CN114885609A

CN114885609A - 基于假Fab的多特异性结合蛋白

Info

Publication number: CN114885609A
Application number: CN201980090844.0A
Authority: CN
Inventors: C·贝尔; K-C·恩格尔; G·赫斯勒; S·霍尔珀; C·兰格; T·兰格; C·莱蒙; W-D·卢希纳; S·奥泽尔·布鲁德尔; E·雷奥; N·斯平德勒; S·韦尔
Original assignee: Sanofi SA
Current assignee: Sanofi SA
Priority date: 2018-12-24
Filing date: 2019-12-23
Publication date: 2022-08-09
Also published as: AU2019416895A2; JP2024504880A; CA3124770A1; MX2021007677A; TW202041534A; US20200255540A1; WO2020136564A1; CO2021009025A2; SG11202106393SA; EP3902825A1; BR112021012337A2; US20230391888A1; KR20220015369A; IL284317A; US11739160B2; AU2019416895A1; MA54601A

Abstract

提供了结合蛋白，其包含包括稳定敲除结构域的假Fab结构域以及形成第一功能性抗原结合结构域的第二VH/VL。还提供了包含至少一种假Fab的多特异性结合蛋白。还提供了多特异性结合蛋白、编码结合蛋白和多特异性结合蛋白的核酸、表达载体、宿主细胞、药物组合物以及给予本文所述的结合蛋白或多特异性结合蛋白的治疗方法。

Description

基于假Fab的多特异性结合蛋白

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年12月24日提交的欧洲申请号18306840.2和2019年6月21日提交的欧洲申请号19305813.8的优先权，将所述申请的内容出于所有目的通过引用并入本文。

背景技术

天然抗体结构中不对称性的产生是产生具有两种(例如，双特异性抗体)或更多种结合特异性的多特异性结合蛋白的先决条件。例如，通过分离不同的不对称结合臂或Fab上的一个或多个Fv，可以使双特异性抗体具有同时结合两种不同抗原或表位的灵活性。然而，尽管有这些优点，众多种多特异性抗体技术由于各条不对称重链和轻链的错误配对而具有工艺和制造问题。例如，这些技术中许多具有所谓的“轻链问题”，其中两条不同轻链与重链的随机配对产生除了所需组合以外的多种链配对组合。在一些情况下，可以通过使用共同轻链来避免轻链问题，所述共同轻链使得能结合至两种抗原或表位。然而，这对于许多抗体可能是不可行的，因为这种形式要求在转基因小鼠中重新产生抗体。此外，罕见抗体如源自人类患者的广泛中和性抗HIV抗体不能适应于这样的形式。因此，仍然需要针对错误配对问题的替代性和创造性解决方案。

发明内容

本公开文本是基于可以用于形成“假Fab”的被称为“稳定敲除结构域”的新颖异二聚化结构域的发现。如本文所公开，可以将假Fab掺入众多种结合蛋白和结合形式中以赋予多特异性结合特性。在某些方面，假Fab部分可以促进所需多特异性结合蛋白的优先产生、合成或纯化，同时最小化或消除用常规多特异性结合蛋白形式通常所产生的不期望的链错误配对。在一方面，本公开文本提供了一种结合蛋白，所述结合蛋白包含：

第一假Fab部分，所述第一假Fab部分包含(1)第一VL结构域(VLa)，所述第一VL结构域与第一VH结构域(VHa)配对以形成结合靶抗原A的第一功能性抗原结合位点；(2)第一稳定敲除VH结构域(VHX)，所述第一稳定敲除VH结构域与第一稳定敲除VL结构域(VLX)配对以形成第一稳定敲除结构域；

其中所述稳定敲除结构域包含(3)消除与靶抗原的结合的一个或多个失活突变；和(4)一个或多个工程化链间二硫键。

在一方面，本公开文本提供了一种结合蛋白，所述结合蛋白包含：

其中所述稳定敲除结构域包含(3)相对于野生型结构域，消除其与靶抗原的结合的一个或多个失活突变；和(4)相对于参考Fab分子，赋予所述假Fab的增强的热稳定性(Tm)的一个或多个工程化链间二硫键，其中除了在假Fab分子中，所述参考Fab分子的CH1和CL结构域被VHX和VLX结构域替代以外，所述参考Fab分子与所述假Fab分子相同。

在一些实施方案中，所述结合蛋白是多特异性结合蛋白，所述多特异性结合蛋白还至少包含：

第二VL结构域(VLb)，所述第二VL结构域与第二VH结构域(VHb)配对以形成结合靶抗原B的第二功能性抗原结合位点。

在一方面，本公开文本提供了一种多特异性结合蛋白，所述多特异性结合蛋白包含：

a)第一假Fab部分，所述第一假Fab部分包含(1)第一VL结构域(VLa)，所述第一VL结构域与第一VH结构域(VHa)配对以形成结合靶抗原A的第一功能性抗原结合位点；(2)第一稳定敲除VH结构域(VHX)，所述第一稳定敲除VH结构域与第一稳定敲除VL结构域(VLX)配对以形成第一稳定敲除结构域；

b)第一Fab部分，所述第一Fab部分包含(3)第二VL结构域(VLb)，所述第二VL结构域与第二VH结构域(VHb)配对以形成结合靶抗原B的第二功能性抗原结合位点；(4)第一CH1结构域，所述第一CH1结构域与第一CL结构域配对；并且

其中所述稳定敲除结构域包含(5)消除其与靶抗原的结合的一个或多个失活突变；和(6)一个或多个工程化链间二硫键；或者可替代地，其中所述稳定敲除结构域包含(5)相对于野生型结构域，消除其与靶抗原的结合的一个或多个失活突变；和(6)相对于参考Fab分子，赋予所述假Fab的增强的热稳定性(Tm)的一个或多个工程化链间二硫键，其中除了在假Fab分子中，所述参考Fab分子的CH1和CL结构域被VHX和VLX结构域替代以外，所述参考Fab分子与所述假Fab分子相同。

在另一方面，本公开文本提供了一种多特异性结合蛋白，所述多特异性结合蛋白包含：

a)第一假Fab部分，所述第一假Fab部分包含(1)第一VL结构域(VLa)，所述第一VL结构域与第一VH结构域(VHa)配对以形成结合靶抗原A的第一功能性抗原结合位点；(2)第一稳定敲除VH结构域(VHX)，所述第一稳定敲除VH结构域与第一稳定敲除VL结构域(VLX)配对以形成稳定敲除结构域，条件是所述第一假Fab部分不包含与CL结构域配对的CH1结构域；

其中所述稳定敲除结构域包含(3)消除其与靶抗原的结合的一个或多个失活突变；和(4)一个或多个工程化链间二硫键；或者可替代地，其中所述稳定敲除结构域包含(3)相对于野生型结构域，消除其与靶抗原的结合的一个或多个失活突变；和(4)相对于参考Fab分子，赋予所述假Fab的增强的热稳定性(Tm)的一个或多个工程化链间二硫键，其中除了在假Fab分子中，所述参考Fab分子的CH1和CL结构域被VHX和VLX结构域替代以外，所述参考Fab分子与所述假Fab分子相同；

b)第一Fab部分，所述第一Fab部分包含(5)第二VL结构域(VLb)，所述第二VL结构域与第二VH结构域(VHb)配对以形成结合靶抗原B的第二功能性抗原结合位点；(6)第一CH1结构域，所述第一CH1结构域与第一CL结构域配对；以及

c)接头部分，所述接头部分可操作地连接所述第一Fab部分和所述第一假Fab部分。

在一些实施方案中，所述接头部分是在一条或多条重链上。

在一些实施方案中，所述多特异性结合蛋白还包含第三VL结构域(VLc)，所述第三VL结构域与第三VH结构域(VHc)配对以形成结合靶抗原C的第三功能性抗原结合位点。

在一些实施方案中，所述多特异性结合蛋白独立地包含一个或两个假Fab部分和一个或两个Fab部分。

在一些实施方案中，所述接头部分是肽接头。在一些实施方案中，所述肽接头是式(Gly₄Ser)_n的Gly-Ser接头，其中n是1-10(SEQ ID NO:101)。

在一些实施方案中，所述异二聚化结构域包含全长IgG抗体。在一些实施方案中，所述异二聚化结构域包含全长IgG抗体的Fc结构域或其功能片段。

在一些实施方案中，所述结合蛋白包含选自下组之一的分开的蛋白质链：

(a)VHa-CH1-L1-VHb-L2-VHX和VLa-CL和VLb-L3-VLX；

(b)VHa-L2-VHX-L1-VHb-CH1和VLa-L3-VLX和VLb-CL；

(c)VHa-CH1-L1-VHa-CH1和VHb-L2-VHX-L3-VHb-L4-VHX和两条链VLb-L5-VLX和两条链VLa-CL；

其中(a)和(b)的链可以存在一次或两次，并且其中L1、L2、L3、L4和L5是可以独立地相同或不同的接头。

本公开文本提供了一种多特异性抗体，所述多特异性抗体包含：

a)第一假Fab部分，所述第一假Fab部分包含：

(1)第一VL结构域(VLa)，所述第一VL结构域与第一VH结构域(VHa)配对以形成结合靶抗原A的第一抗原结合位点；

(2)第一稳定敲除VL结构域(VLX)，所述第一稳定敲除VL结构域与第一稳定敲除VH结构域(VHX)配对以形成第一二硫键稳定的敲除(dsKO)结构域；

(3)第一异二聚化结构域(HD1)；

其中所述第一dsKO结构域包含(i)消除其与靶抗原的结合的一个或多个失活突变；和(ii)一个或多个工程化链间二硫键；或者可替代地，包含(i)相对于野生型结构域，消除其与靶抗原的结合的一个或多个失活突变；和(ii)相对于参考Fab分子，赋予所述假Fab的增强的热稳定性(Tm)的一个或多个工程化链间二硫键，其中除了在假Fab分子中，所述参考Fab分子的CH1和CL结构域被VHX和VLX结构域替代以外，所述参考Fab分子与所述假Fab分子相同。

b)第一Fab部分，所述第一Fab部分包含：

(1)第二VL结构域(VLb)，所述第二VL结构域与第二VH结构域(VHb)配对以形成结合靶抗原B的第二功能性抗原结合位点；

(2)第一CH1结构域，所述第一CH1结构域与第一CL结构域配对；和

(3)第二异二聚化结构域(HD2)。

在一些实施方案中，所述第一异二聚化结构域(HD1)可操作地连接至所述假Fab部分的VHX结构域的C末端。

在一些实施方案中，所述第二异二聚化结构域(HD2)可操作地连接至所述第一Fab部分的第一CH1结构域的C末端。

在一些实施方案中，所述第一和第二异二聚化结构域包含第一和第二Fc结构域。

在一些实施方案中，所述Fc结构域包含通用结构：铰链-CH2结构域-CH3结构域。

在一些实施方案中，所述Fc结构域包含一个或多个杵臼结构(knob-in-hole，KIH)突变。

在一些实施方案中，一个Fc结构域包含第一CH3结构域，所述第一CH3结构域包含S354C和T366W突变中的一个或两个，并且另一个Fc结构域包含第二CH3结构域，所述第二CH3结构域包含Y349C、T366S、L368A和Y407V突变中的一个或两个。

在一些实施方案中，所述Fc结构域包含H435R和/或Y436F突变。

在一些实施方案中，所述第一假Fab部分包含第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链具有由下式表示的结构：

(Ia)N-VHa-L1-VHX-C

并且所述第二多肽链具有由下式表示的结构：

(IIa)N-VLa-L2-VLX-C

其中L1和L2是可以独立地存在或不存在的接头，并且其中N和C分别表示N末端和C末端。

(Ib)N-VHX-L1-VHa-C

并且所述第二多肽链具有由下式表示的结构：

(IIb)N-VLX-L2-VLa-C

(Ic)N-VLa-L1-VHX-C

并且所述第二多肽链具有由下式表示的结构：

(IIc)N-VHa-L2-VLX-C

(Id)N-VHX-L1-VLa-C

并且所述第二多肽链具有由下式表示的结构：

(IId)N-VLX-L2-VHa-C

在一些实施方案中，靶抗原A、靶抗原B和靶抗原C中的至少两种是不同的靶抗原。

在一些实施方案中，所述靶抗原中的至少一种是细胞表面受体的配体，并且所述靶抗原中的至少一种是细胞表面受体。

在一些实施方案中，所述抗原结合位点衍生自不同的抗体。

在一些实施方案中，靶抗原A、靶抗原B和靶抗原C是相同的靶抗原。

在一些实施方案中，所述抗原结合位点结合相同靶抗原上的不同表位。

在一些实施方案中，所述抗原结合位点结合相同靶抗原上的相同表位。

在一些实施方案中，所述抗原结合位点衍生自相同的抗体。

在一些实施方案中，所述假Fab部分的熔解温度(T_m)比所述参考Fab分子高至少4摄氏度。

在一些实施方案中，所述工程化链间二硫键是VH44C-VL100C。

在一些实施方案中，所述工程化链间二硫键是VH105C-VL43C。

在一些实施方案中，消除与所述靶抗原的结合的所述一个或多个失活突变中的至少一个存在于所述假Fab部分的VHX结构域中。

在一些实施方案中，消除与所述靶抗原的结合的所述一个或多个失活突变中的至少一个存在于所述VHX结构域的CDRH3中。

在一些实施方案中，消除与所述靶抗原的结合的所述一个或多个失活突变中的至少一个存在于所述VHX结构域的CDRH2中。

在一些实施方案中，消除与所述靶抗原的结合的所述一个或多个失活突变中的至少一个存在于所述VHX结构域的CDRH1中。

在一些实施方案中，消除与所述靶抗原的结合的所述一个或多个失活突变中的至少一个存在于所述假Fab部分的VLX结构域中。

在一些实施方案中，消除与所述靶抗原的结合的所述一个或多个失活突变中的至少一个存在于所述VLX结构域的CDRL3中。

在一些实施方案中，消除与所述靶抗原的结合的所述一个或多个失活突变中的至少一个存在于所述VLX结构域的CDRL2中。

在一些实施方案中，消除与所述靶抗原的结合的所述一个或多个失活突变中的至少一个存在于所述VLX结构域的CDRL1中。

在一些实施方案中，所述假Fab部分的VHX结构域包含选自SEQ ID NO:77、SEQ IDNO:78和SEQ ID NO:79的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述VLX/VHX对选自：

(i)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VLX，和

包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VHX；

ii)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VLX，和

包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的VHX；以及

iii)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VLX，和

包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的VHX。

在一些实施方案中，所述结合蛋白还包含与所述结合蛋白的N末端或C末端可操作地连接的一个或多个另外的结合结构域。

在一些实施方案中，所述一个或多个另外的结合结构域可操作地连接至所述第一或第二假Fab部分的N末端。

在一些实施方案中，所述一个或多个另外的结合结构域可操作地连接至所述第一或第二Fab部分的N末端。

在另一方面，本公开文本提供了一种多特异性结合蛋白，所述多特异性结合蛋白包含形成至少两个抗原结合位点的四条多肽链，其中

(a)第一多肽包含由下式表示的结构：

VLa-L1-VLX[I]

(b)第二多肽包含由下式表示的结构：

VHa-L2-VHX-FC1[II]

(c)第三多肽包含由下式表示的结构：

VLb-CL[III]

(d)第四多肽包含由下式表示的结构：

VHb-CH1-FC2[IV]

其中：

VLa是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；

VLb是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；

VHa是第一免疫球蛋白重链可变结构域；

VHb是第二免疫球蛋白重链可变结构域；

VLX是稳定敲除轻链可变结构域；

VHX是稳定敲除重链可变结构域；

CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；

CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；

FC1和FC2是包含免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域的Fc结构域；并且

L1和L2是可以独立地相同或不同的氨基酸接头；

其中

(1)所述第一VL结构域(VLa)与第一VH结构域(VHa)配对以形成结合靶抗原A的第一功能性抗原结合位点；

(2)所述第二VL结构域(VLb)与第二VH结构域(VHb)配对以形成结合靶抗原B的第二功能性抗原结合位点；

(3)所述稳定敲除VL结构域(VLX)与所述稳定敲除VH结构域(VHX)配对以形成二硫键稳定的敲除(dsKO)结构域；

其中所述dsKO结构域包含(i)消除其与靶抗原的结合的一个或多个失活突变；和(ii)一个或多个工程化链间二硫键。

在另一方面，本公开文本提供了一种抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含形成四个抗原结合位点的六条多肽链，其中

(a)所述第一和第二多肽包含由下式表示的结构：

VLa-L1-VLX[I]和[II]

(b)所述第三和第四多肽包含由下式表示的结构：

VLb-CL[III]和[IV]

(c)所述第五多肽包含由下式表示的结构：

VHa-L2-VHX-L3-VHb-CH1-FC1[V]

(d)所述第六多肽包含由下式表示的结构：

VHa-L2-VHX-L3-VHb-CH1-FC2[VI]

其中：

VLa是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；

VLb是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；

VHa是第一免疫球蛋白重链可变结构域；

VHb是第二免疫球蛋白重链可变结构域；

VLX是稳定敲除轻链可变结构域；

VHX是稳定敲除重链可变结构域；

CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；

CH1是免疫球蛋白重链恒定结构域；

L1、L2和L3是氨基酸接头，

其中

(1)所述第一VL结构域(VLa)与所述第一VH结构域(VHa)配对以形成结合靶抗原A的第一功能性抗原结合位点；

(2)所述第二VL结构域(VLb)与所述第二VH结构域(VHb)配对以形成结合靶抗原B的第二功能性抗原结合位点；

(a)所述第一和第二多肽包含由下式表示的结构：

VLa-L1-VLX[I]和[II]

(b)所述第三和第四多肽包含由下式表示的结构：

VLb-CL[III]和[IV]

(c)所述第五多肽包含由下式表示的结构：

VHb-CH1-L3-VHa-L2-VHX-FC1[V]

(d)所述第六多肽包含由下式表示的结构：

VHb-CH1-L3-VHa-L2-VHX-FC2[VI]

其中：

VLa是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；

VLb是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；

VHa是第一免疫球蛋白重链可变结构域；

VHb是第二免疫球蛋白重链可变结构域；

VLX是稳定敲除轻链可变结构域；

VHX是稳定敲除重链可变结构域；

CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；

CH1是免疫球蛋白重链恒定结构域；

L1、L2和L3是氨基酸接头，

其中

其中所述dsKO结构域包含(i)消除其与靶抗原的结合的一个或多个失活突变；(ii)一个或多个工程化链间二硫键。

(a)所述第一和第二多肽包含由下式表示的结构：

VLa-L1-VLX[I]和[II]

(b)所述第三和第四多肽包含由下式表示的结构：

VLb-CL[III]和[IV]

(c)所述第五多肽包含由下式表示的结构：

VHa-L2-VHX-L3-VHa-L4-VHX-FC1[V]

(d)所述第六多肽包含由下式表示的结构：

VHb-CH1-L5-VHb-CH1-FC2[VI]

其中：

VLa是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；

VLb是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；

VHa是第一免疫球蛋白重链可变结构域；

VHb是第二免疫球蛋白重链可变结构域；

VLX是稳定敲除轻链可变结构域；

VHX是稳定敲除重链可变结构域；

CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；

CH1是免疫球蛋白重链恒定结构域；

L1、L2、L3、L4和L5是氨基酸接头，

其中

在另一方面，本公开文本提供了一种抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含形成三个抗原结合位点的四条多肽链，其中：

(a)所述多肽包含由下式表示的结构：

VLa-L1-VLX[I]

(b)所述第二多肽包含由下式表示的结构：

VHa-L2-VHX-FC1[II]

(c)所述第三多肽包含由下式表示的结构：

VLb-L3-VLc-L4-CL[III]

(d)所述第四多肽包含由下式表示的结构：

VHc-L5-VHb-L6-CH1-FC2[IV]

其中：

VLa是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；

VLb是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；

VLc是第三免疫球蛋白轻链可变结构域；

VHa是第一免疫球蛋白重链可变结构域；

VHb是第二免疫球蛋白重链可变结构域；

VHc是第三免疫球蛋白重链可变结构域；

CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；

CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；

VLX是第一稳定敲除轻链可变结构域；

VHX是第一稳定敲除重链可变结构域；

L1、L2、L3、L4、L5和L6是氨基酸接头，

其中

(3)所述第三VL结构域(VLc)与所述第三VH结构域(VHc)配对以形成结合靶抗原C的第一功能性抗原结合位点；

(4)所述式III的多肽和所述式IV的多肽形成交叉轻链-重链对(CODV)；

(5)所述稳定敲除VL结构域(VLX)与所述稳定敲除VH结构域(VHX)配对以形成二硫键稳定的敲除(dsKO)结构域；

(a)所述多肽包含由下式表示的结构：

VLa-L1-VLX[I]

(b)所述第二多肽包含由下式表示的结构：

VHa-L2-VHX-FC1[II]

(c)所述第三多肽包含由下式表示的结构：

VLb-L3-VLc-L4-CL[III]

