JP6230582B2 - 細胞又は組織の凍結保存用治具および凍結保存方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞又は組織などを凍結保存する際に使用する凍結保存用治具、およびこれを用いた凍結保存方法に関する。

細胞又は組織の優れた保存技術は、様々な産業分野で求められている。例えば、牛の胚移植技術においては、胚を凍結保存し、受胚牛の発情周期に合わせて胚を融解し、移植することが行われている。また、ヒトの不妊治療においては、母体から卵子又は卵巣を採取後、移植に適したタイミングに合わせるために凍結保存しておき、移植時に融解して用いることがなされている。

一般に、生体内から採取された細胞又は組織は、たとえ培養液の中であっても、次第に活性が失われていくことから、生体外での細胞又は組織の長期間の培養は好ましくない。そのため、生体活性を失わせずに長期間保存するための技術が重要である。優れた保存技術によって、採取された細胞又は組織をより正確に分析することが可能になる。また優れた保存技術によって、より高い生体活性を保ったまま細胞又は組織を移植に用いることが可能となり、移植後の生着率が向上することが望める。さらには、生体外で培養した培養皮膚、生体外で構築したいわゆる細胞シートのような移植のための人工の組織を、順次生産して保存しておき、必要なときに使用することも可能となり、医療の面だけではなく、産業面においても大きなメリットが期待できる。

細胞又は組織の保存方法として、例えば緩慢凍結法が知られている。この方法では、まず、例えばリン酸緩衝生理食塩水等の生理的溶液に耐凍剤を含有させることで得られた保存液に、細胞又は組織を浸漬する。該耐凍剤としては、グリセロール、エチレングリコール等の化合物が用いられる。該保存液に、細胞又は組織を浸漬後、比較的遅い冷却速度（例えば０．３〜０．５℃／分の速度）で、−３０〜−３５℃まで冷却することにより、細胞内外又は組織内外の溶液が十分に冷却され、粘性が高くなる。このような状態で、該保存液中の細胞又は組織をさらに液体窒素の温度（−１９６℃）まで冷却すると、細胞内又は組織内とその外の周囲の微少溶液がいずれも非結晶のまま固体となるガラス化が起こる。ガラス化により、細胞内外又は組織内外が固化すると、実質的に分子の動きがなくなるので、ガラス化された細胞又は組織を液体窒素中に保存することで、半永久的に保存できると考えられる。

しかしながら、前記緩慢凍結法では、比較的遅い冷却速度で冷却する必要があるために、凍結保存のための操作に時間を要する。また、温度制御をするための装置又は治具を必要とする問題がある。加えて、前記緩慢凍結法では、細胞外又は組織外の保存液中に氷晶が形成されるので、細胞又は組織が該氷晶により物理的に損害を受けるおそれがある。

前記緩慢凍結法での問題点を解決するための方法として、ガラス化保存法が提案されている。ガラス化保存法とは、グリセロール、エチレングリコール、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）などの耐凍剤を多量に含む水溶液の凝固点降下により、氷点下でも氷晶ができにくくなる原理を用いたものである。この水溶液を急速に液体窒素中で冷却させると氷晶を生じさせないまま固体化させることができる。このように固体化することをガラス化凍結という。また、耐凍剤を多量に含む水溶液をガラス化液という。

前記ガラス化法の具体的な操作としては、ガラス化液に細胞又は組織を浸漬させ、その後、液体窒素の温度（−１９６℃）で冷却する。ガラス化法は、このような簡便かつ迅速な工程であるために、凍結保存のための操作に長い時間を必要としない他、温度制御をするための装置又は治具を必要としないという利点がある。

ガラス化保存法を用いると、細胞内外のいずれにも氷晶が生じないために凍結時及び融解時の細胞への物理的障害（凍害）を回避することができるが、ガラス化液に含まれる高濃度の耐凍剤には化学的毒性がある。このため、細胞又は組織の凍結保存時には細胞又は組織周囲に存在するガラス化液が少ない方が好ましく、細胞がガラス化液に暴露される時間、つまりは凍結までの時間が短時間であることが好ましい。さらには、解凍後ただちにガラス化液を希釈する必要がある。

ガラス化保存法を用いた細胞又は組織の凍結保存については、様々な方法で、様々な種類の細胞又は組織を用いた例が示されている。例えば、特許文献１では、動物又はヒトの生殖細胞又は体細胞へのガラス化保存法の適用が凍結保存及び融解後の生存率の点で、極めて有用であることが示されている。

ガラス化保存法は、主にヒトの生殖細胞を用いて発展してきた技術であるが、最近では、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞への応用も広く検討されている。また、非特許文献１では、ショウジョウバエの胚の保存にガラス化保存法が有効であったことが示されている。さらに、特許文献２では、植物培養細胞や組織の保存において、ガラス化保存法が有効であることが示されている。このように、ガラス化法は広く様々な種の細胞及び組織の保存に有用であることが知られている。

特許文献３、特許文献４では、ヒトの不妊治療分野で使用されているいわゆるクライオトップ法という方法で、卵付着保持用ストリップとして短冊状の可撓性かつ無色透明なフィルムを使用した卵凍結保存用具を使用して、顕微鏡観察下で該フィルム上に極少量のガラス化液と共に卵子又は胚を載置し、凍結保存する方法が提案されている。

特許文献５では、卵子又は胚をガラス化液と共にガラス化保存液除去材の上に載置し、下部から吸引することで卵子又は胚の周囲に付着した余分なガラス化液を除き、優れた生存率で凍結保存させる方法が提案されている。なお、ガラス化保存液除去材としては、金網、紙などの天然物や合成樹脂からなるフィルム状物で貫通孔を有したものが記載されている。また余分なガラス化液を除き、また細胞を載置する際の作業性を向上することが可能な凍結保存用治具として、例えば、特定のヘーズ値を有するガラス化液吸収体を有するガラス化凍結保存用治具が特許文献６に記載されている。

一方、特許文献７には細胞を培地とともに保存する際に用いられる細胞保存容器に関し、該容器の内面が、細胞が付着しにくい材料で形成された容器、具体的には容器の内面に親水性材料や疎水性材料等が結合または被覆された容器により、保存中における容器壁面への細胞の接着を防止できることが記載され、親水性材料としてアクリルアミド系重合体やポリビニルアルコール等が例示され、疎水性材料としてフッ素樹脂やシリコーン樹脂が例示されている。

特許第３０４４３２３号公報 特開２００８−５８４６号公報 特開２００２−３１５５７３号公報 特開２００６−２７１３９５号公報 国際公開第２０１１／０７０９７３号パンフレット 特開２０１４−１８３７５７号公報 特開２００４−１８５０４号公報

Ｓｔｅｐｏｎｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４５：１７０−１７２（１９９０）

特許文献３、特許文献４では、卵子又は胚を載置するフィルムの幅を制限することにより、少ない量のガラス化液とともに卵子又は胚を凍結保存し、優れた生存率を得る方法が提案されている。しかしながら、この方法では、作業者の操作によって、極少量のガラス化液とともに卵子又は胚をフィルム上に載置する際に、操作の難度が高いといった問題があった。また、この方法をもとにしたクライオトップ法では、より少ない量のガラス化液と共に卵子又は胚を凍結保存するために、一度ガラス化液と共に卵子又は胚をフィルム上に載せた後に、余分なガラス化液を吸引してフィルム上から除去するといった煩雑な操作がされることもある。さらに、卵子又は胚を凍結後に融解する際、しばしばフィルム上の卵子又は胚がフィルム上に固着してしまい、これらを回収する際にも高い技量が要求されるという問題もある。

特許文献５では、卵子又は胚の周囲に付着した余分なガラス化液を除くことにより、優れた生存率でこれらの生殖細胞を凍結保存させる方法が提案されている。しかしながら、上記公報記載の方法では、余分なガラス化液を除く際に、下部からの吸引操作を必要とするため、煩雑な操作となり、短時間でガラス化凍結保存操作を行う場合には不向きである。さらには、下部からの吸引が不十分であると余分なガラス化液が残存する問題がある。また、特許文献３、特許文献４と同様に、凍結後に融解する際、卵子又は胚がフィルム上に固着してしまい、回収する際にも高い技量が要求されるという問題もある。特許文献６では、卵子又は胚の周囲に付着した余分なガラス化液を作業者が除く必要はなく、良好な作業性が得られるものの、ガラス化液吸収体がガラス化液を吸収する際に、卵子又は胚は、ガラス化液吸収体にとりわけ強固に固着することから、卵子又は胚を回収する際にとりわけ高い技量が要求されるという問題があった。

本発明は、細胞又は組織の凍結保存作業を容易にかつ確実に行うことが可能な、細胞又は組織の凍結保存用治具を提供することを主な課題とする。より具体的には、細胞又は組織をガラス化液等の保存液に浸漬し、細胞又は組織を保存液と共に該凍結保存用治具に載置して凍結保存した後、該細胞又は組織を融解する際に、細胞又は組織を容易に剥離、回収することができる凍結保存用治具を提供することを第一の課題とする。また、前記した細胞又は組織を容易に回収できることに加え、ガラス化液等の保存液の優れた吸収性を有する凍結保存用治具を提供することを第二の課題とする。更には、凍結保存後の細胞又は組織を容易に剥離、回収することができる凍結保存方法を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、以下の構成を有する細胞又は組織の凍結保存用治具（本明細書中、「細胞又は組織の凍結保存用治具」を、単に「凍結保存用治具」ともいう）によって、上記課題を解決できることを見出した。

（１）細胞又は組織を載置する載置部の最表面に、水溶性高分子化合物を含有する層を有し、該水溶性高分子化合物を含有する層は融解液に対して可溶性であり、かつ乾燥された層であることを特徴とする細胞又は組織の凍結保存用治具。
（２）上記水溶性高分子化合物が、エタンジオール基を有するポリビニルアルコールおよびエチレンオキサイド基を有するポリビニルアルコールから選択される少なくとも１種類であることを特徴とする、上記（１）に記載の細胞又は組織の凍結保存用治具。
（３）上記水溶性高分子化合物が、ケン化度が９４ｍｏｌ％以下のポリビニルアルコールであることを特徴とする、上記（１）に記載の細胞又は組織の凍結保存用治具。
（４）上記水溶性高分子化合物を含有する層が更にコロイダルシリカを含有することを特徴とする、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の細胞又は組織の凍結保存用治具。
（５）上記載置部が保存液吸収体を有し、該保存液吸収体上に上記水溶性高分子化合物を含有する層を有することを特徴とする、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の細胞又は組織の凍結保存用治具。
（６）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の細胞又は組織の凍結保存用治具の載置部上に、保存液に浸漬した細胞又は組織を保存液と共に載置し、細胞又は組織を載置部に保持した状態で凍結保存用治具を液体窒素の中に浸漬することにより細胞又は組織を凍結し、その後、凍結した細胞または組織を該凍結保存用治具と共に融解液中に浸漬し、該細胞または組織を融解することを特徴とする、細胞又は組織の凍結保存方法。
（７）上記保存液が、保存液の全質量に対して１０質量％以上の耐凍剤を含むガラス化液であることを特徴とする、上記（６）に記載の細胞又は組織の凍結保存方法。

上記（１）の発明によれば、細胞又は組織の凍結保存作業において、凍結した細胞又は組織を融解する際に、細胞又は組織を容易に回収することができる凍結保存用治具を提供することができる。上記（２）〜（４）の発明によれば、凍結した細胞又は組織を融解する際に、細胞又は組織をとりわけ容易に回収することができる凍結保存用治具を提供することができる。上記（５）の発明によれば、上記した効果に加えて、細胞又は組織を凍結保存用治具の載置部に載置する際、細胞又は組織の外周に付着した余分な保存液を保存液吸収体が吸収することから、余分な保存液を除くためのその他の操作（例えば、保存液吸収体下部からの吸引除去操作や、マイクロピペット等を用いた細胞又は組織周囲からの直接的な吸引除去操作）を特に必要とせずに、細胞又は組織の凍結保存作業を容易かつ簡便に行うことが可能な、細胞又は組織の凍結保存用治具を提供することができる。上記（６）および（７）の発明によれば、凍結保存後の細胞又は組織を容易に剥離、回収することができる凍結保存方法を提供することができる。

