JP6184695B2 - 多重特異性抗体、抗体アナログ、組成物、及び方法 - Google Patents

多重特異性抗体、抗体アナログ、組成物、及び方法 Download PDF

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Description

関連出願への相互参照
本出願は２００９年１２月４日に出願された米国仮出願番号６１／２６７００６、及び２０１０年５月２０日に出願された米国仮出願番号６１／３４６５６６の優先権を主張し、これらの出願の両方が出典明記によってその全体が本明細書中に援用される。
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由でＡＳＣＩＩ形式で送信された配列表を含み、その全体が本明細書に参考として援用される。２０１０年１１月３０日に作成された前記ＡＳＣＩＩ形式のコピーはＰ４３７７Ｒ１ＷＯ．ｔｘｔと命名され、５３，５４９バイトの大きさである。
分野
少なくとも２つの異なるエピトープを結合する多重特異性抗体が提供される。天然型抗体（抗体アナログ）の構造変異体も与えられる。同様に与えられるのは様々な生物学的活性を持つ多重特異性抗体及び抗体アナログである。アゴニスト及びアンタゴニスト多特異性抗体、アゴニスト及びアンタゴニスト抗体の類似体が与えられる。治療および/または診断薬をコンジュゲートした多重特異性抗体及び抗体アナログもまた与えられるが、多重特異性抗体及び抗体アナログがそうした薬剤を欠いた多重特異性抗体及び抗体アナログと比較してインビボでの半減期を増加する薬剤とコンジュゲートしているためである。治療、研究、および診断における多重特異性抗体および抗体アナログの用途も与えられる。
モノクローナル抗体は癌、免疫学的及び神経学的疾患、また感染症をも含む様々な疾患の治療のための新しい治療法を供与してきた。Newsome, B. W.ら、Br J Clin Pharmacol 66(1):6-19 (2008); Chames, P.ら、Br J Pharmacol 157(2):220-33 (2009); Dimitrov, D. S.ら、Methods Mol Biol 525:1-27, xiii (2009).これらの治療法は、標的タンパク質との堅牢な強い相互作用及びモノクローナル抗体が提供する単一特異性のため、少なくとも部分的に成功している。モノクローナル抗体の比較的長い半減期及び安定性はインビボで望ましい投与レジメンを可能とし、細胞媒介性毒素は抗体のFc領域により保証されうる(Tabrizi, M. A.ら、Drug Discov Today 11(1-2):81-8 [2006])。ある状況では、治療用抗体は分泌された細胞表面タンパク質の重要な機能性領域に結合してそれを中和することにより、細胞のシグナルを遮断するために使用されている。モノクローナル抗体のそのような基本的性質は、従来の抗体に比して異なる作用機構を持つ分子治療の設計に現在用いられている(Dimitrov, D. S.ら、Methods Mol Biol 525:1-27, xiii [2009])。所定のそうした技術は現在臨床的開発にあり有望な兆候を示している(Chames, P.ら、Br J Pharmacol 157(2):220-33 [2009])。
例えば、一つのアプローチは、腫瘍へ細胞傷害性薬剤を送達するために抗体を用いた細胞特異的ターゲティングが含まれる。Carter, P. J.ら、Cancer J 14(3):154-69 (2008); Junutula, J. R.ら、Nat Biotechnol 26(8):925-32 (2008); Senter, P. D., Curr Opin Chem Biol 13(3):235-44 (2009).この場合、モノクローナル抗体の特異性は細胞毒性分子を標的細胞へ向け、それが必要とされる場所で、非標的細胞への影響を最小限に抑えつつ細胞傷害性成分の高い毒性を濃縮する。このような抗体−薬剤コンジュゲートは、非特異的毒性を最小限に抑える投与枠を維持しつつ、腫瘍細胞を死滅することにおける効力を増加させることを可能とする。
その他の例は、ｓｉＲＮＡなどの薬剤を含むナノ粒子等、機能性複合体の送達であり、ターゲティングのために粒子の表面上にモノクローナル抗体を含んでなる。Schiffelers, R. M.ら、Nucleic Acids Res 32(19):e149 (2004); Vornlocher, H. P., Trends Mol Med 12(1):1-3 (2006); Davis, M. E., Mol Pharm 6(3):659-68 (2009).
更に別のアプローチは、同時に２つの標的に結合する二重特異性分子を構築するための抗体の二価構造を使用する(Fischer, N.ら、Pathobiology 74(1):3-14 [2007])。二重特異性抗体は、特異性を増加して、効力を拡大し、従来のモノクローナル抗体では獲得できない新規な作用機構を活用する機会を提供する。Drakeman, D. L., Expert Opin Investig Drugs 6(9):1169-78 (1997); Kontermann, R. E., Acta Pharmacol Sin 26(1):1-9 (2005); Marvin, J. S.ら、Acta Pharmacol Sin 26(6):649-58 (2005); Marvin, J. S.ら、Curr Opin Drug Discov Devel 9(2):184-93 (2006); Shen, J.ら、J Biol Chem 281(16):10706-14 (2006); Chames, P.ら、Curr Opin Drug Discov Devel 12(2):276-83 (2009).一本の経路を阻害する二重特異性抗体を用いて２つの異なるレセプターを架橋することは多くの適用において有用性を示している。一例では、細胞表面のチロシンホスファターゼが、リン酸化のＩｇＥ受容体の活性を減少させるためにＩｇＥレセプター複合体に補充された(Jackmanら、J. Biol. Chem. 285:20850-20859 (2010))。二重特異性抗体によるシグナル伝達の阻害がリガンドの高濃度存在下においてさえも発生したため、このアプローチはリガンド結合部位を遮断するより効果的であった。同上。
細胞傷害性Ｔ細胞を補充する二重特異性抗体の使用はまた、Ｔ細胞活性化が、２つの異なる細胞型で同時に、二重特異性抗体結合レセプターにより、腫瘍細胞に近接して達成された臨床的機会も示している。Bargou, R., E.ら、Science 321(5891):974-7 (2008); Shekhar, C.,Chem Biol 15(9): 877-8 (2008); Baeuerle, P. A.ら、Cancer Res 69(12):4941-4 (2009).一つのアプローチでは、ＦｃγＲＩＩＩを結合した一つのアーム及びＨＥＲ２レセプターへ結合した別のアームを有する二重特異性抗体が、ＨＥＲ２抗原を過剰発現する卵巣癌および乳癌の治療のために開発された。(Hseih-Maら、Cancer Research 52:6832-6839 [1992]及びWeinerら、Cancer Research 53:94-100 [1993]).二重特異性抗体はまた、Ｔ細胞による死滅を媒介することができる。通常、二重特異性抗体は、Ｔ細胞上のＣＤ３複合体を腫瘍関連抗原へ連結する。抗ｐ１８５ＨＥＲ２へ連結した抗ＣＤ３からなる完全ヒト化Ｆ(ａｂ')２二重特異性抗体が、ＨＥＲ２レセプターを過剰発現する腫瘍細胞を死滅するＴ細胞を標的とするために使用された。Shalabyら、J. Exp. Med. 175(1):217 (1992).二重特異性抗体は、初期段階での複数の臨床試験で試験されており、有望な結果を与えている。一つの試験では、肺、卵巣又は乳癌の１２患者は抗ＣＤ３／抗腫瘍（ＭＯＣ３１）二重特異性抗体で標的とされた活性化Ｔリンパ球の注入で治療された。deLeijら、Bispecific Antibodies and Targeted Cellular Cytotoxicity, Romet-Lemonne, Fanger and Segal Eds., Lienhart (1991) 頁249。標的細胞は、腫瘍細胞のかなりの局所溶解、軽度の炎症反応を誘導したが、毒性副作用又は抗マウス抗体応答を誘導しなかった。
更に、二重特異性抗体は、感染症の治療に用いることができ（例えば、ＨＩＶ又はインフルエンザウイルスなどのウイルス感染細胞又はトキソプラズマ原虫などへのエフェクター細胞をターゲティングにおいて）、腫瘍細胞にイムノトキシンを送達したり、又は細胞表面レセプターに免疫複合体をターゲットするために使用される。例えば、Fangerら、Crit. Rev. Immunol. 12:101-124 (1992)を参照。たとえば、ＨＩＶ感染に関して、Bergら、PNAS (USA) 88:4723-4727(1991)は、マウスＣＤ４−ＩｇＧから誘導された二重特異性抗体−イムノアドヘシンキメラを作成した。これらの作業者は、２つのアームを有する四量体分子を構築した。一方のアームは、抗体軽鎖定常ドメインとＣＤ４融合体と共に、抗体の重鎖定常ドメインと融合したＣＤ４で構成されていた。他のアームは同じ抗体の完全な軽鎖とともに抗ＣＤ３抗体の完全な重鎖から構成されていた。ＣＤ４−ＩｇＧのアームのおかげで、この二重特異性分子は、細胞傷害性Ｔ細胞の表面上のＣＤ３に結合する。細胞傷害性細胞及びＨＩＶ−感染細胞の並置は後者の細胞の特異的死滅をもたらす。
数多くの方法が二重特異性抗体を含む多特異性抗体の合成のために記載されている。二価抗体断片の合成のための方法は、国際公開第９９／６４４６０号に記載されている。しかし、これらのアプローチの多くは、様々な問題を提示している。例えば、タンパク質発現及び大規模生産の困難さ、安定性及びインビボでの半減期、フォールディング及び凝集のすべてが報告されている。Morimoto, K.ら、J Immunol Methods 224(1-2):43-50 (1999); Kriangkum, J.ら、Biomol Eng 18(2):31-40 (2001); Segal, D. M. and B. J. Bast (2001). "Production of bispecific antibodies." Curr Protoc Immunol Chapter 2:Unit 2 13; Graziano, R. F.ら、Methods Mol Biol 283:71-85 (2004); Kontermann, R. E.ら、Methods Mol Biol 248:227-42 (2004); Das, D.ら、Methods Mol Med 109:329-46 (2005); Fischer, N.ら、Pathobiology 74(1):3-14 (2007); Shen, J.ら、J Immunol Methods 318(1-2):65-74 (2007)。更に、これらの方法の多くは煩雑で時間がかかり、従って構築されて望みの活性についてスクリーニングすることが可能な分子の数及び種類を制限している。本明細書に記載の方法はこれらの問題に対処し、本明細書に記載の方法、組成物、多重特異性抗体及び抗体アナログに更なる利点を与える。
特許出願及び出版物を含む本明細書に引用の全ての参考文献は、いかなる目的においても出典明示によりその全体が援用される。
本発明の方法および組成物は、高純度多特異性抗体及び抗体アナログの信頼性と再現性のある生産のための方法の開発に、少なくとも部分的に基づいている。所定の実施態様において、数多くの多重特異性又は単一特異性の組み合わせが容易に調製され、所望の活性についてスクリーニングすることができる。一態様にて、天然型抗体の構造変異体は、強力なアンタゴニストから強力なアゴニストの範囲に、その中間に様々なレベルの活性を持つ幅広い生物学的活性のスペクトルを有すことが可能であるという驚くべきかつ予期せぬ知見にもとずいて、抗体機能を改変する新しい方法が提供される。別の態様にて、本明細書に記載の方法を用いて、既存の親抗体から得られ、親抗体に関連しない新規な機能を有する多重特異性抗体及び抗体アナログが与えられる。本明細書に記載の方法及び多重特異性抗体及び抗体アナログは、少なくとも一部は、新しい治療薬及び診断薬及び研究ツールの製造、スクリーニング、同定及び開発のための新しいアプローチを与える。
一態様にて、多重特異性抗体を合成する方法が与えられ、第一の単一特異性及び遊離スルフヒドリル基を有する第一の親抗体から得た第一の抗体断片がチオ−反応性架橋剤と反応して抗体断片−架橋剤部分を生成し、及び抗体断片−架橋剤部分が第二の単一特異性及び遊離スルフヒドリル基を有する第二の親抗体から得た第二の抗体断片と反応し、多重特異性抗体を生成し、及び第一の単一特異性は第二の単一特異性とは異なる。所定の実施態様において、第一の親抗体は抗Ｈｅｒ１及び抗Ｈｅｒ２から選択される。所定の実施態様において、第一の親抗体は抗Ｈｅｒ２であり第二の親抗体は抗Ｈｅｒ１であり、又は第一の親抗体は抗Ｈｅｒ１であり第二の親抗体は抗Ｈｅｒ２である。所定の実施態様において、抗Ｈｅｒ２はＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）及び２Ｃ４（ペルツズマブ）から選択される。所定の実施態様において、第一の親抗体は抗Ｈｅｒ２であり、かつ第一の抗体断片は配列番号１、２、３、６、及び７から選択される軽鎖配列、及び／又は配列番号４、５、及び８から選択される重鎖配列を含む。所定の実施態様において、抗Ｈｅｒ１は、Ｄ１−５およびＣ３−１０１から選択される。所定の実施態様において、第一の親抗体は抗Ｈｅｒ１であり、かつ第一の抗体断片は配列番号１８、１９、２１及び２２から選択される軽鎖配列、及び／又は配列番号１７及び２０から選択される重鎖配列を含む。所定の実施態様において、抗Ｈｅｒ２はトラスツズマブ及びペルツズマブから選択され、及び抗Ｈｅｒ１はＤ１−５及びＣ３−１０１から選択される。所定の実施態様において、抗Ｈｅｒ２から得た抗体断片は、配列番号１、２、３、６、及び７から選択される軽鎖配列、及び／又は配列番号４、５、及び８から選択される重鎖配列を含み；及び抗Ｈｅｒ１から得た抗体断片は配列番号１８、１９、２１及び２２から選択される軽鎖配列、及び／又は配列番号１７及び２０から選択される重鎖配列を含む。
上記方法の更なる態様にて、第一の親抗体は、抗ＦｃγＲＩＩｂ及び抗ＦｃεＲＩαから選択される。所定の実施態様において、第一の親抗体は抗ＦｃγＲＩＩｂであり、第二の親抗体は抗ＦｃεＲＩαであり、又は第一の親抗体は抗ＦｃεＲＩαであり、第二の親抗体は抗ＦｃγＲＩＩｂである。所定の実施態様において、抗ＦｃγＲＩＩｂは５Ａ６である。所定の実施態様において、第一の親抗体は抗ＦｃγＲＩＩｂであり、第一の抗体断片は配列番号１１及び１２から選択される軽鎖配列、及び／又は配列番号９及び１０から選択される重鎖配列を含む。所定の実施態様において、抗ＦｃεＲＩαは２２Ｅ７である。所定の実施態様において、第一の親抗体は抗ＦｃεＲＩαであり、及び第一の抗体断片は配列番号１５及び１６から選択される軽鎖配列、及び／又は配列番号１３及び１４から選択される重鎖配列を含む。所定の実施態様において、抗ＦｃγＲＩＩｂから得た抗体断片は配列番号１１及び１２から選択される軽鎖配列、及び／又は配列番号９及び１０から選択される重鎖配列を含み；抗ＦｃεＲＩαから得た抗体断片は配列番号１５及び１６から選択される軽鎖配列、及び／又は配列番号１３及び１４から選択される重鎖配列を含む。
更に別の態様にて、チオ反応性架橋剤は、ビスマレイミドハロゲン化物、ビス-アルキルハロゲン化物、ピリジルジスルフィド、ビス-水銀塩、５-チオ-２-ニトロ安息香酸媒介架橋剤、及びビス-チオスルホン酸塩から選択される。一実施態様にて、架橋剤はビスマレイミドである。所定の実施態様において、第一の抗体断片及び／又は第二の抗体断片はシステイン改変抗体から得られる。所定のそうした実施態様にて、第一の抗体断片及び／又は第二の抗体断片はチオ-Ｆａｂ（ｔｈｉｏ-Ｆａｂ）である。所定の実施態様において、システイン改変抗体は残基の番号付けがＥＵ番号付けシステムによる軽鎖の位置１１０又は位置２０５においてシステイン置換を含む。所定の実施態様において、システイン改変抗体は残基の番号付けがＥＵ番号付けシステムによる重鎖の位置１１８又は位置１２１においてシステイン置換を含む。所定の実施態様において、第一の抗体断片及び／又は第二の抗体断片は天然型抗体から得られ、そこで天然型抗体はペプシンで消化されＦ（ａｂ’）２断片を生成し、Ｆ（ａｂ’）２断片は精製され、還元剤で処理された後、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の間のジスルフィドが再形成され、ヒンジ領域のシステイン残基は非酸化のままである条件下で酸化剤により処理される。
別の態様では、抗体アナログの合成方法が提供され、遊離スルフヒドリル基を持つ第一の抗体断片がチオ反応性架橋剤と反応して抗体断片−架橋剤部分を生成し、抗体断片−架橋剤部分が遊離スルフヒドリル基を持つ第二の抗体断片と反応して抗体アナログを生成し、単一親抗体から第一の抗体断片及び第二の抗体断片が得られる。所定の実施態様において、抗体アナログは、親抗体の抗原結合領域から構造的に異なる抗原結合領域を有している。所定の実施態様において、親抗体は抗Ｈｅｒ１、抗Ｈｅｒ２、抗ＦｃεＲＩα、及び抗ＦｃγＲＩＩｂから選択される。所定の実施態様において、抗Ｈｅｒ２はハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）及び２Ｃ４（ペルツズマブ）から選択される。所定の実施態様において、親抗体は抗Ｈｅｒ２であり、第一の抗体断片及び第二の抗体断片は、軽鎖配列が配列番号１、２、３、６、及び７から選択される同じ軽鎖を含み、及び／又は重鎖配列が配列番号４、５、及び８から選択される同じ重鎖を含む。所定の実施態様において、抗Ｈｅｒ１はＤ１−５及びＣ３−１０１から選択される。所定の実施態様において、親抗体は抗Ｈｅｒ１であり、第一の抗体断片及び第二の抗体断片は、軽鎖配列が配列番号１８、１９、２１、及び２２から選択される同じ軽鎖を含み、及び／又は重鎖配列が配列番号１７及び２０から選択される同じ重鎖を含む。所定の実施態様において、抗ＦｃγＲＩＩｂは５Ａ６である。所定の実施態様において、親抗体は抗ＦｃγＲＩＩｂであり、第一の抗体断片及び第二の抗体断片は、軽鎖配列が配列番号１１及び１２から選択される同じ軽鎖配列を含み、及び／又は重鎖配列が配列番号９及び１０から選択される同じ重鎖配列を含む。所定の実施態様において、抗ＦｃεＲＩαは２２Ｅ７である。所定の実施態様において、親抗体は抗ＦｃεＲＩαであり、第一の抗体断片及び第二の抗体断片は、軽鎖配列が配列番号１５及び１６から選択される同じ軽鎖を含み、及び／又は重鎖配列が配列番号１３及び１４から選択される同じ重鎖を含む。所定の実施態様において、親抗体はシステイン改変抗体である。所定の実施態様において親抗体は天然型抗体である。