(d)所述第四多肽包含由下式表示的结构：

VHc-L5-VHb-L6-CH1-FC2[IV]

其中：

VLa是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；

VLb是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；

VLc是第三免疫球蛋白轻链可变结构域；

VHa是第一免疫球蛋白重链可变结构域；

VHb是第二免疫球蛋白重链可变结构域；

VHc是第三免疫球蛋白重链可变结构域；

CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；

CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；

VLX是第一稳定敲除轻链可变结构域；

VHX是第一稳定敲除重链可变结构域；

L1、L2、L3、L4、L5和L6是氨基酸接头，

其中

其中所述dsKO结构域包含(i)消除其与参考Fab分子的靶抗原的结合的一个或多个失活突变；和(ii)一个或多个工程化链间二硫键。

在其他方面，一些实施方案涉及本文所述的所有结合蛋白，其中所述dsKO结构域包含(i)相对于野生型结构域，消除其与靶抗原的结合的一个或多个失活突变；和(ii)相对于参考Fab分子，赋予所述假Fab的增强的热稳定性(Tm)的一个或多个工程化链间二硫键，其中除了在假Fab分子中，所述参考Fab分子的CH1和CL结构域被VHX和VLX结构域替代以外，所述参考Fab分子与所述假Fab分子相同。在那些实施方案中，通过本领域已知的方法(例如但不限于表面等离子体共振)测量与靶抗原的结合，并且通过本领域已知的方法(例如但不限于差示扫描量热法)测量热稳定性。

在一些实施方案中，所述FC1和FC2结构域包含一个或多个杵臼结构(KIH)突变，其中所述突变促进所述多肽的Fc结构域异二聚化。

在一些实施方案中，FC1或FC2中的一个包含第一CH3结构域，所述第一CH3结构域包含S354C和T366W突变中的一个或两个，并且FC1或FC2中的另一个包含第二CH3结构域，所述第二CH3结构域包含Y349C、T366S、L368A和Y407V突变中的一个或两个，其中所述突变促进Fc结构域异二聚化。

在一些实施方案中，所述FC1或FC2结构域包含H435R和/或Y436F突变。

在一些实施方案中，所述抗原结合位点衍生自不同的抗体。

在一些实施方案中，所述抗原结合位点衍生自相同的抗体。

在一些实施方案中，所述工程化链间二硫键是VH44C-VL100C。

在一些实施方案中，所述工程化链间二硫键是VH105C-VL43C。

在一些实施方案中，所述VLX/VHX对选自：

(i)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VLX，和

包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VHX；

ii)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VLX，和

包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的VHX；以及

iii)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VLX，和

包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的VHX。

在另一方面，本公开文本提供了稳定敲除结构域用于减少多特异性结合蛋白中的重链-轻链错误配对的用途，其中所述稳定敲除结构域包含VHX和VLX结构域，所述VHX和VLX结构域包含(3)消除其与所述靶抗原的结合的一个或多个失活突变；和(4)相对于参考Fab分子，赋予所述假Fab的增强的热稳定性(Tm)的一个或多个工程化链间二硫键，其中除了在假Fab分子中，所述参考Fab分子的CH1和CL结构域被VHX和VLX结构域替代以外，所述参考Fab分子与所述假Fab分子相同。

在一些实施方案中，所述工程化链间二硫键是VH44C-VL100C。

在一些实施方案中，所述工程化链间二硫键是VH105C-VL43C。

在一些实施方案中，所述VLX/VHX对选自：

(i)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VLX，和

包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VHX；

ii)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VLX，和

包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的VHX；以及

iii)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VLX，和

包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的VHX。

在一些实施方案中，所述假Fab缺少所述CH1和CL结构域。

在一些实施方案中，提供了一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含编码一种或多种结合蛋白的核苷酸序列。在一些实施方案中，提供了成套分离的核酸分子，所述成套分离的核酸分子包含编码一种或多种结合蛋白的一种或多种核苷酸序列。

在一些实施方案中，提供了一种包含所述核酸分子的表达载体。在一些实施方案中，提供了成套包含所述成套核酸分子的表达载体。

在一些实施方案中，提供了一种分离的宿主细胞，所述分离的宿主细胞包含所述核酸分子或所述表达载体。在一些实施方案中，提供了一种分离的宿主细胞，所述分离的宿主细胞包含所述成套核酸分子或所述成套表达载体。

在一些实施方案中，提供了一种产生所述结合蛋白的方法，所述方法包括在使得所述结合蛋白被表达的条件下培养所述宿主细胞；以及从所述宿主细胞中纯化所述结合蛋白。

在一些实施方案中，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载体和治疗有效量的所述多特异性结合蛋白。在一些实施方案中，提供了用作药物的多特异性结合蛋白。

在一些实施方案中，提供了一种治疗其中抗原活性是有害的障碍的方法，所述方法包括向有需要的受试者给予有效量的多特异性结合蛋白。

上述发明内容是非限制性的，并且根据本发明的以下具体实施方式和权利要求，所公开的组合物和方法的其他特征和优点将是清楚的。

序列说明

SEQ ID NO:1：曲妥珠单抗的可变轻链序列。

SEQ ID NO:2：曲妥珠单抗的可变重链序列。

SEQ ID NO:3：曲妥珠单抗ko变体1的可变重链序列。

SEQ ID NO:4：曲妥珠单抗ko变体2的可变重链序列。

SEQ ID NO:5：曲妥珠单抗ko变体3的可变重链序列。

SEQ ID NO:6：抗IL13--VL-G4S-抗Her2-(曲妥珠单抗-Q100C)-VL。

SEQ ID NO:7：抗IL13--VH-G4S-抗Her2-(曲妥珠单抗-G44C)-VH-Fc-huIgG1。

SEQ ID NO:8：抗IL13-VL-(G4S)2-抗Her2-(曲妥珠单抗-Q100C)-VL。

SEQ ID NO:9：抗IL13-VH-(G4S)2-抗Her2-(曲妥珠单抗-G44C)-VH-Fc-huIgG1。

SEQ ID NO:10：抗IL13-VL3-IGK。

SEQ ID NO:11：抗IL13-VH2-IGHG1。

SEQ ID NO:12：抗TNFα-VL-G4S-抗Her2-(曲妥珠单抗-Q100C)-VL。

SEQ ID NO:13：抗TNFα-VH-G4S-抗Her2-(曲妥珠单抗-G44C)-VH-Fc-huIgG1。

SEQ ID NO:14：抗TNFα-VL-(G4S)2-抗Her2-(曲妥珠单抗-Q100C)-VL。

SEQ ID NO:15：抗TNFα-VH-(G4S)2-抗Her2-(曲妥珠单抗-G44C)-VH-Fc-huIgG1。

SEQ ID NO:16：抗TNFa-VL-huIGKC。

SEQ ID NO:17：抗TNFa-VH-huIgG1。

SEQ ID NO:18：抗IL6R-VL-G4S-抗Her2-(曲妥珠单抗-Q100C)-VL。

SEQ ID NO:19：抗IL6R-VH-G4S-抗Her2-(曲妥珠单抗-G44C)-VH-Fc-huIgG1。

SEQ ID NO:20：抗IL6R-VL-(G4S)2-抗Her2-(曲妥珠单抗-Q100C)-VL

SEQ ID NO:21：抗IL6R-VH-(G4S)2-抗Her2-(曲妥珠单抗-G44C)-VH-Fc-huIgG1。

SEQ ID NO:22：抗IL6R-VL-huIGKC。

SEQ ID NO:23：抗IL6R-VH-huIgG1。

SEQ ID NO:24：抗CTLA4-VL-G4S-抗Her2-(曲妥珠单抗-Q100C)-VL。

SEQ ID NO:25：抗CTLA4-VH-G4S-抗Her2-(曲妥珠单抗-G44C)-VH-Fc-huIgG1。

SEQ ID NO:26：抗CTLA4-VL-(G4S)2-抗Her2-(曲妥珠单抗-Q100C)-VL。

SEQ ID NO:27：抗CTLA4-VH-(G4S)2-抗Her2-(曲妥珠单抗-G44C)-VH-Fc-huIgG1。

SEQ ID NO:28：抗CTLA4-VL-huIGKC。

SEQ ID NO:29：抗CTLA4-VH-huIgG1。

SEQ ID NO:30：抗PD1-VL-G4S-抗Her2-(曲妥珠单抗-Q100C)-VL。

SEQ ID NO:31：抗PD1-VH-G4S-抗Her2-(曲妥珠单抗-G44C)-VH-Fc-huIgG1。

SEQ ID NO:32：抗PD1-VL-(G4S)2-抗Her2-(曲妥珠单抗-Q100C)-VL

SEQ ID NO:33：抗PD1-VH-(G4S)2-抗Her2-(曲妥珠单抗-G44C)-VH-Fc-huIgG1。

SEQ ID NO:34：抗huPD-1-VL-huIGKC。

SEQ ID NO:35：抗huPD-1-VH-huIgG1。

SEQ ID NO:36：抗IL4-VL-G4S-抗Her2-(曲妥珠单抗-Q100C)-VL。

SEQ ID NO:37：抗IL4-VH-G4S-抗Her2-(曲妥珠单抗-G44C)-VH-Fc-huIgG1。

SEQ ID NO:38：抗IL4-VL-(G4S)2-抗Her2-(曲妥珠单抗-Q100C)-VL。

SEQ ID NO:39：抗IL4-VH-(G4S)2-抗Her2-(曲妥珠单抗-G44C)-VH-Fc-huIgG1。

SEQ ID NO:40：抗IL4-VL1-IGKC。

SEQ ID NO:41：抗IL4-VH1-IgG1。

SEQ ID NO:42：抗PD1-VL-(G4S)2-抗Her2-(曲妥珠单抗-Q100C)-VL。

SEQ ID NO:43：抗PD1-VH-(G4S)2-抗Her2-(曲妥珠单抗-G44C-Var2)-VH-Fc-huIgG1。

SEQ ID NO:44：抗CTLA4-VL-(G4S)2-抗Her2-(曲妥珠单抗-Q100C)-VL。

SEQ ID NO:45：抗CTLA4-VH-(G4S)2-抗Her2-(曲妥珠单抗-G44C-Var2)-VH-Fc-huIgG1。

SEQ ID NO:46：抗IL4-VL-(G4S)2-抗Her2-(曲妥珠单抗-Q100C)-VL。

SEQ ID NO:47：抗IL4-VH-(G4S)2-抗Her2-(曲妥珠单抗-G44C-Var2)-VH-Fc-huIgG1。

SEQ ID NO:48：抗IL13-VL-(G4S)2-抗Her2-(曲妥珠单抗-Q100C)-VL。

SEQ ID NO:49：抗IL13-VH-(G4S)2-抗Her2-(曲妥珠单抗-G44C-Var2)-VH-DKTHT-His6。

SEQ ID NO:50：抗IL13-VL-(G4S)2-抗Her2-(曲妥珠单抗-Q100C)-VL。

SEQ ID NO:51：抗IL13-VH-(G4S)2-抗Her2-(曲妥珠单抗-VH_Var1-G44C)-VH-Fc-huIgG1。

SEQ ID NO:52：抗IL4-VL-(G4S)2-抗Her2-(曲妥珠单抗-Q100C)-VL。

SEQ ID NO:53：抗IL4-VH-(G4S)2-抗Her2-(曲妥珠单抗-G44C-Var2)-VH-Fc-huIgG1(杵)。

SEQ ID NO:54：抗PD1-huIGKC。

SEQ ID NO:55：抗PD1-VH-huIgG1(臼-RF)。

SEQ ID NO:56：抗IL13-VL-(G4S)2-抗Her2-(曲妥珠单抗-Q100C)-VL。

SEQ ID NO:57：抗IL13-VH-(G4S)2-抗Her2-(曲妥珠单抗-G44C-Var2)-VH-Fc-huIgG1(杵)。

SEQ ID NO:58：抗PD1-VL-huIGKC。

SEQ ID NO:59：抗PD1-VH-huIgG1(臼-RF)。

SEQ ID NO:60：抗PD1-VL-(G4S)2-抗Her2-(曲妥珠单抗-Q100C)-VL。

SEQ ID NO:61：抗PD1-VH-(G4S)2-抗Her2-(曲妥珠单抗-G44C-Var2)-VH-Fc-huIgG1(杵)。

SEQ ID NO:62：抗IL13-VL huIGKC。

SEQ ID NO:63：抗IL13-VH-huIgG1(臼-RF)。

SEQ ID NO:64：抗CTLA4-VL-(G4S)2-抗Her2-(曲妥珠单抗-Q100C)-VL。

SEQ ID NO:65：抗CTLA4-VH-(G4S)2-抗Her2-(曲妥珠单抗-G44C-Var2)-VH-Fc-huIgG1(杵)。

SEQ ID NO:66：抗PD1-VL-huIGKC。

SEQ ID NO:67：抗PD1-VH-huIgG1(臼-RF)。

SEQ ID NO:68：抗IL4-VL-(G4S)2-抗Her2-(曲妥珠单抗-Q100C)-VL。

SEQ ID NO:69：抗IL4-VH-(G4S)2-抗Her2-(曲妥珠单抗-G44C-Var2)-VH-Fc-huIgG1(杵)。

SEQ ID NO:70：抗IL13-VL huIGKC。

SEQ ID NO:71：抗IL13-VH-huIgG1(臼-RF)。

SEQ ID NO:72：抗PD1-VL-(G4S)2-抗Her2-(曲妥珠单抗-Q100C)-VL。

SEQ ID NO:73：抗PD1-VH-(G4S)2-抗Her2-(曲妥珠单抗-G44C-Var2)-VH-Fc-huIgG1(杵)。

SEQ ID NO:74：抗PD1-VL-huIGKC。

SEQ ID NO:75：抗PD1-VH-huIgG1(臼-RF)。

SEQ ID NO:76：ds ko曲妥珠单抗的可变轻链序列。

SEQ ID NO:77：ds ko曲妥珠单抗变体1的可变重链序列。

SEQ ID NO:78：ds ko曲妥珠单抗变体2的可变重链序列。

SEQ ID NO:79：ds ko曲妥珠单抗变体3的可变重链序列。

SEQ ID NO:80：抗TCRα/βx抗CD123野生型

SEQ ID NO:81：抗TCRα/βx抗CD123-dsTrasKO2

SEQ ID NO:82：抗TCRα/β-dsTrasKO2 x抗CD123

SEQ ID NO:83：抗CD3εx抗CD123野生型

SEQ ID NO:84：抗CD3εx抗CD123-dsTrasKO2

SEQ ID NO:85：抗CD3ε-dsTrasKO2 x抗CD123

SEQ ID NO:86：抗CD3εx抗CD123野生型

SEQ ID NO:87：抗CD3εx抗CD123-dsTrasKO2

SEQ ID NO:88：抗CD3ε-dsTrasKO2 x抗CD123

SEQ ID NO:89：抗TCRα/βx抗TNP阴性对照-野生型

SEQ ID NO:90：抗TCRα/βx抗TNP-dsTrasKO2阴性对照

SEQ ID NO:91：抗TCRα/β-dsTrasKO2 x抗TNP阴性对照

SEQ ID NO:92：抗TNP x抗CD123阴性对照-野生型

SEQ ID NO:93：抗TNP x抗CD123-dsTrasKO2阴性对照

SEQ ID NO:94：抗TNP-dsTrasKO2 x抗CD123阴性对照

SEQ ID NO:95：抗CD3εx抗TNP阴性对照-野生型

SEQ ID NO:96：抗CD3εx抗TNP-dsTrasKO2阴性对照

SEQ ID NO:97：抗CD3ε-dsTrasKO2 x抗TNP阴性对照

SEQ ID NO:98：抗CD3εx抗TNP阴性对照-野生型

SEQ ID NO:99：抗CD3εx抗TNP-dsTrasKO2阴性对照

SEQ ID NO:100：抗CD3ε-dsTrasKO2 x抗TNP阴性对照

附图说明

从以下说明性实施方案的详细描述结合附图将更充分地理解本发明的前述和其他特征和优点。所述专利或申请文件含有制作的至少一张彩色附图。在请求并支付必要的费用后，官方将会提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开物的副本。

图1A-图1B示意性地描绘了包含其中CH1/CL对被二硫键稳定的敲除结构域(dsKO)替代的假Fab片段的二聚体双特异性串联分子。图1A中描绘了串联-(Fv-Fab x Fv-假Fab)分子，并且图1B中描绘了串联-(Fv-假Fab x Fv-Fab)分子。

图2示意性地描绘了示例性二聚体双特异性IgG分子((Fv-假Fab)x(Fv-Fab)-Fc))。二硫键稳定的敲除结构域(dsKO)替代IgG分子的一个Fab臂的CH/CL结构域。肽接头(例如，G4S(SEQ ID NO:102)或(G4S)2(SEQ ID NO:103))将第一抗原结合位点(Fv)连接至dsKO结构域以形成结合抗原靶标A的假Fab部分。具有杵臼结构(KIH)突变或RF突变的Fc异二聚化结构域将假Fab部分与结合抗原靶标B的第二Fab结合臂连接。

图3A-图3C示意性地描绘了包含CH1/CL的曲妥珠单抗WT VH/VL替代的抗体构建体的单体级分(图3A)与包含CH1/CL的二硫键稳定的曲妥珠单抗敲除(“dsTrastKO”)VH/VL替代的抗体构建体的单体级分(图3B)的比较，以及两种构建体的热稳定性(图3C)。

图4示意性地描绘了曲妥珠单抗(绿色)与HER2(棕色)结合的PDB结构1N8Z。以黄色注解消除与HER2的结合的四个失活突变的位置(R50、R59、Y33和Y103)。

图5A-图5C以图表方式描绘了证明dsTrastuKO变体1-3不再结合HER2的结合实验的结果。

图6A-图6B描绘了在实验中用作某些对照的假IgG和假Fab构建体。

图7A-图7D描绘了根据某些示例性实施方案的代表性的双特异性形式和纯化结果。图7A示出了IgG支架内单独结构域的排列。Fv1(抗IL4)经由(G4S)2接头(SEQ ID NO:103)与dsTrasKO2的VL/VH融合。Fv2(抗IL13)保留野生型构型。图7B示出了使用4％-12％Bis/Tris MOPS十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的抗体的还原形式(一条轻链和一条重链)和氧化形式。使用分析型尺寸排阻色谱在图7C中示出产物的纯度。使用配备有Jet Stream双ESI接口和Agilent 1290/1260Infinity LC***的Agilent 6540超高清(UHD)Q-TOF，通过完整质量分析来验证分子完整性(图7D)。

图8示出了分析型疏水性相互作用色谱(HIC)结果，表明dsTrasKO2双特异性构建体正确配对并且不含有出乎意料的种类。

图9示意性地描绘了具有图6A的超微结构的假Fab IL13-dsTrasKO2构建体的晶体结构。所述结构是在

下解出。所述结构显示了TrasKO2-IL13假Fab(浅灰色)和Fab抗IL13(深灰色)的IL13-VH/VL结构域的重叠。

图10A-10B示意性地描绘了包含其中CH1/CL对被二硫键稳定的敲除结构域(dsKO)替代的假Fab片段的二聚体双特异性串联分子。图10A中描绘了串联-(Fv-Fab x Fv-假Fab)-IgG分子，并且图10B中描绘了串联-(Fv-假Fab xFv-Fab)-IgG分子。

图11A-11B示意性地描绘了包含其中CH1/CL对被二硫键稳定的敲除结构域(dsKO)替代的假Fab片段的二聚体双特异性串联分子。图11A(具有杵臼结构(KIH)突变和RF突变的Fc异二聚化结构域)和图11B(仅具有RF突变的Fc异二聚化结构域)中描绘了(((Fv-假Fab)[HC]-(Fv-假Fab))x((Fv-Fab)[HC]-(Fv-Fab)))-Fc分子。

图12A-图12D描绘了代表性的双特异性串联IgG设计，其中包含Fv1结构域(具有针对第一靶抗原A(即，GITR)的结合特异性)和dsTrasKO结构域的第一假Fab被附加至常规IgG抗体(泊加珠单抗(Pogalizumab))的每个Fv2结构域(具有针对第二靶抗原B(即，Ox40)的结合特异性)。图12A示出了IgG支架内单独结构域的排列。Fv1(抗GITR)经由(G4S)2接头(SEQID NO:103)与dsTrasKO2的VL/VH融合。Fv2(抗Ox40)保留野生型构型。Fv1-dsTrasKO2经由(G4S)2接头(SEQ ID NO:103)与Fv2-Ck/CH1融合。图12B示出了使用4％-12％Bis/TrisMOPS十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的抗体的还原形式(两条轻链和一条重链)和氧化形式。使用分析型尺寸排阻色谱在图12C中示出产物的纯度。使用配备有JetStream双ESI接口和Agilent 1290/1260Infinity LC***的Agilent 6540超高清(UHD)Q-TOF，通过完整质量分析来验证分子完整性(图12D)。

图13A-图13D描绘了代表性的三特异性CODV IgG设计，其中包含Fv3结构域(具有针对第一靶抗原A(即，CD137)的结合特异性)和dsTrasKO结构域的第一假Fab与CODV臂(具有针对第二靶抗原B(即，Ox40)的结合特异性(Fv1)和针对第三靶抗原C(即，PD1)的结合特异性(Fv2))配对。图13A示出了CODV IgG支架内单独结构域的排列。CODV臂上的Fv1(抗Ox40)和Fv2(抗PD1)与野生型λ结构域和CH1结构域融合。Fab臂上的Fv3(抗CD137)经由(G4S)2接头(SEQ ID NO:103)与dsTrasKO2的VL/VH融合。图13B示出了使用4％-12％Bis/Tris MOPS十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的CODV抗体的还原形式(两条轻链和两条重链)和氧化形式。使用分析型尺寸排阻色谱在图13C中示出产物的纯度。使用配备有Jet Stream双ESI接口和Agilent 1290/1260Infinity LC***的Agilent 6540超高清(UHD)Q-TOF，通过完整质量分析来验证分子完整性(图13D)。

图14描绘了用于确保与dsTrasKO2敲除双特异性分子的正确轻链配对的两步纯化过程的示意图。

图15A-图15B描绘了人panT细胞针对与双特异性抗体抗CD3εx抗CD123共孵育的THP-1靶细胞的细胞毒性测定。图15A对应于ID编号为33、34和35的双特异性抗体以及阴性对照45和46。图15B对应于ID编号为36、37和38的双特异性抗体以及阴性对照47和48。将T效应细胞和CFSE标记的THP-1靶细胞以10:1的效应细胞与靶细胞比率接种，并且与相应双特异性分子的连续稀释液(10nM-0nM)在37℃下共孵育20小时。将死细胞用7-AAD染色并通过流式细胞术测量。基于死THP-1靶细胞(7-AAD/CFSE双阳性)的百分比计算细胞毒性活性。数据示出了作为两名代表性健康供体的平均值的死靶细胞[％]与双特异性分子浓度[pM]的关系。

具体实施方式

I.定义

为了可以更容易理解本公开文本，如下定义所选术语。

如本文所用，二十种常规氨基酸及其缩写遵循常规用法。二十种常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)；非天然氨基酸(如a-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其他非常规氨基酸)也可以是本发明的结合蛋白的多肽链的合适组分。非常规氨基酸的例子包括：4-羟基脯氨酸、y-羧基谷氨酸、c-N,N,N-三甲基赖氨酸、c-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、u-N-甲基精氨酸以及其他类似的氨基酸和亚氨基酸(例如，4-羟基脯氨酸)。在本文所用的多肽表示法中，根据标准用法和惯例，左手方向是氨基末端方向并且右手方向是羧基末端方向。可以基于常见侧链特性将天然存在的残基分为多个类别(参见表1)。

表1.

