JP5825571B2 - 生体試料を凍結保存するための凍結保存用具 - Google Patents

Description

本発明は、組織片や細胞などの生体試料を凍結保存するための凍結保存用具に関する。

近年、がんに対する集学的治療の進歩に伴い、がん患者の治療後の生存率が向上している。その一方で、治療寛解後の若年女性がん患者において、治療によって引き起こされる卵巣機能の廃絶が問題となっている。すなわち、化学療法や、外科手術、放射線療法などにより卵巣の機能が失われてしまい、妊孕性消失や早発閉経、更年期障害または骨粗鬆症の発症などにより女性としてのＱＯＬが低下することが問題となっている。若年女性がん患者に対して治療を行う場合、卵巣の機能を維持することは、妊孕性温存という観点だけではなく、女性としてのＱＯＬを維持するためにも重要である。

治療後も卵巣機能を維持する方法として、治療前に卵巣組織を体外に摘出して凍結保存し、治療寛解後に融解した卵巣組織を自家移植することが提案されている。２００４年には、この方法により卵巣機能を維持した女性から生児を得られたことが報告されている（非特許文献１参照）。その後も、欧州を中心に卵巣組織を凍結保存する試みがなされており、自家移植後に生児を得たとする報告が相次いでいる。しかしながら、この技術による生児獲得率は高いとはいえず、生児獲得率の向上に向けて解決すべき課題は山積している。

卵巣組織の凍結保存法は、緩慢凍結法とガラス化凍結法とに大別される。緩慢凍結法は、プログラムフリーザーを用いて卵巣組織をゆっくりと時間をかけて凍結する方法である。現時点では、緩慢凍結法が標準的な凍結保存法であると認識されている。しかしながら、緩慢凍結法では、細胞内外に形成される氷晶による物理的傷害や、溶液中の水が氷結して塩濃度が高くなることによる塩害などにより卵巣組織の細胞がダメージを受けてしまうことが指摘されている。その結果、緩慢凍結法で凍結保存した卵巣組織では、融解後の卵胞発育過程における卵母細胞の発育と顆粒膜細胞の成熟とのバランスが損なわれている可能性がある。

一方、ガラス化凍結法は、氷晶の形成を抑制するために、凍結保護剤を高濃度で含む凍結溶液中に浸漬した卵巣組織を急速に凍結する方法である（例えば、特許文献１参照）。ガラス化凍結法は、プログラムフリーザーや植氷操作を必要とせず、緩慢凍結法に比べて簡便な方法である。また、ヒト卵巣組織を用いた基礎的な実験報告もあり、形態学的に正常な原子卵胞の割合が緩慢凍結法とガラス化凍結法とでほぼ同様であったと報告されている。ガラス化凍結法は、卵巣組織に与えるダメージが小さく、かつ簡便に行える手法であることから、緩慢凍結法に代わる凍結保存法として期待されている。

ガラス化凍結法では、凍結溶液中に浸漬した卵巣組織を液体窒素に直接浸漬して急速に凍結させる。現在、卵巣組織を液体窒素に浸漬させる際に用いられる凍結保存用具としては、多数の貫通孔を設けられた金属板が用いられている（例えば、特許文献２参照）。

図１は、現在用いられている凍結保存用具（特許文献２に記載されている組織片凍結保存用プレートと実質的に同じもの）を示す模式図である。図１Ａに示されるように、従来の凍結保存用具１０は、多数の貫通孔２２を設けられた金属板からなる試料載置部２０と、試料載置部２０の基端部に固定された保持部３０と、チューブ本体４０とを有する。保持部３０には、チューブ本体４０を密封しうるスクリューキャップ３２が設けられている。図１Ｂに示されるように、凍結保存する卵巣組織５０は、試料載置部２０の上に載置された状態で液体窒素中に浸漬される。凍結された卵巣組織５０は、試料載置部２０の上に載置された状態でチューブ本体４０内に収容され、保存される。