更なる態様にて、上記のように多重特異性抗体または抗体アナログの合成法が与えられ、架橋剤は保護されたＳＨ基を含む修飾架橋剤である。一実施態様にて、修飾架橋剤はビスマレイミドアセチルアセテート（ＢＭａｔａ）である。所定の実施態様において、修飾架橋剤を含む多重特異性抗体または抗体アナログは官能基を含む薬剤と更に反応させる。所定の実施態様において、薬剤はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルブミン結合ペプチド（ＡＢＰ）、蛍光タグ、放射性イメージング剤、細胞傷害性薬剤、及びｓｉＲＮＡから選択される。所定の実施態様において、修飾架橋剤を含む多重特異性抗体または抗体アナログは更にＰＥＧと反応させる。所定の実施態様において、ＰＥＧは２０００ｍｗ（２Ｋ）ＰＥＧ、１２，０００ｍｗ（１２Ｋ）ＰＥＧ、又は２０，０００ｍｗ（２０Ｋ）ＰＥＧである。
更に別の態様にて、多重特異性抗体のパネルを合成する方法が与えられ、第一の単一特異性及び遊離スルフヒドリル基を有する第一の親抗体から得られた第一の抗体断片は、チオ-反応性架橋剤と反応させ、抗体断片−架橋剤部分を生成し、抗体断片−架橋剤部分は、各々が遊離スルフヒドリル基を有する、第一の親抗体由来の異なる単一特異性の一又は複数の親抗体から得られた２又はそれ以上の付加的抗体断片の各々と対で反応させ、多重特異性抗体のパネルを生成する。所定の実施態様において、抗体断片−架橋剤部分は、一以上の親抗体、又は二以上の親抗体、又は三以上の親抗体、又は四以上の親抗体、又は五以上の親抗体、又は十以上の親抗体、又は１５以上の親抗体、又は２０以上の親抗体、又は２５以上の親抗体、又は５０以上の親抗体、又は１００以上の親抗体から得られた各々の場合、第一の親抗体からの異なる単一特異性の各々の場合、三又はそれ以上の付加的抗体断片の各々、又は四又はそれ以上の付加的抗体断片の各々、又は五又はそれ以上の付加的抗体断片の各々、又は十又はそれ以上の付加的抗体断片の各々、又は１５又はそれ以上の付加的抗体断片の各々、又は２０又はそれ以上の付加的抗体断片の各々、又は２５又はそれ以上の付加的抗体断片の各々、又は５０又はそれ以上の付加的抗体断片の各々、又は１００又はそれ以上の付加的抗体断片の各々と対に反応させる。所定の実施態様において、第一の親抗体は抗Ｈｅｒ１、抗Ｈｅｒ２、抗ＦｃεＲＩα及び抗ＦｃγＲＩＩｂから選択される。所定の実施態様において、第一の抗体断片は抗Ｈｅｒ２から得られ、二またはそれ以上の付加的抗体断片の各々は抗Ｈｅｒ１から得られ、又は第一の抗体断片は抗Ｈｅｒ１から得られ、及び二以上の付加的抗体断片の各々は抗Ｈｅｒ２から得られ、又は第一の抗体断片は抗ＦｃεＲＩαから得られ、及び二以上の付加的抗体断片の各々は抗ＦｃγＲＩＩｂから得られ、又は第一の抗体断片は抗ＦｃγＲＩＩｂから得られ、及び二以上の付加的抗体断片の各々は抗ＦｃεＲＩαから得られる。所定の実施態様において、抗Ｈｅｒ２はハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）及び２Ｃ４（ペルツズマブ）から選択される。所定の実施態様において、抗Ｈｅｒ１は、Ｄ１−５およびＣ３−１０１から選択される。所定の実施態様において、抗Ｈｅｒ２はトラスツズマブ及びペルツズマブから選択され、及び抗Ｈｅｒ１は、Ｄ１−５およびＣ３−１０１から選択される。所定の実施態様において、抗ＦｃγＲＩＩｂは５Ａ６である。所定の実施態様において、抗ＦｃεＲＩαは２２Ｅ７である。所定の実施態様において、抗ＦｃγＲＩＩｂは５Ａ６であり抗ＦｃεＲＩαは２２Ｅ７である。所定の実施態様において、チオ反応性架橋剤はビスマレイミドハロゲン化物、ビス-アルキルハロゲン化物、ピリジルジスルフィド、ビス-水銀塩、５-チオ-２-ニトロ安息香酸媒介架橋剤、及びビス-チオスルホン酸塩から選択される。所定の実施態様において、チオ反応性架橋剤はビスマレイミドである。所定の実施態様において、第一の抗体断片及び／又は二以上の付加的抗体断片の各々はシステイン改変抗体から得られる。所定のそうした実施態様において、システイン改変抗体は、残基の番号付けがＥＵ番号付けシステムによる軽鎖の位置１１０又は位置２０５において置換を含む。所定の実施態様において、システイン改変抗体は残基の番号付けがＥＵ番号付けシステムによる重鎖の位置１１８又は位置１２１において置換を含み、その置換はシステインである。
さらに別の態様では、抗体アナログのパネルを合成する方法が提供され、遊離スルフヒドリル基を有する第一の抗体断片は、チオ-反応性架橋剤と反応させ抗体断片−架橋剤部分を生成し、抗体断片−架橋剤部分は、各々が遊離スルフヒドリル基を有する、２又はそれ以上の付加的抗体断片の各々と対で反応させ、抗体アナログのパネルを生成し、抗体断片の各々は単一の親抗体から得られる。所定の実施態様において、抗体断片−架橋剤部分は三以上の付加的抗体断片の各々、又は四以上の付加的抗体断片の各々、又は五以上の付加的抗体断片の各々、又は十以上の付加的抗体断片の各々、又は１５以上の付加的抗体断片の各々、又は２０以上の付加的抗体断片の各々、又は２５以上の付加的抗体断片の各々、又は５０以上の付加的抗体断片の各々と対に反応させ、抗体断片の各々は単一の親抗体から得られる。所定の実施態様において、パネルの一以上の抗体アナログは、親抗体の抗原結合領域とは構造的に異なる抗原結合領域を有する。所定の実施態様において、親抗体は抗Ｈｅｒ１、抗Ｈｅｒ２、抗ＦｃεＲＩα及び抗ＦｃγＲＩＩｂから選択される。所定の実施態様において、抗Ｈｅｒ２はトラスツズマブ及びペルツズマブから選択される。所定の実施態様において、抗Ｈｅｒ１はＤ１−５およびＣ３−１０１から選択される。所定の実施態様において、抗ＦｃγＲＩＩｂは５Ａ６である。所定の実施態様において、抗ＦｃεＲＩαは２２Ｅ７である。所定の実施態様において、チオ反応性架橋剤はビスマレイミドハロゲン化物、ビス-アルキルハロゲン化物、ピリジルジスルフィド、ビス-水銀塩、５-チオ-２-ニトロ安息香酸媒介架橋剤、及びビス-チオスルホン酸塩から選択される。一実施態様にて、チオ反応性架橋剤はビスマレイミドである。所定の実施態様において、親抗体はシステイン改変抗体である。所定のそうした実施態様において、システイン改変抗体は残基の番号付けがＥＵ番号付けシステムによる軽鎖の位置１１０又は位置２０５において置換を含み、置換はシステインである。所定の実施態様において、システイン改変抗体は残基の番号付けがＥＵ番号付けシステムによる重鎖の位置１１８又は位置１２１において置換を含み、置換はシステインである。
更なる態様にて、多重特異性抗体が与えられ、第一の単一特異性及び遊離スルフヒドリル基を有する第一の親抗体から得られた第一の抗体断片をチオ反応性架橋剤と反応させて抗体断片−架橋剤部分を生成し、その後抗体断片−架橋剤部分を、第二の単一特異性及び遊離スルフヒドリル基を有する第二の親抗体から得られた第二の抗体断片と反応させて多重特異性抗体を生成することを含む方法により合成され、ここで第一の単一特異性は第二の単一特異性とは異なる。所定の実施態様において、第一の親抗体は抗Ｈｅｒ１及び抗Ｈｅｒ２から選択される。所定の実施態様において、第一の親抗体は抗Ｈｅｒ２であり第二の親抗体は抗Ｈｅｒ１であり、又は第一の親抗体は抗Ｈｅｒ１であり第二の親抗体は抗Ｈｅｒ２である。所定の実施態様において、抗Ｈｅｒ２はハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）及び２Ｃ４（ペルツズマブ）から選択される。所定の実施態様において、第一の親抗体は抗Ｈｅｒ２であり、かつ第一の抗体断片は配列番号１、２、３、６、及び７から選択される軽鎖配列、及び／又は配列番号４、５、及び８から選択される重鎖配列を含む。所定の実施態様において、抗Ｈｅｒ１はＤ１−５及びＣ３−１０１から選択される。所定の実施態様において、第一の親抗体は抗Ｈｅｒ１であり、かつ第一の抗体断片は配列番号１８、１９、２１及び２２から選択される軽鎖配列、及び／又は配列番号１７及び２０から選択される重鎖配列を含む。所定の実施態様において、抗Ｈｅｒ２はトラスツズマブ及びペルツズマブから選択され、及び抗Ｈｅｒ１はＤ１−５及びＣ３−１０１から選択される。所定の実施態様において、抗Ｈｅｒ２から得た抗体断片は、配列番号１、２、３、６、及び７から選択される軽鎖配列、及び／又は配列番号４、５、及び８から選択される重鎖配列を含み；及び抗Ｈｅｒ１から得た抗体断片は配列番号１８、１９、２１及び２２から選択される軽鎖配列、及び／又は配列番号１７及び２０から選択される重鎖配列を含む。
上記の多重特異性抗体の更なる態様にて、第一の親抗体は抗ＦｃγＲＩＩｂ及び抗ＦｃεＲＩαから選択される。所定の実施態様において、第一の親抗体は抗ＦｃγＲＩＩｂであり第二の親抗体は抗ＦｃεＲＩαであり、又は第一の親抗体は抗ＦｃεＲＩαであり第二の親抗体は抗ＦｃγＲＩＩｂである。所定の実施態様において、抗ＦｃγＲＩＩｂは５Ａ６である。所定の実施態様において、第一の親抗体は抗ＦｃγＲＩＩｂであり、第一の抗体断片は配列番号１１及び１２から選択される軽鎖配列、及び／又は配列番号９及び１０から選択される重鎖配列を含む。所定の実施態様において、抗ＦｃεＲＩαは２２Ｅ７である。所定の実施態様において、第一の親抗体は抗ＦｃεＲＩαであり、及び第一の抗体断片は配列番号１５及び１６から選択される軽鎖配列、及び／又は配列番号１３及び１４から選択される重鎖配列を含む。所定の実施態様において、抗ＦｃγＲＩＩｂから得た抗体断片は配列番号１１及び１２から選択される軽鎖配列、及び／又は配列番号９及び１０から選択される重鎖配列を含み；抗ＦｃεＲＩαから得た抗体断片は配列番号１５及び１６から選択される軽鎖配列、及び／又は配列番号１３及び１４から選択される重鎖配列を含む。
さらに別の態様では、第一の親抗体がＴ細胞上の標的を特異的に結合し、第二の親抗体が腫瘍細胞上の標的を特異的に結合する、上記の方法で合成される多重特異性抗体が与えられる。所定の実施態様において、第一の親抗体は抗ＣＤ３であり、第二の親抗体は抗ＢＬＲ１、抗ＢＲ３、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ２２、抗ＣＤ７２、抗ＣＤ７９Ａ、抗ＣＤ７９Ｂ、抗ＣＤ１８０、抗ＣＲ２、抗ＦＣＥＲ２、抗ＦｃＲＨ１、抗ＦｃＲＨ２、抗ＦｃＲＨ５、抗ＦＣＲＬ４、抗Ｈｅｒ２、抗ＨＬＡ−ＤＯＢ、及び抗ＮＡＧ１４から選択される。所定の実施態様において、第一の親抗体は抗ＣＤ３であり、第二の親抗体は抗ＣＤ１９である。一実施態様において、第一の親抗体は抗ＣＤ３であり、第二の親抗体は抗ＣＤ２０である。一実施態様において、第一の親抗体は抗ＣＤ３であり、第二の親抗体は抗ＣＤ２２である。一実施態様において、第一の親抗体は抗ＣＤ３であり、第二の親抗体は抗ＦｃＲＨ５である。一実施態様において、第一の親抗体は抗ＣＤ３であり、第二の親抗体は抗Ｈｅｒ２である。所定の実施態様において、多重特異性抗体はポリエピトープ特異性を示す。所定の実施態様において、多重特異性抗体は親抗体の各々と区別がつかない一又は複数の生物学的活性を示す。所定の実施態様において、多重特異性抗体は親抗体の少なくとも一つと区別できる一又は複数の生物学的活性を示す。
その他の態様にて、抗体アナログが与えられ、遊離スルフヒドリル基を有する第一の抗体断片をチオ反応性架橋剤と反応させ抗体断片-架橋剤部分を生成し、次いで抗体断片-架橋剤部分を遊離スルフヒドリル基を有する第二の抗体断片と反応させ抗体アナログを生成することを含む方法で合成され、ここで第一の抗体断片及び第二の抗体断片は同じ親抗体から得られる。所定の実施態様において、親抗体は抗Ｈｅｒ１、抗Ｈｅｒ２、抗ＦｃεＲＩα及び抗ＦｃγＲＩＩｂから選択される。所定の実施態様において、抗Ｈｅｒ２はハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）及び２Ｃ４（ペルツズマブ）から選択される。所定の実施態様において、親抗体は抗Ｈｅｒ２であり、かつ第一の抗体断片は配列番号１、２、３、６、及び７から選択される軽鎖配列、及び／又は配列番号４、５、及び８から選択される重鎖配列を含む。所定の実施態様において、抗Ｈｅｒ１は、Ｄ１−５およびＣ３−１０１から選択される。所定の実施態様において、親抗体は抗Ｈｅｒ１であり、かつ第一の抗体断片は配列番号１８、１９、２１及び２２から選択される軽鎖配列、及び／又は配列番号１７及び２０から選択される重鎖配列を含む。所定の実施態様において、抗ＦｃγＲＩＩｂは５Ａ６である。所定の実施態様において、親抗体は抗ＦｃγＲＩＩｂであり、第一の抗体断片及び第二の抗体断片は軽鎖配列が配列番号１１及び１２から選択される同じ軽鎖配列、及び／又は重鎖配列が配列番号９及び１０から選択される同じ重鎖配列を含む。所定の実施態様において、抗ＦｃεＲＩαは２２Ｅ７である。所定の実施態様において、親抗体は抗ＦｃεＲＩαであり、かつ第一の抗体断片及び第二の抗体断片は軽鎖配列が配列番号１５及び１６から選択される同じ軽鎖配列、及び／又は重鎖配列が配列番号１３及び１４から選択される同じ重鎖配列を含む。所定の実施態様において、親抗体はシステイン改変抗体である。所定の実施態様において、親抗体は天然型抗体である。所定の実施態様において、抗体アナログは親抗体から区別できない一以上の生物学的活性を示す。所定の実施態様において、抗体アナログは親抗体から区別できる一以上の生物学的活性を示す。所定の実施態様において、生物学的活性は、細胞増殖である。所定の実施態様において、抗体アナログはＨｅｒ２発現細胞のアンタゴニストであり、親抗体はハーセプチン（登録商標）である。所定のそうした実施態様において、抗体アナログはビスＦａｂ１３２４、ビスＦａｂ１３２８、及びビスＦａｂ１３２９から選択される。所定の実施態様において、抗体アナログの生物学的活性は拮抗性であり、親抗体の生物学的活性は作動性である。所定の実施態様において、抗体アナログの生物学的活性は作動性であり、親抗体の生物学的活性は拮抗性である。所定の実施態様において、抗体アナログはＨｅｒ２発現細胞のアゴニストであり、親抗体はハーセプチン（登録商標）である。所定のそうした実施態様において、抗体アナログはビスＦａｂ１１８８、ビスＦａｂ１３２１、ビスＦａｂ１３２２、ビスＦａｂ１３２３、及びビスＦａｂ１３２５から選択される。
その他の態様にて、一つ以上の多重特異性抗体を含む組成物が提供される。所定の実施態様において、一つ以上の多重特異性抗体は、ビスＦａｂ１１８７、ビスＦａｂ１１８９、ビスＦａｂ１１９０、ビスＦａｂ１１９１、ビスＦａｂ１１９２、ビスＦａｂ１１９３、ビスＦａｂ１２９９、ビスＦａｂ１３００、ビスＦａｂ１３０１、ビスＦａｂ１３０２、ビスＦａｂ１３０３、ビスＦａｂ１３０４、ビスＦａｂ１３０５、ビスＦａｂ１３０６、及びビスＦａｂ１３０７から選択される。
別の態様において、一以上の抗体アナログを含む組成物が提供される。所定の実施態様において、一以上の抗体アナログは、ビスＦａｂ１１８８、ビスＦａｂ１２０４、ビスＦａｂ１３２１、ビスＦａｂ１３２２、ビスＦａｂ１３２３、ビスＦａｂ１３２４、ビスＦａｂ１３２５、ビスＦａｂ１３２６、ビスＦａｂ１３２７、ビスＦａｂ１３２８、ビスＦａｂ１３２９、ビスＦａｂ１４００、及びビスＦａｂ１４０１から選択される。
更に別の態様において、上記のように多重特異性抗体の治療有効量が治療を必要とする被検体に投与される癌の治療方法が提供される。所定の実施態様において、第一の抗体断片は抗Ｈｅｒ２であり、第二の抗体断片は抗Ｈｅｒ１である。所定の実施態様において、抗Ｈｅｒ２はハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）及び２Ｃ４（ペルツズマブ）から選択される。所定の実施態様において、抗Ｈｅｒ１は、Ｄ１−５およびＣ３−１０１から選択される。所定の実施態様において、第一の抗体断片は抗ＣＤ３であり、第二の抗体断片は抗ＢＬＲ１、抗ＢＲ３、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ２２、抗ＣＤ７２、抗ＣＤ７９Ａ、抗ＣＤ７９Ｂ、抗ＣＤ１８０、抗ＣＲ２、抗ＦＣＥＲ２、抗ＦｃＲＨ１、抗ＦｃＲＨ２、抗ＦｃＲＨ５、抗ＦＣＲＬ４、抗Ｈｅｒ２、抗ＨＬＡ−ＤＯＢ及び抗ＮＡＧ１４から選択される。一実施態様において、第一の抗体断片は抗ＣＤ３であり、第二の抗体断片は抗ＣＤ１９である。一実施態様において、第一の抗体断片は抗ＣＤ３であり、第二の抗体断片は抗ＣＤ２０である。一実施態様において、第一の抗体断片は抗ＣＤ３であり、第二の抗体断片は抗ＣＤ２２である。一実施態様において、第一の抗体断片は抗ＣＤ３であり、第二の抗体断片は抗ＦｃＲＨ５である。一実施態様において、第一の抗体断片は抗ＣＤ３であり、第二の抗体断片は抗Ｈｅｒ２である。
その他の態様にて、上記の通りの多重特異性抗体の量で、又はその薬学的に許容される塩又は溶媒和物を腫瘍細胞又は癌細胞を死滅させ又は増殖を阻害するために有効な量で細胞を処置することを含む、腫瘍細胞又は癌細胞を死滅させ又は増殖を阻害する方法が与えられる。
更に別の態様が与えられ、上記のような多重特異性抗体の有効量、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物の有効量をそれを必要としている被検体に投与することを含む自己免疫疾患又は感染症を治療するための方法を含む。
