JP6944573B2 - CD3εおよびBCMAに対する二重特異的抗体 - Google Patents
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Description
ヒトB細胞成熟標的(BCMA; TR17_HUMAN、TNFRSF17(UniProt Q02223)としても公知)は、分化した形質細胞で優先的に発現される腫瘍壊死レセプタースーパーファミリーのメンバーである[Laabi et al. 1992; Madry et al. 1998]。BCMAは、非グリコシル化III型膜貫通タンパク質であり、これは、B細胞成熟、増殖および生存に関与する。BCMAは、TNFスーパーファミリーの2つのリガンド:APRIL(増殖誘導リガンド)(BCMAに対する高親和性リガンド)およびB細胞活性化因子BAFF(BCMAに対する低親和性リガンド)(THANK、BlyS、Bリンパ球刺激因子、TALL−1およびzTNF4)に対するレセプターである。APRILおよびBAFFは、構造類似性および重なり合うが別個のレセプター結合特異性を示す。負の調節因子TACIはまた、BAFFおよびAPRILの両方に結合する。BCMAおよび/もしくはTACIへの、APRILおよびBAFFの同等の結合は、転写因子NF−κBを活性化し、生存促進性Bcl−2ファミリーメンバー(例えば、Bcl−2、Bcl−xL、Bcl−w、Mcl−1、A1)の発現およびアポトーシス促進因子(例えば、Bid、Bad、Bik、Bimなど)のダウンレギュレーションを増大させ、従って、アポトーシスを阻害し、生存を促進する。この組み合わされた作用は、B細胞分化、増殖、生存および抗体生成を促進する(Rickert RC et al., Immunol Rev (2011) 244 (1): 115−133において概説されるとおり)。BCMAに対する抗体は、例えば、Gras M−P. et al. Int Immunol. 7 (1995) 1093−1106、WO200124811、およびWO200124812に記載されている。リンパ腫および多発性骨髄腫の処置のための抗BCMA抗体の使用は、例えば、WO2002066516およびWO2010104949で言及されている。
4:2, (2012) 1−16を参照のこと)。可変ドメインVLおよびVHもしくは定常ドメインCLおよびCH1が互いに置き換えられている二重特異的抗体は、WO2009080251およびWO2009080252に記載されている。
JB, Presta LG, Carter P;およびWO1996027011)。ヘテロダイマーのパーセンテージは、ファージディスプレイアプローチおよび上記ヘテロダイマーを安定化させるジスルフィド架橋の導入を使用して、2つのCH3ドメインの相互作用表面を再構築することによってさらに増大させることができた(Merchant A.M, et al, Nature Biotech 16 (1998) 677−681; Aτwell S, Ridgway JB, Wells JA,
Carter P., J MoI Biol 270 (1997) 26−35)。上記ノブが凹みに入り込む技術に関する新たなアプローチは、例えば、EP 1870459A1に記載されている。この様式は、非常に魅力的であるようだが、クリニックに向けた進歩を記載するデータは現在入手できていない。このストラテジーの1つの重大な制約は、2つの親抗体の軽鎖が誤って対合し、不活性分子を形成するのを防止するために同一でなければならないことである。従って、この技法は、第1の標的および第2の標的に対する2種の抗体から出発する、2つの標的に対する組換え二重特異的抗体を容易に開発するために適していない。なぜなら、これらの抗体の重鎖および/もしくは同一の軽鎖のいずれかが最適化されねばならないからである。Xie, Z., et al, J
Immunol Methods 286 (2005) 95−101は、FC部分のためにノブが凹みに入り込む技術と組み合わせてscFvを使用する二重特異的抗体の様式に言及している。WO 2012116927およびWO 2010/145792は、CH1およびCLドメインの交換に言及している。WO 2009/080254は、二重特異的抗体を生成するために凹み内のノブ(knob in hole)構築に言及している。
本発明は、2つの標的ヒトCD3ε(さらに「CD3」とも称される)およびヒトBCMAの細胞外ドメイン(さらに「BCMA」とも称される)に特異的に結合する二重特異的抗体を含み、該抗体は、濃度6.25nMでの該抗体の結合が、140ng/ml マウスAPRILによって10%超は低下せず、好ましくは、APRILなしのヒトBCMAへの該抗体の結合と比較して、ELISAアッセイにおいて450nmのODとして測定して、1%超は低下しないことを特徴とする。好ましくは、上記二重特異的抗体は、濃度50nMでの該抗体の結合が、ELISAアッセイにおいて450nmのODとして測定して、APRILなしのヒトBCMAへの該抗体の結合と比較して、140ng/ml
マウスAPRILによって10%超は低下しないことを特徴とする。
i)上記二重特異的抗体は、抗CD3抗体のFabフラグメントがそのN末端において抗BCMA抗体のFabフラグメントのC末端へと化学的に結合した融合タンパク質である、および
ii)上記抗CD3抗体の可変ドメインVLおよびVHもしくは定常ドメインCLおよびCH1が互いに置き換えている、
ことを特徴とする。
Fab BCMA−Fc−Fab CD3−Fab BCMA(二重特異的様式3.1)Fc−Fab CD3−Fab BCMA(二重特異的様式3.2)
Fab CD3−Fab BCMA(二重特異的様式3.3)
Fab CD3− Fab BCMA− Fab BCMA(二重特異的様式3.4)。
a)上記標的のうちの一方に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖を含む;ならびに
b)上記標的のうちの他方に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖を含み、ここで可変ドメインVLおよびVHもしくは定常ドメインCLおよびCH1は、互いに置き換えられる、
ことを特徴とし、そして
c)ヒトBCMAに特異的に結合する上記抗体の結合は、ELISAアッセイにおいて405nmのODとして測定して、APRILなしでのヒトBCMAへの上記抗体の結合と比較して、100ng/ml APRILによって20%超は低下しない、
d)上記抗体は、APRILのみと比較して、APRIL依存性NF−κB活性化を20%超は変化させない、ならびに
e)上記抗体は、上記抗体なしと比較して、APRILなしでのNF−κB活性化を20%超は変化させない、
ことを特徴とする。
a)上記標的のうちの一方に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖を含む;ならびに
b)上記標的のうちの他方に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖を含み、ここで可変ドメインVLおよびVHもしくは定常ドメインCLおよびCH1は、互いに置き換えられる
ことを特徴とし、そして
c)ヒトBCMAに特異的に結合する上記抗体の結合は、ELISAアッセイで405nmのODとして測定して、APRILもしくはBAFFそれぞれなしでのヒトBCMAへの上記抗体の結合と比較して、100ng/ml APRILによって低下しない、および100ng/ml BAFFによって20%超は低下しない、
d)上記抗体は、APRILのみと比較して、APRIL依存性NF−κB活性化を20%超は変化させない、
e)上記抗体は、BAFFのみと比較して、BAFF依存性NF−κB活性化を20%超は変化させない、ならびに
f)上記抗体は、上記抗体なしと比較して、BAFFおよびAPRILなしでのNF−κB活性化を20%超は変化させない、
ことを特徴とする。
好ましくは、ヒトBCMAに特異的に結合する上記抗体部分、好ましくは、そのFabフラグメントは、配列番号44のCDR1H、配列番号54のCDR2H、配列番号64のCDR3H、ならびに配列番号74のCDR1L、配列番号84のCDR2L、配列番号94のCDR3Lを含む(CDR MAB29B11)ことを特徴とする。好ましくは、ヒトBCMAに特異的に結合する上記抗体部分、好ましくは、そのFabフラグメントは、配列番号45のCDR1H、配列番号55のCDR2H、配列番号65のCDR3H、ならびに配列番号75のCDR1L、配列番号85のCDR2L、配列番号95のCDR3Lを含む(CDR MAB29F3)ことを特徴とする。
MABからなることを特徴とする。本発明のさらなる実施形態は、CD3εおよびBCMAに特異的に結合する二重特異的抗体が、上記二重特異的様式3.4の13C2、17A5、83A10、13A4、13D2、14B11、14E1、29B11および29F3からなる群より選択される、CDR MAB CD3およびCDR MABからなることを特徴とする。
好ましくは、ヒトBCMAに特異的に結合する上記抗体部分、好ましくは、そのFabフラグメントは、配列番号25のVHおよび配列番号35のVLを含む(VHVL MAB
29F3)ことを特徴とする。
a)上記二重特異的抗体内で他方の重鎖のCH3ドメインの元の界面に接触する一方の重鎖のCH3ドメインの元の界面内で、1つのアミノ酸残基が、より大きな側鎖体積を有する1つのアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、他方の重鎖のCH3ドメインの界面内の間隙に配置可能である一方の重鎖のCH3ドメインの界面内で突出部を生成するように、一方の重鎖のCH3ドメインが変化する、ならびに
b)上記二重特異的抗体内で第1のCH3ドメインの元の界面に接触する第2のCH3ドメインの元の界面内で、1つのアミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有する1つのアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、第1のCH3ドメインの界面内の突出部が配置可能である第2のCH3ドメインの界面内で間隙を生成するように、他方の重鎖のCH3ドメインが変化する、
ことを特徴とする。
a)宿主細胞を、第1の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含むベクターおよび第2の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含むベクターで形質転換する工程であって、ここで可変ドメインVLおよびVHもしくは定常ドメインCLおよびCH1は、互いに置き換えられる、工程;
b)上記宿主細胞を、上記抗体分子の合成を可能にする条件下で培養する工程;ならびに
c)上記抗体分子を上記培養物から回収する工程、
を包含する。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
2つの標的ヒトCD3εおよびヒトBCMAに特異的に結合する二重特異的抗体であって、該二重特異的抗体は、
a)該標的のうちの一方に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖を含む;および
b)該標的のうちの他方に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖を含み、ここでその可変ドメインVLおよびVHもしくはその定常ドメインCLおよびCH1は、互いに置き換えられる
ことを特徴とし、そして
c)ヒトBCMAに特異的に結合する該抗体の結合は、ELISAアッセイにおいて405nmでのODとして測定して、APRILなしでのヒトBCMAへの該抗体の結合と比較して、100ng/ml APRILによって20%超は低下しない、
d)該抗体は、APRILのみと比較して、APRIL依存性NF−κB活性化を20%超は変化させない、および
e)該抗体は、該抗体なしと比較して、APRILなしのNF−κB活性化を20%超は変化させない、
ことを特徴とする、二重特異的抗体。
(項目2)
項目1に記載の、2つの標的ヒトCD3εおよびヒトBCMAに特異的に結合する二重特異的抗体であって、
a)該標的のうちの一方に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖を含む;および
b)該標的のうちの他方に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖を含み、ここでその可変ドメインVLおよびVHもしくはその定常ドメインCLおよびCH1は、互いに置き換えられる、
ことを特徴とし、そして
c)ヒトBCMAに特異的に結合する該抗体の結合は、ELISAアッセイにおいて405nmでのODとして測定して、APRILもしくはBAFFそれぞれなしでのヒトBCMAへの該抗体の結合と比較して、20%超は、100ng/ml APRILによって低下せず、100ng/ml BAFFによって低下しない、
d)該抗体は、APRILのみと比較して、APRIL依存性NF−κB活性化を20%超は変化させない、
e)該抗体は、BAFFのみと比較して、BAFF依存性NF−κB活性化を20%超は変化させない、および
f)該抗体は、該抗体なしと比較して、BAFFおよびAPRILなしでのNF−κB活性化を20%超は変化させない、
ことを特徴とする、二重特異的抗体。
