抗体和C1复合物上的C1q相互作用所介导的补体依赖性细胞毒性(CDC)；由抗体的Fc区与效应细胞上的Fc受体结合所介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；以及吞噬作用。可以使用各种测定，如Fc受体结合测定、C1q结合测定和细胞裂解测定来评估效应功能。
如本文所使用的，“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的效应细胞识别靶细胞上的结合抗体或抗原结合片段并且随后引起靶细胞的裂解。“ADCC活性”或“ADCC效应”是指结合在靶细胞上的抗体或抗原结合片段以引发如上所述的ADCC反应的能力。
如本文所使用的，“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指一种机制，通过所述机制，抗体可以通过活化有机体的补体***来介导特异性靶细胞裂解。在CDC中，C1q结合抗体并且这种结合触发补体级联，作为经典通路补体活化的结果，这会导致在靶细胞表面处形成膜攻击复合物(MAC)(C5b到C9)。“CDC活性”或“CDC效应”是指结合在靶细胞上的抗体或抗原结合片段以引发如上所述的CDC反应的能力。
如本文所使用的，“靶细胞”是指包括Fc区的抗体特异性结合的细胞。“效应细胞”是表达一种或多种Fc受体并执行效应功能的白细胞。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；其中PBMC和NK细胞是优选的。效应细胞可以从其天然来源中分离，例如从本领域中已知的血液或PBMC中分离。
“分离的”物质已经经人工由自然状态改变。如果自然界中出现某种“分离的”组合物或物质，那么其已经被改变或脱离其原始环境，或二者均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在的多核苷酸或多肽不是“分离的”，但如果所述多核苷酸或多肽与其在天然状态下共存的物质充分分离并以基本上纯的状态存在，则可以认为是“分离的”。“分离的核酸序列”是指分离的核酸分子的序列。在某些实施方式中，“分离的抗体或其抗原结合片段”是指纯度为至少60％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的抗体或其抗原结合片段，如通过电泳方法(如SDS-PAGE、等电聚焦、毛细管电泳)或色谱方法(如离子交换色谱法或反相HPLC)确定的。
如本文所使用的，术语“载体”是指可以将编码蛋白质的多核苷酸可操作地***其中以便引起所述蛋白质的表达的媒剂。载体可以用于转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传元件在宿主细胞内得以表达。载体的实例包括质粒、噬菌粒、粘粒、人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)、如λ噬菌体或M13噬菌体等噬菌体以及动物病毒。用作载体的动物病毒的类别包括逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、***瘤病毒和乳多空病毒(例如，SV40)。载体可以含有多种用于控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、可选择元件和报告基因。另外，载体还可以含有复制起点。载体还可以包括协助其进入细胞的材料，包括但不限于病毒颗粒、脂质体或蛋白质包衣。载体可以是表达载体或克隆载体。本公开提供了载体(例如，表达载体)，所述载体含有本文所提供的编码抗体或其抗原结合片段的核酸序列、至少一个可操作地连接到所述核酸序列的启动子(例如，SV40、CMV、EF-1α)以及至少一个选择标志物。载体的实例包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、***瘤病毒、乳多空病毒(例如，SV40)、λ噬菌体和M13噬菌体、质粒pcDNA3.3、pMD18-T、pOptivec、pCMV、pEGFP、pIRES、pQD-Hyg-Gseu、pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS10、pLexA、pACT2.2、pCMV-SCRIPT.RTM.、pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、PCR 2.1、pEF-1、pFB、pSG5、pXT1、pCDEF3、pSVSPORT、pEF-Bos等。
如本文所使用的，短语“宿主细胞”是指其中可以或已经引入有外源多核苷酸和/或载体的细胞。
术语“受试者”包括人和非人动物。非人动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类动物、小鼠、大鼠、猫、兔、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。除在指出时之外，术语“患者”、“受试者”或“个体”在本文中可互换使用。
术语“抗肿瘤活性”意指肿瘤细胞增殖、活力或转移活性的降低。例如，与未使用疗法的对照相比，可以通过在治疗期间出现的异常细胞的生长率的减少或肿瘤大小稳定性或减少或由于治疗引起的更长的存活率来表示抗肿瘤活性。可以使用公认的体外或体内肿瘤模型来评估此类活性，所述模型包括但不限于异种移植模型、同种异体移植模型、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)模型和本领域已知的其它已知模型来研究抗肿瘤活性。
如本文所使用的，疾病、病症或病状的“治疗(treating/treatment)”包括预防或缓解疾病、病症或病状、减缓疾病、病症或病状的发作或发展速率、降低罹患疾病、病症或病状的风险、预防或延缓与疾病、病症或病状相关的症状的发展、减少或结束与疾病、病症或病状相关的症状、使疾病、病症或病状完全或部分消退、治愈疾病、病症或病状或其一些组合。
如本文所使用的，术语“生物样品”或“样品”是指从所关注的受试者获得或源自所关注的受试者的生物组合物，所述生物组合物含有例如基于物理、生化、化学和/或生理特性待表征和/或鉴定的细胞和/或其它分子实体。生物样品包括但不限于通过本领域技术人员已知的任何方法获得的受试者的细胞、组织、器官和/或生物体液。在一些实施方式中，所述生物样品是体液样品。在一些实施方式中，所述体液样品是全血、血浆、血清、粘液(包括鼻腔引流物和痰)、腹膜液、胸膜液、胸液、唾液、尿液、滑液、脑脊液(CSF)、胸腔穿刺液、腹腔积液、腹水或心包液。在一些实施方式中，所述生物样品是从所述受试者的胃、心脏、肝脏、脾、肺、肾、皮肤或血管获得的组织或细胞。
如本文所使用的，“PD-L1”，也称为B7-H1或CD274，是指程序性细胞死亡配体1(PD-L1，参见例如Freeman等人(2000)《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》192:1027)蛋白，并且包括PD-L1的通过细胞自然表达或通过用PD-L1基因转染的细胞表达的任何变体、构象、同种型和物种同系物。例如，本文所描述的PD-L1可以指源自任何脊椎动物来源的PD-L1蛋白，所述脊椎动物来源包括如灵长类动物(例如，人、猴)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)等哺乳动物。其在胎盘、脾脏、***、胸腺、心脏、胎肝中表达，并且还可在许多肿瘤细胞或癌细胞上找到。NCBI登录号：NP 054862.1(代表性的氨基酸序列)和NCBI登录号：NM_014143.3(代表性的核酸序列)中公开了人PD-L1的示例性序列。非人PD-L1的示例性序列包括：食蟹猴(Macaca fascicularis)(猴)PD-L1蛋白(NCBI Ref Seq No.XM_005581779.3)；小家鼠(Musmusculus)(小鼠)PD-L1蛋白(NCBI Ref Seq No.ADK70950.1)；褐家鼠(Rattusnorvegicus)(大鼠)PD-L1蛋白(NCBI Ref Seq No.NP_001178883.1)。在某些实施方式中，本文所使用的PD-L1还可以是重组PD-L1，所述重组PD-L1可以任选地以重组PD-L1复合物的形式表达。重组PD-L1复合物可以在细胞表面上表达，或者也可以以与细胞表面不结合的可溶形式表达。在某些实施方式中，PD-L1是人PD-L1。术语“PD-L1”、“PDL1”、“B7H1”、“B7-H1”和“CD274”在本公开中可以互换使用。
如本文所使用的，术语“4-1BB”，也称为CD137或肿瘤坏死因子受体超家族成员9(TNFRSF9)，是指4-1BB蛋白并且包括4-1BB的通过细胞自然表达或通过用4-1BB基因转染的细胞表达的任何变体、构象、同种型和物种同系物。例如，本文所描述的4-1BB可以指源自任何脊椎动物来源的4-1BB蛋白，所述脊椎动物来源包括如灵长类动物(例如，人、猴)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)等哺乳动物。NCBI登录号NP_001552.2、NM_001561.5、XP_011539688.1或XM_011541386.2中公开了人4-1BB的示例性序列。非人4-1BB的示例性序列包括：食蟹猴(猴)4-1BB蛋白(NCBI Ref Seq No.ABY47575.1)；小家鼠(小鼠)4-1BB蛋白(NCBI Ref Seq No.NP_001070977.1、NM_001077509.1、NP_035742.1、NM_011612.2、XP_011248530.1、XM_011250228.2)；褐家鼠(大鼠)4-1BB蛋白(NCBI Ref Seq No.NP_852049.1、NP_001020944.1、AAH97483.1)。在某些实施方式中，本文所使用的4-1BB还可以是重组4-1BB，所述重组4-1BB可以任选地以重组PD-L1复合物的形式表达。重组4-1BB复合物可以在细胞表面上表达，或者也可以以与细胞表面不结合的可溶形式表达。在某些实施方式中，4-1BB是人4-1BB。术语“4-1BB”、“41BB”、“CD137”、“CD-137”、“CD 137”和“TNFRSF9”在本公开中可以互换使用。
如本文所使用的，“与PD-L1和/或4-1BB相关的疾病、病症或病状”或“PD-L1和/或4-1BB相关的疾病、病症或病状”是指由PD-L1和/或4-1BB的表达或活性的增加或降低所引起、加剧或以其它方式连接的任何疾病、病症或病状。在一些实施方式中，与PD-L1和/或4-1BB相关的疾病、病症或病状是与过量细胞增殖相关的病症，例如癌症。在某些实施方式中，所述疾病、病症或病状的特征在于表达或过表达PD-L1和/或4-1BB或与PD-L1和/或4-1BB相关的基因。
抗体
一方面，本公开提供了与抗PD-L1抗体、抗4-1BB抗体或双特异性PD-L1/4-1BB抗体特异性结合的抗体及其抗原结合片段。在一些实施方式中，本公开提供了与ATG-101特异性结合的抗体及其抗原结合片段。
如本文所使用的，术语“ATG-101”是靶向PD-L1和4-1BB的同源二聚体双功能分子，所述同源二聚体双功能分子包括针对PD-L1的全人IgG1抗体和针对4-1BB的scFv，其中针对4-1BB的scFv包括针对4-1BB的VH区和针对4-1BB的VL区，并且VH区通过连接子(例如，(GGGGS)3)与VL区连接，并且scFv的VH区通过连接子(例如，(GGGGS)3)与针对PD-L1的全人IgG1抗体的Fc区的C末端连接。在一些实施方式中，ATG-101的第297位(根据EP编号***)的天冬酰胺突变为丙氨酸以消除与Fcγ受体的结合亲和力。贯穿本说明书，ATG-101的针对PD-L1的全人IgG1抗体被称为ATG-101的“PD-L1结合部分”，并且ATG-101的针对4-1BB的scFv被称为ATG-101的“4-1BB结合部分”。表1中示出了ATG-101的HCDR、LCDR、VH区、VL区、重链和轻链的氨基酸序列。表1中ATG-101的CDR边界是根据IMGT规则确定的。
表1.ATG-101的HCDR、LCDR、VH区、VL区、重链和轻链的氨基酸序列
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本文所提供的抗体或其抗原结合片段的结合亲和力可以由KD值表示，其代表当抗原与抗原结合分子之间的结合达到平衡时解离速率与缔合速率的比率(koff/kon)。可以使用本领域已知的合适方法(包括例如流式细胞术测定)适当地测定抗原结合亲和力(例如，KD)。在一些实施方式中，可以通过流式细胞术测定抗体或其抗原结合片段与不同浓度的抗原的结合，所确定的平均荧光强度(MFI)可以首先对抗体浓度进行绘图，然后使用Prism版本5(加利福尼亚州圣地亚哥GraphPad软件(GraphPad Software，San Diego，CA))，可以通过将特异性结合荧光强度(Y)和抗体浓度(X)的依赖性拟合到一个位点饱和方程(sitesaturation equation)中来计算KD值：Y＝Bmax*X/(KD+X)，其中Bmax是指被测抗体与抗原的最大特异性结合。
本文所提供的抗体或其抗原结合片段与ATG-101的结合也可以用“半最大有效浓度”(EC50)值表示，其是指抗体的观察到其最大结合的50％的浓度。EC50值可以通过本领域已知的结合测定来测量，例如直接或间接结合测定，如酶联免疫吸附测定(ELISA)、FACS测定和其它结合测定。在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段能够与ATG-101特异性结合(例如，如通过ELISA测定测量的)。在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段能够与ATG-101的PD-L1结合部分特异性结合(例如，如通过ELISA测定测量的)。在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段能够与ATG-101的4-1BB结合部分特异性结合(例如，如通过ELISA测定测量的)。在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段能够与ATG-101的PD-L1结合部分和4-1BB结合部分特异性结合(例如，如通过ELISA测定测量的)。
另一方面，本公开提供了与ATG-101竞争结合PD-L1和/或4-1BB的抗体及其抗原结合片段。
“与ATG-101竞争结合”靶标的能力是指第一抗体或其抗原结合片段抑制靶标(例如，PD-L1和/或4-1BB)与ATG-101之间结合的相互作用到任何可检测的程度的能力。在某些实施方式中，竞争与PD-L1和/或4-1BB结合的抗体或抗原结合片段将PD-L1和/或4-1BB与ATG-101之间结合的相互作用抑制至少85％或至少90％。在某些实施方式中，所述抑制可以大于95％或大于99％。
示例性抗体
在某些实施方式中，本公开提供了抗体或其抗原结合片段，包括：
包含在选自由以下组成的组的重链可变(VH)区序列中的任何一个内的一个或两个或三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和/或HCDR3)：SEQ ID NO:6、13、20、27、34、41、48和55；和/或
包含在选自由以下组成的组的轻链可变(VL)区序列中的任何一个内的一个或两个或三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和/或LCDR3)：SEQ ID NO:7、14、21、28、35、42、49和56。
本领域技术人员可以通过本领域已知的方法定义或确定VH区或VL区的CDR边界，只要所述VH区或VL区的氨基酸序列是已知的。例如，抗体或其抗原结合片段的CDR边界可以通过Kabat、IMGT、Chothia或Al-Lazikani规则来定义或确定(Al-Lazikani,B.、Chothia,C.、Lesk,A.M.,《分子生物学杂志》,273(4),927(1997)；Chothia,C.等人,《分子生物学杂志》12月5日；186(3):651-63(1985)；Chothia,C.和Lesk,A.M.,《分子生物学杂志》,196,901(1987)；Chothia,C.等人,《自然》12月21-28日；342(6252):877-83(1989)；Kabat E.A.等人,《具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteins of immunologicalInterest)》,第5版公共卫生署(Public Health Service),国立卫生研究院(NationalInstitutes of Health),马里兰州贝塞斯达(Bethesda,Md.)(1991)；Marie-PauleLefranc等人,《发育与比较免疫学(Developmental and Comparative Immunology)》,27:55-77(2003)；Marie-Paule Lefranc等人,《免疫组研究(Immunome Research)》,1(3),(2005)；Marie-Paule Lefranc,《B细胞的分子生物学(Molecular Biology of B cells)》(第二版),第26章,481-514,(2015))。在一些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段的CDR边界是根据Kabat规则确定的。在一些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段的CDR边界是根据IMGT规则确定的。在一些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段的CDR边界是根据Chothia规则确定的。在一些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段的CDR边界是根据Al-Lazikani规则确定的。
在某些实施方式中，本公开提供了抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括抗体9D6E11、10F10G7、27E8A8、31B6G8、58H6F8、63C9C12、75H9F7或50D6E10中的一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个或6个)CDR序列。
如本文所使用的，抗体“9D6E11”是指包括具有SEQ ID NO:6的序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:7的序列的轻链可变区的小鼠单克隆抗体。
如本文所使用的，抗体“10F10G7”是指包括具有SEQ ID NO:13的序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:14的序列的轻链可变区的小鼠单克隆抗体。
如本文所使用的，抗体“27E8A8”是指包括具有SEQ ID NO:20的序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:21的序列的轻链可变区的小鼠单克隆抗体。
如本文所使用的，抗体“31B6G8”是指包括具有SEQ ID NO:27的序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:28的序列的轻链可变区的小鼠单克隆抗体。
如本文所使用的，抗体“58H6F8”是指包括具有SEQ ID NO:34的序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:35的序列的轻链可变区的小鼠单克隆抗体。
如本文所使用的，抗体“63C9C12”是指包括具有SEQ ID NO:41的序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:42的序列的轻链可变区的小鼠单克隆抗体。
如本文所使用的，抗体“75H9F7”是指包括具有SEQ ID NO:48的序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:49的序列的轻链可变区的小鼠单克隆抗体。
如本文所使用的，抗体“50D6E10”是指包括具有SEQ ID NO:55的序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:56的序列的轻链可变区的小鼠单克隆抗体。