図１は、本発明の細胞又は組織の凍結保存用治具の一例を示す全体図である。 図２は、図１中の載置部の一例の断面構造概略図である。 図３は、図１に示した載置部が保存液吸収体を有する場合の一例を示す断面構造概略図である。 図４は、図１に示した載置部が保存液吸収体を有する場合の別の一例を示す断面構造概略図である。 図５は、図１に示した載置部が保存液吸収体を有する場合の別の一例を示す断面構造概略図である。 図６は、載置部の表面層が無機微粒子を含有する場合の断面構造概略図の一例である。 図７は、載置部の表面層が無機微粒子を含有する場合の断面構造概略図の別の一例である。 図８は、載置部が保存液吸収体を有し、表面層が無機微粒子を含有する場合の一例を示す断面構造概略図である。 図９は、載置部が保存液吸収体を有し、表面層が無機微粒子を含有する場合の別の一例を示す断面構造概略図である。 図１０は実施例２４の凍結保存用治具の載置部表面の走査型電子顕微鏡観察画像である。

本発明の凍結保存用治具は、細胞又は組織を凍結保存する際に用いられるものである。本明細書中で細胞とは、単一の細胞のみならず、複数の細胞からなる生物の細胞集団を含むものである。複数の細胞からなる細胞集団とは単一の種類の細胞から構成される細胞集団でも良いし、複数の種類の細胞から構成される細胞集団でも良い。また、組織とは、単一の種類の細胞から構成される組織でも良いし、複数の種類の細胞から構成される組織でも良く、細胞以外に細胞外マトリックスのような非細胞性の物質を含むものでも良い。

本発明の凍結保存用治具は、凍結保存操作に用いるものであり、好ましくはガラス化凍結保存操作に用いるものである。このため本発明の凍結保存用治具は、細胞又は組織のガラス化凍結保存用治具として好適に使用される。詳細には、本発明の凍結保存用治具は、細胞又は組織が載置された凍結保存用治具を液体窒素等の冷却溶媒に浸漬し凍結させるためのものである。また凍結保存用治具上に載置された細胞又は組織を融解する際には、細胞又は組織を凍結保存用治具と共に冷却媒体から取り出し、融解液中に浸漬させて融解する。本発明の凍結保存用治具を用いて凍結保存操作を行う場合、細胞又は組織は、通常、保存液と共に載置部の水溶性高分子化合物を含有する層上に載置される。本発明の凍結保存用治具を用いると、細胞又は組織を載置した際にこれを確実に保持することができ、また融解時には容易に細胞又は組織を回収できることから、細胞又は組織の凍結保存にかかる作業を容易にかつ確実に行うことができる。本発明の凍結保存用治具は、細胞又は組織の凍結保存用具、細胞又は組織の保存用具、細胞又は組織の凍結保存器具、細胞又は組織の保存用器具と言い換えることができる。

本発明の凍結保存用治具は、細胞又は組織を載置する載置部の最表面に、水溶性高分子化合物を含有する層（以下、本発明における表面層あるいは単に表面層とも記載）を有する。かかる表面層は融解液に対して可溶性であることが好ましい。ここで可溶性とは２５℃の融解液に対する表面層の溶解度が０．２質量％以上であることを意味する。本発明の凍結保存用治具は上述の通り、凍結操作時に、細胞又は組織を保存液と共に凍結保存用治具の水溶性高分子化合物を含有する層上に載置した後に、冷媒（例えば液体窒素）に浸漬、凍結し、融解時には、凍結した細胞又は組織を凍結保存用治具と共に取り出し、融解液中に浸漬して融解するものであるが、細胞又は組織を融解する際に、水溶性高分子化合物を含有する層の全体又は一部が融解液中に溶解することにより、細胞又は組織が凍結保存用治具の載置部に固着することなく、容易に剥離・回収することが可能となる。

本発明においては、上記載置部が保存液吸収体を有することが好ましく、該保存液吸収体上に上記水溶性高分子化合物を含有する層（表面層）を有することが好ましい。
本発明の凍結保存用治具の載置部が保存液吸収体を有し、更に該載置部の最表面に本発明における表面層を有する場合には、上記効果に加えて、該保存液吸収体が余分な保存液を吸収するので、余分な保存液を除くためのその他の操作を特に必要とせず、作業性が格段に向上する。また、そのように操作された細胞又は組織は極少量の保存液に覆われており、凍結作業する場合でも速やかに凍結状態にすることができる。さらに、前記したガラス化凍結法においては、保存液が多量の耐凍剤を含有することによる化学的毒性が問題となるが、載置部が保存液吸収体を有する凍結保存用治具によれば、載置された細胞又は組織周辺のガラス化液が極少量となることで、細胞又は組織の生存率の向上が期待できる。載置部が保存液吸収体を有する場合、保存液吸収体と表面層との間に、別の層を有さないことが好ましい。

以下に、本発明の凍結保存用治具の構成を説明する。

本発明の凍結保存用治具は、細胞又は組織を載置する載置部の最表面に、水溶性高分子化合物を含有する層を有する。ここで細胞又は組織を載置する載置部の最表面とは、細胞又は組織が保存液と共に載置される表面部分に相当する。本発明において載置部は、本発明における表面層を、各種樹脂フィルム、金属、ガラス、ゴム等の非吸収性支持体上や、保存液吸収体上に有することが好ましく、特に保存液吸収体上に本発明における表面層を有することが好ましい。なお、本発明において該表面層は、細胞又は組織を載置する載置部全体において均一な層を形成していなくても良く、例えば海島状やストライプ状の層であっても良い。すなわち、本発明における表面層は、細胞又は組織を保存液と共に載置する箇所の最表面に存在することが重要であり、細胞又は組織が載置されない箇所においては、該表面層が存在していても、存在していなくても良い。このように載置部は、表面層をその最表面全体に有してもよく、最表面の一部に有してもよい。

本発明において表面層が含有する水溶性高分子化合物としては、例えば、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース等のセルロース誘導体、デンプンおよびその誘導体、ゼラチン、カゼイン、アルギン酸およびその塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、スチレン・マレイン酸共重合体塩、スチレン・アクリル酸共重合体塩等が挙げられる。中でも、アルギン酸およびその塩やゼラチンは保存液に対する溶解性と適度な被膜形成作用が得られることから好ましく、ポリビニルアルコールは、非生物由来素材であり、かつ細胞又は組織に対しても低毒性であるため、特に好ましい。これらの水溶性高分子化合物は、単独で用いても良いし、２種類以上を併用しても良い。また表面層は、融解液に対する溶解度が１０質量％を下回らない範囲で、架橋剤を含有することができる。なお、本発明の水溶性高分子化合物の水溶性とは、２５℃における水に対する溶解量が少なくとも０．５質量％以上であることを意味し、より好ましくは５質量％以上である。

表面層が含有する水溶性高分子化合物の固形分量は、０．０１〜１００ｇ／ｍ^２であることが好ましく、より好ましくは０．１〜１０ｇ／ｍ^２である。水溶性高分子化合物の固形分量が１００ｇ／ｍ^２を超える場合には、融解液中への水溶性高分子化合物の溶出・混入が多くなり、好ましくない。一方で、水溶性高分子化合物の固形分量が０．０１ｇ／ｍ^２を下回る場合には、融解する際に、細胞又は組織を容易に剥離できない場合がある。

本発明において表面層は、水溶性高分子化合物としてエタンジオール基を有するポリビニルアルコールおよびエチレンオキサイド基を有するポリビニルアルコールから選択される少なくとも１種類を含有することが好ましい。エタンジオール基を有するポリビニルアルコールおよびエチレンオキサイド基を有するポリビニルアルコールは、その被膜の優れた親水性、適度な強度、適度な溶解性が奏功し、融解作業の際に、細胞又は組織が載置部に固着することなく、とりわけ容易に剥離・回収することが可能となる。エタンジオール基を有するポリビニルアルコールおよびエチレンオキサイド基を有するポリビニルアルコールは、様々なケン化度の該ポリビニルアルコールを用いることができるが、細胞又は組織の良好な剥離性が得られる観点から、これらポリビニルアルコールのケン化度は９４ｍｏｌ％以下であることが好ましい。また、これらの該ポリビニルアルコールは、単独で用いても良いし、２種類以上を併用しても良い。エタンジオール基を有するポリビニルアルコールおよびエチレンオキサイド基を有するポリビニルアルコールは、例えば日本合成化学工業（株）から市販されるものを入手し、使用することができる。

表面層が、エタンジオール基を有するポリビニルアルコールおよびエチレンオキサイド基を有するポリビニルアルコールから選択される少なくとも１種類のポリビニルアルコールを含有する場合、かかる表面層は、その他の水溶性高分子化合物を一又は二種類以上含有することができる。該水溶性高分子化合物としては、例えば、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース等のセルロース誘導体、デンプンおよびその誘導体、ゼラチン、カゼイン、アルギン酸およびその塩、エタンジオール基およびエチレンオキサイド基を有さないポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、スチレン・マレイン酸共重合体塩、スチレン・アクリル酸共重合体塩等が挙げられる。その他の水溶性高分子化合物の含有量は、エタンジオール基を有するポリビニルアルコールおよびエチレンオキサイド基を有するポリビニルアルコールから選択される少なくとも１種類のポリビニルアルコールの固形分量に対して、５０質量％以下であることが好ましい。

本発明において表面層は、水溶性高分子化合物としてケン化度が９４ｍｏｌ％以下のポリビニルアルコールを含有することが好ましい。ケン化度が９４ｍｏｌ％以下のポリビニルアルコールの被膜を表面層として用いることで、優れた細胞又は組織の剥離性が得られることから、融解作業の際に、細胞又は組織が載置部に固着することなく、容易に回収することが可能となる。さらに、ケン化度が８１ｍｏｌ％以下のポリビニルアルコールを選択することで、あるいはケン化度が９４ｍｏｌ％以下でかつ、重合度が４００以下であるポリビニルアルコールを選択することで、細胞又は組織の剥離性にとりわけ優れた凍結保存用治具を得ることができる。これらの該ポリビニルアルコールは、単独で用いても良いし、２種類以上を併用しても良い。

表面層が、ケン化度が９４ｍｏｌ％以下のポリビニルアルコール含有する場合、かかる表面層は、その他の水溶性高分子化合物を一又は二種類以上含有することができる。該水溶性高分子化合物としては、例えば、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース等のセルロース誘導体、デンプンおよびその誘導体、ゼラチン、カゼイン、アルギン酸およびその塩、ケン化度が９４ｍｏｌ％を超えるポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、スチレン・マレイン酸共重合体塩、スチレン・アクリル酸共重合体塩等が挙げられる。その他の水溶性高分子化合物の含有量は、ケン化度が９４ｍｏｌ％以下のポリビニルアルコールの固形分量に対して、５０質量％以下であることが好ましい。

本発明において表面層は、上記した水溶性高分子化合物に加え、更に無機微粒子を含有することが好ましい。無機微粒子は表面層の親水性を低下させず、また表面層に微細な凹凸を形成し載置部と細胞又は組織の接触面積を低下させることが可能となるため、細胞又は組織が凍結保存用治具の載置部に固着することなく、より容易に剥離・回収することが可能となる。

かかる無機微粒子としては、例えば軽質炭酸カルシウム、重質炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、カオリン、二酸化チタン、酸化亜鉛、水酸化亜鉛、珪酸カルシウム、珪酸マグネシウム、非晶質合成シリカ、アルミナ、アルミナ水和物、水酸化マグネシウム等が挙げられる。かかる無機微粒子の平均粒子径（一次粒子が凝集して二次凝集体を形成している無機微粒子では平均二次粒子径、二次粒子を形成しない無機微粒子においては平均一次粒子径）は１μｍ以下が好ましく、より好ましくは６００ｎｍ以下である。無機微粒子の平均粒子径の下限は特に限定されないが、６ｎｍ以上であることが好ましい。平均粒子径は、例えば、一次粒子が凝集して二次凝集体を形成している無機微粒子であれば、レーザー散乱式の粒度分布計（例えば、堀場製作所製、ＬＡ９１０）を用いて個数メジアン径として求めることができる。また二次粒子を形成しない無機微粒子であれば、一次粒子径が判別できるまで分散された粒子の電子顕微鏡写真より一定面積内に存在する１００個の粒子の平均粒子径として求めることができる。中でも一次粒子同士は凝集せず、二次粒子を形成しない無機微粒子（以下、単一粒子分散性の無機微粒子という。）は、載置部における細胞又は組織との接触面積が比較的小さくなることから好ましい。このような観点から、コロイダルシリカが好適である。コロイダルシリカは、例えば日産化学工業（株）からスノーテックス（登録商標）として市販されている。また、ＧＥヘルスケア・ジャパン（株）から市販されているパーコール（商品名）のような、ポリビニルピロリドンを粒子表面に被覆したようなコロイダルシリカも好ましく用いることができる。

