JP2015188404A - 細胞または組織のガラス化凍結保存用治具 - Google Patents

Abstract

【課題】細胞または組織のガラス化凍結作業を容易にかつ確実に行うことが可能な、ガラス化凍結保存用治具を提供する。
【解決手段】多孔質金属体をガラス化液吸収体として有する細胞または組織のガラス化凍結保存用治具。
【選択図】図２

Description

本発明は、生物の細胞または組織などを凍結保存する際に使用するガラス化凍結保存用治具に関する。

生物の細胞または組織の優れた保存技術は、様々な産業分野で求められている。例えば、牛の胚移植技術に用いられる胚は、受胚牛の発情周期に合わせて移植が行われており、発情周期に胚の移植を合わせるために、胚を凍結保存し、発情周期に合わせて胚を融解して移植することが行われている。また、ヒトの不妊治療においては、母体から卵子または卵巣を採取後、移植に適したタイミングに合わせるために凍結保存しておき、移植時に融解して用いることがなされている。

一般に、生体内から採取された細胞または組織は、たとえ培養液の中であっても、次第に活性が失われていくことから、生体外での細胞または組織の長期間の培養は好ましくない。そのため、生体活性を損なわずに長期間保存する技術が重要である。優れた保存技術によって、採取された細胞または組織をより正確に分析することが可能になる。また優れた保存技術によって、より高い生体活性を保ったまま移植に用いることが可能となり、移植後の生着率が向上することが望める。さらには、生体外で培養した培養皮膚や生体外で構築したいわゆる細胞シートのような移植のための人工の組織を、順次生産して保存しておき、必要な時に使用することも可能となり、医療の面だけではなく、産業面においても広く求められている技術である。

細胞または組織の保存方法として、例えば緩慢凍結法が知られている。この方法では、まず、リン酸緩衝生理食塩水等の生理的溶液に耐凍剤を含有させることで得られた保存液に、細胞または組織を浸漬する。該耐凍剤としては、グリセロール、エチレングリコール等の化合物が用いられる。該保存液に、細胞または組織を浸漬後、比較的遅い冷却速度（例えば０．３〜０．５℃／分の速度）で、−３０〜−３５℃まで冷却することにより、細胞内外または組織内外の溶液が十分に冷却され、粘性が高くなる。このような状態で、該保存液中の細胞または組織をさらに液体窒素の温度（−１９６℃）まで冷却すると、細胞内または組織内とその外の周囲の微少溶液がいずれも非結晶のまま固体となるガラス化が起こる。ガラス化により、細胞内外または組織内外が固化すると、実質的に分子の動きがなくなるので、ガラス化された細胞または組織を液体窒素中に保存することで、半永久的に保存できると考えられる。

しかしながら、前記緩慢凍結法では、比較的遅い冷却速度で冷却する必要があるために、凍結保存のための操作に時間を要する。また、温度制御をするための装置または治具を必要とする問題がある。加えて、前記緩慢凍結法では、細胞外または組織外の保存液中に氷晶が形成されるので、細胞または組織が該氷晶により物理的に損害を受けるおそれがある。

前記緩慢凍結法での問題点を解決するための方法として、ガラス化保存法が提案されている。ガラス化保存法とは、グリセロールやエチレングリコール、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）などの耐凍剤を多量に含む水溶液の凝固点降下により、氷点下でも氷晶ができにくくなる原理を用いたものである。この水溶液を急速に液体窒素中で冷却させると氷晶を生じさせないまま固体化させることができる。このように固体化することをガラス化凍結という。また、耐凍剤を多量に含む水溶液をガラス化液という。

前記ガラス化法の具体的な操作としては、ガラス化液に細胞または組織を浸漬させ、その後、液体窒素の温度（−１９６℃）で冷却する。このような簡便かつ迅速な工程であるために、凍結保存のための操作に時間を必要としない他、温度制御をするための装置または治具を必要としない。

ガラス化保存法を用いると、細胞内外のいずれにも氷晶が生じないために凍結時及び融解時の細胞への物理的障害（凍害）を回避することができるが、ガラス化液に含まれる高濃度の耐凍剤には化学的毒性があり、細胞または組織の凍結保存時にはガラス化液が必要以上に多くないことが好ましい。また、細胞または組織がガラス化液に暴露される時間つまりは凍結までの時間が短時間であることが好ましい。さらには、解凍後ただちにガラス化液を希釈する必要がある。