保守氨基酸取代可以涉及这些类别中一个类别的成员与同一类别中另一个成员的交换。保守氨基酸取代可以涵盖非天然存在的氨基酸残基，它们通常通过化学肽合成而不是通过生物***合成而掺入。这些包括拟肽以及氨基酸残基的其他反转(reversed)或倒转(inverted)形式。非保守取代可以涉及这些类别中一个类别的成员与来自另一个类别的成员的交换。

如本文所用，术语“突变”或“突变的”是指通过缺失、***和/或取代一个或多个氨基酸而对氨基酸序列的改变。突变是关于给定序列(例如，特异性地识别表位1的VL1和/或VH1对的氨基酸序列)引入的。术语“非突变的”是指展现出功能特性的任何氨基酸序列，例如仍然显示出结合特性的任何序列。将此阐明如下：将VH1/VL1突变使得其不特异性地结合表位。此VH1/VL1的非突变的形式仍然与表位1特异性地结合。因此，与任何表位结合的抗体的每个VH/VL结构域均适合于突变以用作本发明的支架蛋白。

如本文所用，术语“变体”是指与衍生出它的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:1或SEQID NO:2)至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。使用Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,5873-5877,1993的数学算法来完成两个序列之间的同一性百分比的确定。这样的算法被并入Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215,403-410的BLASTN和BLASTP程序中。为了获得用于比较目的的空位化比对，利用空位化BLAST，如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25,3389-3402中所述。当利用BLAST和空位化BLAST程序时，使用相应程序的默认参数。可替代地，也可以将变体定义为具有多达20、15、10、5、4、3、2或1个氨基酸取代，特别是保守氨基酸取代。保守取代是本领域中熟知的(参见例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company)。在上表1中给出了氨基酸的物理和化学特性的概述。在特定实施方案中，保守取代是用共同具有根据表1(即，第1栏和/或第2栏)的至少一种特性的氨基酸进行的取代。术语“变体”还包括片段。片段具有总计多达20、15、10、5、4、3、2或1个氨基酸的N末端和/或C末端缺失。另外地或可替代地，变体可以被修饰，例如通过总计多达50、40、30、20、10、5、4、3、2或1个氨基酸的N末端和/或C末端氨基酸添加来修饰。

如本文所用，术语“抗原”或“靶抗原”或“抗原靶标”是指分子或分子的一部分，所述分子或分子的一部分能够被本发明的结合蛋白特异性地结合，并且另外能够用于动物中以产生能够与该抗原的表位特异性地结合的抗体。靶抗原可具有一个或多个表位。关于由结合蛋白识别的每种靶抗原，结合蛋白能够与识别所述靶抗原的完整抗体竞争。

如本文所用，术语“结合蛋白”或“结合多肽”是指含有负责与感兴趣的靶抗原(例如，人抗原)选择性地结合的至少一个结合位点的多肽(例如，抗体或其片段)。示例性结合位点包括但不限于抗体可变结构域、受体的配体结合位点或配体的受体结合位点。在某些方面，结合多肽包含多个(例如，两个、三个、四个或更多个)结合位点。在某些方面，结合蛋白不是治疗性酶。

如本文所用，术语“Her2”或“HER2”是指人表皮生长因子受体2，其是表皮生长因子受体家族的成员。

如本文所用，术语“结合蛋白”是指能够与至少一种抗原特异性地结合的非天然存在的或重组的或工程化的分子。在特定实施方案中，结合蛋白包含与抗原特异性地结合的至少一个VH/VL对。

通过在单个宿主细胞中共表达两条轻链和两条重链产生双特异性结合蛋白可能具有很高的挑战性，因为所需双特异性结合蛋白的产量低且难以去除紧密相关的错误配对的结合蛋白污染物(Suresh等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83,7989-7993,1986)。这是因为重链形成同二聚体以及所需异二聚体，在本文中称为“重链配对问题”。另外，轻链可能与非同源重链错误配对，在本文中称为“轻链配对问题”。因此，除了所需双特异性结合蛋白以外，两种抗体的共表达还可能产生多达九种不需要的种类。

如本文所用，“异二聚化结构域”是指双特异性或多特异性结合蛋白的亚基，所述亚基促进、引导或迫使轻链及其同源重链正确组装以在防止相应轻链或重链错误配对的同时产生所需蛋白质。

如本文所用，术语“异二聚化Fc”或“异二聚化Fc的功能片段”是指恒定结构域(例如，CH2-CH3或CH2-CH3-CH4)的突变体形式，所述突变体形式关于天然存在的Fc部分是突变的，原因在于其不再形成同二聚体，而是与对应的突变的Fc部分形成异二聚体。因此，所述术语是指形成异二聚体的两条链的一部分。几个此类对是本领域中已知的并且包含例如杵臼结构(KIH)变体或EV-RWT变体。

Rigdeway和同事通过以下方式产生有利于异二聚体组装的CH3界面：用较大侧链替代一个CH3界面上的小侧链以产生杵，并且用较小侧链替代另一个CH3结构域上的大侧链以产生臼。测试此类变体展示出优先的异二聚化。通过噬菌体展示进一步扩展这种原始杵臼结构突变以鉴定另外的合适组合，所述组合用于产生双特异性IgG抗体，从而测试允许二硫键形成的另外的取代。杵臼结构变体进一步描述于美国专利号5,732,168和美国专利号8,216,805中，将所述专利通过引用并入本文。因此，在一个实施方案中，一个FC结构域或异二聚化结构域的CH3结构域含有突变Y349C、T366S、L368A和Y407V，并且另一个FC结构域或异二聚化结构域的CH3结构域含有突变S354C和T366W(氨基酸位置通过参考IgG1序列来指示)。

如本文所用，术语“同二聚化结构域”是指介导两个相似结构域(例如，两条重链)的同二聚化的结构域。重链配对是由恒定区的最后一个结构域(即，IgG分子中的CH3)介导的，这形成高亲和力同二聚体复合物(KD为约10pM)。另外的相互作用存在于负责重链组装后形成的两条重链的共价连接的铰链区中。CH3同二聚体中的相互作用涉及CH3-CH3界面处的大约16个残基，如针对人γ1CH3所示，其中由界面中心处的6个残基(T366、L368、F405、Y407和K409)形成的补丁(patch)强烈促进稳定性。同二聚化结构域包括但不限于Fc区和其效应子修饰的变体以及Fc区和其效应子修饰的变体中任一者的片段、CH2结构域或其片段、CH3结构域或其片段、CH4结构域或其片段等。

天然存在的抗体通常包含四聚体。每个这种四聚体通常由两个相同的多肽链对构成，每一对具有一条全长“轻”链(通常具有约25kDa的分子量)和一条全长“重”链(通常具有约50-70kDa的分子量)。如本文所用，术语“重链”和“轻链”是指具有足以赋予对靶抗原的特异性的可变结构域序列的任何免疫球蛋白多肽。每条轻链和重链的氨基末端部分通常包括约100至110个或更多个氨基酸的可变结构域，所述可变结构域通常负责抗原识别。每条链的羧基末端部分通常定义负责效应子功能的恒定结构域。因此，在天然存在的抗体中，全长重链IgG免疫球蛋白多肽包括一个可变结构域(VH)和三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)，其中所述VH结构域位于多肽的氨基末端并且所述CH3结构域位于羧基末端，并且全长轻链免疫球蛋白多肽包括一个可变结构域(VL)和一个恒定结构域(CL)，其中所述VL结构域位于多肽的氨基末端并且所述CL结构域位于羧基末端。

通常将人轻链分类为κ和λ轻链，并且通常将人重链分类为μ、δ、γ、α或ε，并且将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有几个亚类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有多个亚类，包括但不限于IgM1和IgM2。IgA被类似地细分为多个亚类，包括但不限于IgA1和IgA2。在全长轻链和重链内，可变结构域和恒定结构域通常通过约12个或更多个氨基酸的“J”区接合，并且重链还包括约10个或更多个氨基酸的“D”区。参见例如，Fundamental Immunology(Paul,W.编辑,Raven Press,第2版,1989)，将所述文献出于所有目的通过引用以其整体并入。每个轻链/重链对的可变区通常形成抗原结合位点。天然存在的抗体的可变结构域通常展现出通过三个高变区(也称为互补决定区或CDR)接合的相对保守的框架区(FR)的相同总体结构。来自每一对的两条链的CDR通常通过框架区对齐，这可以使得能够结合至特定表位。从氨基末端到羧基末端，轻链和重链可变结构域二者通常均包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。

如本文所用，术语“CDR组”是指存在于能够结合抗原的单个可变区中的一组三个CDR。这些CDR的确切边界已经根据不同***以不同方式加以定义。由Kabat描述的***(Kabat等人,SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST(美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)，贝塞斯达，马里兰州)(1987)和(1991))不仅提供了适用于抗体的任何可变区的明确残基编号***，还提供了定义三个CDR的准确残基边界。这些CDR可以被称为Kabat CDR。Chothia和同事(Chothia和Lesk,1987,J.Affol.Biol.196:901-17；Chothia等人,1989,Nature 342:877-83)发现，虽然在氨基酸序列水平上具有显著多样性，但是Kabat CDR内的某些子部分采用几乎相同的肽骨架构象。这些子部分被命名为L1、L2和L3或者H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别指定轻链区和重链区。这些区域可以被称为Chothia CDR，它们具有与Kabat CDR重叠的边界。与Kabat CDR重叠的定义CDR的其他边界已经描述于Padlan,1995,FASEB J.9:13339；MacCallum,1996,J.Mol.Biol.262(5):732-45；以及Lefranc,2003,Dev.Comp.Immunol.27:55-77中。仍有其他CDR边界定义可能不严格遵循本文中的一个***，但仍然会与Kabat CDR重叠，不过鉴于特定残基或残基组或甚至整个CDR不显著影响抗原结合的预测或实验发现，所述其他CDR边界可能会被缩短或延长。本文所用的方法可以利用根据这些***中的任一个***定义的CDR，但是某些实施方案使用Kabat或Chothia定义的CDR。使用氨基酸序列鉴定所预测的CDR是本领域中熟知的，如在Martin,A.C.“Protein sequence and structure analysis of antibody variabledomains”，于Antibody Engineering,第2卷Kontermann R.,Dikel S.编辑Springer-Verlag,柏林,第33-51页(2010)中。还可以通过其他常规方法(例如，通过与其他重链和轻链可变区的已知氨基酸序列进行比较以确定具有序列超变性的区域)来检查重链和/或轻链可变结构域的氨基酸序列以鉴定CDR的序列。可以通过目测或者通过采用比对程序(如CLUSTAL程序套件中的一种)来比对已编号的序列，如Thompson,1994,Nucleic AcidsRes.22:4673-80中所述。常规地使用分子模型来正确描绘框架区和CDR区，并且由此校正基于序列的比对。

在一些实施方案中，免疫球蛋白轻链或重链中的CDR/FR定义应基于IMGT定义(Lefranc等人Dev.Comp.Immunol.,2003,27(1):55-77；www.imgt.org)来确定。

如本文所用，术语“Fc”是指包含由抗体消化产生或通过其他手段产生的非抗原结合片段的序列的分子(所述分子呈单体或多聚体形式)，并且可以含有铰链区。虽然在示例性实施方案中使用IgG1和IgG2，但是天然Fc的原始免疫球蛋白来源通常是人起源的，并且可以是任何免疫球蛋白。Fc分子由可以通过共价(即，二硫键)和非共价缔合连接成二聚体或多聚体形式的单体多肽组成。天然Fc分子的单体亚基之间的分子间二硫键的数目范围为1至4，这取决于类别(例如，IgG、IgA和IgE)或亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgA1和IgGA2)。Fc的一个例子是由IgG的木瓜蛋白酶消化产生的二硫键键合的二聚体。如本文所用，术语“天然Fc”对于单体、二聚体和多聚体形式是通用的。

F(ab)片段通常包括一条轻链以及一条重链的VH和CH1结构域，其中F(ab)片段的VH-CH1重链部分不能与另一个重链多肽形成二硫键。如本文所用，F(ab)片段也可以包括含有被氨基酸接头隔开的两个可变结构域的一条轻链以及含有被氨基酸接头隔开的两个可变结构域和CH1结构域的一条重链。

F(ab')片段通常包括一条轻链和含有更多恒定区的一条重链的一部分(在CH1与CH2结构域之间)，使得可以在两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab')2分子。

如本文所用，术语“T_m”是指结合蛋白、抗原结合蛋白、抗体的熔解温度，并且是抗原结合蛋白的热稳定性的关键参数。T_m一般涉及Fv片段(即，可变区重链和轻链(VH/VL))的热稳定性。可以通过差示扫描量热法(DSC)测量T_m。

本公开文本的一个实施方案提供了对介于一种与三种之间的靶抗原具有生物和免疫特异性的结合蛋白。本公开文本的另一个实施方案提供了包含核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列编码形成此类结合蛋白的多肽链。本公开文本的另一个实施方案提供了包含核酸分子的表达载体，所述核酸分子包含编码形成此类结合蛋白的多肽链的核苷酸序列。本公开文本的又另一个实施方案提供了宿主细胞，所述宿主细胞表达此类结合蛋白(即，包含编码形成此类结合蛋白的多肽链的核酸分子或载体)。

如本文所用，术语“抗原”或“靶抗原”或“抗原靶标”是指分子或分子的一部分，所述分子或分子的一部分能够被结合蛋白结合，并且另外能够用于动物中以产生能够与该抗原的表位结合的抗体。靶抗原可具有一个或多个表位。关于由结合蛋白识别的每种靶抗原，结合蛋白能够与识别所述靶抗原的完整抗体竞争。

如本文所用，术语“表位”或“靶表位”或“表位靶标”是指能够与免疫球蛋白或T细胞受体特异性地结合的任何决定簇，例如多肽决定簇。例如但绝不限制，靶表位A可以是第一抗原上的第一表位，并且靶表位B可以是第一抗原上的第二表位。可替代地，靶表位B可以是第二抗原上的第二表位。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面基团(grouping)，如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。表位是由抗体或由抗体的抗原结合片段或由结合蛋白结合的抗原区域。在某些实施方案中，当结合蛋白在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中优先识别其靶抗原时，称结合蛋白特异性地结合抗原。在一些实施方案中，当平衡解离常数<10^-8M时，当平衡解离常数<1^-9M时，或者当解离常数<10^-10M时，称结合蛋白特异性地结合抗原。

如本文所用，术语“接头”是指0-100个连续的氨基酸残基。接头是存在的或不存在的，并且是相同的或不同的。接头可以全部都具有相同的氨基酸序列或者可以全部都具有不同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，术语“接头”是指1-15个连续的氨基酸残基。通常，接头提供两个氨基酸之间或两个多肽结构域之间的柔性和空间分离。可以根据分子的形式将接头***VH、VL、CH和/或CL结构域之间，以为轻链和重链的结构域提供足够的柔性和运动性，例如以折叠成交叉双可变区免疫球蛋白。在氨基序列水平上，通常分别在可变结构域之间、在可变结构域与敲除结构域之间或者在可变结构域与恒定结构域之间的过渡处***接头。由于免疫球蛋白结构域的大致尺寸已被充分理解，因此可以鉴定结构域之间的过渡。结构域过渡的准确位置可以通过定位没有形成(如通过实验数据所证明或者如通过建模或二级结构预测的技术可以确定的)二级结构元件(如β片层或α螺旋)的肽延伸段来确定。在某些示例性实施方案中，可以将接头***Fab结构域之间以产生串联Fab抗体。在特定实施方案中，可以将接头***第一Fab的VH结构域的N末端与第二Fab的CH1结构域的C末端之间。

接头中氨基酸残基的身份和序列可以根据接头中需要实现的一种或多种二级结构元件的类型而变化。例如，甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸对于具有最大柔性的接头是合适的。如果需要刚性更强且延长的接头，则甘氨酸、脯氨酸、苏氨酸和丝氨酸的某些组合是有用的。根据所需特性，必要时可以将任何氨基酸残基与其他氨基酸残基的组合视为接头，以构建较大肽接头。

在一些实施方案中，接头包含：单个甘氨酸(Gly)残基；二甘氨酸肽(Gly-Gly)；三肽(Gly-Gly-Gly)；具有四个甘氨酸残基的肽(Gly-Gly-Gly-Gly；SEQ ID NO:104)；具有五个甘氨酸残基的肽(Gly-Gly-Gly-Gly-Gly；SEQ ID NO:105)；具有六个甘氨酸残基的肽(Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly；SEQ ID NO:106)；具有七个甘氨酸残基的肽(Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly；SEQ ID NO:107)；和具有八个甘氨酸残基的肽(Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly；SEQ ID NO:108)。

在一些实施方案中，接头包含小氨基酸，如Gly、Ala或Ser。

在一些实施方案中，接头包含Gly和Ser，或者GS、GGS、GGGS(SEQ ID NO:109)或GGGGS(SEQ ID NO:102)。在一些实施方案中，接头包含(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)₂(即，(GGGGS)₂(SEQ ID NO:103))。在一些实施方案中，接头包含(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)₃(即，(GGGGS)₃(SEQ ID NO:110))。

在一些实施方案中，接头包含Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:102)、肽Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:103)、肽Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:110)和肽Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly(SEQ ID NO:111)。

在一些实施方案中，接头包含单个Ser残基；单个Val残基；选自Arg-Thr、Gln-Pro、Ser-Ser、Thr-Lys和Ser-Leu的二肽；Thr-Lys-Gly-Pro-Ser(SEQ ID NO:112)、Thr-Val-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO:113)、Gln-Pro-Lys-Ala-Ala(SEQ ID NO:114)、Gln-Arg-Ile-Glu-Gly(SEQ ID NO:115)；Ala-Ser-Thr-Lys-Gly-Pro-Ser(SEQ ID NO:116)、Arg-Thr-Val-Ala-Ala-Pro-Ser(SEQ ID NO:117)、Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO:118)、His-Ile-Asp-Ser-Pro-Asn-Lys(SEQ ID NO:119)和Asp-Lys-Thr-His-Thr(SEQ IDNO:120)。

在一些实施方案中，两个串联Fab通过(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)₂接头(SEQ ID NO:103)连接。在一些实施方案中，稳定敲除结构域与VH/VL对之间的接头是(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)₂接头(SEQ ID NO:103)。

