JP2005506074A - 肝臓の幹細胞および前駆細胞の膵臓機能細胞への転換 - Google Patents
肝臓の幹細胞および前駆細胞の膵臓機能細胞への転換 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2005506074A JP2005506074A JP2003536424A JP2003536424A JP2005506074A JP 2005506074 A JP2005506074 A JP 2005506074A JP 2003536424 A JP2003536424 A JP 2003536424A JP 2003536424 A JP2003536424 A JP 2003536424A JP 2005506074 A JP2005506074 A JP 2005506074A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- liver
- pancreatic
- growth factor
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 167
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 154
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 title description 6
- 210000003897 hepatic stem cell Anatomy 0.000 title 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims abstract description 149
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims abstract description 58
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims abstract description 57
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 48
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 47
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 18
- 230000004044 response Effects 0.000 claims abstract description 8
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 6
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 104
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 52
- 101710183548 Pyridoxal 5'-phosphate synthase subunit PdxS Proteins 0.000 claims description 30
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 22
- 102100032063 Neurogenic differentiation factor 1 Human genes 0.000 claims description 18
- 108050000588 Neurogenic differentiation factor 1 Proteins 0.000 claims description 18
- -1 Thy1.1 Proteins 0.000 claims description 17
- 230000015031 pancreas development Effects 0.000 claims description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 16
- 102100028098 Homeobox protein Nkx-6.1 Human genes 0.000 claims description 15
- 101000578254 Homo sapiens Homeobox protein Nkx-6.1 Proteins 0.000 claims description 15
- 102100024392 Insulin gene enhancer protein ISL-1 Human genes 0.000 claims description 15
- 101150070110 Isl1 gene Proteins 0.000 claims description 15
- 210000003999 epithelial cell of bile duct Anatomy 0.000 claims description 15
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 claims description 14
- 108091006299 SLC2A2 Proteins 0.000 claims description 14
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 14
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 14
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 claims description 13
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 claims description 13
- 101000603702 Homo sapiens Neurogenin-3 Proteins 0.000 claims description 13
- 102100038553 Neurogenin-3 Human genes 0.000 claims description 13
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 claims description 13
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 claims description 12
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 claims description 12
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 claims description 12
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 claims description 12
- 108700014808 Homeobox Protein Nkx-2.2 Proteins 0.000 claims description 12
- 102000007354 PAX6 Transcription Factor Human genes 0.000 claims description 12
- 101150081664 PAX6 gene Proteins 0.000 claims description 12
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 claims description 12
- 102100032378 Carboxypeptidase E Human genes 0.000 claims description 11
- 108010058255 Carboxypeptidase H Proteins 0.000 claims description 11
- 102000003972 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 claims description 11
- 108090000385 Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 claims description 11
- 102100040445 Keratin, type I cytoskeletal 14 Human genes 0.000 claims description 11
- 108010066321 Keratin-14 Proteins 0.000 claims description 11
- 102000051325 Glucagon Human genes 0.000 claims description 10
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 claims description 10
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 claims description 10
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 claims description 10
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 10
- 108010021582 Glucokinase Proteins 0.000 claims description 9
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 claims description 9
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 claims description 9
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 claims description 9
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 claims description 9
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 claims description 9
- 102400001320 Transforming growth factor alpha Human genes 0.000 claims description 9
- 101800004564 Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 claims description 9
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 claims description 9
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims description 9
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims description 9
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 claims description 9
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 claims description 9
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 claims description 9
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 claims description 9
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 claims description 9
- 108010011459 Exenatide Proteins 0.000 claims description 8
- 102000030595 Glucokinase Human genes 0.000 claims description 8
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 claims description 8
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 claims description 8
- JUFFVKRROAPVBI-PVOYSMBESA-N chembl1210015 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO[C@]3(O[C@@H](C[C@H](O)[C@H](O)CO)[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C3)C(O)=O)O2)O)[C@@H](CO)O1)NC(C)=O)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 JUFFVKRROAPVBI-PVOYSMBESA-N 0.000 claims description 8
- 229960001519 exenatide Drugs 0.000 claims description 8
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 claims description 8
- MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M sodium butyrate Chemical compound [Na+].CCCC([O-])=O MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 claims description 8
- 229920002157 Cellulin Polymers 0.000 claims description 7
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 claims description 7
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 claims description 7
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 claims description 7
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 claims description 7
- 102000016971 Proto-Oncogene Proteins c-kit Human genes 0.000 claims description 7
- 108010014608 Proto-Oncogene Proteins c-kit Proteins 0.000 claims description 7
- 230000009996 pancreatic endocrine effect Effects 0.000 claims description 7
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 6
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 6
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 claims description 6
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 claims description 6
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims description 6
- 108090000545 Proprotein Convertase 2 Proteins 0.000 claims description 6
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 claims description 6
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 claims description 6
- 230000009707 neogenesis Effects 0.000 claims description 6
- 102400000921 Gastrin Human genes 0.000 claims description 5
- 108010052343 Gastrins Proteins 0.000 claims description 5
- 101100189458 Mesocricetus auratus INGAP gene Proteins 0.000 claims description 5
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 claims description 5
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 claims description 5
- AOXOCDRNSPFDPE-UKEONUMOSA-N chembl413654 Chemical compound C([C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@H](CCSC)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 AOXOCDRNSPFDPE-UKEONUMOSA-N 0.000 claims description 5
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 claims description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 5
- GCYXWQUSHADNBF-AAEALURTSA-N preproglucagon 78-108 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 GCYXWQUSHADNBF-AAEALURTSA-N 0.000 claims description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 5
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 claims description 5
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 claims description 5
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 claims description 5
- NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N (4S)-4-[[(4R,7S,10S,16S,19S,25S,28S,31R)-31-[[(2S)-2-[[(1R,6R,9S,12S,18S,21S,24S,27S,30S,33S,36S,39S,42R,47R,53S,56S,59S,62S,65S,68S,71S,76S,79S,85S)-47-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-methylbutanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-18-(4-aminobutyl)-27,68-bis(3-amino-3-oxopropyl)-36,71,76-tribenzyl-39-(3-carbamimidamidopropyl)-24-(2-carboxyethyl)-21,56-bis(carboxymethyl)-65,85-bis[(1R)-1-hydroxyethyl]-59-(hydroxymethyl)-62,79-bis(1H-imidazol-4-ylmethyl)-9-methyl-33-(2-methylpropyl)-8,11,17,20,23,26,29,32,35,38,41,48,54,57,60,63,66,69,72,74,77,80,83,86-tetracosaoxo-30-propan-2-yl-3,4,44,45-tetrathia-7,10,16,19,22,25,28,31,34,37,40,49,55,58,61,64,67,70,73,75,78,81,84,87-tetracosazatetracyclo[40.31.14.012,16.049,53]heptaoctacontane-6-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-7-(3-carbamimidamidopropyl)-25-(hydroxymethyl)-19-[(4-hydroxyphenyl)methyl]-28-(1H-imidazol-4-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15,18,21,24,27,30-nonaoxo-16-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14,17,20,23,26,29-nonazacyclodotriacontane-4-carbonyl]amino]-5-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-3-carboxy-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(1S)-1-carboxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]cn1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H]3NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H]4CCCN4C(=O)[C@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC3=O)[C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc3ccccc3)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N3CCC[C@H]3C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](Cc2ccccc2)NC(=O)[C@H](Cc2c[nH]cn2)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)C(C)C)C(=O)N[C@@H](Cc2c[nH]cn2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](Cc2ccc(O)cc2)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N 0.000 claims description 4
- 108010059616 Activins Proteins 0.000 claims description 3
- 102100026818 Inhibin beta E chain Human genes 0.000 claims description 3
- 101710151472 Neuroendocrine convertase 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101100519293 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) pdx-1 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 102000018886 Pancreatic Polypeptide Human genes 0.000 claims description 3
- 108700020479 Pancreatic hormone Proteins 0.000 claims description 3
- DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N [14c]-nicotinamide Chemical compound N[14C](=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N 0.000 claims description 3
- 239000000488 activin Substances 0.000 claims description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 3
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 claims description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 3
- 210000000750 endocrine system Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 abstract description 26
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 30
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 25
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 17
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 16
- 238000011161 development Methods 0.000 description 16
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 16
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 13
- XXROGKLTLUQVRX-UHFFFAOYSA-N allyl alcohol Chemical compound OCC=C XXROGKLTLUQVRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 11
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 9
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 9
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N Glucagon-like peptide 1 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N 0.000 description 8
- 101800000224 Glucagon-like peptide 1 Proteins 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102100040918 Pro-glucagon Human genes 0.000 description 8
- 210000003890 endocrine cell Anatomy 0.000 description 8
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 8
- 210000000013 bile duct Anatomy 0.000 description 7
- 210000001900 endoderm Anatomy 0.000 description 7
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 101150111723 PDX1 gene Proteins 0.000 description 6
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 6
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 6
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 6
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 6
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 6
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 6
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L (5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl) phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP([O-])(=O)[O-])=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 5
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 5
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 5
- 108010023082 activin A Proteins 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 231100000753 hepatic injury Toxicity 0.000 description 5
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N nitro blue tetrazolium(2+) Chemical compound COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 4
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 4
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 4