本発明において、載置部が後述する保存液吸収体を有する場合には、該保存液吸収体が有する細孔を無機微粒子が閉塞することなく、載置部の最表面に水溶性高分子化合物及び無機微粒子を含有する層を設けることが好ましい。このため無機微粒子の粒子径は保存液吸収体が有する細孔径よりも大きくすることもできるし、また保存液吸収体の吸収性が著しく減少しない範囲であれば、保存液吸収体の細孔内部に、無機微粒子が存在することも可能である。

本発明の凍結保存用治具が有する無機微粒子の固形分量としては、０．０１〜１００ｇ／ｍ^２であることが好ましく、より好ましくは０．１〜１０ｇ／ｍ^２である。無機微粒子の固形分量が１００ｇ／ｍ^２を超える場合には、融解液中への無機微粒子の溶出・混入が多くなり、好ましくない。一方で、無機微粒子の固形分量が０．０１ｇ／ｍ^２を下回る場合には、融解する際に、細胞又は組織を容易に剥離できない場合がある。

本発明において表面層が上記した水溶性高分子化合物に加え更に無機微粒子を含有する場合、水溶性高分子化合物に対する無機微粒子の含有比率（無機微粒子の合計質量／水溶性高分子化合物の合計質量）は１〜１００であることが好ましく、より好ましくは、１．６７〜５０である。水溶性高分子化合物に対する無機微粒子の含有比率をこのような範囲にすることにより、載置部の表面（該表面層）は適度な凹凸を維持でき、融解作業時に容易に細胞又は組織を回収することができる。また、例えば、凍結保存用治具使用前の無機微粒子の脱落（粉落ち）や、凍結作業時にガラス化液を滴下した際の無機微粒子の意図しない脱落を抑制することができる。

本発明において載置部は、細胞または組織を凍結保存する際に、これらを支持する目的で支持体を有し、該支持体上に表面層を有することが好ましい。かかる支持体（非吸収性支持体）としては、例えば、各種樹脂フィルム、金属、ガラス、ゴム等が挙げられる。このような支持体は１種類の素材からなるものでも良いし、２種類以上の素材からなるものでも良い。中でも樹脂フィルムは、取り扱いの観点で好適に用いられる。樹脂フィルムの具体例としては、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）やポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）等のポリエステル樹脂、アクリル樹脂、エポキシ樹脂、シリコーン樹脂、ポリカーボネート樹脂、ジアセテート樹脂、トリアセテート樹脂、ポリアクリレート樹脂、ポリ塩化ビニル樹脂、ポリスルフォン樹脂、ポリエーテルスルフォン樹脂、ポリイミド樹脂、ポリアミド樹脂、ポリオレフィン樹脂、環状ポリオレフィン樹脂等からなる樹脂フィルムが挙げられる。また支持体の全光線透過率が８０％以上であると、載置部に載置した細胞又は組織を透過型顕微鏡を用いて容易に確認することができるため好ましい。さらに、温度伝導性に優れ、急速な凍結を可能にするという観点で金属製支持体も好適に用いることができる。金属製支持体の具体例としては、銅、銅合金、アルミニウム、アルミニウム合金、金、金合金、銀、銀合金、鉄、ステンレスなどを挙げることができる。上記した支持体の厚さは１０μｍ〜１０ｍｍであることが好ましい。また、目的に応じて、支持体の表面をコロナ放電処理のような電気的な方法や、化学的な方法により易接着処理することもでき、さらには粗面化することもできる。さらに、支持体と表面層の間に別の層を一又は複数有していても良いし、支持体の表側に表面層を有し、裏側に、別の層を一又は複数有していても良い。また、表面層を支持体の表裏に設けることもできる。支持体は後述する保存液吸収体であっても良い。

次に、本発明の凍結保存用治具が保存液吸収体上に水溶性高分子化合物を含有する層を有する場合について説明する。

前述の通り、本発明の細胞又は組織の載置部が保存液吸収体を有する場合、細胞又は組織に付着した保存液の量が多くても保存液吸収体が保存液を除くことができるため、保存液の除去操作が不要となり作業性が格段に向上する。またそのように操作された細胞又は組織は極少量の保存液に覆われており、凍結操作する場合でも速やかに凍結状態にすることができる。さらに、前記したガラス化凍結法においてはグリセロール、エチレングリコール、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）などの耐凍剤を多量に含む水溶液が保存液として利用され、この保存液には多量の耐凍剤による化学的毒性が存在するが、載置部が保存液吸収体を有する凍結保存用治具によれば、載置された細胞又は組織周辺のガラス化液が極少量となることで、細胞又は組織の生存率の向上が期待できる。したがって載置部が保存液吸収体上に水溶性高分子化合物を含有する層を有する凍結保存用治具は、ガラス化凍結保存用治具として好適である。

本発明において、載置部が保存液吸収体を有する場合には、該保存液吸収体が有する細孔を閉塞することなく、載置部の最表面に表面層を設けることが好ましい。また、保存液吸収体の吸収性が著しく低下しない範囲であれば、保存液吸収体の細孔内部に、表面層が存在することも可能である。

本発明において、載置部が保存液吸収体を有する場合には、表面層の固形分量が多くなるほど、保存液吸収体が有する細孔が狭くなるために、保存液の吸収性は低下する傾向にある。一方、融解作業の際の細胞又は組織の剥離性は、表面層の固形分量が多くなるほど優位である。用いる保存液吸収体の厚み、細孔径、空隙率によるが、載置部が保存液吸収体を有する場合における表面層の固形分量は、上記性能のバランスを考え、適宜調整でき、好ましくは０．１〜５ｇ／ｍ^２である。

本発明の凍結保存用治具が有する保存液吸収体としては、繊維からなるシート、多孔性樹脂シート、多孔性金属シート、および多孔性金属酸化物シート等の各種シートが挙げられる。本発明における「多孔性」とは、上記したシートが表面に気孔（細孔）を有する構造体であることを意味し、シート表面及び内部に連続的な気孔を有する構造体であることがより好ましい。また保存液吸収体（上記した各種シート）の厚みは１０μｍ〜５ｍｍであることが好ましく、より好ましくは２０μｍ〜２．５ｍｍである。保存液吸収体が、薄いシートである場合には、補強部材として前記した非吸収性支持体を用いることができる。

本発明において、保存液吸収体として用いる繊維からなるシートとしては、紙又は不織布が例示され、紙はバインダーなどの結着剤成分の紙全体に占める割合が１０質量％以下である紙が好ましく、より好ましくは５質量％以下であり、更に３質量％以下である紙が好ましい。これにより優れた保存液の吸収性が得られる。また、該紙に含まれる製紙用薬品の紙全体に占める割合は１質量％以下であることが好ましい。通常紙に含まれている製紙用薬品のうち、例えば蛍光増白剤や染料、カチオン系のサイズ剤などには細胞への影響が懸念される場合がある。

繊維からなるシートが紙である場合、密度が０．１〜０．６ｇ／ｃｍ^３であり、坪量が１０〜１３０ｇ／ｍ^２の紙であることが好ましい。特に密度が０．１２〜０．３ｇ／ｃｍ^３であり、坪量が１０〜１００ｇ／ｍ^２である紙は、保存液の吸収性に優れ、さらには、透過型顕微鏡を用いて載置部上に載置した細胞又は組織を観察することができるような、細胞又は組織の視認性に優れた凍結保存用治具を提供することが可能となるため好ましい。

繊維からなるシートが不織布である場合、該不織布が含有する繊維としては、セルロース繊維、セルロース繊維からなる再生繊維であるレーヨン繊維やキュプラ繊維、さらにはセルロース繊維からの半合成繊維であるアセテート繊維、ポリエステル繊維、ナイロン繊維、アクリル繊維、ポリプロピレン繊維、ポリエチレン繊維、ポリ塩化ビニル繊維、ビニリデン繊維、ポリウレタン繊維、ビニロン繊維、ガラス繊維、絹繊維などが挙げられ、これら繊維を各種混合した不織布も用いることができる。中でもセルロース繊維、セルロース繊維由来の繊維でセルロース再生繊維であるレーヨン繊維やキュプラ繊維、更にはセルロース繊維からの半合成繊維であるアセテート繊維が好ましい。

繊維からなるシートが不織布である場合、密度が０．１〜０．４ｇ／ｃｍ^３であり、坪量が１０〜１３０ｇ／ｍ^２の不織布であることが好ましい。特に密度が０．１２〜０．３ｇ／ｃｍ^３であり、坪量が１０〜１００ｇ／ｍ^２である不織布は、保存液の吸収性に優れ、さらには細胞又は組織の視認性に優れた凍結保存用治具を提供することが可能となるため好ましい。

保存液吸収体として用いられる不織布においても前記した紙と同様に、バインダーなどの結着剤成分の不織布に占める割合が１０質量％以下である不織布が好ましく、より好ましくは５質量％以下であり、更に３質量％以下である不織布が好ましい。特に結着剤を含有しない不織布が好ましい。

不織布は紙と異なり様々な製造方法があるが、上記した結着剤成分が低減された不織布としては、スパンボンド法、メルトブロー法で製造された不織布、更には湿式法又は乾式法で繊維を並べて後、水流交絡法又はニードルパンチ法で製造された不織布が好適に使用できる。また上記した通り、本発明において不織布が含有する好ましい繊維としては、セルロース繊維、セルロース繊維由来の繊維でセルロース再生繊維であるレーヨン繊維やキュプラ繊維、更にはセルロース繊維からの半合成繊維であるアセテート繊維が挙げられるが、これら繊維を用いて製造する場合は、湿式法、乾式法関わらず水流交絡法又はニードルパンチ法での製造方法が好適である。

本発明において、保存液吸収体として用いる多孔性樹脂シートとしては、例えば特公昭４２−１３５６０号公報や、特開平０８−２８３４４７号公報に記載される、少なくとも一軸方向に延伸し、樹脂の融点以上に加熱し焼結することで得た微細繊維状構造により多孔質構造を形成した樹脂シート、特開２００９−２３５４１７号公報に記載される、乳化重合又は粉砕等の方法によって得られた熱可塑性樹脂の固体粉末を金型に充填し、加熱、焼結して粉末粒子表面を融着させて冷却することにより、多孔質構造を形成した樹脂シート等が挙げられる。多孔性樹脂シートを保存液吸収体として用いた場合、保存液の吸収性に優れ、さらには細胞又は組織の視認性に優れた凍結保存用治具を提供することが可能となるため、好ましい。

上記した多孔性樹脂シートを形成する樹脂としては、低密度ポリエチレン、高密度ポリエチレン、超高分子ポリエチレン等の各種ポリエチレンやポリプロピレン、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレンやポリビニリデンジフロライド等のフッ素樹脂、エチレン−酢酸ビニル共重合体、ポリアミド、スチレン−アクリロニトリル共重合体、スチレン−ブタジエン−アクリロニトリル三元共重合体、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル等が挙げられる。中でもポリテトラフルオロエチレンやポリビニリデンジフロライド等のフッ素樹脂は、細胞又は組織をガラス化液等の保存液と共に載置部に載置した場合、該多孔性樹脂シートの透明性が高くなり、透過顕微鏡観察下での細胞又は組織の視認性が飛躍的に高まり、細胞又は組織の視認性にとりわけ優れた凍結保存用治具を提供することが可能となるため好適である。また多孔性樹脂シートとしては、理化学実験用途や研究用途として市販されている、濾過用のメンブレンフィルターも使用できる。

