CN104903440B - 使用小分子从多能干细胞产生胰内胚层 - Google Patents

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Abstract

产生表达至少5%PDX1/NKX6.1双阳性的胰细胞或胰细胞前体的方法，包括将定形内胚层细胞暴露于有效量的一种或多种小分子，以使人定形内胚层细胞分化为胰细胞或胰细胞前体。本发明还涉及通过所述方法产生的胰内胚层细胞和所述胰内胚层细胞的用途。

Description

使用小分子从多能干细胞产生胰内胚层
技术领域
本发明涉及从多能干(PS)细胞例如人定形内胚层产生胰内胚层的方法。
发明背景
β细胞移植潜在地提供了I型糖尿病的最终治疗。然而，供体β细胞有限的可用性制约了该治疗作为临床治疗的用途。多能干细胞可无限增殖和分化为多种细胞类型；因此，PS细胞为有希望的β细胞来源。然而，在PS细胞可用于治疗糖尿病前，其需要有效和可再生地分化为胰细胞。
在脊椎动物胚胎发育期间，多能细胞产生三个胚层：外胚层、中胚层和内胚层。对于形成内胚层衍生组织，定形内胚层(DE)的诱导是第一步；从DE细胞产生胰内胚层(PE)为产生产胰岛素的β细胞所必需的。具有成为内分泌祖细胞(EP)潜能的PE细胞特征在于两个重要转录因子PDX1和NKX6.1的共表达。
对于从PS细胞产生胰细胞已经建立了分步体外分化方案。这些方案一般模拟胰发育的主要事件，其包括几个阶段例如共表达SOX17和FOXA2的DE、原肠、后前肠、PE、EP和最后成熟β细胞的形成。迄今为止，hES细胞的有效DE分化已通过激活蛋白A处理实现。产生胰β细胞的下一个主要步骤为产生共表达PDX1和NKX6.1的PE。已开发出几组可将PS细胞分化为DE和PE的体外方案，然而其仅能产生中等分数的NKX6.1/PDX1双阳性(db +ve)细胞，而且重要的是其中无一能够体外产生完全成熟的β细胞(Cai等(2010); D’Amour等(2006);Kunisada等(2012); Schulz等(2012); Zhang等(2009); Ameri等(2010))。
概述
本发明涉及产生胰细胞或胰细胞前体的方法，其中至少5%的细胞共表达PDX1和NKX6.1，包括将定形内胚层(DE)细胞暴露于有效量的由以下组成的组中的至少一种化合物：
a. BMP抑制剂LDN-193189 (在表1中列出)
b. 激酶抑制剂(在表1和表2中列出)
c. 视黄酸受体激动剂(在表2中列出)，
以使人DE细胞分化为胰细胞或胰细胞前体。
本发明进一步涉及用于产生胰细胞或胰细胞前体的方法，其中至少5%的细胞共表达PDX1和NKX6.1，包括将DE细胞暴露于有效量的由以下组成的组中的至少一种化合物：
a. BMP抑制剂LDN-193189 (在表1中列出)
b. 具有或不具有N-烷基化的1,9-吡唑并蒽酮的异构体(在表1和2中列出)
c. 视黄酸受体激动剂(在表2中列出)，
以使人DE细胞分化为胰细胞或胰细胞前体(pancreatic or pancreatic cellprecursors)。
本发明进一步涉及用于产生胰细胞或胰细胞前体的方法，其中至少5%的细胞共表达PDX1和NKX6.1，包括将定形内胚层细胞暴露于有效量的由以下组成的组中的至少一种化合物：
a. BMP抑制剂LDN-193189
b. JNK抑制剂II
c. AM580，
以使人DE细胞分化为胰细胞或胰细胞前体。
本发明进一步涉及用于产生胰细胞或胰细胞前体的方法，其中至少5%的细胞共表达PDX1和NKX6.1，包括将定形内胚层细胞暴露于有效量的BMP抑制剂LDN-193189，以使人DE细胞分化为胰细胞或胰细胞前体。
本发明进一步涉及用于产生胰细胞或胰细胞前体的方法，其中至少5%的细胞共表达PDX1和NKX6.1，包括将DE细胞暴露于有效量的BMP抑制剂LDN-193189，并随后暴露于下列分子之一，
a. Wnt抑制剂IWP2
b. Hedgehog抑制剂环巴胺(Cyclopamine, Cyc)
以使人DE细胞分化为胰细胞或胰细胞前体。
本发明进一步涉及用于产生胰细胞或胰细胞前体的方法，其中至少5%的细胞共表达PDX1和NKX6.1，包括将DE细胞暴露于有效量的BMP抑制剂LDN-193189，并随后暴露于JNK抑制剂II、视黄酸或视黄酸衍生物、bFGF和下列分子之一的组合：
a. Wnt抑制剂IWP2
b. Hedgehog抑制剂环巴胺
以使人DE细胞分化为胰细胞或胰细胞前体。