図１は実施例１に記載のビスＦａｂの合成方法を示す。パネル１、還元及び酸化によるチオ付加物の除去；パネル２、第一のチオＦａｂ又はヒンジＣｙｓＦａｂのビスマレイミド架橋剤との反応；パネル３、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による架橋剤を含む単量体種の単離、挿入パネル；パネル４、単量体架橋種の第二のチオＦａｂ又はヒンジ-ｃｙｓ-Ｆａｂとの反応、上のパネルの挿入は質量分析の結果及び１００ｋＤのビスＦａｂ生成物の単離を示し、下のパネルの挿入はＳＥＣによる２量体ビスＦａｂの単離を示す；パネル５、最終ビスＦａｂ生成物の模式図、２つの異なるビスＦａｂのＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析、非還元下及び還元下（＋ＤＴＴ）でのαＶＥＧＦ／αＨｅｒ２（１）及びαＶＥＧＦ／αＶＥＧＦ（２）。 図２は実施例２に記載されたように、所定のビスＦａｂの純度及び所定の生物学的特性を示す。（Ａ）左側、所定のビスＦａｂの模式図及びビスＦａｂ同定番号及び各ビスＦａｂの由来を与える表；右側、表にリストされたビスＦａｂの非還元ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析；（Ｂ）上のパネル、抗ＥＧＦＲ抗体由来Ｆａｂを含む所定のビスＦａｂによるＮＲ-ｇＤ-ＥＧＦＲ細胞中でのＴＧＦα刺激によるＥＧＦＲリン酸化；下のパネル、抗Ｈｅｒ２抗体由来Ｆａｂを含む所定のビスＦａｂによるＭＣＦ７細胞中におけるヘレグリン誘導Ｈｅｒ３リン酸化の阻害；（Ｃ）ＭＤＡ-１７５細胞の増殖についての表示されたビスＦａｂ及びＦａｂ分子の比較；（Ｄ）ＮＲ６-ＥＧＦＲ細胞の増殖についての表示されたビスＦａｂ、Ｆａｂ、及び抗体分子の比較；（Ｅ）ＭＤＡ-１７５細胞の増殖についてのペルツズマブ及びビスＦａｂ１２０４の比較；（Ｆ）ＢＴ４７４細胞の増殖についてのトラスツズマブ、トラスツズマブＦａｂ、及びビスＦａｂ１１８８の比較。 図３は、実施例３に記載されたように、トラスツズマブ由来のビスＦａｂ構造変異体の生成及び特性評価を示す。（Ａ）チオ付着点を示す４つのトラスツズマブ由来のＦａｂの模式図（上の部分）及び各ビスＦａｂのユニークな識別子及び各ビスＦａｂの由来を示す表（下の部分）；（Ｂ）ビスＦａｂの非還元ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；（Ｃ）ＢＴ４７４細胞増殖における様々な濃度でのビスＦａｂの作用；（Ｄ）経時的ＢＴ４７４細胞増殖における親抗体ハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）と比較したビスＦａｂ１３２５の作用（上向き斜め縞模様のバー）。下向き斜め縞模様のバー、無処置。 図４は、実施例３に記載されたように、指示されたビスＦａｂのゲルろ過分析を示す。相対保持時間（横軸）（ＲＴ）及び流体半径（Ｒｈ）が示される。 図５は実施例３に記載されたように、ＢＴ４７４細胞におけるＨｅｒ２ ビスＦａｂ及びハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）についてのシグナル伝達経路の分析結果を示す。（Ａ）ハーセプチンハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）による処置に応答したＡＫＴリン酸化のＥＬＩＳＡ分析、アゴニストビスＦａｂ１３２５、アンタゴニストビスＦａｂ１３２９又はｇＤ；（Ｂ）ハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）、アゴニストのビスＦａｂ１３２５、アンタゴニストのビスＦａｂ１３２９又はｇＤ(ｐＨＥＲ３、ｐＡＫＴ、ｐＭＡＰＫ：リン酸化特異的抗体；ＨＥＲ３、ＡＫＴ、ＭＡＰＫ：非リン酸化特異的抗体；チューブリン：コントロール）で処置されたＢＴ４７４における所定のＨｅｒシグナル伝達経路の酵素（ＨＥＲ３、ＡＫＴ、及びＭＡＰＫ）のリン酸化状態を探索するウエスタンブロット分析；（Ｃ）Ｈｅｒ２のトリプシン開裂に由来するリン酸化ペプチドの表。各ペプチドにおいて対象とするあるリン酸化残基はペプチド配列中で太字のイタリックタイプの小さな頭文字で示される。表はまた、無処置（基本）、ハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）による処置、アゴニストビスＦａｂ１３２５（Ｂｉｓ-Ｆａｂ）、又は１０ｎＭのヘレグリンによる処置後に、絶対的定量化（ＡＱＵＡ）又は標識フリー定量化により定量された、Ｈｅｒ２におけるリン酸化ペプチド部位の全リン酸化の質量分析を与える。データは、３つの独立した生物学的及び技術的な複製の平均を表しており、標準偏差（ＳＤ）を含む；（Ｄ）ＡＱＵＡ（ＡＱＵＡペプチド）に使用される重原子を含む合成ペプチドの一覧表；“＋１３Ｃ：”ＡＱＵＡペプチドにおける重炭素原子の数；“＋１５Ｎ：”ＡＱＵＡペプチドにおける重窒素原子の数；“付加質量：”天然ペプチドの質量に対するＡＱＵＡペプチドの全質量の増加；“重モノアイソトピック（heavy monoisotopic）ＭＨ＋：”単独荷電状態の重ペプチドの全質量；重原子を含むＡＱＵＡペプチドの残基は大きな太字、斜体、下線付きの頭文字で示される；ＡＱＵＡペプチドのリン酸化部位は、小さな、太字、斜体の頭文字で示される。（Ｅ）３つの処置群、ビスＦａｂ１３２５（ＢＦアゴニスト、上のグラフ）、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃ、中央のグラフ）及びヘレグリン（Ｈｒｇ、下のグラフ）はそれぞれ無処置に対して比較される対比較。リン酸化部位は、下のグラフの水平軸に沿って示され；リン酸化の平均パーセントの差異は、各グラフの縦軸に沿って示されている。
図６Ａ及び図６Ｂは、実施例４に記載されたように、ＥＬＩＳＡにより測定されたＦｃεＲＩα及びＦｃγＲＩＩＢの両方を発現するＲＢＬ細胞からのヒスタミン放出における指示されたビスＦａｂの濃度を増加の効果を示す。
図７は修飾架橋剤、ＢＭａｔａ（Ａ）及び実施例５に記載されたように、ペグ化されたビスＦａｂの合成の一般的なスキーム（Ｂ）を示す。
図８は実施例５に記載されたように、様々な大きさのＰＥＧ又はＡＢＰを含有するために修飾されたビスＦａｂＣ３-１０１Ｖ１１０Ｃ／ＨｅｒｃＶ１１０ＣのＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析（Ａ）及びＳ-２００ゲル濾過分析（Ｂ）を示す。
図９は実施例５に記載されたように、非修飾（ネイキッド）又は様々な大きさのＰＥＧ又はＡＢＰを含有するために修飾されたビスＦａｂＣ３-１０１Ｖ１１０Ｃ／ＨｅｒｃＶ１１０Ｃのマウス（Ａ）又はヌードラット（Ｂ）へ投与後の薬剤動態解析を示す。
図１０は実施例５に記載されたように、精製された２０ＫのＰＥＧ-ビスＦａｂ２Ｃ４Ｖ１１０Ｃ／Ｄ１-５Ｖ１１０ＣのＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析（Ａ）及びＣａｌｕ３細胞を用いる細胞増殖阻害アッセイを示す。
図１１は実施例５に記載されたように、ＳＣＩＤベージュマウスにおける２０ＫのＰＥＧ-２Ｃ４Ｖ１１０Ｃ／Ｄ１-５Ｖ１１０ＣビスＦａｂ(dithioFab)の薬剤動態実験を示す。（Ａ）血清濃度の時間に対するプロット；（Ｂ）血清濃度／投与量の時間に対するプロット。
図１２は実施例５に記載されたように、Ｃａｌｕ３異種移植マウスモデルにおける腫瘍細胞の増殖における、２０ＫのＰＥＧ-２Ｃ４Ｖ１１０Ｃ／Ｄ１-５Ｖ１１０ＣビスＦａｂ及び親抗体の各々、Ｃ２４及びＤ１-５の作用を示す。
図１３は実施例５に記載されたように、腫瘍が二倍の大きさになる（２ｘＶｏ）時間として分析された、Ｃａｌｕ３異種移植マウスモデルにおける腫瘍細胞の増殖における、２０ＫのＰＥＧ-２Ｃ４Ｖ１１０Ｃ／Ｄ１-５Ｖ１１０ＣビスＦａｂ及び親抗体の各々、Ｃ２４及びＤ１-５の作用を示す。（Ａ）カプラン・マイヤー分析；（Ｂ）一方向分析。
図１４は実施例５に記載されたように、腫瘍が１５００ｍｍ３の大きさに到達する時間として分析された、Ｃａｌｕ３異種移植マウスモデルにおける腫瘍細胞の増殖における、２０ＫのＰＥＧ-２Ｃ４Ｖ１１０Ｃ／Ｄ１-５Ｖ１１０ＣビスＦａｂ及び親抗体の各々、Ｃ２４及びＤ１-５の作用を示す。（Ａ）カプラン・マイヤー分析；（Ｂ）一方向分析。
所定の実施態様の詳細な記述
本発明の所定の実施態様に対して参照が詳細に行われ、その例を添付の構造及び式で説明する。本発明を列挙する実施態様と併せて説明するが、それらは本発明をその実施態様に限定することを意図するものではないことは理解されよう。逆に、本発明は特許請求の範囲によって定まる本発明の範囲に含まれうるあらゆる代替例、変形例、及び均等物を包含することが意図される。
当業者であれば、本発明の実施において使用されうるここに記載のものと同様な又は均等な多くの方法及び材料が分かるであろう。本発明は記載された方法及び材料に決して限定されるものではない。
特に定義のない限り、本明細書中で用いた技術及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者が共通して理解するものと同じ意味を有する。Singletonら、Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley &Sons (New York, N.Y. 1994); March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley &Sons (New York, N.Y. 1992); 及びJaneway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immunobiology, 5th Ed., Garland Publishing, New Yorkは、本出願で使用される多くの用語に対する一般的な指針を当業者に提供している。
所定の定義
本明細書を理解するために、以下の定義を適用し、適切な場合にはいつでも、単数で使用した用語には複数形も含まれ、その逆もそうである。以下に示すいずれかの定義が出典明記によって本明細書中に援用されるいずれかの文献と矛盾する場合、以下の定義が支配する。
本明細書にて商標名が使用される場合、出願人は独立して商標名製品の製剤、ジェネリック医薬品、及び商標名製品の医薬品有効成分（複数）を含めることを意図する。
「抗体」なる用語は本明細書にて広い意味で用いられ、２本の重鎖及び２本の軽鎖、及び、望みの生物学的活性（例えば、エピトープ結合活性）を示す限りそれらの任意の断片、変異体、バリアント又は誘導体を含む任意の免疫グロブリン（Ｉｇ）を言う。例えば、Miller ら、Jour. of Immunology 170:4854-4861(2003)を参照。抗体の例としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体、抗体アナログ及び抗体断片を含むが、これらに限定されない。抗体は、マウス、ヒト、ヒト化、キメラ、または他の種に由来し得る。
本明細書の抗体残基はＫａｂａｔの番号付けシステム及びＥＵ番号付けシステムに従って番号付けられる。Ｋａｂａｔの番号付け方式は一般に可変ドメイン（およそ、軽鎖の残基１−１０７及び重鎖の残基１−１１３）（例えば、Kabat ら、Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)）を指す場合に用いられる。「ＥＵ番号付けシステム」又は「EUインデックス」は一般に免疫グロブリン重鎖定常ドメインの残基を指す場合に用いられる（例えば、上掲のＫａｂａｔらに報告されたＥＵインデックス）。「ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックス」はヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。本明細書中で特に明記しない限り、抗体の可変ドメイン内の残基番号の参照は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによる残基番号付けを意味する。本明細書中で特に明記しない限り、抗体の定常ドメイン内の残基番号の参照は、ＥＵ番号付けシステムによる残基番号付けを意味する。
「多重特異性抗体」なる用語は最も広義に用いられ、ポリエピトープ性特異性を有する抗体を具体的に網羅する。多重特異性抗体は、限定されないが、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨＶＬユニットがポリエピトープ性特異性を有する抗体、二つまたはそれ以上のＶＬ及びＶＨドメインを有し、個々のＶＨＶＬユニットが異なるエピトープに結合する抗体、二つ又はそれ以上の単一可変ドメインを有し、各々の単一可変ドメインが異なるエピトープに結合する抗体、完全長抗体、及び一以上の抗体断片を含む抗体、並びに共有性又は非共有性に連結した抗体断片を含む抗体を含む。ある実施態様によると、多重特異性抗体は、５μＭから０．００１ｐＭ、３μＭから０．００１ｐＭ、１μＭから０．００１ｐＭ、０．５μＭから０．００１ｐＭ、又は０．１μＭから０．００１ｐＭの親和性で、各々のエピトープに結合するＩｇＧ抗体である。
「ポリエピトープ性特異性」なる用語は同一ターゲット又は異なるターゲット上の二つ又はそれ以上の異なるエピトープへ特異的に結合する多重特異性抗体の能力を指す。
「単一特異的」及び「単一特異性」なる用語は抗体が一つのエピトープのみに結合する能力を指し、ターゲット分子に特異的に結合する分子を具体的に網羅する。
「抗体アナログ」なる用語は本明細書にて最も広い意味で用いられ、ターゲット分子に単一特異性で特異的に結合し天然型抗体と構造的に異なる分子を具体的に網羅する。抗体アナログは天然型抗体由来の一以上の抗体断片を含み得る。抗体アナログは、限定されないが、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、ＶＨＶＬユニットが単一特異的である抗体アナログ、二つまたはそれ以上のＶＬ及びＶＨドメインを有し、各々のＶＨＶＬユニットが同一エピトープに対して単一特異的である抗体アナログ、二つ又はそれ以上の単一可変ドメインを有し、各々の単一可変ドメインが同一のエピトープに結合する抗体アナログ、一以上の抗体断片を含む抗体アナログ、共有性又は非共有性に連結した抗体断片を含む抗体アナログ、ＶＨＶＬユニット、単一可変ドメイン、及び／又は抗体断片が天然型抗体のそれとは異なる構造にある抗体アナログを含む。
「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部、典型的にはインタクトな抗体の抗原結合領域又は可変領域を含む。抗体断片の例は、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ')２、Ｆｖ、ダイアボディ(Ｄｂ)；タンデムダイアボディ(ｔａＤｂ)、直鎖状抗体（米国特許第５６４１８７０号、実施例２；Zapata ら、Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)）；ワンアームド抗体、単一可変ドメイン抗体、ミニボディ(Olafsenら、(2004) Protein Eng. Design & Sel. 17(4):315-323)、単鎖抗体分子、Ｆａｂ発現ライブラリーにより生成した断片、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、ＣＤＲ（相補性決定領域）、及びエピトープ結合断片を含む。
「Ｆａｂ」なる用語は、Ｈ鎖（ＶＨ）の可変領域ドメイン、及び一つの重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）とともに全Ｌ鎖（ＶＬおよびＣＬ）からなる抗体断片を言う。インタクトな抗体のパパイン消化は、２つのＦａｂ断片を生成するために使用することができ、その各々は単一の抗原結合部位を含む。典型的には、パパイン消化によって生成されたＦａｂのＬ鎖とＨ鎖断片は鎖間ジスルフィド結合によって連結されている。
「Ｆｃ」なる用語は、両方のＨ鎖のカルボキシ末端部分（ＣＨ２及びＣＨ３）及びジスルフィド結合により結合したヒンジ領域部分を含む。抗体のエフェクター機能はＦｃ領域の配列で決定され、この領域はまた特定の種類の細胞で見出されたＦｃ受容体（ＦｃＲ）によって認識される部分でもある。
「Ｆ（ａｂ’）２」なる用語は、インタクトな抗体のペプシン消化によって産生された抗体断片を指す。Ｆ（ａｂ '）２断片は、２つのＦａｂ断片及びジスルフィド結合によって結合されたヒンジ領域の一部を含む。Ｆ（ａｂ '）２断片は、二価の抗原結合活性を有し、抗原を架橋することが可能である。
用語Ｆａｂ’はＦ（ａｂ’）２断片の還元産物である抗体断片を指す。Ｆａｂ’断片は
抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に追加されたいくつかの残基を有することでＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは本明細書では定常ドメインのシステイン残基（複数）が遊離のチオール基を有するＦａｂ’の呼称である。
「ヒンジ領域」なる用語はヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０に伸展する抗体の部分を指す(Burton, Molec. Immunol.22:161-206 (1985))。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間Ｓ-Ｓ結合を形成する最初と最後のシステイン残基を同じ位置に配することにより、ＩｇＧ１と整合させられうる。
「Ｆｖ」なる用語は、１本の重鎖可変領域及び１本の軽鎖可変領域ドメインが非共有結合性に会合した２量体からなる抗体断片を指す。これら２つのドメインの折り畳みから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に対する抗原結合特異性を付与する６つの高頻度可変ループ(Ｈ及びＬ鎖から、それぞれ３つのループ)が生じる。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含んでなるＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりは低い親和性であるが、抗原を認識し結合する能力を持つ。
「一本鎖Ｆｖ」は「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」とも略され、一本のポリペプチド鎖へ連結したＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片を指す。典型的には、ｓＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓＦｖの概説については、Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, RosenburgおよびMoore編集, Springer-Verlag, New York, 頁269-315 (1994); Malmborg ら、J. Immunol. Methods 183:7-13, 1995を参照のこと。
「ダイアボディ(diabodies)」なる用語は、鎖間ではなく鎖内でＶドメインを対形成させ、二価の断片、すなわち２つの抗原-結合部位を有する断片が得られるように、ＶＨとＶＬドメインとの間に、短いリンカー(約５-１０残基)を持つｓＦｖ断片を構築することにより調製される小型の抗体断片を指す。二重特異性ダイアボディは２つの「交差」ｓＦｖ断片のヘテロダイマーであり、そこでは２つの抗体のＶＨ及びＶＬドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在する。典型的なダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開９３／１１１６１号；及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)に記載されている。