本発明において、保存液吸収体として用いる多孔性金属シートとしては、銅、銅合金、アルミニウム、アルミニウム合金、金、金合金、銀、銀合金、錫、亜鉛、鉛、チタン、ニッケル、ステンレス等の金属からなる多孔性金属シートが挙げられる。また多孔性金属酸化物シートとしては、シリカ、アルミナ、ジルコニウム、石英ガラスなどの金属酸化物からなる多孔性金属酸化物シートを好ましく利用することができる。また多孔性金属シートおよび多孔性金属酸化物シートは、上記した金属および金属酸化物をそれぞれ２種類以上含有する多孔性シートであっても良い。中でも多孔性金属酸化物シートは、細胞又は組織の視認性に優れた凍結保存用治具を提供することが可能となるため、好ましい。

本発明において、保存液吸収体として用いる多孔性金属シート、および多孔性金属酸化物シートの製造方法としては、一般に知られた方法を使用することができる。ガラス化液吸収体が多孔性金属シートの場合には、粉末冶金法、スペーサー法などの方法を使用することができる。また、樹脂射出成型と粉末冶金法を組み合わせた所謂パウダースペースホルダー法も好ましく使用できる。例えば、国際公開第２００６／０４１１１８号パンフレットや特許第４５７８０６２号公報に記載された方法などを用いることができる。より具体的には、金属粉末とスペーサーとなる樹脂を混合後、圧力をかけて成型した後、高温環境下で焼成することで、金属粉末を焼き固め、スペーサーとなる樹脂を気化させて、多孔性金属シートを得ることができる。パウダースペースホルダー法等を用いる場合には、金属粉末とスペーサーとなる樹脂に加えて、樹脂のバインダーを混合することができる。また、金属粉末を高温で加熱した後に、ガスを注入して空隙を作製する発泡溶融法、ガス膨張法などの金属多孔質体の製造方法も使用することができる。さらには、発泡剤を用いて金属多孔質体を製造するスラリー発泡法のような製造方法も使用することができる。保存液吸収体が多孔性金属酸化物シートの場合には、例えば、特開２００９−２９６９２号公報や特開２００２−１６０９３０号公報に記載された方法などを用いることができる。

上記した多孔性樹脂シート、多孔性金属シート、および多孔性金属酸化物シート等の多孔質体の表面は、表面層との親和性を高めるために、親水化処理することもできる。親水化処理の方法としては、グラフト改質法、非溶出性の親水性物質を塗布することによるコーティング法、コロナ放電、プラズマ処理、エキシマレーザー等の各種エネルギーを用いた一般的な表面改質方法を使用することができる。

保存液吸収体が、上記した多孔性樹脂シート、多孔性金属シート、および多孔性金属酸化物シート等の多孔質体である場合には、該多孔質体の細孔径は、０．０２〜１３０μｍであることが好ましく、より好ましくは０．０５〜６０μｍである。細孔径が０．０２μｍ未満の範囲では、保存液の滴下時に保存液の吸収性能が十分でない場合がある。また、多孔性シートの製造が難しいという問題がある。一方、細孔径が１３０μｍを超える範囲では、保存液の吸収性能が十分でない場合がある。なお、多孔質体の細孔径は、多孔性樹脂シートの場合には、バブルポイント試験により測定される最も大きい細孔の直径である。また多孔性金属シートおよび多孔性金属酸化物シートの場合には、該多孔質体の表面及び断面の画像観察から測定した平均細孔直径である。

保存液吸収体の空隙率は２０容量％以上であることが好ましく、より好ましくは３０容量％以上である。また保存液吸収体が、上記した多孔性樹脂シート、多孔性金属シート、および多孔性金属酸化物シート等の多孔質体である場合、多孔質体の内部の気孔は、厚み方向のみならず、厚み方向に対して垂直な方向に対しても連続的な構造であることが好ましい。このような構造を有すると、多孔質体内部の気孔を有効に用いることができるために、保存液の高い吸収性能が得られる。保存液吸収体の厚み、多孔質体の空隙率は、用いる細胞又は組織の種類や細胞又は組織と共に滴下される保存液の滴下量等に応じて、適宜選択することができる。

上記した空隙率とは、以下の式で定義される。ここで空隙容量Ｖは水銀ポロシメーター（測定器名称 Ａｕｔｏｐｏｒｅ ＩＩ ９２２０ 製造者 ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用い測定・処理された、保存液吸収体における細孔半径３ｎｍから４００ｎｍまでの累積細孔容積（ｍｌ／ｇ）に、保存液吸収体の乾燥固形分量（ｇ／平方メートル）を乗ずることで、単位面積（平方メートル）当たりの数値として求めることができる。また保存液吸収体の厚みＴは保存液吸収体の断面を電子顕微鏡で撮影し測長することで得ることができる。
Ｐ＝（Ｖ／Ｔ）×１００（％）
Ｐ：空隙率（％）
Ｖ：空隙容量（ｍｌ／ｍ^２）
Ｔ：厚み（μｍ）

載置部が保存液吸収体に加えて補強部材として非吸収性支持体を有する場合には、保存液吸収体と非吸収性支持体との間に、接着層を設けることができる。接着層としては、湿気硬化性の接着物質に代表されるような瞬間接着組成物、ホットメルト接着組成物、光硬化性接着組成物などを含有することが可能であり、例えば、ポリビニルアルコール、ヒドロキシセルロース、ポリビニルピロリドン、澱粉糊のような水溶性高分子化合物、酢酸ビニル系樹脂、アクリル系樹脂、エポキシ系樹脂、ウレタン系樹脂、エラストマー系樹脂、シアノアクリレート系樹脂、フッ素系樹脂、シリコーン系樹脂、ニトロセルロース系樹脂、ニトリルゴム系樹脂、スチレン−ブタジエン系樹脂、ユリア系樹脂、スチレン系樹脂、フェノール系樹脂、ポリイミド系樹脂、ポリアミド系樹脂、ポリエステル系樹脂、ビスマレイミド系樹脂、オレフィン系樹脂、ＥＶＡ系樹脂などの非水溶性樹脂を含有する組成物が好ましく利用できる。接着層は、一種類の樹脂を含有しても良いし、複数種類の樹脂を含有しても良い。接着層の固形分量は、０．０１〜１００ｇ／ｍ^２の範囲が好ましく、更に０．１〜５０ｇ／ｍ^２の範囲がより好ましい。

本発明の凍結保存用治具が有する載置部の面積は、細胞又は組織と共に滴下される保存液の滴下量等に応じて適宜設定すれば良く、特に限定されないが、例えば、滴下する保存液１μＬにつき１ｍｍ^２以上とすることが好ましく、２〜４００ｍｍ^２とすることがより好ましい。また、同一の凍結保存用治具において、載置部が、非吸収性支持体上に保存液吸収体を複数有する形態である場合には、連続している１つの保存液吸収体部分が前記した面積であることが好ましい。

本発明における載置部の製造方法は特に限定されないが、例えば、支持体上又は保存液吸収体上に表面層を有する載置部は、支持体上又は保存液吸収体上に表面層を形成することにより得ることができる。本発明における表面層の形成方法は特に限定されない。例えば、水溶性高分子を含有する塗布液を支持体又は保存液吸収体に塗布した後、その後に乾燥を行うことにより、支持体上又は保存液吸収体上に表面層を形成することができる。表面層が無機微粒子を含む場合には、水溶性高分子及び無機微粒子を含有する塗布液を用いて表面層を形成すればよい。塗布液は、水、有機溶媒等の溶剤等を含んでもよい。塗布液を塗布する方法も特に限定されず、適宜選択すればよい。

以上、本発明の凍結保存用治具の載置部について説明してきた。本発明の凍結保存用治具は、載置部と共に把持部を有していても良い。把持部を有すると、凍結保存作業時及び融解作業時の作業性が良好となるため、好ましい。

図１は本発明の細胞又は組織の凍結保存用治具の一例を示す全体図である。図１において凍結保存用治具７は、把持部１と載置部２から構成される。

把持部は耐液体窒素素材であることが好ましい。このような素材としては、例えばアルミ、鉄、銅、ステンレス合金などの各種金属、ＡＢＳ樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリエチレン樹脂、フッ素系樹脂や各種エンジニアプラスチック、更にはガラスなどを好適に用いることができる。図１中、把持部１は円柱形であるが、その形状は任意である。また、後述するように、細胞又は組織を直接液体窒素に接触させないことを目的に、凍結前に細胞又は組織を付着させた載置部２にキャップを被せることがあるが、この場合、把持部１を、載置部２を有さない側から、載置部２を有する側に向かって、円柱の径が連続的に小さくなる形状とすることで、キャップを被せる際の作業性を向上させることも可能である。載置部２の形状は、ハンドリング上、短冊状又はシート状であることが好ましい。

図１の把持部１と載置部２の接続方法について説明する。把持部１が樹脂の場合、例えば、成形加工するときにインサート成形により載置部２を把持部１に接続することができる。更に、把持部１に図示しない構造体挿入部を作製して接着剤にて載置部２を接続することができる。接着剤は様々なものが使用できるが、低温に強いシリコーン系やフッ素系の接着剤を好適に用いることができる。

図２は、図１中の載置部の一例の断面構造概略図である。図２中、載置部２ａは、支持体４上に表面層３を有する構造である。このような構造の載置部２ａを得るためには、例えば、支持体上に水溶性高分子化合物を含有する塗布液をスライドホッパー方式で塗布する方法や、ディップコーティングで塗布する方法などの製造方法を用いることができる。

図３〜５は、載置部が保存液吸収体を有し、該保存液吸収体上に水溶性高分子化合物を含有する層を有する凍結保存用治具の一例を示す断面構造概略図である。図３〜５に示す保存液吸収体５は、細孔９（気孔）を有する構造体である。図３〜５に示す保存液吸収体５の断面構造は一例であり、これらに限定されない。
図３は、図１に示した載置部が保存液吸収体を有する場合の一例を示す断面構造概略図である。図３中、載置部２ｂは、保存液吸収体５と保存液吸収体５上に表面層３を有する構造である。このような構造の載置部２ｂを得るためには、例えば、前記した塗布液を、保存液吸収体にスライドホッパー方式で塗布する製造方法を用いることができる。

図４は、図１に示した載置部が保存液吸収体を有する場合の別の一例を示す断面構造概略図である。図４中、載置部２ｃは、保存液吸収体５の多孔質体全体にわたって表面層３を有する構造である。このように、保存液吸収体上に表面層が存在する場合、表面層は保存液吸収体表面において連続した層を形成する必要はなく、保存液吸収体の孔表面に存在しても良い。この構造は、多孔質体の細孔を閉塞しないため、凍結時のガラス化液の吸収性と融解時の細胞又は組織の剥離性を両立することができるため好ましい。この態様においても、微視的には載置部の最表面には本発明における表面層が存在するので、図４は本発明の一例を示すものであるといえる。このような構造の載置部２ｃを得るためには、例えば、上記した塗布液をディップコーティングで塗布する製造方法を用いることができる。

図５は、図１に示した載置部が保存液吸収体を有する場合の別の一例を示す断面構造概略図である。図５中、載置部２ｄは、保存液吸収体５の多孔質体全体にわたって表面層３を有する図４の形態に加えて、支持体４と接着層６を有する。この構造の場合、例えば保存液吸収体５に用いる多孔質体が自立性に乏しい場合であっても、凍結時・融解時の操作をより確実に行うことができる。

図６は、載置部の表面層が無機微粒子を含有する場合の断面構造概略図の一例である。図６中、載置部２ｅは、支持体４上に層状に配置された無機微粒子８を有する構造を有する。このような構造の載置部２ｅを得るためには、例えば、支持体上に水溶性高分子化合物及び無機微粒子を含有する塗布液をスライドホッパー方式で塗布する方法や、ディップコーティング方式で塗布する方法などの製造方法を用いることができる。

図７は、載置部の表面層が無機微粒子を含有する場合の断面構造概略図の別の一例である。図７中、載置部２ｆは、支持体４上に無機微粒子８が点在した構造である。

図８は、載置部が保存液吸収体を有し、表面層が無機微粒子を含有する場合の一例を示す断面構造概略図である。図８中、載置部２ｇは、保存液吸収体５の表面上に、無機微粒子８を有する。このような構造の載置部２ｇを得るためには、保存液吸収体５の細孔径よりも粒子径が大きい無機微粒子８を利用し、該無機微粒子８と水溶性高分子化合物を含有する塗布液を、上記したスライドホッパー方式や、ディップコーティング方式等の塗布方法で塗布すれば良い。