在具有CODV-Fab部分的一些实施方案中，其中L1和L2位于轻链上并且L3和L4位于重链上，L1的长度为3至12个氨基酸残基，L2的长度为3至14个氨基酸残基，L3的长度为1至8个氨基酸残基，并且L4的长度为1至3个氨基酸残基。在一些实施方案中，L1的长度为5至10个氨基酸残基，L2的长度为5至8个氨基酸残基，L3的长度为1至5个氨基酸残基，并且L4的长度为1至2个氨基酸残基。在一些实施方案中，L1的长度为7个氨基酸残基，L2的长度为5个氨基酸残基，L3的长度为1个氨基酸残基，并且L4的长度为2个氨基酸残基。在一些实施方案中，L1的长度为10个氨基酸残基，L2的长度为10个氨基酸残基，L3的长度为0个氨基酸残基，并且L4的长度为0个氨基酸残基。在一些实施方案中，L1、L2、L3和L4各自具有0至15个氨基酸(例如，0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸)的独立选择的长度，其中至少两个接头具有1至15个氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸)的长度。在一些实施方案中，L1、L2、L3和L4是Asp-Lys-Thr-His-Thr(SEQ ID NO:120)。在一些实施方案中，一个或多个接头包含序列Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO:118)。在一些实施方案中，L1包含序列Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO:118)。在一些实施方案中，L1包含序列Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO:118)，L2包含序列Thr-Lys-Gly-Pro-Ser-Arg(SEQ ID NO:121)，L3包含序列Ser，并且L4包含序列Arg-Thr。在一些实施方案中，L3包含序列Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO:118)。在一些实施方案中，L1包含序列Ser，L2包含序列Arg-Thr，L3包含序列Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO:118)，并且L4包含序列Thr-Lys-Gly-Pro-Ser-Arg(SEQ ID NO:121)。

在一些实施方案中，L1、L2、L3和L4各自独立地包含选自以下的序列：(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_n(其中n是在0与5之间的整数；SEQ ID NO:122)、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:103)、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:110)、Ser、Arg-Thr、Thr-Lys-Gly-Pro-Ser(SEQ ID NO:112)、Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO:118)和Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly(SEQ ID NO:111)。在一些实施方案中，L1包含序列Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO:118)，L2包含序列Thr-Lys-Gly-Pro-Ser(SEQ ID NO:112)，L3包含序列Ser，并且L4包含序列Arg-Thr。在一些实施方案中，L1包含序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:103)，L2包含序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:103)，L3的长度为0个氨基酸，并且L4的长度为0个氨基酸。在一些实施方案中，L1包含序列Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly(SEQ ID NO:111)，L2包含序列Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly(SEQ ID NO:111)，L3的长度为0个氨基酸，并且L4的长度为0个氨基酸。在一些实施方案中，L1包含序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:110)，L2的长度为0个氨基酸，L3包含序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ IDNO:110)，并且L4的长度为0个氨基酸。在一些实施方案中，L1和L2的长度为零个氨基酸，并且L3和L4各自包含独立地选自以下的序列：(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_n(其中n是在0与5之间的整数；SEQ ID NO:122)、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:103)、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:110)、Ser、Arg-Thr、Thr-Lys-Gly-Pro-Ser(SEQ ID NO:112)、Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO:118)和Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly(SEQ ID NO:111)。在一些实施方案中，L3和L4的长度为零个氨基酸，并且L1和L2各自包含独立地选自以下的序列：(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_n(其中n是在0与5之间的整数；SEQ ID NO:122)、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:103)、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:110)、Ser、Arg-Thr、Thr-Lys-Gly-Pro-Ser(SEQ ID NO:112)、Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO:118)和Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly(SEQ ID NO:111)。

在一些实施方案中，一个或多个接头包含衍生自天然存在的序列的序列，所述天然存在的序列位于抗体可变结构域与抗体恒定结构域之间的接合处(例如，如WO 2012/135345中所述)。例如，在一些实施方案中，接头包含在内源VH结构域与CH1结构域之间或在内源VL结构域与CL结构域(例如，κ或λ)之间的过渡处发现的序列。在一些实施方案中，接头包含在内源人VH结构域与CH1结构域之间或在内源人VL结构域与CL结构域(例如，人κ或λ)之间的过渡处发现的序列。

上文列出的例子并不意图以任何方式限制本公开文本的范围，并且包含随机选择的氨基酸的接头适合用于在本文所述的结合蛋白中使用，所述随机选择的氨基酸选自缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、甘氨酸和脯氨酸。关于接头序列的另外描述，参见例如通过引用并入的WO2012135345、WO 2017/180913。

如本文所用，术语“化合价”是指结合蛋白、表位、抗原结合蛋白或抗体的结合位点数量。例如，术语“单价结合蛋白”是指具有一个抗原结合位点的结合蛋白。术语“二价结合蛋白”是指具有两个结合位点的结合蛋白。术语“三价结合蛋白”是指具有三个结合位点的结合蛋白。术语“四价结合蛋白”是指具有四个结合位点的结合蛋白。在特定实施方案中，二价结合蛋白可以结合一种抗原靶标。在其他实施方案中，二价结合蛋白可以结合两种不同的抗原靶标。在特定实施方案中，三价结合蛋白可以结合一种抗原靶标，即是单特异性的。在其他实施方案中，三价结合蛋白可以结合两种不同的抗原靶标，即是双特异性的。在其他实施方案中，三价结合蛋白可以结合三种不同的抗原靶标，即是三特异性的。在特定实施方案中，四价结合蛋白可以结合一种抗原靶标，即是单特异性的。在其他实施方案中，四价结合蛋白可以结合两种不同的抗原靶标，即是双特异性的。在其他实施方案中，四价结合蛋白可以结合三种不同的抗原靶标，即是三特异性的。在其他实施方案中，四价结合蛋白可以结合四种不同的抗原靶标，即是四特异性的。

如本文所用，术语“特异性”是指结合蛋白、表位、抗原结合蛋白或抗体的结合特异性数量。例如，术语“单特异性结合蛋白”是指与一种抗原靶标特异性地结合的结合蛋白。术语“双特异性结合蛋白”是指与两种不同的抗原靶标特异性地结合的结合蛋白。术语“三特异性结合蛋白”是指与三种不同抗原靶标特异性地结合的结合蛋白。术语“四特异性结合蛋白”是指与四种不同的抗原靶标特异性地结合的结合蛋白，如此等等。

如本文所用，术语“选择性识别位点”是指结合蛋白中的修饰，所述修饰允许由与选择性识别位点结合的亲和试剂选择性地识别。选择性识别位点的例子包含免疫球蛋白的Fc部分中针对蛋白质A的结合位点。

如本文所用，术语“亲和试剂”是指含有配体的试剂，所述配体固定在基质上并且与分子的表面基团如氨基酸或糖侧链特异性地结合，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。亲和试剂是亲和色谱中的工具，在亲和色谱中通过配体与产物之间的特异性相互作用而使得能纯化。作为亲和试剂的例子的“蛋白质L”是指重组蛋白L，其被固定在基质上以形成对免疫球蛋白κ轻链的可变结构域的亚组具有亲和力的配体。此类基质可以是树脂。亲和试剂的另一个例子是“KappaSelect”，它是指重组的骆驼衍生的13kDa单链抗体，其被固定在基质上以形成对人免疫球蛋白κ轻链的恒定结构域具有亲和力的配体。亲和试剂的另一个例子是蛋白质A。蛋白质A是最初在细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的细胞壁上发现的42kDa表面蛋白。已经经由晶体学精细化显示，蛋白质A的主要结合位点位于Fc区上，在CH2结构域与CH3结构域之间。另外，已经显示蛋白质A结合含有来自人VH3基因家族的IgG F(ab')2片段的人IgG分子。蛋白质A能以强亲和力与某些物种的免疫球蛋白的Fc部分结合。

结合蛋白的解离常数(K_D)可以例如通过表面等离子体共振来确定。通常，表面等离子体共振分析通过表面等离子体共振(SPR)使用BIAcore***(Pharmacia Biosensor；皮斯卡塔韦，新泽西州)测量配体(生物传感器基质上的靶抗原)与分析物(溶液中的结合蛋白)之间的实时结合相互作用。表面等离子体分析还可以通过固定分析物(生物传感器基质上的结合蛋白)并呈递配体(靶抗原)来进行。如本文所用，术语“K_D”是指特定结合蛋白与靶抗原之间的相互作用的解离常数。

如本文所用，术语“特异性地结合”是指结合蛋白或其抗原结合片段以至少约1x10^-6M、1x10^-7M、1x10^-8M、1x10^-9M、1x10^-10M、1x10^-11M、1x10^-12M或更大的Kd结合含有表位的抗原的能力，和/或以比所述结合蛋白或其抗原结合片段对非特异性抗原的亲和力大至少两倍的亲和力结合表位的能力。可以使用BIAcore仪器通过表面等离子体共振(SPR)来进行抗原对结合蛋白或抗体的结合亲和力。

如本文所用，术语“参考Fab分子”是指除了在假Fab分子中，参考Fab分子的CH1和CL结构域被VHX和VLX结构域替代以外，与假Fab分子相同的分子。“参考Fab分子”是指这样的分子，其中可变结构域与假Fab的可变结构域相同并且具有CH1和CL结构域。在假Fab分子中，参考Fab分子的CH1和CL结构域被VHX和VLX结构域替代。

如本文所用，术语“核酸”是指对于所有已知的生命形式都是必需的聚合或寡聚大分子或者生物大分子。包括DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)的核酸是由称为核苷酸的单体制得。大多数天然存在的DNA分子由两条互补的生物聚合物链组成，所述生物聚合物链围绕彼此盘绕以形成双螺旋。DNA链还被称为由核苷酸组成的多核苷酸。每个核苷酸由含氮核碱基以及称为脱氧核糖或核糖的单糖和磷酸基团构成。天然存在的核碱基包含鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)或胞嘧啶(C)。核苷酸在链中通过一个核苷酸的糖与下一个核苷酸的磷酸之间的共价键彼此接合，从而产生交替的糖-磷酸骨架。如果糖是脱氧核糖，则聚合物是DNA。如果糖是核糖，则聚合物是RNA。通常，多核苷酸是通过单独核苷酸单体之间的磷酸二酯键形成的。

如本文所用，术语“多核苷酸”是指长度为至少10个核苷酸的单链或双链核酸聚合物。应理解，包含多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一类型的核苷酸的修饰形式。此类修饰包括碱基修饰(如溴尿苷)、核糖修饰(如阿糖胞苷和2',3'-二脱氧核糖)以及核苷酸间连接修饰(如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯、硫代缩苯胺磷酸酯(phosphoroanilothioate)、缩苯胺磷酸酯(phoshoraniladate)和氨基磷酸酯(phosphoroamidate))。术语“多核苷酸”具体地包括DNA的单链和双链形式。

“分离的多核苷酸”是基因组、cDNA或合成来源或其某种组合的多核苷酸，所述分离的多核苷酸：(1)不与在自然界中发现所述分离的多核苷酸所在的多核苷酸的全部或一部分缔合，(2)与在自然界中其并不连接的多核苷酸连接，或者(3)在自然界中不作为更大序列的一部分存在。

“分离的多肽”是这样的多肽，其：(1)不含通常与其一起被发现的至少一些其他多肽，(2)基本上不含来自相同来源(例如，来自相同物种)的其他多肽，(3)由来自不同物种的细胞表达，(4)已经从至少约50％的在自然界中与其缔合的多核苷酸、脂质、碳水化合物或其他材料分离，(5)不与在自然界中与所述“分离的多肽”缔合的多肽的部分(通过共价或非共价相互作用)缔合，(6)与在自然界中不与其缔合的多肽可操作地缔合(通过共价或非共价相互作用)，或者(7)在自然界中不存在。这种分离的多肽可以由基因组DNA、cDNA、mRNA或合成来源的其他RNA或其任何组合来编码。在示例性实施方案中，分离的多肽基本上不含在其自然环境中发现的会干扰其应用(治疗、诊断、预防、研究或其他应用)的多肽或其他污染物。

如本文所用，术语“表达载体”还被称为表达构建体，通常是指设计用于细胞中的蛋白质表达的质粒或病毒。术语“载体”是指能够被引入细胞中或者能够将其中所包含的蛋白质和/或核酸引入细胞中的蛋白质或多核苷酸或其混合物。载体的例子包括但不限于质粒、粘粒、噬菌体、病毒或人工染色体。特别地，使用载体将感兴趣的基因产物(如例如，外来或异源DNA)转运至合适的宿主细胞中。载体可以含有促进载体在宿主细胞中的自主复制的“复制子”多核苷酸序列。外来DNA被定义为异源DNA，所述异源DNA是并非在宿主细胞中天然发现的DNA，所述异源DNA例如复制载体分子，编码可选择或可筛选标记，或者编码转基因。一旦进入宿主细胞，载体可以独立于宿主染色体DNA复制或与宿主染色体DNA同时复制，并且可以产生几个拷贝的载体及其***的DNA。另外，载体还可以含有必需元件，所述必需元件允许将***的DNA转录成mRNA分子或者以其他方式导致***的DNA复制到多个拷贝的RNA中。载体还可以涵盖调节感兴趣的基因的表达的“表达控制序列”。通常，表达控制序列是多肽或多核苷酸，例如但不限于启动子、增强子、沉默子、绝缘子或阻遏物。在包含编码感兴趣的一种或多种基因产物的多于一种多核苷酸的载体中，可以通过一种或多种表达控制序列一起或单独控制表达。更具体地，载体上所包含的每种多核苷酸可以通过单独的表达控制序列来控制，或者载体上所包含的所有多核苷酸可以通过单一表达控制序列来控制。通过单一表达控制序列控制的单一载体上所包含的多核苷酸可以形成开放阅读框。一些表达载体另外含有与***的DNA相邻的序列元件，所述序列元件增加所表达的mRNA的半衰期和/或允许将mRNA翻译成蛋白质分子。因此可以快速地合成由***的DNA编码的许多mRNA和多肽分子。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指其中已经引入了重组表达载体的细胞。重组宿主细胞或宿主细胞意图不仅是指特定的受试细胞，而且是指这种细胞的子代。因为后代中可能由于突变或环境影响而发生某些修饰，所以这种子代可能实际上与亲代细胞不同，但是此类细胞仍包括在如本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。众多种宿主细胞表达***可以用于表达结合蛋白，所述表达***包括细菌、酵母、杆状病毒和哺乳动物表达***(以及噬菌体展示表达***)。合适的细菌表达载体的例子是pUC19。为了重组表达结合蛋白，用携带编码结合蛋白多肽链的DNA片段的一种或多种重组表达载体转化或转染宿主细胞，使得在所述宿主细胞中表达所述多肽链并且在示例性实施方案中分泌到培养所述宿主细胞的培养基中，从而可以从所述培养基回收所述结合蛋白。

如本文所用，术语“药物组合物”是指当适当地给予患者时能够诱导所需治疗效果的化合物或组合物。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”或“生理学上可接受的载体”是指适合用于实现或增强结合蛋白的递送的一种或多种配制材料。

术语“有效量”和“治疗有效量”当关于包含一种或多种结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)的药物组合物使用时是指足以产生所需治疗结果的量或剂量。更具体地，治疗有效量是结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)的足以将与所治疗病症相关的一种或多种临床上定义的病理过程抑制一定时间段的量。有效量可以根据所使用的特定抗体样结合蛋白而变化，并且还取决于与所治疗患者和障碍严重程度相关的多种因素和状况。例如，如果要在体内给予结合蛋白或多特异性结合蛋白，则诸如患者的年龄、体重和健康状况以及在临床前动物工作中获得的剂量反应曲线和毒性数据等因素将属于所考虑的那些因素。给定的药物组合物的有效量或治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内。

如本文所用，术语“产生结合蛋白的方法”是指使用本领域熟知的技术进行的蛋白质表达的重组方法。

II.假Fab部分

在某些实施方案中，本文所述的结合分子包含至少一个假Fab部分。如本文所用，“假Fab”部分类似于常规抗体的Fab部分，原因在于其包含通过可变轻链(VL)结构域与可变重链(VH)配对形成的功能性抗原结合部分。然而，尽管常规Fab的VL和VH结构域分别直接与恒定轻链(CL)结构域和恒定重链1(CH1)结构域融合或连接，但是假Fab部分缺少CH1和CL结构域。相反，假Fab的VL和VH结构域可操作地连接至第二对稳定敲除VL和VH结构域(在本文中表示为VLX和VHX)，所述稳定敲除VL和VH结构域形成不能与靶抗原特异性地结合的无活性或无功能的结合部分(在本文中为“稳定敲除”部分或结构域)。本文所述的稳定敲除结构域不能特异性地结合任何靶抗原。假Fab部分缺少CH和CL结构域。

虽然不能选择性地结合靶抗原，但是假Fab的VLX和VHX结构域仍然优先彼此缔合以形成稳定的链配对。因此，通过将假Fab附加至具有不同特异性的一个或多个另外的结合结构域，假Fab的VLX/VHX链配对的固有稳定性可以驱动所需多特异性结合分子的链的异二聚化。

因此，本公开文本的假Fab包含第一多肽链和第二多肽链或者由其组成，所述第一多肽链具有由下式表示的结构：

(I)VHa-L1-VHX；或

(II)VHb-L1-VHX

并且所述第二多肽链具有由下式表示的结构：

(III)VLa-L2-VLX；或

(IV)VLb-L2-VLX

其中

VHX与VLX缔合以形成敲除结构域，

VH与VL缔合以形成第一功能性抗原结合结构域，并且

L1和L2是可以存在或不存在的接头。

在某些实施方案中，假Fab的第一多肽链具有结构VH-L1-VHX，并且假Fab的第二多肽链具有结构VL-L2-VLX。

在其他实施方案中，假Fab的第一多肽具有结构VHX-L1-VH，并且第二多肽链具有结构VLX-L2-VL。

在一些实施方案中，结合蛋白包含选自下组之一的分开的蛋白质链：

(a)VHa-CH1-L1-VHb-L2-VHX和VLa-CL和VLb-L3-VLX；

(b)VHa-L2-VHX-L1-VHb-CH1和VLa-L3-VLX和VLb-CL；

(a)敲除结构域

可以通过导致消除或降低正常功能性抗原结合位点的结合亲和力或特异性的任何方式产生假Fab的“敲除”结构域。在某些实施方案中，已经通过敲除结构域的VLX和VHX结构域中的一个或两个中的一个或多个突变而使得假Fab的敲除结构域无活性或无功能。在一个实施方案中，敲除修饰是氨基酸取代。在其他实施方案中，敲除修饰是氨基酸***或缺失。在另一个实施方案中，敲除修饰是一个或多个氨基酸取代、氨基酸***和氨基酸缺失的组合。在又其他实施方案中，通过用例如干扰可变结构域结合靶抗原的能力的部分进行共价修饰而使得敲除结构域无功能。

在某些实施方案中，敲除修饰通过产生稳定抗原-结合蛋白复合物的排斥或破坏来消除结合。在某些实施方案中，敲除修饰可以包括用与靶抗原产生电荷-电荷排斥的氨基酸替代通常与靶抗原形成接触的氨基酸。另外地或可替代地，可以引入使π-π相互作用的复合物不稳定的突变。

在某些实施方案中，敲除修饰是用不带电荷的氨基酸取代带电荷的氨基酸。在其他实施方案中，敲除修饰是用带电荷的氨基酸取代不带电荷的氨基酸。在其他实施方案中，敲除修饰是用非极性氨基酸取代极性氨基酸。在其他实施方案中，敲除修饰是带电荷的氨基酸被极性且不带电荷的氨基酸取代以及极性的不带电荷的氨基酸被非极性的疏水性氨基酸取代。

在某些实施方案中，将敲除修饰引入与抗原形成结合相互作用的氨基酸位置。例如，敲除修饰可以位于通常发生抗原-抗体相互作用的蛋白质表面上。在某些示例性实施方案中，可以将修饰引入VLX或VHX结构域中的一个或两个的互补决定区(CDR)中。

在某些实施方案中，敲除修饰是VHX结构域的CDRH1中的残基的取代。在另一个实施方案中，敲除修饰是VHX结构域的CDRH2中的残基的取代。

在另一个实施方案中，敲除修饰是VHX结构域的CDRH3中的残基的取代。

在某些实施方案中，敲除修饰是VLX结构域的CDRL1中的残基的取代。在另一个实施方案中，敲除修饰是VLX结构域的CDRL2中的残基的取代。在另一个实施方案中，敲除修饰是VLX结构域的CDRL3中的残基的取代。

在某些示例性实施方案中，VHX或VLX结构域的CDR中的精氨酸被突变为谷氨酸。在其他实施方案中，VHX或VLX结构域的CDR中的一个或多个酪氨酸被突变为丙氨酸。

在某些实施方案中，修饰产生敲除结构域，所述敲除结构域完全没有衍生出它的功能性非敲除(即，野生型)对应物的靶抗原结合活性。可替代地，与其功能性非敲除对应物相比，敲除结构域的结合功能性可能实质降低，然而同时保留一定水平的可检测结合。