これらガラス化保存法を用いた細胞または組織の凍結保存については、様々な方法で、様々な種類の細胞または組織を用いた例が示されている。例えば、特許文献１では、動物またはヒトの生殖細胞または体細胞へのガラス化保存法の適用が凍結保存、融解後の生存率の点で、極めて有用であることが示されている。

ガラス化保存法は、主にヒトの生殖細胞を用いて発展してきた技術であるが、最近では、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞への応用も広く検討されている。また、非特許文献１では、ショウジョウバエの胚の保存にガラス化保存法が有効であったことが示されている。さらに、特許文献２では、植物培養細胞や組織の保存において、ガラス化保存法が有効であることが示されている。このように、ガラス化法は広く様々な種の細胞や組織で有用であることが知られている。

ガラス化保存法をより効率的に行うための治具や操作方法としては、特許文献３などでは、ストローにガラス化液を充満させた中で卵子または胚をガラス化凍結保存させ、解凍時に素早く希釈液と接触させて再生率を向上させる試みがなされている。

特許文献４では、卵子または胚をガラス化液と共にガラス化保存用除去材の上に載せ、下部から吸引することで卵子または胚の周囲に付着した余分なガラス化液を除き、優れた生存率で凍結保存させる方法が提案されている。なお、ガラス化保存用除去材としては、金網、紙などの天然物や合成樹脂からなるフィルム状物で貫通孔を有したものが記載されている。

特許文献５では卵子または胚の周囲に付着した余分なガラス化液を濾紙などの吸収体により吸収させることにより、優れた生存率で凍結保存させる方法が提案されている。

特許文献６、特許文献７では、人の不妊治療分野で使用されているいわゆるクライオトップ法という方法で、卵付着保持用ストリップとして短冊状の可撓性かつ無色透明なフィルムを使用し、該フィルム上に極少量のガラス化液と共に卵子または胚を顕微鏡下で付着させ、凍結保存する方法が提案されている。

特許文献８では、金属製の板状部材であって、冷却媒体が侵入可能な２〜８ｍｍ^２程度の大きさの穴を複数有した、採取した組織片をガラス化凍結保存するための組織片凍結保存用プレートを用いて凍結保存する方法が提案されている。

特許文献９では、ガラス化法による凍結細胞シートの製造方法が提案されており、メッシュ状の網等からなる台座の上に、運搬補助膜（材質が主にセルロースからなるシートであるセルシード社製Ｃｅｌｌ Ｓｈｉｆｔｅｒ又はＰＶＤＦ膜）と共に細胞シートをのせ、余分なガラス化液を吸い取る若しくは落とした後で、細胞シートを凍結保存する方法が記載されている。

特許第３０４４３２３号公報 特開２００８−５８４６号公報 特開平１０−２４８８６０号公報 国際公開第２０１１／０７０９７３号パンフレット 特開２００５−４００７３号公報 特開２００２−３１５５７３号公報 特開２００６−２７１３９５号公報 特開２００８−２２２６４０号公報 特開２０１３−１１１０１７号公報

Ｓｔｅｐｏｎｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４５：１７０−１７２（１９９０）

特許文献３で提案されている方法は、ストロー中にガラス化液を充満させることから、凍結までの時間が長い問題がある。また、凍結保存できる細胞または組織の大きさはストローの内径に制限されるため、細胞シートのようなシート形状の組織を保存することは困難である。

特許文献４で提案されている方法は、卵子又は胚の周囲に付着した余分なガラス化液を除くことにより、優れた生存率でこれらの生殖細胞を凍結保存させる方法を提案している。しかしながら、上記公報記載の方法では、余分なガラス化液を除く際に、下部からの吸引操作を必要とするため、煩雑な操作となり、短時間でガラス化凍結保存操作を行う場合には不向きである。さらには、下部からの吸引が不十分であると余分なガラス化液が残存する問題がある。

特許文献５では、卵子又は胚の周囲に付着した余分なガラス化液を濾紙などの吸収体に吸収させることにより、優れた生存率でこれらの生殖細胞を凍結保存させる方法を提案している。しかしながら、細胞シートのようなより大きな組織に用いる場合には、余分なガラス化液も多くなり、吸水性が不十分となる問題がある。

特許文献６、特許文献７で提案されている方法では、卵子又は胚をのせるフィルムの幅を制限することにより、少ない量のガラス化液とともに卵子又は胚を凍結保存する方法が記載されている。この方法では、作業者の操作によって、極少量のガラス化液とともに、卵子又は胚をフィルム上にのせるが、操作の難度が高いといった問題があった。この方法をもとにしたクライオトップ法では、より少ない量のガラス化液と共に卵子又は胚を凍結保存するために、一度ガラス化液と共に卵子又は胚をフィルム上に載せた後に、余分なガラス化液を吸引してフィルム上から除去するといった煩雑な操作がされることもある。また、例えば、細胞シートのようなシート形状で大面積を有する組織の凍結保存への適用には不向きである。