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 4
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 4
- 210000003458 notochord Anatomy 0.000 description 4
- 238000012753 partial hepatectomy Methods 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 108700029231 Developmental Genes Proteins 0.000 description 3
- 206010013554 Diverticulum Diseases 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004140 Oncostatin M Human genes 0.000 description 3
- 108090000630 Oncostatin M Proteins 0.000 description 3
- 101150075928 Pax4 gene Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 3
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 210000000277 pancreatic duct Anatomy 0.000 description 3
- 210000004923 pancreatic tissue Anatomy 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 210000002438 upper gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010015742 Cytochrome P-450 Enzyme System Proteins 0.000 description 2
- 102000003849 Cytochrome P450 Human genes 0.000 description 2
- 102100025012 Dipeptidyl peptidase 4 Human genes 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 2
- 102000003638 Glucose-6-Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108010086800 Glucose-6-Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101100115705 Mus musculus Stfa1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241001045988 Neogene Species 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108010044159 Proprotein Convertases Proteins 0.000 description 2
- 102000006437 Proprotein Convertases Human genes 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- MGSKVZWGBWPBTF-UHFFFAOYSA-N aebsf Chemical compound NCCC1=CC=C(S(F)(=O)=O)C=C1 MGSKVZWGBWPBTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 231100000357 carcinogen Toxicity 0.000 description 2
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 description 2
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 2
- ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N ***e Chemical compound O([C@H]1C[C@@H]2CC[C@@H](N2C)[C@H]1C(=O)OC)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N 0.000 description 2
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 238000012528 insulin ELISA Methods 0.000 description 2
- 230000031142 liver development Effects 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- DDBREPKUVSBGFI-UHFFFAOYSA-N phenobarbital Chemical compound C=1C=CC=CC=1C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O DDBREPKUVSBGFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002695 phenobarbital Drugs 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 210000003240 portal vein Anatomy 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 210000002325 somatostatin-secreting cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 3,3'-diaminobenzidine Chemical compound C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 229920000298 Cellophane Polymers 0.000 description 1
- 208000000668 Chronic Pancreatitis Diseases 0.000 description 1
- 241000252203 Clupea harengus Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102100036912 Desmin Human genes 0.000 description 1
- 108010044052 Desmin Proteins 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067722 Dipeptidyl Peptidase 4 Proteins 0.000 description 1
- 101100351026 Drosophila melanogaster ey gene Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 102000018711 Facilitative Glucose Transport Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 101000930822 Giardia intestinalis Dipeptidyl-peptidase 4 Proteins 0.000 description 1
- 102000007446 Glucagon-Like Peptide-1 Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010086246 Glucagon-Like Peptide-1 Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000058058 Glucose Transporter Type 2 Human genes 0.000 description 1
- 108091052347 Glucose transporter family Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 102000003693 Hedgehog Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000031 Hedgehog Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100022057 Hepatocyte nuclear factor 1-alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100022054 Hepatocyte nuclear factor 4-alpha Human genes 0.000 description 1
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 description 1
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 description 1
- 108010048671 Homeodomain Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000009331 Homeodomain Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101001045751 Homo sapiens Hepatocyte nuclear factor 1-alpha Proteins 0.000 description 1
- 101001045740 Homo sapiens Hepatocyte nuclear factor 4-alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000998011 Homo sapiens Keratin, type I cytoskeletal 19 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 238000012369 In process control Methods 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 101100335081 Mus musculus Flt3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100348675 Mus musculus Nkx6-1 gene Proteins 0.000 description 1
- BKAYIFDRRZZKNF-VIFPVBQESA-N N-acetylcarnosine Chemical compound CC(=O)NCCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 BKAYIFDRRZZKNF-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 206010033645 Pancreatitis Diseases 0.000 description 1
- 206010033647 Pancreatitis acute Diseases 0.000 description 1
- 206010033649 Pancreatitis chronic Diseases 0.000 description 1
- 108091026813 Poly(ADPribose) Proteins 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N Streptozotocin Natural products O=NN(C)C(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241001227561 Valgus Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000003229 acute pancreatitis Diseases 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- WLDHEUZGFKACJH-UHFFFAOYSA-K amaranth Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].C12=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(O)=C1N=NC1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C2=CC=CC=C12 WLDHEUZGFKACJH-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000003484 anatomy Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003920 ***e Drugs 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000004544 dc2 Anatomy 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 210000005045 desmin Anatomy 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 1
- 208000016097 disease of metabolism Diseases 0.000 description 1
- 238000012137 double-staining Methods 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000020619 endoderm development Effects 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 210000002907 exocrine cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003020 exocrine pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 108700014844 flt3 ligand Proteins 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000012637 gene transfection Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 210000000208 hepatic perisinusoidal cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000019514 herring Nutrition 0.000 description 1
- 201000001421 hyperglycemia Diseases 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 230000006362 insulin response pathway Effects 0.000 description 1
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 description 1
- 210000002660 insulin-secreting cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 1
- 238000010212 intracellular staining Methods 0.000 description 1
- 238000004190 ion pair chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000001865 kupffer cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L magnesium chloride Substances [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 101150091879 neo gene Proteins 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 108091005981 phosphorylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000003566 phosphorylation assay Methods 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 229940088336 primor Drugs 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 230000007781 signaling event Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N streptozocin Chemical compound O=NN(C)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N 0.000 description 1
- 229960001052 streptozocin Drugs 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0676—Pancreatic cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
- C12N2500/10—Metals; Metal chelators
- C12N2500/20—Transition metals
- C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
- C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/36—Lipids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/38—Vitamins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/105—Insulin-like growth factors [IGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/117—Keratinocyte growth factors (KGF-1, i.e. FGF-7; KGF-2, i.e. FGF-12)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/12—Hepatocyte growth factor [HGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/13—Nerve growth factor [NGF]; Brain-derived neurotrophic factor [BDNF]; Cilliary neurotrophic factor [CNTF]; Glial-derived neurotrophic factor [GDNF]; Neurotrophins [NT]; Neuregulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/148—Transforming growth factor alpha [TGF-a]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/16—Activin; Inhibin; Mullerian inhibiting substance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/165—Vascular endothelial growth factor [VEGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/24—Interferons [IFN]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/335—Glucagon; Glucagon-like peptide [GLP]; Exendin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/345—Gastrin; Cholecystokinins [CCK]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
- C12N2501/385—Hormones with nuclear receptors of the family of the retinoic acid recptor, e.g. RAR, RXR; Peroxisome proliferator-activated receptor [PPAR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
- C12N2501/39—Steroid hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/03—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from non-embryonic pluripotent stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/14—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from hepatocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
- C12N2510/02—Cells for production
Abstract
本発明は、肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞を膵臓発生遺伝子でトランスフェクトすることにより、および/または膵臓発生因子と共に培養することにより、該肝細胞を膵臓機能細胞に転換させる方法である。得られる細胞はグルコースの刺激に応答してインスリンタンパク質を産生、分泌する。
Description
【背景技術】
【0001】
(発明の背景)
糖尿病の療法または治療としての細胞移植
I型糖尿病は、インスリン産生膵島β細胞の選択的自己免疫不全に起因する慢性代謝疾患である。糖尿病の臨床的管理にはわが国において年間〜1,000億ドルのコストを要する。I型糖尿病のインスリン不全および高血糖は、長い間には重症の2次的合併症をもたらす。しかし、毎日のグルコースの変動をコントロールするために使用されている規則的なインスリン補充治療では、臨床的合併症を予防/低減するために絶えず正常範囲付近のグルコースレベルを維持することはできない(The DCCT Research Group(1991) N. Eng. J. Med. 329:977)。
【0002】
(インスリン非依存性の達成および2次的合併症発症の低減の双方に関して)I型糖尿病を治すまたは治療するためには、全膵臓または膵島のいずれかの移植で患者の膵島β細胞を回復することが必須である。米国では毎年〜35,000例のI型糖尿病の新たな症例が診断されているが、一方約3,000の死体膵臓が同期間で入手できるに過ぎない(Hering, G. J. et al. (1999)Graft 2: 12-27)。このように膵島および/またはインスリン産生細胞を含む、膵臓系譜の機能細胞の代替材料の開発が早急に必要である。移植用膵臓組織の深刻な不足を回避するために利用できる唯一の概念的選択肢は、膵臓系譜の機能細胞(例えば膵島またはインスリン産生細胞)を、幹細胞からin vitroで発生させることである。
【0003】
移植可能な膵島の1つの材料は、膵臓由来の膵島産生幹細胞(IPSC)である(Ramiya, V.K. et al. (2000) Nature Med. 6(3): 278-282;およびPCT/US00/26469,2000年9月27日出願)。しかしI型糖尿病を治すまたは治療する試みにおいて成功のチャンスを拡大するため、膵臓系の細胞を生成する付加的/代替的方法を研究すべきであろう。肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞は、膵臓系の細胞への転換のための実現可能な材料として提供できる。肝臓幹細胞を使用することには多くの利点がある:a)肝臓は部分的肝切除後に再生する非常に大きな潜在能力を有しており(例えば部分的肝切除した肝臓の重量および機能は、肝臓の2/3を切除した場合でさえ、約1週間で完全に回復することができ(Higgins, G.F. et al. (1931) Arc. Pathol. 12: 186-202; Grisham. J.W. (1962)Cancer Res. 22: 842-849;およびBucher, N. (1963)Int. Rev. Cytol. 15: 245-300))、したがって肝臓は、自己移植用の幹細胞のより入手し易い材料として提供できる;およびb)肝臓幹細胞表面の表現型は既に確立されており、したがって器官からそれらを精製することはより容易である(表1参照のこと)。また肝臓幹細胞は、CD34、Thy1.1、幹細胞因子(SCF)/c−kit、Flt−3リガンド/flt−3のような表面の造血幹細胞マーカーを共有しており(Yin, L. et al. (2001) Proc. Am. Assoc. Canc. Res. 42:354; Yin, L. et al. (2001) FASEB J. Late-Breaking Abstracts: 49 (LB267); Fujio, K. et al. (1996) Exp. Cell Res. 224; 243-50; Blakolmer, K. et al. (1995) Hepatology 21(6): 1510-16: Omori, N. et al. (1997) Hepatology 26(3): 720-27; Omori, M. et al. (1997) Am. J. Pathol. 150(4): 1179-87; Lemmer, E.R. et al. (1998) J. Hepatol. 29: 450-454; Petersen, B.E. et al. (1998) Hepatology 27(2): 433-445; およびBaumann, U. et al. (1999) Hepatology 30(1): 112-117)、これらのマーカーを他の公知の肝臓幹細胞マーカーと共に細胞の分類に使用することができる。
【0004】
【表1】
【0005】
以下のセクションで肝臓および膵臓の幹細胞の現状、胚発生期のこれらの関連、およびこれら器官内の分化転換について述べる。
肝臓および肝臓幹細胞の発生
胚において肝臓は、マウスでは発生後約8.5から9日(8.5 to 9 days of development)で前心臓(precardiac)中胚葉と接触する領域の、腹側前腸(ventral foregut)の上皮細胞から発生する。この領域の細胞が増殖して肝臓憩室を形成する。妊娠約9.5日で、肝臓憩室の細胞は周囲の横中隔内に移動し始める。この段階で、細胞は肝芽細胞と命名され、これらの細胞は肝臓上皮細胞系譜に沿って決定されることが示されている。肝芽細胞は二分化能があり、肝細胞および胆管細胞の双方が形成される(Houssaint, E. (1980) Cell Differ. 9: 269-279)。一般に肝臓が傷害されると、成熟肝細胞が増殖して肝臓の重量および機能を回復し、肝臓幹細胞は関与しない(Kelly, D.E. et al.(1984) Bailey's Textbook of Microscopic Anatomy(顕微鏡解剖学についてのBaileyの教科書)、第18版、Williams and Willkins、Baltimore, pp590-616)。しかし傷害が非常に重症である場合、および/または肝細胞の増殖が化学物質、例えば2−N−アセチルアミノフルオレン(2AAF)およびフェノバルビタールにより阻害される場合には、肝臓幹細胞部分が活性化される。成体肝臓における肝臓幹細胞は、主に動物の肝傷害モデル、例えば2AAF/部分肝切除(PH)(Golding, M. et al. (1995) Hepatology 22(4): 1243-1253)、2AAF/アリルアルコール(AA)およびフェノバービタル/コカイン誘発性の門脈周囲の肝傷害(Yavokovsky, L. et al. (1995) Hepatology 21(6): 1702-12; Petersen, B. et al. (1998)Hepatology 27(4): 1030-1038; Yin, L. et al. (1999) J. Hepatology 31: 497-507;およびRosenberg, D. et al. (2000) Hepatology 31(4): 948-955)、および2AAF/CCl4誘発性の中心周囲の肝傷害(Petersen et al. (1998))において広範囲に研究されてきた。傷害部位にかかわりなく、卵円形状の肝臓幹細胞は常にへーリング管の門脈領域に由来する(Wilson, J. et al. (1958) J. Pathol. Bacteriol. 76: 441-449)。成体肝臓のこれらの肝臓前駆細胞は肝細胞および胆管細胞の双方に分化することができる(Stenberg, P. et al. (1991) Carcinogenesis 12: 225-231; およびDabeva, J. et al.(1993) Am. J. Pathology 143: 1606-1620)。ごく最近、動物およびヒトの双方からの証拠のいくつかの傾向は、造血幹細胞が肝臓幹細胞の肝臓以外の材料であることを強く示唆している(Peterson, B. et al. (1999) Science 284: 1168-70; Theise, N. et al. (2000) Hepatology 31(1): 235-40; Theise, N. et al.(2000)Hepatology 32(1): 11-16; およびAlison, M. et al.(2000) Nature 406: 257)。幹細胞様特性を持つ上皮細胞株が、マウス肝臓憩室(Rogler, L. (1997) Am. J. Pathol. 150(2): 591-602)、傷害されたラット肝臓(Yin, L. et al.(2001A) PAACR 42: 354; Yin, L. et al (2001B) FASEB J. Late-Breaking Abstracts: 49 (LB267); Yin, L. et al (2002) Hepatology 35(2): 315-324)、ならびに正常ラット肝臓(Tso, M-S. et al. (1984)Expp. Cell. Res. 154: 38-52; およびTso, M-S. (1988) Lab. Invest. 58: 636-642)、および正常ブタ肝臓(Kano, J. et al. (2000) Am. J. Pathol. 156(6): 2033-2043)、および正常ヒト肝臓(Crosby, H. et al. (2001) )Gastroenterology 120(2): 534-544)から確立された。これらの細胞を誘導して肝細胞および/または胆管細胞にin vitroで(Rogler, L. (1977); Yin, L. et al. (2001A); Yin, L. et al. (2001B); Yin, L. et al. (2002); Crosby, H. et al. (2001);およびColeman, W. et al. (1993) Am. J. Pathol. 142: 1373-82)および移植下のin vivoで(Coleman, W. et al. (1993);およびGrisham, J. et al. (1993) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204: 270-79)分化させることができる。