下表4中示出了如上所述的每个示例性抗体的重链可变区和轻链可变区的具体氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段包括包含在如SEQ IDNO:6所示的VH区序列内的三个重链CDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)以及包含在如SEQ ID NO:7所示的VL区序列内的三个轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段包括包含在如SEQ IDNO:13所示的VH区序列内的三个重链CDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)以及包含在如SEQ ID NO:14所示的VL区序列内的三个轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段包括包含在如SEQ IDNO:20所示的VH区序列内的三个重链CDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)以及包含在如SEQ ID NO:21所示的VL区序列内的三个轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段包括包含在如SEQ IDNO:27所示的VH区序列内的三个重链CDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)以及包含在如SEQ ID NO:28所示的VL区序列内的三个轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段包括包含在如SEQ IDNO:34所示的VH区序列内的三个重链CDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)以及包含在如SEQ ID NO:35所示的VL区序列内的三个轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段包括包含在如SEQ IDNO:41所示的VH区序列内的三个重链CDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)以及包含在如SEQ ID NO:42所示的VL区序列内的三个轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段包括包含在如SEQ IDNO:48所示的VH区序列内的三个重链CDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)以及包含在如SEQ ID NO:49所示的VL区序列内的三个轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段包括包含在如SEQ IDNO:55所示的VH区序列内的三个重链CDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)以及包含在如SEQ ID NO:56所示的VL区序列内的三个轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段包括至少一个(例如，1个、2个或3个)重链或轻链CDR，所述CDR包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ IDNO:1、2、3、4、NAK、5、8、9、10、11、RAN、12、15、16、17、18、AAS、19、22、23、24、25、AAS、26、29、30、31、32、STS、33、36、37、38、39、NAK、40、43、44、45、46、NAK、47、50、51、52、53、QMS和54。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段包括VH区，所述VH区包括HCDR1、HCDR2和HCDR3中的一个或两个或三个，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、2、3、8、9、10、15、16、17、22、23、24、29、30、31、36、37、38、43、44、45、50、51和52。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段包括VL区，所述VL区包括LCDR1、LCDR2和LCDR3中的一个或两个或三个，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:4、NAK、5、11、RAN、12、18、AAS、19、25、AAS、26、32、STS、33、39、NAK、40、46、NAK、47、53、QMS和54。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、8、15、22、29、36、43和50；所述HCDR2包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、9、16、23、30、37、44和51；所述HCDR3包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:3、10、17、24、31、38、45和52。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:4、11、18、25、32、39、46和53；所述LCDR2包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：NAK、RAN、AAS、AAS、STS、NAK、NAK和QMS；所述LCDR3包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:5、12、19、26、33、40、47和54。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段包括：
i.HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
ii.HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列；
iii.HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列；
iv.HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；
v.HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列；
vi.HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列；
vii.HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列；或
viii.HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段包括：
i.LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如NAK所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
ii.LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如RAN所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；
iii.LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如AAS所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列；
iv.LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如AAS所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列；
v.LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如STS所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列；
vi.LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如NAK所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列；
vii.LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如NAK所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列；或
viii.LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如QMS所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段包括：
i.HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如NAK所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
ii.HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQID NO:10所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如RAN所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；
iii.HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如AAS所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列；
iv.HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQID NO:24所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如AAS所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列；
v.HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQID NO:31所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如STS所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列；
vi.HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQID NO:38所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如NAK所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列；
vii.HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如NAK所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列；或
viii.HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如QMS所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列。
下表2中示出了上述8种单克隆抗体中的每种单克隆抗体的重链(表示为“H”)可变区、轻链(表示为“L”)可变区、HCDR和LCDR的SEQ ID NO。除非另有说明，否则如本文描述的CDR边界均由IMGT规则定义或确定。下表3中示出了8种示例性单克隆抗体的每个CDR的氨基酸序列。下表4中示出了8种示例性单克隆抗体的每个VH和VL的氨基酸序列。
表2. 8种示例性单克隆抗体的VH、VL、HCDR和LCDR的SEQ ID NO
表3.8种示例性单克隆抗体的每个CDR的氨基酸序列
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表4. 8种示例性单克隆抗体的每个VH和VL的氨基酸序列
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考虑到8种示例性单克隆抗体中的每种单克隆抗体都可以与ATG-101结合，并且抗原结合特异性主要是由CDR1区、CDR2区和CDR3区提供的，8种示例性单克隆抗体中的每种单克隆抗体的HCDR1序列、HCDR2序列和HCDR3序列以及LCDR1序列、LCDR2序列和LCDR3序列可以被“混合和匹配”(即，来自不同抗体的CDR可以被混合和匹配，但每种抗体必须包含HCDR1、HCDR2和HCDR3以及LCDR1、LCDR2和LCDR3)以产生本公开的ATG-101结合分子。可以使用上述和实施例中的结合测定来测试此类“混合和匹配”的抗体与ATG-101的结合。优选地，当VH CDR序列被混合和匹配时，来自特定VH序列的HCDR1序列、HCDR2序列和/或HCDR3序列被结构上类似的CDR序列替换。同样，当VL CDR序列被混合和匹配时，来自特定VL序列的LCDR1序列、LCDR2序列和/或LCDR3序列优选地被结构上类似的CDR序列替换。例如，抗体9D6E11和27E8A8的HCDR1共享一些结构相似性，并且因此易于混合和匹配。本领域技术人员将显而易见的是，可以通过用来自8种示例性单克隆抗体的本文所公开的CDR序列的结构上类似的序列取代一个或多个VH和/或VL CDR序列来产生新型VH和VL序列。
已知CDR负责抗原结合。然而，已经发现并非所有的6个CDR都是不可缺少或不可改变的。换言之，可以替换或改变或修饰8种示例性单克隆抗体中的每种单克隆抗体的一个或多个CDR，但基本上保留对ATG-101的特异性结合亲和力。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体和抗原结合片段包括抗体9D6E11、10F10G7、27E8A8、31B6G8、58H6F8、63C9C12、75H9F7或50D6E10中的一种的重链CDR3序列。在某些实施方式中，本文所提供的抗体和抗原结合片段包括选自由以下组成的组的重链CDR3序列：SEQ ID NO:3、10、17、24、31、38、45和52。重链CDR3区位于抗原结合位点的中心，并且因此被认为与抗原接触最多，并为抗体提供对抗原的亲和力最自由的能量。还认为，通过多种多样化机制，重链CDR3是迄今为止抗原结合位点在长度、氨基酸组成和构象方面最多样化的CDR(Tonegawa S.《自然(Nature)》302:575-81)。重链CDR3的多样性足以产生大多数抗体特异性(Xu JL、Davis MM.《免疫力(Immunity.)》13:37-45)以及理想的抗原结合亲和力(Schier R等人,《分子生物学杂志(J Mol Biol.)》263:551-67)。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段包括VH区，所述VH区具有如SEQ ID NO:6、13、20、27、34、41、48或55所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:6、13、20、27、34、41、48或55具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)序列同一性的同源序列。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段包括VL区，所述VL区具有如SEQ ID NO:7、14、21、28、35、42、49或56所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7、14、21、28、35、42、49或56具有至少80％(例如，至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)序列同一性的同源序列。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段包括VH/VL氨基酸序列对，所述氨基酸序列对选自由以下组成的组：SEQ ID NO:6和7、13和14、20和21、27和28、34和35、41和42、48和49、以及55和56。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体及其抗原结合片段包括合适的框架区(FR)序列，只要所述抗体及其抗原结合片段可以特异性地结合到ATG-101即可。上表3中提供的CDR序列是从小鼠抗体获得的，但所述CDR序列可以使用如重组技术等本领域已知的合适方法移植到如小鼠、人、大鼠、兔等任何合适物种的任何合适FR序列。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体及其抗原结合片段是人源化的。期望人源化抗体或其抗原结合片段在人类中具有降低的免疫原性。人源化抗体在其可变区是嵌合的，因为非人CDR序列被移植到人或基本上是人的FR序列。抗体或抗原结合片段的人源化基本上可以通过用非人(如鼠)CDR基因取代人免疫球蛋白基因中的对应人CDR基因来进行(参见例如，Jones等人(1986)《自然(Nature)》321:522-525；Riechmann等人(1988)《自然(Nature)》332:323-327；Verhoeyen等人(1988)《科学(Science)》239:1534-1536)。
可以使用本领域已知的方法选择合适的人重链和轻链可变结构域以实现此目的。在说明性实例中，可以使用“最佳拟合”方法，其中针对已知人可变结构域序列的数据库筛选或BLAST非人(例如，啮齿动物)抗体可变结构域序列，鉴定出最接近非人查询序列的人序列，并用作用于移植非人CDR序列的人框架(参见例如Sims等人,(1993)《免疫学杂志(J.Immunol.)》151:2296；Chothia等人(1987)《分子生物学杂志》196:901)。可替代地，来源于所有人抗体的共有序列的框架可以用于移植非人CDR(参见例如Carter等人(1992)《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,89:4285；Presta等人(1993)《免疫学杂志(J.Immunol.)》,151:2623)。
在一些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段是人源化的。在某些实施方式中，除了非人的CDR序列之外，本文所提供的人源化抗体或其抗原结合片段由基本上全人序列构成。在一些实施方式中，可变区FR和恒定区(如果存在)完全或基本上来自人免疫球蛋白序列。人FR序列和人恒定区序列可以源自不同的人免疫球蛋白基因，例如，FR序列源自一种人抗体并且恒定区源自另一种人抗体。在一些实施方式中，人源化抗体或其抗原结合片段包括人重链HFR1、HFR2、HFR3和HFR4和/或轻链LFR1、LFR2、LFR3和LFR4。
在一些实施方式中，源自人的FR区可以包括与其所源自的人免疫球蛋白相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，人FR的一个或多个氨基酸残基被来自亲本非人抗体的对应残基取代。在某些实施方式中，这可能是期望的，以使人源化抗体或其片段非常接近非人亲本抗体结构，从而优化结合特性(例如，增加结合亲和力)。在某些实施方式中，本文所提供的人源化抗体或其抗原结合片段在多个人FR序列中的每个人FR序列中包括不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基取代，或者在重链或轻链可变结构域的所有FR序列中包括不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基取代。在一些实施方式中，氨基酸残基的此类变化可以仅存在于重链FR区、仅存在于轻链FR区、或存在于两条链中。在某些实施方式中，使人FR序列的一个或多个氨基酸随机突变以增加结合亲和力。在某些实施方式中，使人FR序列的一个或多个氨基酸回复突变为亲本非人抗体的对应氨基酸以增加结合亲和力。
在一些实施方式中，本文所提供的抗体和抗原结合片段包括重链可变结构域的全部或一部分和/或轻链可变结构域的全部或一部分。在一个实施例中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段是由本文所提供的重链可变结构域的全部或一部分组成的单结构域抗体。可在本领域中获得有关此类单结构域抗体的更多信息(参见例如美国专利第6,248,516号)。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段进一步包括Fc区。在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段进一步包括人免疫球蛋白(Ig)的Fc区。在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段进一步包括恒定区，所述恒定区任选地进一步包括重链和/或轻链恒定区。在某些实施方式中，重链恒定区包括CH1、铰链和/或CH2-CH3区(或任选的CH2-CH3-CH4区)。在某些实施方式中，本文所提供的抗药抗体或其抗原结合片段包括人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2或IgM的重链恒定区。在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段包括λ(lambda)轻链或κ(kappa)轻链。本文所提供的抗体或其抗原结合片段的恒定区可以与野生型恒定区序列相同或在一个或多个突变中不同。
在某些实施方式中，重链恒定区包括Fc区。已知Fc区介导效应功能，如抗体的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段进一步包括人或小鼠免疫球蛋白(Ig)的Fc区。在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段进一步包括人或小鼠IgG的Fc区。在某些实施方式中，所述Fc区源自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
不同Ig同种型的Fc区具有不同的诱导效应功能的能力。例如，IgG1和IgG3的Fc区已被公认为比IgG2和IgG4的Fc区更有效地诱导ADCC和CDC两者。在某些实施方式中，本文所提供的抗体及其抗原结合片段包括IgG1或IgG3同种型的Fc区，所述Fc区可以诱导ADCC或CDC；或可替代地，IgG4或IgG2同种型的恒定区，所述恒定区具有降低或耗尽的效应功能。在一些实施方式中，所述Fc区源自人IgG1。在一些实施方式中，所述Fc区源自具有增强的效应功能的人IgG1。在一些实施方式中，所述Fc区包括如SEQ ID NO:75所示的氨基酸序列。
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS
GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY
NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR
EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:75)
在一些实施方式中，所述Fc区包括如SEQ ID NO:76所示的氨基酸序列。
AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQS
DLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFP
PKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVS
ELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVS
LTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(SEQ ID NO:76)
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段对ATG-101具有特异性结合亲和力，这足以提供诊断和/或治疗用途。
本文所提供的抗体或其抗原结合片段可以是单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体、重组抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、标记抗体、二价抗体、抗独特型抗体或融合蛋白。重组抗体是使用重组方法在体外而不是在动物体内制备的抗体。
在某些实施方式中，本公开提供了抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与本文所提供的抗体或其抗原结合片段竞争结合ATG-101。在某些实施方式中，本公开提供了抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与抗体9D6E11、10F10G7、27E8A8、31B6G8、58H6F8、63C9C12、75H9F7和50D6E10中的任何一个竞争结合ATG-101。在一些实施方式中，本公开提供了抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与本文所提供的抗体或抗原结合片段竞争相同表位。