特許文献８に提案されている方法では、熱伝導性に優れた金属板を用い、さらに冷却溶媒が侵入可能な、大きさが２〜８ｍｍ^２程度の穴を複数有することにより、卵巣組織の保存において迅速な冷却速度を得るための工夫がなされている。しかしながら、特許文献６や特許文献７における問題と同様に、余分なガラス化液が組織や組織を構成する細胞の周囲に残り、ガラス化液の毒性や、凍結時の温度降下と融解時の温度上昇が遅延するために、組織や組織を構成する細胞の生存率が低下するおそれがある。

特許文献９には、例えば、ガラス板、金属板、メッシュ状の網、不織布等の台座の上に、運搬補助膜（セルシード社製Ｃｅｌｌ Ｓｈｉｆｔｅｒ又はＰＶＤＦ膜）と共に細胞シートを載せて、余分なガラス化液を吸い取る若しくは落とした後で、凍結保存する方法が記載されているが、細胞または組織と共に滴下されるガラス化液の量が多い場合には、ガラス化液の吸収速度が十分でないために、余分なガラス化液が残存する問題がある。

本発明は、細胞または組織の凍結保存作業を容易にかつ確実に行うことが可能な、ガラス化凍結保存用治具を提供することを主な課題とする。より具体的には、細胞または組織をガラス化液に浸漬し、ガラス化液と共に該ガラス化凍結保存用治具に載せる際に、余分なガラス化液を吸収するための優れた吸収性能を備えたガラス化凍結保存用治具を提供する。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、上記した各種技術的な課題は、以下の構成を有する細胞または組織のガラス化凍結保存用治具で解決できることが判明した。
（１）多孔質金属体をガラス化液吸収体として有する細胞または組織のガラス化凍結保存用治具。

本発明により、ガラス化液に浸漬させた細胞または組織をガラス化液と共にガラス化液吸収体上に載せる際に、ガラス化液吸収体が細胞または組織の外周に付着した余分なガラス化液を吸収することから、余分なガラス化液を除くためのその他の操作（例えば、ガラス化液吸収体下部からの吸引除去操作や、マイクロピペット等を用いた細胞または組織周囲からの直接的な吸引除去操作）を特に必要とせずに、細胞または組織の凍結保存作業が容易かつ簡便に行うことが可能な、細胞または組織のガラス化凍結保存用治具を提供することができる。また、本発明のガラス化凍結保存用治具を用いると、細胞または組織のガラス化凍結作業及び融解作業を効率よく行うことができる。

図１は、本発明の細胞または組織のガラス化凍結保存用治具の一例を示す全体図である。 図２は、図１中のガラス化液吸収体の拡大図である。 図３は、支持体を有する場合に用いるガラス化液吸収体の一例を示す概略図である。 図４は、複数個の細胞または組織を１つの当該ガラス化凍結保存用治具で凍結保存させる場合に用いるガラス化液吸収体の一例を示す概略図である。 図５は、複数個の細胞または組織を１つの当該ガラス化凍結保存用治具で凍結保存させる場合に用いるガラス化液吸収体の別の一例を示す概略図である。

以下に本発明のガラス化凍結保存用治具を詳細に説明する。本発明のガラス化凍結保存用治具は、多孔質金属体をガラス化液吸収体として有する。

本発明のガラス化凍結保存用治具は、生物の細胞または組織を凍結保存する際に用いられるものである。本明細書中で細胞とは、単一の細胞のみならず、複数の細胞からなる細胞集団を含むものである。複数の細胞からなる細胞集団とは単一の種類の細胞から構成される細胞集団でも良いし、複数の種類の細胞から構成される細胞集団でも良い。また、組織とは、単一の種類の細胞から構成される組織でも良いし、複数の種類の細胞から構成される組織でも良く、細胞以外に細胞外マトリックスのような非細胞性の物質を含むものでも良い。本発明のガラス化凍結保存用治具は、好ましくは、ガラス化液吸収体に細胞または組織をガラス化液と共に付着させて、細胞または組織が付着した治具を液体窒素等の冷却物質に浸漬し凍結させるためのものである。上記ガラス化液吸収体を有することにより、細胞または組織をガラス化液と共に容易に保持することができ、さらには細胞または組織の液体窒素への浸漬作業も容易に行うことができる。本発明のガラス化凍結保存用治具は、細胞または組織凍結保存用具、細胞または組織ガラス化保存用具と言い換えることができる。