本发明进一步涉及用于产生胰细胞或胰细胞前体的方法，其中至少5%的细胞共表达PDX1和NKX6.1，包括将DE细胞暴露于有效量的BMP抑制剂LDN-193189，并随后暴露于JNK抑制剂II与视黄酸或视黄酸衍生物、bFGF和LDN-193189的组合，以使DE干细胞分化为胰细胞或胰细胞前体。
在本发明的一个实施方案中，视黄酸受体激动剂或激酶抑制剂的任一个可与bFGF组合。
本发明进一步涉及可通过本发明方法获得的胰细胞或胰细胞前体。
本发明涉及通过将人多能干细胞暴露于至少一种表1和2所列化合物而产生的胰细胞或胰细胞前体。
本发明涉及表1和2的任何一种化合物从干细胞诱导胰细胞或胰细胞前体的用途。
本发明涉及LDN-193189从干细胞诱导胰细胞或胰细胞前体的用途。
本发明涉及LDN-193189随后环巴胺或IWP2从干细胞诱导胰细胞或胰细胞前体的用途。
本发明采用一种替代方法以改进人PS细胞向成熟β细胞分化的效率，即通过提供增加NKX6.1/PDX1双阳性细胞(PE细胞定型为内分泌细胞命运的标志)分数的方法。
在一方面，本发明提供改进的胰细胞群，即NKX6.1/PDX1双阳性细胞分数增加的PE。
此外，本发明提供更均质的胰细胞群，这对于这些细胞向内分泌谱系进一步发育是重要的。
本发明还提供更同步的胰群，以到达下一阶段。
本发明还可解决将从示例性实施方案的公开内容中显而易见的其它问题。
附图简述
图1显示使用小分子文库的PE筛选方法—也称为文库筛选方法。多能干(PS)细胞根据DE方案(见通用方法)分化为定形内胚层(DE)并接种在96孔板中用于筛选。胰内胚层(PE)筛选分为前期和后期。在前期在已发表的基于bFGF的方案(Ameri等, 2010, 亦参照WO/2010/136583)中添加化合物进行第一个7天的PE分化，然后无化合物继续另一个6天。在后期在基于bFGF的方案中，仅在最后6天添加化合物。
图2显示文库筛选方法的前期命中(hit)。将来自人诱导的多能干细胞(hiPSC)(黑色)或hESC (白色)的定形内胚层细胞接种在96孔光学板中并使用14天的基于bFGF的方案分化为胰内胚层。在基于bFGF的方案中，添加化合物持续14天中的第一个7天并使用InCell分析仪2000 (GE Healthcare)分析NKX6.1/PDX1双阳性细胞。该图显示与基准方案相比NKX6.1/PDX1双阳性细胞分数的%效果。
图3显示文库筛选方法的后期命中。将来自hiPSC (黑色)或hESC (白色)的定形内胚层细胞接种在96孔光学板中并使用14天的基于bFGF的方案分化为胰内胚层。在基于bFGF的方案中，添加化合物持续最后的6天并使用InCell分析仪2000 (GE Healthcare)分析NKX6.1/PDX1双阳性细胞。该图显示与基准方案相比NKX6.1/PDX1双阳性细胞分数的%效果。
图4显示第二种基于候选物的PE筛选方法。多能干(PS)细胞根据DE方案(见通用方法)分化为定形内胚层并接种在96孔板中用于筛选。胰内胚层筛选分为两部分。在筛选1中，在PE分化的第一个8天将化合物加入基础培养基(RPMI1640+0.1%PEST+12%KOSR)。在具有2天增量的4个不同的时间窗口中检测化合物，然后在基于bFGF的已发表方案(Ameri等,2010)中将细胞继续分化另一个6天。在筛选2中，细胞首先用筛选1的命中化合物分化4天，然后最后的10天将筛选化合物加入基础培养基中。
图5显示与根据Ameri等, 2010 (其用作基准方案，与各筛选平行运行)分化的细胞相比，候选物筛选1和2的命中。在筛选1中，鉴定了一种命中化合物(LDN-193189)并且发现当第一个4天将其加入接着4天基础培养基时其最有效。对于筛选2，当细胞首先在筛选1的命中化合物中暴露4天然后在分化的最后10天加入筛选2的命中化合物时鉴定了两种命中化合物(环巴胺和IWP-2)。该图显示与基准方案相比NKX6.1/PDX1双阳性细胞分数的%效果(hiPSC的条为黑色，hESC的条为白色)。
图6显示与基准方案(Ameri等(2010))相比，两种单独的筛选(小分子文库和候选物方法)中存在的命中化合物组合对PDX1/NKX6.1双阳性细胞的量的有利作用。hiPSC的条为黑色，hESC的条为白色。
缩略词表
+ve：阳性
bFGF：碱性成纤维细胞生长因子(FGF) (也称作FGF2)
Cyc：环巴胺
db：双阳性
DE：定形内胚层
hBS：人胚泡衍生的干
hBSC：人胚泡衍生的干细胞
hES：人胚胎干
hESC：人胚胎干细胞
hiPSC：人诱导多能干细胞
hPSC：人多能干细胞
KOSR：敲除血清替代物