図１Ａに示されるように、従来の凍結保存用具１０では、卵巣組織を載置される金属板（試料載置部２０）に多数の貫通孔２２が設けられている。特許文献２では、このように多数の貫通孔２２を設けることで、液体窒素が卵巣組織の裏側（卵巣組織と金属板との接触面側）にも直接接触できるようになり、かつ金属板自体も冷却されやすくなるので、卵巣組織をより急速に凍結できると説明されている。

特開２００３−２８４５４６号公報 特開２００８−２２２６４０号公報

Donnez, J., et al., "Livebirth after orthotopictransplantation of cryopreserved ovarian tissue", Lancet, Vol.364, pp.1405-1410.

しかしながら、特許文献２に記載の従来の凍結保存用具では、ガラス化凍結法で生体試料を凍結保存する際に、生体試料の冷却速度を十分に上げられないことがある。

前述の通り、従来の凍結保存用具は、生体試料と液体窒素との接触面積を増やすために金属板（試料載置部）に多数の貫通孔を設けている。このように貫通孔を設けられた金属板を液体窒素中に浸漬すると、液体窒素中で常時発生している窒素ガス（気泡）がこの貫通孔にトラップされてしまうことがある。このように窒素ガスが貫通孔にトラップされてしまうと、凍結保存する生体試料と液体窒素との間に窒素ガスが介在してしまうことになる。その結果、−１９６℃の液体窒素で生体試料から直接熱エネルギーを奪うことができなくなることになる。また、窒素ガスなどの気体は熱伝導度が極めて低いことから、冷却速度は顕著に低下してしまう。このように生体試料の冷却速度が不十分な場合、凍結させる際に生体試料がダメージを受けてしまうおそれがある。

また、特許文献２に記載の従来の凍結保存用具には、貫通孔よりも小さい生体試料（例えば、細胞）を凍結させることができないという問題もある。

本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、生体試料が小さくても凍結させることが可能であり、かつ窒素ガスなどの気体による断熱効果を防止して生体試料をより速やかに凍結させることができる凍結保存用具を提供することを目的とする。

本発明者は、貫通孔を設けられていないグラファイトシートを試料載置部として利用することで、窒素ガスなどの気体による断熱効果を防止しつつ生体試料をより速やかに凍結させうることを見出し、さらに検討を加えて本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、以下の凍結保存用具に関する。
［１］生体試料を凍結保存するための凍結保存用具であって：生体試料を載置されるグラファイトシートを含む試料載置部と、前記試料載置部の基端部に固定された保持部とを有し；前記グラファイトシートの生体試料を載置される領域は貫通孔を有していない、凍結保存用具。
［２］前記グラファイトシートは、貫通孔を有していない、［１］に記載の凍結保存用具。
［３］前記グラファイトシートは、細胞膜透過型耐凍結剤を２〜６ｍｏｌ／Ｌ、細胞保護剤を０〜１００ｇ／Ｌ、および細胞膜非透過型耐凍結剤を０〜１ｍｏｌ／Ｌ含有する溶液の液膜で被覆されている、［１］または［２］に記載の凍結保存用具。
［４］前記細胞膜透過型耐凍結剤は、エチレングリコール、ジメチルスルフォキシド、グリセロール、プロパンジオール、アセトアミド、プロピレングリコール、ブタンジオールまたはこれらの組み合わせである、［３］に記載の凍結保存用具。
［５］前記細胞保護剤は、ポリビニルピロリドン、ヒアルロナン、ポリビニルアルコール、フィブロネクチン、不凍タンパク質、不凍アミノ酸またはこれらの組み合わせである、［３］または［４］に記載の凍結保存用具。
［６］前記細胞膜非透過型耐凍結剤は、スクロース、トレハロース、ラクトース、ラフィノースまたはこれらの組み合わせである、［３］〜［５］のいずれか一項に記載の凍結保存用具。
［７］前記試料載置部は、前記グラファイトシートを支持する補強部材をさらに有する、［１］〜［６］のいずれか一項に記載の凍結保存用具。