本発明のガラス化凍結保存用治具は、該ガラス化液吸収体が余分なガラス化液を吸収するので、ガラス化液に浸漬した細胞または組織を、ガラス化液と共に該ガラス化液吸収体上に滴下付着させる際に、細胞または組織に付着したガラス化液の量が多くても安定した細胞または組織の生存率が期待できる。さらに、そのように操作された細胞または組織はごく少量のガラス化液に覆われており、凍結操作する場合でも速やかに凍結状態にすることができる。さらには凍結保存した細胞または組織を解凍後ただちにガラス化液を希釈することができる。

本発明のガラス化凍結保存用治具は、ガラス化液を吸収するガラス化液吸収体を少なくとも有するガラス化凍結保存用治具であって、該ガラス化液吸収体が、多孔質金属体であることを特徴とする。本発明における多孔質金属体とは、表面に気孔（細孔）を有する構造体であり、好ましくは表面及び内部に連続的な気孔を有する構造体である。本発明のガラス化凍結保存用治具は、多孔質金属体のみをガラス化液吸収体としても良いし、支持体を有していても良い。支持体を多孔質金属体とともに用いる場合には、支持体と多孔質金属体との間に、接着層を設けることができる。さらには、該多孔質金属体と該接着層以外にも、例えば支持体上に均一な接着層を得ることを目的に、例えば下塗り層等を設けても良い。支持体は、多孔質金属体を支持する目的だけでなく、支持体自体に吸収性能を持たせることもできる。

本発明のガラス化凍結保存用治具は、細胞または組織を含むガラス化液がガラス化液吸収体上に滴下された時、多孔質金属体の表面の細孔を通してガラス化液がガラス化液吸収体に吸収され、細胞または組織の周囲から余分なガラス化液を除くことができる。

本発明においてガラス化液吸収体として用いる多孔質金属体は、例えば、銅、銅合金、アルミニウム、アルミニウム合金、金、金合金、銀、銀合金、錫、亜鉛、鉛、チタン、ニッケル、ステンレスなどの素材からなる多孔質金属体を用いることができる。素材としての入手のしやすさと扱いやすさの観点から、銅、銅合金、アルミニウム、アルミニウム合金、チタン、ニッケル、ステンレスの素材からなる多孔質金属体であることが好ましい。

上記多孔質金属体の製造方法としては、粉末冶金法、スペーサー法などの一般的な多孔質金属体の製造方法を使用することができる。また、樹脂射出成型と粉末冶金法を組み合わせた所謂パウダースペースホルダー法も好ましく使用できる。例えば、国際公開第２００６／０４０１１１８号パンフレットや特許第４５７８０６２号公報に記載された方法などを用いることができる。より具体的には、金属粉末とスペーサーとなる樹脂を混合後、圧力をかけて成型した後、高温環境下で焼成することで、金属粉末を焼き固め、スペーサーとなる樹脂を気化させて、多孔質金属体を得ることができる。パウダースペースホルダー法等を用いる場合には、金属粉末とスペーサーとなる樹脂に加えて、樹脂のバインダーを混合することができる。類似の方法として、一般に知られている所謂ファイバースペースホルダー法のように、金属粉末と繊維状のスペーサー素材を混合した後に、高温環境下で焼成することで、金属粉末を焼き固め、スペーサーとなる繊維を気化させて、多孔質金属体を製造することもできる。また、金属粉末を高温で加熱した後に、ガスを注入して空隙を作製する発泡溶融法、ガス膨張法などの多孔質金属体の製造方法も使用することができる。さらには、発泡剤を用いて多孔質金属体を製造するスラリー発泡法のような製造方法も使用することができる。

多孔質金属体の表面は、ガラス化液吸収性能を高めるために、親水化処理することもできる。親水化処理の方法としては、グラフト改質法、親水性高分子化合物等を用いたコーティング法、コロナ放電、プラズマ処理、エキシマレーザー等の各種電子線を用いた一般的な表面改質方法を使用することができる。例えば、特開平１１−２５６３５５号公報、特開２０００−２８１９３６号公報、特開２００８−１６１８０６号公報、特開２０１１−７３６５号公報に記載される方法を用いることができる。