図９は、載置部が保存液吸収体を有し、表面層が無機微粒子を含有する場合の別の一例を示す断面構造概略図である。図９中、載置部２ｈは、保存液吸収体５の最表面に無機微粒子８を含有すると共に、保存液吸収体５の細孔内部にも、無機微粒子８を有する。このような構造の載置部２ｈを得るためには、保存液吸収体５の細孔径よりも粒子径が小さい無機微粒子８を利用し、該無機微粒子８と水溶性高分子化合物を含有する塗布液を、上記したスライドホッパー方式や、ディップコーティング方式等の塗布方法で塗布すれば良い。また保存液吸収体５の細孔径よりも粒子径が小さい無機微粒子８を利用した場合であっても、該無機微粒子８が細孔内部に入り込むことで細孔径が小さくなることから、図９にて示したように、保存液吸収体５の表面上に、層状に無機微粒子が配置される場合もある。図６〜図９に示す載置部の断面概略図は、最表面に、水溶性高分子化合物及び無機微粒子化合物を含有する層を有する載置部の一例を示す断面概略図である。なお、上記した図６から図９においては、表面層３（水溶性高分子化合物）を省略し、無機微粒子８のみを記載した。

本発明の、細胞又は組織の凍結保存用治具により、細胞又は組織を長期凍結保存する場合、前述の通り、細胞又は組織を外界と遮断するためにキャップを被せる、又は該凍結保存用治具を任意の形状の容器に入れて密閉することも可能である。液体窒素が滅菌されておらず、細胞又は組織を直接液体窒素に接触させて凍結させる場合においては、凍結保存用治具が滅菌されていても滅菌状態を保証できない場合がある。よって凍結前に細胞又は組織を付着させた載置部にキャップをして、又は凍結保存用治具を容器中に密閉して、細胞又は組織を直接液体窒素に接触させないで凍結させることがある。また、欧州など海外先進国では前記のように液体窒素に直接接触させない凍結方法が主流である。このような理由からキャップ及び容器は耐液体窒素性のある素材である各種金属、各種樹脂、ガラス、セラミックなどで作製することが好ましい。形状としては特に限定されず、例えば、キャップは、鉛筆用のキャップのような半紡錘状又はドーム状等のキャップ、円柱状のストローキャップなど本体部と接触せず、細胞又は組織を外界と遮断できるような形状ならどのような形状でも良い。容器は、載置された細胞又は組織に接触せずに、凍結保存用治具を被包又は収納して密閉できるものであれば良く、その形状は特に限定されない。

本発明においては、本発明の効果を損なわない限り、凍結保存用治具をこのような載置部上の細胞又は組織を外界と遮断することができるキャップ又は容器と組み合わせて使用することができる。また、このようなキャップ又は容器と組み合わせて使用される凍結保存用治具も、本発明に包含される。

本発明の凍結保存用治具は、例えば、クライオトップ法において好適に用いられるものである。また、従来のクライオトップ法は、通常、単一の細胞又は１０個未満の少数の細胞の保存に用いられるが、本発明の凍結保存用治具は、より多くの細胞の保存（例えば、１０〜１００００００個の細胞の保存）においても好適に用いることができる。さらには、複数の細胞からなるシート状の細胞（いわゆる細胞シート）の保存にも好適に用いることができる。本発明の凍結保存用治具を用いると、細胞又は組織の凍結保存作業において、細胞又は組織を凍結後に融解する際に、細胞又は組織を容易に回収することができる。また、載置部が保存液吸収体を有することにより、上記した効果に加えて、細胞又は組織を凍結する際に、細胞又は組織の外周に付着した余分なガラス化液を吸収することから、細胞又は組織の凍結時及び融解時に細胞外のガラス化液による損傷を受けにくく、細胞又は組織を優れた生存率で凍結保存することができる。

本発明の凍結保存用治具を用いて細胞又は組織を凍結保存する方法は特に限定されず、例えば、まず保存液に浸漬した細胞又は組織を保存液と共に載置部上に滴下し、該細胞又は該組織の周囲に付着している余分な保存液をピペットなどを用いて可能な限り除くことが好ましい。このとき、該凍結保存用治具の載置部が保存液吸収体を有する場合には、上記操作は必要なく、自動的に余分な保存液が除かれる。次いで、前記細胞又は前記組織を載置部に保持した状態で凍結保存用治具を液体窒素等の中に浸漬することにより、細胞又は組織を凍結することができる。この際、前記した載置部上の細胞又は組織を外界と遮断することができるキャップを載置部に装着して、又は凍結保存用治具を前記した容器に密閉して、液体窒素等の中に浸漬することもできる。
このように、上記細胞又は組織の凍結保存用治具の載置部上に、保存液に浸漬した細胞又は組織を保存液と共に載置し、細胞又は組織を載置部に保持した状態で凍結保存用治具を液体窒素の中に浸漬することにより細胞又は組織を凍結する細胞又は組織を凍結保存する方法も、本発明の１つである。
保存液は、通常卵子、胚等の細胞の凍結のために使用されるものを使用でき、例えば、上述したリン酸緩衝生理食塩水等の生理的溶液に耐凍剤（グリセロール、エチレングリコール等）を含有させることで得られた保存液や、グリセロールやエチレングリコール、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）などの各種耐凍剤を多量に（少なくとも保存液の全質量に対して１０質量％以上、より好ましくは２０質量％以上）含むガラス化液を使用できる。中でも、保存液としては、保存液の全質量に対して１０質量％以上の耐凍剤を含むガラス化液が好ましい。融解作業の際は、液体窒素等の冷却溶媒中から、該凍結保存用治具を取り出し、凍結された細胞又は組織を載せた載置部を融解液中に浸漬させ、その後、細胞又は組織を回収する。

本発明の凍結保存用治具を用いて凍結保存することができる細胞として、例えば、哺乳類（例えば、人（ヒト）、牛、豚、馬、ウサギ、ラット、マウス等）の卵子、胚、***等の生殖細胞；人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等の多能性幹細胞が挙げられる。また、初代培養細胞、継代培養細胞、及び細胞株細胞等の培養細胞が挙げられる。また、細胞は、一又は複数の実施形態において、線維芽細胞、膵ガン・肝ガン細胞等のガン由来細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、神経細胞、軟骨細胞、組織幹細胞、及び免疫細胞等の接着性細胞が挙げられる。さらに、凍結保存することができる組織として、同種又は異種の細胞からなる組織、例えば、卵巣、皮膚、角膜上皮、歯根膜、心筋等の組織が挙げられる。本発明は、特にシート状構造を有する組織（例えば、細胞シート、皮膚組織など）の凍結保存に好適である。本発明の凍結保存用治具は、直接生体から採取した組織だけでなく、例えば、生体外で培養し増殖させた培養皮膚、生体外で構築したいわゆる細胞シート、特開２０１２−２０５５１６号公報で提案されている三次元構造を有する組織モデルのような人工の組織の凍結保存についても、好適に用いることができる。本発明の凍結保存用治具は、上記のような細胞又は組織の凍結保存用治具として好適に用いられる。

以下に本発明を実施例によりさらに詳細に示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

（実施例１）
支持体として易接着処理された透明ＰＥＴフィルム（全光線透過率９１％、ヘーズ値５．５％）を用い、該支持体上に、日本合成化学工業（株）製の高純度ポリビニルアルコールＥＧ−０５Ｐ（ケン化度８６．５〜８９ｍｏｌ％）の５質量％水溶液を乾燥時の固形分量が５ｇ／ｍ^２となるように、スライドホッパー方式にて塗布し、室温乾燥させ、図２に示す形態の載置部を作製した。この載置部を２ｍｍ×２０ｍｍの大きさ（４０ｍｍ^２）に裁断し、ＡＢＳ樹脂製の把持部と接合させ、図１に示す形態で実施例１の凍結保存用治具を作製した。

（比較例１）
実施例１の凍結保存用治具の作製において、透明ＰＥＴフィルムをそのまま用いて載置部とした以外は同様にして、比較例１の凍結保存用治具を作製した。

＜マウス卵子の凍結操作＞
採取したマウス卵子をｐＨ指示薬として極低濃度のフェノールレッドが含まれる修正リン酸緩衝液（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、０．９ｍＭ ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、１．５ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、８ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、５．６ｍＭ グルコース、０．３ｍＭ ピルビン酸Ｎａ、６５μｇ／ｍｌ 硫酸ジベカシン、１ｍｇ／ｍｌ ポリビニルピロリドン、１４．８ｍＭ Ｌ−ｐｒｏｌｉｎｅ、２００ｍＭ トレハロース）に、１５℃の環境下で１０分間浸漬させた。その後、マウス卵子を一旦取り出し、次にこのマウス卵子を温度１５℃の平衡液（７容量％エチレングリコール、０．５容量％グリセロール、９２．５容量％上記修正リン酸緩衝液）に５分間浸漬させた。次いで、平衡液から取り出したマウス卵子を温度４℃のガラス化液（３０容量％エチレングリコール、０．５容量％グリセロール、６９．５％上記修正リン酸緩衝液、０．５Ｍスクロース）に浸漬させた。３０秒間のガラス化液への浸漬後、マウス卵子を実施例１又は比較例１の凍結保存用治具の載置部上に載置し、透過型顕微鏡観察下で、ピペットを用いてマウス卵子周辺の余分なガラス化液をできるだけ除いた。その後、液体窒素中に浸漬し、ガラス化凍結させた。凍結させた凍結保存用治具は、融解するまで、液体窒素保存容器中で保管した。

＜マウス卵子の融解操作と剥離性の評価＞
マウス卵子を載置した実施例１又は比較例１の凍結保存用治具を液体窒素中から取り出し、温度３７℃の融解液（上記修正リン酸緩衝液に１Ｍスクロースを添加した溶液）に浸漬させた。浸漬後のマウス卵子の様子を透過型光学顕微鏡で観察し、融解時のマウス卵子の剥離性について以下の基準で評価した。これらの結果を表１の「融解時の剥離性」の項目に示す。

融解時の剥離性は以下の基準で評価した。
◎：凍結保存用治具を融解液に浸漬した際に、把持部をわずかに振動させる程度でマウス卵子を剥離することができる（剥離に要する時間は１分以内）。
○：凍結保存用治具を融解液に浸漬した際に、把持部を上下左右にゆすることでマウス卵子を剥離することができる（剥離に要する時間は１分以内）。
×：把持部を上下左右にゆすることでは、１分以内にマウス卵子を剥離することができなかった。

表１の結果から、本発明の凍結保存用治具は、融解時に優れた剥離性を示すことが判る。

（実施例２）
支持体として易接着処理された透明ＰＥＴフィルム（全光線透過率９１％、ヘーズ値５．５％）を用い、該支持体上に接着層として、ヘンケルジャパン（株）製のホットメルトウレタン樹脂Ｐｕｒｍｅｌｔ ＱＲ １７０−７１４１Ｐを乾燥時の固形分量３０ｇ／ｍ^２となるように塗布した。接着層が完全硬化する前に、保存液吸収体として、アドバンテック東洋（株）製の親水化処理されたポリテトラフルオロエチレン多孔体（細孔径０．２μｍ、空隙率７１％、厚み３５μｍ）を貼り合わせた。このようにして得られた積層体を、日本合成化学工業社製の高純度ポリビニルアルコールＥＧ−０５Ｐ（ケン化度８６．５〜８９ｍｏｌ％）の２質量％水溶液に浸漬することで、ディップコーティングし、室温乾燥させ、図５に示す形態の水溶性高分子化合物を含有する層を有する載置部を作製した。なお、水溶性高分子化合物を含有する層の塗布量は、乾燥時の固形分量で１．６ｇ／ｍ^２であった。実施例１と同様に、この載置部を２ｍｍ×２０ｍｍの大きさに裁断し、その後ＡＢＳ樹脂製の把持部と接合させ、図１に示す形態で実施例２の凍結保存用治具を作製した。