如本文所使用的，“阻断结合”或“竞争结合”的能力是指抗体或抗原结合片段抑制两个分子(例如，ATG-101与本公开的抗体)之间结合的相互作用到任何可检测的程度的能力。在某些实施方式中，阻断两个分子之间结合的抗体或其抗原结合片段将两个分子之间结合的相互作用抑制至少85％或至少90％。在某些实施方式中，所述抑制可以大于95％或大于99％。
本领域技术人员将认识到，通过确定人单克隆抗体是否阻止本公开的抗体与ATG-101结合，可以在不进行不当实验的情况下确定人单克隆抗体是否与本公开的抗体(例如，小鼠单克隆抗体9D6E11、10F10G7、27E8A8、31B6G8、58H6F8、63C9C12、75H9F7或50D6E10)结合相同表位。如果测试抗体与本公开的抗体竞争，如本公开的抗体与ATG-101的结合减少所示，则两种抗体与相同或密切相关的表位结合。或者，如果测试抗体与ATG-101的结合被本公开的抗体抑制，则两种抗体与相同或密切相关的表位结合。
抗体变体
本文所提供的抗体及其抗原结合片段还涵盖本文所提供的抗体序列的各种变体。
在某些实施方式中，所述抗体变体包括一个或多个氨基酸残基取代或修饰，但仍保留对ATG-101的特异性结合亲和力。在某些实施方式中，所述取代或修饰中的至少一个位于所述VH区或所述VL区的一个或多个CDR序列中。在某些实施方式中，所述取代或修饰中的至少一个位于所述VH区或所述VL区的一个或多个非CDR序列中。在某些实施方式中，本公开的抗体或其抗原结合片段进一步包括一个或多个非天然氨基酸(NNAA)取代。在某些实施方式中，所述NNAA能够被缀合的。
例如，所述抗体变体包括在上表3中提供的CDR序列中的一个或多个、上表4中提供的重链可变区或轻链可变区的非CDR序列中的一个或多个和/或恒定区(例如，Fc区)中的一个或多个氨基酸残基取代或修饰。此类变体保留了其亲本抗体对ATG-101的结合特异性，但具有一种或多种由修饰或取代赋予的期望性质。例如，抗体变体可以具有改善的抗原结合亲和力、改善的糖基化模式、降低的糖基化风险、减少的脱氨基作用、增强的效应功能、改善的FcRn受体结合、增加的药代动力学半衰期、pH敏感性和/或与缀合的相容性(例如，一个或多个引入的半胱氨酸残基)等。
可以使用本领域已知的方法，例如“丙氨酸扫描诱变”，筛选亲本抗体序列以鉴定合适的或优选的待修饰或取代的残基(参见例如Cunningham和Wells(1989)《科学(Science)》,244:1081-1085)。简要地说，可以鉴定靶标残基(例如带电的残基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并被中性或带负电的氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)替换，并且产生经修饰的抗体，并且针对所关注性质对其进行筛选。如果在特定的氨基酸位置处的取代表现出所关注功能性改变，则所述位置可以被鉴定为潜在的用于修饰或取代的残基。可以通过用另一种残基(例如，半胱氨酸残基、带正电荷的残基等)取代来进一步评估所述潜在的残基。
亲和力变体
抗体的亲和力变体可以含有上表3中提供的一个或多个CDR序列、一个或多个FR序列或上表4中提供的重链或轻链可变区序列中的修饰或取代。本领域技术人员可以基于上表3中的CDR序列和上表4中的可变区序列容易地鉴定FR序列，因为本领域公知在可变区中，CDR区侧接两个FR区。亲和力变体保留了亲本抗体对ATG-101的特异性结合亲和力，或者甚至比亲本抗体具有更高的ATG-101特异性结合亲和力。在某些实施方式中，CDR序列、FR序列或可变区序列中的至少一个(或全部)取代包括保守取代。
本领域技术人员将理解，在上表3中提供的CDR序列以及上表4中提供的可变区序列中，一个或多个氨基酸残基可以被取代，但所得抗体或抗原结合片段仍保留对ATG-101的结合亲和力或结合能力，或者甚至具有改进的结合亲和力或结合能力。可以使用本领域已知的各种方法来实现此目的。例如，可以生成抗体变体(如Fab或scFv变体)的文库，并用噬菌体展示技术表达，随后针对与ATG-101结合的亲和力对其进行筛选。再例如，计算机软件可以用于虚拟模拟抗体与ATG-101的结合，并鉴定抗体上的形成结合界面的氨基酸残基。在取代中可以避开此类残基以防止结合亲和力降低，或者可以作为取代的靶标以获得更强的结合。
在某些实施方式中，本文所提供的人源化抗体或其抗原结合片段包括CDR序列中的一个或多个CDR序列和/或FR序列中的一个或多个FR序列中的一个或多个氨基酸残基取代。在某些实施方式中，亲和力变体包括CDR序列和/或FR序列中总共不超过20个、15个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个取代。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段包括1个、2个或3个CDR序列，所述序列与上表3中所列出的所述序列具有至少80％(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性，但仍以相对于其亲本抗体而言相似或甚至更高的水平保留了对ATG-101的特异性结合亲和力。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段包括一个或多个可变区序列，所述一个或多个可变区序列与上表4中所列出的所述序列具有至少80％(例如，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性，但仍以相对于其亲本抗体而言相似或甚至更高的水平保留了对ATG-101的特异性结合亲和力。在一些实施方式中，在上表4中列出的可变区序列中总共取代、***或缺失了1到10个氨基酸。在一些实施方式中，所述取代、***或缺失发生在CDR之外的区中(例如，在FR中)。
糖基化变体
本文所提供的抗体或其抗原结合片段还涵盖糖基化变体，可以获得所述糖基化变体以增加或减少所述抗体或其抗原结合片段的糖基化程度。
本文所提供的抗体或其抗原结合片段可以包括引入或去除糖基化位点的一个或多个修饰。糖基化位点是具有侧链的氨基酸残基，碳水化合物部分(例如，寡糖结构)可以连接到所述侧链。抗体的糖基化通常是N连接的或O连接的。N连接是指碳水化合物部分连接到天冬酰胺残基(例如，如天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸等三肽序列中的天冬酰胺残基)的侧链，其中X是除了脯氨酸之外的任何氨基酸。O连接的糖基化是指将N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一与羟基氨基酸连接，最常见的是与丝氨酸或苏氨酸连接。可以很方便地去除天然糖基化位点，例如通过改变氨基酸序列，使得存在于所述序列中的上述三肽序列(对于N连接的糖基化位点)或者丝氨酸或苏氨酸残基(对于O连接的糖基化位点)中的一个被取代。可以通过引入此类三肽序列或者丝氨酸或苏氨酸残基以相似的方式产生新的糖基化位点。
半胱氨酸工程化的变体
本文所提供的抗体或其抗原结合片段还涵盖半胱氨酸工程化的变体，所述变体包括一个或多个引入的游离半胱氨酸氨基酸残基。
游离半胱氨酸残基是不为二硫键的一部分的半胱氨酸残基。半胱氨酸工程化的变体可用于通过例如马来酰亚胺或卤乙酰基在经工程化的半胱氨酸的位点处与例如细胞毒性化合物和/或成像化合物、标记或放射性同位素等缀合。用于工程化抗体或其抗原结合片段以引入游离半胱氨酸残基的方法是本领域已知的，参见例如，WO2006/034488。
Fc变体
本文所提供的抗体和抗原结合片段还涵盖Fc变体，所述Fc变体包括在其Fc区和/或铰链区处的一个或多个氨基酸残基修饰或取代。
在某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包括改善与新生儿Fc受体(FcRn)的pH依赖性结合的一个或多个氨基酸取代。此类变体可以具有延长的药代动力学半衰期，因为它在酸性pH下与FcRn结合，使其得以免于在溶酶体中降解，并且随后被转移并释放到细胞外。工程化抗体及其抗原结合片段以提高与FcRn的结合亲和力的方法是本领域众所周知的，参见例如Vaughn,D.等人,《结构(Structure)》,6(1):63-73,1998；Kontermann,R.等人,《抗体工程(Antibody Engineering)》,第1卷,第27章:将Fc区工程化以改善PK(Engineering of the Fc region for improved PK),由施普林格(Springer)出版,2010年；Yeung,Y.等人,《癌症研究(Cancer Research)》,70:3269-3277(2010)；以及Hinton,P.等人,《免疫学杂志》,176:346-356(2006)。
在某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包括一个或多个改变ADCC的氨基酸取代。在Fc区的CH2结构域处的某些氨基酸残基可以被取代以提供增强的ADCC活性。可替代地或另外地，可以改变抗体上的碳水化合物结构以增强ADCC活性。通过抗体工程化改变ADCC活性的方法在本领域已有描述，参见例如Shields RL.等人,《生物化学杂志(JBiolChem.)》2001 276(9):6591-604；Idusogie EE.等人,《免疫学杂志》2000.164(8):4178-84；Steurer W.等人,《免疫学杂志(J.Immunology)》1995,155(3):1165-74；Idusogie EE.等人,《免疫学杂志(J.Immunology)》2001,166(4):2571-5；Lazar GA.等人,《美国国家科学院院刊(PNAS)》,2006,103(11):4005-4010；Ryan MC.等人,《分子癌症疗法(Mol.CancerTher.)》,2007,6:3009-3018；Richards JO等人,《分子癌症疗法(Mol Cancer Ther.)》2008,7(8):2517-27；Shields R.L.等人,《生物化学杂志(J.Biol.Chem)》,2002,277:26733-26740；Shinkawa T.等人,《生物化学杂志(J.Biol.Chem)》,2003,278:3466-3473。
在某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段包括改变CDC的一个或多个氨基酸取代，例如通过改善或减少C1q结合和/或CDC(参见例如WO99/51642；Duncan和Winter《自然(Science)》322:738-40(1988)；美国专利第5,648,260号；美国专利第5,624,821号)；以及关于Fc区变体的其它实例的WO94/29351。可以将选自Fc区的第329、331和322位氨基酸残基的一个或多个氨基酸替换为不同的氨基酸残基，以改变C1q结合和/或增强CDC(参见Idusogie等人的美国专利第6,194,551号)。也可以引入一个或多个氨基酸取代，以改变抗体固定补体的能力(参见Bodmer等人的PCT公开WO 94/29351)。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段包括人免疫球蛋白(例如，IgG1)中位于第234和/或235位(根据EP编号)的一个或多个氨基酸取代。在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段包括人免疫球蛋白(例如，IgG1)中位于第234和235位(根据EP编号)的两个氨基酸取代。在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段包括L234A和L235A(根据EU编号)氨基酸取代。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段包括Fc区的界面中的一个或多个氨基酸取代以便于推动和/或促进异二聚体化。这些修饰包括将突起引入到第一Fc多肽中并且将空腔引入到第二Fc多肽中，其中突起可以定位于空腔中，以便促进第一Fc多肽与第二Fc多肽的相互作用以形成异二聚体或复合物。产生具有这些修饰的抗体的方法是本领域已知的，例如，如美国专利第5,731,168号中所述。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段包括第一Fc多肽的在第366位(根据EP编号)的氨基酸取代，并且包括第二Fc多肽的在第366、368和407位(根据EP编号)中的一个、两个或三个位置处的一个、两个或三个氨基酸取代。在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段包括第一Fc多肽的T366W(根据EP编号)取代，并且包括第二Fc多肽的T366S+L368A+Y407V(根据EP编号)取代。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段还包括第一Fc多肽的一个或多个氨基酸取代，并且包括第二Fc多肽的一个或多个氨基酸取代，从而在两个Fc多肽之间引入非天然二硫键。例如，本文所提供的抗体或其抗原结合片段包括第一Fc多肽的在第354位(根据EU编号)的氨基酸取代，并且包括第二Fc多肽的在第349位(根据EU编号)的氨基酸取代。在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段包括第一Fc多肽的S354C(根据EP编号)取代，并且包括第二Fc多肽的Y349C(根据EP编号)取代。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段包括第一Fc多肽和第二Fc多肽，所述第一Fc多肽包括如SEQ ID NO:77所示的氨基酸序列，所述第二Fc多肽包括如SEQ ID NO:78所示的氨基酸序列。
KTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD
GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK
AKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:77)
KTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:78)
抗原结合片段
本文还提供了抗原结合片段。各种类型的抗原结合片段是本领域已知的并且可以基于本文所提供的抗体开发，所述抗体包括例如其CDR在上表3中示出并且可变序列在表4中示出的示例性抗体及其不同变体(如亲和力变体、糖基化变体、Fc变体、半胱氨酸工程化的变体等)。
在某些实施方式中，本文所提供的抗原结合片段是双功能抗体(diabody)、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv’)、二硫键稳定的双功能抗体(ds diabody)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(二价双功能抗体)、多特异性抗体、骆驼化单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体和二价结构域抗体。
可以使用多种技术产生此类抗原结合片段。示例性方法包括完整抗体的酶消化(参见例如Morimoto等人,《生物化学与生物物理方法杂志(Journal of Biochemical andBiophysical Methods)》24:107-117(1992)；以及Brennan等人,《科学》,229:81(1985))、通过如大肠杆菌等宿主细胞进行的重组表达(例如，对于Fab、Fv和ScFv抗体片段)、如上文讨论的从噬菌体展示文库筛选(例如，对于ScFv)以及两个Fab'-SH片段的化学偶联以形成F(ab')2片段(Carter等人,《生物/技术(Bio/Technology)》10:163-167(1992))。用于产生抗体片段的其它技术对本领域技术人员来说是显而易见的。
在某些实施方式中，抗原结合片段是scFv。以下中描述了scFv的产生：例如WO 93/16185；美国专利第5,571,894号；以及第5,587,458号。ScFv可以在氨基端或羧基端与效应蛋白融合以提供融合蛋白(参见例如《抗体工程》,Borrebaeck编辑)。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段是二价的、四价的、六价的或多价的。任何超过二价的分子被认为是多价的，涵盖例如三价、四价、六价等。
如果两个结合位点都与同一抗原或同一表位特异性结合，则二价分子可以是单特异性的。在某些实施方式中，这提供了比单价对应物更强的与抗原或表位的结合。类似地，多价分子也可以是单特异性的。在某些实施方式中，在二价或多价抗原结合部分中，结合位点的第一价和结合位点的第二价在结构上相同(即，具有相同的序列)或在结构上不同(即，具有不同的序列，但具有相同的特异性)。
如果两个结合位点对不同的抗原或表位具有特异性，则二价也可以是双特异性的。这也适用于多价分子。例如，当两个结合位点对第一抗原(或表位)是单特异性的并且第三结合位点对第二抗原(或表位)是特异性的时，三价分子可以是双特异性的。
双特异性或多特异性抗体
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段是双特异性的或者多特异性的。在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段进一步与具有与所述抗体不同的结合特异性的第二功能部分或其抗原结合片段连接。在一些实施方式中，本文所提供的双特异性抗体或多特异性抗体及其抗原结合片段对ATG-101具有第一特异性，并且具有第二特异性。在一些实施方式中，第二特异性是针对ATG-101但针对不同的表位的。
在某些实施方式中，第二特异性是针对肿瘤相关抗原或其表位的。术语“肿瘤相关抗原”是指一种抗原，其出现在或可以呈递在肿瘤细胞表面上，也可以位于肿瘤细胞上或肿瘤细胞内。在一些实施方式中，肿瘤相关抗原只能由肿瘤细胞呈递，而不能由正常细胞(即，非肿瘤细胞)呈递。在一些其它实施方式中，肿瘤相关抗原可以排他性地表达于肿瘤细胞上或可以表示相较于非肿瘤细胞的肿瘤特异性突变。在一些其它实施方式中，肿瘤相关抗原可以在肿瘤细胞和非肿瘤细胞两者中找到，但当相较于非肿瘤细胞时在肿瘤细胞上过表达，或由于相较于非肿瘤组织的肿瘤组织的较不紧凑结构而可用于肿瘤细胞中的抗体结合。在一些实施方式中，肿瘤相关抗原位于肿瘤的脉管***上。
在某些实施方式中，本文所提供的双特异性抗体或多特异性抗体或其抗原结合片段能够与除ATG-101以外的一种或多种(例如，1种、2种、3种、4种、5种或更多种)另外的抗原特异性结合，或与ATG-101上的第二表位特异性结合。在某些实施方式中，除ATG-101以外的一种或多种另外的抗原选自由以下组成的组：KRAS、ERK、XPO1、mTORC1/2、PAK4、NAMPT、ATR、EGFR、FGFR、VEGF、LILRB(例如，LILRB1、LILRB2、LILRB3、LILRB4、LILRB5)、c-MET、Her2、Her3、CTLA4、GITA、CD112R、CD2、CD3、CD7、CD16、CD19、CD20、CD24、CD27、CD30、CD34、CD37、CD39、CD70、CD73、CD83、CD28、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、CD40、CD40L(CD154)、CD47、SIRPα、CD122、CD137、CD137L、OX40(CD134)、OX40L(CD252)、BCMA(例如，BCMA02)、PSMA、CLDN18(例如，CLDN18.2)、NKG2C、4-1BB、LIGHT、PVRIG、SLAMF7、HVEM、BAFFR、ICAM-1、2B4、LFA-1、GITR、ICOS(CD278)、ICOSLG(CD275)、LAG3(CD223)、A2AR、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、B7-H5、BTLA(CD272)、CD160、CTLA-4(CD152)、GPRC5D、IDO(例如，IDO1、IDO2)、TDO、KIR、LAIR-1、NOX2、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、VISTA、SIGLEC-7(CD328)、SIGLEC-9(CD329)、SIGLEC-15、TIGIT、PVR(CD155)和TGFβ。
在某些实施方式中，本文所提供的双特异性抗体或多特异性抗体或其抗原结合片段能够与ATG-101的PD-L1结合部分和4-1BB结合部分特异性结合。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段包括：
i.包含在选自由以下组成的组的重链可变(VH)区序列中的任何一个内的一个或两个或三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和/或HCDR3)：SEQ ID NO:6、13、20和27；
ii.包含在选自由以下组成的组的重链可变(VH)区序列中的任何一个内的一个或两个或三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和/或HCDR3)：SEQ ID NO:34、41、48和55；
iii.包含在选自由以下组成的组的轻链可变(VL)区序列中的任何一个内的一个或两个或三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和/或LCDR3)：SEQ ID NO:7、14、21和28；以及
iv.包含在选自由以下组成的组的轻链可变(VL)区序列中的任何一个内的一个或两个或三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和/或LCDR3)：SEQ ID NO:35、42、49和56。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段包括：
i.包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的HCDR1、包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的HCDR2、包括如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的HCDR3、包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的LCDR1、包括如NAK所示的氨基酸序列的LCDR2、包括如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的LCDR3、包括如SEQ ID NO:29
所示的氨基酸序列的HCDR1、包括如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的HCDR2、包括如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列的HCDR3、包括如SEQ ID NO:
32所示的氨基酸序列的LCDR1、包括如STS所示的氨基酸序列的LCDR2以及包括如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列的LCDR3；
ii.包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的HCDR1、包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的HCDR2、包括如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的HCDR3、包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的LCDR1、包括如NAK所示的氨基酸序列的LCDR2、包括如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的LCDR3、包括如SEQ ID NO:36
所示的氨基酸序列的HCDR1、包括如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列的HCDR2、包括如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列的HCDR3、包括如SEQ ID NO:
39所示的氨基酸序列的LCDR1、包括如NAK所示的氨基酸序列的LCDR2以及包括如SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列的LCDR3；
iii.包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的HCDR1、包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的HCDR2、包括如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的HCDR3、包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的LCDR1、包括如NAK所示的氨基酸序列的LCDR2、包括如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的LCDR3、包括如SEQ ID NO:43
所示的氨基酸序列的HCDR1、包括如SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列的HCDR2、包括如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列的HCDR3、包括如SEQ ID
NO:46所示的氨基酸序列的LCDR1、包括如NAK所示的氨基酸序列的LCDR2以及包括如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列的LCDR3；
iv.包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的HCDR1、包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的HCDR2、包括如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的HCDR3、包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的LCDR1、包括如NAK所示的氨基酸序列的LCDR2、包括如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的LCDR3、包括如SEQ ID NO:50
所示的氨基酸序列的HCDR1、包括如SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列的HCDR2、包括如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列的HCDR3、包括如SEQ ID NO:
53所示的氨基酸序列的LCDR1、包括如QMS所示的氨基酸序列的LCDR2以及包括如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列的LCDR3；
v.包括如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的HCDR1、包括如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的HCDR2、包括如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的HCDR3、包括如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的LCDR1、包括如RAN所示的氨基酸序列的LCDR2、包括如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的LCDR3、包括如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列的HCDR1、包括如SEQ IDNO:30所示的氨基酸序列的HCDR2、包括如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列的HCDR3、包括如SEQ ID NO:
32所示的氨基酸序列的LCDR1、包括如STS所示的氨基酸序列的LCDR2以及包括如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列的LCDR3；
vi.包括如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的HCDR1、包括如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的HCDR2、包括如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的HCDR3、包括如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的LCDR1、包括如RAN所示的氨基酸序列的LCDR2、包括如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的LCDR3、包括如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列的HCDR1、包括如SEQ IDNO:37所示的氨基酸序列的HCDR2、包括如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列的HCDR3、包括如SEQ ID NO:
39所示的氨基酸序列的LCDR1、包括如NAK所示的氨基酸序列的LCDR2以及包括如SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列的LCDR3；
vii.包括如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的HCDR1、包括如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的HCDR2、包括如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的HCDR3、包括如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的LCDR1、包括如RAN所示的氨基酸序列的LCDR2、包括如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的LCDR3、包括如SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列的HCDR1、包括如SEQID NO:44所示的氨基酸序列的HCDR2、包括如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列的HCDR3、包括如SEQ ID NO:
46所示的氨基酸序列的LCDR1、包括如NAK所示的氨基酸序列的LCDR2以及包括如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列的LCDR3；
viii.包括如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的HCDR1、包括如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的HCDR2、包括如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的HCDR3、包括如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的LCDR1、包括如RAN所示的氨基酸序列的LCDR2、包括如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的LCDR3、包括如SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列的HCDR1、包括如SEQID NO:51所示的氨基酸序列的HCDR2、包括如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列的HCDR3、包括如SEQ ID NO:
53所示的氨基酸序列的LCDR1、包括如QMS所示的氨基酸序列的LCDR2以及包括如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列的LCDR3；
ix.包括如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的HCDR1、包括如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的HCDR2、包括如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列的HCDR3、包括如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的LCDR1、包括如AAS所示的氨基酸序列的LCDR2、包括如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的LCDR3、包括如SEQ ID
NO:29所示的氨基酸序列的HCDR1、包括如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的HCDR2、包括如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列的HCDR3、包括如SEQ ID NO:
32所示的氨基酸序列的LCDR1、包括如STS所示的氨基酸序列的LCDR2以及包括如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列的LCDR3；
x.包括如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的HCDR1、包括如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的HCDR2、包括如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列的HCDR3、包括如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的LCDR1、包括如AAS所示的氨基酸序列的LCDR2、包括如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的LCDR3、包括如SEQ ID
NO:36所示的氨基酸序列的HCDR1、包括如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列的HCDR2、包括如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列的HCDR3、包括如SEQ ID NO:
39所示的氨基酸序列的LCDR1、包括如NAK所示的氨基酸序列的LCDR2以及包括如SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列的LCDR3；
xi.包括如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的HCDR1、包括如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的HCDR2、包括如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列的HCDR3、包括如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的LCDR1、包括如AAS所示的氨基酸序列的LCDR2、包括如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的LCDR3、包括如SEQ ID
NO:43所示的氨基酸序列的HCDR1、包括如SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列的HCDR2、包括如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列的HCDR3、包括如SEQ ID NO:
46所示的氨基酸序列的LCDR1、包括如NAK所示的氨基酸序列的LCDR2以及包括如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列的LCDR3；
xii.包括如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的HCDR1、包括如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的HCDR2、包括如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列的HCDR3、包括如SEQ IDNO:18所示的氨基酸序列的LCDR1、包括如AAS所示的氨基酸序列的LCDR2、包括如SEQ IDNO:19所示的氨基酸序列的LCDR3、包括如SEQID NO:50所示的氨基酸序列的HCDR1、包括如SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列的HCDR2、包括如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列的HCDR3、包括如SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列的LCDR1、包括如QMS所示的氨基酸序列的LCDR2以及包括如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列的LCDR3；
xiii.包括如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列的HCDR1、包括如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列的HCDR2、包括如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的HCDR3、包括如SEQ IDNO:25所示的氨基酸序列的LCDR1、包括如AAS所示的氨基酸序列的LCDR2、包括如SEQ IDNO:26所示的氨基酸序列的LCDR3、包括如SEQID NO:29所示的氨基酸序列的HCDR1、包括如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的HCDR2、包括如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列的HCDR3、包括如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列的LCDR1、包括如STS所示的氨基酸序列的LCDR2以及包括如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列的LCDR3；
xiv.包括如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列的HCDR1、包括如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列的HCDR2、包括如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的HCDR3、包括如SEQ IDNO:25所示的氨基酸序列的LCDR1、包括如AAS所示的氨基酸序列的LCDR2、包括如SEQ IDNO:26所示的氨基酸序列的LCDR3、包括如SEQID NO:36所示的氨基酸序列的HCDR1、包括如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列的HCDR2、包括如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列的HCDR3、包括如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列的LCDR1、包括如NAK所示的氨基酸序列的LCDR2以及包括如SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列的LCDR3；
xv.包括如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列的HCDR1、包括如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列的HCDR2、包括如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的HCDR3、包括如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列的LCDR1、包括如AAS所示的氨基酸序列的LCDR2、包括如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的LCDR3、包括如SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列的HCDR1、包括如SEQID NO:44所示的氨基酸序列的HCDR2、包括如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列的HCDR3、包括如SEQ ID NO:
46所示的氨基酸序列的LCDR1、包括如NAK所示的氨基酸序列的LCDR2以及包括如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列的LCDR3；或
xvi.包括如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列的HCDR1、包括如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列的HCDR2、包括如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的HCDR3、包括如SEQ IDNO:25所示的氨基酸序列的LCDR1、包括如AAS所示的氨基酸序列的LCDR2、包括如SEQ IDNO:26所示的氨基酸序列的LCDR3、包括如SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列的HCDR1、包括如SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列的HCDR2、包括如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列的HCDR3、包括如SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列的LCDR1、包括如QMS所示的氨基酸序列的LCDR2以及包括如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列的LCDR3。
缀合物
在一些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段进一步包括一个或多个缀合物部分。缀合物部分可以与抗体或其抗原结合片段连接。结合部分是可以与抗体或其抗原结合片段连接的部分。可设想到，多种缀合物部分可以与本文所提供的抗体或其抗原结合片段结合(参见例如“缀合物疫苗(Conjugate Vaccines)”,《对微生物学和免疫学的贡献(Contributions to Microbiology and Immunology)》,J.M.Cruse和R.E.Lewis,Jr.(编辑),纽约Carger出版社(Carger Press,New York),(1989))。这些缀合物部分可以通过共价结合(例如，二硫键)、亲和力结合、嵌入、配位结合、络合、缔合、共混或添加等方法与抗体或其抗原结合片段连接。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合片段可以通过连接子或交联剂与一种或多种缀合物连接。连接子或交联剂包括反应性化学基团，所述反应性化学基团可以与本文所提供的抗体或其抗原结合片段反应。反应性化学基团可以是N-琥珀酰亚胺基酯和N-磺基琥珀酰亚胺基酯。另外，所述连接子包括反应性化学基团，所述反应性化学基团可以是可以与药物反应以形成二硫键的二硫代吡啶基。连接子分子包括例如N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷甲酸酯(SMCC)、N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(参见例如Carlsson等人,《生物化学杂志》,173:723-737(1978))、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)(参见例如美国专利第4,563,304号)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)2-磺基丁酸酯(磺基-SPDB)(参见美国公开第20090274713号)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)(参见例如CAS注册号341498-08-6)、2-亚氨基硫烷或乙酰琥珀酸酐。例如，抗体或细胞结合剂可以用交联试剂修饰，并且因此所得含有游离或受保护的硫醇基团的抗体或细胞结合剂然后与含有二硫化物或硫醇的美登醇(maytansinoid)反应以产生缀合物。缀合物可以通过色谱纯化，包括但不限于HPLC、尺寸排阻、吸附、离子交换和亲和力捕获、透析或正切流过滤。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段可以被工程化以含有表位结合部分之外的可以用于与一个或多个缀合物部分结合的特异性位点。例如，此类位点可以包括一个或多个反应性氨基酸残基，例如半胱氨酸或组氨酸残基，以促进与缀合物部分的共价连接。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段可以间接地或通过另一缀合物部分与缀合物部分连接。例如，本文所提供的抗体或其抗原结合片段可以与生物素缀合，然后与和亲和素缀合的第二缀合物间接缀合。在一些实施方式中，缀合物部分包括清除修饰剂(例如，延长半衰期的聚合物，如PEG)、化学治疗剂、毒素、放射性同位素、镧系元素、可检测标记(例如，发光标记、荧光标记、酶底物标记)、DNA烷基化剂、拓扑异构酶抑制剂、微管蛋白结合剂、纯化部分或其它抗癌药物(例如，toll样受体7(TLR-7)、TLR-8和/或TLR-9的激动剂、siRNA、抗体或其抗原结合片段、肽(如短肽)等)。