本発明に用いる多孔質金属体の細孔径は、０．０５〜５００μｍであることが好ましく、より好ましくは０．５〜５０μｍである。細孔径が０．０５μｍ未満の範囲では、ガラス化液の滴下時にガラス化液の吸収性能が十分でない場合がある。また、多孔質金属体の製造が難しいという問題がある。一方、細孔径が５００μｍを超える範囲では、細胞または組織が細孔中にトラップされ、融解作業時に、細胞が多孔質金属体上から遊離しにくくなる場合がある。また、ガラス化液の吸収性能が十分でない場合がある。なお、多孔質金属体の細孔径は、該多孔質の表面及び断面の画像観察から測定した平均細孔直径である。ガラス化液吸収体の厚みは、５０μｍ〜５０ｍｍであることが好ましく、より好ましくは５００μｍ〜１０ｍｍである。該ガラス化液吸収体の空隙率は２０容量％以上であることが好ましく、より好ましくは４０容量％以上、さらに好ましくは５０容量％以上である。多孔質金属体の内部の気孔は、厚み方向のみならず、厚み方向に対して垂直な方向に連続的な構造である、所謂オープンセル型であることが好ましい。このような構造を有すると、多孔質金属体内部の気孔を有効に用いることができるために、ガラス化液の高い吸収性能が得られる。多孔質金属体の厚み、空隙率は、用いる細胞または組織の種類や細胞または組織と共に滴下されるガラス化液の滴下量等に応じて適宜選択することができる。

ガラス化液吸収体として用いる多孔質金属体の面積は、細胞または組織と共に滴下されるガラス化液の滴下量等に応じて適宜設定すればよく特に限定されないが、例えば、滴下するガラス化液１μＬにつき１ｍｍ^２以上とすることが好ましく、２〜４００ｍｍ^２とすることがより好ましい。

本発明のガラス化凍結保存用治具が有するガラス化液吸収体が支持体を有する場合、一般に知られる様々な支持体を使用することができる。このような支持体としては例えば、各種樹脂フィルム、ガラス、ゴム、金属、繊維形状物質、スポンジ形状物質等が挙げられる。樹脂フィルムの具体例としては、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）やポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）等のポリエステル樹脂、アクリル樹脂、エポキシ樹脂、シリコーン樹脂、ポリカーボネート樹脂、ジアセテート樹脂、トリアセテート樹脂、ポリアリレート樹脂、ポリ塩化ビニル樹脂、ポリスルフォン樹脂、ポリエーテルスルフォン樹脂、ポリイミド樹脂、ポリアミド樹脂、ポリオレフィン樹脂、環状ポリオレフィン樹脂、フッ素樹脂等からなる樹脂フィルムが挙げられる。また温度伝導性に優れ、急速な凍結を可能にするという観点で金属板を好適に用いることができる。該支持体の厚さは１０μｍ〜１００ｍｍであることが好ましい。また、接着層との接着強度を高めるために、支持体の表面をコロナ放電処理のような電気的な方法や、化学的な方法により易接着処理することができ、さらには粗面化することもできる。

本発明のガラス化凍結保存用治具が有するガラス化液吸収体が接着層を有する場合には、湿気硬化性の接着物質に代表されるような瞬間接着物質、ホットメルト接着物質、光硬化性接着物質などを用いた一般的な接着方法が利用でき、例えば、ポリビニルアルコール、ヒドロキシセルロース、ポリビニルピロリドン、澱粉糊のような水溶性接着物質、酢酸ビニル系接着物質、アクリル系接着物質、エポキシ系接着物質、ウレタン系接着物質、エラストマー系接着物質、シアノアクリレート系接着物質、フッ素系接着物質、シリコン系接着物質、ニトロセルロース系接着物質、ニトリルゴム系接着物質、スチレン―ブタジエン系接着物質、ユリア樹脂系接着物質、スチレン系樹脂接着物質、フェノール樹脂系接着物質、ポリイミド系接着物質、ポリアミド系接着物質、ポリエステル系接着物質、ビスマレイミド系接着物質、オレフィン系接着物質、ＥＶＡ系接着物質などの非水溶性接着物質が好ましく利用できる。該接着層は、一種類の接着物質を含有してもよいし、複数種類の接着物質を含有してもよい。接着層の固形分量は、０．０１〜１００ｇ／ｍ^２の範囲が好ましく、更に０．１〜５０ｇ／ｍ^２の範囲がより好ましい。

以上、本発明におけるガラス化液吸収体を説明してきた。以下にこれらを用いたガラス化凍結保存用治具の構成について説明する。本発明のガラス化凍結保存用治具は上述したようなガラス化液吸収体を有するものであればどのようなものであってもよいが、該ガラス化液吸収体が把持部に接続されていてもよい。把持部を有すると、凍結保存作業時及び融解作業時の作業性が良好であるため、好ましい。