用于产生敲除结构域的支架可以例如从蛋白质数据库(PDB)获得。PDB是大型生物分子(如蛋白质和核酸)的三维结构数据的晶体学数据库。敲除结构域可以通过特异性地突变氨基酸来产生，通过对抗原结合结构域及其同源靶抗原的基于计算机的建模将所述氨基酸预测为参与抗原结合。随后的结合研究可以通过使用本领域已知的方法(例如，表面等离子体共振)进行，并且以高精度揭示结合功能是否被消除以及结合结构域与其靶标之间的相互作用是否被破坏。

(b)稳定敲除结构域

在某些实施方案中，敲除结构域是与其野生型对应物相比具有增加的热稳定性的稳定敲除结构域。例如，在某些示例性实施方案中，敲除结构域的熔解温度(T_m)在与衍生出它的野生型对应物相比的至少0.25℃、至少0.5℃、至少0.75℃、至少1℃、至少2℃、至少3℃、至少4℃、至少5℃或至少10℃内。在其他示例性实施方案中，敲除结构域的T_m相对于其野生型对应物有所增加。例如，与衍生出它的野生型对应物相比，T_m可以增加至少0.25℃、至少0.5℃、至少0.75℃、至少1℃、至少2℃、至少3℃、至少4℃、至少5℃或至少10℃。可以通过差式扫描荧光测定法(DSF)或本领域技术人员常规使用的其他生物分析方法测量热稳定性。

在某些实施方案中，假Fab包含在假Fab的敲除结构域的VHX或VLX结构域之间的工程化链内二硫键，所述工程化链内二硫键赋予增强的稳定性。通常，这种修饰是用半胱氨酸(Cys)残基取代VHX结构域的至少一个氨基酸以及用Cys残基取代VLX结构域中的至少一个氨基酸。可以在VHX和VLX结构域的允许在二聚体形成之后形成二硫键的位置处引入Cys残基。在某些实施方案中，可以在VH和VL界面中进行突变以改进VH/VL界面之间的稳定性。VH结构域和VL结构域中特定的氨基酸突变组可以通过引入形成二硫桥的非天然半胱氨酸残基来改进稳定性。

可以对VH和VL结构域中的氨基酸残基进行第一组二硫键稳定突变。在示例性实施方案中，二硫键由VHX结构域的位置44处的Cys和VLX结构域的位置100处的Cys形成。可替代地，这组二硫键稳定突变可以被称为“VH44C/VL100C”突变组。第一组二硫键稳定突变进一步详细描述于出于所有目的通过引用并入本文的Reiter等人Nature Biotechnology.第14卷第1239-1245页1996中。

可以对VH和VL结构域中的氨基酸残基进行第二组二硫键稳定突变。在示例性实施方案中，二硫键由VHX结构域的位置105处的Cys和VLX结构域的位置43处的Cys形成。可替代地，第二组二硫键稳定突变可以被称为“VH105C/VL43C”突变组。其他二硫键稳定突变进一步详细描述于美国专利号9,527,927中，将所述专利出于所有目的通过引用并入本文。

在某些实施方案中，假Fab的VLX结构域包含SEQ ID NO:1的变体，所述变体具有至少一个敲除修饰。例如，VLX结构域可以包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％或100％相同的氨基酸序列，如果没有敲除修饰的话。

在某些实施方案中，假Fab的VHX结构域包含SEQ ID NO:2的变体，所述变体具有至少一个敲除修饰。例如，VHX结构域可以包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％或100％相同的氨基酸序列，如果没有敲除修饰的话。

在一个实施方案中，假Fab的VLX结构域包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列，并且假Fab的VHX结构域包含选自SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:79的氨基酸序列。

II.含假Fab的多特异性结合多肽

在其他方面，提供了包含本文所述的假Fab部分的多特异性结合蛋白。假Fab部分的高度模块化性质允许形成众多种多特异性结构。

在某些实施方案中，本公开文本的多特异性结合蛋白包含附加至假Fab部分的一条或两条链的N末端和/或C末端以形成含假Fab的多价结合蛋白的另外的结合特异性。

在一些实施方案中，多特异性结合蛋白包含：

a)第一假Fab部分，所述第一假Fab部分包含：

(3)第一异二聚化结构域(HD1)；

其中所述第一dsKO结构域包含(i)消除其与靶抗原的结合的一个或多个失活突变；和(ii)一个或多个工程化链间二硫键；

b)第一Fab部分，所述第一Fab部分包含：

(3)第二异二聚化结构域(HD2)。

在一些实施方案中，结合蛋白的第一和第二异二聚化结构域包含第一和第二Fc结构域。在一些实施方案中，Fc结构域包含通用结构：铰链-CH2结构域-CH3结构域。

(a)Fc异二聚化结构域

在某些实施方案中，本公开文本的多特异性结合蛋白还可以包含Fc异二聚化C1或C2结构域。在一些实施方案中，Fc异二聚化结构域选自异二聚化Fc或其片段，特别是Fc部分的杵臼结构(KIH)变体及其效应子修饰的变体；或者异二聚化Fc或其片段，特别是Fc的EV-RWT变体及其效应子修饰的变体。在一些实施方案中，Fc包含一个或多个氨基酸突变。一种可能性是例如通过选自H435R、Y436F的突变去除第一亲和试剂的选择性识别位点以及引入第二亲和试剂的选择性识别位点。可替代地，可以仅引入第二亲和试剂的选择性识别位点。

(b)同二聚化结构域

在某些实施方案中，本公开文本的多特异性结合蛋白还可以包含同二聚化结构域。在一些实施方案中，同二聚化结构域选自Fc区及其效应子修饰的变体；一个或多个CH2结构域(例如，IgG、IgE或IgM的)；一个或多个CH3结构域(例如，IgG、IgA或IgD的)；以及一个或多个CH4结构域(例如，IgE或IgM的)。

III.含假Fab的多聚体结合蛋白

(a)对称的四价构建体

在另一个实施方案中，结合多肽包含含有假Fab的结合蛋白，所述含有假Fab的结合蛋白包含与假Fab的多肽链缔合以形成另外的结合结构域的另外的多肽链。将这些含有假Fab的结合多肽进一步融合至Fc异二聚化结构域以形成常规Y形抗体的一半。

在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含形成四个抗原结合位点的六条多肽链，其中

(a)所述第一和第二多肽包含由下式表示的结构：

VLa-L1-VLX[I]和[II]

(b)所述第三和第四多肽包含由下式表示的结构：

VLb-CL[III]和[IV]

(c)所述第五多肽包含由下式表示的结构：

VHa-L2-VHX-L3-VHb-CH1-FC1[V]

(d)所述第六多肽包含由下式表示的结构：

VHa-L2-VHX-L3-VHb-CH1-FC2[VI]

其中：

VLa是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；

VLb是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；

VHa是第一免疫球蛋白重链可变结构域；

VHb是第二免疫球蛋白重链可变结构域；

VLX是稳定敲除轻链可变结构域；

VHX是稳定敲除重链可变结构域；

CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；

CH1是免疫球蛋白重链恒定结构域；

L1、L2和L3是氨基酸接头，

其中

这些分子也可以被称为“串联-(Fv-假Fab x Fv-Fab)”(参见图10B)。

(a)所述第一和第二多肽包含由下式表示的结构：

VLa-L1-VLX[I]和[II]

(b)所述第三和第四多肽包含由下式表示的结构：

VLb-CL[III]和[IV]

(c)所述第五多肽包含由下式表示的结构：

VHb-CH1-L3-VHa-L2-VHX-FC1[V]

(d)所述第六多肽包含由下式表示的结构：

VHb-CH1-L3-VHa-L2-VHX-FC2[VI]

其中：

VLa是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；

VLb是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；

VHa是第一免疫球蛋白重链可变结构域；

VHb是第二免疫球蛋白重链可变结构域；

VLX是稳定敲除轻链可变结构域；

VHX是稳定敲除重链可变结构域；

CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；

CH1是免疫球蛋白重链恒定结构域；

L1、L2和L3是氨基酸接头，

其中

这些分子也可以被称为“串联-(Fv-Fab x Fv-假Fab-IgG)”(参见图10A)。

(b)不对称的四特异性分子

结合多肽(其中仅一个含有假Fab)的二聚化产生具有另外的特异性的不对称构建体。将这些含有假Fab的结合多肽进一步融合至Fc异二聚化结构域以形成常规全长Y形IgG抗体的一半。

在一些实施方案中，多特异性结合蛋白包含形成至少两个抗原结合位点的四条多肽链，其中

(a)第一多肽包含由下式表示的结构：

VLa-L1-VLX[I]

(b)第二多肽包含由下式表示的结构：

VHa-L2-VHX-FC1[II]

(c)第三多肽包含由下式表示的结构：

VLb-CL[III]

(d)第四多肽包含由下式表示的结构：

VHb-CH1-FC2[IV]

其中：

VLa是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；

VLb是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；

VHa是第一免疫球蛋白重链可变结构域；

VHb是第二免疫球蛋白重链可变结构域；

VLX是稳定敲除轻链可变结构域；

VHX是稳定敲除重链可变结构域；

CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；

CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；

L1和L2是可以独立地相同或不同的氨基酸接头，

其中

这些分子也可以被称为二聚体双特异性IgG分子(Fv-假Fab)x(Fv-Fab)-Fc(参见图2和图7)。

在另一个实施方案中，结合多肽包含含有假Fab的结合蛋白，所述含有假Fab的结合蛋白包含与假Fab的多肽链缔合以形成另外的结合结构域的另外的多肽链。将这些含有假Fab的结合多肽进一步融合至Fc异二聚化结构域以形成常规Y形抗体的一半。此类分子的二聚化产生具有另外的特异性的构建体。

(a)所述第一和第二多肽包含由下式表示的结构：

VLa-L1-VLX[I]和[II]

(b)所述第三和第四多肽包含由下式表示的结构：

VLb-CL[III]和[IV]

(c)所述第五多肽包含由下式表示的结构：

VHa-L2-VHX-L3-VHa-L4-VHX-FC1[V]

(d)所述第六多肽包含由下式表示的结构：

VHb-CH1-L5-VHb-CH1-FC2[VI]

其中：

VLa是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；

VLb是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；

VHa是第一免疫球蛋白重链可变结构域；

VHb是第二免疫球蛋白重链可变结构域；

VLX是稳定敲除轻链可变结构域；

VHX是稳定敲除重链可变结构域；

CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；

CH1是免疫球蛋白重链恒定结构域；

L1、L2、L3、L4和L5是氨基酸接头，

其中

C末端异二聚化结构域可以是常规的Fc-杵臼结构异二聚化结构域、常规的Fc-RF异二聚化结构域或其组合。这些分子也可以被称为“Fv-假Fab([HC]-(Fv-假Fab))x((Fv-Fab)[HC]-(Fv-Fab)))-Fc”(参见图11)。

在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含形成三个抗原结合位点的四条多肽链，其中：

(a)所述第一多肽包含由下式表示的结构：

VLa-L1-VLX[I]

(b)所述第二多肽包含由下式表示的结构：

VHa-L2-VHX-FC1[II]

(c)所述第三多肽包含由下式表示的结构：

VLb-L3-VLc-L4-CL[III]

(d)所述第四多肽包含由下式表示的结构：

VHc-L5-VHb-L6-CH1-FC2[IV]

其中：

VLa是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；

VLb是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；

VLc是第三免疫球蛋白轻链可变结构域；

VHa是第一免疫球蛋白重链可变结构域；

VHb是第二免疫球蛋白重链可变结构域；

VHc是第三免疫球蛋白重链可变结构域；

CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；

CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；

VLX是稳定敲除轻链可变结构域；

VHX是稳定敲除重链可变结构域；

L1、L2、L3、L4、L5和L6是氨基酸接头，

其中

(3)所述第三VL结构域(VLc)与所述第三VH结构域(VHc)配对以形成结合靶抗原C的第三功能性抗原结合位点；

(5)所述稳定敲除VL结构域(VLX)与所述稳定敲除VH结构域(VHX)配对以形成二硫键稳定的敲除(dsKO2)结构域；

(a)所述第一多肽包含由下式表示的结构：

VLa-L1-VLX[I]

(b)所述第二多肽包含由下式表示的结构：

VHa-L2-VHX-FC1[II]

(c)所述第三多肽包含由下式表示的结构：

VLb-L3-VLc-L4-CL[III]

(d)所述第四多肽包含由下式表示的结构：

VHc-L5-VHb-L6-CH1-FC2[IV]

其中：

VLa是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；

VLb是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；

VLc是第三免疫球蛋白轻链可变结构域；

VHa是第一免疫球蛋白重链可变结构域；

VHb是第二免疫球蛋白重链可变结构域；

VHc是第三免疫球蛋白重链可变结构域；

CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；

CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；

VLX是稳定敲除轻链可变结构域；

VHX是稳定敲除重链可变结构域；

L1、L2、L3、L4、L5和L6是氨基酸接头，

其中

这些分子也可以被称为“(CODV-Fab)x(假Fab)-Fc”(参见图13)。

在本发明的第一方面和第二方面的特定实施方案中，结合蛋白包含选自以下的轻链和重链对：SEQ ID NO:6和7；SEQ ID NO:8和9；SEQ ID NO:10和11；SEQ ID NO:12和13；SEQ ID NO:14和15；SEQ ID NO:16和17；SEQ ID NO:18和19；SEQ ID NO:20和21；SEQ IDNO:22和23；SEQ ID NO:24和25；SEQ ID NO:26和27；SEQ ID NO:28和29；SEQ ID NO:30和31；SEQ ID NO:32和33；SEQ ID NO:34和35；SEQ ID NO:36和37；SEQ ID NO:38和39；SEQ IDNO:40和41；SEQ ID NO:42和43；SEQ ID NO:44和45；SEQ ID NO:46和47以及SEQ ID NO:48和49；SEQ ID NO:50和51；SEQ ID NO:52和53以及SEQ ID NO:54和55；SEQ ID NO:56和57以及SEQ ID NO:58和59；SEQ ID NO:60和61以及SEQ ID NO:62和63；SEQ ID NO:64和65以及SEQ ID NO:66和67；SEQ ID NO:68和69以及SEQ ID NO:70和71；SEQ ID NO:72和73；以及SEQ ID NO:74和75。

在一些实施方案中，第一和第二CL独立地选自恒定区轻链κ(CLκ)和恒定区轻链λ(CLλ)。

在一些实施方案中，HD1和HD2各自包含Fc区及其效应子修饰的变体；异二聚化Fc部分，特别是Fc部分的杵臼结构(KIH)变体及其效应子修饰的变体；一个或多个CH2结构域(例如，IgG、IgE或IgM的)；一个或多个CH3结构域(例如，IgG、IgA或IgD的)；或一个或多个CH4结构域(例如，IgE或IgM的)。

在一个实施方案中，HD1或HD2的Fc区包含导致去除第二亲和试剂的选择性识别位点的一个或多个氨基酸突变(例如，选自H435R或Y436F)、或者导致引入第三亲和试剂的选择性识别位点的一个或多个氨基酸突变。

表2：所选结合蛋白的序列

表3：双特异性T细胞衔接器(T cell engager)抗体的序列

(e)核酸

在第五方面，本发明涉及分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含编码假Fab的核苷酸序列，所述假Fab含有本发明的第一、第二或第三方面的结合蛋白和多特异性结合蛋白中的一种或两种。

本发明的一个方面涉及编码本发明的第一至第三方面中任一方面的结合蛋白的多核苷酸。

使用标准重组DNA方法构建编码形成结合蛋白的多肽的多核苷酸，将这些多核苷酸掺入重组表达载体中，并且将此类载体引入宿主细胞中。参见例如，Sambrook等人,2001,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第3版)。可以根据制造商的说明书来进行酶反应和纯化技术，如本领域通常所实现的或如本文所述。除非提供具体定义，否则关于本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的术语以及本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学的实验室程序和技术是本领域中熟知且常用的那些。类似地，常规技术可以用于化学合成、化学分析、药物制备、配制、递送和患者的治疗。

本公开文本的其他方面涉及分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含编码本文所述的任何结合蛋白的核苷酸序列。在本发明的第五方面的一些实施方案中，分离的核酸分子包含与编码本文所述的任何结合蛋白的核酸至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的序列。

本公开文本的某些方面涉及成套多核苷酸。在一些实施方案中，一种或多种多核苷酸是载体(例如，表达载体)。所述套件尤其可以用于产生本文所述的一种或多种结合蛋白，例如本公开文本的异二聚化结构域、二价、三价、四价或多价结合蛋白。

在一些实施方案中，分离的核酸可操作地连接至异源启动子，以指导编码结合蛋白的核酸序列的转录。启动子可以是指指导核酸的转录的核酸控制序列。在第一核酸序列被放置成与第二核酸序列具有功能关系时，所述第一核酸序列可操作地连接至所述第二核酸序列。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则所述启动子可操作地连接至结合蛋白的编码序列。启动子的例子可以包括但不限于从病毒(如多瘤病毒、鸡痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛***瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒、猿猴病毒40(SV40)等)的基因组获得的启动子、异源真核启动子(如肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、热休克启动子等)、CAG启动子(Niwa等人,Gene 108(2):193-9,1991)、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、四环素诱导型启动子(Masui等人,Nucleic Acids Res.33:e43,2005)、lac***、trp***、tac***、trc***、噬菌体λ的主要操纵子和启动子区域、3-磷酸甘油酸激酶的启动子、酵母酸性磷酸酶的启动子和酵母α交配因子的启动子。编码本公开文本的结合蛋白的多核苷酸可以处于以下启动子的控制下：组成型启动子、诱导型启动子、或本文所述的任何其他合适的启动子、或本领域技术人员将易于识别的其他合适的启动子。

在一些实施方案中，将分离的核酸掺入载体中。在一些实施方案中，载体是表达载体。表达载体可以包括与要表达的多核苷酸可操作地连接的一个或多个调节序列。如本文所用，术语“调节序列”包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。合适的增强子的例子可以包括但不限于来自哺乳动物基因的增强子序列(如球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白、胰岛素等)、以及来自真核细胞病毒的增强子序列(如复制起点的后侧上的SV40增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点的后侧上的多瘤增强子、腺病毒增强子等)。合适的载体的例子可以包括例如质粒、粘粒、附加体、转座子和病毒载体(例如，腺病毒、痘苗病毒、辛德毕斯病毒(Sindbis-viral)、麻疹、疱疹病毒、慢病毒、逆转录病毒、腺相关病毒载体等)。表达载体可以用于转染宿主细胞，例如像细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。能够在宿主体内表达并复制的生物功能病毒和质粒DNA载体是本领域中已知的，并且可以用于转染感兴趣的任何细胞。

在第六方面，本发明涉及表达载体，所述表达载体包含本发明的第五方面的核酸分子。

本公开文本的其他方面涉及载体***，所述载体***包含编码本文所述的任何结合蛋白的第一、第二、第三和第四多肽链的一种或多种载体。在本发明的第六方面的一些实施方案中，载体***包含编码结合蛋白的第一多肽链的第一载体、编码结合蛋白的第二多肽链的第二载体、编码结合蛋白的第三多肽链的第三载体和编码结合蛋白的第四多肽链的第四载体。在一些实施方案中，载体***包含编码结合蛋白的第一和第二多肽链的第一载体以及编码结合蛋白的第三和第四多肽链的第二载体。在一些实施方案中，载体***包含编码结合蛋白的第一和第三多肽链的第一载体以及编码结合蛋白的第二和第四多肽链的第二载体。在一些实施方案中，载体***包含编码结合蛋白的第一和第四多肽链的第一载体以及编码结合蛋白的第二和第三多肽链的第二载体。在一些实施方案中，载体***包含编码结合蛋白的第一、第二、第三和第四多肽链的第一载体。载体***的所述一种或多种载体可以是本文所述的任何载体。在一些实施方案中，所述一种或多种载体是表达载体。

(f)分离的宿主细胞

在第七方面，本发明涉及分离的宿主细胞，所述分离的宿主细胞包含本发明的第五方面的核酸分子或本发明的第六方面的表达载体。

本公开文本的其他方面涉及分离的宿主细胞，所述分离的宿主细胞包含本文所述的一种或多种分离的多核苷酸、多核苷酸套件、载体和/或载体***。在本发明的第七方面的一些实施方案中，宿主细胞是细菌细胞(例如，大肠杆菌(E.coli)细胞)。在一些实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌DH5α细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是酵母细胞(例如，酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞)。在一些实施方案中，宿主细胞是昆虫细胞。昆虫宿主细胞的例子可以包括例如果蝇属(Drosophila)细胞(例如，S2细胞)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞(例如，High Five^TM细胞)和草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞(例如，Sf21或Sf9细胞)。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。哺乳动物宿主细胞的例子可以包括例如人胚肾细胞(例如，293细胞或亚克隆用于在悬浮培养物中生长的293细胞)、Expi293TM细胞、CHO细胞、幼仓鼠肾细胞(例如，BHK，ATCC CCL 10)、小鼠支持细胞(例如，TM4细胞)、猴肾细胞(例如，CV1 ATCC CCL 70)、非洲绿猴肾细胞(例如，VERO-76，ATCC CRL-1587)、人***细胞(例如，HELA，ATCC CCL 2)、犬肾细胞(例如，MDCK，ATCC CCL 34)、布法罗(buffalo)大鼠肝细胞(例如，BRL 3A，ATCC CRL 1442)、人肺细胞(例如，W138，ATCC CCL75)、人肝细胞(例如，Hep G2，HB 8065)、小鼠乳腺肿瘤细胞(例如，MMT060562，ATCC CCL51)、TRI细胞、MRC5细胞、FS4细胞、人肝细胞瘤系(例如，Hep G2)、骨髓瘤细胞(例如，NS0和Sp2/0细胞)等。