「ワンアームド抗体（One-armed antibody）」なる用語は、（１）ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン又はＣＨ２-ＣＨ３ドメインを含むポリペプチドへペプチド結合で連結された可変ドメイン、及び（２）可変ドメインを欠く第二のＣＨ２、ＣＨ３又はＣＨ２−ＣＨ３ドメインを含む抗体を指す。ワンアームド抗体は３つのポリペプチド、（１）可変ドメイン（例えばＶＨ）、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む第一のポリペプチド、（２）可変ドメイン（例えばＶＬ）及びＣＬドメインを含む第二のポリペプチド、及びＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む第三のポリペプチドを含む。ワンアームド抗体は、定常重鎖を連結するジスルフィド結合を形成する２つのシステイン残基を含む部分的ヒンジ領域を有し得る。
典型的には、ワンアームド抗体の可変ドメインは抗原結合領域を形成する。ある場合にはワンアームド抗体の可変ドメインは単一可変ドメインであり、各単一可変ドメインは抗原結合領域である。
「単一ドメイン抗体」（ｓｄＡｂｓ）又は「単一可変ドメイン（ＳＶＤ）抗体」なる用語は単一可変ドメイン（ＶＨ又はＶＬ）が抗原結合を与える抗体を指す。言い換えると、単一可変ドメインは標的抗原を認識し結合するために別の可変ドメインと相互作用する必要が無い。単一ドメイン抗体の例としては、ラクダ科動物（ラマ、ラクダ）及び軟骨魚類（例えば、テンジクザメ）由来のもの、及びヒト由来の組換え方法に由来するもの及びマウス抗体が含まれる(Nature (1989) 341:544-546; Dev Comp Immunol (2006) 30:43-56; Trend Biochem Sci (2001) 26:230-235; Trends Biotechnol (2003):21:484-490; 国際公開第２００５／０３５５７２号；国際公開第０３／０３５６９４号; Febs Lett (1994) 339:285-290;国際公開第００／２９００４号；国際公開第０２／０５１８７０号）。
「直鎖状抗体」なる用語は、Zapata等, Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)に記載された抗体を意味する。簡単に言えば、これらの抗体は、相補的な軽鎖ポリペプチドと共に抗原結合領域の対を形成する一対の直列のＦｄセグメント（ＶＨ-ＣＨ１-ＶＨ-ＣＨ１）を含む。直鎖状抗体は二重特異性であっても単一特異性であってもよい。
「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団に含まれる個々の抗体は少量で存在しうる天然に生じる可能性のある突然変異を除いて実質的に同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位に対するもので、高度に特異的である。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体の調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対して向けられている。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体により汚染されないで合成され得る点において有利である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体集団から得られ、任意の特定の方法による抗体の生産を必要とするとは解釈されない抗体の特徴を示す。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Kohler等,(1975) Nature, 256: 495によって最初に記載されたハイブリドーマ法により作成してもよいし、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４８１６５６７号、米国特許第５８０７７１５号を参照）により作成してもよい。また「モノクローナル抗体」はファージ抗体ライブラリから、例えば、Clackson等(1991) Nature, 352:624-628; Marks 等(1991) J. Mol. Biol., 222:581-597に記載された技術を用いて単離してもよい。
「インタクトな抗体」は、ＶＬおよびＶＨドメイン、並びに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む抗体を指す。定常ドメインは、天然の配列の定常ドメイン(例えばヒト天然配列定常ドメイン)又はそのアミノ酸配列変異体であってもよい。インタクトな抗体は、抗体のＦｃ定常領域(天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域)に起因する生物活性を指す一又は複数の「エフェクター機能」を有してよい。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞障害作用；Ｆｃレセプター結合；抗体依存性細胞媒介性細胞障害作用(ＡＤＣＣ)；食作用；及びＢ細胞レセプター等の細胞表面レセプターの下方制御が含まれる。
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、インタクトな抗体は異なる「クラス」に分類できる。インタクトな免疫グロブリン抗体の五つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、それらの幾つかは更に「サブクラス」（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３，ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２に分類される。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ及びμと称される。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び３次元構造はよく知られている。Ｉｇの形態にはヒンジの修飾又はヒンジの無い形態が含まれる（Roux等(1998) J. Immunol. 161:4083-4090; Lund等(2000) Eur. J. Biochem. 267:7246-7256;米国特許出願公開第２００５／００４８５７２号；米国特許出願公開第２００４／０２２９３１０号）。
「ＥｒｂＢレセプター」は、ＥｒｂＢレセプターファミリーに属するレセプタープロテインチロシンキナーゼであり、そのメンバーは、細胞増殖、分化および生存の重要なメディエーターである。ＥｒｂＢレセプターファミリーは、上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１、ＨＥＲ１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２又はｐ１８５ｎｅｕ）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）及びＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４又はｔｙｒｏ２）を含む４つの異なるメンバーが含まれる。抗ＥｒｂＢ２抗体のパネルは、ヒト乳癌細胞株ＳＫＢＲ３を使用して特徴づけられている(Hudziakら、(1989) Mol. Cell. Biol. 9(3):1165-1172。最大阻害は細胞増殖を５６％抑制した４Ｄ５と呼ばれる抗体で得られた。パネル内の他の抗体は、このアッセイにおいて、より少ない程度に細胞増殖を減少させた。抗体４Ｄ５はさらに、ＴＮＦ−αの細胞毒性効果に対してＥｒｂＢ２過剰発現乳癌細胞株を敏感にすることが判明した（米国特許第５６７７１７１号）。Hudziak等で議論された抗ErbB2抗体は、Fendlyら、(1990) Cancer Research 50:1550-1558; Kottsら、(1990) In Vitro 26(3):59A; Sarupら、(1991) Growth Regulation 1:72-82; Shepardら、J. (1991) Clin. Immunol. 11(3):117-127; Kumarら、(1991) Mol. Cell. Biol. 11(2):979-986; Lewisら、(1993) Cancer Immunol. Immunother. 37:255-263; Pietrasら、(1994) Oncogene 9:1829-1838; Vitettaら、(1994) Cancer Research 54:5301-5309; Sliwkowskiら、(1994) J. Biol. Chem. 269(20):14661-14665; Scottら、(1991) J. Biol. Chem. 266:14300-5; D'souzaら、Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91:7202-7206; Lewisら、(1996) Cancer Research 56:1457-1465; and Schaeferら、(1997) Oncogene 15:1385-1394で更に特徴付けられる。
ＥｒｂＢレセプターは、一般的に、細胞外ドメインを含む。ＥｒｂＢリガンド、親油性の膜貫通ドメイン、保存された細胞内チロシンキナーゼドメイン、及びリン酸化可能な幾つかのチロシン残基を保有するカルボキシル末端シグナル伝達ドメインを結合し得る。ＥｒｂＢレセプターは「天然配列」ＥｒｂＢレセプターまたはその「アミノ酸配列変異体」であってもよい。ＥｒｂＢレセプターファミリーのいくつかのメンバーが知られており、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１、ＨＥＲ１）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥｒｂＢ３（ＨＥＲ３）、及びＥｒｂＢ４（ＨＥＲ４）が含まれる。
「ＥｒｂＢ１」、「上皮成長因子レセプター」、「ＥＧＦＲ」及び「ＨＥＲ１」という用語は、ここで、互換的に使用され、例えばCarpenterら、(1987) Ann. Rev. Biochem. 56:881-914に開示されているようなＥＧＦＲを指し、その自然発生突然変異体（例えば、Humphreyら、PNAS(USA) 87:4207-4211(1990)に記載されているような欠失変異体ＥＧＦＲ）を含む。ｅｒｂＢ１なる用語は、ＥＧＦＲタンパク質産物をコードする遺伝子を指す。ＨＥＲ１に対する抗体は例えばMurthy等(1987) Arch. Biochem. Biophys., 252:549-560及び国際公開第９５／２５１６７号に記載される。
「ＥＲＲＰ」、「ＥＧレセプター関連タンパク質」、「ＥＧＦＲ関連タンパク質」及び「上皮成長因子レセプター関連タンパク質」なる用語は本明細書において互換的に使用され、例えば米国特許第６３９９７４３号、米国特許出願公開第２００３／００９６３７３号に開示されたＥＲＲＰを指す。
「ＥｒｂＢ２」及び「ＨＥＲ２」なる用語は、ここで互換的に使用され、例えばSemba等(1985) Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 82:6497-6501及びYamamoto等(1986) Nature, 319:230-234 (Genebank受託番号X03363)に記載されているヒトＨＥＲ２タンパク質を指す。「erbB2」という用語は、ヒトＥｒｂＢ２をコードする遺伝子を指し、「ｎｅｕ」はラットｐ１８５ｎｅｕをコードする遺伝子を指す。
「ＥｒｂＢ３」及び「ＨＥＲ３」なる用語は、ここで互換的に使用され、例えば米国特許第５１８３８８４号及び同第５４８０９６８号、並びにKraus等(1989) Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 86:9193-9197に開示されたレセプターポリペプチドを指す。ＥｒｂＢ３の抗体は、当技術分野で知られており、例えば、米国特許第５１８３８８４号、同第５４８０９６８号及び国際公開第９７／３５８８５号に記載されている。
「ＥｒｂＢ４」及び「ＨＥＲ４」なる用語は、ここで互換的に使用され、例えば欧州特許出願第５９９２７４号； Plowman ら、(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1746-1750;及びPlowman ら、(1993) Nature 366:473-475に開示されたレセプターポリペプチドを指し、例えば国際公開第９９／１９４８８号に開示されたそのアイソフォームを含む。ＨＥＲ４に対する抗体は例えば国際公開第０２／１８４４４号に記載されている。
ＥｒｂＢ受容体に対する抗体は、例えばサンタクルスバイオテクノロジー社、米国カリフォルニア州を含むいくつかの供給源から市販されている。
「アミノ酸配列変異体」という用語は、天然配列ポリペプチド由来と或る程度異なっているアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。通常、アミノ酸配列変異体は天然のＥｂｒＢリガンドの少なくとも１つのレセプター結合ドメインと又は天然のＥｂｒＢレセプターの少なくとも１つのリガンド結合ドメインと少なくとも約７０％の相同性を有しており、或いはそれらは該レセプター又はリガンド結合ドメインと少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％の相同性を有している。アミノ酸配列変異体は、天然アミノ酸配列のアミノ酸配列内の所定の位置での置換、欠失及び／又は挿入を有している。アミノ酸は、従来の名前、１文字及び３文字コードで指定される。
「配列同一性」は配列を整列させ必要に尾維持手ギャップを導入して最大パーセントの配列同一性を獲得した後で、同一であるアミノ酸配列変異体中の残基のパーセンテージとして定義される。整列するための方法およびコンピュータプログラムは、当技術分野において周知である。そのようなコンピュータプログラムの一つは、１９９１年１２月１０日に米国著作権局、ワシントンＤ．Ｃ．２０５５９へユーザー文書とともに提出された、ジェネンテック社により著された「アライン２（Ａｌｉｇｎ ２）」である。
「抗体依存性細胞媒介性細胞障害」又は「ＡＤＣＣ」とは、Ｆｃレセプター(ＦｃＲ)を発現する非特異的細胞傷害性細胞(例えば、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、好中球及びマクロファージ)が、標的細胞上に結合した抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起す細胞媒介反応を指す。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞ＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch及びKinet(1991), Annu. Rev. Immunol 9:457-92 の４６４頁の表３に要約されている。対象の分子のＡＤＣＣ活性をアッセイするために、米国特許第５５００３６２号又は同第５８２１３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイを実施することができる。このようなアッセイにおいて有用なエフェクター細胞には、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー細胞(ＮＫ細胞)が含まれる。代わりとして、もしくは付加的に、対象の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Clynes等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)において開示されているような動物モデルにおいて、インビボで評価することが可能である。
「ヒトエフェクター細胞」とは、一又は複数のＦｃＲｓを発現し、エフェクター機能を実行する白血球のことである。典型的にはエフェクター細胞は少なくともＦｃγＲIIIを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例として、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、単球、細胞障害性Ｔ細胞及び好中球が含まれる。エフェクター細胞は天然源、例えば血液又はＰＢＭＣから単離してもよい。
「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」なる用語は、抗体のＦｃ定常領域に結合するレセプターを記述するために使用される。典型的には、ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマレセプター）と結合するとはＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγ受容ＲＩＩＩサブクラスのレセプターを含むものであり、これらの受容体の対立遺伝子変異体及び選択的スプライシング型を含む。ＦｃγＲＩＩレセプターは、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化レセプター」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害レセプター」）を含み、主にその細胞質ドメインにおいて異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化レセプターＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫レセプターチロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害レセプターＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫レセプターチロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む。(総説のM. in Daeron, “Annu. Rev. Immunol.” 15:203-234 (1997)を参照)。FcRは、 Ravetch及びKinet, “Annu. Rev. Immunol”., 9:457-92 (1991); Capel等(1994) Immunomethods 4:25-34;及びde Haas等(1995) J. Lab. Clin. Med. 126:330-41にレビューされる。他のＦｃＲは、本明細書で用語「ＦｃＲ」により包含される。本用語はまた、胎児への母性ＩｇＧの転送に関与する新生児レセプター、ＦｃＲｎを含む(Guyer ら、(1976) J. Immunol., 117:587 and Kim ら、(1994) J. Immunol. 24:249)。