（実施例３）
ポリビニルアルコールＥＧ−０５Ｐの水溶液の濃度を１質量％とした以外は、実施例２と同様にして、実施例３の凍結保存用治具を作製した。なお、実施例３の凍結保存用治具が有する水溶性高分子化合物を含有する層の塗布量は、乾燥時の固形分量で０．５ｇ／ｍ^２であった。

（実施例４）
ポリビニルアルコールＥＧ−０５Ｐの水溶液の濃度を０．２質量％とした以外は、実施例２と同様にして、実施例４の凍結保存用治具を作製した。なお、実施例４の凍結保存用治具が有する水溶性高分子化合物を含有する層の塗布量は、乾燥時の固形分量で０．１ｇ／ｍ^２であった。

（実施例５）
別のポリビニルアルコールである（株）クラレ製ＰＶＡ１０３（ケン化度９８〜９９ｍｏｌ％）の１質量％水溶液に積層体を浸漬させて水溶性高分子化合物を含有する層を設けた以外は、実施例２と同様にして、実施例５の凍結保存用治具を作製した。なお、実施例５の凍結保存用治具が有する水溶性高分子化合物を含有する層の塗布量は、乾燥時の固形分量で０．５ｇ／ｍ^２であった。

（実施例６）
ポリビニルアルコールにかえて、ゼラチンであるゼライス（株）製ＰＮ５０５の１質量％水溶液に積層体を浸漬させて水溶性高分子化合物を含有する層を設けた以外は、実施例２と同様にして、実施例６の凍結保存用治具を作製した。なお、実施例６の凍結保存用治具が有する水溶性高分子化合物を含有する層の塗布量は、乾燥時の固形分量で０．５ｇ／ｍ^２であった。

（実施例７）
太盛工業（株）製の親水化処理されたステンレス多孔質体（細孔径１．５μｍ、空隙率６５％、厚み１ｍｍ）を保存液吸収体とし、ポリビニルアルコールＥＧ−０５Ｐの１質量％水溶液に浸漬することで、ディップコーティングし、室温乾燥させ、図４に示す形態の水溶性高分子化合物を含有する層を有する載置部を作製した。なお、実施例７の水溶性高分子化合物を含有する層の塗布量は、乾燥時の固形分量で０．４ｇ／ｍ^２であった。実施例１と同様に、この載置部をＡＢＳ樹脂製の把持部と接合させ、図１に示す形態で実施例７の凍結保存用治具を作製した。

（比較例２）
実施例２の凍結保存用治具の作製において、水溶液への浸漬を行わない以外は実施例２と同様にして、水溶性高分子化合物を含有する層を有さない比較例２の凍結保存用治具を作製した。すなわち該凍結保存用治具は、易接着処理された透明ＰＥＴフィルム（全光線透過率９１％、ヘーズ値５．５％）上に、接着層（ヘンケルジャパン（株）製のホットメルトウレタン樹脂Ｐｕｒｍｅｌｔ ＱＲ １７０−７１４１Ｐ）を介して、親水化処理されたポリテトラフルオロエチレン多孔体（細孔径０．２μｍ、空隙率７１％、厚み３５μｍ）が貼り合わされたものである。

（比較例３）
実施例７の凍結保存用治具の作製において、水溶液への浸漬を行わない以外は実施例７と同様にして、水溶性高分子化合物を含有する層を有さない比較例３の凍結保存用治具を作製した。

＜ガラス化液の吸収性の評価＞
先の実施例１、比較例１での凍結操作と同様の方法で、修正リン酸緩衝液、平衡液、ガラス化液に順に浸漬させたマウス卵子を０．４μＬのガラス化液と共に、実施例２〜７、および比較例２、比較例３の凍結保存用治具が有する載置部上にオリジオ社製ストリッパーピペッターを用いて滴下した。実施例２〜６および比較例２については透過型光学顕微鏡を用いて、実施例７と比較例３については反射型光学顕微鏡を用いて観察しながら、滴下後のガラス化液の吸収の様子を以下の基準で評価した。これらの結果を表２の「ガラス化液の吸収性」の項目に示す。

ガラス化液の吸収性は以下の基準で評価した。
◎：ガラス化液を滴下後、マウス卵子周辺の余分なガラス化液が吸収され、見えなくなるまで、６秒未満だった。
○：ガラス化液を滴下後、マウス卵子周辺の余分なガラス化液が吸収され、見えなくなるまで６〜３０秒だった。
×：ガラス化液を滴下後、３０秒の時点で、マウス卵子周辺の余分なガラス化液が残存していた。

＜マウス卵子の融解操作と剥離性の評価＞
実施例２〜７、および比較例２、比較例３の凍結保存用治具を用いた融解操作と剥離性の評価は、先の実施例１、比較例１の各凍結保存用治具と同様の方法にて評価した。ただし、実施例７と比較例３の評価においては、透過型光学顕微鏡にかえて反射型光学顕微鏡を用いた。この結果を表２の「融解時の剥離性」の項目に示す。

表２の結果から、本発明の凍結保存用治具によって、融解時の優れた剥離性に加えて、ガラス化液の優れた吸収性が得られることが判る。

（実施例８）
支持体として易接着処理された透明ＰＥＴフィルム（全光線透過率９１％、ヘーズ値５．５％）を用い、該支持体上に、エチレンオキサイド基を有するポリビニルアルコールである日本合成化学工業（株）製のゴーセネックスＷＯ−３２０Ｒ（ケン化度８８．３ｍｏｌ％）の５質量％水溶液を乾燥時の固形分量が５ｇ／ｍ^２になるように、スライドホッパー方式で塗布し、室温乾燥後、１２０℃で４０時間加熱処理を行い、支持体上に表面層を有する図２に示す形態の載置部を作製した。この載置部を２ｍｍ×２０ｍｍの大きさ（４０ｍｍ^２）に裁断し、ＡＢＳ樹脂製の把持部と接合させ、図１に示す形態で実施例８の凍結保存用治具を作製した。

また、上記実施例８の凍結保存用治具の作製において、透明ＰＥＴフィルムをそのまま用いて載置部とした以外は同様にして、凍結保存用治具を作製した。よって該凍結保存用治具は先に記載した比較例１と同じであるから、後述する表３中、該凍結保存用治具を比較例１として記載した。

＜マウス胚の凍結作業＞
採取したマウス胚盤胞期胚をｐＨ指示薬として極低濃度のフェノールレッドが含まれる修正リン酸緩衝液（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、０．９ｍＭ ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、１．５ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、８ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、５．６ｍＭ グルコース、０．３ｍＭ ピルビン酸Ｎａ、６５μｇ／ｍｌ 硫酸ジベカシン、１ｍｇ／ｍｌ ポリビニルピロリドン、１４．８ｍＭ Ｌ−ｐｒｏｌｉｎｅ、２００ｍＭ トレハロース）に、１５℃の環境下で１０分間浸漬させた。その後、マウス胚を一旦取り出し、次にこのマウス胚を温度１５℃の平衡液（７．５容量％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、７．５容量％エチレングリコール、１７容量％ウシ胎児血清、６８容量％上記修正リン酸緩衝液）に５分間浸漬させた。次いで、平衡液から取り出したマウス胚を温度４℃のガラス化液（１５容量％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、１５容量％エチレングリコール、１４容量％ウシ胎児血清、５６容量％上記修正リン酸緩衝液、０．５Ｍスクロース）に浸漬させた。３０秒間のガラス化液への浸漬後、マウス胚を実施例８又は比較例１の凍結保存用治具の載置部上に載置し、透過型顕微鏡観察下で、ピペットを用いてマウス胚周辺の余分なガラス化液をできるだけ除いた。その後、液体窒素中に浸漬し、ガラス化凍結させた。凍結させた凍結保存用治具は、融解するまで、液体窒素保存容器中で保管した。

＜マウス胚の融解作業と剥離性の評価＞
マウス胚を載置した実施例８又は前述した比較例１の凍結保存用治具を液体窒素中から取り出し、温度３７℃の融解液（上記修正リン酸緩衝液に１Ｍスクロースを添加した溶液）に浸漬させた。浸漬後のマウス胚の様子を透過型光学顕微鏡で観察し、融解時のマウス胚の剥離性について以下の基準で評価した。これらの結果を表３の「細胞又は組織の剥離性」の項目に示す。なお表３中に記載される比較例１は、先に示した通り、易接着処理された透明ＰＥＴフィルムをそのまま用いて載置部とした凍結保存用治具である。

細胞又は組織の剥離性は以下の基準で評価した。
◎：凍結保存用治具を融解液に浸漬した際に、把持部をゆすりながらマウス胚を剥離することができた（剥離に要した時間は２０秒未満）。
○：凍結保存用治具を融解液に浸漬した際に、把持部をゆすりながらマウス胚を剥離することができた（剥離に要した時間は２０秒以上４０秒未満）。
△：凍結保存用治具を融解液に浸漬した際に、把持部をゆすりながらマウス胚を剥離するのに、４０〜６０秒を要した。
×：把持部をゆすることでは、６０秒以内にマウス胚を剥離することができなかった。

表３の結果から、本発明の凍結保存用治具は、融解時に優れた剥離性を示すことが判る。

（実施例９）
支持体として易接着処理された透明ＰＥＴフィルム（全光線透過率９１％、ヘーズ値５．５％）を用い、該支持体上に接着層として、ヘンケルジャパン（株）製のホットメルトウレタン樹脂Ｐｕｒｍｅｌｔ ＱＲ １７０−７１４１Ｐを乾燥時の固形分量３０ｇ／ｍ^２となるように塗布した。接着層が完全硬化する前に、保存液吸収体として、アドバンテック東洋（株）製の親水化処理されたポリテトラフルオロエチレン多孔体（細孔径０．２μｍ、空隙率７１％、厚み３５μｍ）を貼り合わせた。このようにして得られた積層体を、エタンジオール基を有するポリビニルアルコールである日本合成化学工業（株）製のＮｉｃｈｉｇｏ−Ｇ ｐｏｌｙｍｅｒ ＡＺＦ８０３５Ｗ（ケン化度９８．４ｍｏｌ％）の２質量％水溶液に浸漬することで、ディップコーティングし、室温乾燥後、１２０℃で４０時間加熱処理を行い、図５に示す形態の表面層を有する載置部を作製した。なお、表面層の固形分量は、１．６ｇ／ｍ^２であった。実施例８と同様に、この載置部を２ｍｍ×２０ｍｍの大きさに裁断し、その後ＡＢＳ樹脂製の把持部と接合させ、図１に示す形態で実施例９の凍結保存用治具を作製した。

（実施例１０）
エタンジオール基を有するポリビニルアルコールである日本合成化学工業（株）製のＮｉｃｈｉｇｏ−Ｇ ｐｏｌｙｍｅｒ ＯＫＳ−８０４１（ケン化度８８．９ｍｏｌ％）の２質量％水溶液を用いてディップコーティングを行った以外は、実施例９と同様にして、実施例１０の凍結保存用治具を作製した。なお、実施例１０の凍結保存用治具が有する表面層の固形分量は、１．６ｇ／ｍ^２であった。

（実施例１１）
エチレンオキサイド基を有するポリビニルアルコールであるゴーセネックスＷＯ−３２０Ｒ（ケン化度８８．３ｍｏｌ％）の２質量％水溶液を用いてディップコーティングを行った以外は、実施例９と同様にして、実施例１１の凍結保存用治具を作製した。なお、実施例１１の凍結保存用治具が有する表面層の固形分量は、１．６ｇ／ｍ^２であった。

（実施例１２）
ゴーセネックスＷＯ−３２０Ｒの水溶液の濃度を０．５質量％とした以外は、実施例１１と同様にして、実施例１２の凍結保存用治具を作製した。なお、実施例１２の凍結保存用治具が有する表面層の固形分量は、０．５ｇ／ｍ^２であった。

（実施例１３）
エチレンオキサイド基を有するポリビニルアルコールである日本合成化学工業（株）製のゴーセネックスＷＯ−３２０Ｎ（ケン化度９９ｍｏｌ％）の２質量％水溶液を用いてディップコーティングを行った以外は、実施例９と同様にして、実施例１３の凍結保存用治具を作製した。なお、実施例１３の凍結保存用治具が有する表面層の固形分量は、１．６ｇ／ｍ^２であった。