IV.制备方法

1.表达方法

本公开文本的其他方面涉及产生本文所述的任何结合蛋白的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：

a)在使得宿主细胞表达结合蛋白的条件下培养包含分离的核酸、载体和/或载体***(例如，本文所述的任何分离的核酸、载体和/或载体***)的宿主细胞(例如，本文所述的任何宿主细胞)；以及

b)从宿主细胞中分离结合蛋白。在表达蛋白质的条件下培养宿主细胞的方法是本领域普通技术人员所熟知的。从培养的宿主细胞中分离蛋白质的方法是本领域普通技术人员所熟知的，包括例如通过亲和色谱(例如，两步亲和色谱，包括蛋白质A亲和色谱，随后是尺寸排阻色谱)。

2.纯化方法

在第四方面，本发明涉及用于纯化本发明的第三方面的多特异性结合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)将包含多特异性结合蛋白的溶液施加至第一、第二或第三亲和试剂，所述第一、第二或第三亲和试剂特异性地结合多特异性结合蛋白的针对所述第一、第二或第三亲和试剂的识别位点；以及

(ii)回收不与第一、第二或第三亲和试剂结合的多特异性结合蛋白或与第一或第三亲和试剂结合的多特异性结合蛋白，

其中所述第一、第二和第三亲和试剂中的每一种与多特异性结合蛋白的不同识别位点结合。

在一些实施方案中，所述方法包括以下另外的步骤：将包含在步骤(ii)中回收的多特异性结合蛋白的溶液施加至第一、第二或第三亲和试剂，其中所述亲和试剂与步骤(i)中使用的亲和试剂不同；回收不与第一、第二或第三亲和试剂结合的多特异性结合蛋白或与第一或第三亲和试剂结合的多特异性结合蛋白。

在一些实施方案中，第一亲和试剂与Cκ结合；第二亲和试剂是蛋白质A；和/或第三亲和试剂是蛋白质G。

在一些实施方案中，将本公开文本的结合蛋白通过蛋白质A亲和色谱、κ轻链亲和色谱(例如，根据制造商的说明书使用KappaSelect树脂；GE Healthcare)和任选地λ轻链亲和色谱(例如，根据制造商的说明书使用LambdaFabSelect树脂；GE Healthcare)纯化。在一些实施方案中，将本公开文本的结合蛋白通过蛋白质A亲和色谱、λ轻链亲和色谱(例如，根据制造商的说明书使用LambdaFabSelect树脂；GE Healthcare)和任选地κ轻链亲和色谱(例如，根据制造商的说明书使用KappaSelect树脂；GE Healthcare)纯化。在一些实施方案中，结合蛋白包含两个Fc区，每个Fc区包含CH3结构域，并且仅一个CH3结构域包含在与根据EU索引的人IgG1或IgG4的位置435和436对应的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是H435R和Y436F。在一些实施方案中，将本公开文本的结合蛋白依次通过蛋白质A亲和色谱，然后κ轻链亲和色谱(例如，根据制造商的说明书使用KappaSelect树脂；GEHealthcare)，然后任选地λ轻链亲和色谱(例如，根据制造商的说明书使用LambdaFabSelect树脂；GE Healthcare)纯化。在一些实施方案中，将本公开文本的结合蛋白依次通过蛋白质A亲和色谱，然后λ轻链亲和色谱(例如，根据制造商的说明书使用LambdaFabSelect树脂；GE Healthcare)，然后任选地κ轻链亲和色谱(例如，根据制造商的说明书使用KappaSelect树脂；GE Healthcare)纯化。例如，在一些实施方案中，使结合蛋白与蛋白质A接触，在适合于将结合蛋白从包含0或2个CH3结构域(其包含为H435R和Y436F的氨基酸取代)的结合蛋白中分离出来的条件下从蛋白质A中洗脱，与κ轻链亲和介质(例如，如在KappaSelect树脂中使用；GE Healthcare)接触，并且在适合于将结合蛋白与仅包含λCL结构域的结合蛋白中分离出来的条件下从κ轻链亲和介质中洗脱(例如，根据制造商的说明书)。

适合于蛋白质A洗脱的条件是本领域中已知的，包括但不限于从pH4.5-2.8的逐步洗脱梯度。在一些实施方案中，采用可用于蛋白质纯化的蛋白质A或蛋白质A变体。在一些实施方案中，蛋白质A例如作为色谱介质的一部分附接至底物或树脂。在一些实施方案中，在从κ轻链亲和介质中洗脱之后，使结合蛋白与λ轻链亲和介质(例如，如在LambdaFabSelect树脂中使用；GE Healthcare)接触，并且在适合于将结合蛋白从仅包含κCL结构域的结合蛋白中分离出来的条件下从λ轻链亲和介质中洗脱(例如，根据制造商的说明书)。在一些实施方案中，使用HIC色谱检测本公开文本的结合蛋白。在一些实施方案中，结合蛋白包含：含有λCL结构域的第一多肽链；第二多肽链的CH3结构域，所述CH3结构域包含在与根据EU索引的人IgG1或IgG4的位置354和366对应的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是S354C和T366W；第三条多肽链的CH3结构域，所述CH3结构域包含在与根据EU索引的人IgG1或IgG4的位置349、366、368、407、435和436对应的位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是Y349C、T366S、L368A、Y407V、H435R和Y436F；以及包含κCL结构域的第四多肽链。在一些实施方案中，结合蛋白由宿主细胞产生。在一些实施方案中，从细胞培养基或宿主细胞提取物中纯化结合蛋白。在一些实施方案中，结合蛋白由宿主细胞分泌或者从宿主细胞产生并提取(例如，在与蛋白质A接触之前)。在一些实施方案中，当与蛋白质A接触时，结合蛋白是在细胞培养基或宿主细胞提取物中。在一些实施方案中，从其他结合蛋白、多肽和/或其他细胞组分中纯化出结合蛋白。

在一些实施方案中，将稳定敲除结构域用于促进所需多特异性结合蛋白的优先合成或纯化，其中所述稳定敲除结构域包含(1)消除与靶抗原的结合的一个或多个失活突变；和(2)相对于参考Fab分子，赋予增强的热稳定性(Tm)的一个或多个工程化链间二硫键，其中除了在假Fab分子中，所述参考Fab分子的CH1和CL结构域被VHX和VLX结构域替代以外，所述参考Fab分子与所述假Fab分子相同。

V.配制品/药物组合物

在第八方面，本发明涉及药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载体和治疗有效量的本发明的第一至第三方面中任一方面的蛋白质。

包含结合蛋白的治疗或药物组合物在本公开文本的范围内。本发明的第八方面的一些实施方案包含药物组合物，所述药物组合物包含与针对与给予方式的适合性选择的药学上或生理学上可接受的配制剂混合的治疗有效量的任一种如本文所述的结合蛋白或结合蛋白-药物缀合物。

可接受的配制材料在所用剂量和浓度下对接受者通常是无毒的。

在一些实施方案中，药物组合物可以含有用于改良、维持或保持例如组合物的pH、摩尔渗透压浓度、粘度、澄清度、颜色、等渗性、气味、无菌度、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透的配制材料。合适的配制材料包括但不限于氨基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)、抗微生物剂、抗氧化剂(如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)、缓冲液(如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸)、膨胀剂(如甘露醇或甘氨酸)、螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))、络合剂(如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)、填充剂、单糖、二糖和其他碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖或糊精)、蛋白质(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)、着色剂、调味剂和稀释剂、乳化剂、亲水性聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)、低分子量多肽、成盐抗衡离子(如钠)、防腐剂(如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)、溶剂(如丙三醇、丙二醇或聚乙二醇)、糖醇(如甘露醇或山梨醇)、悬浮剂、表面活性剂或润湿剂(如普朗尼克(pluronics)；PEG；脱水山梨糖醇酯；聚山梨酯(如聚山梨酯20或聚山梨酯80)；曲通(triton)；氨丁三醇；卵磷脂；胆固醇或泰洛沙泊(tyloxapal))、稳定性增强剂(如蔗糖或山梨醇)、张力增强剂(如碱金属卤化物(例如，氯化钠或氯化钾)或甘露醇山梨醇)、递送媒介物、稀释剂、赋形剂和/或药物佐剂(参见例如，出于任何目的通过引用并入本文的Remington’sPharmaceutical Sciences(第18版,A.R.Gennaro编辑,Mack PublishingCompany 1990)和其后续版本)。

在一些实施方案中，最佳药物组合物将由技术人员根据例如预期给予途径、递送形式和所需剂量来决定。此类组合物可能影响结合蛋白的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。

在一些实施方案中，药物组合物中的主要媒介物或载体的性质可以是水性或非水性的。例如，适合于注射的媒介物或载体可以是水、生理盐水溶液或人工脑脊液，可能补充有用于肠胃外给予的组合物中常用的其他材料。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是另外的示例性媒介物。其他示例性药物组合物包含约pH 7.0-8.5的Tris缓冲液或约pH4.0-5.5的乙酸盐缓冲液，它们还可以包括山梨醇或合适的取代物。在本公开文本的一个实施方案中，结合蛋白组合物可以通过将具有所需纯度的所选组合物与呈冻干饼或水溶液形式的任选配制剂混合来制备用于储存。此外，可以使用诸如蔗糖等适当赋形剂将结合蛋白配制为冻干物。

在一些实施方案中，可以选择本公开文本的药物组合物用于肠胃外递送或皮下递送。可替代地，可以选择组合物用于吸入或用于经消化道递送，如口服。此类药学上可接受的组合物的制备在本领域的技术范围内。

在一些实施方案中，配制组分以给予位点可接受的浓度存在。例如，使用缓冲液将组合物维持在生理pH或略低的pH，通常在约5至约8的pH范围内。

在考虑肠胃外给予时，所用治疗组合物可以呈无热原的肠胃外可接受的水溶液形式，其包含在药学上可接受的媒介物中的所需结合蛋白。用于肠胃外注射的特别合适的媒介物是无菌蒸馏水，在其中将结合蛋白配制为适当保存的无菌等渗溶液。又另一种制备可以涉及用提供产物的受控或持续释放的试剂(如可注射微球、生物蚀解性颗粒、聚合化合物(如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠或脂质体)配制所需分子，然后可以将所述分子经由积存注射来递送。还可以使用透明质酸，并且这可以具有促进在循环中的持久持续时间的作用。用于引入所需分子的其他合适的手段包括可植入的药物递送装置。

在一个实施方案中，可以将药物组合物配制用于吸入。例如，可以将结合蛋白配制为吸入用干粉。结合蛋白吸入溶液也可以用用于气溶胶递送的推进剂来配制。在又另一个实施方案中，可以将溶液雾化。

还考虑到可以将某些配制品口服给予。在本公开文本的一个实施方案中，可以将以这种方式给予的多特异性结合蛋白用或不用在固体剂型(如片剂和胶囊)的混配中通常使用的那些载体来配制。例如，胶囊可以设计为在胃肠道中在生物利用度最大化且前***性降解最小化时释放配制品的活性部分。可以包括另外的试剂以有利于结合蛋白的吸收。还可以采用稀释剂、调味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、片剂崩解剂和粘合剂。

另一种药物组合物可以涉及在具有适合于制造片剂的无毒赋形剂的混合物中的有效量的多特异性结合蛋白。通过将片剂溶解于无菌水或另一种适当媒介物中，可以按单位剂量形式制备溶液。合适的赋形剂包括但不限于惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠或碳酸氢钠、乳糖或磷酸钙；或者结合剂，如淀粉、明胶或***胶；或者润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。

本公开文本的另外的药物组合物对于本领域技术人员将是明显的，所述药物组合物包括在持续或受控递送配制品中包含结合蛋白的配制品。用于配制多种其他持续或受控递送手段(如脂质体载体、生物蚀解性微粒或多孔珠和积存注射)的技术也是本领域技术人员已知的。持续释放制剂的另外的例子包括呈成型物品(例如，薄膜或微胶囊)形式的半渗透性聚合物基质。持续释放基质可以包括聚酯、水凝胶、聚丙交酯、L-谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)、乙烯乙酸乙烯酯或聚D(-)-3-羟丁酸。持续释放组合物还可以包括脂质体，所述脂质体可以通过本领域中已知的几种方法中的任何方法来制备。

在一些实施方案中，将用于体内给予的药物组合物通常必须是无菌的。这可以通过经无菌滤膜过滤来实现。在将组合物冻干的情况下，可以在冻干和重构之前或之后使用这种方法进行灭菌。用于肠胃外给予的组合物可以按冻干形式或在溶液中储存。另外，通常将肠胃外组合物置入具有无菌进入口的容器中，所述容器是例如静脉输液袋或具有可以由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶。

一旦已经配制药物组合物，可以将其作为溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体或作为脱水或冻干粉末储存在无菌小瓶中。可以将此类配制品以即用形式或以需要在给予前重构的形式(例如，冻干)储存。

本公开文本还涵盖用于产生单一剂量给予单位的试剂盒。试剂盒可以各自含有具有干燥的多特异性结合蛋白的第一容器和具有水性配制品的第二容器二者。本公开文本的范围内还包括含有单室和多室预填充注射器(例如，液体注射器和冻干剂注射器(lyosyringe))的试剂盒。

将治疗性地采用的结合蛋白药物组合物的有效量将取决于例如治疗背景和目标。本领域技术人员将认识到，治疗的适当剂量水平将因此部分根据以下而变：所递送的分子、结合蛋白所用于的适应证、给予途径以及患者的大小(体重、体表或器官大小)和状况(年龄和一般健康状况)。因此，临床医师可以滴定剂量并修改给予途径以获得最佳治疗效果。

给药频率将取决于所用配制品中结合蛋白的药代动力学参数。通常，临床医师将给予组合物直至达到实现所需效果的剂量为止。因此，组合物可以作为单个剂量、作为随时间的两个或更多个剂量(它们可以含有或可以不含等量的所需分子)或作为经由植入装置或导管进行的连续输注来给予。适当剂量的进一步精细化是由本领域普通技术人员以常规方式进行，并且在本领域普通技术人员常规进行的任务范围内。适当剂量可以通过使用适当的剂量-反应数据来确定。

药物组合物的给予途径与已知方法一致，例如，口服；通过经静脉内、腹膜内、大脑内(脑实质内)、脑室内、肌内、眼内、动脉内、门静脉内或病灶内途径注射；通过持续释放***；或者通过植入装置。在需要的情况下，组合物可以通过推注注射来给予，或者通过输注连续给予，或者通过植入装置来给予。

在一些实施方案中，还可以将组合物经由已经使所需分子吸附或包封于其上的膜、海绵状物或其他适当材料的植入局部给予。在使用植入装置的情况下，可以将所述装置植入任何合适的组织或器官中，并且所需分子的递送可以经由扩散、定时释放推注或连续给予来进行。

VI.治疗/使用方法

在第九方面，本发明涉及治疗其中抗原活性是有害的障碍的方法，所述方法包括向有需要的受试者给予有效量的本发明的第一至第三方面中任一方面的结合蛋白。在一些实施方案中，提供了用作药物的多特异性结合蛋白。

结合蛋白可以用于任何已知的测定方法，如竞争性结合测定、直接和间接夹心式测定以及免疫沉淀测定，所述测定方法用于一种或多种靶抗原的检测和定量。结合蛋白将以适合于所用测定方法的亲和力结合所述一种或多种靶抗原。

对于诊断应用，在一些实施方案中，可以用可检测部分标记结合蛋白。可检测部分可以是能够直接或间接产生可检测信号的任何部分。例如，可检测部分可以是放射性同位素，如³H、¹⁴C、³²P、³⁵S、¹²⁵I、⁹⁹Tc、¹¹¹In或⁶⁷Ga；荧光或化学发光化合物，如异硫氰酸荧光素、罗丹明或萤光素；或者酶，如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶。

结合蛋白也可用于体内成像。可以将用可检测部分标记的结合蛋白给予动物，例如给予至血流中，并且测定宿主中经标记的抗体的存在和位置。可以用在动物中通过核磁共振、放射学或本领域中已知的其他检测手段可检测的任何部分标记结合蛋白。

对于临床或研究应用，在一些实施方案中，可以将结合蛋白与细胞毒性剂缀合。与细胞毒性剂偶联的多种抗体(即，抗体-药物缀合物)已经用于将细胞毒性有效负载靶向特定肿瘤细胞。细胞毒性剂和将所述药剂与抗体缀合的接头是本领域中已知的；参见例如，Parslow,A.C.等人(2016)Biomedicines 4:14；和Kalim,M.等人(2017)DrugDes.Devel.Ther.11:2265-2276。

本公开文本还涉及包含结合蛋白和可用于检测生物样品中的靶抗原水平的其他试剂的试剂盒。此类试剂可以包括可检测标记、封闭血清、阳性和阴性对照样品以及检测试剂。在一些实施方案中，试剂盒包含组合物，所述组合物包含本文所述的任何结合蛋白、多核苷酸、载体、载体***和/或宿主细胞。在一些实施方案中，试剂盒包含容器以及在所述容器上或与所述容器相连的标签或包装说明书。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可以由诸如玻璃或塑料等多种材料制成。容器容纳组合物，所述组合物(其本身或与另一种组合物组合)可有效治疗、预防和/或诊断病症，并且容器可以具有无菌进入口(例如，容器可以是静脉输液袋或具有可以由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。在一些实施方案中，标签或包装说明书指示，所述组合物用于预防、诊断和/或治疗所选病症。可替代地或另外地，制品或试剂盒还可以包含含有药学上可接受的缓冲液(如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液)的第二(或第三)容器。制品或试剂盒还可以包括从商业和用户角度所需的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针和注射器。

在一些实施方案中，将本公开文本的结合蛋白给予有需要的患者用于治疗或预防癌症。在一些实施方案中，本公开文本涉及预防和/或治疗增殖性疾病或障碍(例如，癌症)的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向患者给予治疗有效量的至少一种本文所述的结合蛋白或与其相关的药物组合物。在一些实施方案中，患者是人。

在一些实施方案中，所述至少一种结合蛋白是与一种或多种抗癌疗法(例如，本领域已知的任何抗癌疗法，如化学治疗剂或疗法)组合给予的。在一些实施方案中，所述至少一种结合蛋白是在所述一种或多种抗癌疗法之前给予的。在一些实施方案中，所述至少一种结合蛋白是与所述一种或多种抗癌疗法同时给予的。在一些实施方案中，所述至少一种结合蛋白是在所述一种或多种抗逆转录病毒疗法之后给予的。

实施例

在下文详细描述本发明之前，应理解，本发明并不限于本文所述的特定方法、方案和试剂，因为这些可以改变。还应理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不意图限制本发明的范围，本发明的范围将仅受所附的权利要求限制。除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。在特定实施方案中，本文所用的术语如“A multilingual glossary ofbiotechnological terms:(IUPAC Recommendations),”Leuenberger,H.G.W,Nagel,B.和Kolb,H.编辑.(1995),Helvetica Chimica Acta,CH-4010Basel,Switzerland中所述来定义。除非本文另外定义，否则本文所用的科学和技术术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。在任何潜在歧义的情况下，本文所提供的定义优先于任何字典或非固有定义。除非上下文另外要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。除非另外陈述，否则“或”的使用意指“和/或”。术语“包括(including)”以及其他形式如“包括(includes)”和“包括(included)”的使用是非限制性的。如本文所用，除非另外陈述，否则单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述(the)”包括多个/多种提及物。因此，例如，提及“一种蛋白质”包括多种蛋白质分子。

此外，除非另外指示，否则本文所述的实验使用本领域技术范围内的常规分子和细胞生物学和免疫学技术。此类技术是熟练工作者所熟知的，并且在文献中已充分解释。参见例如，Ausubel等人编辑,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,NY,N.Y.(1987-2008)，包括所有增刊；Molecular Cloning:A LaboratoryManual(第四版)MR Green和J.Sambrook；以及Harlow等人,Antibodies:A LaboratoryManual,第14章,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor(2013,第2版)。

在本说明书的整个正文中引用了若干文献。本文在上文或下文中引用的每个文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书、指导等)都是通过引用以其整体特此并入。本文中的任何内容都不应解释为承认本发明因在先发明而无权早于这种披露内容。