本発明によれば、組織片や細胞などの生体試料をより速やかに凍結させうる凍結保存用具を提供することができる。本発明の凍結保存用具を用いれば、組織片や細胞などの生体試料をより簡便かつ確実に凍結保存することができる。

従来の凍結保存用具を示す模式図 本発明の一実施の形態に係る凍結保存用具を示す模式図 本発明の一実施の形態に係る凍結保存用具の使用態様を示す模式図

本発明の凍結保存用具は、組織片や細胞などの生体試料をガラス化凍結法（急速ガラス化凍結法および超急速ガラス化凍結法を含む）で凍結させるための凍結保存用具である。本発明の凍結保存用具は、グラファイトシートを含む試料載置部と、試料載置部の基端部に固定された保持部とを有する。

本発明の凍結保存用具は、１）試料載置部（グラファイトシート）の生体試料が載置される領域に貫通孔が設けられていないこと、および２）試料載置部としてグラファイトシートを用いることを主たる特徴とする。以下、本発明の凍結保存用具の各構成要素について説明する。

試料載置部は、生体試料（例えば、組織片や細胞など）を載置されるグラファイトシートを有する。グラファイトシートは、グラファイト（黒鉛）をシート状に加工したものであり、非常に高い熱伝導率を有する。本発明の凍結保存用具では、生体試料をより速やかに凍結させるために、試料載置部としてグラファイトシートを採用する。

グラファイトシートは、その製造方法により天然グラファイトシートと人工グラファイトシートとに大別される。天然グラファイトシートは、天然のグラファイトを化学処理した後、加圧してシート状にしたものである。一方、人工グラファイトシートは、高分子フィルムを熱分解してグラファイト化したものである。試料載置部に使用するグラファイトシートは、天然グラファイトおよび人工グラファイトのいずれでもよいが、生体試料をより速やかに凍結させるという観点からは、配向性の低い天然グラファイトシートよりも、単結晶に近い構造を有する人工グラファイトシートの方がより好ましい。単結晶に近い構造を有する人工グラファイトシートは、例えば７００〜１６００Ｗ／（ｍ・Ｋ）と非常に高い熱伝導率を有する。この熱伝導率の値は、熱伝導率が高い材料として知られている銅の熱伝導率の約２〜４倍である。また、単結晶に近い構造を有する人工グラファイトシートは、高い強度を有しつつ軽量であり（銅の約１／１０〜１／４倍）、耐低温性にも優れている。

窒素ガスなどの気体のトラップを防止するため、グラファイトシートの生体試料を載置される領域には、貫通孔が設けられていない。このように貫通孔が設けられていない平板（シート）を試料載置部とすることで、試料載置部において窒素ガスなどの気体がトラップされることを防止し、窒素ガスなどの気体の断熱効果による冷却速度の低下を防止することができる。その一方で、貫通孔が設けられていない平板（シート）を試料載置部とすると、生体試料の裏側（生体試料と試料載置部との接触面側）において生体試料が液体窒素などの冷却媒体と接触することができず、冷却速度が低下してしまうことが危惧される。しかしながら、本発明の凍結保存用具では、試料載置部として熱伝導率が非常に高いグラファイトシートを使用することで、この問題を解消している。

前述の通り、グラファイトシートは、生体試料を載置される領域に貫通孔が設けられていなければよい。したがって、生体試料を載置される領域以外の領域には貫通孔が設けられていてもよいし、設けられていなくてもよい。後者の場合は、グラファイトシート全体に貫通孔が設けられていないことになる。

グラファイトシートの大きさは、凍結させる生体試料の大きさなどに応じて適宜設定すればよい。グラファイトシートの厚さは、生体試料を保持しうる強度を確保するためにはある程度の厚さが必要であるが、熱伝導性の観点からはより薄い方が好ましい。たとえば、グラファイトシートの厚さは、１０〜１００μｍの範囲内であればよい。