【0006】
哺乳類の消化管内胚葉から肝臓へ胚を誘導するシグナリング分子は、完全には理解されていない。心臓中胚葉で発現される繊維芽細胞成長因子(FGF)1,2および8は、最初の肝発生に必須であることが報告されている(Jung, J. et al. (1999) Science 284: 1998-2003)。インターロイキン−6ファミリーのサイトカインであるオンコスタチンM(OSM)は、グルココルチコイドと共に胚の肝臓における肝細胞の成熟を誘発し、このことが今度は胚の造血機能を終了させることになる。gp130、すなわちOSM受容体サブユニットを欠損するマウス由来の肝臓は、肝細胞が成熟できないことを示す(Kamiya, A. et al. (1999) EMBO J. 18(8): 2127-36;およびKinoshita, T. et al. (1999) PNAS 96: 7265-70)。分化した肝細胞は、HNF1、HNF3、HNF4およびC/EBPファミリーの肝臓に豊富に含まれる(肝臓固有ではないが)転写因子を固有の組み合わせで発現することを特徴とする(Johnson, P. (1990) Cell. Growth Differ. 1:47-51; Lai, E. et al. (1991) Trends Biochem. Sci. 16: 427-30; DeSimone, V. et al. (1992) Biochem. Biophys. Acta 1132: 119-126; およびCrabtree, G. et al. (1992) Transcriptional Regulation(転写の制御)S.S. McKnight and K.R. Yamamoto(編)Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, pp. 1063-1102)。
【0007】
膵臓および膵臓の幹細胞の発生
胚の発生期、膵臓は背側および腹側の前腸内胚葉の2つの別々の成長に由来し、腹側および背側の膵芽を形成する。その後これらの膵芽が融合して完全な膵臓を形成する(Houssaint, E. (1980); Spooner, B. et al.(1970) J. Cell Biol. 47: 235-46; Rutter, W. et al.(1980) Monogr. Pathol. 21: 30-38; Guaidi, R. et al.(1996) Genes Dev. 10: 1670-82; Zaret, K. (2000) Mech. Dev. 92: 83-88; Edlund, H. (1998) Diabetes 47: 1817-1823; St-Onge, L. et al. (1999) Curr. Opin. Gene Dev. 9: 295-300; およびSlack, J. (1995) 121: 1569-80)。胚形成期、膵臓内の膵島の発生は、膵管上皮に最初に関与する未分化の前駆体細胞から開始するようである(Pictet, R. et al. (1992) Handbook of Physiology(生理学のハンドブック), Steiner, D. and Frienkel, N. (編) Williams and Wilkins, Baltimore, MD, pp. 25-66)。この管上皮は急速に増殖して、その後様々な膵島に関連する細胞集団に分化する(Teitelman, G. et al. (1993) Development 118: 1031-39; およびBeattie, G. et al. (1994) J. Clin. Endo. Met. 78: 1232-1240)。成体の膵臓において、膵島細胞の成長は2つの異なる系列:すなわち管上皮の分化による新たな膵島の成長(新生)、または既に存在するβ細胞の複製のいずれかにより起こりうる。新生は、ダイズトリプシン阻害剤による食事治療(Weaver, C. et al. (1985) Diabetologia 28: 781-785)、高レベルのインターフェロン−γ(Gu, D. (1993) Dev. 118: 33-46)、部分膵移植(Bommer-Weir, S. et al. (1993) Diabetes 42: 1715-1720)、セロハン内に膵臓頭部を包むこと(Rosenberg, L. et al. (1992) Adv. Exp. Med. Biol. 321: 95-104)により、そして特異的成長因子(Otonkonski, T. et al. (1994) Diabetes 43: 947-952)により実験的に誘導することができた。このように膵島のすべてのタイプの内分泌細胞は、同一の管上皮幹細胞から連続的な分化を通して発生することが、一般に受け入れられている(Gu, D. (1993); Rosenberg, L. (1992); およびHellerstrom, D. (1984) Diabetologia 26: 393-400)。膵臓幹細胞が成体膵管調製物から単離され、in vitro でインスリン産生細胞に(ある程度まで)分化することが示され(Ramiya, V. et al. (2000); Cornelius, J. et al. (1997) Horm. Metab. Res, 29: 271-277; およびBonner-Weir, S. et al. (2000) PNAS 97(14): 7999-8004)、このことから移植で非肥満型糖尿病(NOD)マウスの糖尿病を改善することができた(Ramiya, V. et al. (2000))。
【0008】
胚の発生期、背側および腹側の膵臓原基痕跡の特性には違いがある。背側の前膵臓(pre-pancreatic)内胚葉は初期発生段階では脊索との緊密な関連を維持する。覆っている脊索由来のシグナル、例えばアクチビンおよびFGF−2が、ソニックヘッジホッグ(Shh)の内胚葉発現を抑制することにより、背側膵臓の発生を促進する(Hebrok M. et al. (2000) Dev. 127: 4905-13; Kim, S. et al. (1997) Dev. 124: 4243-52; およびLi, H. et al. (1999) Nat. Genet. 23: 67-70)。これらのシグナリング事象に応答しての背側膵臓の形成はまた、多数の転写因子の発現も必要とする。例えばマウスの“ノックアウト”の研究は、背側膵臓の形成がIsl1およびHlxb9に依存し、その後の分化にはPdx1を必要とすることを示した(Li, H. et al. (1999); Harrison, K. et al. (1999) Nat. Genet 23: 71-75; Ahlgren, U. et al. (1997) Nature 385: 257-60)。腹側膵臓の発生の開始を制御するメカニズムは完全には解明されていない。腹側膵臓の発生のコントロールは背側膵臓のそれとは異なると思われる、というのは脊索は腹側内胚葉まで達しておらず、脊索がないため腹側内胚葉はShhを発現しない。さらに腹側膵臓の発生はIsl1−/−およびHlxb9−/−マウスでは正常である(Deutsch, G. et al. (2001) Development 128: 871-881; およびDuncan, S. (2001) Nature Genetics 27: 355-356)。Pdx1は膵臓発生の初期の段階で必要である(Jonsson, J. et al. (1994) Nature 371: 606-609; Ahlgren, U. et al. (1996) Development 122: 1409-1416; Stoffers, D. et al. (1997) Nat. Genet. 15: 106-110; およびOffield, M. et al. (1996) Development 122: 983-995)。Pdx1を欠損するマウスおよびヒトは無膵である(Jonsson, J. et al.(1994); Ahlgren, U. et al. (1996); Stoffers, D. et al.(1997); およびOffield, M. et al.(1996))。しかし消化管内胚葉を膵臓原基に最初に方向付けるためのPdx1発現の上流に作用する他の遺伝子があるようである。したがって上皮の外反ならびに背側および腹側の膵芽の最初の方向付けは、Pdx1変異マウスでもまだ起こり、インスリンポジティブおよびグルカゴンポジティブな細胞もまだ分化する(Ahlgren, U. et al.(1996); およびOffield, M. et al. (1996))。後に膵臓におけるPdx1およびHlxb9の発現は、インスリン産生β細胞に限定されるようになる(Li, H. et al. (1999); Harrison, K. et al.(1999); およびJonsson, J. et al. (1994))。インスリン、GLUT2、グルコキナーゼ、およびプロホルモンコンバターゼ(PC)1、2および3を含む様々な内分泌遺伝子の発現を調節することにより、ホルモンを産生するβ細胞の形質発現を維持するため、Pdx1が必要となる(Ahlgren, U. et al.(1998) Genes Dev. 12: 1763-68; Hart, A. et al.(2000) Nature 408: 864-68; およびBaeza, N. et al.(2001) Diabetes 50, Sup. 1: S36)。Pdx1遺伝子の活性化は、HNF3β(Zaret, K. (1996) Annu. Rev. Physiol. 58: 231-251)およびNeuroD/β2(Sharma, T. et al. (1997) Mol. Cell Biol. 17: 2598-2404)により制御することができる。ngn3、Isl1、Nkx2.2、Nkx6.1、Pax4、Pax6およびNeuroD/β2のような、いくつかのホメオドメインおよび塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックス(bHLH)の転写因子が、膵臓内分泌細胞の分化のコントロールに重要な役割を担っていることが示された(Edlund, H. (1998); St-Onge, L. et al. (1999); Sander, M. et al. (1997) J. Mol. Med. 75: 327-340; Madsen, O. et al. (1997) Horm. Metab. Res. 29(6): 265-270;およびGradwohl, G. et al. (2000) PNAS 97(4): 1607-11)。これらの遺伝子のうち、ngn3は膵臓の4つの内分泌細胞系譜すべての発生に極めて重要であることが報告された(Grawohl, G. et al. (2000))。Pax4はインスリン産生β細胞およびソマトスタチン産生δ細胞の発生を選択的にコントロールするようである(Sosa-Pineda, B. et al. (1997) Nature 386: 399-402)。Nkx6.1は成体ラットにおける高度に制限されたβ細胞発現を有する(Madsen, O. et al. (1997))。マウスのNkx6.1を破壊するとβ細胞前駆細胞の欠損をきたし、β細胞新生が遮断される(Sander, M. et al. (2000) Dev. 127(24): 5533-5540)。このように分化の過程を追ってこれらの因子のスクリーニングし、分化の程度を決定することは極めて重要である。
【0009】
様々な成長因子、ホルモン、ビタミンおよび化学物質、例えば肝細胞成長因子(HGF)、グルカゴン様ペプチド−1(GLP−1)、エキセンディン−4、アクチビン−A、β−セルリン(cellulin)、デキサメタゾン、ニコチンアミド、酪酸ナトリウムは、in vitro でβ細胞の分化に有効であることが示された。HGF(Mashima, H. et al. (1996) Endocrinol. 137: 3969-76)、GLP−1(Zhou, J. et al. (1999) Diabetes 48: 2358-2366)、エキセンディン−4(Zhou, J. et al (1999))、デキサメタゾン、β−セルリンおよびアクチビン−A(Mashima, H. et al.(1996) J. Clin. Invest. 97(7): 1647-54)は、腺房細胞をインスリン分泌細胞に分化させる。GLP−1はβ細胞cAMPおよびインスリン遺伝子の転写のレベルを増加させ、グルコース依存性のインスリン放出を刺激する(Grucker, D. et al. (1987) PNAS 84: 3434-3438)。部分的膵切除に続く糖尿病新生仔ラットへの10日間GLP−1投与は、膵島の増殖および新生の誘導によるβ細胞の重量増加を刺激した(Xu, G. et al. (2000) Diabetes 48: 2270-76)。GLP−1はまたPdx1遺伝子の発現および結合能を増加させる(Buteau, J. et al. (1999) Diabetes 49: 1156-1164)。エキセンディン−4はGLP−1の非常に有効な構造的類似体で、より長い血中半減期を有する。この物質は膵島上のGLP−1受容体にGLP−1と類似するアフィニティーで結合するが、等モル濃度のGLP−1に比してcAMPレベルを3倍増加させるため、長期にわたる動物の研究に使用するためのより有効な薬剤とすることができる(Garcia-Ocana, A. et al. (2001) JCE & M 86: 984-988)。デキサメタゾンおよび酪酸ナトリウムは、ブタの膵島様細胞クラスターにおけるインスリン/DNA含有量の増加により証明されたように、β細胞の分化を促進する可能性がある(Korsgren, O. et al. (1993) Ups. J. Med. Sci. 98(1): 39-52)。膵臓細胞株において、RIN−m5F、酪酸ナトリウムはヘキソキナーゼおよびグルコキナーゼの双方の活性、ならびにグルコキナーゼ遺伝子の発現を2倍に増加させる。ニコチンアミドは、培養ヒト胎児膵臓細胞およびマウスIPSCにおいて、β細胞を分化しその質量を増加させることが知られているポリ(ADP−リボース)シンセターゼ阻害剤であり(Ramiya, V. et al. (2000); およびOtonkoski, T. et al. (1993) J. Clin. Invest. 92: 1459-66)、薬剤誘発型糖尿病動物モデルならびにNODマウスにおける糖尿病の発症を防ぐ(Uchigata, Y. et al. (1983) Diabetes 32: 316-18; およびYamada, K. et al. (1982) Diabetes 31: 749-753)。
【0010】
膵臓幹細胞および肝臓幹細胞の分化の操作
胚の発生において肝臓および腹側膵臓は双方とも、腹側前腸の同じ位置を起源とする(Houssaint, E. (1980); Rutter, W. (1980); Guaidi, R. et al. (1996); Zaret, K. (2000); Deutsh, G. et al. (2001); およびZaret, K. (1996))。したがって発生の観点から、これら2つの器官の上皮細胞は、共通の幹細胞を持ち得ることは可能である。新たな研究は、肝臓および膵臓の双方を形成することになる胚の内胚葉中に、二分化能の細胞集団が存在することを示している。膵臓細胞原基または肝臓細胞原基のいずれに適用させるかのこれらの細胞による決定は、発生する心臓にそれらの細胞が近位かどうかにより決定される(Deutsch, G. et al. (2001))。腹側内胚葉の発生プログラムのデフォルトは、腹側膵臓になることである。証拠のいくつかの傾向は、膵臓幹細胞の肝臓細胞に分化する能力を証明した。例えば銅の枯渇および過多は、膵臓外分泌腺の萎縮をきたし、膵管内に卵円形細胞が出現し、その卵円形細胞が膵臓内での肝細胞に分化する(Rao, M. et al. (1986) Cell Differ. 18: 109-117; Rao, M. et al. (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 156: 131-136; およびReddy, J. et al. (1991) Dig. Dis. Sci. 36(4): 502-509)。肝臓幹細胞と同一の免疫表現型をもつ卵円形細胞はまた、急性膵炎、慢性膵炎および膵島細胞症(pesidioblastosis)のヒトの膵臓内でも発見された(Mikami, Y. et al. (1998) Hepatology 28(4), Pt. 4: 417A)。膵臓の肝細胞は発癌性物質に対して肝臓の肝細胞と類似した形で反応する(Rao, M. et al. (1991) Am. J. Pathol. 139(5): 1111-1117)。肝臓内への移植後、銅欠乏ラット膵臓から単離された膵臓卵円形細胞は、肝臓柔組織に構造的に組み込まれた成熟肝細胞に分化し、肝細胞固有の生化学的機能を発現することができる(Dabeva, J. et al. (1997) PNAS 94: 7356-61)。ごく最近Wangらは、正常な成体マウスの膵臓内に肝細胞の未分化の前駆細胞があることを示した(Wang, X. et al. (2001))Am. J. Pathol. 158: 571-79)。膵臓細胞はまた、in vitroでデキサメタゾン処理により肝細胞に転換させることができる(Shen, C-N. et al. (2000) Nature Cell Biol. 2: 879-887)。初期の事象は転写因子C/EBP−βの活性化を伴う。C/EBP−βでの細胞のトランスフェクションは肝臓の分化を引き起こす。したがってC/EBP−βは、肝臓および膵臓の分化のプログラムを区別する鍵となる成分であることが示唆される。インスリンプロモーターにより誘発されるKGFを過剰発現するトランスジェニックマウスにおける膵臓の肝細胞の持続的な発生は、分化転換過程におけるKGFの関与を示唆する(Krakowski, M. et al. (1999) Am. J. Pthol. 154(3): 683-91)。内分泌細胞特異的ではないが、膵臓上皮細胞を産生する肝臓の能力についての報告もある(Rao, M. et al. (1986) Histochem. Cytochem. 34: 197-201; およびBisgaard, H. et al. (1991) J. Cell Physiol. 147(2): 333-343)。さらにPdx1をコードする遺伝子を保有する組換えアデノウイルスで形質導入された肝臓は、機能的なインスリンを産生することができ、マウスのストレプトゾトシン誘発糖尿病を改善する;しかしPdx1は、in vitroでは肝臓の肝細胞をインスリン産生細胞に分化転換しないことが報告されており、マウス肝臓の幹細胞または前駆細胞がin vivo (またはin vitro)でPdx1コンストラクトでトランスフェクトするという証拠は提供されていない(Ferber, S. et al. (2000) Nature Med. 6(5): 568-571)。最後に、転写因子、例えばIsl1、ngn3、NeuroD/β2、Pax4、pax6およびNkx2.2が内分泌および神経への分化経路で共有されていることが確認された(Ahlgren, U. et al. (1997); Sander, M. et al. (1997); Sosa-Pineda, B. et al. (1997); Pfaff, S. et al. (1996) Cell 84: 309-320; Lee, J. et al. (1995) Science 268: 836-844; Naya, F. et al. (1997) Genes Dev. 11: 2323-2334; Miyata, T. et al. (1999) Genes Dev. 13: 1647-52; St-Onge, L. et al. (1997) Nature 387: 406-409; Ericson, J. et al. (1997) J. Cell 90: 169-180; Sussel, L. et al. (1998) Dev. 125: 2213-2221; Briscoe, J. et al. (1999) Nature 398: 622-627)が、転写因子を肝臓と膵臓との間で共有することに関する明確な情報はない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【0011】
(発明の概要)
本発明は肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞を、ホルモン、成長因子、ビタミンおよび化学物質と組み合わせて培養して、肝臓の幹細胞または前駆細胞を膵臓機能細胞に転換させる方法を含む。本発明はさらに肝臓の幹細胞または前駆細胞の膵臓機能細胞への転換のためのトランスフェクションの方法を含む。
【0012】
したがって本発明は、肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞を膵臓発生遺伝子でトランスフェクトすることにより、肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞を膵臓機能細胞に転換させる方法を提供する。あるいは肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞は、同細胞を膵臓機能細胞に転換させる条件下で培養することができる。さらに転換は、トランスフェクションおよび培養条件の双方により達成する、すなわち同時にまたはいずれかの順で連続して行うことができる。
【0013】
肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞は、肝芽細胞または肝臓卵円形細胞とすることができる。肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞は少なくとも1つの造血マーカーおよび/または少なくとも1つの肝臓卵円形細胞または肝芽細胞のマーカーを発現することが好ましい。造血マーカーはCD34、Thy1.1、およびCD45を含む。肝臓の肝芽細胞または卵円形細胞のマーカーは、α−胎児タンパク質、アルブミン、サイトケラチン14(CK14)、c−kit、OC.2、OC.3、OC.10、OV1およびOV6を含む。
【0014】
膵臓発生遺伝子は、肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞を膵臓機能細胞に転換させることのできるあらゆる遺伝子であり、Pdx1、Hlxb9、Isl1、ngn3、Nkx2.2、Pax6、NeuroD/β2、Nkx6.1およびPdx4を含む。好ましくは膵臓発生遺伝子はPdx−1である。
【0015】
肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞を膵臓機能細胞に転換させる培養条件は、基本培地に加えて膵臓細胞への分化を誘導するホルモン、成長因子、ビタミンおよび化学物質、またはそれらのあらゆる組み合わせとする付加的な因子を含む。このようなホルモンは、デキサメタゾン、グルカゴン様ペプチド−1(GLP−1)、およびエキセンディン−4を含み;成長因子はガストリン、インターフェロン−γ(IFNγ)、肝細胞成長因子(HGF)、表皮成長因子(EGF)、β−セルリン、アクチビン−A、ケラチノサイト成長因子(KGF)、繊維芽細胞成長因子(FGF)、トランスフォーミング成長因子−α(TGF−α)、トランスフォーミング成長因子−β(TGF−β)、神経成長因子(NGF)、インスリン様成長因子類(IGFs)、膵島新生に関連するタンパク質(INGAP)、および血管内皮成長因子(VEGF)を含み;ビタミンはニコチンアミドおよびレチノイン酸を含み;そして化学物質は酪酸ナトリウムを含む。
【0016】
この方法により転換された肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞は、インスリンI(InsI)、インスリンII(InsII)、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓のポリペプチド(PP)、アミラーゼ、エラスターゼ、グルコーストランスポーター2(GLUT2)、グルコキナーゼ、PC1、PC2、PC3、カルボキシペプチダーゼE(CPE)、Pdx1、Hlxb9、Isl1、ngn3、Nkx2.2、Pax6、NeuroD/β2、Nkx6.1およびPdx4を含む、多数の膵臓のメッセンジャーRNAのあらゆる組み合わせを発現することができる。同様に転換された細胞は、InsI、InsII、グルカゴン、ソマトスタチン、PP、アミラーゼ、エラスターゼ、GLUT2、グルコキナーゼ、PC1、PC2、PC3、CPE、Pdx1、Hlxb9、Isl1、ngn3、Nkx2.2、Pax6、NeuroD/β2、Nkx6.1およびPdx4を含む、多数の膵臓のタンパク質のあらゆる組み合わせを発現することができる。
【0017】
好ましくは転換された肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞は、膵臓の内分泌系列に分化する。このような転換された細胞を培養して、内分泌ホルモン(例えばβ、αおよびγ細胞由来のインスリン、グルカゴンおよびソマトスタチン)を産生することができる。
【0018】
膵臓の発生遺伝子でのトランスフェクションによる、または培養条件による転換の方法により、膵島産生幹細胞(IPSC)、膵島前駆細胞(IPC)および膵島様構造体もしくはIPC由来の膵島(IdI)、またはそれらの細胞成分(α、β、γおよび/またはPP細胞)を含む、分化の異なる段階の膵臓細胞を得ることができる。分化転換はまた、膵臓細胞の発現パターンを明らかに示し(例えばインスリン産生)、そしてまた肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞の特徴も保持し得る(例えば肝臓の幹細胞または前駆細胞のマーカー)細胞を得ることができる。肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞のマーカーは、造血マーカーおよび肝臓卵円形細胞もしくは肝芽細胞のマーカーを含む。
【0019】
当明細書に引用したすべての参考文献を、その全内容において参照として援用する。
(発明の詳細な説明)
本発明のさらなる理解を促進するため、以下の定義を提供する。
【0020】
“膵島産生幹細胞”(IPSC)は、in vitro およびin vivoで膵管上皮からまたは膵管上皮の間で発生する幹細胞をいう。IPSCを得て、維持する方法は、2000年9月27日に出願されたPCT/US00/26469に詳細に記載されており、同文献をその全内容において当明細書に参照として援用する。
【0021】
“膵島前駆細胞”(IPC)は、当明細書およびPCT/US00/26469に記載の方法を用いてin vitroで培養されたIPSCから発生する膵臓前駆細胞をいう。
“IPC由来の膵島”(IdI)は、当明細書およびPCT/US00/26469に記載の方法を用いてin vitroで培養されたIPCから発生する膵島様構造体をいう。
【0022】
“肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞”は、非限定的に肝芽細胞、卵円形細胞、幹細胞様特性を有する肝臓上皮細胞、ならびに未分化の肝細胞および胆管細胞を含む、すべての肝臓の幹細胞および/または前駆細胞をいう。多くの肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞株が文献に報告されている(Williams, G. et al. (1971) Exp. Cell Res. 69: 106-112; Williams, G. et al. (1973) 29: 293-303; Grisham, J. (1980) Ann. N.Y. Acad. Sci. 349: 128-137; Tsao, M-S. et al. (1984) Exp. Cell Res. 154: 38-52; Coleman, W. et al. (1997) Am. J. Pathol. 151: 353-359; Coleman, W. et al. (1993) Am. J. Pathol. 142: 1372-82; McCullough, K. et al. (1994) Cancer Res. 54: 3668-71; Amicone, L. et al. (1997) EMBO J. 16: 495-503; Spagnoli, F. et al. (1998) J. Cell Biol. 143: 1101-1112; Sell, S. et al. (1982) Hepatol. 2: 77-86; Shinozuka, H. et al. (1978) Cancer Res. 38: 1092-98; McMahon, J. et al. (1986) Cancer Res. 46: 4665-71; Brill, S. et al. (1999) Digest. Dis. Sci. 44: 364-71; およびRogler, L. (1977) Am. J. Pathol. 150: 591-602)が、好ましくは当該方法で使用する肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞は、例えばYin, L. et al. (2001A), Yin, L. et al. (2001B)およびYin, L. et al. (2002)に記載されているように、発癌性物質の関与のない肝臓傷害モデルから得る。肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞は、1つまたはそれ以上の肝臓卵円形細胞または肝芽細胞のマーカー(α−胎児タンパク質、アルブミン、サイトケラチン14(CK14)、c−kit、OC.2、OC.3、OC.10、OV1およびOV6)、および/または1つまたはそれ以上の造血幹細胞マーカー(CD34、Thy1.1およびCD45)を発現することもまた好ましい。
【0023】
“膵臓内分泌系”は、発生が膵臓内分泌細胞に方向付けられていることをいう。
“膵臓系”は、発生が内分泌細胞、外分泌細胞および/または管細胞を含む膵臓細胞に方向付けられていることをいう。