(項目3)
項目1または2に記載の二重特異的抗体であって、
a)該二重特異的抗体は、抗CD3抗体のFabフラグメントがそのN末端において抗BCMA抗体のFabフラグメントのC末端に化学的に結合された融合タンパク質である、および
b)該抗CD3抗体のうちの可変ドメインVLおよびVHもしくは定常ドメインCLおよびCH1は、互いに置き換えられる、
ことを特徴とする、二重特異的抗体。
(項目4)
2つの標的ヒトCD3εおよびヒトBCMAに特異的に結合する二重特異的抗体であって、
a)該二重特異的抗体は、抗CD3抗体のFabフラグメントがそのN末端において抗BCMA抗体のFabフラグメントのC末端に化学的に結合された融合タンパク質である、および
b)該抗CD3抗体の可変ドメインVLおよびVHもしくは定常ドメインCLおよびCH1は、互いに置き換えられる、
ことを特徴とする、二重特異的抗体。
(項目5)
項目1〜4のいずれか1項に記載の抗体であって、
ヒトCD3εに特異的に結合する該抗体部分は、配列番号1、2および3の重鎖CDRを、それぞれ、該抗CD3ε抗体の重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVH、ならびに配列番号4、5および6の軽鎖CDRを、それぞれ、該抗CD3ε抗体の軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVLを含むことを特徴とする、ことを特徴とする、抗体。
(項目6)
項目1〜5のいずれか1項に記載の抗体であって、
ヒトCD3εに特異的に結合する該抗体部分は、配列番号7および8の可変ドメインを含むことを特徴とする、ことを特徴とする、抗体。
(項目7)
項目1〜6のいずれか1項に記載の抗体であって、
ヒトBCMAに特異的に結合する該抗体部分は、配列番号37〜45、47〜55、および57〜65の重鎖CDRを、それぞれ、重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVHを含むことを特徴とする、ことを特徴とする、抗体。
(項目8)
項目1〜7のいずれか1項に記載の抗体であって、
ヒトBCMAに特異的に結合する該抗体部分は、配列番号67〜75、77〜85、および87〜95の軽鎖CDRをそれぞれ、軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVLを含むことを特徴とする、ことを特徴とする、抗体。
(項目9)
項目1〜8のいずれか1項に記載の抗体であって、
ヒトBCMAに特異的に結合する該抗体部分は、配列番号37〜45、47〜55、および57〜65の重鎖CDRを、それぞれ、重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVH、ならびに配列番号67〜75、77〜85、および87〜95の軽鎖CDRを、それぞれ、軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVLを含むことを特徴とする、ことを特徴とする、抗体。
(項目10)
項目1〜9のいずれか1項に記載の抗体であって、
ヒトBCMAに特異的に結合する該抗体部分の可変ドメインVHは、配列番号17〜25の群から選択されることを特徴とする、抗体。
(項目11)
項目1〜10のいずれか1項に記載の抗体であって、
ヒトBCMAに特異的に結合する該抗体部分の可変ドメインVLは、配列番号27〜35の群から選択されることを特徴とする、抗体。
(項目12)
項目1〜11のいずれか1項に記載の抗体であって、
ヒトBCMAに特異的に結合する該抗体部分の可変ドメインVHは、配列番号17〜25の群から選択され、ヒトBCMAに特異的に結合する該抗体部分の可変ドメインVLは、配列番号27〜35の群から選択される、という点でそれぞれ特徴付けられる、抗体。
(項目13)
項目1〜12のいずれか1項に記載の抗体であって、
一方の重鎖のCH3ドメインおよび他方の重鎖のCH3ドメインは、各々、該抗体のCH3ドメインの間の元の界面を含む界面で接触することを特徴とし;ここで該界面は、前記二重特異的抗体の形成を促進するように変化し、該変化は、
a)該二重特異的抗体内で他方の重鎖のCH3ドメインの元の界面に接触する一方の重鎖のCH3ドメインの元の界面内で、1つのアミノ酸残基が、より大きな側鎖体積を有する1つのアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、他方の重鎖のCH3ドメインの界面内の間隙に配置可能である一方の重鎖のCH3ドメインの界面内での突出部を生成するように、一方の重鎖のCH3ドメインが変化する、および
b)該二重特異的抗体内で第1のCH3ドメインの元の界面に接触する第2のCH3ドメインの元の界面内で、1つのアミノ酸残基がより小さな側鎖体積を有する1つのアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、該第1のCH3ドメインの界面内の突出部がその内部に配置かのうである、該第2のCH3ドメインの界面内の間隙を生成するように、他方の重鎖のCH3ドメインが変化する、
ことを特徴とする、抗体。
(項目14)
両方の重鎖の定常重鎖ドメインCH3のうちの1つは、定常重鎖ドメインCH1によって置き換えられる;および他方の定常重鎖ドメインCH3は、定常軽鎖ドメインCLによって置き換えられる、ことを特徴とする、項目1〜13のいずれか1項に記載の抗体。
(項目15)
項目1または14に記載の二重特異的抗体であって、
a)該二重特異的抗体は、抗CD3抗体のFabフラグメントがそのN末端において抗BCMA抗体のFabフラグメントのC末端に化学的に結合された融合タンパク質である、および
b)該抗CD3抗体の可変ドメインVLおよびVHもしくは定常ドメインCLおよびCH1は、互いに置き換えられる、
二重特異的抗体。
(項目16)
項目1〜15のいずれか1項に記載の二重特異的抗体を調製するための方法であって、該方法は、
a)宿主細胞を、第1の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含むベクターおよび第2の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含むベクターで形質転換する工程であって、ここでその可変ドメインVLおよびVHもしくはその定常ドメインCLおよびCH1は、互いに置き換えられる、工程;
b)該宿主細胞を、該抗体分子の合成を可能にする条件下で培養する工程;および
c)該抗体分子を該培養物から回収する工程、
を包含する、方法。
(項目17)
項目1〜15のいずれか1項に記載の抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含むベクターを含む、宿主細胞。
(項目18)
項目1〜15のいずれか1項に記載の抗体および薬学的に受容可能な賦形剤を含む、薬学的組成物。
(項目19)
医薬としての使用のための、項目1〜15のいずれか1項に記載の抗体または項目8に記載の薬学的組成物。
(項目20)
形質細胞障害の処置における医薬として使用するための、項目1〜15のいずれか1項に記載の抗体または項目8に記載の薬学的組成物。
(項目21)
多発性骨髄腫の処置における医薬として使用するための、項目1〜15のいずれか1項に記載の抗体または項目8に記載の薬学的組成物。
(項目22)
多発性骨髄腫MMもしくはBCMAを発現する他のB細胞障害のような形質細胞障害の処置のための、項目1〜15のいずれか1項に記載の抗体または項目8に記載の薬学的組成物。
用語「BCMA」とは、本明細書で使用される場合、BCMA; TR17_HUMAN, TNFRSF17(UniProt Q02223)としても公知であり、分化した形質細胞で優先的に発現される腫瘍壊死レセプタースーパーファミリーのメンバーであるヒトB細胞成熟標的に関する。BCMAの細胞外ドメインは、UniProtによれば、アミノ酸1〜54(もしくは5〜51)からなる。用語「BCMAに対する抗体、抗BCMA抗体」とは、本明細書で使用される場合、BCMAに特異的に結合する抗体に関する。
2007 (Mol Cancer Ther; 6 (11): 3009−18)に記載されるように生成され得る。
2003 (Biochemistry; 42 (20): 5977−5983)に記載されるように生成され得る。好ましくは、Hisタグ化BAFFが、本発明に従って使用される。好ましくは、上記Hisタグ化BAFFは、BAFF残基82〜285をコードするDNAフラグメントを発現ベクターにクローニングし、N末端Hisタグ、そのあとにトロンビン切断部位を有する融合物を作り、上記ベクターを発現させ、その回収されたタンパク質をトロンビンで切断することによって生成される。
RA, Pflanzer RG (2002). Human Physiology, 4th ed., Thomson Learning)。別個の重鎖は、サイズおよび組成において異なっている;αおよびγは、約450アミノ酸を含む一方で、μおよびεは、約550アミノ酸を有する。各重鎖は、2つの領域、定常領域および可変領域を有する。上記定常領域は、同じアイソタイプの全ての抗体において同一であるが、異なるアイソタイプの抗体においては異なる。重鎖γ、αおよびδは、3つの定常ドメインCH1、CH2、およびCH3(一列に)から構成される定常領域、ならびに付加された可撓性のためにヒンジ領域を有する(Woof J, Burton D Nat Rev
Immunol 4 (2004) 89−99);重鎖μおよびεは、4つの定常ドメインCH1、CH2、CH3、およびCH4から構成される定常領域を有する(Janeway CA, Jr et al (2001). Immunobiology.
5th ed., Garland Publishing)。上記重鎖の可変領域は、種々のB細胞によって生成される抗体において異なるが、単一のB細胞もしくはB細胞クローンによって生成される全ての抗体に関して同じである。各重鎖の可変領域は、約110アミノ酸長であり、単一の抗体ドメインから構成される。
and Cebra, J.J., MoI. Immunol. 16 (1979) 907−917; Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338−344; Thommesen, J.E., et al., MoI. Immunol. 37 (2000) 995−1004; Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178−4184; Hezareh, M., et al., J.
Virol. 75 (2001) 12161−12168; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319−324;およびEP 0 307 434に記載される。このような結合部位は、例えば、L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331およびP329(番号付けは、KabatのEUインデックスに従う(以下を参照のこと))である。サブクラスIgG1、IgG2およびIgG3の抗体は、通常は、補体活性化、C1q結合およびC3活性化を示すのに対して、IgG4は、補体系を活性化せず、C1qを結合せず、そしてC3を活性化しない。好ましくは、上記Fc部分は、ヒトFc部分である。好ましくは、上記Fc部分は、ヒトIgG1Fc部分である。
Sci. USA 81 (1984) 6851−6855;米国特許第5,202,238号および同第5,204,244号を参照のこと。
314 (1985) 268−270を参照のこと。特に好ましいCDRは、キメラ抗体に関して上記に示される標的を認識する配列を表すものに対応する。本発明によって包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、定常領域が本発明に従う特性(特に、C1q結合および/もしくはFcレセプター(FcR)結合に関して)を生じるために、元の抗体のものからさらに改変されているかもしくは変化させられているものである。
Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5
(2001) 368−374)。ヒト抗体はまた、免疫の際に、内因性免疫グロブリン生成の非存在下で、ヒト抗体の全レパートリーもしくは選択物を生成し得るトランスジェニック動物(例えば、マウス)で生成され得る。このような生殖系列変異マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移入は、標的チャレンジの際に、ヒト抗体の生成をもたらす(例えば、Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551−2555; Jakobovits, A., et al., Nature 362 ( 1993) 255−258; Bruggemann, M., et al.,
Year Immunol. 7 (1993) 33−40を参照のこと)。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーで生成され得る(Hoogenboom,
H.R., and Winter, G., J. MoI. Biol. 227
(1992) 381−388; Marks, J.D., et al., J.