図１は本発明の細胞または組織のガラス化凍結保存用治具の一例を示す全体図である。図１においてガラス化凍結保存用治具５は、把持部１とガラス化液吸収体２から構成される。把持部１は耐液体窒素素材であることが好ましい。このような素材としては、例えばアルミ、鉄、銅、ステンレス合金などの各種金属、ＡＢＳ樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリエチレン樹脂、フッ素系樹脂や各種エンジニアプラスチック、更にはガラスなどを好適に用いることができる。また基本的にガラス化液吸収体２はハンドリング上、短冊状又はシート状であることが好ましい。

本発明におけるガラス化液吸収体の一例を、図２に示す。図２は、図１のガラス化液吸収体２の拡大図である。図２のガラス化液吸収体２ａは支持体を有さずに多孔質金属体３そのものをガラス化液吸収体とする形態の一例である。また、図３は支持体を有する場合に用いるガラス化液吸収体の一例を示す概略図であり、該ガラス化液吸収体２ｂは支持体４上に多孔質金属体３を有する。図３に示すガラス化液吸収体２ｂは、ガラス化液吸収体の全面に多孔質金属体を有する形態の一例である。

図１の把持部１とガラス化液吸収体２の接続方法について説明する。把持部１が樹脂の場合、例えば、成形加工する時にインサート成形によりガラス化液吸収体２を把持部１に接続することができる。更に、把持部１に図示しないガラス化液吸収体挿入部を作製して接着剤にてガラス化液吸収体２を接続することができる。接着剤は様々なものが使用できるが、低温に強いシリコン系やフッ素系の接着剤が好適に用いることができる。

本発明における細胞または組織のガラス化液保存用治具で細胞または組織を長期凍結保存する場合、図１に示す治具本体に安全のため、外界と遮断するためにキャップを被せることも可能である。更に、通常液体窒素は滅菌されておらず、直接液体窒素に接触させて凍結させる場合、ガラス化液保存用治具が滅菌されていても無菌状態を保証できない場合がある。よって凍結前に細胞または組織を付着させたガラス化液吸収体にキャップをして、直接液体窒素に接触させないで凍結させることがある。また、米国・ＥＵなど海外先進諸国では前記のように液体窒素に直接接触させない凍結方法が主流となってきている。このような理由からキャップは耐液体窒素性のある素材である各種金属、各種樹脂、ガラス、セラミックなどで作製することが好ましい。形状としては、鉛筆用のキャップや円柱状のストローキャップなどガラス化液吸収体と接触せず、外界と遮断できるような形状ならどのような形状でもよい。

図４、図５に、本発明におけるガラス化液吸収体の別の態様の例を示す。図１に示す細胞または組織のガラス化凍結保存用治具において、ガラス化液吸収体を図４、図５に示すものとすることもできる。図４は、複数個の細胞または組織を１つの当該ガラス化凍結保存用治具で凍結保存させる場合に用いるガラス化液吸収体の一例を示す概略図を示す。また、図５は複数個の細胞または組織を１つの当該ガラス化凍結保存用治具で凍結保存させる場合に用いるガラス化液吸収体の別の一例を示す概略図である。図４及び図５では多孔質金属体３が支持体４上に、不連続であって複数が配置されている。

前述した図３のように多孔質金属体３が連続した形状である場合、複数の細胞または組織を多孔質金属体３に付着させようとすると、ガラス化液は多孔質金属体で横方向と厚み方向に広がるため、例えば２個目以降の細胞または組織を多孔質金属体３に付着させた場合、ガラス化液の吸収性が低下する場合がある。しかし、図４及び図５のように多孔質金属体３が支持体４上に、不連続で複数設けられているとそのような心配がなく、ガラス化液と共に細胞または組織を各多孔質金属体３に１個ずつ確実に付着させることができる。図４及び図５では、一例として、升目状の多孔質金属体３を複数配置した。図４及び図５に示すガラス化液吸収体２ｃ及びガラス化液吸収体２ｄは、支持体上の一部に多孔質金属体を有するガラス化液吸収体の一例でもある。

本発明のガラス化凍結保存用治具は、例えば、クライオトップ法において好適に用いられるものである。また、従来のクライオトップ法は、通常、単一の細胞または１０個未満の少数の細胞の保存に用いられるが、本発明のガラス化凍結保存用治具は、より多くの細胞の保存（例えば、１０〜１００００００個の細胞の保存）においても好適に用いることができる。さらには、複数の細胞からなるシート状の細胞（所謂細胞シート）の保存にも好適に用いることができる。本発明のガラス化凍結保存用治具を用いると、細胞または組織の凍結時及び融解時に細胞外のガラス化液による損傷を受けにくく、細胞または組織を優れた生存率で凍結保存することができる。