NKX6.1：NK6同源异型框1
PDX1：胰和十二指肠同源异型框1
PEST：青霉素链霉素
PS：多能干
Rockout；Rho激酶抑制剂III
RT：室温
发明详述
本发明涉及从干细胞，例如人定形内胚层细胞和诱导的多能干细胞产生胰内胚层的方法。
本发明采用一种替代方法以改进人PS细胞向成熟β细胞分化的效率，即通过提供提高NKX6.1/PDX1双阳性细胞百分数(达到内分泌细胞群所需的细胞阶段之一，PE细胞群的标志)的方法。
此外，本发明提供更均质和同步的胰细胞群，这对于这些细胞向内分泌谱系进一步发育是重要的。
本发明还可解决将从示例性实施方案的公开内容中显而易见的其它问题。
在一个实施方案中，可通过本发明方法获得的胰内分泌细胞为产胰岛素细胞，任选与向产胰高血糖素、生长抑素、胰多肽和/或生长素释放肽(ghrelin)的细胞分化的细胞一起。如本文所使用的，“产胰岛素细胞”指产生和储存或分泌可检测量的胰岛素的细胞。“产胰岛素细胞”可为单个细胞或细胞集合。
在另一个实施方案中，包含胰细胞的细胞群从体细胞群获得。在一些方面，体细胞群已被诱导而去分化为胚胎-样干(ES，例如，多能)细胞。这样的去分化细胞还称为诱导的多能干细胞(iPSC)。
在另一个实施方案中，包含胰细胞的细胞群从胚胎干(ES，例如，多能)细胞获得。在一些方面，包含胰细胞的细胞群为多能细胞例如ES样细胞。
在另一个实施方案中，包含胰细胞的细胞群为胚胎分化的干(ES或多能)细胞。分化发生在胚状体和/或单层细胞培养物或其组合中。
在另一个实施方案中，细胞群为干细胞群。在一些方面，细胞群为分化为胰分泌谱系的干细胞群。
干细胞为通过其在单细胞水平自我更新且分化产生子代细胞(包括自我更新祖细胞、非更新祖细胞和终末分化细胞)的能力而界定的未分化细胞。干细胞特征还在于其体外从多胚层(内胚层、中胚层和外胚层)分化为各种细胞谱系的功能细胞以及移植后产生多胚层的组织和注入胚泡后显著促成大部分(若非全部)组织的能力。
干细胞按照其发育潜能分为：(1) 全能的，意指能够产生所有胚胎和胚外细胞类型；(2) 多能的(pluripotent)，意指能够产生所有胚胎细胞类型；(3) 多潜能的(multi-potent)，意指能够产生细胞谱系的子集，但所有均在一种特定组织、器官或生理***内(例如，造血干细胞可产生包括HSC (自我更新)的子代、血细胞限制的寡潜能祖细胞和为血液正常组分的所有细胞类型和成分(例如，血小板))；(4) 寡多能的，意指能够产生比多潜能干细胞更受限的细胞谱系子集；和(5) 单能的，意指能够产生单细胞谱系(例如，产生***的干细胞)。
用于从干细胞获得胰细胞的方案示例性地为，但不限于，D'Amour, K. A.等(2006)、Jiang, J.等(2007)、Kroon, E.等(2008)中描述的方案。
用于从体细胞或经诱导而去分化为多能细胞例如ES样细胞的体细胞获得胰细胞的方案示例性地为，但不限于，Aoi, T.等(2008)、D'Amour, K. A.等(2006)、Jiang, J.等(2007)、Kroon, E.等(2008)、Takahashi, K.等(2007)、Takahashi, K.和Yamanaka, S.(2006)和Wernig, M.等(2007)中描述的方案。
如本文所使用的“分化(differentiate)”或分化“(differentiation)”指细胞从未分化状态发展至分化状态，从不成熟状态发展至较不成熟状态或从不成熟状态发展至成熟状态的过程。例如，早期未分化的胚胎胰细胞能够增殖和表达特征标志物，如PDX1、NKX6.1和PTF1a。成熟或分化的胰细胞不增殖而确实分泌高水平的胰内分泌激素或消化酶。例如，完全分化的β细胞响应葡萄糖而分泌高水平的胰岛素。当细胞丧失未分化细胞的标志物或获得分化细胞的标志物时，出现细胞相互作用变化和成熟。丧失或获得单个标志物可指示细胞已经“成熟或完全分化”。术语“分化因子”指加至胰细胞以促进其分化为成熟内分泌细胞(同样包含产胰岛素的β细胞)的化合物。示例性的分化因子包括肝细胞生长因子、角质形成细胞生长因子、艾塞那肽(exendin)-4、碱性成纤维细胞生长因子、***-1、神经生长因子、表皮生长因子、血小板衍生生长因子和胰高血糖素样肽1。在一些方面，细胞的分化包括在包含一种或多种分化因子的培养基中培养细胞。