MoI. Biol. 222 (1991) 581−597)。Cole et al.およびBoerner et al.の技法はまた、ヒトモノクローナル抗体の調製のために利用可能である(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985);およびBoerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86−95)。本発明に従うキメラ抗体およびヒト化抗体について既に言及されたように、用語「ヒト抗体」はまた、本明細書で使用される場合、本発明に従う特性(特に、C1q結合および/もしくはFcR結合に関して)を例えば「クラススイッチ」、すなわち、Fc部分の変化もしくは変異(例えば、IgG1からIgG4および/もしくはIgG1/IgG4変異へ)によって生成するために、定常領域において改変されているこのような抗体を包含する。
al. Int J Cancer 2002)。T細胞二重特異的結合因子(TCB)は、従来の単一特異的抗体より遙かに低い用量で与えられる。例えば、ブリナツモマブ(blinatumomab)(CD19xCD3)は、急性リンパ性白血病の処置のために5〜15μg/m2/日(すなわち、わずか0.35〜0.105mg/m2/週)、または非ホジキンリンパ腫の処置のために60μg/m2/日の連続静脈内用量で与えられ、これらの用量での血清濃度は、0.5〜4ng/mlの範囲にある(Klinger et al., Blood 2012; Topp et al., J Clin Oncol 2011; Goebeler et al. Ann Oncol 2011)。TCBの低用量は、患者において高い有効性を発揮し得るので、本発明に従う抗体に関しては、皮下投与が可能であり、臨床状況において(好ましくは、0.25〜2.5mg/m2/週の用量範囲において)好ましいと予見される。これらの低い濃度/用量/レセプター占有においてすら、TCBは、かなりの有害事象を引き起こし得る(Klinger et al., Blood 2012)。従って、腫瘍細胞占有/適用範囲を制御することは重要である。高くかつ変動性のレベルの血清APRILおよびBAFFを有する患者(例えば、多発性骨髄腫患者、Moreaux et al. 2004; Blood 103(8): 3148−3157)において、腫瘍細胞に結合したTCBの数、応答する(resp.)腫瘍細胞占有は、APRIL/BAFFによってかなり影響を受け得る。しかし、本発明の上記抗体、腫瘍細胞占有、それぞれ、有効性/安全性を使用することによって、本発明に従う抗体の用量を増大させる必要はない可能性がある。なぜなら、上記抗体は、APRIL/BAFFリガンド競合によって影響を受け得ないからである。本発明に従う抗体の別の利点は、Fc部分の包含に基づき、このことは、***半減期を約12日間へと増大させ、患者によって運ばれるポンプを用いて静脈内におよび連続して与えられる必要があるFc部分なしのTCB(例えば、ブリナツモマブ)と比較すると、1週間に少なくとも1回もしくは2回の投与を可能にする。
ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は、以下に与えられる:Kabat, E. A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)。抗体鎖のアミノ酸は、EU番号付けに従って番号付けされかつ参照される(Edelman, G.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78−85; Kabat, E.A., et al.,
Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991))。
標準的方法は、Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されるようにDNAを操作するために使用した。分子生物学的試薬を、製造業者の指示に従って使用した。ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は、以下に示される: Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., NIH Publication No. 91−3242。
所望の遺伝子セグメントを、化学合成によって作製されたオリゴヌクレオチドから調製する。600〜1800bp長の遺伝子セグメント(これは、単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位が隣接している)を、PCR増幅を含むオリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーションによってアセンブリし、その後、示される制限部位(例えば、KpnI/SadもしくはAscI/PacI)を介してpPCRScript(Stratagene)ベースのpGA4クローニングベクターへとクローニングする。サブクローニングした遺伝子フラグメントのDNA配列を、DNA配列決定によって確認する。遺伝子合成フラグメントを、Geneart(Regensburg, Germany)の所定の仕様に従って注文する。
DNA配列を、二重鎖配列決定法によって決定した。
GCG(Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin)のソフトウェアパッケージバージョン10.2およびInfomaxのVector NTl Advanceスイートバージョン8.0を、配列作製、マッピング、分析、註釈および図解のために使用する。
a)一過性発現(例えば、HEK293 EBNAもしくはHEK293−Fにおいて)のための発現プラスミドの記載される抗体改変体の発現のために、CMV−イントロンAプロモーターでのcDNA組織化もしくはCMVプロモーターでのゲノム組織化のいずれかに基づく細胞を適用する。抗体発現カセットの他に、ベクターは、E.coli中でこのプラスミドの複製を可能にする複製起点、およびE.coliにアンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子を含む。抗体遺伝子の転写ユニットは、以下のエレメントから構成される:
−5’末端における特有の制限部位(複数可)−ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
−続いて、cDNA組織化の場合には、イントロンA配列、
−ヒト抗体遺伝子の5’非翻訳領域、
−免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−cDNAもしくは免疫グロブリンエキソン−イントロン組織化を含むゲノム組織化のいずれかとしてのヒト抗体鎖(野生型もしくはドメイン交換を有する)
−ポリアデニル化シグナル配列を有する3’非翻訳領域、ならびに
−3’末端における特有の制限部位(複数可)。
重鎖および軽鎖のDNA配列の可変領域を、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクターの中に予め挿入されたヒトIgG1定常重鎖もしくはヒト(hum)IgG1定常軽鎖のいずれかとインフレームでサブクローニングした。抗体発現を、CMVエンハンサーおよびMPSVプロモーター、続いて、5’ UTR、イントロンおよびκMARエレメントを含むキメラMPSVプロモーターによって駆動した。転写を、CDSの3’末端において合成ポリAシグナル配列によって終了させる。全てのベクターは、真核生物細胞における分泌のためのタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする5’末端DNA配列を有する。さらに、各ベクターは、EBV EBNA発現細胞におけるエピソームプラスミド複製のためのEBV OriP配列を含む。
標準的な細胞培養技法を、Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J. S., Dasso,
M., Harford, J.B., Lippincott−Schwartz,
J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.に記載されるように使用する。
二重特異的抗体を、以下に記載されるように、接着して増殖するHEK293−EBNA細胞においてもしくは懸濁物中で増殖するHEK293−F細胞において、それぞれの発現プラスミドの一過性の共トランスフェクションによって発現させる。
二重特異的抗体を、接着して増殖するHEK293−EBNA細胞(10% Ultra Low IgG FCS(ウシ胎仔血清, Gibco)、2mM L−グルタミン(Gibco)、および250μg/ml ジェネティシン(Gibco)を補充したDMEM(ダルベッコ改変イーグル培地, Gibco)中で培養したエプスタイン・バーウイルス核標的を発現するヒト胚性腎細胞株293;アメリカンタイプカルチャーコレクション寄託番号ATCC # CRL− 10852, Lot. 959 218)中で、それぞれの発現プラスミド(例えば、重鎖および改変重鎖、ならびにその対応する軽鎖および改変軽鎖ををコードする)の一過性共トランスフェクションによって発現させる。トランスフェクションのために、FuGENETM 6 Transfection Reagent(Roche Molecular Biochemicals)を、FuGENETM試薬(μl) 対 DNA(μg)が4:1(3:1〜6:1の範囲)の比で使用する。
二重特異的抗体を、HEK293−Fシステム(Invitrogen)を使用して、製造業者の指示に従って、それぞれのプラスミド(例えば、重鎖および改変重鎖、ならびにその対応する軽鎖および改変軽鎖をコードする)の一過性トランスフェクションによって生成する。簡潔には、振盪フラスコ中もしくは撹拌発酵器中のいずれかで、無血清FreeStyle 293発現培地(Invitrogen)中、懸濁物中で増殖するHEK293−F細胞(Invitrogen)を、上記4つの発現プラスミドおよび293フェクチン(fectin)もしくはフェクチン(Invitrogen)の混合物でトランスフェクトした。2L 振盪フラスコ(Corning)に関しては、HEK293−F細胞を、600mL中、密度1.0×106細胞/mLで播種し、120rpm, 8% CO2でインキュベートする。その翌日、上記細胞を、細胞密度 約1.5×106細胞/mLにおいて、A)20mL Opti−MEM(Invitrogen)と、重鎖もしくは改変重鎖それぞれおよびその対応する軽鎖を等モル比でコードする600μg 総プラスミドDNA(1μg/mL)、ならびにB)20ml Opti−MEM+1.2mL 293フェクチンもしくはフェクチン(2μl/mL)の約42mL ミックスでトランスフェクトする。グルコース消費に従って、グルコース溶液を、発酵の過程の間に添加する。分泌された抗体を含む上清を、5〜10日後に回収し、抗体は、上記上清から直接精製するか、または上記上清を、凍結および保存するかのいずれかである。
精製された抗体および派生物のタンパク質濃度を、Pace et al., Protein Science, 1995, 4, 2411−1423に従ってアミノ酸配列に基づいて計算したモル吸光係数を使用して、280nmでの光学密度(OD)を決定することによって決定する。
細胞培養上清中の抗体および派生物の濃度を、プロテインAアガロースビーズ(Roche)での免疫沈降によって概算する。60μL プロテインAアガロースビーズを、TBS−NP40(50mM Tris, pH7.5、150mM NaCl、1% Nonidet−P40)中で3回洗浄する。その後、1〜15mL 細胞培養上清を、TBS−NP40で予め平衡化したプロテインAアガロースビーズにアプライする。室温で1時間インキュベートした後、上記ビーズを、0.5mL TBS−NP40で1回、0.5mL 2×リン酸緩衝食塩水(2×PBS, Roche)で2回、および0.5mL 100mM クエン酸Na pH5,0で短時間4回、Ultrafree−MC−フィルターカラム(Amicon]上で洗浄する。結合した抗体を、35μl NuPAGE(登録商標) LDSサンプル緩衝液(Invitrogen)を添加することによって溶離する。そのサンプルの半分を、それぞれ、NuPAGE(登録商標)サンプル還元剤と混合するか、もしくは還元しないままにし、10分間、70℃で加熱する。最終的に、5〜30μlを、4−12% NuPAGE(登録商標) Bis−Tris SDS−PAGE(Invitrogen)にアプライし(非還元SDS−PAGEについてはMOPS緩衝液で、および還元SDS−PAGEについてはNuPAGE(登録商標)抗酸化剤泳動緩衝液添加剤(antioxidant running buffer additive)(Invitrogen)を含むMES緩衝液で)、クーマシーブルーで染色する。
