JP7030661B2 - 凍結保存液 - Google Patents
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Description
L-グルタミン、フェノールレッド、25mMのHEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)を含む市販のMedium199培地(Life Technologies製)を基礎液として、有機溶媒系耐凍剤としてエチレングリコールを15容量%とDMSO(ジメチルスルホキシド)を15容量%、糖類としてスクロースを0.5M、抗生物質としてゲンタマイシンを50mg/L、エチレンオキサイド基を有する変性ポリビニルアルコールである日本合成化学工業(株)のゴーセネックスWO-320R(ケン化度88mol%)を0.5質量%含有する実施例1の凍結保存液を作製した。
ゴーセネックスWO-320Rの含有量を0.5質量%にかえて、0.9質量%とした以外は実施例1と同様にして、実施例2の凍結保存液を作製した。
ゴーセネックスWO-320Rの含有量を0.5質量%にかえて、1.8質量%とした以外は実施例1と同様にして、実施例3の凍結保存液を作製した。
ゴーセネックスWO-320Rの含有量を0.5質量%にかえて、2.5質量%とした以外は実施例1と同様にして、実施例4の凍結保存液を作製した。
ゴーセネックスWO-320Rを添加せず、エチレンオキサイド基を有する変性ポリビニルアルコールである日本合成化学工業(株)のゴーセネックスWO-320N(ケン化度99mol%)を0.5質量%含有させた以外は実施例1と同様にして、実施例5の凍結保存液を作製した。
ゴーセネックスWO-320Nの含有量を0.5質量%にかえて、0.9質量%とした以外は実施例5と同様にして、実施例6の凍結保存液を作製した。
ゴーセネックスWO-320Nの含有量を0.5質量%にかえて、1.8質量%とした以外は実施例5と同様にして、実施例7の凍結保存液を作製した。
ゴーセネックスWO-320Nの含有量を0.5質量%にかえて、2.5質量%とした以外は実施例5と同様にして、実施例8の凍結保存液を作製した。
ゴーセネックスWO-320Rを添加しなかった以外は、実施例1と同様にして、比較例1の凍結保存液を作製した。
ゴーセネックスWO-320Rを添加せず、エチレンオキサイド基を有さないポリビニルアルコールである日本合成化学工業(株)製のゴーセノール(登録商標)EG05P(ケン化度88mol%)を0.9質量%含有させた以外は実施例1と同様にして、比較例2の凍結保存液を作製した。
細胞又は組織の剥離性の評価に用いるスフェアは以下のように調整した。マウス胚性線維芽細胞であるMEF細胞を培養シャーレ上で培養後、トリプシン処理により剥離、回収した。その後、住友ベークライト(株)製PrimeSurface(登録商標)96Uプレートに50細胞/ウェルの細胞数で播種し、浮遊培養することでスフェア形成を誘導した。培養3日後に直径約100μmのスフェアを得た。
細胞又は組織の凍結保存作業に用いる凍結保存用治具は以下のようにして準備した。透明PETフィルム上に接着層として、ヘンケルジャパン(株)製のホットメルトウレタン樹脂Purmelt(登録商標)QR 170-7141Pを乾燥時の固形分量30g/m2となるように塗布した。なお、接着層の塗布は載置部領域には行わず、周辺のみとした。接着層が完全硬化する前に、保存液吸収体として、アドバンテック東洋(株)製の親水化処理されたポリテトラフルオロエチレン多孔体(細孔径0.2μm、空隙率71%、厚み35μm)を貼り合わせ、これを細胞又は組織を載置する載置部とした。この載置部を1.5mm×20mmの大きさに裁断し、載置部の短辺側をスティック状のABS樹脂製把持部と接合させ、凍結保存用治具を作製した。
上記のように得たスフェアを培養液中から回収し、細管状の治具であるストリッパーピペッター(以下、ピペット)を用いて、少量の培養液とともに平衡化液中に移動させた。なお、平衡化液の組成は、前記Medium199培地を基礎液として、7.5容量%エチレングリコール、7.5容量%DMSO(ジメチルスルホキシド)、50mg/Lゲンタマイシンを含有させたものである。スフェアを平衡化液中で3分間浸漬させた後に、ピペットを用いて、少量の平衡化液とともに、実施例1~8または比較例1、2の凍結保存液中に移した。スフェアを凍結保存液中で数回ピペッティングした後に、凍結保存液に浸漬後40秒経過後のタイミングで、前記凍結保存用治具の載置部上にピペットを用いて、スフェアを極少量の凍結保存液とともに、滴下付着させた。スフェアを滴下付着後、凍結保存液が自動的に保存液吸収体に吸収される様子を顕微鏡下で確認しながら、余分な凍結保存液が概ね吸収されたことを確認した後に、凍結保存用治具の載置部上のスフェアを液体窒素に浸漬させ、凍結させた。なお、スフェアを凍結保存液中で数回ピペッティングした後、液体窒素中に浸漬させるまでの時間はおよそ1分であった。凍結された凍結保存用治具は、融解作業を行うまでの間、液体窒素中で保存した。
凍結作業における凍結保存液中でのピペット操作の際の作業性を以下の基準で評価した。これらの結果を表1の「凍結作業における作業性の評価」の項目に示す。
○:ピペット操作が容易であり、凍結保存液中でのピペッティング等の作業性は良好であった。
△:ピペット操作にやや支障があったが、凍結保存液中でのピペッティング等の一連の作業は可能であった。
×:ピペット操作に支障があり、ピペット操作が困難であった。
実施例1~8または比較例1、2の凍結保存液によって凍結作業を行ったスフェアを以下の操作によりそれぞれ融解操作を行った。液体窒素中から凍結したスフェアを含む凍結保存用治具を取り出し、37℃に温調した融解液中に、スフェアが載置された凍結保存用治具の載置部を浸漬した。融解液の組成は、前記Medium199培地を基礎液として、1Mのスクロース、50mg/Lゲンタマイシンを含有するものである。融解液中に浸漬した載置部を顕微鏡下で観察しながら、スフェアを載置部上から剥離することを試みた。なお、スフェアの剥離作業は以下のように行った。融解液に載置部を浸漬後、60秒間は静置しながらスフェアが載置部上から剥離する様子を観察した。融解液浸漬から60秒経過後にスフェアが剥離しなかった場合には、載置部をゆすってスフェアの剥離を試みた。
融解作業における載置部上からのスフェアの剥離性を以下の基準で評価した。これらの結果を表1の「融解作業における剥離性の評価」の項目に示す。
◎:融解液浸漬後60秒以内にスフェアが載置部上から剥離した。
○:融解液浸漬後60秒経過後、載置部をゆすってスフェアを載置部上から剥離できた。
×:スフェアを回収することが容易にできないほどに固着しており、剥離できなかったか、回収の際にスフェアを構成する細胞がバラバラになってしまった。
Claims (1)
- エチレンオキサイド基を有する変性ポリビニルアルコールを0.1~3質量%含有することを特徴とする凍結保存液。
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JP2018167445A JP7030661B2 (ja) | 2018-09-07 | 2018-09-07 | 凍結保存液 |
Applications Claiming Priority (1)
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JP2018167445A JP7030661B2 (ja) | 2018-09-07 | 2018-09-07 | 凍結保存液 |
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JP2020039261A JP2020039261A (ja) | 2020-03-19 |
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Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2017060457A (ja) | 2014-10-23 | 2017-03-30 | 三菱製紙株式会社 | 細胞又は組織の凍結保存用治具および凍結保存方法 |
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- 2018-09-07 JP JP2018167445A patent/JP7030661B2/ja active Active
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