如本文所使用的，“人多能干细胞”(hPSC)指可从任何来源衍生的并且能够在适当条件下产生人不同细胞类型(其为所有3个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的衍生物)子代的细胞。hPSC可具有在8-12周龄SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力和/或在组织培养物中形成所有三个胚层的可鉴别细胞的能力。人多能干细胞的定义中包括各种类型的胚胎细胞，包括文献30中人胚泡衍生的干(hBS)细胞(常称作人胚胎干(hES)细胞) (参见，例如Thomson等(1998), Heins等(2004)，以及诱导的多能干细胞(参见，例如Yu等(2007)、Takahashi等(2007))。本文中描述的各种方法和其它实施方案可能需要或利用多种来源的hPSC。例如，适用的hPSC可从发育的胚胎获得。另外或替代地，合适的hPSC可从已建立的细胞系和/或人诱导多能干(hiPS)细胞获得。
如本文所使用的“hiPSC”指人诱导多能干细胞。
ES细胞系也可衍生自单个卵裂球而不破坏子宫外胚胎并且不影响临床结果(Chung等(2006)和Klimanskaya等(2006))。
如本文所使用的，术语“胚泡-衍生的干细胞”表示BS细胞，并且人形式称为“hBS细胞”。在文献中该细胞常常被称为胚胎干细胞，更特别为人胚胎干细胞(hESC)。本发明使用的多能干细胞因此可为从胚泡制备的胚胎干细胞，如例如WO 03/055992和WO 2007/042225中所述，或可为市售可得的hBS细胞或细胞系。然而，进一步设想本发明可使用任何人多能干细胞，包括通过例如Yu,等(2007)、Takahashi等(2007)和Yu等(2009)中所公开的用某些转录因子例如OCT4、SOX2、NANOG和LIN28处理成体细胞而重编程为多能细胞的分化成体细胞。
如本文所使用的JNK抑制剂II包括具有或不具有N-烷基化的1,9-吡唑并蒽酮的异构体或互变异构体。其中1,9-吡唑并蒽酮可定义为“SMILES: c1ccc2c(c1)-c3c4c(cccc4[nH]n3)C2=O”或“1,6-二氢二苯并[cd,g]吲唑-6-酮”。
DEF培养基或DEF-CS培养基/***为确定的用于人多能干细胞的建立和增殖的平衡培养基，DEF-CS培养基/***。
本发明实施方案
1. 产生胰细胞或胰细胞前体的方法，其中至少5%的细胞共表达PDX1和NKX6.1，包括将胚胎干细胞暴露于有效量的由以下组成的组中的至少一种化合物：
a. BMP抑制剂
b. 激酶抑制剂
c. 视黄酸受体激动剂，
以使人胚胎干细胞分化为胰细胞或胰细胞前体。
2. 实施方案1的方法，其中所述化合物在表1或2中列出。
3. 实施方案1或2的方法，其中所述激酶抑制剂为具有或不具有N-烷基化的1,9-吡唑并蒽酮的异构体。
4. 实施方案1-3的方法，其中所述激酶抑制剂为JNK抑制剂II。
5. 实施方案1-2的方法，其中所述视黄酸受体激动剂为AM580。
6. 实施方案1-5的方法，其中所述JNK抑制剂II与AM580组合。
7. 实施方案3-6的方法，其中存在bFGF。
8. 实施方案7的方法，其中所述bFGF为FGF2、FGF7或FGF10。
9. 实施方案8的方法，其中所述bFGF为FGF7。
10. 实施方案1的方法，其中所述BMP抑制剂为LDN-193189。
11. 实施方案10的方法，其中所述LDN-193189之后暴露于Wnt抑制剂或hedgehog抑制剂。
12. 实施方案11的方法，其中所述Wnt抑制剂为IWP2。
13. 实施方案12的方法，其中所述hedgehog抑制剂为环巴胺。
14. 实施方案1-13的方法，其中所述胰细胞或胰细胞前体为10-20%、10-30%、10-40%、5-20%、5-30%、5-40%、5-50%、5-60% 或5-70%、5-80%、40-80%或5-90% PDX1/NKX6.1双阳性。
15. 实施方案1-14中任一个的方法，其中所述胰细胞或胰细胞前体为5-50%PDX1/NKX6.1双阳性。
16. 实施方案1-9中任一个的方法，其中所述胰细胞或胰细胞前体为40-80%PDX1/NKX6.1双阳性。
17. 可通过实施方案1-16中的方法获得的胰细胞或胰细胞前体。
18. 通过将人多能干细胞暴露于至少一种表1或2中所列化合物而产生的胰细胞或胰细胞前体。
19. 实施方案18的胰细胞或胰细胞前体，其中所述化合物为LDN-193189。
20. 实施方案18的胰细胞或胰细胞前体，其中所述化合物为JNK抑制剂II。
21. 实施方案18的胰细胞或胰细胞前体，其中所述化合物为AM580。