pH7.4中のApplied Biosystems Poros A/20カラムにアプライし、Agilent HPLC 1100システムで200mM NaCl、100mM クエン酸,pH2.5を用いてマトリクスから溶離する。その溶離したタンパク質を、UV吸光度およびピーク面積の積分によって定量する。精製された標準的IgG1抗体は、標準物質として働いた。
タンパク質を、標準プロトコルを参照して、濾過した細胞培養上清から精製する。簡潔には、抗体を、プロテインAセファロースカラム(GE healthcare)にアプライし、PBSで洗浄する。抗体の溶離を、pH2.8で行い、続いて、そのサンプルを直ぐに中和する。凝集したタンパク質を、PBS中もしくは20mM ヒスチジン、150mM NaCl pH6.0中でのサイズ排除クロマトグラフィー(スーパーデックス200, GE Healthcare)によってモノマー抗体から分離する。モノマー抗体画分をプールし、必要な場合には、例えば、MILLIPORE Amicon Ultra(30 MWCO)遠心分離濃縮器を使用して濃縮し、−20℃で凍結および貯蔵する。上記サンプルの一部をその後のタンパク質分析および分析による特徴付け(例えば、SDS−PAGE、サイズ排除クロマトグラフィーもしくは質量分析による)のために提供する。
NuPAGE(登録商標)プレキャストゲルシステム(Invitrogen)を、製造業者の指示に従って使用する。特に、10%もしくは4−12% NuPAGE(登録商標) Novex(登録商標) Bis−TRISプレキャストゲル(pH6.4)およびNuPAGE(登録商標) MES(還元ゲル、NuPAGE(登録商標)抗酸化剤泳動緩衝液添加剤を含む)もしくはMOPS(非還元ゲル)泳動緩衝液を使用する。
抗体の凝集およびオリゴマー状態を決定するためのサイズ排除クロマトグラフィーを、HPLCクロマトグラフィーによって行う。簡潔には、プロテインA精製抗体を、300mM NaCl、50mM KH2PO4/K2HPO4, pH7.5中の、Agilent HPLC 1100システム上のTosoh TSKgel G3000SWカラムに、または2×PBS中の、Dionex HPLC−System上のスーパーデックス200カラム(GE Healthcare)にアプライする。溶離したタンパク質を、UV吸光度およびピーク面積の積分によって定量する。BioRad Gel Filtration Standard 151−1901を、標準物質として働いた。
クロスオーバー抗体の全脱グリコシル化質量を決定し、エレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI−MS)によって確認する。簡潔には、100μgの精製抗体を、100mM KH2PO4/K2HPO4, pH7中、37℃で12〜24時間、タンパク質濃度最大2mg/mlで、50mil N−グリコシダーゼF(PNGaseF, ProZyme)で脱グリコシル化する。その後、セファデックスG25カラム(GE Healthcare)のHPLCによって脱塩する。それぞれの重鎖および軽鎖の質量を、脱グリコシル化および還元後にESI−MSによって決定する。簡潔には、115μl中の50μg 抗体を、60μl IM TCEPおよび50μl 8M グアニジン塩酸塩とともにインキュベートし、その後脱塩する。総質量ならびに還元重鎖および軽鎖の質量を、NanoMate(登録商標)源を装備したQ−Star Elite MSシステムでESI−MSによって検出する。
(実施例1A。抗原およびツール試薬の生成)
(実施例1A1。組換え可溶性ヒトBCMA細胞外ドメイン)
a)組換え可溶性ヒトBCMA細胞外ドメイン(「BCMA ECD」)を、Ryan, 2007(Mol Cancer Ther; 6 (11): 3009−18)に記載されるように生成する。簡潔には、上記ヒトBCMA細胞外ドメイン(ECD;アミノ酸5〜51;NP_001183)を、BamH1部位(太字下線)を組みこんだ順方向プライマー
slide−A−lyzer(Pierce)を使用して、PBS(pH7.4)に対して透析する。GSTタグ除去のために、BCMA:GSTを、グルタチオンセファロースに結合させながら50mmol/L Tris(pH8.0)、0.15mol/L NaCl中のトロンビンで処理する。次いで、放出されたトロンビンは、ベンズアミジンセファロースカラム(GE Healthcare)によって捕捉される。GST切断BCMAは、上記カラムから3〜5CVの50mmol/L Tris(pH8.0)、0.15mol/L NaClで溶離され、PBS(pH7.4)に対して透析される。トロンビン除去を、色素生成性基質S−2238(Chromogenix, DiaPharma)を使用してトロンビン活性に関して画分を分析することによって確認する。タンパク質濃度を、A280によって決定する。全ての精製タンパク質を、SDS−PAGEによって、およびTSK−Gel G3000SW HPLCサイズ排除クロマトグラフィー(Tosoh Bioscience)によって分析する。
Fc部分(凹鎖(hole chain))とのヘテロダイマー化を可能にした。
a)組換え短縮型マウスAPRILを、Ryan, 2007(Mol Cancer
Ther; 6 (11): 3009−18)に記載されるように生成する。簡潔には、マウスAPRIL(残基106〜241; NP_076006)を、IMAGEクローン5290965(Invitrogen)から増幅し、COOH末端において、遺伝子特異的順方向プライマー
組換え短縮型ヒトを、Gordon, 2003(Biochemistry; 42
(20): 5977−5983)に記載されるように生成する。簡潔には、BAFF残基82〜285をコードするDNAフラグメントを、N末端においてHisタグ、および後ろにトロンビン切断部位を含むpBr322ベクターへとクローニングし、N末端Hisタグ、そのあとにトロンビン切断部位を有する融合物を作る。lacUV5プロモーターの制御下にあるT7 RNAポリメラーゼ遺伝子を含むE.coli株を、37℃において、50mg/L カルベニシリンを含むLB培地中で対数期中期まで培養し、次いで、16℃へと冷却し、その後、1.0mM IPTGで誘導する。細胞を、さらなる増殖の12時間後に遠心分離によって回収し、−80℃で保存する。上記細胞ペレットを、50mM Tris, pH8.0、および500mM NaCl中に再懸濁し、氷上で超音波処理する。遠心分離後、その上清を、Ni−NTAアガロースカラム(Qiagen)に載せる。上記カラムを、50mM Tris, pH8.0、500mM NaCl、および20mM イミダゾールで洗浄し、次いで、250mM イミダゾールを有する同じ緩衝液中での段階勾配で溶離する。BAFF含有画分をプールし、トロンビンを添加し、そのサンプルを、20mM Tris, pH8.0、および5mM CaCl2に対して4℃において一晩透析する。タンパク質を、monoQ(Pharmacia)カラムで、最終的に、20mM Tris、150mM NaCl、および5mM MgCl2中のS−200サイズ排除カラムでさらに精製する。
ヒトBCMAを表面に発現する組換え細胞(「HEK293−BCMA細胞」)を、Ryan, 2007(Mol Cancer Ther; 6 (11): 3009−18)に記載されるように生成する。簡潔には、全長ヒトBCMAを、HindIII制限部位(太字下線)およびKozakコンセンサス配列を含む順方向プライマー
a)細胞起源および培養条件。 ヒトMM細胞株NCI−H929を、アメリカンタイプカルチャーコレクションから得る(ATCC CRL−9068)。NCI−H929細胞を、10% ウシ胎仔血清、2mM L−グルタミン、1mM ピルビン酸ナトリウムを補充したRPMI 1640中で増殖させる。U266B1(ATCC TIB−196)ヒトBリンパ球骨髄腫細胞株を、RPMI high Glucose、10% FCS、1% グルタミン、1% ピルビン酸ナトリウム、10mM HEPES中で培養する。RPMI 8226(ATCC CCL−155)、ヒトBリンパ球骨髄腫細胞株を、DMEM、10% FCS、1% グルタミン中で培養する。。MKN45(DSMZ ACC 409)、ヒト胃腺癌細胞株を、10% FCSおよび1% グルタミンを含むDMEM中で培養する。MM細胞株でのBCMA発現を、蛍光色素結合体化抗ヒトBCMA抗体(BD Biosciences)を使用して、フローサイトメトリーによって確認する。
抗BCMA抗体を、Ryan, 2007 (Mol Cancer Ther; 6
(11): 3009−18)に記載されるように、BCMA ECDでのラットの免疫によって生成する。簡潔には、Sprague−Dawleyラットを、TiterMax(登録商標)アジュバント(Sigma)を使用して、キーホールリンペットヘモシアニン結合体化BCMA ECD(アミノ酸5〜54; NP_001183)で皮下免疫する。キーホールリンペットヘモシアニン結合体化を、Imject mcKLHV(Pierce)を使用して、リジン残基で行う。ヒトとマウスとの間のBCMAタンパク質の配列相同性が高いことに起因して、ラットは、抗体生成に好ましい。B細胞を、免疫した脾臓から回収し、標準的なポリエチレングリコール融合プロトコル(Goding 1996; Monoclonal antibodies: principles and practice. 3rd ed. Academic Press)を使用して、P3−X63.Ag8骨髄腫細胞に融合する。ハイブリドーマを、80% イスコフ改変ダルベッコ培地(10% fetal clone I、4mmol/L L−グルタミン、10% クローニングファクターを補充し、ペニシリン、ストレプトマイシンおよび1×ヒポキサンチンナトリウム、アミノプテリン、およびチミジンもまた含む)中で培養する。ELISA試験を行って、BCMAへのハイブリドーマ培養上清の結合を検出する。陽性BCMA結合ハイブリドーマを、BCMAトランスフェクト体(HEK293−BCMA細胞)への細胞ベースの結合についてフローサイトメトリーによってさらにスクリーニングする。選択したハイブリドーマは、2ラウンドの限界希釈クローニングを受け、精製のためのさらに増殖させられる。さらに、これらの同じ選択されたハイブリドーマ由来の抗体を、標準的な方法によってヒト定常領域を有するキメラ抗体へと変換する。簡潔には、重鎖および軽鎖の可変領域をコードするcDNAを、ハイブリドーマ由来のmRNAからRT−PCRによって増幅し、次いで、ヒトIgG1の重鎖定常領域およびヒトκ軽鎖定常領域をそれぞれコードするcDNAとインフレームで結合させる。これらのcDNAを、哺乳動物一過性発現ベクターにクローニングし、プラスミドDNAを、E.coliで生成し、トランスフェクションのために精製する。HEK293細胞を、are 標準的なトランスフェクション法(リン酸カルシウムベースのトランスフェクション)によってトランスフェクトし、7日間後、IgG1抗体を、プロテインAカラム上でのアフィニティークロマトグラフィーによって培養上清から精製し、続いて、モノマー抗体画分をサイズ排除クロマトグラフィーによって単離する。
(実施例1E1。包括的Fabライブラリーの構築)
Fab様式での包括的抗体ライブラリーを、以下のVドメイン対合を使用して、ヒト生殖系列遺伝子に基づいて構築する:DP47−3ライブラリーについてはVk3_20 κ軽鎖とVH3_23 重鎖、およびDP88−3ライブラリーについてはVk1_17κ軽鎖とVH1_69重鎖。両方のライブラリーを、軽鎖のCDR3(L3)および重鎖のCDR3(H3)の中で無作為化し、重複伸長によるスプライシング(SOE)PCR(splicing by overlapping extension (SOE)
PCR)によって1ライブラリーあたり3つのフラグメントからアセンブリする。フラグメント1は、無作為化したL3を含む抗体遺伝子の5’末端を含み、フラグメント2は、L3からH3にわたる中央の定常フラグメントであるのに対して、フラグメント3は、無作為化H3および抗体遺伝子の3’部分を含む。以下のプライマーの組み合わせを、DP47−3ライブラリーについてのライブラリーフラグメントを生成するために使用する:フラグメント1(LMB3−LibL1b_new)、フラグメント2(MS63−MS64)、フラグメント3(Lib2H−fdseqlong)。WO2012020038の表1を参照のこと。以下のプライマーの組み合わせを、DP88−3ライブラリーについてのライブラリーフラグメントを生成するために使用する:フラグメント1(LMB3−RJH_LIB3)、フラグメント2(RJH31−RJH32)およびフラグメント3(LIB88_2−fdseqlong)。WO2012020038の表3および表4を参照のこと。