【0024】
“膵臓機能細胞”は、膵臓系の細胞、または当明細書に記載の方法により分化転換もしくは転換された細胞をいい、これらの細胞は、膵臓細胞に特徴的および特異的なmRNAまたはタンパク質(例えばインスリン)を発現し、そしてまた肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞の特徴(すなわち肝臓の肝細胞または前駆細胞のマーカー)を保持することもできる。膵臓機能細胞は好ましくはグルコース応答性のインスリン産生細胞である。この機能細胞は好ましくはグルコース刺激に応答してインスリンタンパク質を産生、分泌する。この応答は好ましくは、目的の哺乳類種のインスリン応答の正常範囲内である。このような正常範囲は当該技術分野で公知であり、容易に決定できる。
【0025】
“トランスフェクション”は、コードする配列を含む核酸のフラグメントまたはコンストラクトを標的細胞(ここでは肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞)内に導入して標的細胞内でコードする配列を発現させるに至ることのできる、当該技術分野に公知のあらゆる方法をいう。標的細胞内での発現のための必要なプロモーター配列および制御配列は、フラグメントまたはコンストラクトに含まれるものとする。
【0026】
このように本発明は、肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞を膵臓発生遺伝子でトランスフェクトすることにより、および/または膵臓機能細胞への分化を誘導する因子を含む倍地中で、前記の肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞を培養することにより、肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞を膵臓機能細胞に転換させる方法を含む。得られる膵臓機能細胞は、膵臓内分泌系の細胞とすることができる、または肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞と膵臓系の細胞との間の中間的な発現パターンを有する細胞とすることができる。“膵臓系の細胞”という用語は、膵島産生幹細胞(IPSC)、膵島前駆細胞(IPC)、膵島様構造体もしくはIPC由来の膵島(IdI)、または天然に由来する膵臓内分泌細胞(例えばα、βおよび/もしくはδ細胞、または管細胞)を意味する。加えて、中間的発現パターンを有する細胞は、グルコースの刺激に応答してインスリンタンパク質を産生、分泌する細胞であり、そしてこの細胞は肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞のマーカーを発現することができる。
【0027】
肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞は、肝芽細胞および/または肝臓卵円形細胞とすることができる。肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞は、少なくとも1つの造血マーカーおよび/または少なくとも1つの肝臓卵円形細胞もしくは肝芽細胞のマーカーを発現する。造血マーカーはCD34、Thy1.1、および/またはCD45である。肝芽細胞または卵円形細胞のマーカーは、α−胎児タンパク質、アルブミン、サイトケラチン14(CK14)、c−kit、OC.2、OC.3、OC.10、OV1およびOV6である。
【0028】
トランスフェクションの態様において、膵臓発生遺伝子は、Pdx1、Hlxb9、Isl1、ngn3、Nkx2.2、Pax6、NeuroD/β2、Nkx6.1および/またはPdx4とすることができる。好ましくは膵臓発生遺伝子はPdx−1である。
【0029】
培養による分化転換の態様において、肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞を当該技術分野に公知の方法で、標準的な培地に因子を加えて培養する。この因子は、デキサメタゾン、グルカゴン様ペプチド−1(GLP−1)、エキセンディン−4、ガストリン、インターフェロン−γ(IFNγ)、肝細胞成長因子(HGF)、表皮成長因子(EGF)、β−セルリン、アクチビン−A、ケラチノサイト成長因子(KGF)、繊維芽細胞成長因子(FGF)、トランスフォーミング成長因子−α(TGF−α)、トランスフォーミング成長因子−β(TGF−β)、神経成長因子(NGF)、インスリン様成長因子類(IGFs)、膵島新生に関連するタンパク質(INGAP)、および血管内皮成長因子(VEGF)、ニコチンアミド、レチノイン酸、酪酸ナトリウム、またはそれらのあらゆる組み合わせを含む。
【0030】
転換された細胞は、インスリンI(InsI)、インスリンII(INsII)、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓のポリペプチド(PP)、アミラーゼ、エラスターゼ、グルコーストランスポーター2(GLUT2)、グルコキナーゼ、PC1、PC2、PC3、カルボキシペプチダーゼE(CPE)、Pdx1、Hlxb9、Isl1、ngn3、Nkx2.2、Pax6、NeuroD/β2、Nkx6.1および/またはPdx4を含む多数の膵臓のメッセージのいずれかを発現することができる。したがって転換された細胞は、InsI、InsII、グルカゴン、ソマトスタチン、PP、アミラーゼ、エラスターゼ、GLUT2、グルコキナーゼ、PC1、PC2、PC3、CPE、Pdx1、Hlxb9、Isl1、ngn3、Nkx2.2、Pax6、NeuroD/β2、Nkx6.1およびPdx4を含む複数の膵臓のタンパク質を発現することができる。しかし、転換された細胞はグルコース刺激に応答してインスリンタンパク質を産生、分泌することが好ましい。反応は好ましくは目的の哺乳類の細胞の正常範囲内である。
【0031】
本発明はまた当明細書に記載の方法により産生される膵臓機能細胞を含み、この場合膵臓機能細胞は、肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞および膵臓系の細胞との間の中間的な発現パターンを有する。1つの態様において、膵臓機能細胞はPdx1、アミラーゼおよびインスリンIIを発現する。
【0032】
本発明はさらに、当明細書に記載したように肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞を膵臓細胞に転換させ、当該技術分野に公知の方法を用いて該膵臓機能細胞を培養し、そして当該技術分野に公知の方法を用いて細胞培養物から内分泌ホルモンを回収することを含む、内分泌ホルモンを産生する方法を含む。
【実施例】
【0033】
(実施例)
実施例1−肝臓幹細胞 / 肝臓前駆細胞
肝臓幹細胞特性をもつ肝臓上皮細胞株を、Yin, L. et al. (2001A); Yin, L. et al. (2001B);およびYin, L. et al. (2002)に記載されているようにアリルアルコール(AA)により傷害された成体ラット肝臓から発生させた。 AAは門脈周囲の肝臓の傷害を誘発する、したがって肝臓発癌物質の関与のない肝臓傷害モデルである(Peterson B.E. et al. (1998) Hepatology 27(4): 1030-38)。1(1)#3、1(1)#6、1(3)#3、2(11)および3(8)#21と命名された5つの細胞株を選択し、それらの膵臓系の細胞への分化の可能性を調べた。これら5株は、様々な肝臓発生マーカー、細胞系譜マーカーおよび造血幹細胞マーカーについて、ウェスタンブロット、ノーザンブロット、免疫細胞化学および組織化学により十分に特徴付けられている。結果を図1にまとめる。細胞株3(8)#21の免疫細胞化学の結果の写真も、図1に示す。興味深いことにこれらの細胞株のほとんどすべてが造血幹細胞とのこれらの関連の可能性を示す、造血幹細胞マーカーCD34,Thy1.1およびCD45を発現している。これらは肝臓前駆細胞遺伝子、例えばα−胎児タンパク質(AFP)、アルブミン、サイトケラチン14(CK14)およびc−kitもまた発現している。これらはIto細胞マーカーのデスミンまたはクッパー細胞/マクロファージのマーカー、ED1およびED2は発現しない(結果は示していない)。これらの細胞は成熟肝細胞の特異的遺伝子、例えばグルコース−6−ホスファターゼ(G−6−Pase)、ジペプチジルペプチダーゼIV(DPP IV)、およびシトクロムP450(CYP450)を発現しない、そして成熟胆管細胞の特異的遺伝子CK19の発現を示さない、未分化の状態で維持することができる(結果は示していない)。5株はすべてフローサイトメトリーにより二倍体であることが確認されている。細胞株3(8)#21で行われた分化の誘導は、STO繊維芽細胞のフィーダーレイヤーを使用せずに長期間培養することにより、肝細胞表現型を誘導できることを示す(図2A、B)。塩基性FGFは分化を増大させることができる(図2C)。マトリゲル上での細胞の培養は肝臓の胆管の表現型を誘導する(図2D、E)。これらの結果は、肝細胞または肝臓の胆管細胞に分化する、細胞株3(8)#21の二分化能を示唆している。
【0034】
実施例2−肝臓前駆細胞株における、膵臓発生および細胞系譜の特異的遺伝子の発現
これら5つの(未処理)肝臓前駆細胞株を、インスリンIおよびインスリンII、膵臓外分泌マーカーのアミラーゼ、GLUT2(グルコーストランスポーター)、および膵臓の発生に深く関与する一部の転写因子、例えばPdx1、Isl1、NeuroD/β2、Nkx6.1およびPdx4を含む、選択された膵臓内分泌マーカーの発現について分析した。これらの遺伝子の発現はRT−PCRにより決定し、サザンブロットにより確認した。データは図3に示した。ラットの膵臓組織は、インスリンI、インスリンII、アミラーゼ、GLUT2、Pdx1、Isl1およびNkx6.1を含む検査したマーカーのほとんどを発現するが、NeuroD/β2およびPdx4は発現しない(図3;レーン1)。
ガンマ照射したSTOフィーダー細胞はこれらのマーカーのいずれも発現しない(図3;レーン2)。肝臓前駆細胞株1(1)#3(図3;レーン3)および3(8)#21(図3;レーン7)は検査したほとんどすべての膵臓転写因子、そしてインスリンIおよびインスリンIIさえも発現するが、アミラーゼ、Pdx1およびGLUT2は検出可能なレベルでは発現しない(図3;レーン3および7)。細胞株1(1)#6は、INSIおよびIIならびにNeuroD/β2についてはポジティブである(図3;レーン4)。細胞株2(11)はNeuroD/β2、Nkx6.1およびPdx4についてはポジティブであるが、他のすべてのマーカーにはネガティブである(図3;レーン6)。細胞株1(1)#3はNeuroD/β2についてのみポジティブである(図3;レーン5)。これらのデータは、検査した5つの肝臓前駆細胞株の少なくとも2つ(1(1)#3および3(8)#21)が、膵島に分化させる因子による何らかの処置前でさえも、これらの膵臓系列に入る “準備ができていること”を発現していることを示す。
【0035】
さらにそしてポジティブコントロールとして、膵臓分化経路に肝臓幹細胞を方向付ける目的で、膵臓決定転写因子であるPdx1をこれらの各肝臓前駆細胞株にトランスフェクトした。図4に示したようにPdx1遺伝子の導入はアミラーゼ遺伝子発現の引き金となる(図4;レーン3、5、7、9、11)が、トランスフェクトしなかった親株では発現していない(図4;レーン2、4、6、8、10)。興味深いことにインスリンIIを発現する細胞株1(1)#3および3(8)#21は、Pdx1遺伝子によるトランスフェクション後、インスリンIIの発現低下を示す(図4;レーン2、3、10、11)が、一方トランスフェクション前にこの遺伝子を発現しなかった細胞株ではインスリンIIの誘発がみとめられた(図4;レーン4、5、6、7)。
【0036】
実施例3−肝臓幹細胞 / 肝臓前駆細胞の分化能を決定するための、異なる実験条件下での同細胞における発現の特徴づけ
当明細書で述べた肝臓前駆細胞株を、異なる段階で膵臓の発生をコントロールする遺伝子(Pdx1、Hlxb9、Isl1、ngn3、Nkx2.2、Pax6、NeuroD/β2、Nkx6.1およびPdx4)、内分泌細胞系譜マーカー(インスリンI、インスリンII、グルカゴン、ソマトスタチンおよびPP)、外分泌マーカー(アミラーゼおよびエラスターゼ)、ならびにインスリンの感知(sensing)、合成、過程(process)および分泌に関与する遺伝子(GLUT−2、グルコキナーゼ、PC1、PC2、PC3およびカルボキシペプチダーゼE(CPE))の発現について検討する。各細胞株を、未処理および処理の条件下での発現について評価する。処理する細胞株は膵臓の幹細胞または前駆細胞の分化を高めることが知られている培養条件下で増殖させる、および/または膵臓発生遺伝子でトランスフェクトするものとする。
【0037】
RT−PCR、サザンブロット、免疫細胞化学、およびウェスタンブロットの技術を用いて、mRNAの発現(すべての遺伝子)およびタンパク質レベル(例えばPdx1およびホルモン)の双方で遺伝子の発現を決定する。正常な膵臓組織、初期肝細胞、およびSTOフィーダー細胞をコントロールとする。処理細胞株の特徴付けを行い、未処理株と比較する。肝臓幹細胞マーカー(AFP、アルブミン、CK14、c−kit、OV6、OV1)および造血幹細胞/前駆細胞マーカー(CD34、Thy1.1、CD45)の発現についても処理細胞株で分析し、それらの肝臓幹細胞の表現型が処理後に失われているかどうかを調べる。
【0038】
プラスミド、例えばPdx1遺伝子およびNeo遺伝子を保有するプラスミドpBKCMV/Stf1(Pdx1)(Dr. Dutta, Hoffmann-La Roche, Inc. Nutley, NJ より供与)を使用して、肝臓細胞株をトランスフェクトした。Pdx1でトランスフェクトした細胞は、インスリン産生細胞への分化に関するポジティブコントロールとして使用することができる。
【0039】
RT−PCR / サザンブロット
DNAを含まないRNAは、StrataPrep(登録商標)Total RNA Miniprep Kit(Stratagene, La Jolla, CA)またはRNAqueous(登録商標)-4PCR Kit(Ambion, Austin, TX)を用いて、製品のプロトコルに従って抽出する。RT−PCRは当該技術分野で公知の方法に従って行う。PCRのアンプライマー(amplimer)として使用するオリゴヌクレオチドを表1に列記する。PCRサイクルは、95℃で3分間、続いて94℃で45秒間、各プライマーペアに対応する至適アニーリング温度で45秒間、72℃で1分間(34サイクル)そして72℃で10分間とする。PCR産生物はBioRad/RAC300 power supplyを用いて100ボルトで80分間、TBEバッファー中の1.5% Seakem アガロースゲルに流す。ゲルをTBEバッファー中の1% 臭化エチジウム溶液中で15から30分間インキュベーションした後、UV光で可視化する。画像を撮影し、AlphaImage(登録商標)2200 Documentation & Analysis system (Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA)を用いて処理する。サザンブロッティング用のオリゴプローブのジゴキシゲニン標識は、Dig Oligonucleotide Tailing Kit (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN)を用いて、製品のプロトコルに従って行う。確認のための技術として、サザンブロッティングをPCR反応後に標準的なプロトコルを用いて行う。
【0040】
【表2】
【0041】
免疫細胞化学
Biogenex (San Ramon, CA)から導入したアビジン−ビオチン法を次に行う。細胞は細胞遠心機(Cytopro(登録商標), Wescor, Inc. Logan, UT)を用いてFisher Brand superfrost pulus slide (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)上にサイトスピンさせる(cytospun)か、または組織培養プレート(Falcon(登録商標),Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)に設置した8ウェルガラススライド(ICN Costa Mesa, California)上で増殖させるかのいずれかとし、0.5% グルタルアルデヒド中で1時間、室温で固定する。細胞内染色のため、細胞を0.2%Triton-X を用いて透過処理する。ブロッキングおよび抗原回復(必要な場合)は細胞の第1抗体染色前に行う。アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼに連結させたビオチンと第2抗体を複合させ;ストレプトアビジン(ビオチンと結合する)を、アルカリホスファターゼまたはぺルオキシダーゼに連結させる。次に3,3’−ジアミノベンジジン(DAB)、3−アミノ−9−エチルカルボゾール(AEC)、Fast Red、または5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルホスフェート/ニトロブルーテトラゾリウム(BCIP/NBT)を用いて抗体を視覚化する。このシステムはまた、複数の抗原の発現を視覚化できる二重染色法として使用することもできる。
【0042】
ウェスタンブロット
ウェスタンブロットもまた遺伝子の翻訳の研究に使用する。細胞を溶菌バッファー(8.0mlに対して:3.8mlのdH2O、1mlの0.5M Tris−HCl(pH6.8)、0.8mlのグリセロール、1.6mlの10%(w/v)SDS、および0.4mlのβ−メルカプトエタノール、および0.4mlの0.5% ブロモフェノールブルー)中で溶菌させる。
【0043】
【表3】
【0044】
組織を氷上でホモジェネート用バッファー(20mM Tris、137mM NaCl、10% グリセロール、1mM Na3VO4、1u/ml アプロチニン、1mM 4−(2−アミノエチル)ベンゼンスルホニルフルオリド(AEBSF)、pH8.0)中でホモジェネートし、9,000gで20分間、4℃で遠心し、上清を集める。タンパク質濃度をCoomassie Plus Protein Assay Reagent(クーマシープラスタンパク質アッセイ試薬)(PIERCE, Rockford, Illinois)を用いて決定する。次にサンプルを適当な濃度で分離用ゲルに100V,4ワット、および50mAで2時間流す。次にゲルを、Mini Trans-Blot Cell(Bio-Rad, Hercules, CA)を用いて、移行用バッファー(25mM Tris、192mM グリシンおよび20%v/v メタノール、pH8.3)中で30ボルト、2ワット、および50mA、オーバーナイトで、ニトロセルロース膜(Bio-Rad)に移行させる。その後膜を各プライマリー抗体中で4℃、オーバーナイトでブロットする。その後、膜を洗浄し、アルカリホスファターゼと連結させた対応する2次抗体と共に、1時間室温でインキュベーションし、適当な発色が得られるまで、60μlのニトロブルーテトラゾリウム(NBT)溶液(50mgのNBTを0.3ml dH2Oを含む0.7mlのN,N−ジメチルホルムアミド(DMF)に溶かす)、および60μlの5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルホスフェート(BCIP)溶液(50mgのBCIPを1mlの100%DMFに溶かす)を含む炭酸バッファー(0.1M NaHCO3、1mM MgCl2、pH9.8)中で、発色させる。
【0045】
肝臓幹細胞の分化
肝臓幹細胞を、ホルモン(デキサメタゾン、GLP−1、エキセンディン−4)、成長因子(ガストリン、インターフェロン−γ(IGFγ)、HGF、EGF、β−セルリン、アクチビン−A、KGF、FGF、TGF−αおよび−β、NGF、IGFs、INGAP、およびVEGF)、ビタミン(ニコチンアミドおよびレチノイン酸)、および/または化学物質(酪酸ナトリウム)を組み合わせたものを表4に列記した濃度で含む基本培地(BM)中で培養する。表4に示した濃度はそれらの有効性を至適化するように濃度を1−3桁変動させてもよい。上述のホルモン、成長因子、ビタミンおよび化学物質は膵臓/β細胞の発生に関与することが、文献または2002年3月29日に出願されたPCT特許出願第PCT/US02/09881号に報告されている。処理細胞株において、肝臓幹細胞マーカーおよび造血幹細胞マーカーの発現についても観察し、処理後に肝臓幹細胞表現型が失われているかどうかを決定する。
【0046】
トランスフェクションおよび選択
FuGENE6トランスフェクション試薬(Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN)を用いてPdx1遺伝子およびNeogeneを保有するpBKCMV/Stf1(Pdx1)を、製品のプロトコルにより肝臓幹細胞にトランスフェクトする。Mockトランスフェクションおよびベクターのみのトランスフェクションもまた同時に行う。遺伝子のトランスフェクションの3日後、細胞を1mg/mlのG418を含む培養用培地で培養する。耐性クローンは約10日で認められる。2から4週間の間に選択を行う。その後、細胞を0.3mg/mlのG418を含む培養用培地で培養する。
類似のトランスフェクションも他の膵臓発生遺伝子を含むプラスミドで行うことができる。
【0047】
実施例4−ラット肝臓幹細胞 / 肝臓前駆細胞由来のインスリン産生細胞(LSDIPC)機能の能力の決定
インスリンを産生することが発見された実施例3の細胞株(LSDIPC)を、さらにそのグルコースへの応答性について評価する。細胞は細胞外および細胞内双方のインスリン産生について検査する。細胞株がグルコース応答性のインスリン産生を示す場合は、次に基質のリン酸化パターンをグルコースの刺激後に決定することができる。新たに単離されたラット膵島細胞をポジティブコントロールとする。基質のリン酸化パターンの観察により、インスリン産生の誘導に関与する早期のシグナル応答を明らかにする。
【0048】
グルコースに誘発されるインスリンの刺激のアッセイ
分化させたLSDIPCを5.5mM グルコースを含む1mlの培地を入れた24ウェルプレートで、各ウェル当たり2x105個の細胞の濃度で植え付け、24時間寝かせる。細胞をKrebs-Ringerバッファー(KRB)で洗浄し、グルコースを含むまたは含まない(0、5.5、11および17.5mMグルコース)培養用培地1mlで3−18時間刺激する。細胞を含まない上清を集め使用するまで−70℃で保存する。次に細胞を溶菌バッファーで処理して、Mercodia Ultrasensitive Rat Insulin ELISA Enzyme イムノアッセイキット(Mercodia, Uppsala, Sweden)を用いてインスリン含有量を決定する。このインスリンキットを使用して、BioRad's Benchmark プレートリーダー(490nm)を用いて分泌されたインスリンおよび細胞内のインスリン双方を測定する。インスリンの値は細胞の(Trizol (登録商標),Gibcoを用いて抽出された)総DNA濃度に対して標準化する。
【0049】
ホルモン検出のためのELISA
上述のように、分泌されたインスリンおよび細胞内のインスリンを、Mercodia Ultrasensitive Rat Insulin ELISA Enzyme イムノアッセイキット(Mercodia, Uppsala, Sweden)を用いて製品のプロトコルに従って測定する。同様にグルカゴンアッセイを当該技術分野に公知の方法、またはそれを適応させた方法で行う。
【0050】
基質のリン酸化のアッセイ
分化させたLSDIPCを17.5mM グルコースで0、5、15および30分間刺激した後、抽出バッファー(20mmol/l K2HPO4、pH7.5、5mmol/l DTT、1mmol/l EDTA、および110mmol/l KCL)中でホモジェネートする。ホモジェネート液を用いて、10%SDS−PAGE(BioRad)上でタンパク質を分離し、リン酸化されたタンパク質基質を抗ホスホチロシン抗体(Pharmingen, San Diego, CA)を用いてウェスタンブロット法で検出する。
【0051】
当明細書に述べた実施例および態様は説明のみを目的としており、その観点において様々な修飾または変更を当業者に示唆しており、そしてそれらは本出願の精神および範囲ならびに付記した請求項の範疇内に含まれるものとすることは、理解されるべきであろう。
【図面の簡単な説明】
【0052】
【図1】図1はアリルアルコールに傷害されたラット肝臓由来の5つの肝臓上皮細胞株の特徴を示す。記号の意味は:−ネガティブ、+/−わずかにポジティブ、+ポジティブ、++非常にポジティブである。
【図2】図2は、幹細胞様細胞および胆管様細胞に分化する、肝臓上皮細胞株3(8)#21の二分化能を示す。A:フィーダーを使用せずに培養した3(8)#21は成熟肝細胞マーカーH4にポジティブである。B:6日目、フィーダーを使用せずに培養した3(8)#21は12日目で成熟肝細胞マーカーCYPIAIIにポジティブである。C:フィーダーを使用しないがbFGFを使用して培養した3(8)#21;6日目でH4によりポジティブな細胞が観察された。D:フィーダーを使用せずマトリゲル上で培養した3(8)#21は4日目で管状構造を形成する。E:フィーダーを使用せずにマトリゲル上で培養した3(8)#21は13日目で成熟胆管細胞マーカーBD1を強発現する。パネルA、B、C、およびEの倍率は400xである。パネルDの倍率は200xである(Yin, L. et al. (2001A); Yin, L. et al. (2001B);およびYin, L. et al. (2002))。
【図3】図3は5つの肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞株における膵臓発生マーカーの発現を示す。
【図4】図4はPdx1遺伝子によるトランスフェクション後、肝臓前駆細胞株におけるインスリンIIおよびアミラーゼの発現を示す。
【0001】
(発明の背景)
糖尿病の療法または治療としての細胞移植
I型糖尿病は、インスリン産生膵島β細胞の選択的自己免疫不全に起因する慢性代謝疾患である。糖尿病の臨床的管理にはわが国において年間〜1,000億ドルのコストを要する。I型糖尿病のインスリン不全および高血糖は、長い間には重症の2次的合併症をもたらす。しかし、毎日のグルコースの変動をコントロールするために使用されている規則的なインスリン補充治療では、臨床的合併症を予防/低減するために絶えず正常範囲付近のグルコースレベルを維持することはできない(The DCCT Research Group(1991) N. Eng. J. Med. 329:977)。
【0002】
(インスリン非依存性の達成および2次的合併症発症の低減の双方に関して)I型糖尿病を治すまたは治療するためには、全膵臓または膵島のいずれかの移植で患者の膵島β細胞を回復することが必須である。米国では毎年〜35,000例のI型糖尿病の新たな症例が診断されているが、一方約3,000の死体膵臓が同期間で入手できるに過ぎない(Hering, G. J. et al. (1999)Graft 2: 12-27)。このように膵島および/またはインスリン産生細胞を含む、膵臓系譜の機能細胞の代替材料の開発が早急に必要である。移植用膵臓組織の深刻な不足を回避するために利用できる唯一の概念的選択肢は、膵臓系譜の機能細胞(例えば膵島またはインスリン産生細胞)を、幹細胞からin vitroで発生させることである。
【0003】
移植可能な膵島の1つの材料は、膵臓由来の膵島産生幹細胞(IPSC)である(Ramiya, V.K. et al. (2000) Nature Med. 6(3): 278-282;およびPCT/US00/26469,2000年9月27日出願)。しかしI型糖尿病を治すまたは治療する試みにおいて成功のチャンスを拡大するため、膵臓系の細胞を生成する付加的/代替的方法を研究すべきであろう。肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞は、膵臓系の細胞への転換のための実現可能な材料として提供できる。肝臓幹細胞を使用することには多くの利点がある:a)肝臓は部分的肝切除後に再生する非常に大きな潜在能力を有しており(例えば部分的肝切除した肝臓の重量および機能は、肝臓の2/3を切除した場合でさえ、約1週間で完全に回復することができ(Higgins, G.F. et al. (1931) Arc. Pathol. 12: 186-202; Grisham. J.W. (1962)Cancer Res. 22: 842-849;およびBucher, N. (1963)Int. Rev. Cytol. 15: 245-300))、したがって肝臓は、自己移植用の幹細胞のより入手し易い材料として提供できる;およびb)肝臓幹細胞表面の表現型は既に確立されており、したがって器官からそれらを精製することはより容易である(表1参照のこと)。また肝臓幹細胞は、CD34、Thy1.1、幹細胞因子(SCF)/c−kit、Flt−3リガンド/flt−3のような表面の造血幹細胞マーカーを共有しており(Yin, L. et al. (2001) Proc. Am. Assoc. Canc. Res. 42:354; Yin, L. et al. (2001) FASEB J. Late-Breaking Abstracts: 49 (LB267); Fujio, K. et al. (1996) Exp. Cell Res. 224; 243-50; Blakolmer, K. et al. (1995) Hepatology 21(6): 1510-16: Omori, N. et al. (1997) Hepatology 26(3): 720-27; Omori, M. et al. (1997) Am. J. Pathol. 150(4): 1179-87; Lemmer, E.R. et al. (1998) J. Hepatol. 29: 450-454; Petersen, B.E. et al. (1998) Hepatology 27(2): 433-445; およびBaumann, U. et al. (1999) Hepatology 30(1): 112-117)、これらのマーカーを他の公知の肝臓幹細胞マーカーと共に細胞の分類に使用することができる。
【0004】
【表1】
【0005】
以下のセクションで肝臓および膵臓の幹細胞の現状、胚発生期のこれらの関連、およびこれら器官内の分化転換について述べる。
肝臓および肝臓幹細胞の発生