「補体依存性細胞障害」又は「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解する分子の能力を指す。補体経路の活性化は補体系(Ｃｌｑ)の第１補体が、同族抗原と結合した分子（例えば、抗体）に結合することにより開始される。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているように実施することができる。
「天然抗体」なる用語は、２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である天然に生じる基本的な４本鎖抗体ユニットを指す。（ＩｇＭ抗体は、Ｊ鎖と呼ばれる追加のポリペプチドと一緒に基本的なヘテロ四量体単位の５つから成り、従って１０の抗原結合部位を含み、一方分泌型ＩｇＡ抗体は重合し、Ｊ鎖と一緒に基本的な４鎖単位を２〜５含む多価の集合体を形成することができる）。ＩｇＧの場合には、４鎖単位は、一般的に約１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖は、１つの共有結合性ジスルフィド結合によりＨ鎖に連結されるが、２本のＨ鎖はＨ鎖のアイソタイプに応じて、１つ以上のジスルフィド結合によって互いに連結されている。各ＨおよびＬ鎖はまた規則的に間をあけた鎖間ジスルフィド結合を有する。各Ｈ鎖はＮ末端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、その後にα及びγ鎖の各々に対する３つの定常ドメイン（ＣＨ）及びμ及びεアイソタイプについての４つのＣＨドメインが続く。各Ｌ鎖はＮ末端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、その後他の終端で定常ドメイン（ＣＬ）が続く。ＶＬはＶＨと整列されており、ＣＬは、重鎖の第一の定常ドメイン（ＣＨ１）と整列される。特定のアミノ酸残基が軽鎖および重鎖可変ドメイン間のインタフェースを形成すると考えられている。VHおよびVLの組み合わせが、単一の抗原結合部位を形成する。抗体の異なるクラスの構造と特性については、例えば、Basic and Clinical Immunology,第８版, Daniel P. Stites, Abba I. Terr 及びTristram G. Parslow (編集), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, 頁71及び第６章を参照のこと。任意の脊椎動物種に由来するL鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる2つの明らかに異なるタイプのいずれかに割り当てることができる。
「可変」なる用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の高頻度可変領域と呼ばれる３つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を連結し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、３つの高頻度可変領域により連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲをそれぞれ含んでいる。各鎖の高頻度可変領域は、ＦＲによって近接して結合され、他の鎖の高頻度可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabat等, Sequence of Proteins ofImmunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, BEthesda, MD. (1991))。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）への抗体の関与を示す。
「高頻度可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」なる用語は、配列において高頻度可変であり、及び／又は構造的に定まったループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。一般に、抗体は６つの高頻度可変領域を含み；ＶＨに３つ(Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３)、ＶＬに３つ(Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３)である。天然の抗体では、Ｈ３及びＬ３は６つの高頻度可変領域のうちで最も高い多様性を示し、特にＨ３は抗体に良好な特異性を与える際に特有の役割を果たすように思われる。例えば、Xu等, Immunity 13:37-45 (2000); Johnson及びWu, in Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)を参照。実際、重鎖のみからなる天然に生じるラクダ科の抗体は機能的であり、軽鎖が無い状態で安定である。例えば、Hamers-Casterman 等, Nature 363:446-448 (1993); Sheriff 等, Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)を参照。
多数の高頻度可変領域の描写が使用され本明細書に包含される。Ｋａｂａｔ相補性決定領域(ＣＤＲ)は配列可変性に基づいており、最も一般的に使用されている(Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。Ｃｈｏｔｈｉａは、代わりに構造的ループの位置に言及している(Chothia及びLesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。ＡｂＭ高頻度可変領域は、ＫａｂａｔのＨＶＲ及びＣｈｏｔｈｉａの構造的ループの間の妥協を表し、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより使用される。「接触」ＨＶＲは、利用できる複合体結晶構造の分析に基づく。これらのＨＶＲの各々由来の残基を以下に示す。
ＨＶＲは、次のような「拡大高頻度可変領域」を含むことができる、即ち、ＶＬの２４−３６又は２４−３４(Ｌ１)、４６−５６又は５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７又は８９−９６(Ｌ３)及び、ＶＨの２６−３５(Ｈ１)、５０−６５又は４９−６５(Ｈ２)及び９３−１０２、９４−１０２、又は９５−１０２(Ｈ３)である。可変ドメイン残基には、これらの定義の各々について、上掲のＫａｂａｔ等に従って番号を付した。
「フレームワーク領域」（ＦＲ）は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。各可変ドメインは、一般的にＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４として同定される４つのＦＲを持つ。ＣＤＲがＫａｂａｔに従い定義され、軽鎖ＦＲ残基は残基およそ１−２３（ＬＣＦＲ１）、３５−４９（ＬＣＦＲ２）、５７−８８（ＬＣＦＲ３）および９８−１０７（ＬＣＦＲ４）に位置し、重鎖ＦＲ残基は重鎖残基の残基１−３０（ＨＣＦＲ１）、３６−４９（ＨＣＦＲ２）、６６−９４（ＨＣＦＲ３）および１０３−１１３（ＨＣＦＲ４）に位置する。ＣＤＲが高頻度可変ループからのアミノ酸残基を含むならば、軽鎖ＦＲ残基は軽鎖の残基１−２５（ＬＣＦＲ１）、３３−４９（ＬＣＦＲ２）、５３−９０（ＬＣＦＲ３）および９７−１０７（ＬＣＦＲ４）に位置し、重鎖ＦＲ残基は重鎖残基の残基１−２５（ＨＣＦＲ１）、３３−５２（ＨＣＦＲ２）、５６−９５（ＨＣＦＲ３）および１０２−１１３（ＨＣＦＲ４）に位置する。場合によって、ＣＤＲがＫａｂａｔの定義によるＣＤＲと高頻度可変ループのものの両方からのアミノ酸を含む場合、ＦＲ残基はそれに応じて調節されるであろう。例えば、ＣＤＲＨ１がアミノ酸Ｈ２６−Ｈ３５を含む場合、重鎖ＦＲ１残基は位置１−２５にあり、ＦＲ２残基は位置３６−４９にある。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選別において最も共通して生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選別は、可変ドメイン配列のサブグループから行う。一般に、配列のサブグループはＫａｂａｔによるサブグループである。所定の場合、ＶＬについて、サブグループはＫａｂａｔによるサブグループのカッパＩである。所定の場合、ＶＨについて、サブグループはＫａｂａｔによるサブグループＩＩＩである。
「キメラ抗体」は所望の生物学的活性が示される限り、Ｈ及び／又はＬ鎖の一部が、特定の種から得られた抗体か又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体内の対応する配列に同一か又は同種のものであり、一方、Ｈ及び／又はＬ鎖の残りの部分は、別の種から得られた抗体か又は別の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体、ならびにそのような抗体の断片内の、対応する配列に同一か又は同種のものである（米国特許第４８１６５６７号；Morrison ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)）。キメラ抗体には、非ヒト霊長類（旧世界ザル（Ｏｌｄ Ｗｏｒｌｄ Ｍｏｎｋｅｙ）、類人猿など）及びヒト定常領域部配列に由来した可変ドメイン抗原−結合配列を含む霊長類化した(primatized)抗体が含まれる。
非ヒト(例えば齧歯類)抗体の「ヒト化」形とは、非ヒト抗体から得られた最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような所望の抗体特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)の高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。幾つかの場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、全て又は実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに一致し、全て又は実質的に全てのＦＲがヒト免疫グロブリン配列である、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は場合によっては、免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。さらなる詳細は、Jones等, Nature 321, 522-525(1986)；Riechmann等, Nature 332, 323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596(1992)を参照のこと。
本明細書で使用される「複合体」又は「複合体化」は、ペプチド結合でない結合及び／又は力（例えば、ファンデルワールス、疎水性、親水性の力）によりお互いに相互作用する２以上の分子の会合を指す。所定の場合、複合体はヘテロ多量体である。本明細書で使用される「タンパク質複合体」又は「ポリペプチド複合体」は、タンパク質複合体（例えば、限定しないが、毒素、架橋剤、または検出剤などの化学分子を含む）のタンパク質にコンジュゲートした非タンパク質実体を有する複合体を含む。
本明細書で使用される「ヘテロ多量体」又は「ヘテロ多量体の」なる用語は、非ペプチド性、共有結合（例えばジスルフィド結合）及び／又は非共有結合性相互作用（例えば、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用）でお互いに相互作用する二以上のポリペプチドを記述し、ここで少なくとも２つのポリペプチドはお互いに異なるアミノ酸配列を有する。
分子標的又は対象の抗原を「結合する」抗体とは、抗体がタンパク質又は抗原を発現する細胞又は組織を標的とすることに有用であり、他のタンパク質と有意に交差反応しないように十分な親和性でその抗原を結合することが可能なものである。このような抗体は、例えば、診断及び／又は治療薬及び／又は研究用ツールとして有用である。典型的には、抗体の「非標的」タンパク質への結合の程度は、典型的な測定法、例えば蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）分析又は放射免疫沈降（ＲＩＡ）又はＥＬＩＳＡにより決定される場合、抗体のその特定の標的タンパク質への結合の約１０％未満であろう。
「特異的結合」又は「に特異的に結合する」又は「に特異的な」なる用語は、例えば、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド標的のエピトープなどの標的分子に対する抗体の結合を指し、非特異的な相互作用とは測定可能な差異を有する結合を意味する（例えば、非特異的な相互作用は、ウシ血清アルブミン又はカゼインへの結合であって良い)。特異的結合は、例えば、コントロール分子の結合と比較して標的分子の結合を決定することにより測定することができる。例えば、特異的結合は、標的、例えば標識していない過剰な量の標的に類似したコントロール分子との競合により決定することができる。この場合、プローブに対する標識した標的の結合が、標識していない過剰な量の標的により競合的に阻害された場合、特異的結合が示される。本明細書で用いる特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド標的上のエピトープに対する「特異的結合」又は「に特異的に結合する」又は「に特異的である」といった用語は、例えば、少なくともおよそ２００ｎＭ、あるいは少なくともおよそ１５０ｎＭ、あるいは少なくともおよそ１００ｎＭ、あるいは少なくともおよそ６０ｎＭ、あるいは少なくともおよそ５０ｎＭ、あるいは少なくともおよそ４０ｎＭ、あるいは少なくともおよそ３０ｎＭ、あるいは少なくともおよそ２０ｎＭ、あるいは少なくともおよそ１０ｎＭ、あるいは少なくともおよそ８ｎＭ、あるいは少なくともおよそ６ｎＭ、あるいは少なくともおよそ４ｎＭ、あるいは少なくともおよそ２ｎＭ、あるいは少なくともおよそ１ｎＭ又はそれ以上の対標的Ｋｄを有する分子によって提示されうる。所定の場合、「特異的な結合」なる用語は、分子が他のいかなるポリペプチド又はポリペプチドエピトープに実質的に結合すること無く特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープに結合する結合を指す。標的分子の例としては、血清可溶性タンパク質及びそれらのレセプター、例えば、サイトカイン及びサイトカインレセプター、アドヘシン、成長因子およびそれらのレセプター、ホルモン、ウイルス粒子（例えば、ＲＳＶ Ｆタンパク質、ＣＭＶ、ＳｔａｐｈＡ、インフルエンザ、Ｃ型肝炎ウイルス）、微生物（例えば、細菌細胞のタンパク質、真菌細胞）、アドヘシン、ＣＤタンパク質およびそのレセプターを含むが、これらに限定されない。
「結合親和性」は、分子(例えば抗体)の単一結合部位とその結合パートナー(例えば抗原)との間の非共有結合的な相互作用の総和の強度を指す。特に明記しない限り、本明細書で用いられる場合、「結合親和性」は、結合対のメンバー(例えば抗体と抗原)間の１：１の相互作用を反映する内因性結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、解離定数(Ｋｄ)として表される。例えば、Ｋｄはおよそ２００ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、８ｎＭ、６ｎＭ、４ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭであり又はそれより強い可能性がある。親和性は、本明細書中に記載のものを含む当業者に公知の共通した方法によって測定することができる。低親和性抗体は一般に抗原にゆっくり結合して素早く解離する傾向があるのに対し、高親和性抗体は一般に抗原により速く結合しより長く結合したままとなる。結合親和性の様々な測定方法が当分野で公知である。
本明細書で用いる場合、「Ｋｄ」又は「Ｋｄ値」は、例えば、およそ１０反応単位(ＲＵ)の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃のＢＩＡｃｏｒｅTM-２０００又はＢＩＡｃｏｒｅＴＭ-３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いた表面プラズモン共鳴アッセイを使用することによって測定された解離定数を指す。簡単に言うと、この方法は、提供者の指示書に従ってＮ-エチル-Ｎ'-(３-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)及びＮ-ヒドロキシスクシニミド(ＮＨＳ)で活性化したカルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(ＣＭ５，ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｃ.)を用いる。抗原を１０ｍＭ 酢酸ナトリウム(ｐＨ４．８)で５μｇ／ｍｌ(〜０．２μＭ)に希釈し、結合したタンパク質の反応単位(ＲＵ)がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入した。抗原の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。動力学的な測定のために、２倍の段階希釈したＦａｂ(例えば、０．７８ｎＭから５００ｎＭ)を２５℃で、およそ２５μｌ／分の流速で０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０(ＰＢＳＴ)を含むＰＢＳに注入した。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model) (BIAcore Evaluationソフトウェアバージョン3.2)を用いて、会合速度(Ｋｏｎ)及び解離速度(Ｋｏｆｆ)を算出した。平衡解離定数(Ｋｄ)をＫｏｆｆ／Ｋｏｎの比として算出した。例として、Chen, Y.ら、(1999) J. Mol Biol 293:865-881を参照。その表面プラスモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計(stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)又は撹拌キュベットを備えた8000シリーズSLM-Aminco分光光度計(ThermoSpectronic)で測定される場合、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ(ｐＨ７．２)、２５℃の、２０ｎＭの抗抗原抗体(Ｆａｂ型)の蛍光放出強度(励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ)における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定することができる。