“毒素”可以是对细胞有害或可以损伤或杀死细胞的任何药剂。毒素的实例包括但不限于紫杉醇、CC-1065和CC-1065类似物、杜卡霉素(duocarmycin)和杜卡霉素类似物、如卡奇霉素(calicheamicin)等烯二炔类、多拉司他汀(dolastatin)和多拉司他汀类似物(包括澳瑞他汀(auristatin))、托美霉素衍生物(tomaymycin derivative)、来普霉素衍生物(leptomycin derivative)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、柔红霉素、阿霉素、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、马法兰(melphalan)、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥和吗啉代阿霉素、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、MMAE、MMAF、DM1、DM4、长春花碱(vinblastine)、秋水仙碱(colchicine)、阿霉素、柔红霉素、二羧基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracindione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素(mithramycin)、放线菌素D(actinomycin D)、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、***(propranolol)、嘌呤霉素(puromycin)和其类似物、抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪(dacarbazine)、烷化剂(例如，氮芥、塞替派苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、美法仑(melphalan)、卡莫司汀(carmustine)(BSNU)和洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、环磷酰胺、白消安(busulfan)、二溴甘露醇、链脲霉素(streptozotocin)、丝裂霉素C和二氯二胺铂(II)(DDP顺铂)、蒽环霉素(anthracycline)(例如，柔红霉素(以前的道诺霉素(daunomycin)和阿霉素)、抗生素(例如，更生霉素(dactinomycin)(以前的放线菌素)、博来霉素(bleomycin)、光神霉素和氨茴霉素(anthramycin)(AMC))、抗有丝***剂(例如，长春新碱和长春碱)、拓扑异构酶抑制剂和微管蛋白结合剂。
可检测标记的实例可以包括荧光标记(例如，荧光素、罗丹明、丹酰、藻赤素或德克萨斯红)、酶底物标记(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖类氧化酶或β-D-半乳糖苷酶)、放射性同位素(例如，123I、124I、125I、131I、35S、3H、111In、112In、14C、64Cu、67Cu、86Y、88Y、90Y、177Lu、211At、186Re、188Re、153Sm、212Bi和32P、其它镧系元素)、发光标记、发色团部分、地高辛、生物素/亲和素、DNA分子或金以供检测。
在某些实施方式中，缀合物部分可以是帮助增加抗体的半衰期的清除修饰剂。说明性实例包括水溶性聚合物，如PEG、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇/丙二醇的共聚物等。聚合物可以具有任何分子量，并且可以是支化的或未支化的。与抗体连接的聚合物的数量可能会有所不同，并且如果连接多于一种聚合物，则它们可以是相同或不同的分子。
在某些实施方式中，缀合物部分可以是纯化部分，如磁珠。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段用作缀合物的基底。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段与单个肽缀合。信号肽(有时称为信号序列、前导序列或前导肽)可以用于促进本文所提供的抗体或其抗原结合片段的分泌和分离。信号肽通常表征为疏水氨基酸的核心，所述疏水氨基酸通常在一个或多个切割事件中在分泌期间从成熟蛋白质上切割下来。此类信号肽含有加工位点，当成熟蛋白质穿过分泌途径时，所述加工位点允许从成熟蛋白质上切割信号序列。因此，本发明涉及所描述的具有信号序列的多肽以及信号序列已经被蛋白水解切割的多肽(即，切割产物)。在一个实施例中，编码信号序列的核酸序列可以在表达载体中与所关注的蛋白质，如通常不分泌或以其它方式难以分离的蛋白质可操作地连接。信号序列引导蛋白质的分泌，如从表达载体转化到其中的真核宿主，并且信号序列随后或同时被切割。然后可以通过本领域公认的方法容易地从细胞外培养基中纯化蛋白质。可替代地，信号序列可以使用促进纯化的序列与所关注的蛋白质连接，如使用GST结构域。
嵌合抗原受体
在某些实施方式中，本公开提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括本文所提供的抗体或其抗原结合片段、跨膜区以及细胞内信号区。
如本文所使用的，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指将抗原特异性移植到细胞(例如，T细胞，如原初T细胞、中枢记忆T细胞、效应记忆T细胞、调节T细胞，天然杀伤细胞或其任何组合)的工程化受体。CAR也被称为人造细胞受体、嵌合细胞受体或嵌合免疫受体。在一些实施方式中，CAR包括抗原特异性靶向区(例如，如本文所提供的抗体的抗原结合片段)、细胞外区、跨膜区、一个或多个共刺激区以及细胞内信号区。
在一些实施方式中，所述抗原特异性靶向区是scFv。在一些实施方式中，所述跨膜区包括CD3、CD4、CD8或CD28的跨膜区。在一些实施方式中，共刺激区包括CD28、ICOS、CD27、4-1BB、OX40和CD40L的共刺激结构域。在一些实施方式中，所述细胞内信号区选自由以下组成的组：CD3、FcγRI、CD27、CD28、CD137、CD134、MyD88、CD40、CD278、TLR或其组合的细胞内信号区序列。
CAR可以被移植到各种细胞，例如，同种异体细胞、自体细胞或异种细胞。
本文中使用的术语“同种异体细胞”是指源自相同物种的不同个体的任何细胞。
本文中使用的术语“自体细胞”是指源自同一个体的任何细胞，这些细胞随后被重新引入该个体。
本文中使用的术语“异种细胞”是指源自不同物种的不同个体的任何细胞。
在某些实施方式中，CAR被移植到免疫效应细胞，例如，T细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、肿瘤浸润淋巴细胞等。
多核苷酸和重组方法
本公开提供了分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码本文所提供的抗体或其抗原结合片段或编码本文所提供的嵌合抗原受体。如本文所使用的，术语“核酸”或“多核苷酸”是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)和其聚合物。除非另外指出，否则特定多核苷酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列以及明确指出的序列。具体地说，简并密码子取代可以通过生成序列来实现，在所述序列中，一个或多个所选的(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(参见Batzer等人,《核酸研究》19:5081(1991)；Ohtsuka等人,《生物化学杂志》,260:2605-2608(1985)；以及Rossolini等人,《分子与细胞探测(Mol.Cell.Probes)》,8:91-98(1994))。
编码抗体或其抗原结合片段的DNA或本文所提供的嵌合抗原受体使用常规程序(例如通过使用能够与编码抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离和测序。编码DNA也可以通过合成方法获得。
可以使用本领域已知的重组技术将编码本文所提供的抗体或其抗原结合片段和/或本文所提供的嵌合抗原受体的分离的多核苷酸***到载体中以供进一步克隆(DNA的扩增)或表达。许多载体可用。载体组成通常包括但不限于以下中的一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标志物基因、增强子元件、启动子(例如，SV40、CMV、EF-1α)和转录终止序列。
本公开提供了包括本文所提供的分离的多核苷酸的载体。在某些实施方式中，本文所提供的多核苷酸编码抗体或其抗原结合片段或嵌合抗原受体、与核酸序列可操作地连接的至少一种启动子(例如，SV40、CMV、EF-1α)以及至少一种选择标志物。载体的实例包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、***瘤病毒、乳多空病毒(例如，SV40)、λ噬菌体和M13噬菌体、质粒pcDNA3.3、pMD18-T、pOptivec、pCMV、pEGFP、pIRES、pQD-Hyg-Gseu、pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS10、pLexA、pACT2.2、pCMV-SCRIPT.RTM.、pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、PCR 2.1、pEF-1、pFB、pSG5、pXT1、pCDEF3、pSVSPORT、pEF-Bos等。
包括编码本文所提供的抗体或其抗原结合片段或嵌合抗原受体的多核苷酸序列的载体可以被引入到宿主表达***(例如，宿主细胞)进行克隆或基因表达。在某些实施方式中，本文所提供的宿主表达***是微生物、酵母或哺乳动物细胞。在某些实施方式中，所述微生物选自由大肠杆菌和枯草芽孢杆菌组成的组。在某些实施方式中，所述酵母是酵母菌属。在某些实施方式中，所述哺乳动物细胞选自由以下组成的组：COS、CHO-S、CHO-K1、HEK-293和3T3细胞。
用于克隆或表达本文载体中的DNA的合适宿主细胞是上述原核细胞、酵母细胞或高等真核细胞。用于此目的的合适的原核生物包括真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，如埃希氏杆菌属(Escherichia)(例如，大肠杆菌)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)(例如，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium))、沙雷氏菌属(Serratia)(例如，粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans))和志贺氏菌属(Shigella)以及芽孢杆菌属(Bacilli)，如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、假单胞菌属(Pseudomonas)，如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)以及链霉菌属(Streptomyces)。
除了原核生物之外，真核微生物(如丝状真菌或酵母)也是编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通面包酵母是低等真核宿主微生物中最常用的。然而，许多其它属、种和菌株都比较常用且在本文中适用，如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属宿主(Kluyveromyces host)，例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、魏氏克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、克鲁雄酵母(K.waltii)(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏酵母属(yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070)；假丝酵母(Candida)；里氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)；许旺酵母(Schwanniomyces)，如西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；以及丝状真菌(filamentous fungi)，例如脉孢菌(Neurospora)、青霉菌(Penicillium)、弯颈霉(Tolypocladium)和曲霉菌宿主(Aspergillus host)(如钩巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger))。
用于表达本文所提供的糖基化抗体或其抗原结合片段的合适宿主细胞源自多细胞生物体。无脊椎细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已鉴定多种杆状病毒株和变体以及对应的许可性昆虫宿主细胞，所述许可性昆虫宿主细胞来自于如以下等宿主：草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及斑蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedesalbopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)。多种用于转染的病毒株为公众可得，例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体以及家蚕NPV的Bm-5株变体，并且此类病毒都可以根据本发明用作本文的病毒，特别是用于转染草地夜蛾细胞。棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄和烟草的植物细胞培养物也可以用作宿主。
然而，最感兴趣的是脊椎动物细胞，并且脊椎动物细胞在培养物(组织培养物)中的繁殖已成为常规程序。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是由SV40(COS-7，ATCC CRL1651)转化的猴肾CV1系；人胚胎肾系(被亚克隆以在悬浮培养物中生长的293或293细胞，Graham等人,《普通病毒学期刊(J.Gen.Virol.)》36/59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCCCCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO,Urlaub等人,《美国国家科学院院刊》77:4216(1980))；小鼠赛尔托利细胞(TM4，Mather,《生殖生物学(Biol.Reprod.)》23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人***细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人,《纽约科学院年鉴(Annals N.Y.Acad.Sci.)》383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；小鼠前胃癌细胞(MFC)、SNU620细胞和人肝癌系(Hep G2)。在一些实施方式中，宿主细胞是哺乳动物培养的细胞系，如CHO、BHK、NS0、293、MFC、SNU620和其衍生物。
用上述用于抗体产生的表达或克隆载体转化宿主细胞，并将所述宿主细胞在常规营养培养基中培养，所述常规营养培养基被改性成适于诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望的序列的基因。在另一个实施例中，抗体可以通过本领域已知的同源重组产生。在某些实施方式中，宿主细胞能够产生本文所提供的抗体或其抗原结合片段。
本公开还提供了一种表达本文所提供的抗体或其抗原结合片段或嵌合抗原受体的方法，所述方法包括在表达抗体或其抗原结合片段或嵌合抗原受体的条件下培养本文所提供的宿主表达***。用于产生本文所提供的抗体或其抗原结合片段或嵌合抗原受体的宿主表达***可以在多种培养基中培养。可商购获得的培养基如Ham's F10(西格马(Sigma))、最低必需培养基(Minimal Essential Medium，MEM)(西格马)、RPMI-1640(西格马)和杜氏改良伊氏培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)(西格马)适用于培养宿主细胞。另外，在以下中描述的任何培养基都可以用作宿主细胞的培养基：Ham等人,《酶学方法(Meth.Enz.)》58:44(1979)；Barnes等人,《分析生物化学(Anal.Biochem.)》102:255(1980)；美国专利第4,767,704号；第4,657,866号；第4,927,762号第4,560,655号或第5,122,469号；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国再版专利30,985。任何这些培养基都可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCINTM药物)、微量元素(定义为最终浓度通常在微摩尔范围内的无机化合物)和葡萄糖或等效能量源。也可以以本领域技术人员已知的适当浓度包括任何其它必要的补充物。如温度、pH等培养条件是先前与被选定用于表达的宿主细胞一起使用的那些条件，并且对于本领域技术人员而言将是显而易见的。
当使用重组技术时，抗体可以在细胞内、周质间隙中产生，或者直接分泌到培养基中。如果在细胞内产生抗体，那么作为第一步骤，可以例如通过离心或超滤来去除宿主细胞或溶解的片段的微粒状碎片。Carter等人,《生物/技术》10:163-167(1992)描述了一种用于分离分泌到大肠杆菌的周质间隙的抗体的程序。简而言之，将细胞糊在醋酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)的存在下解冻约30分钟。细胞碎片可以通过离心去除。当抗体被分泌到培养基中时，通常首先使用可商购获得的蛋白质浓缩过滤器(例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)对来自此类表达***的上清液进行浓缩。如PMSF等蛋白酶抑制剂可以包括在上述步骤中的任何步骤中以抑制蛋白水解，并且可以包括抗生素以防止外来污染物的生长。
由宿主表达***制备的抗体或其抗原结合片段和/或嵌合抗原受体可以使用例如羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析、DEAE-纤维素离子交换色谱法、硫酸铵沉淀、盐析和亲和色谱法来纯化，其中亲和色谱法是优选的纯化技术。
在某些实施方式中，固定在固相上的蛋白A用于抗体及其抗原结合片段和/或嵌合抗原受体的免疫亲和纯化。蛋白A是否合适作为亲和配体取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc域的种类和同种型。蛋白A可以用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等人,《免疫学方法杂志》62:1-13(1983))。蛋白G被推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等人,《欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)》5:1567 1575(1986))。亲和配体附着的基质最常为琼脂糖，但其它基质也是可用的。与可以用琼脂糖实现的流速和处理时间相比，机械稳定的基质如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯可实现更快的流速和更短的处理时间。在抗体包括CH3结构域的情况下，Bakerbond ABXTM树脂(新泽西州菲利普斯堡马林克罗特贝克有限公司(J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.)可用于纯化。根据待回收的抗体，用于蛋白质纯化的其它技术也是可用的，如在离子交换柱上进行分级、乙醇沉淀、反相HPLC、在二氧化硅上进行色谱法、在肝素SEPHAROSETM上进行色谱法、在阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上进行色谱法、色谱聚焦、SDS-PAGE、以及硫酸铵沉淀。
在任何初步纯化步骤之后，可以使用pH介于约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液使包含所关注抗体和污染物的混合物经受低pH疏水相互作用色谱法，优选地在低盐浓度(例如，约0-0.25M盐)下进行。
组合物
本公开进一步提供了组合物，所述组合物包括本公开提供的抗体或其抗原结合片段或嵌合抗原受体，以及一种或多种载体。
用于本文公开的组合物的载体可以包括例如液体、凝胶或固体载体、水性媒剂、非水性媒剂、抗微生物剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、麻醉剂、悬浮剂/分配剂、多价螯合剂或螯合剂、稀释剂、佐剂、赋形剂或无毒辅助物质、本领域已知的其它组分或其各种组合。