本発明のガラス化凍結保存用治具を用いて細胞または組織を凍結保存する方法は特に限定されず、例えば、まず、ガラス化液に浸漬した細胞または組織をガラス化液と共にガラス化液吸収体上に滴下し、該細胞または該組織の周囲に付着しているガラス化液をガラス化液吸収体に吸収させる。次いで、前記細胞または前記組織をガラス化液吸収体上に保持させたまま液体窒素等の中に浸漬することにより、細胞または組織を凍結することができる。ガラス化液は、通常卵子、胚等の細胞の凍結のために使用されるものを使用でき、例えば、上述したグリセロールやエチレングリコール、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）などの各種耐凍剤を含有する水溶液を使用できる。融解作業の際は、液体窒素等の冷却溶媒中から、該ガラス化凍結保存用治具をとり出し、凍結された細胞または組織を載せたガラス化液吸収体を融解液中に浸漬させることで、速やかに融解作業を行うことができる。

本発明のガラス化凍結保存用治具を用いて凍結保存することができる細胞として、例えば、哺乳類（例えば、人（ヒト）、牛、豚、馬、ウサギ、ラット、マウス等）の卵子または胚、***等の生殖細胞、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞が挙げられる。また、初代培養細胞、継代培養細胞、及び細胞株細胞等の培養細胞が挙げられる。また、細胞は、一または複数の実施形態において、繊維芽細胞、膵ガン・肝ガン細胞等のガン由来細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、神経細胞、軟骨細胞、組織幹細胞、胚性幹細胞、及び免疫細胞等の接着性細胞が挙げられる。さらに、凍結保存することができる組織として、同種または異種の細胞からなる組織、例えば、卵巣、皮膚、角膜上皮、歯根膜、心筋、軟骨等の組織が挙げられる。本発明のガラス化凍結保存用治具は、直接生体から採取した細胞または組織だけでなく、例えば、生体外で培養し増殖させた培養皮膚、生体外で構築した所謂細胞シート、特開２０１２−２０５５１６号公報に記載されている三次元構造を有する組織モデルのような人工の組織のガラス化凍結保存においても好適に用いることができる。

以下に本発明を実施例によりさらに詳細に示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、実施例１、実施例２の細孔径は、表面及び断面の画像観察から測定した平均細孔直径を示す。また、比較例１、比較例４の細孔径は、ＪＩＳ Ｋ３８３２に記載されるバブルポイント試験により測定される最も大きい細孔の直径を示す。

（実施例１）
多孔質金属体として、太盛工業社製の親水化処理が施された多孔質金属体であるステンレス多孔質体（細孔径１．５μｍ、空隙率６５容量％、厚み１ｍｍ）をガラス化液吸収体とし、このガラス化液吸収体５００ｍｍ^２（１０ｍｍ×５０ｍｍ）をＡＢＳ樹脂製の把持部と接合させ、図１に示す形態で実施例１のガラス化凍結保存用治具を作製した。

（実施例２）
多孔質金属体として、太盛工業社製の親水化処理が施された多孔質金属体であるステンレス多孔質体（細孔径８μｍ、空隙率６５容量％、厚み１ｍｍ）をガラス化液吸収体とし、このガラス化液吸収体５００ｍｍ^２（１０ｍｍ×５０ｍｍ）をＡＢＳ樹脂製の把持部と接合させ、図１に示す形態で実施例２のガラス化凍結保存用治具を作製した。

（比較例１）
多孔質金属体にかえて、セルロースアセテートからなるアドバンテック社製セルロースアセテートメンブレン（細孔径０．５μｍ、空隙率６８容量％、膜厚１２５μｍ）をガラス化液吸収体とした。メンブレンが薄く、自立性が十分でないことから、メンブレンは厚み２５０μｍのＰＥＴフィルム上にウレタン系接着物質を用いて貼り付け、実施例１と同様にして比較例１のガラス化凍結保存用治具を作製した。

（比較例２）
濾紙であるアドバンテック製濾紙Ｎｏ．５Ｃ（坪量１２０ｇ／ｍ^２、密度０．５７ｇ／ｃｍ^３）をガラス化液吸収体とした以外は比較例１と同様にして、比較例２のガラス化凍結保存用治具を作製した。

（比較例３）
特許文献９に記載のある細胞の運搬補助膜であるセルロースからなるセルシード社製Ｃｅｌｌ Ｓｈｉｆｔｅｒをガラス化液吸収体とした以外は比較例１と同様にして、比較例３のガラス化凍結保存用治具を作製した。