「遊離のシステインアミノ酸」は、ポリペプチド中のシステインアミノ酸残基、例えば、チオール官能基を有し、かつ分子内ジスルフィド架橋もしくは分子間ジスルフィド架橋として対形成しない抗体又は抗体断片を指す。所定の場合、遊離システインアミノ酸残基は例えば、米国特許出願公開第２００７／００９２９４０号及びJunutula, J. R.ら、J Immunol Methods 332(1-2):41-52 (2008)に記載されたように親抗体中に改変される。
「チオール反応性値」なる用語は、遊離のシステインアミノ酸の反応性の定量的性質決定をいう。チオール反応性値は、システイン改変抗体における遊離のシステインアミノ酸の百分率であり、この抗体はチオール反応性試薬と反応し、そして最大値１に変換される。例えば、１００％の収率でチオール反応性試薬（例えば、ビオチン-マレイミド試薬）と反応してビオチン標識化抗体を形成する、システイン改変抗体上の遊離のシステインアミノ酸は、１．０のチオール反応性値を有する。チオール反応性試薬と８０％の収率で反応する、同じかもしくは異なる親抗体内に改変された別のシステインアミノ酸は、０．８のチオール反応性値を有する。チオール反応性試薬とまったく反応しない、同じかもしくは異なる親抗体内に改変された別のシステインアミノ酸は、０のチオール反応性値を有する。特定のシステインのチオール反応性値の決定は、ＥＬＩＳＡアッセイ、質量分析、液体クロマトグラフィー、オートラジオグラフィー、または他の定量的分析試験によって実施される。
「親抗体」は、1つ以上の抗体断片の源である抗体である。親抗体は、天然の配列もしくは野生型配列を含み得る。「親抗体」は、１つもしくはそれより多くのアミノ酸残基が１つもしくはそれより多くのシステイン残基によって置換されているアミノ酸配列を含む抗体である。親抗体は、抗体の他の天然型、野生型、もしくは改変形態に対して、事前に存在するアミノ酸配列改変（例えば、付加、欠失および／もしくは置換）を有し得る。親抗体は、目的の標的抗原、例えば、生物学的に重要なポリペプチドに対して指向され得る。親抗体は非ポリペプチド抗原（例えば、腫瘍関連糖脂質抗原；米国特許第５０９１１７８号参照）に対して指向され得る。典型的な親の抗体は、細胞表面および膜貫通型レセプター及び腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する親和性と選択性を有する抗体を含むが、これらに限定されない。
「単離された」抗体又はポリペプチドは、同定されており、かつ、その天然の環境の成分から、分離され及び／又は回収されている抗体である。その天然の環境の夾雑成分は、例えば診断的使用もしくは治療的使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモンおよび他のタンパク性溶質もしくは非タンパク性溶質が挙げられ得る。典型的には、抗体は、（１）ローリー法によって決定される抗体の重量の９５重量％より多く、そして最も好ましくは９９重量％より多くなるまで、（２）スピニングカップシークエネーター（spinning cup sequenator)の使用によってＮ末端アミノ酸配列もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るために十分な程度、または（３）クーマシーブルー染色もしくは銀染色を用いた還元条件もしくは非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均質になるまで、精製される。単離された抗体は、組換え細胞内のインサイツの抗体を含む。何故なら、この抗体の天然環境の少なくとも１種の成分が存在しないからである。しかし、通常は、単離された抗体は、少なくとも１回の精製工程によって調製される。
「実質的に均質な」、「実質的に均質な形態」及び「実質的均質性」なる句は、産物が望ましくないポリペプチドの組合せ（例えばホモ多量体）に由来する副産物を実質的に欠いていることを表すために用いられる。精製度に関して表すとき、実質的均質性は副産物の量が、１０重量％、９重量％、８重量％、７重量％、６重量％、４重量％、３重量％、２重量％又は１重量％を上回らないか、または１重量％未満であることを意味する。典型的には副産物は５％未満である。
本明細書で用いられる「Ｌｙｓ−Ｃエンドペプチダーゼ切断部位」は、Ｌｙｓ−ＣエンドペプチダーゼによりＣ末端側で切断されうるアミノ酸配列中のリジン残基である。Ｌｙｓ−Ｃエンドペプチダーゼはリジン残基のＣ末端側で切断する。
特に示されなければ、「モノクローナル抗体４Ｄ５」なる用語は、マウス４Ｄ５抗体（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０４６３）の、又は該抗体由来の抗原結合残基を有する抗体を指す。例えば、モノクローナル抗体４Ｄ５はマウスモノクローナル抗体４Ｄ５又はその変異体、たとえばヒト化４Ｄ５であってもよい。例示的なヒト化４Ｄ５は、米国特許第５８２１３３７号にあるようにｈｕＭＡｂ４Ｄ５−１、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−２、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−３、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−４、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−５、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−６、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−７及びｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８（トラスツズマブ、ハーセプチン（登録商標））を含む。
「処置する」もしくは「処置」なる用語は、被験体が、所望されない生理学的変化または疾患を予防されるかもしくは緩徐にされる（軽減される）、治療的処置および予防的（prophylactic)もしくは防衛的(preventative)手段の両方を指す。有益であるかもしくは所望される臨床結果としては、症状の緩和、疾患の程度の軽減、疾患の安定化（すなわち、悪化しない）状態、疾患の進行を遅延させるかもしくは緩徐にすること、疾患状態の改善もしくは緩和、および（部分的もしくは完全な）寛解が挙げられるが、これらに限定されない（検出可能であるか検出不可能であるかにかかわらない）。「処置」はまた、処置を受けなかった場合の予測される生存と比較した場合の、生存の延長（例えば癌の処置におけるような）を意味し得る。処置を必要とする者としては、既にこの状態もしくは障害を有する者、ならびにこの状態もしくは障害が予防されるべきである場合にこの状態もしくは障害に罹りやすい者が挙げられる。
「治療的に有効な量」なる用語は、被検体において疾患もしくは障害を処置するための、抗体、抗体断片、又は誘導体、例えば多重特異性抗体又は抗体アナログの量を言う。腫瘍（例えば癌性腫瘍）の場合、抗体又は抗体断片（例えば多重特異性抗体又は抗体アナログ）の治療的に有効な量は、癌細胞の数を減少させ得；原発腫瘍 サイズを縮小させ得；末梢器官への癌細胞浸潤を阻害し得（すなわち、ある程度遅らせ、そして好ましくは停止させる）；腫瘍転移を阻害し得（すなわち、ある程度遅らせ、そして好ましくは停止させる）；ある程度腫瘍増殖を阻害し得；及び／又は疾患に関連する１つもしくはそれより多くの症状をある程度軽減し得る。抗体又は抗体断片（多重特異性抗体又は抗体アナログ）が存在する癌細胞の増殖を予防し得る程度及び／又は存在する癌細胞を殺傷する程度に、それは細胞増殖抑制性及び／又は細胞傷害性であり得る。癌治療について、インビボでの効力は、例えば、生存期間、疾患進行の時間（ＴＴＰ）、反応速度（ＲＲ）、応答の持続時間、及び／又は生活の質を評価することによって測定され得る。
「低減するか又は阻害する」とは、２０％以上、或いは５０％以上、或いは７５％、８５％、９０％、９５％以上の全体の減少を引き起こす能力を意味する。低減又は阻害とは、治療される疾患の症状、転移の存在又はサイズ、原発性腫瘍のサイズ、又は血管形成性疾患の血管のサイズ又は数を指しうる。
「生物学的利用能」なる用語は、患者に投与される薬剤の所定の量の全身有効性(すなわち、血液／血しょう濃度)を指す。生物学的利用能は、投与された用量形態から体循環に達する薬剤の時間(速度)と総量(程度)の測定値を示す絶対的な用語である。
「癌」及び「癌性」なる用語は、一般的に調節不可能な細胞成長／増殖に特徴がある哺乳動物の生理学的状態を指すか又は表す。「腫瘍」は、1つ以上の癌細胞を含む。癌の例には、カルシノーマ、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病又はリンパ系悪性腫瘍が含まれるが、これに限定されるものではない。このような癌のより具体的な例には、扁平細胞癌(例えば上皮性扁平細胞癌)、肺癌(小細胞肺癌、非小細胞肺癌（NSCLC）、肺の腺癌、及び肺の扁平癌腫(squamous carcinoma)を含む)、腹膜癌、肝細胞癌、胃(gastric)又は腹部(stomach)癌(消化器癌及び胃腸癌を含む)、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、大腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓(kidney)又は腎(renal)癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌、肛門癌、陰茎癌、並びに頭頸部癌を含む。
「ＥｒｂＢ発現癌」はそれらの細胞表面に存在するＥｒｂＢタンパク質を持つ細胞を含むものである。「ＥｒｂＢ発現癌」は、抗ＥｒｂＢ２抗体が結合し癌に対する治療効果を持つことが可能なようにその細胞表面に十分な量のＥｒｂＢ２を生成するものである。
抗原性レセプターを過剰発現する癌は、同じ組織型の非癌細胞と比較して、その細胞表面で有意な量のレセプター、例えばＥｒｂＢ２を有するものである。このような過剰発現は、遺伝子増幅か、又は転写または翻訳の増加によって引き起こされ得る。レセプター過剰発現は細胞の表面上に存在するレセプタータンパク質の増加量を評価することにより、診断または予後のアッセイにおいて測定することができる（例えば、免疫組織化学アッセイ；ＩＨＣを介して）。代わりに又は付加的に、例えば蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ；国際公開第９８／４５４７９号を参照）、サザンブロッティング、またはリアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）のようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を介して細胞中のレセプターをコードする核酸の量を測定することができる。
ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を過剰発現する腫瘍は、細胞あたりに発現されたＨＥＲ２分子のコピー数に対応する免疫組織化学的スコアで評価され、生化学的に決定することが可能である：０＝０−１０，０００コピー／細胞、１＋＝少なくとも約２００，０００コピー／細胞、２＋＝少なくとも約５００，０００コピー／細胞、３＋＝約１−２ｘ１０６コピー／細胞。ＨＥＲ２の３＋レベルでの過剰発現は、チロシンキナーゼのリガンド依存性活性化へ導き(Hudziakら、(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7159-7163)、乳癌のおよそ３０％で生じ、これらの患者においては無再発生存期間および全生存率が減少する(Slamonら、(1989) Science, 244:707-712; Slamonら、(1987) Science, 235:177-182)。
本明細書で用いられる「細胞毒性」なる用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を意味する。この用語は、放射性同位元素(例えば、２１１Ａｔ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、２１２Ｂｉ、３２Ｐ、６０Ｃ、及びＬｕの放射性同位体)、化学療法剤、及び小分子毒素、または細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素活性毒素などの毒素（合成類縁体およびその誘導体を含む）を含むことを意図している。
本明細書において「アレルギー性または炎症性疾患は、個々の免疫システムの過剰活性化に起因する疾患または障害である。典型的なアレルギー性疾患または炎症性疾患は、限定されないが、喘息、乾癬、関節リウマチ、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、紅斑、湿疹、臓器移植、加齢黄斑変性症、クローン病、潰瘍性大腸炎、好酸球性食道炎、炎症に関連付けられている自己免疫疾患を含む。
本明細書において「自己免疫性疾患」は個体自身の組織又は器官から生じかつ指向された疾患又は障害又は共分離又はその徴候又はそこから得た結果の状態である。これらの自己免疫疾患および炎症性疾患の多くにおいて、多くの臨床及び検査用マーカーが存在し、限定されないが、高ガンマグロブリン血症、自己抗体の高レベル、組織での抗原-抗体複合体沈着物は、コルチコステロイドまたは免疫抑制治療の恩恵、患部組織におけるリンパ球細胞凝集体を含む。
Ｂ細胞媒介自己免疫疾患に関するいかなる理論に限定されることなく、Ｂ細胞は機械的な経路の多数を介してヒトの自己免疫疾患の病原性効果を発揮すると考えられており、自己抗体産生、免疫複合体形成、樹状突起及びＴ細胞活性化、サイトカイン合成、直接的ケモカイン放出を含み、異所性ネオ・リンパ球産生の病巣を提供している。
これらの経路の各々は、自己免疫疾患の病態に異なる度合いで関与し得る。自己免疫疾患は臓器特異的疾患（すなわち、免疫応答は、器官系、例えば内分泌系、造血系、皮膚、心肺系、胃腸や肝臓系、腎臓系、甲状腺、耳、神経系、中枢神経系などに対して特異的に指向される。）又は複数の器官系が影響する可能性がある全身性疾患（例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ、多発性筋炎など）であり得る。
「細胞増殖抑制性」なる用語は、細胞の機能を制限する効果、例えば細胞の細胞成長または増殖を制限することを指す。
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）、ジェネンテック／ＯＳＩ Ｐｈａｒｍ．）、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍ．)、フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標）、Ａｓｔｒａｚｅｎｅｃａ）、スーテント（ＳＵ１１２４８、Ｐｆｉｚｅｒ)、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、イマチニブメシル酸塩（ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＰＴＫ７８７／ＺＫ ２２２５８４（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、オキサリプラチン（Ｅｌｏｘａｔｉｎ（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ）、５−ＦＵ（５−フルオロウラシル）、ロイコボリン、ラパマイシン（シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ）、ラパチニブ（ＧＳＫ５７２０１６、グラクソ・スミスクライン）、ロナファーニブ（ＳＣＨ ６６３３６）、ソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６、Ｂａｙｅｒ Ｌａｂｓ．）