a)選択を、BCMA−ECD−ビオチンに対して行う。抗原を、発現の際にインビボでビオチン化する。以下のプロトコルに従って、溶液中で選択を行う:(i)0.5時間にわたる総体積1ml中でのライブラリーDP88−3の約1012 ファージミド粒子および100nM BCMA−ECD−ビオチンの結合;(ii)10分間にわたる5.4×107ストレプトアビジン被覆磁性ビーズの添加による、BCMA−ECD−ビオチンおよび結合したファージの捕捉;(iii)5×1ml PBS/Tween(登録商標)20および5×1ml PBSを使用してのビーズの洗浄;(iv)10分間にわたる1mL 100mM TEA(トリエチルアミン)の添加によるファージ粒子の溶離および500μL 1M Tris/HCl pH7.4の添加による中和;ならびに(v)対数期のE.coli TG1細胞(Zymo Research)の再感染、ヘルパーファージVCSM13(Stratagene)での感染およびその後の選択ラウンドで使用される予定のその後のファージミド粒子のPEG/NaCl沈殿。
a)固定化BCMAへのBCMA抗体の結合親和性を測定するために、Biacore(登録商標)3000機器(Pharmacia Biosensor)で表面プラズモン共鳴測定を行う。レセプターBCMA(BCMA−ECD)を、製造業者によって提供されるアミンカップリングプロトコルを使用して、400共鳴単位のレベルでセンサチップにカップリングする。代替のBCMA−ECD−ビオチンを、これもまた400共鳴単位のレベルで、製造業者によって提供される上記プロトコルを使用して、ストレプトアビジン−センサチップにカップリングする。全ての実験において、フローセル1を、参照セルとして使用する。センサグラムを、濃度0.1pM〜200nMの範囲に及ぶFab溶液について記録する。非線形回帰分析を使用して、製造業者のソフトウェアを使用して動力学定数および結合定数を同時に計算する。≦100nMのBCMA−ECDへの一価の結合親和性を有するFabクローンを、標準的な方法によってIgGに変換する。簡潔には、重鎖および軽鎖の可変領域をコードするcDNAを、ヒトIgG1の重鎖定常領域およびヒトκ軽鎖定常領域をそれぞれコードするcDNAとインフレームで結合する。これらのcDNAを、哺乳動物一過性発現ベクターへとクローニングし、プラスミドDNAを、E.coliにおいて生成し、トランスフェクションのために精製する。HEK293細胞を、標準的なトランスフェクション法(リン酸カルシウムベースのトランスフェクション)によってトランスフェクトし、7日後に、IgG1抗体を、プロテインAカラム上でのアフィニティークロマトグラフィーによって培養上清から精製し、続いて、モノマー抗体画分をサイズ排除クロマトグラフィーによって単離する。
pH1.5を使用して水平配向で再生を行った。
EDTA、0.005% Surfactant P20、Biacore, Freiburg/Germany)を用い、Biacore T200において行った。抗BCMA抗体と組換えBCMA Fc(kih)(ヒト、カニクイザルおよびマウス)との間の相互作用のアビディティを決定した。ビオチン化組換えヒト、カニクイザルおよびマウスBCMA Fc(kih)を、指示(Biacore, Freiburg/Germany)に従ってSAチップに直接カップリングした。固定化レベルは、200〜700 RUの範囲に及んだ。上記抗BCMA抗体を、2倍濃度範囲(1.95〜500nM)において、流速30μL/分で、120秒間にわたってフローセルに通過させた。180秒間、解離をモニターした。バルク屈折率差を、参照フローセルで得られる応答を差し引くことによって、較正した。ここで、上記抗BCMA抗体を、標準的なアミンカップリングキットに記載されるように予め活性化し、脱活性化した空の表面に流した。みかけの動力学的定数を、Biacore T200 Evaluation Software(vAA, Biacore AB, Uppsala/Sweden)を使用して導出して、比較目的の相互作用が二価であるが、数値積分によって1:1 Langmuir型結合の速度式を適合させた。
Langmuir型結合の速度式を適合させた(表5)。組換えカニクイザルBCMA
Fc(kih)およびマウスBCMA Fc(kih)への83A10 抗BCMA抗体の結合もまた、測定した(表6)。
a)Ryan, 2007 (Mol Cancer Ther; 6 (11): 3009−18)に記載されるように、NCI−H929細胞を洗浄し、処理前に、0.25% ウシ胎仔血清を補充したRPMI中で24時間インキュベートする。次いで、上記細胞を、処理しないか、または0.1μg/mL TNF−α、100ng/mL、好ましくは、1000ng/mL 熱処理HT短縮型APRIL、100ng/mL、好ましくは、1000ng/mL 短縮型APRIL、0.1pM〜200nM アイソタイプコントロール、もしくは0.1pM〜200nM 抗BCMA抗体で、20分間処理する。リガンドブロックを評価するために、20分間、0.1pM〜200nMの抗BCMA抗体もしくはアイソタイプコントロール抗体で予備処理した細胞を、1μg/mLの短縮型APRILで処理する。次いで、細胞を回収し、洗浄し、プロテアーゼインヒビターおよびホスファターゼインヒビターを補充した50mmol/L Tris−HCl(pH7.5)、1% NP40、150mmol/L NaCl、1mmol/L EDTA、1mmol/L EGTAで溶解する。次いで、タンパク質抽出物を、TransAM(登録商標) 化学発光アッセイキット(Active Motif)を使用してNF−κB活性について分析し、発光シグナル読み取りを、Fusion HTプレートリーダー(Packard Instruments)で行う。
本発明は、1)ヒトBCMAに結合する、2)BCMAへの結合は、100ng/mL、好ましくは、1000ng/mLのAPRILおよびBAFFによって影響を受けない、3)APRIL依存性NF−κB活性化を>20%、好ましくは、>15%ブロックも低下もさせない、または>20%、好ましくは、>15% 増大させない、4)BAFF依存性NF−κB活性化を、>20%、好ましくは、>15%ブロックも低下もさせない、または>20%、好ましくは、>15%増大させない、5)APRILもBAFFもなしでNF−κB活性化をそれ自体で誘導させない、抗ヒトBCMA抗体の生成に関する。表10は、所望の新たな特性:非リガンド結合/ブロック、非リガンド競合を有するBCMA抗体の選択のためのスクリーニングパラダイムを示す。BCMAへの結合がAPRILによってもBAFFによってもブロックされない抗体を選択する。
a)固定化アプローチおよび/もしくは上記の組換えインビトロライブラリーのスクリーニングのいずれかに由来する抗BCMA抗体を、フローサイトメトリーによって、HEK293−BCMA細胞上のヒトBCMAへの結合について分析する。簡潔には、培養した細胞を回収し、計数し、細胞生存率をトリパンブルー排除法を使用して評価する。次いで、生細胞を、BSA含有FACS染色緩衝液(BD Biosciences)中で2×106 細胞/mlへと調節する。この細胞懸濁物のうちの90μlを、丸底96ウェルプレートへと1ウェルあたりでさらにアリコートに分ける。10μlの上記抗BCMA抗体もしくは対応するIgGコントロールを、終濃度0.1pM〜200nMを得るように、その細胞を含むウェルに添加する。全ての構築物およびコントロールIgGを同じ容量モル濃度で使用する。30分間、4℃でインキュベートした後、上記細胞を遠心分離し(5分間、350×g)、150μl/ウェル FACS染色緩衝液(BD Biosciences)で洗浄し、再懸濁し、さらに30分間、4℃で12μl/ウェル 蛍光色素結合体化AffiniPure F(ab’)2 Fragmentヤギ抗ヒトIgG
Fcγ Fragment Specific(Jackson Immuno Research Lab; 作業溶液: 1:20)とともにインキュベートする。次いで、細胞を、染色緩衝液(BD Biosciences) 120μl/ウェルで洗浄し、350×gで5分間の遠心分離によってペレット化する。第2の洗浄工程を、FACS染色緩衝液150μl/ウェルを使用して行う。上記サンプルを、200μl/ウェル FACS染色緩衝液中に再懸濁し、FACSDiva(登録商標)ソフトウェアを備えたLSR IIフローサイトメーター(BD Biosciences)を使用して、取得および分析する。平均蛍光強度(MFI)を、抗BCMA抗体濃度の関数としてプロットして、結合曲線を得て最大結合の50%に達する有効抗体濃度(EC50)を計算する。細胞上のBCMAに結合する抗BCMA抗体は、このアッセイから判定されるように、次のスクリーニング工程、すなわち、APRILおよびBAFFに対する競合BCMA結合アッセイのために選択される(以下の工程(実施例1H2))。
et al. (2007)によって記載されるとおりのELISA法を使用して確認する。簡潔には、イムノソーブ(immunosorb)96ウェルプレートを、1.5μg/mLのGST−BCMA−ECDで被覆し、PBS+1% Tween(PBS−T)で洗浄し、PBS−T+1% 血清アルブミンでブロックする。BCMA被覆プレートを、ハイブリドーマ培養上清とともに2時間室温でインキュベートし、PBS−Tで5回洗浄し、ペルオキシダーゼ結合体化ヤギ抗ラットIgGとともにインキュベートする。二次抗体とのインキュベーションの後、プレートを洗浄し、3,3,5,5−テトラメチルベンジジン基質とともにインキュベートし、等体積の1mol/L H2SO4で停止させる。
F(ab’)2 Fragmentヤギ抗ヒトIgG Fc Fragment Specific(Jackson Immuno Research Lab; 109−116−170)とともにインキュベートした。次いで、細胞を、染色緩衝液(BD Biosciences)で2回洗浄し、1ウェルあたり100μl BD固定緩衝液(#BD Biosciences, 554655)を使用して、4℃で20分間固定し、120μl FACS緩衝液中に再懸濁し、BD FACS CantoIIを使用して分析した。図5は、抗BCMA抗体濃度の関数でプロットした抗BCMA IgGクローンの平均蛍光強度を示す;(A)H929細胞に対してクローン13C2、17A5、83A10、(B)MKN45細胞に対してクローン13C2、17A5、83A10、(C)H929細胞に対してクローン13A4、13D2、14E1、13A7、14B11、(D)MKN45細胞に対してクローン13A4、13D2、14E1、13A7、14B11。H929細胞へのクローン13C2、17A5、83A10の結合に関するEC50値(最大結合の50%に達するために必要とされる抗体濃度を示す)を、表7にまとめる。
a)上記の工程(実施例1H1)から選択された抗BCMA抗体を、次いで、フローサイトメトリーによって、100ng/mL、好ましくは、1000ng/mL APRILもしくはBAFFの存在下もしくは非存在下で、HEK293−BCMA細胞上のヒトBCMAへの結合について分析する。生きているHEK293−BCMA細胞を、BSA含有FACS染色緩衝液(BD Biosciences)中で2×106 細胞/mlに調節する。この細胞懸濁物のうちの90μlを、丸底96ウェルプレートに1ウェルあたりでさらにアリコートに分ける。10μlの上記抗BCMA抗体もしくは対応するIgGコントロールを、その細胞含有ウェルに添加して、終濃度0.1pM〜200nMを得る。全ての構築物およびコントロールIgGを、同じ容量モル濃度で使用する。30分間37℃でインキュベートした後、100ng/ml、好ましくは、1000ng/mLのAPRILおよびBAFFそれぞれの存在下および非存在下で、上記細胞を遠心分離し(5分、350×g)、150μl/ウェル FACS染色緩衝液(BD Biosciences)で洗浄し、再懸濁し、さらに30分間4℃で12μl/ウェル 蛍光色素結合体化AffiniPure F(ab’)2 Fragmentヤギ抗ヒトIgG Fcγ Fragment Specific(Jackson Immuno Research Lab;作業溶液: 1:20)とともにインキュベートする。次いで、細胞を、染色緩衝液(BD Biosciences) 120μl/ウェルで洗浄し、350×gで5分間の遠心分離によってペレット化する。第2の洗浄工程を、FACS染色緩衝液 150μl/ウェルを使用して行う。上記サンプルを、200μl/ウェル FACS染色緩衝液中に再懸濁し、FACSDiva(登録商標)ソフトウェアを備えたLSR