グラファイトシートの表面は、平滑であることが好ましい。後述するように、本発明の凍結保存用具を用いて生体試料を凍結させる際には、試料載置部を液体窒素などの冷却媒体に浸漬するが、グラファイトシートの表面に凹凸が存在すると、冷却媒体中で発生した気体（例えば、窒素ガス）がグラファイトシートの表面に付着しやすくなるおそれがある。生体試料の周囲において気体がグラファイトシートの表面に付着してしまうと、気体の断熱効果により生体試料の冷却速度を低下させてしまうおそれがある。グラファイトシートの表面を平滑にする方法は、特に限定されない。たとえば、グラファイトシートの表面を凍結溶液の液膜で被覆して、グラファイトシート表面の凹凸を無くせばよい。

グラファイトシートの表面を被覆する凍結溶液の種類は、グラファイトシート表面における気体（例えば、窒素ガス）の滑りをよくする溶液であれば特に限定されず、ガラス化凍結法で使用される公知の凍結溶液を使用してもよい。たとえば、グラファイトシートを被覆する凍結溶液としては、細胞膜透過型耐凍結剤を２〜６ｍｏｌ／Ｌ、細胞保護剤を０〜１００ｇ／Ｌ、および細胞膜非透過型耐凍結剤を０〜１ｍｏｌ／Ｌ含有する水溶液を使用することができる。細胞膜透過型耐凍結剤の例には、エチレングリコールやジメチルスルフォキシド、グリセロール、プロパンジオール、アセトアミド、プロピレングリコール、ブタンジオールなどが含まれる。これらの細胞膜透過型耐凍結剤は、単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて使用してもよい。細胞保護剤の例には、ポリビニルピロリドンやヒアルロナン、ポリビニルアルコール、フィブロネクチン、不凍タンパク質、不凍アミノ酸などが含まれる。これらの細胞保護剤は、単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて使用してもよい。細胞膜非透過型耐凍結剤の例には、スクロースやトレハロース、ラクトース、ラフィノースなどが含まれる。これらの細胞膜非透過型耐凍結剤は、単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて使用してもよい。

グラファイトシートは柔軟なため、そのままでは生体試料を同じ位置に保持できないことがある。そこで、試料載置部は、グラファイトシートが生体試料を同じ位置に保持できるようにグラファイトシートを支持する補強部材を有していてもよい。補強部材の形状および補強部材を構成する材料は、生体試料の冷却速度を低下させなければ特に限定されない。たとえば、補強部材は、グラファイトシートの周囲に固定された金属細線である（実施の形態参照）。

保持部は、試料載置部の基端部に固定されたグリップである。ユーザ（例えば、医療従事者）は、手で直接またはピンセットなどの器具を用いてこの保持部を保持して、生体試料を載置された試料載置部を液体窒素などの冷却媒体に浸漬する。保持部の大きさおよび形状は特に限定されず、ユーザが保持しやすい大きさおよび形状であればよい。

本発明の凍結保存用具を用いて生体試料を凍結させる方法は、特に限定されないが、例えば、１）試料載置部のグラファイトシート（貫通孔が設けられていない領域）上に凍結させる生体試料を載置し、２）生体試料を載置された試料載置部を冷却媒体（例えば、液体窒素やスラッシュ窒素、液体ヘリウム、液体プロパン、エタンスラッシュなど）に静かに浸漬させればよい。ガラス化凍結法で生体試料を凍結保存する場合、凍結保存する生体試料は凍結溶液に浸漬されている。したがって、１）のステップでグラファイトシート上に載置される生体試料は、凍結溶液に浸漬された生体試料である。また、前述の通り、１）のステップで生体試料をグラファイトシートの上に載置する前に、グラファイトシートを凍結溶液の液膜で被覆してもよい。