、及びゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標）、アストラゼネカ）、ＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１（ＳＵ５２７１；Ｓｕｇｅｎ）、チオテパ及びシクロスホスファミド(CYTOXAN(登録商標))のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethiylenethiophosphoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(acetogenins）(特にブラタシン(bullatacin)及びブラタシノン(bullatacinone)）；カンプトセシン(合成類似体トポテカン(topotecan)；ブリオスタチン；カリスタチン(callystatin）；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン(adozelesin)、カルゼレシン(carzelesin)及びバイゼレシン(bizelesin)合成類似体を含む)；クリプトフィシン(cryptophycin)(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン(dolastatin）；デュオカルマイシン(duocarmycin ）（合成類似体、KW-2189及びCB1-TM1を含む）；エレトロビン(eleutherobin）；パンクラチスタチン(pancratistatin）；サルコディクチン(sarcodictyin）；スポンジスタチン(spongistatin）；クロランブシル、クロルナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード；ニトロスレアス(nitrosureas)、例えばカルムスチン(carmustine)、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン(lomustine)、ニムスチン、ラニムスチン；エネジイン(enediyne) 抗生物質等の抗生物質（例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンガンマ１Ｉ及びカリケアマイシンオメガＩ１（Agnew Chem Intl. Ed. Engl.,(1994) 33：183-186）；ダイネミシンＡ(dynemicinＡ）を含むダイネミシン(dynemicin）；クロドロネート（clodronate）などのビスフォスフォネート（bisphosphonate);エスペラマイシン(esperamicin）；同様にネオカルチノスタチン発光団及び関連色素蛋白エネジイン(enediyne) 抗生物質発光団）、アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、アントラマイシン(anthramycin)、アザセリン、ブレオマイシン(bleomycins)、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン(carminomycin）、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorubicin）、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ADRIAMYCIN(登録商標)ドキソルビシン (モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin）、イダルビシン、マセロマイシン(marcellomycin）、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン(mitomycins）、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；メトトレキセート及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ）などの抗-代謝産物；デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸類似体；フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)のようなピリミジン類似体；カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸(frolinic acid)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル(eniluracil)；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium acetate)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン(lonidainine)；メイタンシン(maytansine)及びアンサマイトシン(ansamitocin)のようなメイタンシノイド(maytansinoid)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダンモール(mopidanmol)；ニトラエリン(nitraerine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン(losoxantrone)；ポドフィリン酸（podophyllinic acid）；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖類複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン(rhizoxin)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン(trichothecenes)(特に、Ｔ-２トキシン、ベラキュリンＡ(verracurin A)、ロリデンＡ(roridin A)及びアングイデン(anguidine)）；ウレタン（urethan）；ビンデシン（vindesine）；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド（「Ara-C」）；シクロホスファミド（cyclophosphamide）；チオテパ；タキソイド、例えばタキソール(登録商標)パクリタキセル、（Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ）、ABRAXANETM クレモフォール(Cremophor)を含まない、アルブミン設計のナノ粒子形状のパクリタキセル(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois)及びタキソテア(登録商標）ドキセタキセル、（Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロランブシル；GEMZAR(登録商標)ゲンシタビン(gemcitabine)；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン及びカルボプラチンのようなプラチナ類似体；ビンブラスチン(VELBAN(登録商標))；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン（vincristine）；NAVELBINE(登録商標)ビノレルビン；ノバントロン(novantrone)；テニポシド（teniposide）；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ（xeloda）；イバンドロナート(ibandronate)；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸などのレチノイド類；カペシタビン(capecitabine)(XELODA(登録商標))；及び上述したものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
また、「化学療法剤」の定義に含まれるのは、（ｉ）抗卵胞ホルモン類及び選択的なエストロゲンレセプターモジュレータ類(ＳＥＲＭ)など、腫瘍におけるホルモン作用を調節し又は阻害するために働く抗ホルモン剤、例えば、タモキシフェン(NOLVADEX(登録商標)タモキシフェン)、ラロキシフェン、ドロロキシフェン(droloxifene)、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、LY117018、オナプリストン及びFARESTON・トレミフェンを含み；（ｉｉ）副腎のエストロゲン産生を制御する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害薬、例えば、例えば４(５)-イミダゾール、アミノグルテチミド、MEGASE(登録商標)メゲストロールアセテート、AROMASIN(登録商標) エキセメスタン、ホルメスタン、ファドロゾール、RIVISOR(登録商標) ボロゾール、FEMARA(登録商標) レトロゾール及びARIMIDEX(登録商標) アナストロゾール：（ｉｉｉ）フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリンなどの抗アンドロゲン;並びにトロキサチタビン(troxacitabine)(1,3-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体)、（ｉｖ）アロマターゼ阻害剤；（ｖ）プロテインキナーゼ阻害剤；（ｖｉ）脂質キナーゼ阻害剤；（ｖｉｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に異常な細胞増殖に関係するシグナル伝達経路の遺伝子の発現を阻害するもの、例として、例えばＰＫＣ-α、Ｒａｆ、Ｈ-Ｒａｓ；（ｖｉｉｉ）VEGF発現阻害剤（例えば、ANGIOZYMERリボザイム）およびHER2発現阻害剤などのリボザイム；（ｉｘ）遺伝子治療ワクチンなどのワクチン、例えばALLOVECTIN(登録商標)ワクチン、LEUVECTIN(登録商標)ワクチン及びVAXID(登録商標)ワクチン；PROLEUKIN（登録商標）rIL-2；LURTOTECAN(登録商標)トポイソメラーゼ１インヒビター、ABARELIX(登録商標)ｒｍＲＨ；（ｘ）ベバシズマブのような抗血管新生阻害剤（AVASTIN（登録商標）、ジェネンテック）；及び（ｘｉ）薬学的に受容可能な塩類、酸又は上記の何れかの誘導体である。
ここで用いられる際の「増殖阻害剤」は、細胞の増殖をインビトロ又はインビボの何れかで阻害する化合物又は組成物を意味する。よって、増殖阻害剤は、Ｓ期で細胞の割合を有意に減少させるものである。増殖阻害剤の例は、細胞周期の進行を（Ｓ期以外の位置で）阻害する薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキサン類、及びトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。またＧ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びアラ-Ｃである。更なる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakami等, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。タキサン類（パクリタキセル及びドセタキセル）は、共にイチイに由来する抗癌剤である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル（TAXOTERE（登録商標）、ローン・プーラン ローラー）は、パクリタキセル（TAXOL（登録商標）、ブリストル-マイヤー スクウィブ）の半合成類似体である。パクリタキセル及びドセタキセルは、チューブリン二量体から微小管の集合を促進し、細胞の有糸***を阻害する結果となる脱重合を防ぐことによって微小管を安定化にする。
本明細書で用いられる「抗癌療法」は被検体の癌を減少または阻害する処置を指す。抗癌治療の例としては、被検体に対する細胞傷害性放射線療法、並びに細胞傷害性薬剤、化学療法剤、成長阻害剤、癌ワクチン、血管新生阻害剤、プロドラッグ、サイトカイン、サイトカイン拮抗薬、コルチコステロイド、免疫抑制剤、制吐剤、抗体または抗体断片、又は鎮痛薬の治療上有効量の投与を含む。
「サイトカインアンタゴニスト」により、少なくとも１つのサイトカインの生物学的活性を部分的又は完全に遮断し、阻害し、又は中和する分子を意味する。例えば、サイトカインアンタゴニストはサイトカインの発現及び／又は分泌を阻害し、又はサイトカイン又はサイトカインレセプターへの結合によりサイトカインの活性を阻害し得る。サイトカインアンタゴニストは、サイトカイン又はサイトカインレセプターへ結合する抗体、合成又は天然型配列ペプチド、イムノアドヘシン、及び小分子アンタゴニストを含む。サイトカインアンタゴニストは、場合によっては細胞毒性剤にコンジュゲートするか又は融合される。例示的なＴＮＦアンタゴニストは、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標））、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））、およびアダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡＴＭ）である。
本明細書で用いられる「免疫抑制剤」なる用語は、処置される被検体の免疫系を抑制又は遮蔽するために働く物質を言う。これは、サイトカイン産生を抑制し、自己抗原の発現をダウンレギュレートまたは抑制し、あるいはＭＨＣ抗原を遮蔽する物質が含まれる。免疫抑制剤の例には、２-アミノ-６-アリル-５-置換ピリミジン(米国特許第４６６５０７７号を参照)；ミコフェノール酸モフェチル、例えばＣＥＬＬＣＥＰＴ(登録商標)；アザチオプリン(ＩＭＵＲＡＮ(登録商標)、ＡＺＡＳＡＮ(登録商標)／６‐メルカプトプリン；ブロモクリプチン；ダナゾール；ダプソン；グルタールアルデヒド(米国特許第４１２０６４９号に記載のように、ＭＨＣ抗原をマスキングするもの)；ＭＨＣ抗原およびＭＨＣ断片のための抗イディオタイプ抗体；サイクロスポリンＡ；副腎皮質ステロイドおよび糖質コルチコイドといったステロイド、例えばプレドニゾン、プレドニソロン、例えばＰＥＤＩＡＰＲＥＤ(登録商標)(プレドニソロンリン酸ナトリウム)又はＯＲＡＰＲＥＤ(登録商標)(プレドニソロンリン酸ナトリウム経口溶液)、メチルプレドニゾロンおよびデキサメサゾン；メトトレキセート(経口又は皮下)(ＲＨＥＵＭＡＴＲＥＸ(登録商標)、ＴＲＥＸＡＬＬＴＭ)；ヒドロキシクロロキン／クロロキン；スルファサラジン；レフルノミド；サイトカイン又はサイトカインレセプターアンタゴニスト、例として抗インターフェロン-γ、-β、又は-α抗体、抗腫瘍壊死因子-α抗体(インフリキシマブ又はアダリムマブ)、抗ＴＮＦαイムノアドヘシン(ＥＮＢＲＥＬ(登録商標)、エタネルセプト)、抗腫瘍壊死因子-β抗体、抗インターロイキン２抗体、及び抗ＩＬ−２レセプター抗体；抗ＣＤ１１ａおよび抗ＣＤ１８抗体を含む抗ＬＦＡ-１抗体；抗Ｌ３Ｔ４抗体；異種性抗リンパ球グロブリン；ポリクローナル又はパンＴ抗体、又はモノクローナル抗ＣＤ3又は抗ＣＤ４／ＣＤ4ａ抗体；ＬＦＡ-３結合ドメインを含む可溶性ペプチド(国際公開９０／０８１８７)；ストレプトキナーゼ；ＴＧＦ-β；ストレプトドルナーゼ；宿主のＲＮＡ又はＤＮＡ；ＦＫ５０６；ＲＳ-６１４４３；デオキシスペルグアリン；ラパマイシン；Ｔ細胞レセプター(Cohenら、米国特許第５１１４７２１号)；Ｔ細胞レセプター断片(Offnerら、Science, 251: 430-432 (1991)；国際公開９０／１１２９４；Ianeway, Nature, 341: 482 (1989)；及び国際公開９１／０１１３３)；Ｔ１０Ｂ９といったＴ細胞レセプター抗体(欧州特許第３４０１０９号)；シクロホスファミド(ＣＹＴＯＸＡＮ(登録商標))；ダプソン；ペニシラミン(ＣＵＰＲＩＭＩＮＥ(登録商標))；血漿交換；または、静脈免疫グロブリン(ＩＶＩＧ)が含まれる。これらは単独で用いられても、互いに、特にステロイド及び他の免疫抑制剤との組合せ、又はこの組合せの後にステロイドの必要性を低減するために維持用量の非ステロイド剤を組み合わせて用いられてもよい。
「鎮痛剤」は、被検体の痛みを阻害するかまたは抑制するために作用する薬剤を指す。例示的な鎮痛剤には、非ステロイド系抗炎症薬(ＮＳＡＩＤ)、例えばイブプロフェン(ＭＯＴＲＩＮ(登録商標))、ナプロキセン(ＮＡＰＲＯＳＹＮ(登録商標))、アセチルサリチル酸、インドメタシン、スリンダクおよびトルメチン、これらの塩類及び誘導体、並びに、生じうる鋭い痛みを低減するために用いられる様々な他の医薬、例えば抗痙攣剤(ガバペンチン、ｐｈｅｎｙｌｏｉｎ、カルバマゼピン)又は三環系抗鬱薬が含まれる。具体例には、アセトアミノフェン、アスピリン、アミトリプチリン(ＥＬＡＶＩＬ(登録商標))、カルバマゼピン(ＴＥＧＲＥＴＯＬ(登録商標))、ｐｈｅｎｙｌｔｏｉｎ(ＤＩＬＡＮＴＩＮ(登録商標))、ガバペンチン(ＮＥＵＲＯＮＴＩＮ(登録商標))、(Ｅ)-Ｎ−バニリル−８−メチル−６−ノネアミド(ＣＡＰＳＡＩＣＩＮ(登録商標))又は神経遮断薬が含まれる。
「副腎皮質ステロイド」は、天然に生じる副腎皮質ステロイドの効果を模倣するかあるいは増大するステロイドの一般的な化学構造を有するいくつかの合成又は天然に生じる物質の何れか一つを指す。合成副腎皮質ステロイドの例として、プレドニゾン、プレドニゾロン(メチルプレドニゾロンを含む)、デキサメサゾン、トリアムシノロン及びベタメサゾンが含まれる。
本明細書で用いる「癌ワクチン」は、癌に対して被検体において免疫応答を刺激する組成物である。癌ワクチンは典型的に、抗原に対して免疫応答を更に刺激してブーストする他の構成成分(例えばアジュバント)とともに、被検体に対して自己由来性(自己から)又は同種異系性(他から)である癌関連の物質又は細胞(抗原)の供与源からなる。癌ワクチンにより、被検体の免疫系が刺激され、１又はいくつかの特異的抗原に対して抗体が産生され、および／またはそれらの抗原を有する癌細胞を攻撃するためにキラーＴ細胞が産生され得る。
本明細書で用いる「細胞障害性放射線療法」は、細胞の機能を阻害又は予防し、および／または細胞の破壊を引き起こす放射線療法を指す。放射線療法には、例えば、外的光線照射又は抗体などの放射性標識した薬剤による療法が含まれうる。この用語は、放射性同位体(例えばＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｒａ２２３、Ｐ３２およびＬｕの放射性同位体)の使用を含むことを目的とする。