合适的组分可以包括例如抗氧化剂、填料、粘结剂、崩解剂、缓冲剂、防腐剂、润滑剂、调味剂、增稠剂、着色剂、乳化剂或稳定剂，如糖和环糊精。合适的抗氧化剂可以包括例如甲硫氨酸、抗坏血酸、EDTA、硫代硫酸钠、铂、过氧化氢酶、柠檬酸、半胱氨酸、硫代甘油、巯基乙酸、硫代山梨糖醇、丁基化羟基茴香醚(butylated hydroxanisol)、丁基化羟基甲苯和/或没食子酸丙酯。如本文所公开的，在包括本文所提供的抗体或其抗原结合片段和缀合物的组合物中包括一种或多种如甲硫氨酸等抗氧化剂降低了抗体或其抗原结合片段的氧化。这种氧化降低可防止或减少结合亲和力的丧失，从而提高抗体稳定性并最大化保质期。因此，在某些实施方式中，提供了包括如本文公开的一种或多种抗体或其抗原结合片段和一种或多种如甲硫氨酸等抗氧化剂的药物组合物。进一步提供了用于通过将抗体或抗原结合片段与一种或多种如甲硫氨酸等抗氧化剂混合来防止本文所提供的抗体或抗原结合片段的氧化、延长保质期和/或提高功效的方法。
为了进一步说明，载体可以包括例如：水性媒剂，如氯化钠注射液、林格氏注射液(Ringer's injection)、等渗右旋糖注射液、无菌水注射液或右旋糖和乳酸林格氏注射液；非水性媒剂，如植物来源的固定油、棉籽油、玉米油、芝麻油或花生油；细菌抑制或真菌抑制浓度下的抗微生物剂；等渗剂，如氯化钠或右旋糖；缓冲剂，如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂；抗氧化剂，如硫酸氢钠；局部麻醉剂，如盐酸普鲁卡因；悬浮和分散剂，如羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮；乳化剂，如聚山梨醇酯80(TWEEN-80)；多价螯合剂或螯合剂，如EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇四乙酸)；乙醇；聚乙二醇；丙二醇；氢氧化钠；盐酸；柠檬酸或乳酸。可以将用作载体的抗微生物剂添加到多剂量容器中的药物组合物中，所述抗微生物剂包括苯酚或甲酚、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵。合适的赋形剂可以包括例如水、盐水、右旋糖、甘油或乙醇。合适的无毒辅助物质可以包括例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、溶解度增强剂或如乙酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或环糊精等药剂。
组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳液、丸剂、胶囊、片剂、缓释调配物或粉末。口服调配物可以包括标准载体，如医药级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
在某些实施方式中，将组合物调配成可注射组合物。可注射组合物可以以任何常规形式制备，所述常规形式例如液体溶液、悬浮液、乳液或适用于产生液体溶液、悬浮液或乳液的固体形式。注射制剂可以包括准备注射的无菌和/或无热原溶液、准备在使用前与溶剂组合的无菌干燥可溶性产品(如冻干粉末，包括皮下注射片剂)、准备注射的无菌悬浮液、准备在使用前与媒剂组合的无菌干燥的不溶性产品以及无菌和/或无热原乳液。溶液可以是水性的或非水性的。
在某些实施方式中，单位剂量肠胃外制剂被包装在安瓿、小瓶或带有针头的注射器中。正如本领域已知和实践的一样，所有用于肠胃外施用的制剂都应该是无菌且无热原的。
在某些实施方式中，通过将如本文公开的抗体或其抗原结合片段溶解在合适的溶剂中来制备无菌冻干粉末。所述溶剂可以含有赋形剂，所述赋形剂可改善粉末或由粉末制备的重构溶液的稳定性或其它药理学组分。可以使用的赋形剂包括但不限于水、右旋糖、山梨糖醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其它合适的药剂。溶剂可以含有缓冲剂，如柠檬酸盐、磷酸钠或磷酸钾、或本领域技术人员已知的其它此类缓冲剂，在一个实施例中，所述缓冲剂为约中性pH。随后对溶液进行无菌过滤，然后在本领域技术人员已知的标准条件下冻干，从而提供期望的调配物。在一个实施例中，将所得溶液分配到小瓶中以冻干。每个小瓶可以含有单剂量或多剂量的抗体或其抗原结合片段或其组合物。用略微高于每次剂量所需或多次剂量所需的量(例如约10％)过填充小瓶是可接受的，以便促进取样精确和给药精确。可以在适当的条件下(如在约4℃到室温下)储存冻干粉末。
用注射用水将冻干粉末重构，从而提供用于肠胃外施用的调配物。在一个实施例中，为了重构，将无菌和/或无热原水或其它合适的液体载体添加到冻干粉末中。精确的量取决于给予的所选疗法并且可以根据经验确定。
试剂盒
在某些实施方式中，本公开提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括本文所提供的抗体或其抗原结合片段和/或本文所提供的组合物和/或本文所提供的嵌合抗原受体。在某些实施方式中，本公开提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括本文所提供的抗体或其抗原结合片段和/或本文所提供的组合物和/或本文所提供的嵌合抗原受体以及第二药剂。在某些实施方式中，第二药剂选自由以下组成的组：检测剂、化学治疗剂、抗癌药物、放射疗法、免疫治疗剂、抗血管生成剂、靶向疗法、细胞疗法、基因疗法、激素疗法、抗病毒剂、抗生素、镇痛剂、抗氧化剂、金属螯合剂和细胞因子。
在某些实施方式中，本公开提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括本文所提供的抗体或其抗原结合片段和/或嵌合抗原受体和/或组合物，所述试剂盒用于检测样品中的抗PD-L1抗体、抗4-1BB抗体或双特异性PD-L1/4-1BB抗体。在一些实施方式中，所述双特异性PD-L1/4-1BB抗体是ATG-101。
在某些实施方式中，本公开提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括本文所提供的抗体或其抗原结合片段和/或嵌合抗原受体和/或组合物，所述试剂盒用于检测抗PD-L1抗体、抗4-1BB抗体或双特异性PD-L1/4-1BB抗体的抗药抗体(ADA)。
如本文所使用的，“抗药抗体”或“ADA”是指与药物的任何部分特异性结合的抗体。例如，抗药抗体可以是抗体或其片段，所述抗体或其片段可以针对抗体药物的任何区域，例如抗体的可变结构域、恒定结构域或糖结构。此类抗药抗体可以在药物疗法期间作为患者的免疫原性反应出现。ADA可以是任何人免疫球蛋白同种型(例如，IgM、IgE、IgA、IgG、IgD)或IgG亚类(IgG1、2、3和4)之一。ADA包括来自任何动物来源的ADA，包括例如人或非人动物(例如，兽医的)来源。
如将对本领域的技术人员显而易见的是，如果需要，此类试剂盒可以进一步包括各种常规试剂盒组件中的一个或多个，例如具有一种或多种载体的容器、另外的容器等。试剂盒中还可以包括指示待施用的组分的量的说明书(作为***物或作为标签)、施用指南和/或用于混合组分的指南。
方法和用途
本公开还提供了检测样品中抗PD-L1抗体、抗4-1BB抗体或双特异性PD-L1/4-1BB抗体的存在或量的方法，所述方法包括使所述样品与本文所提供的抗体或其抗原结合片段和/或组合物和/或嵌合抗原受体接触以及确定样品中抗PD-L1抗体、抗4-1BB抗体或双特异性PD-L1/4-1BB抗体的存在或量。在一些实施方式中，所述方法是非诊断方法。在一些实施方式中，所述方法用于抗PD-L1抗体、抗4-1BB抗体或双特异性PD-L1/4-1BB抗体的药代动力学测定、抗药测定或中和测定。
本公开还提供了一种减轻通过向受试者施用抗PD-L1抗体、抗4-1BB抗体或双特异性PD-L1/4-1BB抗体引起的副作用的方法，所述方法包括向所述受试者施用本公开的抗体或其抗原结合片段和/或组合物和/或嵌合抗原受体。在一些实施方式中，所述副作用是细胞因子风暴。
“细胞因子风暴”，也称为细胞因子释放综合征(CRS)，是当受试者的免疫***对感染或免疫疗法响应过于强烈时发生的一种病状。在一些实施方式中，细胞因子风暴是通过向受试者施用ATG-101引起的。可以通过检测受试者生物样品中细胞因子的蛋白质水平来监测细胞因子水平。也可以通过检测受试者生物样品中细胞因子的核酸水平来监测细胞因子水平。在一些实施方式中，细胞因子选自由以下组成的组：IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-1Ra、IL-2R、IFN-α、IFN-γ、MIP-1α、ΜΙΡ-1β、MCP-1、TNFα、GM-CSF、G-CSF、CXCL9、CXCL10、CXCR因子、VEGF、RANTES、ΕΟΤΑXΓΝ、EGF、HGF、FGF-β、CD40、CD40L、铁蛋白以及其任何组合。
在一些实施方式中，所述抗PD-L1抗体、所述抗4-1BB抗体或所述双特异性PD-L1/4-1BB抗体施用于所述受试者以预防或治疗与PD-L1和/或4-1BB相关的疾病、病症或病状。在某些实施方式中，受试者是人。
在一些实施方式中，PD-L1和/或4-1BB相关的疾病、病症或病状的特征在于表达或过表达PD-L1和/或4-1BB。
在某些实施方式中，PD-L1和/或4-1BB相关的疾病、病症或病症是癌症。在某些实施方式中，所述癌症是PD-L1和/或4-1BB表达性癌症。如本文所使用的，“PD-L1和/或4-1BB表达性癌症”是指特征在于表达癌细胞(即肿瘤浸润免疫细胞)中的PD-L1和/或4-1BB蛋白或表达癌细胞(即肿瘤浸润免疫细胞)中的PD-L1和/或4-1BB的癌症，其表达水平显著高于正常细胞的预期水平。可以使用各种方法来确定受试者的测试生物样品中PD-L1和/或4-1BB的存在和/或量。例如，测试生物样品可以暴露于抗PD-L1和/或4-1BB抗体或其抗原结合片段，其结合并检测所表达的PD-L1和/或4-1BB蛋白。可替代地，也可以使用如qPCR、逆转录酶PCR、微阵列、SAGE、FISH等方法在核酸表达水平上检测PD-L1和/或4-1BB。在一些实施方式中，测试样品源自癌细胞或组织、或肿瘤浸润免疫细胞。参考样品可以是从健康或非患病个体获得的对照样品，或者是从测试样品所获自的同一个体获得的健康或非患病样品。例如，参考样品可以是与测试样品(例如，肿瘤)相邻或在测试样品附近的非患病样品。在某些实施方式中，所述癌症是实体瘤或血液肿瘤。
在某些实施方式中，PD-L1和/或4-1BB相关的疾病、病症或病状选自由以下组成的组：肺癌(例如，非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)(肺腺癌或肺鳞状细胞癌)、腹膜癌、类癌、骨癌、胰腺癌、原始性神经外胚层瘤、皮肤癌、胆囊癌、头颈癌、鳞状细胞癌、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、***癌、膀胱癌(例如，尿路上皮癌)、肛区癌(例如，***鳞状细胞癌)、胃癌(gastric or stomach cancer)(例如，胃肠癌)、食道癌、结肠癌、乳腺癌、子宫癌、肝癌(例如，肝母细胞癌、肝细胞性肝癌/肝细胞瘤或肝癌)、胆管癌、肉瘤、结直肠癌、输卵管癌、唾液腺癌、子***、子宫内膜癌或子宫癌、骨肉瘤、***癌、***癌、食管癌、小肠癌、内分泌***癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、鼻咽癌、软组织肉瘤、真性红细胞增多、尿道癌、***癌、肾脏或尿道癌(例如，肾脏横纹肌样瘤)、皮肤T细胞淋巴癌、成神经管细胞瘤、肾胚细胞瘤、骨髓增生异常综合征、慢性和非慢性骨髓增殖性病症、脉络丛***状瘤、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经***(CNS)赘生物、软组织肉瘤(例如，横纹肌肉瘤、纤维肉瘤、卡波济氏肉瘤)、脊髓轴肿瘤、胶质瘤(例如，室管膜瘤、星形细胞瘤、间变型星形细胞瘤、少突神经胶质瘤)、眼癌(例如，视网膜母细胞瘤)、脑干胶质瘤或如少突星形细胞瘤等混合胶质瘤、脑瘤(例如，成胶质细胞瘤/多形性成胶质细胞瘤(GBM)、非成胶质细胞瘤脑瘤或脑膜瘤)、黑色素瘤(例如，皮肤或眼内黑色素瘤)、血小板增多、间皮瘤、蕈样肉芽肿、塞扎里综合征、原发性骨髓纤维化、孤立性浆细胞瘤、前庭神经鞘瘤、尤因氏肉瘤、软骨肉瘤、MYH相关息肉病、垂体腺瘤、小儿癌症，如小儿肉瘤(例如，神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤)，血液学癌症、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、白血病(例如，淋巴细胞/成淋巴细胞白血病)、慢性或急性白血病、肥大细胞白血病、淋巴细胞淋巴瘤、原发性CNS淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性髓系白血病(CML)、急性髓系白血病(AML)、慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病(HCL)、伯基特氏淋巴瘤(BL)、多发性骨髓瘤(例如，复发性或难治性多发性骨髓瘤)、T细胞或B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)(例如，复发性或难治性套细胞淋巴瘤)、恶性黑色素瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、由滤泡性淋巴瘤引起的DLBCL、高级B细胞淋巴瘤、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤(FL)和原发性纵隔B细胞淋巴瘤。
在一些实施方式中，受试者已被鉴定为具有表达PD-L1和/或4-1BB的癌细胞或肿瘤浸润免疫细胞，任选地在显著高于通常在非癌细胞上发现的水平下。
在一些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段和/或组合物和/或嵌合抗原受体用于中和抗PD-L1抗体、抗4-1BB抗体或双特异性PD-L1/4-1BB抗体(例如，ATG-101)。
本文所提供的抗体或抗原结合片段的量将取决于本领域已知的各种因素，例如，体重、年龄、既往病史、目前的药物治疗、受试者的健康状况和交叉反应的潜力、过敏、敏感性和不良副作用以及施用途径和疾病发展的程度。本领域技术人员(例如，医师或兽医)可以根据这些和其它情况或要求的指示按比例减少或增加剂量。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或抗原结合片段和/或嵌合受体可以以约0.01mg/kg到约100mg/kg的剂量施用。在某些实施方式中，施用剂量可以在治疗过程中改变。例如，在某些实施方式中，初始施用剂量可以高于随后的施用剂量。在某些实施方式中，施用剂量可以在治疗过程中根据受试者的反应而变化。
可以调整剂量方案以提供最佳的期望应答(例如，治疗应答)。例如，可以施用单一剂量，或者可以随时间的推移施用多个分开的剂量。
本文所提供的抗体或其抗原结合片段和/或嵌合抗原受体可以通过本领域已知的任何途径施用，例如，通过包括皮下注射、腹膜内注射、静脉内注射、肌肉内注射或皮内注射的肠胃外途径施用；或通过非胃肠外途径，包括透皮、口服、鼻内、眼内、舌下、直肠或局部施用。
在一些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段和/或嵌合抗原受体可以单独施用或与治疗有效量的第二药剂组合施用。例如，本文公开的抗体或其抗原结合片段和/或嵌合抗原受体可以与第二药剂组合施用，所述第二药剂是例如检测剂、化疗剂、抗癌药物、放疗剂、免疫疗法药剂、靶向疗法药剂、细胞疗法药剂、基因疗法药剂、激素疗法药剂、抗病毒剂、抗生素、镇痛药、抗氧化剂、金属螯合剂、细胞因子、活性剂、成像剂、细胞毒性剂、血管生成抑制剂、激酶抑制剂、共刺激分子激动剂、共抑制分子阻滞剂、粘附分子阻断剂、抗细胞因子抗体或其功能片段、可检测标记或报道基因、抗菌剂、基因编辑剂、β激动剂、病毒RNA抑制剂、聚合酶抑制剂、干扰素或微小RNA。
如本文所使用的，术语“免疫疗法”是指刺激免疫***对抗如癌症等疾病或以一般方式增强免疫***的疗法类型。免疫疗法的实例包括但不限于检查点调节剂、过继性细胞转移、细胞因子、溶瘤病毒和治疗性疫苗。
“靶向疗法”是作用于与癌症相关的特定分子的疗法类型，所述特定分子如存在于癌细胞中但不存在于正常细胞中或在癌细胞中更丰富的特定蛋白质，或有助于癌症生长和存活的癌症微环境中的靶分子。靶向疗法将治疗剂靶向肿瘤，从而使正常组织免受治疗剂的影响。
在这些实施方式中的某些实施方式中，本文所提供的抗体或其抗原结合片段和/或本文所提供的组合物和/或本文所提供的嵌合抗原受体与一种或多种另外的药剂组合施用，可以与一种或多种另外的治疗剂同时施用，并且在这些实施方式中的某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段和/或本文所提供的组合物和/或本文所提供的嵌合抗原受体以及另外的药剂可以作为相同组合物的一部分施用。然而，抗体或其抗原结合片段和/或本文所提供的组合物和/或本文所提供的嵌合抗原受体与另一种药剂“组合”施用不必与所述药剂同时施用或以与所述药剂相同的组合物施用。在另一种药剂之前或之后施用的抗体或其抗原结合片段、组合物或嵌合抗原受体被认为是与所述药剂“组合”施用，如本文所使用的短语，即使抗体或抗原结合片段、组合物或嵌合抗原受体和第二药剂通过不同途径施用也是如此。在可能的情况下，与本文公开的抗体或其抗原结合片段、组合物或嵌合抗原受体组合施用的另外的药剂根据另外的治疗剂的产品信息表中列出的时间表或根据医生桌上参考手册2003(《医生桌上参考手册(Physicians'Desk Reference)》,第57版；医疗经济学公司(Medical Economics Company)；ISBN:1563634457第57版(2002年11月))或本领域众所周知的方案施用。
另一方面，本公开提供了本文所提供的试剂盒，所述试剂盒包括本文所提供的抗体或其抗原结合片段和/或本文所提供的组合物和/或本文所提供的嵌合抗原受体，任选地与可检测部分缀合，所述试剂盒可用于检测ATG-101。试剂盒可以进一步包括使用说明。
另一方面，本公开还提供了一种本文所提供的抗体或其抗原结合片段和/或本文所提供的组合物和/或本文所提供的嵌合抗原受体在制备试剂盒中的用途，其中所述试剂盒在用于检测抗PD-L1抗体、抗4-1BB抗体或双特异性PD-L1/4-1BB抗体的抗药抗体(ADA)(例如，ATG-101)的方法中使用。
在一些实施方式中，如上文所述的方法、试剂盒或用途中使用的抗体或其抗原结合片段包括第一抗体或其抗原结合片段以及第二抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，所述第一抗体或其抗原结合片段包括：
i.包含在选自由以下组成的组的重链可变(VH)区序列中的任何一个内的一个或两个或三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和/或HCDR3)：SEQ ID NO:6、13、20和27；以及
ii.包含在选自由以下组成的组的轻链可变(VL)区序列中的任何一个内的一个或两个或三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和/或LCDR3)：SEQ ID NO:7、14、21和28。
在一些实施方式中，所述第一抗体或其抗原结合片段包括：
i.HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的LCDR1、包括如NAK所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
ii.HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQID NO:10所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如RAN所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；
iii.HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如AAS所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列；或
iv.HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQID NO:24所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如AAS所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述第二抗体或其抗原结合片段包括：
i.包含在选自由以下组成的组的重链可变(VH)区序列中的任何一个内的一个或两个或三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和/或HCDR3)：SEQ ID NO:34、41、48和55；以及
ii.包含在选自由以下组成的组的轻链可变(VL)区序列中的任何一个内的一个或两个或三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和/或LCDR3)：SEQ ID NO:35、42、49和56。
在一些实施方式中，所述第二抗体或其抗原结合片段包括：
i.HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQID NO:31所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如STS所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列；
ii.HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQID NO:38所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如NAK所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列；
iii.HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如NAK所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列；或
iv.HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1包括如SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列，所述HCDR2包括如SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列，所述HCDR3包括如SEQID NO:52所示的氨基酸序列，所述LCDR1包括如SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列，所述LCDR2包括如QMS所示的氨基酸序列，所述LCDR3包括如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，如上文所描述的方法、试剂盒或用途中使用的所述样品选自由以下组成的组：组织切片、活检、石蜡包埋组织、体液、结肠流出物、手术切除样品、分离的血细胞、从血液中分离的细胞以及其任何组合。在一些实施方式中，所述体液选自由以下组成的组：全血、血清、血浆、尿液、粘液、唾液、腹膜液、胸膜液、胸液、滑液、脑脊液、胸腔积液、腹腔积液以及其任何组合。