（実施例１４）
ポリビニルアルコールである（株）クラレ製のＰＶＡ１０３（ケン化度９８．５ｍｏｌ％）の２質量％水溶液を用いてディップコーティングを行った以外は、実施例９と同様にして、実施例１４の凍結保存用治具を作製した。なお、実施例１４の凍結保存用治具が有する表面層の固形分量は、１．６ｇ／ｍ^２であった。

また比較例として、前述した実施例９の凍結保存用治具の作製において、水溶液への浸漬を行わない以外は実施例９と同様にして表面層を有さない凍結保存用治具も作製した。この凍結保存用治具は、易接着処理された透明ＰＥＴフィルム（全光線透過率９１％、ヘーズ値５．５％）上に、接着層（ヘンケルジャパン（株）製のホットメルトウレタン樹脂Ｐｕｒｍｅｌｔ ＱＲ １７０−７１４１Ｐ）を介して、親水化処理されたポリテトラフルオロエチレン多孔体（細孔径０．２μｍ、空隙率７１％、厚み３５μｍ）が貼り合わされたものであり、前述した比較例２と同じである。よって後述する表４中、該該凍結保存用治具を比較例２として記載した。

＜保存液の吸収性の評価＞
先の実施例８、比較例１での凍結作業と同様の方法で、修正リン酸緩衝液、平衡液、ガラス化液に順に浸漬させたマウス胚を０．３μＬのガラス化液と共に、実施例９〜１４、および比較例２の凍結保存用治具が有する載置部上にオリジオ社製ストリッパーピペッターを用いて滴下した。滴下後のガラス化液の吸収の様子を反射型光学顕微鏡を用いて観察しながら、以下の基準で評価した。これらの結果を表４の「保存液の吸収性」の項目に示す。

保存液の吸収性は以下の基準で評価した。
◎：ガラス化液を滴下後、マウス胚周辺の余分なガラス化液が吸収され、見えなくなるまで、６秒未満だった。
○：ガラス化液を滴下後、マウス胚周辺の余分なガラス化液が吸収され、見えなくなるまで６〜３０秒だった。
×：ガラス化液を滴下後、３０秒の時点で、マウス胚周辺の余分なガラス化液が残存していた。

＜マウス胚の融解作業と剥離性の評価＞
実施例９〜１４、および比較例２の凍結保存用治具を用いた融解作業と剥離性の評価は、先の実施例８、比較例１の各凍結保存用治具と同様の方法にて評価した。この結果を表４の「細胞又は組織の剥離性」の項目に示す。

表４の結果から、本発明の凍結保存用治具によって、融解時の優れた剥離性に加えて、ガラス化液の優れた吸収性が得られることが判る。

（実施例１５）
支持体として易接着処理された透明ＰＥＴフィルム（全光線透過率９１％、ヘーズ値５．５％）を用い、該支持体上に、ケン化度が９４ｍｏｌ％以下のポリビニルアルコールである（株）クラレ製のＰＶＡ５０５（ケン化度７３．５ｍｏｌ％、重合度５００）の５質量％水溶液を乾燥時の固形分量が５ｇ／ｍ^２になるように、スライドホッパー方式で塗布し、室温乾燥後、１２０℃で４０時間加熱処理を行い、支持体上に表面層を有する図２に示す形態の載置部を作製した。この載置部を２ｍｍ×２０ｍｍの大きさ（４０ｍｍ^２）に裁断し、ＡＢＳ樹脂製の把持部と接合させ、図１に示す形態で実施例１５の凍結保存用治具を作製した。

また、上記実施例１５の凍結保存用治具の作製において、透明ＰＥＴフィルムをそのまま用いて載置部とした以外は同様にして、凍結保存用治具を作製した。よって該凍結保存用治具は先に記載した比較例１と同じであるから、後述する表５中、該凍結保存用治具を比較例１として記載した。

＜マウス胚の凍結作業＞
凍結保存用治具として、実施例１５及び比較例１の凍結保存用治具をそれぞれ使用した以外は、上述した実施例８の凍結保存用治具を用いたマウス胚の凍結作業と同様の方法で、マウス胚をガラス化凍結させた。凍結させた凍結保存用治具は、融解するまで、液体窒素保存容器中で保管した。

＜マウス胚の融解作業と剥離性の評価＞
マウス胚を載置した実施例１５又は前述した比較例１の凍結保存用治具を液体窒素中から取り出し、温度３７℃の融解液（上記修正リン酸緩衝液に１Ｍスクロースを添加した溶液）に浸漬させた。浸漬後、マウス胚の様子を透過型光学顕微鏡で観察しながら、融解作業を行った。融解作業の際、凍結保存用治具上のマウス胚を融解液に浸漬させた直後から３０秒間は、凍結保存用治具上からマウス胚を回収する操作は行わずに、凍結保存用治具上のマウス胚を静かに融解液中に浸漬させた。３０秒経過後、凍結保存用治具の把持部をゆすることで、載置部に振動を与えたり、ピペットを用いて吸引圧を与えたりすることで、マウス胚の融解液浸漬後から６０秒が経過するまで回収操作を行った。上記融解作業の際のマウス胚の剥離性について以下の基準で評価した。これらの結果を表５の「細胞又は組織の剥離性」の項目に示す。

細胞又は組織の剥離性は以下の基準で評価した。
◎：融解作業の際に、載置部上のマウス胚を剥離しやすかった（把持部を上下左右にゆする操作のみで比較的良好に剥離した）。
○：融解作業の際に、載置部上のマウス胚を剥離することができた（把持部を上下左右にゆする操作のみで剥離することができた）。
△：融解作業の際に、載置部上のマウス胚を剥離することができたが、やや剥離しづらかった。
×：６０秒以内にマウス胚を剥離することができなかった。

表５の結果から、本発明の凍結保存用治具は、融解時に優れた剥離性を示すことが判る。

（実施例１６）
支持体として易接着処理された透明ＰＥＴフィルム（全光線透過率９１％、ヘーズ値５．５％）を用い、該支持体上に接着層として、ヘンケルジャパン（株）製のホットメルトウレタン樹脂Ｐｕｒｍｅｌｔ ＱＲ １７０−７１４１Ｐを乾燥時の固形分量３０ｇ／ｍ^２となるように塗布した。接着層が完全硬化する前に、保存液吸収体として、アドバンテック東洋（株）製の親水化処理されたポリテトラフルオロエチレン多孔体（細孔径０．２μｍ、空隙率７１％、厚み３５μｍ）を貼り合わせた。このようにして得られた積層体を、ケン化度が９４ｍｏｌ％以下のポリビニルアルコールであるＰＶＡ５０５（ケン化度７３．５ｍｏｌ％、重合度５００）の２質量％水溶液に浸漬することで、ディップコーティングし、室温乾燥後、１２０℃で４０時間加熱処理を行い、図５に示す形態の表面層を有する載置部を作製した。なお、表面層の固形分量は、１．６ｇ／ｍ^２であった。実施例１５と同様に、この載置部を２ｍｍ×２０ｍｍの大きさに裁断し、その後ＡＢＳ樹脂製の把持部と接合させ、図１に示す形態で実施例１６の凍結保存用治具を作製した。

（実施例１７）
ケン化度が９４ｍｏｌ％以下のポリビニルアルコールである（株）クラレ製のＰＶＡ２１７（ケン化度８８ｍｏｌ％、重合度１７００）の２質量％水溶液を用いてディップコーティングを行った以外は、実施例１６と同様にして、実施例１７の凍結保存用治具を作製した。なお、実施例１７の凍結保存用治具が有する表面層の固形分量は、１．６ｇ／ｍ^２であった。

（実施例１８）
ケン化度が９４ｍｏｌ％以下のポリビニルアルコールである（株）クラレ製のＰＶＡ２０５（ケン化度８８ｍｏｌ％、重合度５００）の２質量％水溶液を用いてディップコーティングを行った以外は、実施例１６と同様にして、実施例１８の凍結保存用治具を作製した。なお、実施例１８の凍結保存用治具が有する表面層の固形分量は、１．６ｇ／ｍ^２であった。

（実施例１９）
ケン化度が９４ｍｏｌ％以下のポリビニルアルコールである日本合成化学工業（株）製のゴーセノールＥＧ０３Ｐ（ケン化度８８ｍｏｌ％、重合度３００）の２質量％水溶液を用いてディップコーティングを行った以外は、実施例１６と同様にして、実施例１９の凍結保存用治具を作製した。なお、実施例１９の凍結保存用治具が有する表面層の固形分量は、１．６ｇ／ｍ^２であった。

（実施例２０）
ポリビニルアルコールである（株）クラレ製のＰＶＡ１０５（ケン化度９８．５ｍｏｌ％、重合度５００）の２質量％水溶液を用いて行った以外は、実施例１６と同様にして、実施例２０の凍結保存用治具を作製した。なお、実施例２０の凍結保存用治具が有する表面層の固形分量は、１．６ｇ／ｍ^２であった。

また比較例として、前述した実施例１６の凍結保存用治具の作製において、水溶液への浸漬を行わない以外は実施例１６と同様にして表面層を有さない凍結保存用治具も作製した。この凍結保存用治具は、易接着処理された透明ＰＥＴフィルム（全光線透過率９１％、ヘーズ値５．５％）上に、接着層（ヘンケルジャパン（株）製のホットメルトウレタン樹脂Ｐｕｒｍｅｌｔ ＱＲ １７０−７１４１Ｐ）を介して、親水化処理されたポリテトラフルオロエチレン多孔体（細孔径０．２μｍ、空隙率７１％、厚み３５μｍ）が貼り合わされたものであり、前述した比較例２と同じである。よって後述する表６中、該凍結保存用治具を比較例２として記載した。

＜保存液の吸収性の評価＞
先の実施例１５、比較例１での凍結作業と同様の方法で、修正リン酸緩衝液、平衡液、ガラス化液に順に浸漬させたマウス胚を０．４μＬのガラス化液と共に、実施例１６〜２０、および比較例２の凍結保存用治具が有する載置部上にオリジオ社製ストリッパーピペッターを用いて滴下した。滴下後のガラス化液の吸収の様子を反射型光学顕微鏡を用いて観察しながら、以下の基準で評価した。これらの結果を表６の「保存液の吸収性」の項目に示す。

保存液の吸収性は以下の基準で評価した。
○：ガラス化液を滴下後、３０秒以内に、マウス胚周辺の余分なガラス化液が吸収された。
×：ガラス化液を滴下後、３０秒の時点で、マウス胚周辺の余分なガラス化液が残存していた。

＜マウス胚の融解作業と剥離性の評価＞
実施例１６〜２０、および比較例２の凍結保存用治具を用いた融解作業と剥離性の評価は、先の実施例１５、比較例１の各凍結保存用治具と同様の方法にて評価した。この結果を表６の「細胞又は組織の剥離性」の項目に示す。

表６の結果から、本発明の凍結保存用治具によって、融解時の優れた剥離性に加えて、ガラス化液の優れた吸収性が得られることが判る。

（実施例２１）
支持体として易接着処理された透明ＰＥＴフィルム（全光線透過率９１％、ヘーズ値５．５％）を用い、該支持体上に接着層として、ヘンケルジャパン（株）製のホットメルトウレタン樹脂Ｐｕｒｍｅｌｔ ＱＲ １７０−７１４１Ｐを乾燥時の固形分量３０ｇ／ｍ^２となるように塗布した。接着層が完全硬化する前に、保存液吸収体として、アドバンテック東洋（株）製のセルロース混合エステル多孔体（細孔径０．２μｍ、空隙率７３％、厚み１３３μｍ）を貼り合わせた。このようにして得られた積層体を、日産化学工業（株）製のコロイダルシリカであるＳＴ−ＺＬ（平均粒子径８５ｎｍ）をシリカ濃度として２０質量％、日本合成化学工業社製の高純度ポリビニルアルコールＥＧ−０５Ｐ（ケン化度８６．５〜８９ｍｏｌ％）を該ポリビニルアルコールの固形分濃度として１質量％含む水溶液（塗布液）に浸漬することで、ディップコーティングし、室温乾燥させた後に、さらに１２０℃で１日間加熱処理を行い、表面に水溶性高分子化合物と無機微粒子を有する載置部を作製した。なお、このときの無機微粒子の固形分塗布量は、３ｇ／ｍ^２であった。この載置部を２ｍｍ×２０ｍｍの大きさ（４０ｍｍ^２）に裁断し、その後ＡＢＳ樹脂製の把持部と接合させ、図１に示す形態で実施例２１の凍結保存用治具を作製した。