IIフローサイトメーター(BD Biosciences)を使用して、取得および分析する。その平均蛍光強度を抗BCMA抗体濃度の関数としてプロットして、その結合曲線を得て最大結合の50%に達するための有効抗体濃度(EC50)を計算する。1つの結合曲線は、APRILの存在下で、もうひとつはその非存在下で行われ、同じことをBAFFの存在下および非存在下で行う。BCMAへの結合が、100ng/ml、好ましくは、1000ng/mLのAPRILによって影響を受けず、同様に100ng/ml、好ましくは、1000ng/mLのBAFFによっても影響を受けないそれらの抗体を、以下の次の工程のために選択する。BCMAへの結合に関してリガンドAPRILおよびBAFFと競合しない抗体の代表的結合曲線、ならびにBCMAへの結合に関してこれらのリガンドと競合する抗体の代表的結合曲線を、図1に示す。
Biosciences)中で1×106 細胞/mlに調節した。この細胞懸濁物のうちの100μlを、丸底96ウェルプレートに1ウェルあたりでさらにアリコートに分け、30μlの上記抗BCMA抗体もしくは対応するIgGコントロールとともに30分間4℃でインキュベートする。全て抗BCMA抗体(およびアイソタイプコントロール)を力価測定し、終濃度1μg/ml、16μg/mlおよび40μg/mlで分析する。次いで、細胞を遠心分離し(5分、350×g)、120μl/ウェル FACS染色緩衝液(BD Biosciences)で洗浄し、再懸濁し、ヘマグルチニン(HA)(R&D Systems Europe, #7907−AP−010)でタグ化した1μg/ml 組換えマウスΔ−APRILとともにさらに30分間4℃でインキュベートする。次いで、120μl/ウェル FACS緩衝液で1回細胞を洗浄し、FITC結合体化抗HA抗体(Sigma Aldrich, #H7411)とともに30分間4℃でインキュベートする。インキュベーション時間の最後に、細胞を、120μl/ウェル
FACS緩衝液で洗浄し、100μl BD固定緩衝液/ウェル(#BD Biosciences, 554655)を使用して、4℃で20分間固定し、80μl FACS緩衝液で再懸濁し、BD FACS Fortessaを使用して分析する。図7は、H929細胞での抗BCMA抗体クローン13A4、13D2、14E1、13A7、14B11の漸増濃度の関数で検出されるΔ−APRILの相対的メジアン蛍光強度(FITCシグナル)を示す。アイソタイプコントロールの存在下でのΔ−APRILの結合の際のメジアン蛍光強度を、1に設定した;他のシグナルを、それに対して正規化した。
a)上記の工程(実施例1H2)において非競合として選択された抗体(すなわち、それらのBCMA結合曲線が、100ng/ml、好ましくは、1000ng/mLのAPRILの存在によって影響を受けない、および100ng/ml、好ましくは、1000ng/mLのBAFFの存在によっても影響を受けない)を、次いで、APRIL、BAFF、およびBCMA媒介性NF−κB活性化に対する効果に関して工程(実施例1H3)で試験する。APRILはBCMAに対する高親和性リガンドであるので、APRILシグナル伝達に対する抗BCMA抗体のブロック特性もしくはアゴニスト特性を、最初に試験する。Ryan 2007(Mol Cancer Ther; 6 (11): 3009−18)に記載されるように、抗BCMA抗体がAPRIL下流シグナル伝達をブロックするかもしくは増大させるかを確認するために、NCI−H929ヒト多発性骨髄腫(MM)細胞を洗浄し、無血清RPMI中で24時間、処理前にインキュベートする。次いで、上記細胞は未処理であるか、または0.1μg/mL TNF−α(陽性コントロールとして使用)、100ng/mL、好ましくは、1000ng/mL 熱処理HT短縮型APRIL、100ng/mL、好ましくは、1000ng/mL 短縮型APRIL、0.1pM〜200nM アイソタイプコントロール、あるいは0.1pM〜200nM 抗BCMA抗体で、20分間処理する。APRILブロックを評価するために、0.1pM〜200nMの抗BCMA抗体もしくはそれぞれのアイソタイプコントロール抗体で20分間予備処理した細胞を、100ng/mL、好ましくは、1000ng/mLの短縮型APRILで処理する。次いで、細胞を回収し、洗浄し、プロテアーゼインヒビターおよびホスファターゼインヒビターを補充した50mmol/L Tris−HCl(pH7.5)、1% NPκ0、150mmol/L NaCl、1mmol/L
EDTA、1mmol/L EGTAで溶解する。次いで、タンパク質抽出物を、TransAM(登録商標)化学発光アッセイキット(Active Motif)を使用してNF−κB活性について分析し、発光シグナル読み取りを、Fusion HTプレートリーダー(Packard Instruments)で行う。
MM細胞からの核抽出物のものに対して類似であり、有意に低下も増大もさせない)抗BCMA抗体は、以下の次の工程のために選択される。
次いで、上記の工程(実施例1H3)においてAPRIL依存性NF−κB活性化をブロックしないおよび増大させないとして選択された抗体を、次に、BAFF媒介性NF−κB活性化に対する効果に関して工程(実施例1H3)で試験する。Ryan 2007(Mol Cancer Ther; 6 (11): 3009−18)に記載されるように、BCMA抗体が、NF−κB活性化をもたらすBAFF下流シグナル伝達をブロックもしくは増大させるかどうかを確認するために、NCI−H929 MM細胞(CRL−9068TM)を洗浄し、Ryan 2007(Mol Cancer Ther;
6 (11): 3009−18)に記載されるように、無血清RPMI培地中で24時間、処理前にインキュベートする。次いで、細胞は、処理しないか、または0.1μg/mL TNF−α、100ng/mL、好ましくは、1000ng/mL 熱処理HT短縮型BAFF、100ng/mL、好ましくは、1000ng/mL 短縮型BAFF、0.1pM〜200nM アイソタイプコントロール、もしくは0.1pM〜200nM 抗BCMA抗体とともに20分間処理する。BAFFブロックを評価するために、0.1pM〜200nMの抗BCMA抗体もしくはそれぞれのアイソタイプコントロール抗体で20分間予備処理した細胞を、1μg/mLの短縮型BAFFで処理する。次いで、細胞を回収し、洗浄し、プロテアーゼインヒビターおよびホスファターゼインヒビターを補充した50mmol/L Tris−HCl(pH7.5)、1% NP40、150
mmol/L NaCl、1mmol/L EDTA、1mmol/L EGTAで溶解する。次いで、タンパク質抽出物を、TransAM(登録商標)化学発光アッセイキット(Active Motif)を使用してNF−κB活性について分析し、発光シグナル読み取りを、Fusion HTプレートリーダー(Packard Instruments)で行う。BAFF媒介性下流シグナル伝達およびNF−κB活性化を変化させない(すなわち、BAFFのみで処理したNCI−H929 MM細胞由来の核抽出物における、ELISAによって検出されるNF−κBコンセンサス配列に結合したp65由来の平均発光シグナルは、BAFFおよび抗BCMA抗体で処理したNCI−H929 MM細胞由来の核抽出物のものに類似であり、有意に低下も増大もしない)抗BCMA抗体を、以下の次の工程のために選択する。
a)次いで、上記の工程(実施例1H4)においてBAFF依存性NF−κB活性化をブロックしないおよび増大させないとして選択された抗体を、次に、NF−κB活性化を媒介するそれらの内因性のアゴニスト効果について工程(実施例1H5)で試験する。BCMA抗体がアゴニスト的であり、それら自体で下流シグナル伝達を誘導するかどうかを確認するために、NCI−H929細胞を洗浄し、無血清RPMI培地中で24時間、処理前にインキュベートする。次いで、上記細胞は、未処理であるか、0.1μg/mL TNF−α、0.1pM〜200nM アイソタイプコントロールもしくは0.1pM〜200nM 抗BCMA抗体で20分間処理する。次いで、細胞を回収し、洗浄し、プロテアーゼインヒビターおよびホスファターゼインヒビターを補充した50mmol/L Tris−HCl(pH7.5)、1% NP0、150mmol/L NaCl、1mmol/L EDTA、1mmol/L EGTAで溶解する。次いで、タンパク質抽出物を、NF−κB活性についてTransAM(登録商標)化学発光アッセイキット(Active Motif)を使用して分析し、発光シグナル読み取りを、Fusion HTプレートリーダー(Packard Instruments)で行う。下流のシグナル伝達およびNF−κB活性化を誘導しない(すなわち、抗BCMA抗体のみで処理されたNCI−H929 MM細胞に由来する核抽出物中でELISAによって検出されるNF−κBコンセンサス配列に結合したp65由来の平均発光シグナルは、アイソタイプコントロール抗体で処理したNCI−H929 MM細胞に由来する核抽出物のものに類似であり、有意に増大させない)抗BCMA抗体を、さらなる生成ならびにインビトロおよびインビボでの特徴付けのために最終的に選択する。それらは、非リガンドブロック、非競合および非シグナル伝達の抗BCMA抗体を表す(表10を参照)。
Europe, #7907−AP−010)でタグ化した1μg/ml 組換えマウスΔ−APRILとともに、20分間37℃でインキュベートした。インキュベーション時間の最後に、細胞を回収し、洗浄し、溶解し、Nuclear Extract Kit(Active Motif, # 40410)の製造業者のプロトコルに従って処理した。タンパク質抽出物を、TransAm(C) NFkB p65 Chemi Assayキット(Active Motif, #40097)を使用して、製造業者の指示に従ってNFkB活性について分析した。発光シグナルを、Spectra Max M5ルミノメーター(Molecular Devices)を使用して読み取った。上記のように処理したH929細胞から得られた相対的発光シグナル強度を測定した。上記アイソタイプコントロールの存在下でのΔ−APRILの結合の際に得られた発光シグナルを、1に設定した;他のシグナルをこれに対して正規化した。
上記の工程(実施例1H5)後に選択した抗体が、組換え抗体ライブラリーからのインビトロ選択に由来する場合、それらは、既に非結合体化ヒトIgG1抗体である。免疫に由来する、上記の工程(実施例1H5)後に選択したそれらの抗体は、ラット−ヒトキメラ様式にあり、次いで、好ましくは、それらが治療に適用され得るように、ヒト化される。その場合、標準的な抗体ヒト化方法は、それらのラット可変領域の相補性決定領域をヒト抗体可変領域フレームワークに移すことによって適用される。さらなる変異は、必要であれば、キメラ親抗体と比較して、BCMAへの結合を回復させるために、上記可変領域に導入される。
(実施例3A。抗CD3抗体の生成)
VH領域およびVL領域の以下のタンパク質配列を、WO2007/042261に記載されるようにヒトおよびカニクイザル交叉反応性CD3ε抗体を生成するために使用する。
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSS
QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGYYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNRWVFGGGTKLTVL
抗BCMA/抗CD3 T細胞二重特異的因子を、工程(実施例1H5)の後に選択されるヒトもしくはヒト化抗BCMA抗体のために生成する。実施例2に記載されるように、その対応する抗BCMA IgG1抗体の完全重鎖および軽鎖をコードするcDNA、ならびに実施例3Aに記載される抗CD3 VHおよびVLのcDNAを、出発材料として使用する。各二重特異的抗体のために、4種のタンパク質鎖が必要とされ、その対応する抗BCMA抗体の重鎖および軽鎖、ならびに上記の抗CD3抗体重鎖および軽鎖をそれぞれ含む。誤って対合した重鎖を有する、例えば、抗CD3抗体の2つの重鎖を有する副生成物の形成を最小限にするために、変異したヘテロダイマーFc領域が使用され、これは、WO2009080251およびWO2009080252に記載されるように、「ノブが凹みに入り込む変異」および操作されたジスルフィド結合を有する。誤って対合した軽鎖を有する、例えば、抗BCMA抗体の2つの軽鎖を有する副生成物の形成を最小限にするために、CH1×定常κクロスオーバーが、WO2009080251およびWO2009080252に記載される方法論を使用して、抗CD3抗体の重鎖および軽鎖に適用される。