胚において肝臓は、マウスでは発生後約8.5から9日(8.5 to 9 days of development)で前心臓(precardiac)中胚葉と接触する領域の、腹側前腸(ventral foregut)の上皮細胞から発生する。この領域の細胞が増殖して肝臓憩室を形成する。妊娠約9.5日で、肝臓憩室の細胞は周囲の横中隔内に移動し始める。この段階で、細胞は肝芽細胞と命名され、これらの細胞は肝臓上皮細胞系譜に沿って決定されることが示されている。肝芽細胞は二分化能があり、肝細胞および胆管細胞の双方が形成される(Houssaint, E. (1980) Cell Differ. 9: 269-279)。一般に肝臓が傷害されると、成熟肝細胞が増殖して肝臓の重量および機能を回復し、肝臓幹細胞は関与しない(Kelly, D.E. et al.(1984) Bailey's Textbook of Microscopic Anatomy(顕微鏡解剖学についてのBaileyの教科書)、第18版、Williams and Willkins、Baltimore, pp590-616)。しかし傷害が非常に重症である場合、および/または肝細胞の増殖が化学物質、例えば2−N−アセチルアミノフルオレン(2AAF)およびフェノバルビタールにより阻害される場合には、肝臓幹細胞部分が活性化される。成体肝臓における肝臓幹細胞は、主に動物の肝傷害モデル、例えば2AAF/部分肝切除(PH)(Golding, M. et al. (1995) Hepatology 22(4): 1243-1253)、2AAF/アリルアルコール(AA)およびフェノバービタル/コカイン誘発性の門脈周囲の肝傷害(Yavokovsky, L. et al. (1995) Hepatology 21(6): 1702-12; Petersen, B. et al. (1998)Hepatology 27(4): 1030-1038; Yin, L. et al. (1999) J. Hepatology 31: 497-507;およびRosenberg, D. et al. (2000) Hepatology 31(4): 948-955)、および2AAF/CCl4誘発性の中心周囲の肝傷害(Petersen et al. (1998))において広範囲に研究されてきた。傷害部位にかかわりなく、卵円形状の肝臓幹細胞は常にへーリング管の門脈領域に由来する(Wilson, J. et al. (1958) J. Pathol. Bacteriol. 76: 441-449)。成体肝臓のこれらの肝臓前駆細胞は肝細胞および胆管細胞の双方に分化することができる(Stenberg, P. et al. (1991) Carcinogenesis 12: 225-231; およびDabeva, J. et al.(1993) Am. J. Pathology 143: 1606-1620)。ごく最近、動物およびヒトの双方からの証拠のいくつかの傾向は、造血幹細胞が肝臓幹細胞の肝臓以外の材料であることを強く示唆している(Peterson, B. et al. (1999) Science 284: 1168-70; Theise, N. et al. (2000) Hepatology 31(1): 235-40; Theise, N. et al.(2000)Hepatology 32(1): 11-16; およびAlison, M. et al.(2000) Nature 406: 257)。幹細胞様特性を持つ上皮細胞株が、マウス肝臓憩室(Rogler, L. (1997) Am. J. Pathol. 150(2): 591-602)、傷害されたラット肝臓(Yin, L. et al.(2001A) PAACR 42: 354; Yin, L. et al (2001B) FASEB J. Late-Breaking Abstracts: 49 (LB267); Yin, L. et al (2002) Hepatology 35(2): 315-324)、ならびに正常ラット肝臓(Tso, M-S. et al. (1984)Expp. Cell. Res. 154: 38-52; およびTso, M-S. (1988) Lab. Invest. 58: 636-642)、および正常ブタ肝臓(Kano, J. et al. (2000) Am. J. Pathol. 156(6): 2033-2043)、および正常ヒト肝臓(Crosby, H. et al. (2001) )Gastroenterology 120(2): 534-544)から確立された。これらの細胞を誘導して肝細胞および/または胆管細胞にin vitroで(Rogler, L. (1977); Yin, L. et al. (2001A); Yin, L. et al. (2001B); Yin, L. et al. (2002); Crosby, H. et al. (2001);およびColeman, W. et al. (1993) Am. J. Pathol. 142: 1373-82)および移植下のin vivoで(Coleman, W. et al. (1993);およびGrisham, J. et al. (1993) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204: 270-79)分化させることができる。
【0006】
哺乳類の消化管内胚葉から肝臓へ胚を誘導するシグナリング分子は、完全には理解されていない。心臓中胚葉で発現される繊維芽細胞成長因子(FGF)1,2および8は、最初の肝発生に必須であることが報告されている(Jung, J. et al. (1999) Science 284: 1998-2003)。インターロイキン−6ファミリーのサイトカインであるオンコスタチンM(OSM)は、グルココルチコイドと共に胚の肝臓における肝細胞の成熟を誘発し、このことが今度は胚の造血機能を終了させることになる。gp130、すなわちOSM受容体サブユニットを欠損するマウス由来の肝臓は、肝細胞が成熟できないことを示す(Kamiya, A. et al. (1999) EMBO J. 18(8): 2127-36;およびKinoshita, T. et al. (1999) PNAS 96: 7265-70)。分化した肝細胞は、HNF1、HNF3、HNF4およびC/EBPファミリーの肝臓に豊富に含まれる(肝臓固有ではないが)転写因子を固有の組み合わせで発現することを特徴とする(Johnson, P. (1990) Cell. Growth Differ. 1:47-51; Lai, E. et al. (1991) Trends Biochem. Sci. 16: 427-30; DeSimone, V. et al. (1992) Biochem. Biophys. Acta 1132: 119-126; およびCrabtree, G. et al. (1992) Transcriptional Regulation(転写の制御)S.S. McKnight and K.R. Yamamoto(編)Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, pp. 1063-1102)。
【0007】
膵臓および膵臓の幹細胞の発生
胚の発生期、膵臓は背側および腹側の前腸内胚葉の2つの別々の成長に由来し、腹側および背側の膵芽を形成する。その後これらの膵芽が融合して完全な膵臓を形成する(Houssaint, E. (1980); Spooner, B. et al.(1970) J. Cell Biol. 47: 235-46; Rutter, W. et al.(1980) Monogr. Pathol. 21: 30-38; Guaidi, R. et al.(1996) Genes Dev. 10: 1670-82; Zaret, K. (2000) Mech. Dev. 92: 83-88; Edlund, H. (1998) Diabetes 47: 1817-1823; St-Onge, L. et al. (1999) Curr. Opin. Gene Dev. 9: 295-300; およびSlack, J. (1995) 121: 1569-80)。胚形成期、膵臓内の膵島の発生は、膵管上皮に最初に関与する未分化の前駆体細胞から開始するようである(Pictet, R. et al. (1992) Handbook of Physiology(生理学のハンドブック), Steiner, D. and Frienkel, N. (編) Williams and Wilkins, Baltimore, MD, pp. 25-66)。この管上皮は急速に増殖して、その後様々な膵島に関連する細胞集団に分化する(Teitelman, G. et al. (1993) Development 118: 1031-39; およびBeattie, G. et al. (1994) J. Clin. Endo. Met. 78: 1232-1240)。成体の膵臓において、膵島細胞の成長は2つの異なる系列:すなわち管上皮の分化による新たな膵島の成長(新生)、または既に存在するβ細胞の複製のいずれかにより起こりうる。新生は、ダイズトリプシン阻害剤による食事治療(Weaver, C. et al. (1985) Diabetologia 28: 781-785)、高レベルのインターフェロン−γ(Gu, D. (1993) Dev. 118: 33-46)、部分膵移植(Bommer-Weir, S. et al. (1993) Diabetes 42: 1715-1720)、セロハン内に膵臓頭部を包むこと(Rosenberg, L. et al. (1992) Adv. Exp. Med. Biol. 321: 95-104)により、そして特異的成長因子(Otonkonski, T. et al. (1994) Diabetes 43: 947-952)により実験的に誘導することができた。このように膵島のすべてのタイプの内分泌細胞は、同一の管上皮幹細胞から連続的な分化を通して発生することが、一般に受け入れられている(Gu, D. (1993); Rosenberg, L. (1992); およびHellerstrom, D. (1984) Diabetologia 26: 393-400)。膵臓幹細胞が成体膵管調製物から単離され、in vitro でインスリン産生細胞に(ある程度まで)分化することが示され(Ramiya, V. et al. (2000); Cornelius, J. et al. (1997) Horm. Metab. Res, 29: 271-277; およびBonner-Weir, S. et al. (2000) PNAS 97(14): 7999-8004)、このことから移植で非肥満型糖尿病(NOD)マウスの糖尿病を改善することができた(Ramiya, V. et al. (2000))。
【0008】
胚の発生期、背側および腹側の膵臓原基痕跡の特性には違いがある。背側の前膵臓(pre-pancreatic)内胚葉は初期発生段階では脊索との緊密な関連を維持する。覆っている脊索由来のシグナル、例えばアクチビンおよびFGF−2が、ソニックヘッジホッグ(Shh)の内胚葉発現を抑制することにより、背側膵臓の発生を促進する(Hebrok M. et al. (2000) Dev. 127: 4905-13; Kim, S. et al. (1997) Dev. 124: 4243-52; およびLi, H. et al. (1999) Nat. Genet. 23: 67-70)。これらのシグナリング事象に応答しての背側膵臓の形成はまた、多数の転写因子の発現も必要とする。例えばマウスの“ノックアウト”の研究は、背側膵臓の形成がIsl1およびHlxb9に依存し、その後の分化にはPdx1を必要とすることを示した(Li, H. et al. (1999); Harrison, K. et al. (1999) Nat. Genet 23: 71-75; Ahlgren, U. et al. (1997) Nature 385: 257-60)。腹側膵臓の発生の開始を制御するメカニズムは完全には解明されていない。腹側膵臓の発生のコントロールは背側膵臓のそれとは異なると思われる、というのは脊索は腹側内胚葉まで達しておらず、脊索がないため腹側内胚葉はShhを発現しない。さらに腹側膵臓の発生はIsl1−/−およびHlxb9−/−マウスでは正常である(Deutsch, G. et al. (2001) Development 128: 871-881; およびDuncan, S. (2001) Nature Genetics 27: 355-356)。Pdx1は膵臓発生の初期の段階で必要である(Jonsson, J. et al. (1994) Nature 371: 606-609; Ahlgren, U. et al. (1996) Development 122: 1409-1416; Stoffers, D. et al. (1997) Nat. Genet. 15: 106-110; およびOffield, M. et al. (1996) Development 122: 983-995)。Pdx1を欠損するマウスおよびヒトは無膵である(Jonsson, J. et al.(1994); Ahlgren, U. et al. (1996); Stoffers, D. et al.(1997); およびOffield, M. et al.(1996))。しかし消化管内胚葉を膵臓原基に最初に方向付けるためのPdx1発現の上流に作用する他の遺伝子があるようである。したがって上皮の外反ならびに背側および腹側の膵芽の最初の方向付けは、Pdx1変異マウスでもまだ起こり、インスリンポジティブおよびグルカゴンポジティブな細胞もまだ分化する(Ahlgren, U. et al.(1996); およびOffield, M. et al. (1996))。後に膵臓におけるPdx1およびHlxb9の発現は、インスリン産生β細胞に限定されるようになる(Li, H. et al. (1999); Harrison, K. et al.(1999); およびJonsson, J. et al. (1994))。インスリン、GLUT2、グルコキナーゼ、およびプロホルモンコンバターゼ(PC)1、2および3を含む様々な内分泌遺伝子の発現を調節することにより、ホルモンを産生するβ細胞の形質発現を維持するため、Pdx1が必要となる(Ahlgren, U. et al.(1998) Genes Dev. 12: 1763-68; Hart, A. et al.(2000) Nature 408: 864-68; およびBaeza, N. et al.(2001) Diabetes 50, Sup. 1: S36)。Pdx1遺伝子の活性化は、HNF3β(Zaret, K. (1996) Annu. Rev. Physiol. 58: 231-251)およびNeuroD/β2(Sharma, T. et al. (1997) Mol. Cell Biol. 17: 2598-2404)により制御することができる。ngn3、Isl1、Nkx2.2、Nkx6.1、Pax4、Pax6およびNeuroD/β2のような、いくつかのホメオドメインおよび塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックス(bHLH)の転写因子が、膵臓内分泌細胞の分化のコントロールに重要な役割を担っていることが示された(Edlund, H. (1998); St-Onge, L. et al. (1999); Sander, M. et al. (1997) J. Mol. Med. 75: 327-340; Madsen, O. et al. (1997) Horm. Metab. Res. 29(6): 265-270;およびGradwohl, G. et al. (2000) PNAS 97(4): 1607-11)。これらの遺伝子のうち、ngn3は膵臓の4つの内分泌細胞系譜すべての発生に極めて重要であることが報告された(Grawohl, G. et al. (2000))。Pax4はインスリン産生β細胞およびソマトスタチン産生δ細胞の発生を選択的にコントロールするようである(Sosa-Pineda, B. et al. (1997) Nature 386: 399-402)。Nkx6.1は成体ラットにおける高度に制限されたβ細胞発現を有する(Madsen, O. et al. (1997))。マウスのNkx6.1を破壊するとβ細胞前駆細胞の欠損をきたし、β細胞新生が遮断される(Sander, M. et al. (2000) Dev. 127(24): 5533-5540)。このように分化の過程を追ってこれらの因子のスクリーニングし、分化の程度を決定することは極めて重要である。
【0009】
様々な成長因子、ホルモン、ビタミンおよび化学物質、例えば肝細胞成長因子(HGF)、グルカゴン様ペプチド−1(GLP−1)、エキセンディン−4、アクチビン−A、β−セルリン(cellulin)、デキサメタゾン、ニコチンアミド、酪酸ナトリウムは、in vitro でβ細胞の分化に有効であることが示された。HGF(Mashima, H. et al. (1996) Endocrinol. 137: 3969-76)、GLP−1(Zhou, J. et al. (1999) Diabetes 48: 2358-2366)、エキセンディン−4(Zhou, J. et al (1999))、デキサメタゾン、β−セルリンおよびアクチビン−A(Mashima, H. et al.(1996) J. Clin. Invest. 97(7): 1647-54)は、腺房細胞をインスリン分泌細胞に分化させる。GLP−1はβ細胞cAMPおよびインスリン遺伝子の転写のレベルを増加させ、グルコース依存性のインスリン放出を刺激する(Grucker, D. et al. (1987) PNAS 84: 3434-3438)。部分的膵切除に続く糖尿病新生仔ラットへの10日間GLP−1投与は、膵島の増殖および新生の誘導によるβ細胞の重量増加を刺激した(Xu, G. et al. (2000) Diabetes 48: 2270-76)。GLP−1はまたPdx1遺伝子の発現および結合能を増加させる(Buteau, J. et al. (1999) Diabetes 49: 1156-1164)。エキセンディン−4はGLP−1の非常に有効な構造的類似体で、より長い血中半減期を有する。この物質は膵島上のGLP−1受容体にGLP−1と類似するアフィニティーで結合するが、等モル濃度のGLP−1に比してcAMPレベルを3倍増加させるため、長期にわたる動物の研究に使用するためのより有効な薬剤とすることができる(Garcia-Ocana, A. et al. (2001) JCE & M 86: 984-988)。デキサメタゾンおよび酪酸ナトリウムは、ブタの膵島様細胞クラスターにおけるインスリン/DNA含有量の増加により証明されたように、β細胞の分化を促進する可能性がある(Korsgren, O. et al. (1993) Ups. J. Med. Sci. 98(1): 39-52)。膵臓細胞株において、RIN−m5F、酪酸ナトリウムはヘキソキナーゼおよびグルコキナーゼの双方の活性、ならびにグルコキナーゼ遺伝子の発現を2倍に増加させる。ニコチンアミドは、培養ヒト胎児膵臓細胞およびマウスIPSCにおいて、β細胞を分化しその質量を増加させることが知られているポリ(ADP−リボース)シンセターゼ阻害剤であり(Ramiya, V. et al. (2000); およびOtonkoski, T. et al. (1993) J. Clin. Invest. 92: 1459-66)、薬剤誘発型糖尿病動物モデルならびにNODマウスにおける糖尿病の発症を防ぐ(Uchigata, Y. et al. (1983) Diabetes 32: 316-18; およびYamada, K. et al. (1982) Diabetes 31: 749-753)。
【0010】
膵臓幹細胞および肝臓幹細胞の分化の操作
胚の発生において肝臓および腹側膵臓は双方とも、腹側前腸の同じ位置を起源とする(Houssaint, E. (1980); Rutter, W. (1980); Guaidi, R. et al. (1996); Zaret, K. (2000); Deutsh, G. et al. (2001); およびZaret, K. (1996))。したがって発生の観点から、これら2つの器官の上皮細胞は、共通の幹細胞を持ち得ることは可能である。新たな研究は、肝臓および膵臓の双方を形成することになる胚の内胚葉中に、二分化能の細胞集団が存在することを示している。膵臓細胞原基または肝臓細胞原基のいずれに適用させるかのこれらの細胞による決定は、発生する心臓にそれらの細胞が近位かどうかにより決定される(Deutsch, G. et al. (2001))。腹側内胚葉の発生プログラムのデフォルトは、腹側膵臓になることである。証拠のいくつかの傾向は、膵臓幹細胞の肝臓細胞に分化する能力を証明した。例えば銅の枯渇および過多は、膵臓外分泌腺の萎縮をきたし、膵管内に卵円形細胞が出現し、その卵円形細胞が膵臓内での肝細胞に分化する(Rao, M. et al. (1986) Cell Differ. 18: 109-117; Rao, M. et al. (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 156: 131-136; およびReddy, J. et al. (1991) Dig. Dis. Sci. 36(4): 502-509)。肝臓幹細胞と同一の免疫表現型をもつ卵円形細胞はまた、急性膵炎、慢性膵炎および膵島細胞症(pesidioblastosis)のヒトの膵臓内でも発見された(Mikami, Y. et al. (1998) Hepatology 28(4), Pt. 4: 417A)。膵臓の肝細胞は発癌性物質に対して肝臓の肝細胞と類似した形で反応する(Rao, M. et al. (1991) Am. J. Pathol. 139(5): 1111-1117)。肝臓内への移植後、銅欠乏ラット膵臓から単離された膵臓卵円形細胞は、肝臓柔組織に構造的に組み込まれた成熟肝細胞に分化し、肝細胞固有の生化学的機能を発現することができる(Dabeva, J. et al. (1997) PNAS 94: 7356-61)。ごく最近Wangらは、正常な成体マウスの膵臓内に肝細胞の未分化の前駆細胞があることを示した(Wang, X. et al. (2001))Am. J. Pathol. 158: 571-79)。膵臓細胞はまた、in vitroでデキサメタゾン処理により肝細胞に転換させることができる(Shen, C-N. et al. (2000) Nature Cell Biol. 2: 879-887)。初期の事象は転写因子C/EBP−βの活性化を伴う。C/EBP−βでの細胞のトランスフェクションは肝臓の分化を引き起こす。したがってC/EBP−βは、肝臓および膵臓の分化のプログラムを区別する鍵となる成分であることが示唆される。インスリンプロモーターにより誘発されるKGFを過剰発現するトランスジェニックマウスにおける膵臓の肝細胞の持続的な発生は、分化転換過程におけるKGFの関与を示唆する(Krakowski, M. et al. (1999) Am. J. Pthol. 154(3): 683-91)。内分泌細胞特異的ではないが、膵臓上皮細胞を産生する肝臓の能力についての報告もある(Rao, M. et al. (1986) Histochem. Cytochem. 34: 197-201; およびBisgaard, H. et al. (1991) J. Cell Physiol. 147(2): 333-343)。さらにPdx1をコードする遺伝子を保有する組換えアデノウイルスで形質導入された肝臓は、機能的なインスリンを産生することができ、マウスのストレプトゾトシン誘発糖尿病を改善する;しかしPdx1は、in vitroでは肝臓の肝細胞をインスリン産生細胞に分化転換しないことが報告されており、マウス肝臓の幹細胞または前駆細胞がin vivo (またはin vitro)でPdx1コンストラクトでトランスフェクトするという証拠は提供されていない(Ferber, S. et al. (2000) Nature Med. 6(5): 568-571)。最後に、転写因子、例えばIsl1、ngn3、NeuroD/β2、Pax4、pax6およびNkx2.2が内分泌および神経への分化経路で共有されていることが確認された(Ahlgren, U. et al. (1997); Sander, M. et al. (1997); Sosa-Pineda, B. et al. (1997); Pfaff, S. et al. (1996) Cell 84: 309-320; Lee, J. et al. (1995) Science 268: 836-844; Naya, F. et al. (1997) Genes Dev. 11: 2323-2334; Miyata, T. et al. (1999) Genes Dev. 13: 1647-52; St-Onge, L. et al. (1997) Nature 387: 406-409; Ericson, J. et al. (1997) J. Cell 90: 169-180; Sussel, L. et al. (1998) Dev. 125: 2213-2221; Briscoe, J. et al. (1999) Nature 398: 622-627)が、転写因子を肝臓と膵臓との間で共有することに関する明確な情報はない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【0011】
(発明の概要)
本発明は肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞を、ホルモン、成長因子、ビタミンおよび化学物質と組み合わせて培養して、肝臓の幹細胞または前駆細胞を膵臓機能細胞に転換させる方法を含む。本発明はさらに肝臓の幹細胞または前駆細胞の膵臓機能細胞への転換のためのトランスフェクションの方法を含む。
【0012】
したがって本発明は、肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞を膵臓発生遺伝子でトランスフェクトすることにより、肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞を膵臓機能細胞に転換させる方法を提供する。あるいは肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞は、同細胞を膵臓機能細胞に転換させる条件下で培養することができる。さらに転換は、トランスフェクションおよび培養条件の双方により達成する、すなわち同時にまたはいずれかの順で連続して行うことができる。
【0013】
肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞は、肝芽細胞または肝臓卵円形細胞とすることができる。肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞は少なくとも1つの造血マーカーおよび/または少なくとも1つの肝臓卵円形細胞または肝芽細胞のマーカーを発現することが好ましい。造血マーカーはCD34、Thy1.1、およびCD45を含む。肝臓の肝芽細胞または卵円形細胞のマーカーは、α−胎児タンパク質、アルブミン、サイトケラチン14(CK14)、c−kit、OC.2、OC.3、OC.10、OV1およびOV6を含む。
【0014】
膵臓発生遺伝子は、肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞を膵臓機能細胞に転換させることのできるあらゆる遺伝子であり、Pdx1、Hlxb9、Isl1、ngn3、Nkx2.2、Pax6、NeuroD/β2、Nkx6.1およびPdx4を含む。好ましくは膵臓発生遺伝子はPdx−1である。
【0015】
肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞を膵臓機能細胞に転換させる培養条件は、基本培地に加えて膵臓細胞への分化を誘導するホルモン、成長因子、ビタミンおよび化学物質、またはそれらのあらゆる組み合わせとする付加的な因子を含む。このようなホルモンは、デキサメタゾン、グルカゴン様ペプチド−1(GLP−1)、およびエキセンディン−4を含み;成長因子はガストリン、インターフェロン−γ(IFNγ)、肝細胞成長因子(HGF)、表皮成長因子(EGF)、β−セルリン、アクチビン−A、ケラチノサイト成長因子(KGF)、繊維芽細胞成長因子(FGF)、トランスフォーミング成長因子−α(TGF−α)、トランスフォーミング成長因子−β(TGF−β)、神経成長因子(NGF)、インスリン様成長因子類(IGFs)、膵島新生に関連するタンパク質(INGAP)、および血管内皮成長因子(VEGF)を含み;ビタミンはニコチンアミドおよびレチノイン酸を含み;そして化学物質は酪酸ナトリウムを含む。
【0016】
この方法により転換された肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞は、インスリンI(InsI)、インスリンII(InsII)、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓のポリペプチド(PP)、アミラーゼ、エラスターゼ、グルコーストランスポーター2(GLUT2)、グルコキナーゼ、PC1、PC2、PC3、カルボキシペプチダーゼE(CPE)、Pdx1、Hlxb9、Isl1、ngn3、Nkx2.2、Pax6、NeuroD/β2、Nkx6.1およびPdx4を含む、多数の膵臓のメッセンジャーRNAのあらゆる組み合わせを発現することができる。同様に転換された細胞は、InsI、InsII、グルカゴン、ソマトスタチン、PP、アミラーゼ、エラスターゼ、GLUT2、グルコキナーゼ、PC1、PC2、PC3、CPE、Pdx1、Hlxb9、Isl1、ngn3、Nkx2.2、Pax6、NeuroD/β2、Nkx6.1およびPdx4を含む、多数の膵臓のタンパク質のあらゆる組み合わせを発現することができる。
【0017】
好ましくは転換された肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞は、膵臓の内分泌系列に分化する。このような転換された細胞を培養して、内分泌ホルモン(例えばβ、αおよびγ細胞由来のインスリン、グルカゴンおよびソマトスタチン)を産生することができる。
【0018】
膵臓の発生遺伝子でのトランスフェクションによる、または培養条件による転換の方法により、膵島産生幹細胞(IPSC)、膵島前駆細胞(IPC)および膵島様構造体もしくはIPC由来の膵島(IdI)、またはそれらの細胞成分(α、β、γおよび/またはPP細胞)を含む、分化の異なる段階の膵臓細胞を得ることができる。分化転換はまた、膵臓細胞の発現パターンを明らかに示し(例えばインスリン産生)、そしてまた肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞の特徴も保持し得る(例えば肝臓の幹細胞または前駆細胞のマーカー)細胞を得ることができる。肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞のマーカーは、造血マーカーおよび肝臓卵円形細胞もしくは肝芽細胞のマーカーを含む。
【0019】
当明細書に引用したすべての参考文献を、その全内容において参照として援用する。
(発明の詳細な説明)
本発明のさらなる理解を促進するため、以下の定義を提供する。
【0020】
“膵島産生幹細胞”(IPSC)は、in vitro およびin vivoで膵管上皮からまたは膵管上皮の間で発生する幹細胞をいう。IPSCを得て、維持する方法は、2000年9月27日に出願されたPCT/US00/26469に詳細に記載されており、同文献をその全内容において当明細書に参照として援用する。
【0021】
“膵島前駆細胞”(IPC)は、当明細書およびPCT/US00/26469に記載の方法を用いてin vitroで培養されたIPSCから発生する膵臓前駆細胞をいう。
“IPC由来の膵島”(IdI)は、当明細書およびPCT/US00/26469に記載の方法を用いてin vitroで培養されたIPCから発生する膵島様構造体をいう。
【0022】
“肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞”は、非限定的に肝芽細胞、卵円形細胞、幹細胞様特性を有する肝臓上皮細胞、ならびに未分化の肝細胞および胆管細胞を含む、すべての肝臓の幹細胞および/または前駆細胞をいう。多くの肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞株が文献に報告されている(Williams, G. et al. (1971) Exp. Cell Res. 69: 106-112; Williams, G. et al. (1973) 29: 293-303; Grisham, J. (1980) Ann. N.Y. Acad. Sci. 349: 128-137; Tsao, M-S. et al. (1984) Exp. Cell Res. 154: 38-52; Coleman, W. et al. (1997) Am. J. Pathol. 151: 353-359; Coleman, W. et al. (1993) Am. J. Pathol. 142: 1372-82; McCullough, K. et al. (1994) Cancer Res. 54: 3668-71; Amicone, L. et al. (1997) EMBO J. 16: 495-503; Spagnoli, F. et al. (1998) J. Cell Biol. 143: 1101-1112; Sell, S. et al. (1982) Hepatol. 2: 77-86; Shinozuka, H. et al. (1978) Cancer Res. 38: 1092-98; McMahon, J. et al. (1986) Cancer Res. 46: 4665-71; Brill, S. et al. (1999) Digest. Dis. Sci. 44: 364-71; およびRogler, L. (1977) Am. J. Pathol. 150: 591-602)が、好ましくは当該方法で使用する肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞は、例えばYin, L. et al. (2001A), Yin, L. et al. (2001B)およびYin, L. et al. (2002)に記載されているように、発癌性物質の関与のない肝臓傷害モデルから得る。肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞は、1つまたはそれ以上の肝臓卵円形細胞または肝芽細胞のマーカー(α−胎児タンパク質、アルブミン、サイトケラチン14(CK14)、c−kit、OC.2、OC.3、OC.10、OV1およびOV6)、および/または1つまたはそれ以上の造血幹細胞マーカー(CD34、Thy1.1およびCD45)を発現することもまた好ましい。
【0023】
“膵臓内分泌系”は、発生が膵臓内分泌細胞に方向付けられていることをいう。
“膵臓系”は、発生が内分泌細胞、外分泌細胞および/または管細胞を含む膵臓細胞に方向付けられていることをいう。
【0024】
“膵臓機能細胞”は、膵臓系の細胞、または当明細書に記載の方法により分化転換もしくは転換された細胞をいい、これらの細胞は、膵臓細胞に特徴的および特異的なmRNAまたはタンパク質(例えばインスリン)を発現し、そしてまた肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞の特徴(すなわち肝臓の肝細胞または前駆細胞のマーカー)を保持することもできる。膵臓機能細胞は好ましくはグルコース応答性のインスリン産生細胞である。この機能細胞は好ましくはグルコース刺激に応答してインスリンタンパク質を産生、分泌する。この応答は好ましくは、目的の哺乳類種のインスリン応答の正常範囲内である。このような正常範囲は当該技術分野で公知であり、容易に決定できる。
【0025】
“トランスフェクション”は、コードする配列を含む核酸のフラグメントまたはコンストラクトを標的細胞(ここでは肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞)内に導入して標的細胞内でコードする配列を発現させるに至ることのできる、当該技術分野に公知のあらゆる方法をいう。標的細胞内での発現のための必要なプロモーター配列および制御配列は、フラグメントまたはコンストラクトに含まれるものとする。
【0026】
このように本発明は、肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞を膵臓発生遺伝子でトランスフェクトすることにより、および/または膵臓機能細胞への分化を誘導する因子を含む倍地中で、前記の肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞を培養することにより、肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞を膵臓機能細胞に転換させる方法を含む。得られる膵臓機能細胞は、膵臓内分泌系の細胞とすることができる、または肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞と膵臓系の細胞との間の中間的な発現パターンを有する細胞とすることができる。“膵臓系の細胞”という用語は、膵島産生幹細胞(IPSC)、膵島前駆細胞(IPC)、膵島様構造体もしくはIPC由来の膵島(IdI)、または天然に由来する膵臓内分泌細胞(例えばα、βおよび/もしくはδ細胞、または管細胞)を意味する。加えて、中間的発現パターンを有する細胞は、グルコースの刺激に応答してインスリンタンパク質を産生、分泌する細胞であり、そしてこの細胞は肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞のマーカーを発現することができる。
【0027】
肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞は、肝芽細胞および/または肝臓卵円形細胞とすることができる。肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞は、少なくとも1つの造血マーカーおよび/または少なくとも1つの肝臓卵円形細胞もしくは肝芽細胞のマーカーを発現する。造血マーカーはCD34、Thy1.1、および/またはCD45である。肝芽細胞または卵円形細胞のマーカーは、α−胎児タンパク質、アルブミン、サイトケラチン14(CK14)、c−kit、OC.2、OC.3、OC.10、OV1およびOV6である。
【0028】
トランスフェクションの態様において、膵臓発生遺伝子は、Pdx1、Hlxb9、Isl1、ngn3、Nkx2.2、Pax6、NeuroD/β2、Nkx6.1および/またはPdx4とすることができる。好ましくは膵臓発生遺伝子はPdx−1である。
【0029】
培養による分化転換の態様において、肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞を当該技術分野に公知の方法で、標準的な培地に因子を加えて培養する。この因子は、デキサメタゾン、グルカゴン様ペプチド−1(GLP−1)、エキセンディン−4、ガストリン、インターフェロン−γ(IFNγ)、肝細胞成長因子(HGF)、表皮成長因子(EGF)、β−セルリン、アクチビン−A、ケラチノサイト成長因子(KGF)、繊維芽細胞成長因子(FGF)、トランスフォーミング成長因子−α(TGF−α)、トランスフォーミング成長因子−β(TGF−β)、神経成長因子(NGF)、インスリン様成長因子類(IGFs)、膵島新生に関連するタンパク質(INGAP)、および血管内皮成長因子(VEGF)、ニコチンアミド、レチノイン酸、酪酸ナトリウム、またはそれらのあらゆる組み合わせを含む。
【0030】
転換された細胞は、インスリンI(InsI)、インスリンII(INsII)、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓のポリペプチド(PP)、アミラーゼ、エラスターゼ、グルコーストランスポーター2(GLUT2)、グルコキナーゼ、PC1、PC2、PC3、カルボキシペプチダーゼE(CPE)、Pdx1、Hlxb9、Isl1、ngn3、Nkx2.2、Pax6、NeuroD/β2、Nkx6.1および/またはPdx4を含む多数の膵臓のメッセージのいずれかを発現することができる。したがって転換された細胞は、InsI、InsII、グルカゴン、ソマトスタチン、PP、アミラーゼ、エラスターゼ、GLUT2、グルコキナーゼ、PC1、PC2、PC3、CPE、Pdx1、Hlxb9、Isl1、ngn3、Nkx2.2、Pax6、NeuroD/β2、Nkx6.1およびPdx4を含む複数の膵臓のタンパク質を発現することができる。しかし、転換された細胞はグルコース刺激に応答してインスリンタンパク質を産生、分泌することが好ましい。反応は好ましくは目的の哺乳類の細胞の正常範囲内である。
【0031】
本発明はまた当明細書に記載の方法により産生される膵臓機能細胞を含み、この場合膵臓機能細胞は、肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞および膵臓系の細胞との間の中間的な発現パターンを有する。1つの態様において、膵臓機能細胞はPdx1、アミラーゼおよびインスリンIIを発現する。
【0032】
本発明はさらに、当明細書に記載したように肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞を膵臓細胞に転換させ、当該技術分野に公知の方法を用いて該膵臓機能細胞を培養し、そして当該技術分野に公知の方法を用いて細胞培養物から内分泌ホルモンを回収することを含む、内分泌ホルモンを産生する方法を含む。
【実施例】
【0033】
(実施例)
実施例1−肝臓幹細胞 / 肝臓前駆細胞
肝臓幹細胞特性をもつ肝臓上皮細胞株を、Yin, L. et al. (2001A); Yin, L. et al. (2001B);およびYin, L. et al. (2002)に記載されているようにアリルアルコール(AA)により傷害された成体ラット肝臓から発生させた。 AAは門脈周囲の肝臓の傷害を誘発する、したがって肝臓発癌物質の関与のない肝臓傷害モデルである(Peterson B.E. et al. (1998) Hepatology 27(4): 1030-38)。1(1)#3、1(1)#6、1(3)#3、2(11)および3(8)#21と命名された5つの細胞株を選択し、それらの膵臓系の細胞への分化の可能性を調べた。これら5株は、様々な肝臓発生マーカー、細胞系譜マーカーおよび造血幹細胞マーカーについて、ウェスタンブロット、ノーザンブロット、免疫細胞化学および組織化学により十分に特徴付けられている。結果を図1にまとめる。細胞株3(8)#21の免疫細胞化学の結果の写真も、図1に示す。興味深いことにこれらの細胞株のほとんどすべてが造血幹細胞とのこれらの関連の可能性を示す、造血幹細胞マーカーCD34,Thy1.1およびCD45を発現している。これらは肝臓前駆細胞遺伝子、例えばα−胎児タンパク質(AFP)、アルブミン、サイトケラチン14(CK14)およびc−kitもまた発現している。これらはIto細胞マーカーのデスミンまたはクッパー細胞/マクロファージのマーカー、ED1およびED2は発現しない(結果は示していない)。これらの細胞は成熟肝細胞の特異的遺伝子、例えばグルコース−6−ホスファターゼ(G−6−Pase)、ジペプチジルペプチダーゼIV(DPP IV)、およびシトクロムP450(CYP450)を発現しない、そして成熟胆管細胞の特異的遺伝子CK19の発現を示さない、未分化の状態で維持することができる(結果は示していない)。5株はすべてフローサイトメトリーにより二倍体であることが確認されている。細胞株3(8)#21で行われた分化の誘導は、STO繊維芽細胞のフィーダーレイヤーを使用せずに長期間培養することにより、肝細胞表現型を誘導できることを示す(図2A、B)。塩基性FGFは分化を増大させることができる(図2C)。マトリゲル上での細胞の培養は肝臓の胆管の表現型を誘導する(図2D、E)。これらの結果は、肝細胞または肝臓の胆管細胞に分化する、細胞株3(8)#21の二分化能を示唆している。
【0034】
実施例2−肝臓前駆細胞株における、膵臓発生および細胞系譜の特異的遺伝子の発現
これら5つの(未処理)肝臓前駆細胞株を、インスリンIおよびインスリンII、膵臓外分泌マーカーのアミラーゼ、GLUT2(グルコーストランスポーター)、および膵臓の発生に深く関与する一部の転写因子、例えばPdx1、Isl1、NeuroD/β2、Nkx6.1およびPdx4を含む、選択された膵臓内分泌マーカーの発現について分析した。これらの遺伝子の発現はRT−PCRにより決定し、サザンブロットにより確認した。データは図3に示した。ラットの膵臓組織は、インスリンI、インスリンII、アミラーゼ、GLUT2、Pdx1、Isl1およびNkx6.1を含む検査したマーカーのほとんどを発現するが、NeuroD/β2およびPdx4は発現しない(図3;レーン1)。
ガンマ照射したSTOフィーダー細胞はこれらのマーカーのいずれも発現しない(図3;レーン2)。肝臓前駆細胞株1(1)#3(図3;レーン3)および3(8)#21(図3;レーン7)は検査したほとんどすべての膵臓転写因子、そしてインスリンIおよびインスリンIIさえも発現するが、アミラーゼ、Pdx1およびGLUT2は検出可能なレベルでは発現しない(図3;レーン3および7)。細胞株1(1)#6は、INSIおよびIIならびにNeuroD/β2についてはポジティブである(図3;レーン4)。細胞株2(11)はNeuroD/β2、Nkx6.1およびPdx4についてはポジティブであるが、他のすべてのマーカーにはネガティブである(図3;レーン6)。細胞株1(1)#3はNeuroD/β2についてのみポジティブである(図3;レーン5)。これらのデータは、検査した5つの肝臓前駆細胞株の少なくとも2つ(1(1)#3および3(8)#21)が、膵島に分化させる因子による何らかの処置前でさえも、これらの膵臓系列に入る “準備ができていること”を発現していることを示す。
【0035】
さらにそしてポジティブコントロールとして、膵臓分化経路に肝臓幹細胞を方向付ける目的で、膵臓決定転写因子であるPdx1をこれらの各肝臓前駆細胞株にトランスフェクトした。図4に示したようにPdx1遺伝子の導入はアミラーゼ遺伝子発現の引き金となる(図4;レーン3、5、7、9、11)が、トランスフェクトしなかった親株では発現していない(図4;レーン2、4、6、8、10)。興味深いことにインスリンIIを発現する細胞株1(1)#3および3(8)#21は、Pdx1遺伝子によるトランスフェクション後、インスリンIIの発現低下を示す(図4;レーン2、3、10、11)が、一方トランスフェクション前にこの遺伝子を発現しなかった細胞株ではインスリンIIの誘発がみとめられた(図4;レーン4、5、6、7)。
【0036】
実施例3−肝臓幹細胞 / 肝臓前駆細胞の分化能を決定するための、異なる実験条件下での同細胞における発現の特徴づけ
当明細書で述べた肝臓前駆細胞株を、異なる段階で膵臓の発生をコントロールする遺伝子(Pdx1、Hlxb9、Isl1、ngn3、Nkx2.2、Pax6、NeuroD/β2、Nkx6.1およびPdx4)、内分泌細胞系譜マーカー(インスリンI、インスリンII、グルカゴン、ソマトスタチンおよびPP)、外分泌マーカー(アミラーゼおよびエラスターゼ)、ならびにインスリンの感知(sensing)、合成、過程(process)および分泌に関与する遺伝子(GLUT−2、グルコキナーゼ、PC1、PC2、PC3およびカルボキシペプチダーゼE(CPE))の発現について検討する。各細胞株を、未処理および処理の条件下での発現について評価する。処理する細胞株は膵臓の幹細胞または前駆細胞の分化を高めることが知られている培養条件下で増殖させる、および/または膵臓発生遺伝子でトランスフェクトするものとする。
【0037】
RT−PCR、サザンブロット、免疫細胞化学、およびウェスタンブロットの技術を用いて、mRNAの発現(すべての遺伝子)およびタンパク質レベル(例えばPdx1およびホルモン)の双方で遺伝子の発現を決定する。正常な膵臓組織、初期肝細胞、およびSTOフィーダー細胞をコントロールとする。処理細胞株の特徴付けを行い、未処理株と比較する。肝臓幹細胞マーカー(AFP、アルブミン、CK14、c−kit、OV6、OV1)および造血幹細胞/前駆細胞マーカー(CD34、Thy1.1、CD45)の発現についても処理細胞株で分析し、それらの肝臓幹細胞の表現型が処理後に失われているかどうかを調べる。
【0038】
プラスミド、例えばPdx1遺伝子およびNeo遺伝子を保有するプラスミドpBKCMV/Stf1(Pdx1)(Dr. Dutta, Hoffmann-La Roche, Inc. Nutley, NJ より供与)を使用して、肝臓細胞株をトランスフェクトした。Pdx1でトランスフェクトした細胞は、インスリン産生細胞への分化に関するポジティブコントロールとして使用することができる。
【0039】
RT−PCR / サザンブロット
DNAを含まないRNAは、StrataPrep(登録商標)Total RNA Miniprep Kit(Stratagene, La Jolla, CA)またはRNAqueous(登録商標)-4PCR Kit(Ambion, Austin, TX)を用いて、製品のプロトコルに従って抽出する。RT−PCRは当該技術分野で公知の方法に従って行う。PCRのアンプライマー(amplimer)として使用するオリゴヌクレオチドを表1に列記する。PCRサイクルは、95℃で3分間、続いて94℃で45秒間、各プライマーペアに対応する至適アニーリング温度で45秒間、72℃で1分間(34サイクル)そして72℃で10分間とする。PCR産生物はBioRad/RAC300 power supplyを用いて100ボルトで80分間、TBEバッファー中の1.5% Seakem アガロースゲルに流す。ゲルをTBEバッファー中の1% 臭化エチジウム溶液中で15から30分間インキュベーションした後、UV光で可視化する。画像を撮影し、AlphaImage(登録商標)2200 Documentation & Analysis system (Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA)を用いて処理する。サザンブロッティング用のオリゴプローブのジゴキシゲニン標識は、Dig Oligonucleotide Tailing Kit (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN)を用いて、製品のプロトコルに従って行う。確認のための技術として、サザンブロッティングをPCR反応後に標準的なプロトコルを用いて行う。
【0040】
【表2】
【0041】
免疫細胞化学
Biogenex (San Ramon, CA)から導入したアビジン−ビオチン法を次に行う。細胞は細胞遠心機(Cytopro(登録商標), Wescor, Inc. Logan, UT)を用いてFisher Brand superfrost pulus slide (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)上にサイトスピンさせる(cytospun)か、または組織培養プレート(Falcon(登録商標),Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)に設置した8ウェルガラススライド(ICN Costa Mesa, California)上で増殖させるかのいずれかとし、0.5% グルタルアルデヒド中で1時間、室温で固定する。細胞内染色のため、細胞を0.2%Triton-X を用いて透過処理する。ブロッキングおよび抗原回復(必要な場合)は細胞の第1抗体染色前に行う。アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼに連結させたビオチンと第2抗体を複合させ;ストレプトアビジン(ビオチンと結合する)を、アルカリホスファターゼまたはぺルオキシダーゼに連結させる。次に3,3’−ジアミノベンジジン(DAB)、3−アミノ−9−エチルカルボゾール(AEC)、Fast Red、または5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルホスフェート/ニトロブルーテトラゾリウム(BCIP/NBT)を用いて抗体を視覚化する。このシステムはまた、複数の抗原の発現を視覚化できる二重染色法として使用することもできる。
【0042】
ウェスタンブロット
ウェスタンブロットもまた遺伝子の翻訳の研究に使用する。細胞を溶菌バッファー(8.0mlに対して:3.8mlのdH2O、1mlの0.5M Tris−HCl(pH6.8)、0.8mlのグリセロール、1.6mlの10%(w/v)SDS、および0.4mlのβ−メルカプトエタノール、および0.4mlの0.5% ブロモフェノールブルー)中で溶菌させる。
【0043】
【表3】
【0044】
組織を氷上でホモジェネート用バッファー(20mM Tris、137mM NaCl、10% グリセロール、1mM Na3VO4、1u/ml アプロチニン、1mM 4−(2−アミノエチル)ベンゼンスルホニルフルオリド(AEBSF)、pH8.0)中でホモジェネートし、9,000gで20分間、4℃で遠心し、上清を集める。タンパク質濃度をCoomassie Plus Protein Assay Reagent(クーマシープラスタンパク質アッセイ試薬)(PIERCE, Rockford, Illinois)を用いて決定する。次にサンプルを適当な濃度で分離用ゲルに100V,4ワット、および50mAで2時間流す。次にゲルを、Mini Trans-Blot Cell(Bio-Rad, Hercules, CA)を用いて、移行用バッファー(25mM Tris、192mM グリシンおよび20%v/v メタノール、pH8.3)中で30ボルト、2ワット、および50mA、オーバーナイトで、ニトロセルロース膜(Bio-Rad)に移行させる。その後膜を各プライマリー抗体中で4℃、オーバーナイトでブロットする。その後、膜を洗浄し、アルカリホスファターゼと連結させた対応する2次抗体と共に、1時間室温でインキュベーションし、適当な発色が得られるまで、60μlのニトロブルーテトラゾリウム(NBT)溶液(50mgのNBTを0.3ml dH2Oを含む0.7mlのN,N−ジメチルホルムアミド(DMF)に溶かす)、および60μlの5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルホスフェート(BCIP)溶液(50mgのBCIPを1mlの100%DMFに溶かす)を含む炭酸バッファー(0.1M NaHCO3、1mM MgCl2、pH9.8)中で、発色させる。
【0045】
肝臓幹細胞の分化
肝臓幹細胞を、ホルモン(デキサメタゾン、GLP−1、エキセンディン−4)、成長因子(ガストリン、インターフェロン−γ(IGFγ)、HGF、EGF、β−セルリン、アクチビン−A、KGF、FGF、TGF−αおよび−β、NGF、IGFs、INGAP、およびVEGF)、ビタミン(ニコチンアミドおよびレチノイン酸)、および/または化学物質(酪酸ナトリウム)を組み合わせたものを表4に列記した濃度で含む基本培地(BM)中で培養する。表4に示した濃度はそれらの有効性を至適化するように濃度を1−3桁変動させてもよい。上述のホルモン、成長因子、ビタミンおよび化学物質は膵臓/β細胞の発生に関与することが、文献または2002年3月29日に出願されたPCT特許出願第PCT/US02/09881号に報告されている。処理細胞株において、肝臓幹細胞マーカーおよび造血幹細胞マーカーの発現についても観察し、処理後に肝臓幹細胞表現型が失われているかどうかを決定する。
【0046】
トランスフェクションおよび選択
FuGENE6トランスフェクション試薬(Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN)を用いてPdx1遺伝子およびNeogeneを保有するpBKCMV/Stf1(Pdx1)を、製品のプロトコルにより肝臓幹細胞にトランスフェクトする。Mockトランスフェクションおよびベクターのみのトランスフェクションもまた同時に行う。遺伝子のトランスフェクションの3日後、細胞を1mg/mlのG418を含む培養用培地で培養する。耐性クローンは約10日で認められる。2から4週間の間に選択を行う。その後、細胞を0.3mg/mlのG418を含む培養用培地で培養する。
類似のトランスフェクションも他の膵臓発生遺伝子を含むプラスミドで行うことができる。
【0047】
実施例4−ラット肝臓幹細胞 / 肝臓前駆細胞由来のインスリン産生細胞(LSDIPC)機能の能力の決定
インスリンを産生することが発見された実施例3の細胞株(LSDIPC)を、さらにそのグルコースへの応答性について評価する。細胞は細胞外および細胞内双方のインスリン産生について検査する。細胞株がグルコース応答性のインスリン産生を示す場合は、次に基質のリン酸化パターンをグルコースの刺激後に決定することができる。新たに単離されたラット膵島細胞をポジティブコントロールとする。基質のリン酸化パターンの観察により、インスリン産生の誘導に関与する早期のシグナル応答を明らかにする。
【0048】
グルコースに誘発されるインスリンの刺激のアッセイ
分化させたLSDIPCを5.5mM グルコースを含む1mlの培地を入れた24ウェルプレートで、各ウェル当たり2x105個の細胞の濃度で植え付け、24時間寝かせる。細胞をKrebs-Ringerバッファー(KRB)で洗浄し、グルコースを含むまたは含まない(0、5.5、11および17.5mMグルコース)培養用培地1mlで3−18時間刺激する。細胞を含まない上清を集め使用するまで−70℃で保存する。次に細胞を溶菌バッファーで処理して、Mercodia Ultrasensitive Rat Insulin ELISA Enzyme イムノアッセイキット(Mercodia, Uppsala, Sweden)を用いてインスリン含有量を決定する。このインスリンキットを使用して、BioRad's Benchmark プレートリーダー(490nm)を用いて分泌されたインスリンおよび細胞内のインスリン双方を測定する。インスリンの値は細胞の(Trizol (登録商標),Gibcoを用いて抽出された)総DNA濃度に対して標準化する。
【0049】
ホルモン検出のためのELISA
上述のように、分泌されたインスリンおよび細胞内のインスリンを、Mercodia Ultrasensitive Rat Insulin ELISA Enzyme イムノアッセイキット(Mercodia, Uppsala, Sweden)を用いて製品のプロトコルに従って測定する。同様にグルカゴンアッセイを当該技術分野に公知の方法、またはそれを適応させた方法で行う。
【0050】
基質のリン酸化のアッセイ
分化させたLSDIPCを17.5mM グルコースで0、5、15および30分間刺激した後、抽出バッファー(20mmol/l K2HPO4、pH7.5、5mmol/l DTT、1mmol/l EDTA、および110mmol/l KCL)中でホモジェネートする。ホモジェネート液を用いて、10%SDS−PAGE(BioRad)上でタンパク質を分離し、リン酸化されたタンパク質基質を抗ホスホチロシン抗体(Pharmingen, San Diego, CA)を用いてウェスタンブロット法で検出する。
【0051】
当明細書に述べた実施例および態様は説明のみを目的としており、その観点において様々な修飾または変更を当業者に示唆しており、そしてそれらは本出願の精神および範囲ならびに付記した請求項の範疇内に含まれるものとすることは、理解されるべきであろう。
【図面の簡単な説明】
【0052】
【図1】図1はアリルアルコールに傷害されたラット肝臓由来の5つの肝臓上皮細胞株の特徴を示す。記号の意味は:−ネガティブ、+/−わずかにポジティブ、+ポジティブ、++非常にポジティブである。
【図2】図2は、幹細胞様細胞および胆管様細胞に分化する、肝臓上皮細胞株3(8)#21の二分化能を示す。A:フィーダーを使用せずに培養した3(8)#21は成熟肝細胞マーカーH4にポジティブである。B:6日目、フィーダーを使用せずに培養した3(8)#21は12日目で成熟肝細胞マーカーCYPIAIIにポジティブである。C:フィーダーを使用しないがbFGFを使用して培養した3(8)#21;6日目でH4によりポジティブな細胞が観察された。D:フィーダーを使用せずマトリゲル上で培養した3(8)#21は4日目で管状構造を形成する。E:フィーダーを使用せずにマトリゲル上で培養した3(8)#21は13日目で成熟胆管細胞マーカーBD1を強発現する。パネルA、B、C、およびEの倍率は400xである。パネルDの倍率は200xである(Yin, L. et al. (2001A); Yin, L. et al. (2001B);およびYin, L. et al. (2002))。
【図3】図3は5つの肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞株における膵臓発生マーカーの発現を示す。
【図4】図4はPdx1遺伝子によるトランスフェクション後、肝臓前駆細胞株におけるインスリンIIおよびアミラーゼの発現を示す。
Claims (22)
- 肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞を膵臓機能細胞、ここで当該膵臓機能細胞はグルコースの刺激に応答してインスリンを産生し、そして分泌する、に転換させる方法であって、以下:
当該肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞を膵臓発生遺伝子でトランスフェクトすること、膵臓機能細胞への分化を誘導する因子を含む培地中で当該肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞を培養すること、またはその双方を含み、それにより前記のトランスフェクトした細胞を膵臓機能細胞に転換させる、前記方法。 - 膵臓機能細胞が膵臓内分泌系の細胞である、請求項1に記載の方法。
- 転換された細胞が、膵島産生幹細胞(IPSC)、膵島前駆細胞(IPC)、および膵島様構造体もしくはIPC由来の膵島(IdI)からなる群から選択される、請求項2に記載の方法。
- 膵臓機能細胞がさらに肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞のマーカーを発現する、請求項1に記載の方法。
- 肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞が、肝芽細胞または肝臓卵円形細胞からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞が、造血マーカーおよび肝臓卵円形細胞または肝芽細胞のマーカーからなる群から選択される少なくとも1つのマーカーを発現する、請求項1に記載の方法。
- 造血マーカーがCD34、Thy1.1、およびCD45からなる群から選択される、請求項6に記載の方法。
- 肝臓の肝芽細胞または卵円形細胞のマーカーが、α−胎児タンパク質、アルブミン、サイトケラチン14(CK14)、c−kit、OC.2、OC.3、OC.10、OV1およびOV6からなる群から選択される、請求項6に記載の方法。
- 膵臓発生遺伝子が、Pdx1、Hlxb9、Isl1、ngn3、Nkx2.2、Pax6、NeuroD/β2、Nkx6.1およびPdx4からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 膵臓発生遺伝子がPdx−1である、請求項9に記載の方法。
- 因子が、デキサメタゾン、グルカゴン様ペプチド−1(GLP−1)、エキセンディン−4、ガストリン、インターフェロン−γ(IFNγ)、肝細胞成長因子(HGF)、表皮成長因子(EGF)、β−セルリン、アクチビン−A、ケラチノサイト成長因子(KGF)、繊維芽細胞成長因子(FGF)、トランスフォーミング成長因子−α(TGF−α)、トランスフォーミング成長因子−β(TGF−β)、神経成長因子(NGF)、インスリン様成長因子類(IGFs)、膵島新生に関連するタンパク質(INGAP)、および血管内皮成長因子(VEGF)、ニコチンアミド、レチノイン酸、酪酸ナトリウム、およびそれらのあらゆる組み合わせ、からなる群から選択される請求項1に記載の方法。