（実施例２２）
＜気相法シリカ分散液の作製＞
水 ４３０部
変性エタノール ２２部
カチオン性ポリマー ３部
（ジメチルジアリルアンモニウムクロライドホモポリマー、第一工業製薬社製、シャロールＤＣ９０２Ｐ、平均分子量９０００）
気相法シリカ １００部
（平均一次粒子径７ｎｍ、ＢＥＴ法による比表面積３００ｍ^２／ｇ）

分散媒の水と変性エタノールの中にジメチルジアリルアンモニウムクロライドホモポリ
マーを添加し、次いで気相法シリカを添加し予備分散して粗分散液を作製した。次にこの
粗分散液を高圧ホモジナイザーで２回処理して、シリカ濃度が２０質量％の気相法シリカ
の分散液を作製した。気相法シリカの平均粒子径は１００ｎｍであった。

実施例２１の凍結保存用治具の作製において、上記気相法シリカ分散液をシリカ濃度として１０質量％、ポリビニルアルコールＥＧ−０５Ｐを該ポリビニルアルコールの固形分濃度として１質量％含む水溶液を用いた以外は実施例２１と同様にして、実施例２２の凍結保存用治具を作製した。なお、このときの無機微粒子の固形分塗布量は、３ｇ／ｍ^２であった。

（実施例２３）
実施例２１の凍結保存用治具の作製において、接着層を介して支持体に貼り合わせる保存液吸収体として、セルロース混合エステル多孔体にかえて、アドバンテック東洋（株）製の親水化処理されたポリテトラフルオロエチレン多孔体（細孔径０．２μｍ、空隙率７１％、厚み３５μｍ）を用いた以外は実施例２１と同様にして、実施例２３の凍結保存用治具を作製した。なお、このときの無機微粒子の固形分塗布量は、３ｇ／ｍ^２であった。

（実施例２４）
実施例２３の凍結保存用治具の作製において、積層体のディップコーティングに用いる塗布液として、日産化学工業（株）製のコロイダルシリカであるＭＰ−４５４０（平均粒子径４５０ｎｍ）をシリカ濃度として５質量％、ポリビニルアルコールＥＧ−０５Ｐを該ポリビニルアルコールの固形分濃度として２質量％含む水溶液を用いた以外は実施例２３と同様にして、実施例２４の凍結保存用治具を作製した。なお、このときの無機微粒子の固形分塗布量は、１ｇ／ｍ^２であった。

実施例２４の凍結保存用治具の載置部の表面を、走査型電子顕微鏡を用いて観察したところ、図１０のような顕微鏡観察像が観察された。図１０中、スケールバーは５μｍである。

（実施例２５）
実施例２３の凍結保存用治具の作製において、積層体のディップコーティングに用いる塗布液として、ＧＥヘルスケア・ジャパン社製のコロイダルシリカであるパーコール（平均粒子径３０ｎｍ）をシリカ濃度として２０質量％、ポリビニルアルコールＥＧ−０５Ｐを該ポリビニルアルコールの固形分濃度として１質量％含む水溶液を用いた以外は、実施例２３と同様にして実施例２５の凍結保存用治具を作製した。なお、このときの無機微粒子の固形分塗布量は、１ｇ／ｍ^２であった。

（実施例２６）
実施例２１の凍結保存用治具の作製において、支持体として易接着処理された透明ＰＥＴフィルム（全光線透過率９１％、ヘーズ値５．５％）を用い、該支持体上を、実施例２１と同様の塗布液に浸漬することでディップコーティングし、室温乾燥させた以外は実施例２１と同様にして、実施例２６の凍結保存用治具を作製した。なお、このときの無機微粒子の固形分量は、３ｇ／ｍ^２であった。

（比較例４）
実施例２１の凍結保存用治具の作製において、保存液吸収体としてセルロース混合エステル多孔体を有する積層体を、ディップコーティングせずにそのまま用いて載置部とした以外は同様にして、比較例４の凍結保存用治具を作製した。

実施例２１の凍結保存用治具の作製において、透明ＰＥＴフィルムをそのまま用いて載置部とした以外は同様にして、凍結保存用治具を作製した。よって該凍結保存用治具は先に記載した比較例１と同じであるから、後述する表７中、該凍結保存用治具を比較例１として記載した。

さらに前述した実施例２３の凍結保存用治具の作製において、ポリテトラフルオロエチレン多孔体を含む積層体を、ディップコーティングせずにそのまま用いて載置部とした以外は同様にして凍結保存用治具を作製した。この凍結保存用治具は、易接着処理された透明ＰＥＴフィルム（全光線透過率９１％、ヘーズ値５．５％）上に、接着層（ヘンケルジャパン（株）製のホットメルトウレタン樹脂Ｐｕｒｍｅｌｔ ＱＲ １７０−７１４１Ｐ）を介して、親水化処理されたポリテトラフルオロエチレン多孔体（細孔径０．２μｍ、空隙率７１％、厚み３５μｍ）が貼り合わされたものであり、前述した比較例２と同じである。よって後述する表７中、該凍結保存用治具を比較例２として記載した。

＜ヒト肝細胞スフェロイドの作製＞
ヒト肝細胞スフェロイドは、住友ベークライト社製のＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標） ９６Ｕプレートを用いて作製した。シャーレ上、１０％の血清を添加したイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）で増殖させたＨｅｐＧ２細胞をトリプシン処理によってシャーレから剥離・回収した後に、１ウェルあたり５０ｃｅｌｌの細胞濃度でＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ ９６Ｕプレート上に播種した。３７℃、２％ＣＯ_２の条件下において、プレート上で３日間培養した後に、スフェロイドの形成を確認した。スフェロイドの中から、形状が球形に近く、かつ直径が１００μｍに近いものを選択し、以降の評価試験に用いた。

＜スフェロイドの凍結作業＞
スフェロイド１個をガラス化液（３０容量％エチレングリコール、０．５容量％グリセロール、６９．５％下記修正リン酸緩衝液、０．５Ｍスクロース）に浸漬させた後に、ガラス化液と共に、実施例２１〜２６及び比較例１、比較例２、比較例４の凍結保存用治具の載置部上に載置した。凍結作業にあたっては、実施例２３〜２６、比較例１、比較例２については、従来の一般的な操作の通り、透過型顕微鏡下で観察しながら作業を行った。実施例２１、実施例２２、および比較例４の場合には、載置部の光透過性が低いため、反射型顕微鏡を用いて観察しながら作業を行った。また、実施例２６と比較例１以外の保存液吸収体を有する凍結保存用治具については、透過型顕微鏡又は反射型顕微鏡下で、スフェロイド周辺のガラス化液が十分に除去されたことを確認した後、液体窒素に浸漬して凍結した。実施例２６と比較例１の凍結保存用治具については、透過型顕微鏡下で、ピペットを用いて、スフェロイド周辺のガラス化液を可能な限り十分除去した後に、液体窒素に浸漬して凍結した。

＜融解作業と剥離性の評価＞
スフェロイドを載置した実施例２１〜２６及び比較例１、比較例２、比較例４の凍結保存用治具を液体窒素中から取り出し、温度３７℃の融解液（修正リン酸緩衝液（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、０．９ｍＭ ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、１．５ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、８ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、５．６ｍＭ グルコース、０．３ｍＭ ピルビン酸Ｎａ、６５μｇ／ｍｌ 硫酸ジベカシン、１ｍｇ／ｍｌ ポリビニルピロリドン、１４．８ｍＭ Ｌ−ｐｒｏｌｉｎｅ、２００ｍＭ トレハロース）に１Ｍスクロースを添加した溶液）に浸漬させた。浸漬後のスフェロイドの様子を透過型光学顕微鏡又は反射型顕微鏡で観察しながら、ピペットを用いて、載置部からのスフェロイドの回収操作を行い、融解時のスフェロイドの剥離性について以下の基準で評価した。これらの結果を表７の「細胞又は組織の剥離性」の項目に示す。

◎：凍結保存用治具を融解液に浸漬した際に、把持部を上下左右にゆすったり、ピペッティングしたりすることで、デバイスからスフェロイドを３０秒以内に剥離することができた。
〇：凍結保存用治具を融解液に浸漬した際に、把持部を上下左右にゆすったり、ピペッティングしたりし、デバイスからのスフェロイドの剥離に３０秒〜１分を要した。
×：１分以内にスフェロイドを剥離することができなかった。

＜保存液の吸収性＞
スフェロイド１個をガラス化液（３０容量％エチレングリコール、０．５容量％グリセロール、６９．５％上記修正リン酸緩衝液、０．５Ｍスクロース）に浸漬させた後に、ガラス化液と共に、凍結保存用治具の載置部上に載置した際に、保存液の吸収性を評価した。保存液吸収体を有する実施例２１〜２５の凍結保存用治具は、良好な吸収性を有し、ピペット等を用いて余分なガラス化液を除く操作を必要としなかった。とりわけ、実施例２４は優れた吸収性を示し、１０秒以内に余分なガラス化液が吸収・除去された。

＜細胞又は組織の視認性＞
スフェロイド１個をガラス化液（３０容量％エチレングリコール、０．５容量％グリセロール、６９．５％上記修正リン酸緩衝液、０．５Ｍスクロース）に浸漬させた後に、ガラス化液と共に、凍結保存用治具の載置部上に載置した際に、透過型顕微鏡下でスフェロイドを観察した際の作業性を、細胞又は組織の視認性として評価した。実施例２１、実施例２２の凍結保存用治具と比較して、実施例２３〜２６の凍結保存用治具は、より明瞭に載置されたスフェロイドの形態を観察することが可能だった。

本発明は、牛などの家畜や動物の胚移植や人工授精、人への人工授精などの他、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、一般に用いられている培養細胞、生体から採取した検査用又は移植用の細胞又は組織、生体外で培養した細胞又は組織などの凍結保存に用いることができる。

１ 把持部
２、２ａ〜２ｈ 載置部
３ 表面層
４ 支持体
５ 保存液吸収体
６ 接着層
７ 凍結保存用治具
８ 無機微粒子
９ 細孔（気孔）

Claims (7)

1. 細胞又は組織を載置する載置部の最表面に、水溶性高分子化合物を含有する層を有し、該水溶性高分子化合物を含有する層は融解液に対して可溶性であり、かつ乾燥された層であることを特徴とする細胞又は組織の凍結保存用治具。
2. 前記水溶性高分子化合物が、エタンジオール基を有するポリビニルアルコールおよびエチレンオキサイド基を有するポリビニルアルコールから選択される少なくとも１種類であることを特徴とする、請求項１に記載の細胞又は組織の凍結保存用治具。
3. 前記水溶性高分子化合物が、ケン化度が９４ｍｏｌ％以下のポリビニルアルコールであることを特徴とする、請求項１に記載の細胞又は組織の凍結保存用治具。
4. 前記水溶性高分子化合物を含有する層が更にコロイダルシリカを含有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の細胞又は組織の凍結保存用治具。
5. 前記載置部が保存液吸収体を有し、該保存液吸収体上に前記水溶性高分子化合物を含有する層を有することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の細胞又は組織の凍結保存用治具。
6. 請求項１〜５のいずれかに記載の細胞又は組織の凍結保存用治具の載置部上に、保存液に浸漬した細胞又は組織を保存液と共に載置し、細胞又は組織を載置部に保持した状態で凍結保存用治具を液体窒素の中に浸漬することにより細胞又は組織を凍結し、その後、凍結した細胞または組織を該凍結保存用治具と共に融解液中に浸漬し、該細胞または組織を融解することを特徴とする、細胞又は組織の凍結保存方法。
7. 前記保存液が、保存液の全質量に対して１０質量％以上の耐凍剤を含むガラス化液であることを特徴とする、請求項６に記載の細胞又は組織の凍結保存方法。