在下文中，将描述本发明的要素。这些要素是用具体实施方案来列出，然而，应理解，这些具体实施方案可以按任何方式和以任何数量组合以产生另外的实施方案。差异性描述的实施例和优选/特定实施方案不应解释为将本发明限制于仅明确描述的实施方案。本说明书应理解为支持并涵盖组合明确描述的实施方案与任何数量的所公开和/或优选要素的实施方案。此外，除非上下文另外指示，否则应考虑本申请的说明书公开本申请中所有所述要素的任何排列和组合。

通常，本文所述的结合细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交使用的术语是本领域中熟知且常用的那些。除非另外指示，否则本文所提供的方法和技术通常是根据本领域中熟知并且如本说明书通篇引用和讨论的各个通用和更具体参考文献中所述的常规方法来进行的。根据制造商的说明书来进行酶反应和纯化技术，如本领域通常所实现的或如本文所述。关于本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的术语以及本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学的实验室程序和技术是本领域中熟知且常用的那些。将常规技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者的治疗。

实施例1：鉴定合适的替代支架

本文所公开的结合蛋白包含各种抗体形式中的敲除VH/VL结构域对一个CH1/CL对的替代(参见图1、2、7、10-13)。为了鉴定合适的替代支架来替代CH1/CL二聚体，研究了将二硫桥引入某些VH/VL对中。此外，研究了另一个VH/VL对的可表达性和与其的融合。

为了解决正确轻链配对的问题，曲妥珠单抗被确定为替代CH1/CL二聚体的合适替代支架。

实施例2：使用曲妥珠单抗可变结构域替代CH1/CL

已确定在位置VH44和VL100处的半胱氨酸残基是相容的以在曲妥珠单抗(在本文中称为ds-曲妥珠单抗)的VH/VL之间产生二硫键，从而稳定异二聚体。为了确定其热稳定性，将ds-曲妥珠单抗结构域以1mg/mL的浓度在D-PBS缓冲液(GIBCO)中于40℃下孵育14天。将相同浓度的对照样品保持在-80℃和4℃。应力测试完成之后，通过分析型尺寸排阻色谱(SEC)分析样品的总聚集体含量。使用BioSECcurity仪器(PSS Polymer)用TSKgelSuperSW3000柱(4.6mm x 300mm)和TSKgel SuperSW HPLC保护柱(Tosoh Bioscience)在25℃下进行分析型SEC。所述分析是以0.25ml/min的流速使用250mM NaCl、100mM磷酸钠(pH6.7)来运行的，并且在280nm和260nm下进行检测。在436nm下检测静态光散射。将5μl蛋白质样品(1mg/ml)施加至柱。使用WinGPC软件8.1版(PSS Polymer)进行数据评价。对于分子量的估计，用分子量范围为6.5至670kDa的蛋白质标准品校准SEC柱。

发现ds-曲妥珠单抗支架(具有VH44/VL100半胱氨酸修饰)将热稳定性增加了4℃(参见图3A-C)。

实施例3：研究与假IgG设计中的VH/VL的连接

产生了假IgG1构建体，其含有二硫键稳定的曲妥珠单抗框架作为CH1/CL的替代支架。用G4S(SEQ ID NO:102)或(G4S)2(SEQ ID NO:103)接头将ds-曲妥珠单抗支架与感兴趣的VH/VL对融合(参见图6)。

确定熔点(T_m)

使用差示扫描荧光测定法(DSF)确定熔点(T_m)。将样品在白色96孔半裙板(BIORAD)中在D-PBS缓冲液(Invitrogen)中稀释至0.2μg/μl的最终浓度，包括SYPRO-Orange染料(Invitrogen，DMSO中的5000x原液)在D-PBS中的4x浓缩溶液。所有测量都是使用MyiQ2实时PCR仪器(BIORAD)一式双份地进行的。在iQ5软件2.1版(BIORAD)中生成熔融曲线的负一阶导数曲线(-d(RFU)/dT)。然后将数据导出至Excel中进行Tm确定和数据的图形显示。

与ds-曲妥珠单抗融合地表达了六种抗体序列，并且每种融合蛋白以及不具有ds-曲妥珠单抗结构域的假IgG抗体的蛋白质A纯化后的单体％和熔解温度描述于下表4中。与WT-IgG相比表达水平略低，并且与WT-IgG相比单体含量的量略低。

表4：假IgG1抗体-ds-曲妥珠单抗融合蛋白的单体％和熔解温度

实施例4：产生ds-Tras敲除(dsTrasKO)变体

通过在曲妥珠单抗抗体的互补位区域中引入四个关键点氨基酸残基突变来敲除曲妥珠单抗的结合活性，以影响所述抗体与受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2(HER2)的结合能力。基于PDB结构1N8Z(可在PDB公共数据库中获得)对曲妥珠单抗建模。鉴定出重链上的四个位置可能破坏ds-曲妥珠单抗与其抗原的相互作用。所述位置包括精氨酸R59和R50二者，它们结合HER2上的谷氨酸和天冬氨酸。通过将精氨酸突变成谷氨酸残基恢复电荷应导致HER2的排斥。不意图受科学理论的束缚，另外两个位置(酪氨酸Y33和Y105)似乎通过与苯丙氨酸的π-π相互作用来稳定所述复合物。不意图受科学理论的束缚，丙氨酸的突变应破坏这种相互作用。使用BIOVIA Discovery Studio套件分析了来自1N8Z文件的晶体学数据。应特别注意抗体(曲妥珠单抗fab)与其靶标(HER2蛋白结构域)之间的现有界面区域(参见图4)。

分析1N8Z共晶界面区域

在抗体和靶标界面区域分析期间，使用BIOVIA Discovery Studio非键合相互作用监测器证明所有非共价相互作用合格。表5呈现了结果表的摘录。对于每种相互作用，表5呈现了在相互作用原子之间的距离、相互作用类型的性质和相互作用原子的特征。

表5.

从非键合相互作用监测器中提取1N8Z PDB文件。链A、B和C分别对应于曲妥珠单抗 Fab轻链、曲妥珠单抗Fab重链和HER2。

基于曲妥珠单抗fab与HER2蛋白之间发生的非共价相互作用的表，选择某些相互作用来消除以便破坏结合相互作用。

提出的破坏结合相互作用的突变组合

基于非键合相互作用数据选择以下四个氨基酸残基突变，以便维持原始曲妥珠单抗序列。

曲妥珠单抗重链精氨酸50残基的情况：

抗体的这个精氨酸残基使得与HER2残基谷氨酸558和天冬氨酸560发生盐桥相互作用。将精氨酸50突变成谷氨酸残基，以便产生HER2残基谷氨酸558和天冬氨酸560的排斥。

曲妥珠单抗重链精氨酸59残基的情况：

抗体的这个精氨酸残基使得与HER2残基谷氨酸558和天冬氨酸560发生盐桥相互作用。将精氨酸59突变成谷氨酸残基，以便产生HER2残基谷氨酸558和天冬氨酸560的排斥。

酪氨酸重链精氨酸33残基的情况：

抗体的这个酪氨酸33残基使得与HER2残基苯丙氨酸573发生π相互作用。将酪氨酸33突变成丙氨酸残基，以便破坏抗体与其靶标之间发生的这些π相互作用。

酪氨酸重链精氨酸105残基的情况：

抗体的这个酪氨酸105残基使得与HER2残基苯丙氨酸573发生π相互作用。将酪氨酸105突变成丙氨酸残基，以便破坏抗体与其靶标之间发生的这些π相互作用。

表6中呈现了提出将被突变的氨基酸残基的特定组合。这些组合产生曲妥珠单抗抗体的两种变体。

表6.曲妥珠单抗的敲除变体(TrasKO)

变体1Fab包含所有四个点突变。具有两个带正电荷的残基逆转成带负电荷的残基的变体2Fab拥有将HER2蛋白排斥到原始曲妥珠单抗HER2结合区的排斥区域。具有与HER2苯丙氨酸573的π相互作用的破坏的变体3Fab诱导曲妥珠单抗-HER2复合物的去稳定。发现所有三种dsTrasKO变体都消除与HER2的结合(参见图5A-图5B)。变体2(dsTrasKO2)被鉴定为最佳生产者。

实施例5：评价dstrasko2作为CH1/CL的替代支架

以假IgG(单特异性)形式(参见图6A)和假Fab(参见图6B)评价dsTrasKO变体。经测试的假IgG和假Fab形式具有与亲本抗体相似的表达和纯化特征(参见表7)。

表7：具有CH1/CL的dsTrasKO2结构域替代的假IgG抗体的表达和纯化结果

实施例6：使用dstrasko2作为CH1/CL的替代支架评价具有天然结构的双特异性抗体

将dsTrasKO2结构域作为具有天然IgG结构的双特异性抗体中的替代支架进行评价。特别地，合成了在Fc中具有RF突变的抗IL4-dsTrasKO(Var2)x抗IL13-huIgG1双特异性设计(参见图7)。

i.表达dsTrasKO2双特异性分子

使编码对应构建体的两条重链(dsTrasKO2-杵和WT-臼)和两条轻链(dsTrasKO和WT-κ/λ)的表达质粒在大肠杆菌DH5α中繁殖。使用Qiagen EndoFree Plasmid Mega试剂盒从大肠杆菌中制备用于转染的质粒。

使用聚乙烯亚胺转染试剂用所指示的轻链(LC)和重链(HC)质粒转染在F17无血清悬浮培养物(Invitrogen)中生长的HEK 293-FS细胞。在37℃下培养7天之后，通过离心去除细胞，并且使上清液通过0.22μm过滤器以去除颗粒。

对于纯化，在MabSelect SuRe柱(目录号：11-0034-93，GE Healthcare)上捕获抗体并用0.1M柠檬酸盐缓冲液(pH 3.0)洗脱，并且使用HiPrep 26/10脱盐柱(目录号：17-05087-02，GE Healthcare)直接脱盐。可能的同二聚体dsTrasKO2单特异性分子将通过使用另外的KappaSelect捕获步骤(0.1M甘氨酸pH 2,7洗脱缓冲液)分选出(参见图14)。在通过尺寸排阻色谱(SEC，如上文实施例2中所述进行)使用Superdex200 26/60(GE)精制(polishing)蛋白质和最终的超滤浓缩步骤之后，将蛋白质用于进一步表征。关于dsTrasKO2双特异性构建体的纯化结果，参见表8。关于代表性的双特异性设计和纯化结果，参见图7A-图7D。

表8.dsTrasKO2双特异性构建体的纯化产量

评价包含CH1/CL对的dsTrasKO2替代的双特异性抗体的抗原结合。

将表面等离子体共振(SPR)用于评估抗原与抗体的结合。使用表面等离子体共振(SPR)用BIAcore 3000仪器(GE Healthcare)和HBS-EP缓冲液(GE Healthcare)测量抗原与抗体构建体的结合。将人IL4(IL004，Millipore)和人IL13(IL012，Millipore)、人HER2(1129-ER，R&D Systems)、人TNFa(H8916，SIGMA Aldrich)、人CTLA4(CT4-H5229，ACROBiosystems)、人PD-1(8986-PD，R&D Systems)和人IL6Ra(227-SR/CF，R&D Systems)用作抗原。在研究级CM5芯片(GE Life Sciences)上使用标准程序经由伯胺基团(11000RU)固定抗人Fc捕获抗体(人抗体捕获试剂盒，GE Life Sciences)。以导致30RU的最大分析物结合的经调节的RU值以10μl/min的流速捕获配体。通过用抗人Fc抗体捕获抗原来进行与HER2的结合测试。将所测试的抗体构建体用作分析物，并且以100nM浓度注射240秒，其中解离时间为300秒，流速为30μL/min。通过注射3nM至100nM的分析物的两倍连续稀释液使用捕获的抗体进行结合动力学测量。对于人IL4和IL13，分别使用0.1nM至3nM和0.8nM至25nM的稀释系列。通过用捕获试剂盒所提供的再生缓冲液的2min注射使芯片表面再生。用空白芯片表面和HBS-EP缓冲液空白对传感图进行双重参照。使用BIAevaluation软件4.1版进行数据分析。mAb、假IgG和双特异物的结合特征示于下表9中。

表9.通过SPR测得的结合动力学：mAb、假IgG和双特异物的比较

SPR结果显示，与dsTrasKO2融合的各种VH/VL保留了亲本抗原结合亲和力，包括双特异性抗体。

分析蛋白质完整性

通过LC-质谱(LC-MS)分析异二聚体构建体的蛋白质完整性和潜在错误配对。用12.5μg蛋白质(在用0.5μl PNGaseF(无甘油，New England Biolabs)处理的D-PBS缓冲液中稀释至0.5mg/ml)将蛋白质样品在37℃下去糖基化15小时。使用6540UHD Accurate-MassQ-TOF LC/MS仪器(Agilent)进行LC-MS分析。使用Poroshell 300SB-C8 5μm(75x0.5mm)(Agilent)和保护柱Poroshell 300SB-C8 5μm(2.1x12.5mm)(Agilent)以180μL/min进行反相(RP)色谱。洗脱剂是LC水、0.1％甲酸(A)以及90％乙腈、10％LC水、0.1％甲酸(B)。将2μg蛋白质注射到柱上，并且使用在13分钟内从0％至100％B的线性梯度进行洗脱。使用MassHunter软件B.06(Agilent)进行数据分析。使用GPMAW软件9.13a2版(LighthouseData)基于蛋白质的氨基酸序列计算分子质量。显示dsTrasKO2-抗体融合蛋白大部分是完整的，并且展现出正确的异二聚体配对(参见下表10)。

表10.dsTrasKO2-抗体融合蛋白的LC-MS结果

除了LC-MS分析以外，还通过疏水性相互作用色谱(HIC)对双特异性样品进行分析，以检测潜在的错误配对或出乎意料的种类。使用LC10 HPLC仪器(Shimadzu)用TSKgelEther-5PW 10μm(2x75mm)(Tosoh Bioscience)在25℃下进行分析型HIC。所述分析是以0.1ml/min的流速来运行的，并且在280nm下进行检测。将5μg未稀释的蛋白质样品施加至柱。梯度洗脱是从0至30min(0％至100％B)，随后是10min的100％B和15min的再平衡。缓冲液A由1.5M硫酸铵、25mM磷酸钠(pH 7.0)构成。缓冲液B由25mM磷酸钠(pH 7.0)构成。使用LabSolutions软件5.85版(Shimadzu)进行数据评价。数据显示，dsTrasKO2双特异性样品具有均匀的HIC谱，表明不存在出乎意料的种类并且双特异性样品具有正确的配对(参见图8)。

热稳定性：假IgG和双特异物的比较

如上文实施例2中所述评估dsTrasKO2假IgG和双特异性样品的热稳定性。如实施例3中所述，使用差示扫描荧光测定法(DSF)确定熔点(Tm)。与亲本单克隆IgG相比，基于dsTrasKO2的构建体显示出降低的熔解温度，并且在2周的热稳定性测定(40℃、4℃和-80℃)中未检测到稳定性受损(参见下表11)。

表11.dsTrasKO2-抗体构建体的热稳定性。

实施例7：假fab IL-13的晶体结构

进行dsTrasKO2-IL13-假Fab的结晶用于结构研究。将结晶试验设置为在标准两滴式(two-drop)96孔MRC板中使用1:1的蛋白质:储液比的沉滴实验(sitting-dropexperiment)，并且在20℃下孵育。针对各种可商购获得的稀疏矩阵筛，筛选TrasKO2-CH1/CL和抗IL13-TrasKO2二者的结晶命中。通过将100nl蛋白质溶液与100nl储液混合来制备在20mM HEPES pH 7.5、0.1M氯化钠中的TrasKO2-CH1/CL(原液为15mg/ml)和抗IL13-TrasKO2(原液为15.6mg/ml)的筛选滴剂，并且将其在针对80μl储液的沉滴蒸汽扩散实验中平衡。用由0.1M柠檬酸磷酸钠pH 4.2、20％(w/v)聚乙二醇8000和0.2M氯化钠组成的储液，使适合于数据收集和结构解析的TrasKO2-CH1/CL最终晶体在20℃下生长。用由0.1M CHES pH 9.5和20％(w/v)聚乙二醇8000组成的储液使衍射级抗IL13-TrasKO2晶体生长。在液氮中快速冷却之前，经由添加25％(w/v)乙二醇(最终浓度)将所有晶体进行冷冻保护。

数据收集和结构确定

在瑞士菲林根(Villingen)的Swiss Light Source(SLS)的光束线PSII上收集衍射数据。使用CCP4程序套件(Winn等人,2011)的XDS(Kabsch,2010)和AIMLESS(Evans&Mushudov,2013)的组合处理衍射数据。TrasKO2-CH1/CL结晶，空间群为I23，晶胞参数为

90.00°、90.00°、90.00°，数据扩展到

的分辨率。抗IL13-TrasKO2的晶体属于晶胞参数为145.37 145.37 52.06 90.00 90.00 120.00的空间群P3221，并且衍射至

采用Phaser的CCP4实施方案通过分子置换来解出结构(McCoy等人,2007)。对于TrasKO2-CH1/CL，将曲妥珠单抗-VH-VL结构域的修饰形式和pdb条目1n8z的CH1/CL结构域用作搜索模型。用Fab抗IL13的Sanofi内部结构的抗IL13 VH/VL结构域和1n8z VH/VL结构域的修饰形式作为定相模型(phasing model)，进行对抗IL13-TrasKO2的分子置换。通过使用Coot(Emsley等人,2010)和Refine(Bricogne,2017)进行迭代轮次的手动模型构建和精细化来构建原子模型。对于TrasKO2-CH1/CL，最终模型的R-和R-free因子是19.2/23.2，并且对于抗IL13-TrasKO2，是21.0/31.2(关于晶体结构，参见图9)。

实施例8：使用dstrasko2作为CH1/CL的替代支架评价具有串联结构的双特异性抗体

将dsTrasKO2结构域作为双特异性串联IgG设计中的替代支架进行评价。特别地，合成并测试了抗GITR-dsTrasKO2 x抗OX40-κ]-huIgG1串联IgG设计(参见图10-12)。

表达dsTrasKO2双特异性串联分子

使编码对应构建体的重链和两条轻链(dsTrasKO和WT-κ/λ)的表达质粒在大肠杆菌DH5a中繁殖。使用Qiagen EndoFree Plasmid Mega试剂盒从大肠杆菌中制备用于转染的质粒。

使用聚乙烯亚胺转染试剂用所指示的LC和HC质粒转染在F17无血清悬浮培养物(Invitrogen)中生长的HEK 293-FS细胞。在37℃下培养7天之后，通过离心去除细胞，并且使上清液通过0.22μm过滤器以去除颗粒。

对于纯化，在MabSelect SuRe柱(目录号：11-0034-93，GE Healthcare)上捕获抗体并用0.1M柠檬酸盐缓冲液(pH 3.0)洗脱，并且使用HiPrep 26/10脱盐柱(目录号：17-05087-02，GE Healthcare)直接脱盐。可能的同二聚体dsTrasKO2单特异性分子将通过使用另外的KappaSelect捕获步骤(0.1M甘氨酸pH 2,7洗脱缓冲液)分选出(参见图14)。在通过尺寸排阻色谱(SEC)使用Superdex200 26/60(GE)精制蛋白质和最终的超滤浓缩步骤之后，将蛋白质用于进一步表征。

关于代表性的双特异性设计和纯化结果，参见图12A-图12D。

实施例9：使用dstrasko2作为CH1/CL的替代支架评价具有CODV结构的三特异性抗体

将dsTrasKO2结构域作为三特异***叉可变结构域(CODV)设计中的替代支架进行评价。特别地，合成并测试了CODV-抗Ox40 x抗PD1]x抗CD137-dsTrasKO2-huIgG1-LALA-KIH-RF构建体(参见图13)。

表达dsTrasKO2三特异性CODV分子

使编码对应构建体的重链和两条轻链(dsTrasKO和WT)的表达质粒以及编码对应构建体的两条重链(CODV-杵和dsTrasKO2-臼)和两条轻链(CODV和dsTrasKO)的表达质粒在大肠杆菌DH5a中繁殖。使用Qiagen EndoFree Plasmid Mega试剂盒从大肠杆菌中制备用于转染的质粒。

对于纯化，在MabSelect SuRe柱(目录号：11-0034-93，GE Healthcare)上捕获抗体并用0.1M柠檬酸盐缓冲液(pH 3.0)洗脱，并且使用HiPrep 26/10脱盐柱(目录号：17-05087-02，GE Healthcare)直接脱盐。将样品在MonoS阳离子交换柱(目录号：17-5169-01，GE Healthcare，在0.01M L-组氨酸pH6.0缓冲液中的0-1M NaCl盐梯度)上进一步纯化。在超滤浓缩步骤之后，将蛋白质用于进一步表征。

关于代表性的三特异性设计和纯化结果，参见图13A-图13D。

实施例10：使用dstrasko2作为CH1/CL的替代支架评价双特异性T细胞衔接器抗体

通用方法

分析型尺寸排阻色谱(SEC)