実施例3で生成された二重特異的抗BCMA/抗CD3 T細胞二重特異的抗体のBCMAおよびCD3への結合特性を、表面プラズモン共鳴(SPR)技術によって、Biacore(登録商標) T100機器(Biacore AB)と、ランニング緩衝液(0.01M HEPES pH7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA,
0.005% Surfactant P20, Biacore)としてHBS−EPを使用して分析する。このシステムは、分子相互作用の研究のために十分に確立されている。それは、リガンド/分析物結合の連続リアルタイムモニタリングを可能とし、従って、種々のアッセイ状況において会合速度定数(ka)、解離速度定数(kd)、および平衡定数(KD)の決定を可能にする。SPR技術は、金被覆バイオセンサチップの表面の近傍の屈折率の測定に基づく。屈折率の変化は、固定化されたリガンドと、溶液中の注入された分析物との相互作用によって引き起こされる表面上での質量変化を示す。分子が上記表面の固定化リガンドに結合すれば、質量は増加し、解離すれば、質量は減少する。
実施例3で生成した抗BCMA/抗CD3 T細胞二重特異的抗体をまた、フローサイトメトリーによって、NCI−H929多発性骨髄腫細胞上で発現されるヒトBCMAもしくはヒト白血病T細胞Jurkat(ATCC)上で発現されるヒトCD3へのそれらの結合特性に関して分析する。簡潔には、培養した細胞を回収し、計数し、細胞生存率を、トリパンブルー排除法を使用して評価する。次いで、生細胞を、0.1% BSAを含むPBS中で2×106 細胞/mlに調節する。この細胞懸濁物のうちの90μlを、丸底96ウェルプレートに1ウェルあたりでさらにアリコートに分ける。上記T細胞二重特異的抗体もしくは対応するIgGコントロールのうちの10μlを、上記細胞含有ウェルに添加して、0.1pM〜200nMの終濃度を得る。抗BCMA/抗CD3 T細胞二重特異的抗体およびコントロールIgGを、同じ容量モル濃度で使用する。30分間、4℃でのインキュベーションの後に、細胞を遠心分離し(5分間、350×g)、150μl/ウェル BSA含有FACS染色緩衝液(BD Biosciences)で洗浄し、再懸濁し、さらに30分間4℃で、12μl/ウェル 蛍光色素結合体化抗His抗体(Lucerna)とともに、T細胞二重特異的抗体の検出のためにインキュベートする。次いで、細胞を、120μl/ウェル FACS染色緩衝液の添加および350×gで5分間の遠心分離によって洗浄する。第2の洗浄工程を、150μl/ウェル FACS染色緩衝液で行う。上記サンプルを、200μl/ウェル FACS染色緩衝液中で再懸濁し、FACSDiva(登録商標)ソフトウェアを備えたLSR II フローサイトメーター(BD Biosciences)を使用して取得および分析する。MM細胞およびT細胞への上記抗BCMA/抗CD3 T細胞二重特異的抗体の結合を評価し、その平均蛍光強度を、BCMA発現NCI−H929 MM細胞もしくはCD3発現Jurkat T細胞のいずれかに対してゲーティングをかけて決定し、ヒストグラムもしくはドットプロットでプロットする。
実施例3で生成した抗BCMA/抗CD3 T細胞二重特異的抗体をまた、フローサイトメトリーによって、ヒトBCMA発現MM細胞の存在下もしくは非存在下、CD4+およびCD8+ T細胞上の初期活性化マーカーCD69または後期活性化マーカーCD25の表面発現を評価することによって、T細胞活性化を誘導するそれらの能力を分析する。簡潔には、BCMA発現NCI−H929 MM細胞を、細胞解離緩衝液で回収し、計数し、トリパンブルーを使用して細胞生存率を確認する。生存MM細胞を、完全RPMI−1640培地中で0.2×106 細胞/mLに調節し、1ウェルあたりこの細胞懸濁物のうちの100μlを、丸底96ウェルプレートの中にピペットで移す。T細胞二重特異的構築物のうちの50μlを、MM細胞含有ウェルに添加して、終濃度1nMを得る。上記96ウェルプレートを確保しておき、さらなる操作のときまで、37℃、5% CO2で維持する。
Biosciences)を使用して取得および分析する。CD69およびCD25活性化マーカーの発現を、ヒストグラムもしくはドットブロットで表されるように、CD4+およびCD8+ T細胞集団に対してゲーティングをかけた平均蛍光強度を測定することによって決定する。
実施例3で生成した抗BCMA/抗CD3 T細胞二重特異的抗体をまた、フローサイトメトリーによって、ヒトBCMA発現MM細胞の存在下もしくは非存在下で、CD8+もしくはCD4+ T細胞の増殖を誘導するそれらの能力について分析する。簡潔には、BCMA発現NCI−H929 MM細胞を、細胞解離緩衝液で回収し、計数し、トリパンブルーを使用して生存率について調べる。生存MM細胞を、完全RPMI培地中で0.2×106 細胞/mlに調節し、この細胞懸濁物のうちの100μlを、丸底96ウェルプレートに1ウェルあたりピペットで移す。T細胞二重特異的構築物のうちの50μlを、MM細胞含有ウェルに添加して、0.1pM〜200nMの範囲の終濃度(複数可)を得る。上記ウェルプレートを確保しておき、37℃、5% CO2で維持する。
FACS染色緩衝液中で再懸濁し、FACSDiva(登録商標)ソフトウェア(BD)を補完したLSR IIフローサイトメーターを使用して取得および分析する。非増殖細胞のパーセンテージを、ウェルがBCMA発現MM細胞およびCFSE染色T細胞を含むが、T細胞二重特異的抗体なしの群において一番右の非希釈CFSEピークでゲーティングをかけることによって決定し、他の実験群(ウェル)のものと比較する。増殖細胞のパーセンテージを、最も右のピーク(観察可能であれば)を除く全てのその希釈CFSEピークをゲーティング、することによって測定する。CD4+およびCD8+ T細胞の増殖レベルを、その集団で最初にゲーティングをかけ、次にCFSE希釈ピークをさらに調べることによって決定する。
(実施例8A。インターフェロン−γ生成)
実施例3で生成した抗BCMA/抗CD3 T細胞二重特異的抗体もまた、ヒトBCMA発現MM細胞の存在下もしくは非存在下でT細胞によってインターフェロン−γ(IFN−γ)生成を誘導するそれらの能力について分析する。簡潔には、BCMA発現NCI−H929 MM細胞を、細胞解離緩衝液で回収し、計数し、トリパンブルーを使用して生存率について調べる。1ウェルあたり約20,000個の生細胞を丸底96ウェルプレートにまき、それぞれの抗体希釈物を添加して、0.1pM〜200nMの範囲の終濃度(複数可)を得る。同じ容量モル濃度に調節した抗ヒトBCMA IgGおよび抗CD3 IgGを、コントロールとして使用する。ヒト全Tエフェクター細胞を添加して、最終E:T比 5:1を得る。37℃、5% CO2で20時間のインキュベーションの後、上清中のヒトIFN−γレベルを、ELISAによって、製造業者の指示(ヒトIFN−γ
ELISA Kit II, BD Biosciences)に従って測定する。抗BCMA/抗CD3 T細胞二重特異的抗体およびBCMA発現MM細胞の存在下でのT細胞によって生成されたIFN−γのレベルを測定し、ヒストグラムにプロットし、抗BCMA/抗CD3 T細胞二重特異的抗体の存在下であるが、BCMA発現MM細胞なしでのT細胞によって生成されたものと比較する。
実施例3で生成した抗BCMA/抗CD3 T細胞二重特異的抗体をまた、ヒトBCMA発現MM細胞の存在下もしくは非存在下でT細胞媒介性サイトカイン生成を誘導するそれらの能力について分析する。PBMCを、密度勾配遠心分離法を使用し、クエン酸ナトリウムを含む細胞調製チューブ(Vacutainer CPT tubes, BD Biosciences)を使用して新鮮な血液から単離し、最終細胞濃度30万個の細胞/ウェルを、丸底96ウェルプレートにまく。次いで、BCMA発現NCI−H929
MM細胞を添加して、最終E:T比 10:1を得、同様に、T細胞二重特異的構築物およびIgGコントロールを添加して、37℃、5% CO2での24時間にわたって、0.1pM〜200nMの範囲の終濃度(複数可)を得る。翌日、上記細胞を、5分間、350×gで遠心分離し、その上清を、新たな深型ウェルの96ウェルプレートへとさらなる分析のために移す。CBA分析を、LSR IIフローサイトメーターのための製造業者の指示に従って、ヒトIL−2、ヒトIL−4、ヒトIL−6、ヒトIL−10、ヒトTNF−α、およびヒトIFN−γを含むHuman Th1/Th2 Cytokine Kit II(BD Biosciences)を使用して行う。抗BCMA/抗CD3 T細胞二重特異的抗体およびBCMA発現MM細胞の存在下でT細胞によって生成されるサイトカインのレベルを測定し、ヒストグラムにプロットし、抗BCMA/抗CD3 T細胞二重特異的抗体の存在下であるが、BCMA発現MM細胞なしでT細胞によって生成されるものと比較する。
T細胞二重特異的抗体の架橋の際のMM細胞のT細胞による再指向された細胞傷害性(LDH放出アッセイ))
実施例3で生成した抗BCMA/抗CD3 T細胞二重特異的抗体をまた、細胞上のBCMAへの抗原結合部分の結合による上記構築物の架橋の際に、BCMA発現MM細胞におけるT細胞媒介性アポトーシスを誘導するそれらの能力について分析する。簡潔には、ヒトBCMA発現NCI−H929 多発性骨髄腫標的細胞を細胞解離緩衝液で回収し、10% ウシ胎仔血清(Invitrogen)を補充したRPMI中で洗浄および再懸濁する。約30,000個の細胞/ウェルを、丸底96ウェルプレートにまき、上記構築物の各々の希釈物を、所望の終濃度;0.1pM〜200nMの範囲の終濃度のために添加する(三連で)。適切な比較のために、全T細胞二重特異的構築物およびコントロールを、同じ容量モル濃度に調節する。ヒト全T細胞(エフェクター)をウェルに添加して、最終E:T比 5:1を得る。ヒトPBMCがエフェクター細胞として使用される場合、最終E:T比 10:1が使用される。PHA−L(Sigma)は、1μg/mlの濃度でヒトT細胞活性化の陽性コントロールとして使用される。陰性コントロール群は、エフェクターもしくは標的細胞のみによって表される。正規化のために、NCI−H929
MM標的細胞の最大溶解(=100%)を、標的細胞と終濃度1% Triton X−100とをインキュベートし細胞死を誘導することによって決定する。最小溶解(=0%)は、標的細胞と、エフェクター細胞のみとを、すなわち、いかなるT細胞二重特異的抗体もなしで共インキュベートすることによって表す。37℃、5% CO2での20時間のインキュベーションの後、次いで、アポトーシス/壊死MM標的細胞から上清へのLDH放出を、LDH検出キット(Roche Applied Science)で、製造業者の指示に従って測定する。LDH放出のパーセンテージを、濃度応答曲線において、抗BCMA/抗CD3 T細胞二重特異的抗体の濃度に対してプロットする。そのIC50値を、Prismソフトウェア(GraphPad)を使用して測定し、LDH放出の50%を生じるT細胞二重特異的抗体濃度として決定する。
ある特定の組織学的悪性疾患(例えば、多発性骨髄腫)において、循環するBCMA−リガンドAPRILおよびBAFFのレベルは、上昇し得る(Moreaux et al. 2004; Blood 103(8): 3148−3157)。従って、本発明者らは、血清中の高レベルのリガンドが腫瘍細胞上のBCMAへの抗BCMA抗体の結合を妨害し得ることを認識している。健康なドナーとの比較において、MM患者における循環するAPRIL(BCMAに対する高親和性リガンド)のレベルは、約10ng/mLに対して約100ng/mLである。BAFF(BCMAに対する低親和性リガンド)に関しては、そのレベルは、健康なドナーの約3ng/mLと比較して、1〜1000ng/mLで変動し得る。上記腫瘍細胞の近くでは、APRIL/BAFF濃度は、血清中で測定されるよりさらにかなり高い可能性がある。ある特定の自己免疫疾患(例えば、全身性エリテマトーデス)では、循環するAPRILのレベルも同様に高く、約85ng/mLである(Koyama et al. 2005; Ann Rheum Dis 64: 1065−1067)。