以上のように、本発明の凍結保存用具は、生体試料を載置する部分に貫通孔が設けられていないため、生体試料の裏面に気体（例えば、窒素ガスなど）がトラップされることがなく、かつ小さい試料も載置することができる。また、本発明の凍結保存用具は、生体試料の裏面に気体がトラップされないことに加えて、生体試料を載置するグラファイトシートの熱伝導度が非常に高いため、生体試料をより速やかに凍結することができる。

［実施の形態］
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。ここでは、インナーキャップ型のクライオチューブと一体化された本発明の凍結保存用具の例を示す。

図２は、本発明の一実施の形態に係る凍結保存用具を示す模式図である。図２に示されるように、本発明の凍結保存用具１００は、試料載置部１１０、保持部１２０およびチューブ本体１３０を含む。

試料載置部１１０は、グラファイトシート１１２および補強部材１１４を有する。グラファイトシート１１２は、凍結させる生体試料（例えば、組織片や細胞など）を載置される。グラファイトシート１１２には、貫通孔は設けられていない。たとえば、グラファイトシート１１２は、幅８ｍｍ、長さ２０ｍｍ、厚さ２５〜１００μｍのグラファイトシートである。一方、補強部材１１４は、グラファイトシート１１２の両端（対向する長辺）に設けられた金属板（金属細線）である。たとえば、補強部材１１４は、幅１ｍｍ、長さ２０ｍｍ、厚さ１ｍｍ以下の金属板（銅板、金板または銀板）である。

保持部１２０は、試料載置部１１０の基端部に固定された樹脂成型品（グリップ）である。保持部１２０はチューブ本体１３０を密閉するインナーキャップとしても機能する。保持部１２０を構成する樹脂の種類は、特に限定されず、一般的なクライオチューブで用いられている樹脂（例えば、ポリプロピレンなど）から選択すればよい。

チューブ本体１３０は、一般的なクライオチューブと同じ形状の、樹脂からなる容器である。チューブ本体１３０の形状は、特に限定されず、例えば丸底タイプ、コニカル底タイプまたは自立タイプのいずれであってもよい。チューブ本体を構成する樹脂の種類は、特に限定されず、一般的なクライオチューブで用いられている樹脂（例えば、ポリプロピレンなど）から選択すればよい。

図３は、本実施の形態の凍結保存用具１００の使用態様を示す模式図である。

図３Ａに示されるように、凍結させる生体試料２００（例えば、凍結溶液に浸漬した卵巣組織）は、試料載置部１１０のグラファイトシート１１２の上に載置される。このとき、試料２００を載置する前に、試料載置部１１０の表面を凍結溶液の液膜で被覆しておいてもよい。

次に、ユーザは保持部１２０を保持して、試料載置部１１０を液体窒素などの冷却媒体に浸漬させる。このとき、保持部１２０をピンセットなどで保持して、試料載置部１１０だけでなく保持部１２０も冷却媒体に浸漬させてもよい。試料載置部１１０を冷却媒体に浸漬させることにより、生体試料２００も冷却媒体に浸漬され、凍結する。生体試料２００の表面のうちグラファイトシート１１２と接触していない面は、冷却媒体と直接接触する。一方、グラファイトシート１１２と接触している面は、グラファイトシート１１２と接触する。本実施の形態の凍結保存用具１００では、グラファイトシート１１２に貫通孔が設けられていないため、生体試料２００とグラファイトシート１１２との間に気体（例えば、窒素ガス）がトラップされることはなく、生体試料２００とグラファイトシート１１２とは直接接触している。また、グラファイトシート１１２の熱伝導度が非常に高いため、生体試料２００は速やかに冷却される。

図３Ｂに示されるように、凍結された生体試料２００は、試料載置部１１０（グラファイトシート１１２）の上に載置された状態でチューブ本体１３０内に収容され、保存される。

［参考実験］
以下、参考実験として、グラファイトシート（本発明の凍結保存用具で使用）および金属板（従来の凍結保存用具で使用）の冷却速度および加温速度の測定結果を示す。