- 転換された細胞が、インスリンI(InsI)、インスリンII(InsII)、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓のポリペプチド(PP)、アミラーゼ、エラスターゼ、グルコーストランスポーター2(GLUT2)、グルコキナーゼ、PC1、PC2、PC3、カルボキシペプチダーゼE(CPE)、Pdx1、Hlxb9、Isl1、ngn3、Nkx2.2、Pax6、NeuroD/β2、Nkx6.1およびPdx4からなる群から選択される膵臓のメッセージを発現する、請求項1に記載の方法。
- 転換された細胞が、InsI、InsII、グルカゴン、ソマトスタチン、PP、アミラーゼ、エラスターゼ、GLUT2、グルコキナーゼ、PC1、PC2、PC3、CPE、Pdx1、Hlxb9、Isl1、ngn3、Nkx2.2、Pax6、NeuroD/β2、Nkx6.1およびPdx4からなる群から選択される膵臓タンパク質を発現する、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法により産生される膵臓機能細胞。
- 細胞がさらにPdx1、アミラーゼおよびインスリンIIを発現する、請求項14に記載の膵臓機能細胞。
- 肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞を請求項1の方法により転換させることを含む内分泌ホルモンを産生させる方法であって:
前記の転換された細胞を培養すること;および
該細胞培養から内分泌ホルモンを回収すること;
をさらに含む前記方法。 - 膵臓発生遺伝子でトランスフェクトした肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞。
- 肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞が、肝芽細胞または肝臓卵円形細胞からなる群から選択される、請求項17に記載の方法。
- 膵臓発生遺伝子がPdx1、Hlxb9、Isl1、ngn3、Nkx2.2、Pax6、NeuroD/β2、Nkx6.1およびPdx4からなる群から選択される、請求項17に記載の肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞。
- 膵臓発生遺伝子がPdx1である、請求項19に記載の肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞。
- 膵臓機能細胞への分化を誘導する因子を含む倍地中で培養した肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞。
- 因子が、デキサメタゾン、グルカゴン様ペプチド−1(GLP−1)、エキセンディン−4、ガストリン、インターフェロン−γ(IFNγ)、肝細胞成長因子(HGF)、表皮成長因子(EGF)、β−セルリン、アクチビン−A、ケラチノサイト成長因子(KGF)、繊維芽細胞成長因子(FGF)、トランスフォーミング成長因子−α(TGF−α)、トランスフォーミング成長因子−β(TGF−β)、神経成長因子(NGF)、インスリン様成長因子類(IGFs)、膵島新生に関連するタンパク質(INGAP)、および血管内皮成長因子(VEGF)、ニコチンアミド、レチノイン酸、酪酸ナトリウム、およびそれらのあらゆる組み合わせ、からなる群から選択される請求項21に記載の肝臓幹細胞/肝臓前駆細胞。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US33744601P | 2001-10-18 | 2001-10-18 | |
PCT/US2002/033304 WO2003033697A1 (en) | 2001-10-18 | 2002-10-18 | Conversion of liver stem and progenitor cells to pancreatic functional cells |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2005506074A true JP2005506074A (ja) | 2005-03-03 |
Family
ID=23320562
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2003536424A Pending JP2005506074A (ja) | 2001-10-18 | 2002-10-18 | 肝臓の幹細胞および前駆細胞の膵臓機能細胞への転換 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20050053588A1 (ja) |
EP (1) | EP1444345A4 (ja) |
JP (1) | JP2005506074A (ja) |
CA (1) | CA2463914A1 (ja) |
WO (1) | WO2003033697A1 (ja) |
Cited By (26)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009520474A (ja) * | 2005-12-21 | 2009-05-28 | ユニヴァルシテ カソリック デ ルーバン | 単離肝幹細胞 |
JP2012533629A (ja) * | 2009-07-20 | 2012-12-27 | ヤンセン バイオテツク,インコーポレーテツド | ヒト胚性幹細胞の分化 |
US9181528B2 (en) | 2010-08-31 | 2015-11-10 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of pluripotent stem cells |
US9388387B2 (en) | 2008-10-31 | 2016-07-12 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
US9434920B2 (en) | 2012-03-07 | 2016-09-06 | Janssen Biotech, Inc. | Defined media for expansion and maintenance of pluripotent stem cells |
US9506036B2 (en) | 2010-08-31 | 2016-11-29 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
US9528090B2 (en) | 2010-08-31 | 2016-12-27 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
US9593305B2 (en) | 2008-06-30 | 2017-03-14 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of pluripotent stem cells |
US9593310B2 (en) | 2009-12-23 | 2017-03-14 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
US9752125B2 (en) | 2010-05-12 | 2017-09-05 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
US9752126B2 (en) | 2008-10-31 | 2017-09-05 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human pluripotent stem cells |
US9969973B2 (en) | 2008-11-20 | 2018-05-15 | Janssen Biotech, Inc. | Methods and compositions for cell attachment and cultivation on planar substrates |
US9969982B2 (en) | 2007-11-27 | 2018-05-15 | Lifescan, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
US9969981B2 (en) | 2010-03-01 | 2018-05-15 | Janssen Biotech, Inc. | Methods for purifying cells derived from pluripotent stem cells |
US9969972B2 (en) | 2008-11-20 | 2018-05-15 | Janssen Biotech, Inc. | Pluripotent stem cell culture on micro-carriers |
US10066210B2 (en) | 2012-06-08 | 2018-09-04 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endocrine cells |
US10066203B2 (en) | 2008-02-21 | 2018-09-04 | Janssen Biotech Inc. | Methods, surface modified plates and compositions for cell attachment, cultivation and detachment |
US10138465B2 (en) | 2012-12-31 | 2018-11-27 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endocrine cells using HB9 regulators |
US10316293B2 (en) | 2007-07-01 | 2019-06-11 | Janssen Biotech, Inc. | Methods for producing single pluripotent stem cells and differentiation thereof |
US10344264B2 (en) | 2012-12-31 | 2019-07-09 | Janssen Biotech, Inc. | Culturing of human embryonic stem cells at the air-liquid interface for differentiation into pancreatic endocrine cells |
US10358628B2 (en) | 2011-12-22 | 2019-07-23 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells into single hormonal insulin positive cells |
US10370644B2 (en) | 2012-12-31 | 2019-08-06 | Janssen Biotech, Inc. | Method for making human pluripotent suspension cultures and cells derived therefrom |
US10377989B2 (en) | 2012-12-31 | 2019-08-13 | Janssen Biotech, Inc. | Methods for suspension cultures of human pluripotent stem cells |
US10420803B2 (en) | 2016-04-14 | 2019-09-24 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of pluripotent stem cells to intestinal midgut endoderm cells |
US10456424B2 (en) | 2007-07-31 | 2019-10-29 | Janssen Biotech, Inc. | Pancreatic endocrine cells and methods thereof |
US10870832B2 (en) | 2014-05-16 | 2020-12-22 | Janssen Biotech, Inc. | Use of small molecules to enhance MAFA expression in pancreatic endocrine cells |
Families Citing this family (97)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040037818A1 (en) * | 1998-07-30 | 2004-02-26 | Brand Stephen J. | Treatment for diabetes |
US6774120B1 (en) | 1999-06-01 | 2004-08-10 | Sarah Ferber | Methods of inducing regulated pancreatic hormone production in non-pancreatic islet tissues |
US8778899B2 (en) | 1999-06-01 | 2014-07-15 | Sarah Ferber | Methods of inducing regulated pancreatic hormone production in non-pancreatic islet tissues |
US7202080B2 (en) * | 2001-03-29 | 2007-04-10 | Ixion Biotechnology, Inc. | Method for transdifferentiation of non-pancreatic stem cells to the pancreatic differentiation pathway |
US20050095708A1 (en) * | 2001-11-09 | 2005-05-05 | Pera Martin F. | Characterization and isolation of subsets of human embryonic stem cells (HES) and cells associated or derived therefrom |
AU2002359390A1 (en) * | 2001-11-09 | 2003-05-19 | Artecel Sciences, Inc. | Endocrine pancreas differentiation of adipose tissue-derived stromal cells and uses thereof |
US7662768B2 (en) * | 2002-01-11 | 2010-02-16 | Mcgill University | Transdifferentiation of pancreatic acinar cells |
US7029915B2 (en) * | 2002-02-22 | 2006-04-18 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Method for differentiating rat hepatic stem cells to insulin-producing cells |
GB0206357D0 (en) * | 2002-03-18 | 2002-05-01 | Univ Bath | Cells |
JP4136434B2 (ja) * | 2002-04-17 | 2008-08-20 | 進 清野 | インスリン産生細胞の誘導 |
US20060234373A1 (en) * | 2002-05-24 | 2006-10-19 | Alex Rabinovitch | Treatment for diabetes |
US20060122104A1 (en) * | 2002-05-28 | 2006-06-08 | Presnell Sharon C | Methods for in vitro expansion and transdifferentiation of human pancreatic acinar cells into insulin-producing cells |
US20030228287A1 (en) * | 2002-06-07 | 2003-12-11 | Regents Of The University Of California | Maintenance of islet cells |
WO2004011621A2 (en) * | 2002-07-29 | 2004-02-05 | Es Cell International Pte Ltd. | Multi-step method for the differentiation of insulin positive, glucose |
GB0300208D0 (en) * | 2003-01-06 | 2003-02-05 | Oxford Biomedica Ltd | Insulin producing cells |
WO2004087885A2 (en) * | 2003-03-27 | 2004-10-14 | Ixion Biotechnology, Inc. | Method for transdifferentiation of non-pancreatic stem cells to the pancreatic pathway |
JP2006525994A (ja) * | 2003-05-12 | 2006-11-16 | サラ ファーバー, | 非膵島組織における調節された膵ホルモンの産生を誘導する方法 |
US7875272B2 (en) * | 2003-06-27 | 2011-01-25 | Ethicon, Incorporated | Treatment of stroke and other acute neuraldegenerative disorders using postpartum derived cells |
US8491883B2 (en) * | 2003-06-27 | 2013-07-23 | Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc | Treatment of amyotrophic lateral sclerosis using umbilical derived cells |
US9592258B2 (en) | 2003-06-27 | 2017-03-14 | DePuy Synthes Products, Inc. | Treatment of neurological injury by administration of human umbilical cord tissue-derived cells |
US9572840B2 (en) | 2003-06-27 | 2017-02-21 | DePuy Synthes Products, Inc. | Regeneration and repair of neural tissue using postpartum-derived cells |
US8790637B2 (en) * | 2003-06-27 | 2014-07-29 | DePuy Synthes Products, LLC | Repair and regeneration of ocular tissue using postpartum-derived cells |
US8518390B2 (en) | 2003-06-27 | 2013-08-27 | Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc | Treatment of stroke and other acute neural degenerative disorders via intranasal administration of umbilical cord-derived cells |
ES2597837T3 (es) | 2003-06-27 | 2017-01-23 | DePuy Synthes Products, Inc. | Células posparto derivadas de tejido de la placenta, y métodos de fabricación y utilización de los mismos |
EP1668119A2 (en) * | 2003-09-15 | 2006-06-14 | Ramot at Tel Aviv University Ltd. | Insulin-producing bone marrow derived cells and methods of generating and using same |
CA2553303C (en) * | 2004-01-14 | 2014-06-10 | Novahep Ab | Human hepatic progenitor cells and methods of use thereof |
EP1706134A2 (en) * | 2004-01-20 | 2006-10-04 | DeveloGen Aktiengesellschaft | Use of protein products for preventing and treating pancreatic diseases and/or obestiy and/or metabolic syndrome |
US20080267928A1 (en) * | 2004-02-23 | 2008-10-30 | Lijun Yang | Compositions and Methods for Making Insulin-Producing Cells |
CN1950498A (zh) * | 2004-03-10 | 2007-04-18 | 加利福尼亚大学董事会 | 培养胚胎干细胞的组合物和方法 |
AU2005241008C1 (en) * | 2004-04-23 | 2010-11-04 | Bioe, Inc. | Multi-Lineage Progenitor Cells |
US7622108B2 (en) * | 2004-04-23 | 2009-11-24 | Bioe, Inc. | Multi-lineage progenitor cells |
US8017395B2 (en) | 2004-12-17 | 2011-09-13 | Lifescan, Inc. | Seeding cells on porous supports |
WO2006101548A2 (en) * | 2004-12-21 | 2006-09-28 | Ethicon, Inc. | Postpartum cells derived from umbilical cord tissue, and methods of making, culturing, and using the same |
US20060153815A1 (en) * | 2004-12-21 | 2006-07-13 | Agnieszka Seyda | Tissue engineering devices for the repair and regeneration of tissue |
US20060166361A1 (en) * | 2004-12-21 | 2006-07-27 | Agnieszka Seyda | Postpartum cells derived from placental tissue, and methods of making, culturing, and using the same |
JP5340599B2 (ja) | 2004-12-23 | 2013-11-13 | エシコン・インコーポレイテッド | 臍帯組織由来産褥細胞ならびにその製造方法および使用方法 |
WO2006071802A2 (en) | 2004-12-23 | 2006-07-06 | Ethicon Incorporated | Treatment of stroke and other acute neural degenerative disorders using postpartum derived cells |
WO2006126219A1 (en) * | 2005-05-26 | 2006-11-30 | Fresenius Medical Care Deutschland G.M.B.H. | Liver progenitor cells |
AU2006202209B2 (en) * | 2005-05-27 | 2011-04-14 | Lifescan, Inc. | Amniotic fluid derived cells |
DK1888123T3 (da) | 2005-06-08 | 2013-04-15 | Janssen Biotech Inc | Celleterapi til øjendegeneration |
EP1904525A4 (en) | 2005-06-30 | 2009-10-21 | Ipsen Pharma | GLP-1 PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS |
DK2674485T3 (da) | 2005-10-27 | 2019-08-26 | Viacyte Inc | Pdx-1 udtrykkende dorsal og ventral fortarm endoderm |
WO2007070870A1 (en) * | 2005-12-16 | 2007-06-21 | Ethicon, Inc. | Compositions and methods for inhibiting adverse immune response in histocompatibility-mismatched transplantation |
AU2006327073B2 (en) * | 2005-12-19 | 2012-08-30 | Ethicon, Inc. | In vitro expansion of postpartum derived cells in roller bottles |
US9125906B2 (en) | 2005-12-28 | 2015-09-08 | DePuy Synthes Products, Inc. | Treatment of peripheral vascular disease using umbilical cord tissue-derived cells |
JP5599568B2 (ja) * | 2005-12-28 | 2014-10-01 | エシコン・インコーポレイテッド | 分娩後由来細胞を用いた末梢血管疾患の治療 |
EP2019858B1 (en) * | 2006-04-17 | 2012-06-13 | BioE LLC | Differentiation of multi-lineage progenitor cells to respiratory epithelial cells |
US8741643B2 (en) | 2006-04-28 | 2014-06-03 | Lifescan, Inc. | Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage |
US7776593B2 (en) * | 2006-08-07 | 2010-08-17 | The Regents Of The University Of California | Hes6 as a marker of pancreatic endocrine cells |
CN101835479A (zh) * | 2007-07-25 | 2010-09-15 | 佰欧益有限公司 | 多系祖细胞分化为软骨细胞 |
CN102036688B (zh) * | 2007-10-05 | 2014-07-02 | 伊西康公司 | 使用人脐带组织来源的细胞进行肾脏组织的修复和再生 |
US8623648B2 (en) | 2008-04-24 | 2014-01-07 | Janssen Biotech, Inc. | Treatment of pluripotent cells |
CA2724839A1 (en) * | 2008-05-21 | 2009-11-26 | Bioe Llc | Differentiation of multi-lineage progenitor cells to pancreatic cells |
EP2291514B1 (en) * | 2008-05-22 | 2020-12-23 | Vesta Therapeutics, Inc. | Method of differentiating mammalian progenitor cells into insulin producing pancreatic islet cells |
BRPI0909866B1 (pt) * | 2008-06-11 | 2021-08-24 | Fresenius Medical Care Deutschland Gmbh | Método de produção de um meio condicionado de células progenitoras de fígado, meio condicionado e composição farmacêutica |
AU2009267167A1 (en) * | 2008-06-30 | 2010-01-07 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Differentiation of pluripotent stem cells |
US20100028307A1 (en) * | 2008-07-31 | 2010-02-04 | O'neil John J | Pluripotent stem cell differentiation |
US10179900B2 (en) * | 2008-12-19 | 2019-01-15 | DePuy Synthes Products, Inc. | Conditioned media and methods of making a conditioned media |
EP2379088B1 (en) | 2008-12-19 | 2018-02-28 | DePuy Synthes Products, Inc. | Treatment of lung and pulmonary diseases and disorders |
EP2412800A1 (en) * | 2010-07-29 | 2012-02-01 | Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen | Liver organoid, uses thereof and culture method for obtaining them |
PL2393917T3 (pl) | 2009-02-03 | 2016-12-30 | Podłoże do hodowli nabłonkowych komórek macierzystych i organoidów zawierających komórki macierzyste | |
EP2216042A1 (en) | 2009-02-09 | 2010-08-11 | Ipsen Pharma S.A.S. | GLP-1 analogues pharmaceutical compositions |
JP5908394B2 (ja) | 2009-03-26 | 2016-04-26 | デピュイ・シンセス・プロダクツ・インコーポレイテッド | アルツハイマー病の療法としてのヒト臍帯組織細胞 |