在一些实施方式中，在如上文所述的方法、试剂盒或用途中使用的双特异性PD-L1/4-1BB抗体为ATG-101。
提供以下实施例以更好地说明所要求保护的发明并且不应将所述实施例解释为限制本发明的范围。下文描述的所有具体组合物、材料和方法全部或部分地落入本发明的范围内。这些具体组合物、材料和方法不旨在限制本发明，而仅用于说明落入本发明范围内的具体实施例。本领域技术人员可以在不运用发明能力和不脱离本发明范围的情况下开发出等效的组合物、材料和方法。将理解，可以在本文描述的程序中做出许多变化，同时仍然保持在本发明的界限内。本发明的发明人的意图是此类变化都包括在本发明的范围内。
实施例
实施例1.抗体产生
1.1免疫
为了产生针对ATG-101的PD-L1结合部分和4-1BB结合部分的抗体，用两种免疫原性肽免疫SJL小鼠：YN-035(在WO2019196309A1中描述，该专利申请的全部内容通过引用并入本文)的F(ab’)2和靶向4-1BB的scFV-Fc。YN-035的F(ab’)2是通过亲本抗体YN-035的胃蛋白酶消化产生的，所述亲本抗体提供了ATG-101的PD-L1结合部分(胃蛋白酶:YN-035比率为1:4，在37℃过夜反应)，并且通过将ATG-101的4-1BB结合部分(即4-1BB特异性scFv结构域)与人IgG1 Fc的N末端连接来产生靶向4-1BB的scFv-Fc。初次免疫随后进行若干次增强免疫，直到动物产生适合于杂交瘤开发的令人满意的抗血清效价。Gerbu MM被用作免疫佐剂。下表5中示出了动物的分组。下表6中示出了两组动物的免疫方案。
表5.动物分组
组 免疫原 途径 动物/品系 组大小 剂量
1 靶向PD-L1的YN-035的F(ab’)2 跗关节 SJL 5/5 每只小鼠10μg
2 靶向4-1BB的scFv-Fc 跗关节 SJL 5/5 每只小鼠10μg
表6.第1组和第2组的免疫方案
1.2杂交瘤产生和筛选
通过将骨髓瘤与小鼠的脾细胞融合来产生杂交瘤，其中这些小鼠是通过针对ATG-101的PD-L1结合部分或4-1BB结合部分进行测试采血ELISA评估的，测定为免疫反应最佳的小鼠。使用优化的电融合方案，将来自脾脏和***的淋巴细胞与Sp2/0-Ag14细胞系融合。进行了多次融合，以确保项目的成功。
将融合细胞接种(每孔1×104到105个细胞)到一堆96孔板中。监测板中细胞的生长情况并每周进料一次。在10-14天内具有细胞生长的孔将被ELISA实验经过初级筛选而挑出来。对于第1组，将来自初级筛选的对与YN-035的F(ab’)2的结合呈阳性并且对人IgG1呈阴性的阳性亲本克隆扩增到24孔板中，并进行次级筛选。对于第2组，将来自初级筛选的对与靶向4-1BB的scFv-Fc的结合呈阳性并且对人IgG1呈阴性的阳性亲本克隆扩增到24孔板中，并进行次级筛选。
在初级筛选后进行次级筛选，再次通过ELISA筛选扩增到24孔板中的阳性亲本克隆。对于第1组，选择对与YN-035的F(ab’)2、ATG-101的结合呈阳性并且对人IgG1呈阴性的阳性亲本克隆以进行亚克隆。对于第2组，选择对与靶向41BB的scFv-Fc、ATG-101的结合呈阳性并且对人IgG1呈阴性的阳性亲本克隆以进行亚克隆。还对两组进行了竞争性ELISA，以评估由杂交瘤候选物产生的抗体对于抑制ATG-101结合PD-L1或4-1BB的阻断能力，其中包括竞争性克隆和非竞争性克隆两者。
然后通过多轮限制稀释或单细胞分选对具有所期望反应性和来自上述筛选漏斗的同种型的亲本杂交瘤进行亚克隆，直到获得单克隆为止。
如在次级筛选中所述的，通过ELISA筛选亚克隆板中的细胞，并且将具有良好结合能力的亚克隆扩增到24孔以进行确认测试。
对所期望的亚克隆细胞系进行测序，并且使其进一步扩增到培养瓶中以进行冷冻保存。最初以0.5-1.0×107个细胞/小瓶冷冻保存每个细胞系4-6个小瓶。如果需要，为选定的最有价值的细胞系建立了主细胞库和工作细胞库。
结果发现了8种具有独特序列的抗体，其与YN-035(PD-L1)和ATG-101的结合呈阳性，或与靶向4-1BB的scFv-Fc和ATG-101的结合呈阳性，并且对人IgG1呈阴性结合(如下表7A和7B所示)，表明这些抗体特异性识别ATG-101的抗原靶向区。
表7A.所选抗体对ATG-101的结合亲和力以及对ATG-101结合PD-L1的竞争能力(OD450值)
表7B.所选抗体对ATG-101的结合亲和力以及对ATG-101结合4-1BB的竞争能力(OD450值)
实施例2.抗体表征
2.1抗体
对杂交瘤抗体克隆10F10G7、9D6E11、27E8A8、31B6G8、50D6E10、58H6F8、63C9C12和75H9F7进行表征，并且通过以下方法鉴定其序列。
2.2杂交瘤测序
按照RNAiso Plus(TAKARA目录号9109)的技术手册从杂交瘤细胞中分离出总RNA。然后按照PrimeScript II第1链cDNA合成试剂盒(TAKARA目录号6210A)的技术手册，使用同种型特异性反义引物或通用引物将总RNA逆转录为cDNA。根据TaKaRa TaqTM(目录号R001A)扩增VH和VL的抗体片段。将经扩增的抗体片段单独克隆到标准克隆载体中。进行菌落PCR以筛选具有正确大小的***物的克隆。对每个片段的不少于五个具有正确大小的***物的菌落进行测序。对不同克隆的序列进行比对，并提供这些克隆的共有序列。
上表4中提供了杂交瘤抗体的可变区序列。
2.3 ELISA结合亲和力
通过ELISA测定抗体与ATG-101的结合亲和力。
·用100μl/孔的1μg/ml抗原(ATG-101，全人IgG)包被细胞培养板，并在37℃下密封孵育2小时。
·用分液器将板洗涤3次。
·在37℃下将板与每孔300μl封闭缓冲液孵育2小时。
·抗体通过连续稀释法进行滴定测量，被滴定的抗体将被用于孵育。通过使用缓冲液进行稀释以达到最终浓缩来制备溶液：连续进行10倍稀释，从100nM(以8点进行)，使用100μl/孔溶液在37℃下孵育持续1小时。
·用分液器将板洗涤3次。加入二抗(100μl/孔，在1:10000稀释度下的抗小鼠IgG-HRP)并在37℃下孵育0.5小时。
·用分液器将板洗涤6次。加入100μl/孔TMB工作溶液(通过以1:1的比率混合溶液A和B制备)并在37℃下孵育15分钟。通过加入50μl/孔1N HCl来终止反应。
·通过酶标仪在450nm波长处读取每个孔的吸光度。通过GraphPad Prism分析数据并作图。
图1A到1F中示出了结果。如图1A到1F所示，所选抗体克隆10F10G7、9D6E11、27E8A8、31B6G8、50D6E10、58H6F8、63C9C12和75H9F7与ATG-101特异性结合，但没有与阴性对照小鼠的IgG1结合。
2.4抗体竞争能力表征
通过ELISA确定了针对ATG-101与对应抗原的抗体竞争能力。
·细胞培养板用100μL/孔抗原(1μg/mL PD-L1或4-1BB)进行包被，并在4℃下孵育过夜。
·用PBST缓冲液洗涤板3次。
·在37℃下用含1％BSA的PBST缓冲液培养板对封闭2小时。
·用PBST缓冲液洗涤板3次。
·加入100μL/孔初级抗体(ATG-101 0.2nM)和测试抗体(100nm，1:10连续稀释，8个稀释梯度)，并在37℃下孵育1.5小时。
·用PBST缓冲液洗涤板3次。
·加入100μL/孔二抗(抗人IgG-HRP)并在37℃下孵育1小时。
·通过PBST缓冲液洗涤板5次，并且然后加入100μL/孔TMB并孵育10分钟。
·用50μL/孔1N HCl终止反应。
·用酶标仪(Molecular device spectra max plus384)在450nm波长处读取吸光度。
图2、下表8A和表8B中示出了结果。如图2、表8A和表8B所示，所选抗体克隆10F10G7、9D6E11、27E8A8和31B6G8显示了对ATG-101结合人PD-L1蛋白的不同竞争能力；并且所选抗体克隆50D6E10、58H6F8、63C9C12和75H9F7显示了对ATG-101结合人4-1BB蛋白的不同竞争能力。
表8A.所选抗体对ATG-101的结合亲和力以及对ATG-101结合PD-L1的竞争能力
/>
表8B.所选抗体对ATG-101的结合亲和力以及对ATG-101结合4-1BB的竞争能力
/>

Claims (39)

1.一种抗PD-L1/4-1BB双特异性抗体的抗药抗体，包括：
i.重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述LCDR2的氨基酸序列如NAK所示，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；
ii.重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，所述LCDR2的氨基酸序列如RAN所示，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；
iii.重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:16所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQID NO:18所示，所述LCDR2的氨基酸序列如AAS所示，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示；
iv.重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示，所述LCDR2的氨基酸序列如AAS所示，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示；
v.重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示，所述LCDR2的氨基酸序列如STS所示，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示；
vi.重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示，所述LCDR2的氨基酸序列如NAK所示，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:40所示；
vii.重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:44所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQID NO:46所示，所述LCDR2的氨基酸序列如NAK所示，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:47所示；或
viii.重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:50所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO:51所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:52所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQID NO:53所示，所述LCDR2的氨基酸序列如QMS所示，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:54所示。
2.根据权利要求1所述的抗药抗体，包括重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区氨基酸序列对，所述氨基酸序列对选自由以下组成的组：SEQ ID NO:6和7、13和14、20和21、27和28、34和35、41和42、48和49、以及55和56。
3.根据权利要求1或2所述的抗药抗体，其能够与ATG-101的PD-L1结合部分和/或4-1BB结合部分特异性结合；或与ATG-101竞争结合PD-L1和/或4-1BB。
4.根据权利要求1或2所述的抗药抗体，其是嵌合抗体或人源化抗体。
5.根据权利要求1或2所述的抗药抗体，其是标记的抗体、二价抗体、抗独特型抗体或融合蛋白。
6.根据权利要求1或2所述的抗药抗体，其是Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、或单链抗体分子(scFv)。
7.根据权利要求1或2所述的抗药抗体，进一步包括Fc区。
8.根据权利要求7所述的抗药抗体，进一步包括人IgG的Fc区。
9.根据权利要求8所述的抗药抗体，其中所述Fc区源自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
10.根据权利要求9所述的抗药抗体，其中所述Fc区包括选自由SEQ ID NO:75-78组成的组的氨基酸序列。
11.根据权利要求1或2所述的抗药抗体，其中所述轻链是λ轻链或κ轻链。
12.根据权利要求1所述的抗药抗体，是双特异性或多特异性抗体。
13.根据权利要求12所述的抗药抗体，能够与ATG-101的PD-L1结合部分和4-1BB结合部分特异性结合。
14.根据权利要求13所述的抗药抗体，包括：
i.如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的HCDR1、如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的HCDR2、如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的HCDR3、如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的LCDR1、如NAK所示的氨基酸序列的LCDR2和如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的LCDR3；以及如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列的HCDR1、如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的HCDR2、如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列的HCDR3、如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列的LCDR1、如STS所示的氨基酸序列的LCDR2和如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列的LCDR3；
ii.如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的HCDR1、如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的HCDR2、如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的HCDR3、如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的LCDR1、如NAK所示的氨基酸序列的LCDR2和如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的LCDR3；以及如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列的HCDR1、如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列的HCDR2、如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列的HCDR3、如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列的LCDR1、如NAK所示的氨基酸序列的LCDR2和如SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列的LCDR3；
iii.如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的HCDR1、如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的HCDR2、如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的HCDR3、如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的LCDR1、如NAK所示的氨基酸序列的LCDR2和如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的LCDR3；以及如SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列的HCDR1、如SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列的HCDR2、如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列的HCDR3、如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列的LCDR1、如NAK所示的氨基酸序列的LCDR2和如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列的LCDR3；
iv.如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的HCDR1、如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的HCDR2、如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的HCDR3、如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的LCDR1、如NAK所示的氨基酸序列的LCDR2和如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的LCDR3；以及如SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列的HCDR1、如SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列的HCDR2、如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列的HCDR3、如SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列的LCDR1、如QMS所示的氨基酸序列的LCDR2和如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列的LCDR3；
v.如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的HCDR1、如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的HCDR2、如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的HCDR3、如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的LCDR1如RAN所示的氨基酸序列的LCDR2和如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的LCDR3；以及如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列的HCDR1、如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的HCDR2、如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列的HCDR3、如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列的LCDR1、如STS所示的氨基酸序列的LCDR2和如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列的LCDR3；
vi.如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的HCDR1、如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的HCDR2、如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的HCDR3、如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的LCDR1、如RAN所示的氨基酸序列的LCDR2和如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的LCDR3；以及如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列的HCDR1、如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列的HCDR2、如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列的HCDR3、如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列的LCDR1、如NAK所示的氨基酸序列的LCDR2和如SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列的LCDR3；