（比較例４）
特許文献９に記載のある細胞の運搬補助膜であるＰＶＤＦからなるメルクミリポア社製の親水性デュラポアメンブレン（細孔径０．１μｍ、空隙率７０容量％、膜厚１２５μｍ）をガラス化液吸収体とした以外は比較例１と同様にして、比較例４のガラス化凍結保存用治具を作製した。

（比較例５）
無色透明なフィルムである透明ＰＥＴフィルム（空隙率０容量％、厚さ２５０μｍ）をそのまま用いてガラス化液吸収体とした以外は実施例１と同様にして、比較例５のガラス化凍結保存用治具を作製した。

＜ガラス化液の吸収性の評価＞
実施例１、実施例２及び比較例１〜５の各ガラス化凍結保存用治具のガラス化液吸収体上に、ガラスビーズ（直径１００μｍ）を疑似細胞として複数個含むガラス化液２００μＬを滴下付着させた。なお、ガラス化液は、シグマアルドリッチ社製 修正ＴＣＭ１９９培地に、２０容積％血清、１５容積％ＤＭＳＯ、１５容積％エチレングリコール、０．２容積％スクロースが含まれる組成のものを用いた。滴下付着後、落射型正立光学顕微鏡（オムロン（株）製、ＶＣ４５００−Ｓ１）にて、ガラス化液吸収体上に載置された疑似細胞周辺のガラス化液が吸収される様子を観察し、以下の基準で評価した。これらの結果を、表１の「ガラス化液の吸収性の評価」の項目に示す。

○：ガラス化液滴下付着後、５秒以内にガラス化液が完全に吸収された。
×：ガラス化液滴下付着後、５秒以内にガラス化液の吸収が十分でなく、疑似細胞周辺にガラス化液の残存が確認された。

＜冷却溶媒への浸漬評価＞
実施例１、実施例２及び比較例１〜５の各ガラス化凍結保存用治具のガラス化液吸収体上に、ガラスビーズ（直径１００μｍ）を疑似細胞として複数個含むガラス化液１００μＬを滴下付着させた。なお、ガラス化液は、シグマアルドリッチ社製 修正ＴＣＭ１９９培地に、２０容積％血清、１５容積％ＤＭＳＯ、１５容積％エチレングリコール、０．２容積％スクロースが含まれる組成のものを用いた。滴下付着させて１０秒後に、ガラス化液吸収体を完全に液体窒素中に浸漬させた。１０分間の浸漬後、ガラス化凍結保存用治具を液体窒素中からとり出し、室温環境下においた。液体窒素浸漬前と比較して、ガラス化液吸収体の変形や破損が無いかを目視で観察し、実用上の耐久性を以下の基準で評価した。これらの結果を、表１の「冷却溶媒への浸漬評価」の項目に示す。

○：ガラス化液吸収体の変形や破損が一切認められなかった。
×：ガラス化液吸収体に変形または破損が認められた。または、一連の評価の工程の中で、変形または破損等の発生により、作業の不具合が認められた。

本発明の実施例１、実施例２のガラス化凍結保存用治具は、いずれも優れたガラス化液吸収性能を示した。一方、比較例１〜５のガラス化凍結保存用治具は、滴下したほとんどのガラス化液が残存したことから、ガラス化液吸収性能が不十分であった。

また、本発明の実施例１、実施例２、比較例２〜５のガラス化凍結保存用治具は、液体窒素に浸漬した場合において変形や破損は認められず、一連の凍結保存操作において不具合は認められなかった。一方で、比較例１のガラス化凍結保存用治具では、液体窒素浸漬後にガラス化液吸収体に破損が認められた。

以上の結果から、本発明のガラス化凍結保存用治具によって、細胞または組織のガラス化凍結作業を容易にかつ確実に行うことが可能であることが判る。

本発明は、牛などの家畜や動物の胚移植や人工授精、人への人工授精などの他、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、一般に用いられている培養細胞、生体から採取した検査用または移植用の細胞または組織、生体外で培養した細胞または組織などの凍結保存に用いることができる。

１ 把持部
２ａ ガラス化液吸収体
２ｂ ガラス化液吸収体
２ｃ ガラス化液吸収体
２ｄ ガラス化液吸収体
３ 多孔質金属体
４ 支持体
５ ガラス化凍結保存用治具

Claims (1)

1. 多孔質金属体をガラス化液吸収体として有する細胞または組織のガラス化凍結保存用治具。