グラファイトシートは、厚さ１００μｍの結晶性グラファイトシート（ＰＧＳグラファイトシート；パナソニック）を使用した。金属板は、厚さ１００μｍの銅板（泰豊トレーディング株式会社）を使用した。グラファイトシートおよび銅板は、いずれも０.８ｃｍ×２ｃｍに切断したものを使用した。冷却速度および加温速度の測定には、表面温度センサを接続した記録計（ＥＢ２２０５；株式会社チノー）を使用した。

まず、表面温度センサを直接液体窒素中に浸漬して、０℃から−１００℃になるまでの時間を計測したところ、冷却速度は２６５００℃／分であった。この表面温度センサを液体窒素から大気雰囲気中に取り出して、−１００℃から０℃になるまでの時間を計測したところ、加温速度は６４５００℃であった。

次に、表面温度センサを２枚のグラファイトシートの間または２枚の銅板の間に挟んで固定した上で液体窒素中に浸漬して、０℃から−１００℃になるまでの時間を計測した。その結果、銅板に固定した表面温度センサでは、冷却速度が２５２４℃／分であったのに対し、グラファイトシートに固定した表面温度センサでは、冷却速度が１００２１℃／分であった。また、表面温度センサを固定されたグラファイトシートまたは銅板を液体窒素から大気雰囲気中に取り出して、−１００℃から０℃になるまでの時間を計測した。その結果、銅板に固定した表面温度センサでは、加温速度は４９５７℃／分であったのに対し、グラファイトシートに固定した表面温度センサでは、加温速度は３４６６７℃／分であった。測定結果を表１に示す。

以上の結果から、試料載置部としてグラファイトシートを使用する本発明の凍結保存用デバイスは、試料載置部として金属板を使用する従来の凍結保存用デバイスよりも熱伝導度に優れており、組織片や細胞などの生体試料の凍結保存により好適であることがわかる。

本発明の凍結保存用具は、組織片や細胞などの生体試料をより簡便かつ確実に凍結させることができる。たとえば、本発明の凍結保存用具は、卵巣組織や、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞などを凍結保存する際に有用である。

１０ 凍結保存用具
２０ 試料載置部
２２ 貫通孔
３０ 保持部
３２ スクリューキャップ
４０ チューブ本体
５０ 卵巣組織
１００ 凍結保存用具
１１０ 試料載置部
１１２ グラファイトシート
１１４ 補強部材
１２０ 保持部
１３０ チューブ本体
２００ 生体試料

Claims (4)

1. 生体試料を凍結保存するための凍結保存用具であって、
   生体試料を載置されるグラファイトシートを含む試料載置部と、
   前記試料載置部の基端部に固定された保持部と、を有し、
   前記グラファイトシートの生体試料を載置される領域は、貫通孔を有していない、
   凍結保存用具。
2. 前記グラファイトシートは、貫通孔を有していない、請求項１に記載の凍結保存用具。
3. 前記グラファイトシートは、細胞膜透過型耐凍結剤を２〜６ｍｏｌ／Ｌ、細胞保護剤を０〜１００ｇ／Ｌ、および細胞膜非透過型耐凍結剤を０〜１ｍｏｌ／Ｌ含有する溶液の液膜で被覆されており、
   前記細胞膜透過型耐凍結剤は、エチレングリコール、ジメチルスルフォキシド、グリセロール、プロパンジオール、アセトアミド、プロピレングリコール、ブタンジオールまたはこれらの組み合わせであり、
   前記細胞保護剤は、ポリビニルピロリドン、ヒアルロナン、ポリビニルアルコール、フィブロネクチン、不凍タンパク質、不凍アミノ酸またはこれらの組み合わせであり、
   前記細胞膜非透過型耐凍結剤は、スクロース、トレハロース、ラクトース、ラフィノースまたはこれらの組み合わせである、
   請求項１に記載の凍結保存用具。
4. 前記試料載置部は、前記グラファイトシートを支持する補強部材をさらに有する、請求項１に記載の凍結保存用具。

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