US10837020B2 (en) | 2009-04-22 | 2020-11-17 | Massachusetts Institute Of Technology | Innate immune suppression enables repeated delivery of long RNA molecules |
US20100273220A1 (en) * | 2009-04-22 | 2010-10-28 | Massachusetts Institute Of Technology | Innate immune suppression enables repeated delivery of long rna molecules |
EP3248618A1 (en) * | 2009-04-22 | 2017-11-29 | Massachusetts Institute Of Technology | Innate immune suppression enables repeated delivery of long rna molecules |
KR101785626B1 (ko) | 2009-07-20 | 2017-10-16 | 얀센 바이오테크 인코포레이티드 | 인간 배아 줄기 세포의 분화 |
AU2010276402B2 (en) | 2009-07-20 | 2014-07-03 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
DK2498796T3 (en) | 2009-11-09 | 2018-03-05 | Aal Scient Inc | HEART DISEASE TREATMENT |
AU2010333840B2 (en) | 2009-12-23 | 2016-01-07 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
CN103080125A (zh) | 2010-07-02 | 2013-05-01 | 安吉奥开米公司 | 用于治疗性结合物的短且含d氨基酸的多肽及其使用 |
ITMI20110780A1 (it) * | 2011-05-06 | 2012-11-07 | Euroclone Spa | Terreno di coltura per differenziare cellule staminali in cellule beta |
KR20210134808A (ko) | 2011-12-05 | 2021-11-10 | 팩터 바이오사이언스 인크. | 세포를 형질감염시키는 방법들 및 생성물들 |
US8497124B2 (en) | 2011-12-05 | 2013-07-30 | Factor Bioscience Inc. | Methods and products for reprogramming cells to a less differentiated state |
JP6301263B2 (ja) | 2011-12-23 | 2018-03-28 | デピュイ・シンセス・プロダクツ・インコーポレイテッド | ヒト臍帯組織由来細胞の検出 |
CA2890110C (en) | 2012-11-01 | 2023-05-02 | Factor Bioscience Inc. | Methods and products for expressing proteins in cells |
US20170029778A1 (en) | 2013-06-11 | 2017-02-02 | President And Fellows Of Harvard College | Sc-beta cells and compositions and methods for generating the same |
CA2915143C (en) | 2013-06-13 | 2021-08-03 | Orgenesis Ltd. | Cell populations, methods of transdifferentiation and methods of use thereof |
US20160129047A1 (en) | 2013-07-05 | 2016-05-12 | Université Catholique de Louvain | Conditioned medium from human adult liver stem cells and its use in the treatment of liver disorders |
KR102338815B1 (ko) | 2013-12-16 | 2021-12-13 | 프레제니우스 메디칼 케어 도이칠란드 게엠베하 | 췌장섬-유사 세포 구조물 및 이의 제조 방법 |
KR102415811B1 (ko) | 2014-01-31 | 2022-07-04 | 팩터 바이오사이언스 인크. | 핵산 제조 및 송달을 위한 방법 및 산물 |
US10597633B2 (en) | 2014-05-16 | 2020-03-24 | Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen | Culture method for organoids |
GB201421092D0 (en) | 2014-11-27 | 2015-01-14 | Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen | Culture medium |
GB201421094D0 (en) | 2014-11-27 | 2015-01-14 | Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen | Culture medium |
US10443042B2 (en) | 2014-12-18 | 2019-10-15 | President And Fellows Of Harvard College | Serum-free in vitro directed differentiation protocol for generating stem cell-derived beta cells and uses thereof |
WO2016100909A1 (en) | 2014-12-18 | 2016-06-23 | President And Fellows Of Harvard College | METHODS FOR GENERATING STEM CELL-DERIVED β CELLS AND USES THEREOF |
WO2016100930A1 (en) | 2014-12-18 | 2016-06-23 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for generating stem cell-derived b cells and methods of use thereof |
MA41296A (fr) | 2014-12-30 | 2017-11-07 | Orgenesis Ltd | Procédés de transdifférenciation et procédés d'utilisation de ceux-ci |
AU2016218977C1 (en) | 2015-02-13 | 2023-03-23 | Factor Bioscience Inc. | Nucleic acid products and methods of administration thereof |
GB201603569D0 (en) | 2016-03-01 | 2016-04-13 | Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen | Improved differentiation method |
US11534466B2 (en) * | 2016-03-09 | 2022-12-27 | Aal Scientifics, Inc. | Pancreatic stem cells and uses thereof |
IL308824A (en) | 2016-08-17 | 2024-01-01 | Factor Bioscience Inc | Nucleic acid products and methods of their administration |
WO2018207179A1 (en) | 2017-05-08 | 2018-11-15 | Orgenesis Ltd. | Transdifferentiated cell populations and methods of use thereof |
US11788062B2 (en) | 2017-07-27 | 2023-10-17 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Functional feline pancreatic cells from adipose tissue |
BR112020009275A2 (pt) | 2017-11-15 | 2020-10-27 | Semma Therapeutics, Inc. | composições de fabricação de célula de ilhota e métodos de uso |
AU2019320072A1 (en) | 2018-08-10 | 2021-02-25 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Stem cell derived islet differentiation |
US10501404B1 (en) | 2019-07-30 | 2019-12-10 | Factor Bioscience Inc. | Cationic lipids and transfection methods |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4439521A (en) * | 1981-10-21 | 1984-03-27 | Ontario Cancer Institute | Method for producing self-reproducing mammalian pancreatic islet-like structures |
US5486359A (en) * | 1990-11-16 | 1996-01-23 | Osiris Therapeutics, Inc. | Human mesenchymal stem cells |
US6242666B1 (en) * | 1998-12-16 | 2001-06-05 | The Scripps Research Institute | Animal model for identifying a common stem/progenitor to liver cells and pancreatic cells |
US6774120B1 (en) * | 1999-06-01 | 2004-08-10 | Sarah Ferber | Methods of inducing regulated pancreatic hormone production in non-pancreatic islet tissues |
EP1257282A4 (en) * | 1999-12-06 | 2003-05-02 | Gen Hospital Corp | PANCREATIC STEM CELLS AND THEIR USE IN TRANSPLANTATION |
US6521451B2 (en) * | 1999-12-09 | 2003-02-18 | California Institute Of Technology | Sealed culture chamber |
US7202080B2 (en) * | 2001-03-29 | 2007-04-10 | Ixion Biotechnology, Inc. | Method for transdifferentiation of non-pancreatic stem cells to the pancreatic differentiation pathway |
-
2002
- 2002-10-18 CA CA002463914A patent/CA2463914A1/en not_active Abandoned
- 2002-10-18 EP EP02770615A patent/EP1444345A4/en not_active Withdrawn
- 2002-10-18 US US10/493,536 patent/US20050053588A1/en not_active Abandoned
- 2002-10-18 US US10/273,746 patent/US20030138951A1/en not_active Abandoned
- 2002-10-18 WO PCT/US2002/033304 patent/WO2003033697A1/en not_active Application Discontinuation
- 2002-10-18 JP JP2003536424A patent/JP2005506074A/ja active Pending
Cited By (40)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009520474A (ja) * | 2005-12-21 | 2009-05-28 | ユニヴァルシテ カソリック デ ルーバン | 単離肝幹細胞 |
US10316293B2 (en) | 2007-07-01 | 2019-06-11 | Janssen Biotech, Inc. | Methods for producing single pluripotent stem cells and differentiation thereof |
US10456424B2 (en) | 2007-07-31 | 2019-10-29 | Janssen Biotech, Inc. | Pancreatic endocrine cells and methods thereof |
US9969982B2 (en) | 2007-11-27 | 2018-05-15 | Lifescan, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
US11001802B2 (en) | 2008-02-21 | 2021-05-11 | Nunc A/S | Surface of a vessel with polystyrene, nitrogen, oxygen and a static sessile contact angle for attachment and cultivation of cells |
US10066203B2 (en) | 2008-02-21 | 2018-09-04 | Janssen Biotech Inc. | Methods, surface modified plates and compositions for cell attachment, cultivation and detachment |
US9593306B2 (en) | 2008-06-30 | 2017-03-14 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of pluripotent stem cells |
US10233421B2 (en) | 2008-06-30 | 2019-03-19 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of pluripotent stem cells |
US9593305B2 (en) | 2008-06-30 | 2017-03-14 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of pluripotent stem cells |
US10351820B2 (en) | 2008-06-30 | 2019-07-16 | Janssen Biotech, Inc. | Methods for making definitive endoderm using at least GDF-8 |
US9388387B2 (en) | 2008-10-31 | 2016-07-12 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
US9752126B2 (en) | 2008-10-31 | 2017-09-05 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human pluripotent stem cells |
US9969973B2 (en) | 2008-11-20 | 2018-05-15 | Janssen Biotech, Inc. | Methods and compositions for cell attachment and cultivation on planar substrates |
US9969972B2 (en) | 2008-11-20 | 2018-05-15 | Janssen Biotech, Inc. | Pluripotent stem cell culture on micro-carriers |
US10076544B2 (en) | 2009-07-20 | 2018-09-18 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
US10471104B2 (en) | 2009-07-20 | 2019-11-12 | Janssen Biotech, Inc. | Lowering blood glucose |
JP2012533629A (ja) * | 2009-07-20 | 2012-12-27 | ヤンセン バイオテツク,インコーポレーテツド | ヒト胚性幹細胞の分化 |
US9593310B2 (en) | 2009-12-23 | 2017-03-14 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
US10704025B2 (en) | 2009-12-23 | 2020-07-07 | Janssen Biotech, Inc. | Use of noggin, an ALK5 inhibitor and a protein kinase c activator to produce endocrine cells |
US10329534B2 (en) | 2010-03-01 | 2019-06-25 | Janssen Biotech, Inc. | Methods for purifying cells derived from pluripotent stem cells |
US9969981B2 (en) | 2010-03-01 | 2018-05-15 | Janssen Biotech, Inc. | Methods for purifying cells derived from pluripotent stem cells |
US9752125B2 (en) | 2010-05-12 | 2017-09-05 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
US9528090B2 (en) | 2010-08-31 | 2016-12-27 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
US9506036B2 (en) | 2010-08-31 | 2016-11-29 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
US9181528B2 (en) | 2010-08-31 | 2015-11-10 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of pluripotent stem cells |
US9458430B2 (en) | 2010-08-31 | 2016-10-04 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of pluripotent stem cells |
US9951314B2 (en) | 2010-08-31 | 2018-04-24 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
US11377640B2 (en) | 2011-12-22 | 2022-07-05 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells into single hormonal insulin positive cells |
US10358628B2 (en) | 2011-12-22 | 2019-07-23 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells into single hormonal insulin positive cells |
US9434920B2 (en) | 2012-03-07 | 2016-09-06 | Janssen Biotech, Inc. | Defined media for expansion and maintenance of pluripotent stem cells |
US9593307B2 (en) | 2012-03-07 | 2017-03-14 | Janssen Biotech, Inc. | Defined media for expansion and maintenance of pluripotent stem cells |
US10208288B2 (en) | 2012-06-08 | 2019-02-19 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endocrine cells |
US10066210B2 (en) | 2012-06-08 | 2018-09-04 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endocrine cells |
US10377989B2 (en) | 2012-12-31 | 2019-08-13 | Janssen Biotech, Inc. | Methods for suspension cultures of human pluripotent stem cells |
US10370644B2 (en) | 2012-12-31 | 2019-08-06 | Janssen Biotech, Inc. | Method for making human pluripotent suspension cultures and cells derived therefrom |
US10344264B2 (en) | 2012-12-31 | 2019-07-09 | Janssen Biotech, Inc. | Culturing of human embryonic stem cells at the air-liquid interface for differentiation into pancreatic endocrine cells |
US10947511B2 (en) | 2012-12-31 | 2021-03-16 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endocrine cells using thyroid hormone and/or alk5, an inhibitor of tgf-beta type 1 receptor |
US10138465B2 (en) | 2012-12-31 | 2018-11-27 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endocrine cells using HB9 regulators |
US10870832B2 (en) | 2014-05-16 | 2020-12-22 | Janssen Biotech, Inc. | Use of small molecules to enhance MAFA expression in pancreatic endocrine cells |
US10420803B2 (en) | 2016-04-14 | 2019-09-24 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of pluripotent stem cells to intestinal midgut endoderm cells |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2463914A1 (en) | 2003-04-24 |
US20030138951A1 (en) | 2003-07-24 |
US20050053588A1 (en) | 2005-03-10 |
EP1444345A1 (en) | 2004-08-11 |
EP1444345A4 (en) | 2004-12-08 |
WO2003033697A1 (en) | 2003-04-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2005506074A (ja) | 肝臓の幹細胞および前駆細胞の膵臓機能細胞への転換 | |
JP5460677B2 (ja) | ヒト胚幹細胞由来の膵島細胞 | |
Soria | In‐vitro differentiation of pancreatic β‐cells | |
Leon-Quinto et al. | In vitro directed differentiation of mouse embryonic stem cells into insulin-producing cells | |
CA2604189C (en) | Method of inducing embryonic stem cells into pancreatic cells | |
Ris et al. | Impact of integrin-matrix matching and inhibition of apoptosis on the survival of purified human beta-cells in vitro | |
US20070020242A1 (en) | Method for transdifferentiation of non-pancreatic stem cells to the pancreatic pathway | |
Petropavlovskaia et al. | Identification and characterization of small cells in the adult pancreas: potential progenitor cells? | |
CA2435826A1 (en) | Differentiation of stem cells to pancreatic endocrine cells | |
Santana et al. | Insulin‐producing cells derived from stem cells: recent progress and future directions | |
Paz et al. | Betacellulin overexpression in mesenchymal stem cells induces insulin secretion in vitro and ameliorates streptozotocin-induced hyperglycemia in rats | |
Li et al. | Coexpression of Pdx1 and betacellulin in mesenchymal stem cells could promote the differentiation of nestin-positive epithelium-like progenitors and pancreatic islet-like spheroids | |
Docherty | Growth and development of the islets of Langerhans: implications for the treatment of diabetes mellitus | |
Noguchi | Pancreatic stem/progenitor cells for the treatment of diabetes | |
US20050064587A1 (en) | Pancreatic small cells and uses thereof | |
Capito et al. | Mouse muscle as an ectopic permissive site for human pancreatic development | |
Carlotti et al. | β-cell generation: can rodent studies be translated to humans? | |
Chelluri et al. | Improved differentiation protocol of rat bone marrow precursors to functional islet like cells | |
Peck et al. | In vitro-generation of surrogate islets from adult stem cells | |
Lu et al. | Heterogeneity in predisposition of hepatic cells to be induced into pancreatic endocrine cells by PDX-1 | |
Ham et al. | Generation of insulin producing cells from the mouse primary hepatocytes | |
Roche et al. | Generation of new islets from stem cells | |
Chelluri et al. | Transplant Immunology & Stem Cell Lab., Global Hospitals, Hyderabad; 2 Zoology Department, Osmania University; 3 Centre for Cellular & Molecular Biology, Hyderabad, India Correspondence: Dr. Lakshmi Kiran Chelluri, Head, Transplant Biology & Stem Cell Lab, Global Hospitals, Lakdi-ka-Pool, Hyderabad, 500 004 (AP), India. Tel.+ 91.40. 30244501-Fax:+ 91.40. 23244455 E-mail: lkiran@ globalhospital. net; apparusu@ hotmail. com | |
Peck et al. | Plasticity of adult-derived pancreatic stem cells | |
Lumelsky | Pancreatic Differentiation of Pluripotent Stem Cells |