22. 实施方案18的胰细胞或胰细胞前体，其中所述胰细胞或胰细胞前体通过将干细胞暴露于至少一种化合物与至少一种额外试剂的组合而产生。
23. 实施方案22的胰细胞或胰细胞前体，其中所述LDN-193189与JNK抑制剂II和AM580组合。
24. 实施方案22的胰细胞或胰细胞前体，其中所述LDN-193189之后暴露于环巴胺。
25. 实施方案22的胰细胞或胰细胞前体，其中所述LDN-193189之后暴露于IWP2。
26. 实施方案22的胰细胞或胰细胞前体，其中所述化合物为JNK抑制剂II与表2中所列的视黄酸受体激动剂的组合。
27. 实施方案22的胰细胞或胰细胞前体，其中JNK抑制剂II与AM580组合。
28. 实施方案22的胰细胞或胰细胞前体，其中JNK抑制剂II与AM580和bFGF组合。
29. 实施方案28的胰细胞或胰细胞前体，其中bFGF为FGF2、FGF7或FGF10。
30. 实施方案29的胰细胞或胰细胞前体，其中bFGF为FGF7。
31. 表1或2的化合物从干细胞诱导胰细胞或胰细胞前体的用途。
32. JNK抑制剂II从干细胞诱导胰细胞或胰细胞前体的用途。
33. JNK抑制剂II与视黄酸受体激动剂组合从干细胞诱导胰细胞或胰细胞前体的用途。
34. JNK抑制剂II与AM580组合从干细胞诱导胰细胞或胰细胞前体的用途。
35. LDN-193189从干细胞诱导胰细胞或胰细胞前体的用途。
36. LDN-193189随后环巴胺或IWP2从干细胞诱导胰细胞或胰细胞前体的用途。
37. LDN-193189随后环巴胺从干细胞诱导胰细胞或胰细胞前体的用途。
38. LDN-193189随后IWP2从干细胞诱导胰细胞或胰细胞前体的用途。
39. LDN-193189随后JNK抑制剂II、AM580和bFGF的组合从干细胞诱导胰细胞或胰细胞前体的用途。
40. LDN-193189随后JNK抑制剂II、AM580、LDN-193189和bFGF的组合从干细胞诱导胰细胞或胰细胞前体的用途。
41. LDN-193189随后JNK抑制剂II、AM580、LDN-193189、bFGF和环巴胺或IWP2的组合从干细胞诱导胰细胞或胰细胞前体的用途。
42. LDN-193189随后JNK抑制剂II、AM580、LDN-193189、bFGF和环巴胺的组合从干细胞诱导胰细胞或胰细胞前体的用途。
43. LDN-193189随后JNK抑制剂II、AM580、LDN-193189、bFGF和IWP2的组合从干细胞诱导胰细胞或胰细胞前体的用途。
44. 产生表达至少5% PDX1/NKX6.1双阳性的胰细胞或胰细胞前体的方法，包括将定形内胚层细胞暴露于有效量的下列各组化合物的至少一种：
a. BMP抑制剂，和
b. 激酶抑制剂，和
c. 视黄酸受体激动剂，
以使定形内胚层细胞分化为胰细胞或胰细胞前体。
45. 实施方案44的方法，其中所述BMP抑制剂为LDN-193189。
46. 实施方案44的方法，其中所述视黄酸受体激动剂为AM580。
47. 实施方案44的方法，其中所述视黄酸受体激动剂为视黄酸衍生物。
48. 实施方案44的方法，其中所述激酶抑制剂为具有或不具有N-烷基化的1,9-吡唑并蒽酮的异构体。
49. 实施方案44的方法，其中所述激酶抑制剂为JNK抑制剂II并且与AM580组合。
50. 实施方案44的方法，其中所述激酶抑制剂和视黄酸受体激动剂与bFGF组合。
51. 实施方案44的方法，其中所述激酶抑制剂和视黄酸受体激动剂与FGF7或FGF10组合。
52. 实施方案44-46的方法，包括将定形内胚层细胞暴露于有效量的无bFGF的LDN-193189的第一步骤，和在bFGF存在下暴露于JNK抑制剂II与AM580的组合的第二步骤。
53. 实施方案44-46的方法，包括将定形内胚层细胞暴露于有效量的LDN-193189，随后暴露于由以下组成的组中的至少一种化合物：
wnt抑制剂，例如IWP2，和/或
hedgehog抑制剂，例如环巴胺。
54. 实施方案44-53中任一个的方法，其中所述胰细胞或胰细胞前体为至少5%、至少10%、10-30%、10-40%、5-70%、10-80%或5-100% PDX1/NKX6.1双阳性。
55. 可通过体外使用实施方案44-54的方法获得的胰细胞或胰细胞前体。
56. 通过将定形内胚层细胞体外暴露于靶向JNK1、2或3、或Syc或Src或GSK-3或P38 MAPK或P38激酶或Rho激酶或MEK或Chk2或VEGFR1、2或3或PDGFRb或KDR/Flk-1的激酶抑制剂而产生的胰细胞或胰细胞前体。