vii.如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的HCDR1、如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的HCDR2、如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的HCDR3、如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的LCDR1、如RAN所示的氨基酸序列的LCDR2和如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的LCDR3；以及如SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列的HCDR1、如SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列的HCDR2、如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列的HCDR3、如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列的LCDR1、如NAK所示的氨基酸序列的LCDR2和如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列的LCDR3；
viii.如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的HCDR1、如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的HCDR2、如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的HCDR3、如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的LCDR1、如RAN所示的氨基酸序列的LCDR2和如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的LCDR3；以及如SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列的HCDR1、如SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列的HCDR2、如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列的HCDR3、如SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列的LCDR1、如QMS所示的氨基酸序列的LCDR2和如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列的LCDR3；
ix.如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的HCDR1、如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的HCDR2、如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列的HCDR3、如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的LCDR1、如AAS所示的氨基酸序列的LCDR2和如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的LCDR3；以及如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列的HCDR1、如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的HCDR2、如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列的HCDR3、如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列的LCDR1、如STS所示的氨基酸序列的LCDR2和如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列的LCDR3；
x.如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的HCDR1、如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的HCDR2、如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列的HCDR3、如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的LCDR1、如AAS所示的氨基酸序列的LCDR2和如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的LCDR3；以及如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列的HCDR1、如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列的HCDR2、如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列的HCDR3、如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列的LCDR1、如NAK所示的氨基酸序列的LCDR2和如SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列的LCDR3；
xi.如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的HCDR1、如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的HCDR2、如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列的HCDR3、如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的LCDR1、如AAS所示的氨基酸序列的LCDR2和如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的LCDR3；以及如SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列的HCDR1、如SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列的HCDR2、如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列的HCDR3、如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列的LCDR1、如NAK所示的氨基酸序列的LCDR2和如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列的LCDR3；
xii.如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的HCDR1、如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的HCDR2、如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列的HCDR3、如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的LCDR1、如AAS所示的氨基酸序列的LCDR2和如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的LCDR3；以及如SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列的HCDR1、如SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列的HCDR2、如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列的HCDR3、如SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列的LCDR1、如QMS所示的氨基酸序列的LCDR2和如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列的LCDR3；
xiii.如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列的HCDR1、如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列的HCDR2、如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的HCDR3、如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列的LCDR1、如AAS所示的氨基酸序列的LCDR2和如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的LCDR3；以及如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列的HCDR1、如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的HCDR2、如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列的HCDR3、如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列的LCDR1、如STS所示的氨基酸序列的LCDR2和如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列的LCDR3；
xiv.如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列的HCDR1、如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列的HCDR2、如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的HCDR3、如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列的LCDR1、如AAS所示的氨基酸序列的LCDR2和如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的LCDR3；以及如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列的HCDR1、如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列的HCDR2、如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列的HCDR3、如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列的LCDR1、如NAK所示的氨基酸序列的LCDR2和如SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列的LCDR3；
xv.如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列的HCDR1、如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列的HCDR2、如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的HCDR3、如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列的LCDR1、如AAS所示的氨基酸序列的LCDR2和如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的LCDR3；以及如SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列的HCDR1、如SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列的HCDR2、如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列的HCDR3、如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列的LCDR1、如NAK所示的氨基酸序列的LCDR2和如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列的LCDR3；或
xvi.如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列的HCDR1、如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列的HCDR2、如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的HCDR3、如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列的LCDR1、如AAS所示的氨基酸序列的LCDR2和如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的LCDR3；以及如SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列的HCDR1、如SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列的HCDR2、如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列的HCDR3、如SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列的LCDR1、如QMS所示的氨基酸序列的LCDR2和如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列的LCDR3。
15.根据权利要求1、2或12到14中任一项所述的抗药抗体，与一个或多个缀合物部分连接。
16.根据权利要求15所述的抗药抗体，其中所述缀合物部分包含清除改性剂、毒素、放射性同位素、DNA烷基化剂、拓扑异构酶抑制剂、微管蛋白结合剂或其它抗癌药物。
17.根据权利要求15所述的抗药抗体，其中所述缀合物部分直接或通过连接子共价连接。
18.一种嵌合抗原受体，其包括根据权利要求1到14中任一项所述的抗药抗体、跨膜区以及细胞内信号区。
19.根据权利要求18所述的嵌合抗原受体，其中所述跨膜区包括CD3、CD4、CD8或CD28的跨膜区。
20.根据权利要求18所述的嵌合抗原受体，其中所述细胞内信号区选自由以下组成的组：CD3、FcγRI、CD27、CD28、CD137、CD134、MyD88、CD40、CD278、TLR或其组合的细胞内信号区序列。
21.根据权利要求18到20中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述抗药抗体是scFv。
22.根据权利要求18到20中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体被移植到同种异体细胞、自体细胞或异种细胞。
23.根据权利要求18到20中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体被移植到免疫效应细胞。
24.根据权利要求18到20中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体被移植到T细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞或肿瘤浸润淋巴细胞。
25.一种组合物，其包含根据权利要求1到17中任一项所述的抗药抗体或者根据权利要求18到24中任一项所述的嵌合抗原受体，以及一种或多种载体。
26.一种分离的多核苷酸，其编码根据权利要求1到14中任一项所述的抗药抗体和/或根据权利要求18到24中任一项所述的嵌合抗原受体。
27.一种载体，其包含根据权利要求26所述的分离的多核苷酸。
28.一种宿主表达***，其包含根据权利要求27所述的载体，或具有整合到其基因组中的根据权利要求27所述的多核苷酸。
29.根据权利要求28所述的宿主表达***，其是微生物、酵母或哺乳动物细胞，其中所述微生物选自由大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)组成的组；并且其中所述哺乳动物细胞选自由以下组成的组：COS、CHO-S、CHO-K1、HEK-293和3T3细胞。
30.一种病毒，其包含根据权利要求27所述的载体。
31.一种表达根据权利要求1到14中任一项所述的抗药抗体或根据权利要求18到24中任一项所述的嵌合抗原受体的方法，所述方法包括在表达根据权利要求1到14中任一项所述的抗药抗体或根据权利要求18到24中任一项所述的嵌合抗原受体的条件下，培养根据权利要求28所述的宿主表达***。
32.一种用于非诊断目的检测样品中抗PD-L1抗体、抗4-1BB抗体或双特异性PD-L1/4-1BB抗体的存在或量的方法，所述方法包括使所述样品与根据权利要求1到17中任一项所述的抗药抗体、和/或根据权利要求18到24中任一项所述的嵌合抗原受体、和/或根据权利要求25所述的组合物接触以及确定所述样品中抗PD-L1抗体、抗4-1BB抗体或双特异性PD-L1/4-1BB抗体的存在或量。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述方法用于抗PD-L1抗体、抗4-1BB抗体或双特异性PD-L1/4-1BB抗体的药代动力学测定、抗药测定或中和测定。
34.一种试剂盒，其包含根据权利要求1到17中任一项所述的抗药抗体、和/或根据权利要求18到24中任一项所述的嵌合抗原受体、和/或根据权利要求25所述的组合物。
35.一种根据权利要求1到17中任一项所述的抗药抗体、和/或根据权利要求18至24中任一项所述的嵌合抗原受体、和/或根据权利要求25所述的组合物在制备试剂盒中的用途，其中所述试剂盒在用于检测抗PD-L1抗体、抗4-1BB抗体或双特异性PD-L1/4-1BB抗体的抗药抗体(ADA)的方法中使用。
36.根据权利要求32或33所述的方法，其中所述样品选自由以下组成的组：石蜡包埋组织、体液、分离的血细胞以及其任何组合。
37.根据权利要求36所述的方法，其中根据权利要求1到17中任一项所述的抗药抗体包括第一抗体以及第二抗体，其中所述第一抗体包括：
i.重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述LCDR2的氨基酸序列如NAK所示，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；
ii.重链互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3，以及轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，所述LCDR2的氨基酸序列如RAN所示，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；
iii.重链互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3，以及轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示，所述LCDR2的氨基酸序列如AAS所示，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示；或
iv.重链互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3，以及轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示，所述LCDR2的氨基酸序列如AAS所示，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示；
其中所述第二抗体包括：
i.重链互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3，以及轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示，所述LCDR2的氨基酸序列如STS所示，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示；
ii.重链互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3，以及轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示，所述LCDR2的氨基酸序列如NAK所示，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:40所示；
iii.重链互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3，以及轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示，所述LCDR2的氨基酸序列如NAK所示，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:47所示；或
iv.重链互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3，以及轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:50所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:51所示，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:52所示，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示，所述LCDR2的氨基酸序列如QMS所示，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:54所示。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述体液选自由以下组成的组：全血、血清、血浆、尿液、粘液、唾液、腹膜液、胸膜液、胸液、滑液、脑脊液、胸腔积液、腹腔积液以及其任何组合。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述双特异性PD-L1/4-1BB抗体是ATG-101。
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