実施例3で生成した非リガンド結合/ブロック、非競合抗BCMA抗体を有する抗BCMA/抗CD3 T細胞二重特異的抗体を、フローサイトメトリーによって、10ng/mL、100ng/mLおよび1000ng/mLのAPRILもしくはBAFFの存在下で、NCI−H929多発性骨髄腫細胞上で発現されるヒトBCMAへのそれらの結合特性について分析する。簡潔には、培養した細胞を回収し、計数し、細胞生存率を、トリパンブルー排除法を使用して評価する。次いで、生細胞を、0.1% BSAを含むPBS中で2×106 細胞/mlに調節する。この細胞懸濁物のうちの90μlを、丸底96ウェルプレートにウェルあたりさらにアリコートに分ける。上記T細胞二重特異的抗体もしくは対応するIgGコントロールのうちの10μlを上記細胞含有ウェルに添加して、好ましくは、0.1pM〜200nMの範囲に及ぶ終濃度を得る。抗BCMA/抗CD3 T細胞二重特異的抗体およびコントロールIgGを、同じ容量モル濃度で使用する。
30分間4℃でのインキュベーションの後、細胞を遠心分離し(5分間、350×g)、150μl/ウェルのBSA含有FACS染色緩衝液(BD Biosciences)で洗浄し、再懸濁し、さらに30分間4℃で、12μl/ウェル 蛍光色素結合体化抗His抗体(Lucerna)とともにT細胞二重特異的抗体の検出のためにインキュベートする。次いで、細胞を、120μl/ウェル FACS染色緩衝液の添加および350×gで5分間の遠心分離によって洗浄する。第2の洗浄工程を、150μl/ウェル FACS染色緩衝液で行う。上記サンプルを200μl/ウェル FACS染色緩衝液中に再懸濁し、FACSDiva(登録商標)ソフトウェアを備えたLSR IIフローサイトメーター(BD Biosciences)を使用して取得および分析する。MM細胞およびT細胞への抗BCMA/抗CD3 T細胞二重特異的抗体の結合を評価し、その平均蛍光強度を、BCMA発現NCI−H929 MM細胞でゲーティングをかけて決定し、ヒストグラムもしくはドットプロットでプロットする。次いで、MM細胞への、非リガンド結合/ブロック、非競合抗BCMA抗体を有する抗BCMA/抗CD3 T細胞二重特異的抗体の結合(例えば、MFI)を、0ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mLのAPRILもしくはBAFFの存在下でリガンド結合/ブロック、競合抗BCMA抗体を有する抗BCMA/抗CD3 T細胞二重特異的抗体の結合と比較する。
実施例3で生成した非リガンド結合/ブロック、非競合抗BCMA抗体を有する抗BCMA/抗CD3 T細胞二重特異的抗体を、漸増濃度(すなわち、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL)のAPRILもしくはBAFFの存在下もしくは非存在下で、細胞上のBCMAへの抗原結合部分の結合による上記構築物の架橋の際に、BCMA発現MM細胞におけるT細胞媒介性アポトーシスを誘導するそれらの能力について分析する。簡潔には、ヒトBCMA発現NCI−H929多発性骨髄腫標的細胞を、細胞解離緩衝液で回収し、10% ウシ胎仔血清(Invitrogen)を補充したRPMI中で洗浄および再懸濁する。約30,000 細胞/ウェルを、丸底96ウェルプレートにまき、上記T細胞二重特異的抗体のそれぞれの希釈物を、好ましくは、0.1pM〜200nMの範囲の濃度になるように添加する(三連で)。適切な比較のために、全てのT細胞二重特異的抗体およびコントロールを、同じ容量モル濃度に調節する。漸増濃度(すなわち、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL)の可溶性ヒト組換えAPRILもしくはBAFFを、上記細胞培養物に添加する。APRILの添加もBAFFの添加もないウェルをまた、コントロールとしてプレートに含める。次いで、ヒト全T細胞(エフェクター)を、ウェルに添加して、最終E:T比 5:1を得る。ヒトPBMCをエフェクター細胞として使用する場合、最終E:T比 10:1を使用する。PHA−L(Sigma)を、濃度1μg/mlでヒトT細胞活性化の陽性コントロールとして使用する。陰性コントロール群は、エフェクターもしくは標的細胞のみによって表される。正規化のために、NCI−H929 MM標的細胞の最大溶解(=100%)を、細胞死を含め、終濃度1% Triton X−100との標的細胞のインキュベーションによって決定する。最小溶解(=0%)を、エフェクター細胞とのみ、すなわち、いかなる構築物も抗体もなしで共インキュベートした標的細胞によって表される。37℃、5% CO2での20時間のインキュベーションの後、次いで、アポトーシス/壊死MM標的細胞から上清へのLDH放出を、LDH検出キット(Roche Applied Science)で、製造業者の指示に従って測定する。LDH放出のパーセンテージを、濃度応答曲線において、抗BCMA/抗CD3 T細胞二重特異的抗体の濃度(複数可)の存在下で、好ましくは、0.1pM〜200nMの濃度範囲で、APRILもしくはBAFFの濃度に対してプロットする。次いで、そのIC50値を、Prismソフトウェア(GraphPad)を使用して測定する。次いで、非リガンド結合/ブロック、非競合抗BCMA抗体を有する抗BCMA/抗CD3 T細胞二重特異的抗体のIC50値を、0ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mLのAPRILもしくはBAFFの存在下で、リガンド結合/ブロック、競合抗BCMA抗体を有する抗BCMA/抗CD3 T細胞二重特異的抗体のものと比較する。
マウス交叉反応性抗BCMA/抗CD3 T細胞二重特異的抗体を、Chesi, 2012(Chesi et al. 2012; Blood 120: 376−385)に記載されるように、Vk*MYC 多発性骨髄腫になりやすいマウスにおいて多発性骨髄腫を防止するそれらの能力について試験する。多発性骨髄腫は、骨髄中の形質細胞の制御されない増大を伴う血液悪性疾患である。BCMAは、悪性形質細胞上で強く発現されるので、本発明者らは、抗BCMA/抗CD3 T細胞二重特異的因子が多発性骨髄腫の処置に効果的であると仮定する。上記Vk*MYC 多発性骨髄腫マウスモデルは、ヒト骨髄腫をよく表し、クリニックにおいて使用される薬物応答の予測となり;抗BCMA/抗CD3 T細胞二重特異的抗体の前臨床的概念実証を試験するための優れたツールの代表である。簡潔には、Mayo Clinic Arizonaでの学術的協同研究から得られたVk*MYCマウスを、ヒトCD3εトランスジェニック(huCD3ε Tg)マウスと交配する。huCD3ε Tg×Vk*MYCマウス由来のT細胞は、ヒトCD3εおよびマウスCD3εの両方をその細胞表面に発現するので、上記マウスは、抗BCMA/抗CD3 T細胞二重特異的因子に応答性である。Vk*MYCマウスは、約30週齢で開始する単クローン性高ガンマグロブリン血症を一律に発症し、これは、ヒト骨髄腫の代表的な臨床徴候(例えば、貧血、骨粗鬆症および腎疾患)を伴って、時間を経てゆっくりと進行する。マウスの尾の掠り傷を付けて定期的に採血し、血液をMicrotainer tubes(BD Biosciences)に集め、室温で凝固させ、次いで、10分間、2,300gで遠心分離する。血清を生理食塩緩衝液中で1:2希釈し、プレキャストQuickGels(Helena Laboratories)を使用して製造業者の指示に従ってQuickGel Chamber装置で分析する。ガンマグロブリン(gamma)/アルブミン比および血清画分を、デンシトメトリー分析によって測定する。
マウス交叉反応性抗BCMA/抗CD3 T細胞二重特異的抗体を、NZB/W proneマウス(十分に特徴付けられたモデル(Hass et al. 2010; J Immunol 184(9): 4789−4800))において全身性エリテマトーデス(SLE)を防止するそれらの能力について試験する。自己反応性形質細胞がSLEにおいて重要な役割を果たし、自己反応性形質細胞の抗BCMA/抗CD3 T細胞二重特異的因子での枯渇が、SLE患者に有益であり得ることを示唆する証拠が蓄積しつつある。簡潔には、NZBおよびNZWマウスを、Jackson Laboratoryから購入し、huCD3ε Tgマウスと交配する。次いで、NZB×huCD3ε TgマウスおよびNZW×huCD3ε Tgマウスを、互いと交配し、雌性huCD3ε
Tg×NZB/W F1マウスを、将来的な研究のために選択する。マウスを、Albustix試薬ストリップ(Siemens Healthcare Diagnostics Inc.)で隔週にタンパク尿について半定量的に試験し、タンパク質濃度(0〜≧20g/lまで)に従って0〜4までのスケールでスコア付けする。7〜8ヶ月齢のhuCD3ε Tg×NZB/W F1雌性マウスを、治療研究に登録し、種々の処置群に無作為化する(n=16/群): 例えば、1)コントロールIgG;2)抗BCMA/抗CD3 T細胞二重特異的抗体; 500μg/kg/週もしくは10μg/マウス/週が尾静脈を介して静脈内投与される;3)標準ケアとして使用される抗BAFF 20mg/kg/週。好ましくは、抗BCMA/抗CD3 T細胞二重特異的抗体の用量(複数可)は、複数であり得、200〜1000μg/kg/週の範囲に及び得る。上記治療研究の開始時のベースラインタンパク質レベルは、30〜300mg/dLである。
Claims (9)
- 2つの標的であるヒトCD3εおよびヒトB細胞成熟抗原(BCMA)に特異的に結合する二重特異的抗体であって、該二重特異的抗体が:
(a)BCMAに特異的に結合する抗体の第1のFabフラグメント(抗BCMA抗体の第1のFabフラグメント);
(b)BCMAに特異的に結合する抗体の第2のFabフラグメント(抗BCMA抗体の第2のFabフラグメント);
(c)Fc部分;および
(d)CD3εに特異的に結合する抗体のFabフラグメント(抗CD3ε抗体のFabフラグメント)、ここで、抗CD3ε抗体のFabフラグメントの可変ドメインVLおよびVHが互いに置き換えられている、
を含み、
該抗BCMA抗体の第1のFabフラグメントは、そのC末端で該Fc部分のヒンジ領域のN末端に結合しており、
該抗CD3ε抗体のFabフラグメントは、そのC末端で該Fc部分のヒンジ領域のN末端に結合しており、
該抗BCMA抗体の第2のFabフラグメントは、そのC末端で該抗CD3ε抗体のFabフラグメントのN末端に化学的に結合しており、
該抗BCMA抗体のFabフラグメントが:
配列番号39、49、および59の重鎖CDRを、それぞれ、重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVH;ならびに
配列番号69、79、および89の軽鎖CDRを、それぞれ、軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVL、
を含むものである、
二重特異的抗体。 - 前記抗CD3ε抗体のFabフラグメントが:配列番号1、2および3の重鎖CDRを、それぞれ、重鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVH;ならびに配列番号4、5および6の軽鎖CDRを、それぞれ、軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3として含む可変ドメインVL、を含むものである、請求項1に記載の二重特異的抗体。
- 前記抗CD3ε抗体のFabフラグメントが、配列番号7および8の可変ドメインを含むものである、請求項1または2に記載の二重特異的抗体。
- 前記抗BCMA抗体のFabフラグメントが、配列番号19の可変ドメインVH、および配列番号29の可変ドメインVL、を含むものである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の二重特異的抗体。
- 前記Fc部分が、野生型ヒトIgG Fc領域のFc改変体であり、ここで、該Fc改変体は、Pro329の位置におけるグリシンもしくはアルギニンによるアミノ酸置換、およびL234AまたはL235Aである少なくとも1個のさらなるアミノ酸置換を含むものである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の二重特異的抗体。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の二重特異的抗体および薬学的に受容可能な賦形剤を含む、薬学的組成物。
- 医薬としての使用のための、請求項1〜5のいずれか1項に記載の二重特異的抗体を含む組成物または請求項6に記載の薬学的組成物。
- 形質細胞障害の処置における医薬として使用するための、請求項1〜5のいずれか1項に記載の二重特異的抗体を含む組成物または請求項6に記載の薬学的組成物。
- 前記形質細胞障害が、多発性骨髄腫もしくはBCMAを発現する他のB細胞障害である、請求項8に記載の使用のための組成物または薬学的組成物。
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