57. 通过实施方案56的方法产生的胰细胞或胰细胞前体，其中激酶抑制剂为JNK抑制剂II，且其中定形内胚层细胞还暴露于下列化合物的至少一种：
LDN-193189，
Wnt抑制剂，
hedgehog抑制剂，
视黄酸受体激动剂。
58. 实施方案56的胰细胞或胰细胞前体，其中将定形内胚层细胞暴露于JNK抑制剂II与表2中所列视黄酸受体激动剂的组合。
59. 表1或2的激酶抑制剂化合物从胰内胚层前体诱导胰细胞或胰细胞前体的用途。
60. JNK抑制剂II和LDN-193189组合从胰内胚层前体诱导胰细胞或胰细胞前体的用途。
61. JNK抑制剂II与视黄酸受体激动剂组合从胰内胚层前体诱导胰细胞或胰细胞前体的用途。
通用方法
多能干细胞的体外培养
将人胚胎干(hES)细胞系SA121和人诱导的多能干细胞(hiPSC) chIPS4(Cellectis)生长在T75培养瓶中的DEF-CS培养基(Cellectis)中。细胞为用5µM Rock抑制剂Y-27632 (Sigma #Y0503)传代的单细胞，以40000个细胞/cm2的密度接种用于实验。细胞在增湿培养箱(ThermoScientific Model 371)中于37℃和5% CO2下培养。
多能干细胞体外分化为定形内胚层
将汇合的hES细胞(系SA121)和hiPSC (chIPS4)培养物在RPMI1640 (Gibco #61870)中洗涤一次并用3µM CHIR99021 (Axon#1386)/RPMI1640处理。24小时后细胞用RPMI1640洗涤并用100 ng/ml激活蛋白A (Peprotech #120-14E)/RPMI1640处理。24小时后，向激活蛋白A培养基中加入2% B27 (Invitrogen #17504-044)持续2天，每天更换培养基。分化期间将细胞在增湿培养箱中维持在37℃和5% CO2下。
接种hES和hiPS细胞衍生的定形内胚层
将人ES细胞衍生的DE和人iPS细胞衍生的DE细胞在PBS-/-中洗涤并使用TrypleSelect (Invitrogen, 12563-029)胰蛋白酶消化5分钟。将DE细胞小心悬浮在RPMI1640中，洗涤一次，然后重悬在DE接种培养基(激活蛋白A 100ng/ml、2% B27、RPMI1640、0.1% PEST(Gibco #15140))中。DE细胞以200 000/cm2接种在96孔光学板(BD Bioscience)中，次日开始使用筛选化合物进行PE分化。
分析
PE分化的第8或14天，吸去培养基，然后用4%低聚甲醛(VWR, 97.131.000)室温固定细胞30分钟。细胞用PBS洗涤并用0.5% Triton X-100 (Sigma, 9002-93-1)透化10分钟，洗涤并在0.5% TNB-缓冲液(Perkin Elmer)中室温封闭30分钟。将第一抗体小鼠抗-NKX6.1 (Abcore#A55F12)和山羊抗-PDX1 (Abcam#47383)分别在0.1% Triton X-100/PBS中1:500和1:8000稀释，加入各个孔中以在4℃过夜孵育。用PBS洗涤细胞3次。将DAPI (4',6-二脒基-2-苯基吲哚, Applichem, A4099.0010)和第二抗体，Alexa Fluor 488驴-抗山羊和Alexa Fluor 594驴抗-小鼠(均为Invitrogen)在0.1% Triton X-100/PBS中1:1000稀释，并加入每个孔中45分钟。将细胞洗涤5次，保持在200µL PBS中用于成像。
成像使用InCell分析仪2000 (GE Healthcare)进行。用10x物镜捕获4个视野/孔。总细胞数目基于DAPI复染，NKX6.1/PDX1双阳性细胞数目使用InCell Developer Toolbox1.8 (GE Healthcare)测定。将NKX6.1/PDX1双阳性细胞分数归一化至每个板的基准并计算%效果。超过200%效果的值归类为命中。
实施例
胰内胚层特征在于共表达两个转录因子，NKX6.1和PDX1。许多已发表的用于制备PE的方案无效，且NKX6.1/PDX1双阳性细胞产量低。增加PE方案有效性为期需的结果。因此我们筛选了小分子文库以鉴定将改进现有PE方案的新型化合物。这基于以下假设进行：抑制剂、激动剂或拮抗剂可调节信号传导途径或染色体可接近性，这将提高NKX6.1/PDX1双阳性细胞的分数。
实施例1 – 筛选诱导NKX6.1/PDX1共表达的小分子
小分子