使用BioSECcurity仪器(PSS Polymer)用AdvanceBio 300柱(4.6mm x 300mm)和AdvanceBio 300保护柱(Agilent Technologies)在25℃下进行分析型SEC。所述分析是以0.5ml/min的流速使用2x浓缩的D-PBS缓冲液(Thermo Fisher Scientific)来运行的，并且在280nm下进行检测。将10μl蛋白质样品(1mg/ml)施加至柱。使用WinGPC软件8.1版(PSSPolymer)进行数据评价。对于分子量的估计，用蛋白质校准标准混合物(AgilentTechnologies)校准SEC柱。

分析型疏水性相互作用色谱(HIC)

使用配备有TSKgel Butyl-NPR柱(2.5μm，4.6x35mm)(Tosoh Bioscience)的LC10HPLC仪器(Shimadzu)或Vanquish HPLC仪器(Thermo Fisher Scientific)在25℃下进行分析型HIC。所述分析是以1ml/min的流速来运行的，并且在280nm下进行检测。将5μg未稀释的蛋白质样品施加至柱。梯度洗脱是在7min内从15％B至85％B，随后是1min至100％B，然后1min至15％B，然后在15％B下3分钟平衡。缓冲液A由1.5M硫酸铵、25mM磷酸钠(pH 7.0)构成。缓冲液B由25mM磷酸钠(pH 7.0)构成。使用LabSolutions软件5.85版(Shimadzu)或Chromeleon 7软件(Thermo Fisher Scientific)进行数据评价。

nanoDSF

使用纳米差式扫描荧光测定法(nano differential scanning fluorimetry，nanoDSF)确定蛋白质变性的起始温度(T起始)和熔点(Tm)。将样品在配制缓冲液中稀释至0.5μg/μl的最终浓度并一式双份地加载到nanoDSF毛细管(Nanotemper Technologies)中。所有测量都是使用Prometheus NT.plex nanoDSF装置(Nanotemper Technologies)进行的。从20℃到95℃，加热速率为1℃/分钟。使用PR.热控制软件2.3.1版(NanotemperTechnologies)记录数据并使用PR.稳定性分析软件1.0.3版(Nanotemper Technologies)进行分析。

表面等离子体共振(SPR)

使用表面等离子体共振(SPR)用BIAcore 8K仪器(GE Healthcare)和HBS-EP+缓冲液(GE Healthcare)测量抗原与抗体构建体的结合。对于结合动力学和亲和力确定，将人CD3εδ-Fc-His和人CD123-Fc-His融合蛋白(二者均来自内部来源)用作抗原。在研究级CM5芯片(GE Life Sciences)上使用标准程序经由伯胺基团(11000RU)固定抗His捕获抗体(His捕获试剂盒，GE Life Sciences)。将抗原以10μL/min的流速通过抗His捕获芯片表面捕获90秒，以达到在10RU与30RU之间的抗体结合水平。将抗体以30μL/min按从100nM至3.1nM(用于确定CD123亲和力)以及从400nM至3.1nM或者100nM至3.1nM(用于确定CD3结合亲和力)的两倍稀释系列注射240秒。通过注射HBS-EP+缓冲液持续1200秒以30μL/min测量解离。通过注射再生缓冲液(His捕获试剂盒，GE Life Sciences)使芯片表面再生。用空白芯片表面和HBS-EP+缓冲液空白对传感图进行双重参照。使用Biacore 8K评价软件1.11.7442版(GE Healthcare)，将数据用1:1朗缪尔结合模型拟合，以确定动力学常数和亲和常数ka、kd和KD。

对于抗体对CD3和CD123的相对结合水平(％Rmax)的评估，通过抗Fc亲和捕获将抗体捕获至传感器芯片。在此测定中，使用了人CD3εδ-FLAG-His(#CT038-H2508H，SinoBiological)和人CD123(#301-R3/CF，R&D Systems)蛋白。在研究级CM5芯片(GE LifeSciences)上使用标准程序经由伯胺基团(11000RU)固定抗人Fc捕获抗体(人抗体捕获试剂盒，GE Life Sciences)。以导致10至30RU的最大分析物结合的经调节的RU值以10μl/min的流速捕获抗体。将抗原用作分析物并以400nM和100nM浓度(对于CD3εδ-FLAG-His)或以100nM浓度(对于CD123)注射。将抗原注射240秒，其中解离时间为300秒，流速为30μL/min。通过用捕获试剂盒所提供的再生缓冲液的2min注射使芯片表面再生。用空白芯片表面和HBS-EP缓冲液空白对传感图进行双重参照。使用Biacore 8K评价软件1.11.7442版(GEHealthcare)进行数据分析和结合水平确定。使用最大结合水平除以理论Rmax值来计算％Rmax值。从捕获水平R捕获、结合化学计量N以及抗体分子量Mw(Ab)和抗原分子量Mw(Ag)，根据Rmax＝R捕获^*N^*(Mw(Ag)/Mw(Ab))来计算理论Rmax值。

质谱

通过LC-质谱(LC-MS)分析异二聚体构建体的蛋白质完整性和潜在错误配对。用12.5μg蛋白质(在用0.5μL PNGaseF(无甘油，New England Biolabs)处理的LC-MS级水(Thermo Scientific)中稀释至0.17mg/mL)将蛋白质样品在37℃下去糖基化16小时。使用Orbitrap Fusion Lumos Tribrid质谱仪仪器进行LC-MS分析。使用MabPac RP HPLC柱(分析型4μm粒径，2.1x100mm)(Thermo Scientific)以300μL/min进行反相(RP)色谱。洗脱剂是LC水、0.1％甲酸(A)以及90％乙腈、10％LC水、0.1％甲酸(B)。将2μg蛋白质溶液注射到柱上，并且使用在12分钟内从0％至95％B的线性梯度进行洗脱。使用Expressionist软件13.0.3(Genedata)进行数据分析。使用GPMAW软件10.32b1版(Lighthouse data)基于蛋白质的氨基酸序列计算分子质量。

使用双特异性TrasKO2分子的细胞毒性测定

在细胞毒性测定中使用原代人T细胞分析双特异性TrasKO2分子。在Leucosep管(Greiner Bio-One，#227290)中使用15mL Histopaque(Sigma-Aldrich，#10771)和以1000xg离心10min分离来自健康供体血液的人外周单核细胞。将分离的PBMC在补充有5％MACS BSA原液(Miltenyi Biotec，#130-091-370)的autoMACS冲洗缓冲液(MiltenyiBiotec，#130-091-222)中洗涤两次。用MACSpro分离器(Miltenyi Biotec)和Pan T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，#130-096-535)使用制造商的方案从人PBMC中分离原代人T细胞。将分离的人T细胞以5x10⁶个细胞/mL重悬于补充有10％FCS HI(Gibco，#10082-147)的RPMI GlutaMAX I培养基(Gibco，#72400)中。在细胞毒性测定之前，将THP-1靶细胞(ADCCTIB-202)用1μMCFSE(Invitrogen，#C1157)在37℃下染色15min。将细胞在RPMI+GlutaMAX I培养基中洗涤两次，并且以400xg离心5min。将THP-1靶细胞以5x10⁵个细胞/mL重悬于补充有10％FCS HI的RPMI培养基中。将CFSE标记的THP-1细胞与人pan T细胞以10:1的效应细胞与靶细胞比率混合并以100μL/孔的总体积接种于96孔测定板(Greiner BioOne，#650185)中。将双特异性TrasKO2分子在从10nM开始至0nM(1:6稀释)的11个稀释系列中以5μL/孔的体积添加到细胞中，并且在37℃和5％CO2下孵育20h。在孵育之后，将细胞用5μg/mL 7-AAD(Invitrogen，#A1310)在4℃下染色30min。为了确定细胞毒性，通过在LSRII流式细胞仪(BD)上对CFSE/7-AAD双阳性THP-1细胞进行门控来测量死靶细胞，并且用Xlfit软件确定EC50值。

将dsTrasKO2结构域作为双特异性T细胞衔接器抗体设计中的替代支架进行评价。通过将抗TCRα/β或两种不同抗CD3ε中的一种用作效应子臂以及将抗CD123用作靶标臂来产生双特异性T细胞衔接器。通过使用TNP抗体序列(三硝基苯酚抗体)产生两个臂的阴性对照。通过MabSelect Sure、随后是KappaSelect和SEC纯化双特异性蛋白。将双特异性抗体表达为野生型双特异性IgG(检测天然发生的错误配对)或表达成在Fab臂之一(产生了两个可能的再工程化Fab臂)上具有TrasKO2替代。在下表12中描述了双特异性抗体的生物物理学表征。

表12.dsTrasKO2-T细胞衔接器抗体构建体的生物物理学表征。

除了上述生物物理学表征以外，还在基于细胞的细胞毒性测定中分析了双特异性TrasKO2分子。如图15A中所示，所有三种抗CD3εx抗CD123双特异性抗体都展示出相当且稳健的活性。抗体ID编号34和35中dsTrasKO2结构域的存在对活性没有负面影响，然而减少了链错误配对。使用了含有TNP抗体序列的阴性对照抗体ID编号45和46。如图15B中所示，具有替代性抗CD3ε结合结构域的所有三种抗CD3εx抗CD123双特异性抗体也都展示出相当且稳健的活性。抗体ID编号37和38中dsTrasKO2结构域的存在对活性没有负面影响，然而减少了链错误配对。作为阴性对照，使用了含有TNP抗体序列的抗体ID编号47和48。

Claims

1.一种结合蛋白，其包含：

至少一个假Fab部分，所述至少一个假Fab部分包含(1)第一VL结构域(VLa)，所述第一VL结构域与第一VH结构域(VHa)配对以形成结合靶抗原A的第一功能性抗原结合位点；(2)第一稳定敲除VH结构域(VHX)，所述第一稳定敲除VH结构域与第一稳定敲除VL结构域(VLX)配对以形成第一稳定敲除结构域；并且

其中所述稳定敲除结构域包含(3)消除其与靶抗原的结合的一个或多个失活突变；和(4)一个或多个工程化链间二硫键。

2.根据权利要求1所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白是多特异性结合蛋白，所述多特异性结合蛋白还至少包含第二VL结构域(VLb)，所述第二VL结构域与第二VH结构域(VHb)配对以形成结合靶抗原B的第二功能性抗原结合位点。

3.一种多特异性结合蛋白，其包含：

a)第一假Fab部分，所述第一假Fab部分包含(1)第一VL结构域(VLa)，所述第一VL结构域与第一VH结构域(VHa)配对以形成结合靶抗原A的第一功能性抗原结合位点；(2)第一稳定敲除VH结构域(VHX)，所述第一稳定敲除VH结构域与第一稳定敲除VL结构域(VLX)配对以形成第一稳定敲除结构域；以及

其中所述稳定敲除结构域包含(5)消除其与靶抗原的结合的一个或多个失活突变；和(6)一个或多个工程化链间二硫键。

4.一种多特异性结合蛋白，其包含：

b)第一Fab部分，所述第一Fab部分包含(3)第二VL结构域(VLb)，所述第二VL结构域与第二VH结构域(VHb)配对以形成结合靶抗原B的第二功能性抗原结合位点；(4)第一CH1结构域，所述第一CH1结构域与第一CL结构域配对；以及

c)接头部分，所述接头部分可操作地连接所述第一Fab部分和所述第一假Fab部分，

5.根据前述权利要求中任一项所述的结合蛋白，其中所述接头部分是肽接头。

6.根据权利要求5所述的结合蛋白，其中所述肽接头是式(Gly₄Ser)_n的Gly-Ser接头，其中n是1-10。

7.根据前述权利要求中任一项所述的结合蛋白，其中所述接头部分是异二聚化结构域。

8.根据前述权利要求中任一项所述的结合结构域，其独立地包含一个或两个第一假Fab部分和一个或两个第一Fab部分。

9.根据前述权利要求中任一项所述的结合蛋白，其包含选自下组之一的分开的蛋白质链：

(a)VHa-CH1-L1-VHb-L2-VHX和VLa-CL和VLb-L3-VLX；

(b)VHa-L2-VHX-L1-VHb-CH1和VLa-L3-VLX和VLb-CL；

10.根据前述权利要求中任一项所述的结合蛋白，其中所述第一假Fab部分包含第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链具有由下式表示的结构：

(Ia)N-VHa-L1-VHX-C

并且所述第二多肽链具有由下式表示的结构：

(IIa)N-VLa-L2-VLX-C

11.根据前述权利要求中任一项所述的结合蛋白，其中所述第一假Fab部分包含第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链具有由下式表示的结构：

(Ib)N-VHX-L1-VHa-C

并且所述第二多肽链具有由下式表示的结构：

(IIb)N-VLX-L2-VLa-C

12.根据前述权利要求中任一项所述的结合蛋白，其中所述第一假Fab部分包含第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链具有由下式表示的结构：

(Ic)N-VLa-L1-VHX-C

并且所述第二多肽链具有由下式表示的结构：

(IIc)N-VHa-L2-VLX-C

13.根据前述权利要求中任一项所述的结合蛋白，其中所述第一假Fab部分包含第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链具有由下式表示的结构：

(Id)N-VHX-L1-VLa-C

并且所述第二多肽链具有由下式表示的结构：

(IId)N-VLX-L2-VHa-C

14.根据前述权利要求中任一项所述的结合蛋白，其还包含与所述结合蛋白的N末端或C末端可操作地连接的一个或多个另外的结合结构域。

15.根据前述权利要求中任一项所述的结合蛋白，其中所述一个或多个另外的结合结构域可操作地连接至所述第一或第二假Fab部分的N末端。

16.一种多特异性结合蛋白，其包含：

a)第一假Fab部分，所述第一假Fab部分包含：

(3)第一异二聚化结构域(HD1)；

b)第一Fab部分，所述第一Fab部分包含：

(3)第二异二聚化结构域(HD2)。

17.根据权利要求16所述的结合蛋白，其中所述第一和第二异二聚化结构域包含第一和第二Fc结构域。

18.根据权利要求16或17所述的结合蛋白，其中所述Fc结构域包含通用结构：铰链-CH2结构域-CH3结构域。

19.一种多特异性结合蛋白，其包含形成至少两个抗原结合位点的四条多肽链，其中

(a)第一多肽包含由下式表示的结构：

VLa-L1-VLX[I]

(b)第二多肽包含由下式表示的结构：

VHa-L2-VHX-FC1[II]

(c)第三多肽包含由下式表示的结构：

VLb-CL[III]

(d)第四多肽包含由下式表示的结构：

VHb-CH1-FC2[IV]

其中：

VLa是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；

VLb是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；

VHa是第一免疫球蛋白重链可变结构域；

VHb是第二免疫球蛋白重链可变结构域；

VLX是稳定敲除轻链可变结构域；

VHX是稳定敲除重链可变结构域；

CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；

CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；

L1和L2是可以独立地相同或不同的氨基酸接头，

其中

20.一种抗原结合蛋白，其包含形成四个抗原结合位点的六条多肽链，其中

(a)所述第一和第二多肽包含由下式表示的结构：

VLa-L1-VLX[I]和[II]

(b)所述第三和第四多肽包含由下式表示的结构：

VLb-CL[III]和[IV]

(c)所述第五多肽包含由下式表示的结构：

VHa-L2-VHX-L3-VHb-CH1-FC1[V]

(d)所述第六多肽包含由下式表示的结构：

VHa-L2-VHX-L3-VHb-CH1-FC2[VI]

其中：

VLa是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；

VLb是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；

VHa是第一免疫球蛋白重链可变结构域；

VHb是第二免疫球蛋白重链可变结构域；

VLX是稳定敲除轻链可变结构域；

VHX是稳定敲除重链可变结构域；

CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；

CH1是免疫球蛋白重链恒定结构域；

L1、L2和L3是氨基酸接头，

其中

21.一种抗原结合蛋白，其包含形成四个抗原结合位点的六条多肽链，其中

(a)所述第一和第二多肽包含由下式表示的结构：

VLa-L1-VLX[I]和[II]

(b)所述第三和第四多肽包含由下式表示的结构：

VLb-CL[III]和[IV]

(c)所述第五多肽包含由下式表示的结构：

VHb-CH1-L3-VHa-L2-VHX-FC1[V]

(d)所述第六多肽包含由下式表示的结构：

VHb-CH1-L3-VHa-L2-VHX-FC2[VI]

其中：

VLa是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；

VLb是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；

VHa是第一免疫球蛋白重链可变结构域；

VHb是第二免疫球蛋白重链可变结构域；

VLX是稳定敲除轻链可变结构域；

VHX是稳定敲除重链可变结构域；

CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；

CH1是免疫球蛋白重链恒定结构域；

L1、L2和L3是氨基酸接头，

其中

22.一种抗原结合蛋白，其包含形成四个抗原结合位点的六条多肽链，其中

(a)所述第一和第二多肽包含由下式表示的结构：

VLa-L1-VLX[I]和[II]

(b)所述第三和第四多肽包含由下式表示的结构：

VLb-CL[III]和[IV]

(c)所述第五多肽包含由下式表示的结构：

VHa-L2-VHX-L3-VHa-L4-VHX-FC1[V]

(d)所述第六多肽包含由下式表示的结构：

VHb-CH1-L5-VHb-CH1-FC2[VI]

其中：

VLa是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；

VLb是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；

VHa是第一免疫球蛋白重链可变结构域；

VHb是第二免疫球蛋白重链可变结构域；

VLX是稳定敲除轻链可变结构域；

VHX是稳定敲除重链可变结构域；

CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；

CH1是免疫球蛋白重链恒定结构域；

L1、L2、L3、L4和L5是氨基酸接头，

其中

23.一种抗原结合蛋白，其包含形成三个抗原结合位点的四条多肽链，其中：

(a)所述第一多肽包含由下式表示的结构：

VLa-L1-VLX[I]

(b)所述第二多肽包含由下式表示的结构：

VHa-L2-VHX-FC1[II]

(c)所述第三多肽包含由下式表示的结构：

VLb-L3-VLc-L4-CL[III]

(d)所述第四多肽包含由下式表示的结构：

VHc-L5-VHb-L6-CH1-FC2[IV]

其中：

VLa是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；

VLb是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；

VLc是第三免疫球蛋白轻链可变结构域；

VHa是第一免疫球蛋白重链可变结构域；

VHb是第二免疫球蛋白重链可变结构域；

VHc是第三免疫球蛋白重链可变结构域；

CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；

CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；

VLX是稳定敲除轻链可变结构域；

VHX是稳定敲除重链可变结构域；

L1、L2、L3、L4、L5和L6是氨基酸接头，

其中

24.根据权利要求17-23中任一项所述的结合蛋白，其中所述Fc结构域包含一个或多个杵臼结构(KIH)突变。

25.根据前述权利要求中任一项所述的结合蛋白，其中所述假Fab部分的熔解温度(T_m)比所述参考Fab分子高至少4摄氏度。

26.根据前述权利要求中任一项所述的结合分子，其中所述一个或多个工程化链间二硫键中的至少一个是VH44C-VL100C。

27.根据前述权利要求中任一项所述的结合蛋白，其中靶抗原A和靶抗原B是相同抗原的不同表位。

28.根据前述权利要求中任一项所述的结合蛋白，其中所述VLX/VHX对选自：

(i)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VLX，和

包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VHX；

ii)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VLX，和

包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的VHX；以及

iii)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VLX，和

包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的VHX。

29.稳定敲除结构域用于减少多特异性结合蛋白中的重链-轻链错误配对的用途，其中所述稳定敲除结构域包含VHK和VLX结构域，所述VHK和VLX结构域包含(1)相对于野生型结构域，消除其与靶抗原的结合的一个或多个失活突变；和(2)相对于参考Fab分子，赋予所述假Fab的增强的热稳定性(Tm)的一个或多个工程化链间二硫键，其中除了在假Fab参考分子中，所述参考Fab分子的CH1和CL结构域被VHX和VLX结构域替代以外，所述参考Fab分子与所述假Fab分子相同。

30.根据权利要求29所述的用途，其中所述VLX/VHX对选自：

(i)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VLX，和

包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VHX；

ii)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VLX，和

包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的VHX；以及

iii)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VLX，和

包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的VHX。

31.一种分离的核酸分子，其包含编码根据前述权利要求之一所述的结合蛋白的核苷酸序列。

32.一种表达载体，其包含根据权利要求31所述的核酸分子。

33.一种分离的宿主细胞，其包含根据权利要求31所述的核酸分子或根据权利要求32所述的表达载体。

34.一种产生根据权利要求1-28中任一项所述的结合蛋白的方法，其包括在使得所述结合蛋白被表达的条件下培养根据权利要求33所述的宿主细胞；并且从所述宿主细胞中纯化所述结合蛋白。

35.一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和治疗有效量的根据权利要求1-28中任一项所述的多特异性结合蛋白。

36.一种治疗其中抗原活性是有害的障碍的方法，所述方法包括向有需要的受试者给予有效量的根据前述权利要求中任一项所述的多特异性结合蛋白。