本筛选中包含四个不同的文库：激酶抑制剂文库(Calbiochem #539743)、生物活性脂质文库(Enzo Life Sciences #BML-2800)、核受体配体文库(Enzo Life Sciences #BML-2802)和磷酸酶抑制剂文库 (Enzo Life Sciences #BML-2834)。生物活性文库内的化合物以1 μM和0.1 μM检测。其它文库的化合物以10 μM和1 μM检测。在第二种基于候选物的筛选方法中，包含了靶向胰发育所涉及的主要信号传导途径的小分子。
NKX6.1/PDX1筛选
文库化合物在用于制备PE的基于bFGF的培养基配方(Ameri等2010) (RPMI1640Gibco#61870、12%KOSR Gibco#10828、0.1% PEST Gibco#15140、64ng/mL bFGF Peprotech#100-18B)中进行筛选。
文库PE筛选方法分为前期和后期(图1)。
在前期，在PE培养基中检测化合物，持续PE分化的第一个7天，然后使用无化合物的PE培养基继续分化另外6天。
在后期，将DE细胞在PE培养基中分化，持续第一个7天。随后的6天，在PE培养基中检测化合物。每个96孔板中包含12个阳性对照孔(PE培养基)和12个阴性对照孔(无bFGF的PE培养基)。每天进行培养基更换。前期筛选中鉴定的命中在图2中说明并在表1中列出。后期筛选中鉴定的命中在图3中说明并在表2中列出。
候选物方法的化合物在未添加bFGF的基础培养基(RPMI1640 Gibco#61870、12%KOSR Gibco#10828、0.1% PEST Gibco#15140)中筛选。该候选物方法筛选分为两部分(图4)。在第一部分，PE分化的第一个8天，化合物以2天增量的时间间隔进行检测(暴露于化合物中2天接着6天基础培养基或暴露于化合物中4天接着4天基础培养基或暴露于化合物中6天随后2天基础培养基或暴露于化合物中8天)。
这8天后将一个板固定并分析PDX1和NKX6.1表达。第二个板使用已发表的PE方案(Ameri等(2010))进一步分化另外6天。
在第二部分，DE细胞根据第一部分的命中化合物分化，接下来的6-10天在基础培养基中检测化合物。
基准方案(Ameri等(2010))用作对照。
第一和第二部分实验中均每天进行培养基更换。
候选物筛选方法中鉴定的命中在图5中说明，并且也包含在表1和2中。
实施例2 – 组合诱导NKX6.1 / PDX1共表达的小分子命中
将候选物筛选方法的命中与文库方法的命中组合
将DE细胞暴露于50nM LDN-193189中4天，接着AM580 (AH Diagnostics, BMLGF104 0025)、JNK抑制剂II (Calbiochem, 420119)、50nM LDN-193189和64ng /ml FGF2，或AM580、JNK抑制剂II、50nM LDN-193189、64ng /ml FGF2和IWP2，或AM580、JNK抑制剂II、50nM LDN-193189、64ng /ml FGF2和环巴胺中8天(图6)。每天进行培养基更换。
实施例3 - 在人诱导多能干细胞中诱导NKX6.1/PDX1共表达的小分子的确认
命中化合物(表1和2)在用于制备PE的基于bFGF的培养基配方(Ameri等2010)(RPMI1640 Gibco#61870、12%KOSR Gibco#10828、0.1% PEST Gibco#15140、64ng/mL bFGFPeprotech #100-18B)中进行筛选。
筛选分为前期和后期(图1)。在前期，在PE培养基中检测化合物，持续PE分化的第一个7天，然后使用无化合物的PE培养基继续额外的6天。在后期，将DE细胞在PE培养基中分化，持续第一个7天。随后的6天，化合物在PE培养基中检测。每个96孔板中包含12个阳性对照孔(PE培养基)和12个阴性对照孔(无bFGF的PE培养基)。每天进行培养基更换。
超过200%效果的值归类为命中(图2和图3)。
表1显示前期命中化合物
与PE培养基相比，提高NKX6.1/PDX1双阳性细胞分数超过200%的化合物。列出了文库、化合物在文库内的位置、靶标、化学结构、命中浓度和PDX1/NKX6.1双阳性细胞的百分数。
表1 前期命中
表2显示后期命中化合物。与PE培养基相比，提高NKX6.1/PDX1双阳性细胞分数超过200%的化合物。列出了文库、化合物在文库内的位置、靶标、化学结构、命中浓度和PDX1/NKX6.1双阳性细胞的百分数。
表2.后期命中
表2(续) 后期命中
尽管本发明的某些特征已经在本文中说明和描述，但现在本领域普通技术人员将想到许多修饰、取代、变更和等价物。因此，应理解的是，所附权利要求书意在涵盖落在本发明真实精神内的所有这些修饰和变更。
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Claims (21)

1.产生表达至少5% PDX1/NKX6.1双阳性的胰细胞或胰细胞前体的方法，包括将定形内胚层细胞暴露于有效量的下列各组化合物中的各至少一种：
a. BMP抑制剂，和
b. 激酶抑制剂，和
c. 视黄酸受体激动剂，
以使定形内胚层细胞分化为胰细胞或胰细胞前体，
其中所述激酶抑制剂为JNK抑制剂II并且与视黄酸受体激动剂AM580组合，其中所述JNK抑制剂II为具有或不具有N-烷基化的1,9-吡唑并蒽酮的异构体或互变异构体。
2.权利要求1的方法，其中所述BMP抑制剂为LDN-193189。
3.权利要求1的方法，其中所述激酶抑制剂和视黄酸受体激动剂与bFGF组合。
4.权利要求1的方法，其中所述激酶抑制剂和视黄酸受体激动剂与FGF7或FGF10组合。
5.权利要求1的方法，包括将定形内胚层细胞暴露于有效量的无bFGF的LDN-193189的第一步骤，和在bFGF存在下暴露于JNK抑制剂II与AM580组合的第二步骤。
6.权利要求1的方法，包括将定形内胚层细胞暴露于有效量的LDN-193189，随后暴露于由以下组成的组中的至少一种化合物：
wnt抑制剂，和/或
hedgehog抑制剂。
7.权利要求6的方法，其中所述wnt抑制剂为IWP2。
8.权利要求6的方法，其中所述hedgehog抑制剂为环巴胺。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述胰细胞或胰细胞前体为至少5%PDX1/NKX6.1双阳性。
10.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述胰细胞或胰细胞前体为至少10%PDX1/NKX6.1双阳性。
11.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述胰细胞或胰细胞前体为10-30%PDX1/NKX6.1双阳性。
12.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述胰细胞或胰细胞前体为10-40%PDX1/NKX6.1双阳性。
13.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述胰细胞或胰细胞前体为5-70%PDX1/NKX6.1双阳性。
14.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述胰细胞或胰细胞前体为10-80%PDX1/NKX6.1双阳性。
15. 权利要求1-8中任一项的方法，其中所述胰细胞或胰细胞前体为5-100% PDX1/NKX6.1双阳性。
16.产生胰细胞或胰细胞前体的方法，其将定形内胚层细胞体外暴露于靶向JNK1、2或3的激酶抑制剂而产生，其中所述靶向JNK1、2或3的激酶抑制剂为JNK抑制剂II。
17.权利要求16的方法，其中定形内胚层细胞还暴露于下列化合物的至少一种：
LDN-193189，
Wnt抑制剂，
hedgehog抑制剂，
视黄酸受体激动剂；
其中所述JNK抑制剂II为具有或不具有N-烷基化的1,9-吡唑并蒽酮的异构体或互变异构体。
18.权利要求16的方法，其中将定形内胚层细胞暴露于JNK抑制剂II与表2中所列视黄酸受体激动剂的组合，其中所述JNK抑制剂II为具有或不具有N-烷基化的1,9-吡唑并蒽酮的异构体或互变异构体。
19.JNK抑制剂II化合物从胰内胚层前体诱导胰细胞或胰细胞前体的用途，其中所述JNK抑制剂II为具有或不具有N-烷基化的1,9-吡唑并蒽酮的异构体或互变异构体。
20.JNK抑制剂II和LDN-193189组合从胰内胚层前体诱导胰细胞或胰细胞前体的用途，其中所述JNK抑制剂II为具有或不具有N-烷基化的1,9-吡唑并蒽酮的异构体或互变异构体。
21.JNK抑制剂II与视黄酸受体激动剂组合从胰内胚层前体诱导胰细胞或胰细胞前体的用途，其中所述JNK抑制剂II为具有或不具有N-烷基化的1,9-吡唑并蒽酮的异构体或互变异构体。
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