本明細書中で使用される場合、用語「ＥＧＦＲ標的化薬剤」は、ＥＧＦＲに結合し、必要に応じて、ＥＧＦＲ活性化を阻害する治療剤をいう。このような薬剤の例としては、ＥＧＦＲに結合する抗体および低分子が挙げられる。ＥＧＦＲに結合する抗体の例としては、ＭＡｂ ５７９（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ＨＢ ８５０６）、ＭＡｂ ４５５（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ＨＢ８５０７）、ＭＡｂ ２２５（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８５０８）、ＭＡｂ ５２８（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８５０９）（米国特許第４９４３５３３号、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ等）およびそれらの改変体、例えばキメラ化２２５（Ｃ２２５もしくはＣｅｔｕｘｉｍａｂ；ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））および再成形（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト２２５（Ｈ２２５）（国際公開第９６／４０２１０号、Ｉｍｃｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．を参照）；ＩＩ型変異体ＥＧＦＲに結合する抗体（米国特許第５２１２２９０号）；米国特許第５８９１９９６号に記載のＥＧＦＲに結合するヒト化抗体およびキメラ抗体；ならびにＡＢＸ−ＥＧＦ（国際公開第９８／５０４３３号、Ａｂｇｅｎｉｘを参照）のようなＥＧＦＲに結合するヒト抗体が挙げられる。抗ＥＧＦＲ抗体は、細胞傷害性薬剤と結合体化され得、それによってイムノコンジュゲートを産生し得る（例えば、欧州特許第６５９，４３９（Ａ２）号、Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ ＧｍｂＨを参照）。ＥＧＦＲに結合する低分子の例としては、ＺＤ１８３９もしくはゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡＴＭ；Ａｓｔｒａ Ｚｅｎｅｃａ）、エルロチニブＨＣｌ（Ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ ＨＣｌ）（ＣＰ−３５８７７４、ＴＡＲＣＥＶＡＴＭ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／ＯＳＩ）およびＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１（ＳＵ ５２７１；Ｓｕｇｅｎ）が挙げられる。
プロテインキナーゼインヒビターとしては、チロシンキナーゼのチロシンキナーゼ活性をある程度阻害するチロシンキナーゼインヒビター（例えばＥｒｂＢレセプター）が挙げられる。このようなインヒビターの例としては、上の段落に記載したＥＧＦＲ標的化薬剤、ならびにＰＤ １５３０３５、４−（３−クロロアニリノ）キナゾリンのようなキナゾリン、ピリドピリミジン、ピリミドピリミジン、ピロロピリミジン（例えばＣＧＰ ５９３２６、ＣＧＰ ６０２６１およびＣＧＰ６２７０６）、およびピラゾロピリミジン、４−（フェニルアミノ）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン、クルクミン（ジフェルロイルメタン（diferuloyl methane）、４，５−ビス（４−フルオロアニリノ）フタルイミド）、ニトロチオフェン部分を含むチロホスチン（tyrphostine）；ＰＤ−０１８３８０５（Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ）；アンチセンス分子（例えば、ＥｒｂＢをコードする核酸に結合するアンチセンス分子）；キノキサリン（米国特許第５８０４３９６号）；ｔｒｙｐｈｏｓｔｉｎｓ（米国特許第５８０４３９６号）；ＺＤ６４７４（Ａｓｔｒａ Ｚｅｎｅｃａ）；ＰＴＫ−７８７（Ｎｏｖａｒｔｉｓ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧ）；ＣＩ−１０３３（Ｐｆｉｚｅｒ）のようなｐａｎ−ＥｒｂＢインヒビター；アフィニタック（Ａｆｆｉｎｉｔａｃ）（ＩＳＩＳ ３５２１；Ｉｓｉｓ／Ｌｉｌｌｙ）；イマチニブメシレート（Ｉｍａｔｉｎｉｂ ｍｅｓｙｌａｔｅ）（Ｇｌｅｅｖｅｃ；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ＰＫＩ １６６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ＧＷ２０１６（Ｇｌａｘｏ ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）；ＣＩ−１０３３（Ｐｆｉｚｅｒ）；ＥＫＢ−５６９（Ｗｙｅｔｈ）；セマキサニブ（Ｓｅｍａｘａｎｉｂ）（Ｓｕｇｅｎ）；ＺＤ６４７４（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；ＰＴＫ−７８７（Ｎｏｖａｒｔｉｓ／ＳｃｈｅｒｉｎｇＡＧ）；ＩＮＣ−１Ｃ１１（Ｉｍｃｌｏｎｅ）；もしくは以下の特許公開のいずれかに記載されるものが挙げられる：ＷＯ ９９／０９０１６（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄ）；国際公開第９８／４３９６０号（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄ）；国際公開第９７／３８９８３号（Ｗａｒｎｅｒ Ｌａｍｂｅｒｔ）；国際公開第９９／０６３７８号（Ｗａｒｎｅｒ Ｌａｍｂｅｒｔ）；国際公開第９９／０６３９６号（Ｗａｒｎｅｒ Ｌａｍｂｅｒｔ）；国際公開第９６／３０３４７号（Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ）；国際公開第９６／３３９７８号（Ｚｅｎｅｃａ）；国際公開第９６／３３９７号（Ｚｅｎｅｃａ）；および国際公開第９６／３３９８０号（Ｚｅｎｅｃａ）。
「抗脈管形成剤」とは、血管の発達をある程度遮断するかもしくは妨害する化合物である。抗脈管形成因子は、例えば、脈管形成の促進に関与する増殖因子もしくは増殖因子レセプターに結合する低分子もしくは抗体であり得る。所定の場合、本明細書中における抗脈管形成因子は、脈管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体である。
「制吐剤」は、被検体における嘔気を軽減又は予防する化合物である。制吐化合物には、例えば、ニューロキニン-１レセプターアンタゴニスト、５ＨＴ３レセプターアンタゴニスト(例えばオンダンセトロン、グラニセトロン、トロピセトロンおよびザチセトロン)、ＧＡＢＡＢレセプターアゴニスト（例えばバクロフェン）、デキサメサゾン、ＫＥＮＡＬＯＧ(登録商標)、ＡＲＩＳＴＯＣＯＲＴ(登録商標)又はＮＡＳＡＬＩＤＥ(登録商標)のような副腎皮質ステロイド、抗ドーパミン作動剤、フェノサイアジン(例えばプロクロルペラジン、フルフェナジン、チオリダジンおよびメソリダジン)、ドロナビノール、ｍｅｔｒｏｃｌｏｐｒａｍｉｄｅ、ドンペリドン、ハロペリドール、シクリジン、ロラゼパム、プロクロルペラジンおよびレボメプロマジンが含まれる。
「サイトカイン」なる用語は、一つの細胞集団から放出され、他の細胞に細胞間メディエータとして作用するタンパク質の一般用語である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインに含まれるのは、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インシュリン；プロインシュリン；レラキシン；プロレラキシン；糖タンパク質ホルモン、例えば濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体化ホルモン（ＬＨ）；上皮性増殖因子（ＥＧＦ）；肝臓成長因子；線維芽成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子-α及び-β；ミューラー阻害因子；マウス生殖腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ-β等の神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ-α及びＴＧＦ-β等のトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦｓ）；インシュリン様成長因子-Ｉ及びＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘発因子；インターフェロン-α、-β、及び-γ等のインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）、例えばマクロファージ-ＣＳＦ（Ｍ-ＣＳＦ）；顆粒球-マクロファージ-ＣＳＦ（ＧＭ-ＣＳＦ）；及び顆粒球-ＣＳＦ（Ｇ-ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬｓ）、例えばＩＬ-１、ＩＬ-１α、ＩＬ-２、ＩＬ-３、ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-１０、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２；腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ-α及びＴＮＦ-β；及びＬＩＦ及びキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子である。本明細書で用いられる際、用語サイトカインには、天然供給源から、又は組換え細胞培養からのタンパク質、及び天然配列サイトカインの生物学的に活性な等価物が含まれる
本明細書で用いられる「プロドラッグ」なる用語は、親薬剤と比較して腫瘍細胞に対する細胞障害性が低く、酵素的に又は加水分解的に活性化されるか又はより活性な親形態に変換されうる薬学的に活性な物質の前駆体又は誘導体の形態を指す。例として、Wilman, “Prodrugs in Cancer Chemotherapy” Biochemical Society Transactions, 14, 頁375-382, 615th Meeting Belfast (1986)及びStella等“Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery,” Directed Drug Delivery, Borchardt 等(編), pp. 247-267, Humana Press (1985)を参照のこと。プロドラッグには、限定するものではないが、ホスフェート含有プロドラッグ、チオホスフェート含有プロドラッグ、硫酸塩含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ-アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β-ラクタム含有プロドラッグ、任意に置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ、又は任意に置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、より活性のある細胞毒のない薬剤に転換可能な５-フルオロシトシン及び他の５-フルオロウリジンプロドラッグを含む。限定はしないが、プロドラッグ形態に誘導体化可能な細胞障害性剤の例には、前記の化学療法剤が含まれる。
「リポソーム」は、哺乳動物への薬剤（例えば、本明細書に開示される抗ＥｒｂＢ２の抗体、及び必要に応じて、化学療法剤）の運搬に有用である様々な種類の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤から成る小さいベシクル(小胞)である。リポソームの構成成分は一般に二重層で配置され、これは生物学的膜の脂質配置と類似している。
「パッケージ挿入物」なる用語は、効能、用途、服用量、投与、配合禁忌及び／又はその治療薬の用途に関する警告についての情報を含む、治療薬の商業的包装を慣習的に含めた指示書を指す。
「ファージディスプレイ」は、変異体ポリペプチドを、ファージ、例えば糸状ファージ粒子の表面上のコートタンパク質へ融合タンパク質としてディスプレイする技術である。ファージディスプレイの一つの有用性は、ランダム化タンパク質変異体の大きなライブラリーを、高親和性でもって標的分子に結合する配列について容易にかつ効率的に選別できるという事実にある。ファージ上へのペプチド及びタンパク質ライブラリーのディスプレイは、特異的結合特性を持つものについて何百万ものポリペプチドをスクリーニングするために使用されている。多価ファージディスプレイ法は、糸状ファージのｐＩＩＩ又はｐＶＩＩＩへの融合体を通してランダム小ペプチド及び小タンパク質をディスプレイするために使用されている（Wells及びLowman, Curr. Opin. Struct. Biol., 3:355-362 (1992)と、そこで引用されている文献）。一価ファージディスプレイでは、タンパク質又はファージコートタンパク質又はその一部分に融合させられ、野生型タンパク質の存在下で低レベルで発現される。選別が内因的なリガンド親和性に基づくように結合活性効果が多価ファージに対して低減され、ファージミドベクターが使用され、これがＤＮＡ操作を単純にする。Lowman及びWells, Methods: A companion to Methods in Enzymology, 3:205-0216 (1991)。ファージディスプレイは、抗体様分子を生成するための技術を含む(Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immunobiology, 5th Ed., Garland Publishing, New York, 頁627-628; Leeら)。
「ファージミド」は、細菌の複製起点、例えばＣｏ１Ｅ１、及びバクテリオファージの遺伝子間領域のコピーを有するプラスミドベクターである。ファージミドは、糸状バクテリオファージ及びラムドイドバクテリオファージを含む任意の既知のバクテリオファージで使用されうる。プラスミドはまた一般には抗生物質耐性の選択マーカーも含む。これらのベクターにクローニングされるＤＮＡセグメントはプラスミドとして増殖することができる。これらのベクターを内部に持つ細胞がファージ粒子の生産のために必要な全ての遺伝子を備えているとき、プラスミドの複製様式はローリングサークル複製に変化し、プラスミドＤＮＡの１つの鎖のコピーとパッケージファージ粒子を生成する。ファージミドは感染性または非感染性ファージ粒子を形成しうる。この用語は、異種ポリペプチドがファージ粒子表面に提示されるように遺伝子融合体としてこの異種ポリペプチドの遺伝子と結合したファージコートタンパク質遺伝子又はその断片を含むファージミドを含む。
「リンカー」、「リンカーユニット」又は「連結」は、本明細書において交換可能に用いられ、共有結合を含む化学的成分、又は抗体又は抗体断片を他の抗体、抗体断片、又は薬剤部分に付着させる原子鎖を意味する。リンカーとしては、アルキルジイル、アリーレン、ヘテロアリーレン、−（ＣＲ２）ｎＯ（ＣＲ２）ｎ−のような部分、アルコキシ（例えば、ポリエチレンオキシ、ＰＥＧ、ポリメチレンオキシ）およびアルキルアミノ（例えば、ポリエチレンアミノ、ＪｅｆｆａｍｉｎｅＴＭ）の反復単位；ならびにコハク酸塩、コハク酸アミド、ジグリコレート、マロネートおよびカプロアミドを含む二価酸エステルおよび二価酸アミドのような二価ラジカルが挙げられる。追加のリンカー又は架橋剤としては、ビスマレイミド、ビス-アルキルハロゲン化物、ピリジルジスルフィド、ビス-水銀塩、５−チオ−２−ニトロ安息香酸媒介架橋剤、およびビス−チオスルホネートが挙げられる。典型的な市販の架橋剤としては、１,４-ビス（マレイミド）ブタン、（１,４-ビスマレイミジル-２,３-ジヒドロキシブタン）、ビス（マレイミド）ヘキサン、ビス（マレイミド）エタン、１,４-ジ-［３´-（２´-ピリジルジチオ）プロミオンアミド］ブタン、１,６-ヘキサン-ビス-ビニルスルホン、ジチオ-ビマレイミドエタン、１,８-ビス-マレイミド-ジエチレングリコール、及び１,１１-ビス-マレイミド-トリエチレングリコールが含まれるが、これらに限定されない。所定の場合において、ホモ三官能性試薬、例えばトリス［２-マレイミドエチル］アミンが架橋剤として用いられる。
「標識」なる用語は、抗体に共有結合し得る任意の部分を意味し、これは、（ｉ）検出可能シグナルを提供する；（ｉｉ）第２の標識と相互作用し、第１もしくは第２の標識によって提供される検出可能なシグナルを改変する（例えば、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）；（ｉｉｉ）抗原もしくはリガンドとの相互作用を安定化するか、もしくは結合の親和性を増大する；（ｉｖ）電荷、疎水性、形状もしくは他の物理的パラメータによって移動度（例えば、電気泳動度）もしくは細胞透過性に影響する、あるいは（ｖ）捕捉部分を提供し、リガンド親和性、抗体／抗原結合もしくはイオン複合体化（ｉｏｎｉｃ ｃｏｍｐｌｅｘ）を調節するように機能する。
本明細書中で使用される立体化学的な規定および規約は、一般に、Ｓ．Ｐ．Ｐａｒｋｅｒ，編，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｒｍｓ（１９８４）ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｂｏｏｋ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；ならびにＥｌｉｅｌ，Ｅ．およびＷｉｌｅｎ，Ｓ．，Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（１９９４）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに従う。多くの有機化合物が、光学活性形態で存在し、すなわち、これらは、平面偏光の平面を回転する能力を有する。光学的に活性な化合物の記載において、接頭語ＤおよびＬ、またはＲおよびＳは、そのキラル中心に関する分子の絶対配置を表示するために使用される。接頭語ｄおよびｌまたは（＋）および（−）は、化合物による平面偏光の回転の符号を表し、（−）もしくはｌは、この化合物が左旋性であることを意味する。（＋）もしくはｄの接頭語を有する化合物は、右旋性である。所定の化学構造について、これらの立体異性体は、互いに鏡像対称であることを除いて同一である。特定の立体異性体はまた、エナンチオマーと呼ばれ得、そしてこのような異性体の混合物は、しばしばエナンチオマー混合物と呼ばれる。エナンチオマーの５０：５０混合物は、ラセミ混合物もしくはラセミ体と呼ばれ、これは、化学反応もしくはプロセスにおいて立体選択性もしくは立体特異性が存在しない場合に生じ得る。「ラセミ混合物」および「ラセミ体」なる用語は、光学活性を有さない、２つのエナンチオマー種の等モル濃度の混合物をいう。
「薬学的に受容可能な塩」なる語句は、本明細書中で使用される場合、薬学的に受容可能な有機もしくは無機の塩をいう。例示的な塩としては、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酸性酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、サッカリン酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、およびパモ酸塩（ｐａｍｏａｔｅ）（すなわち、１，１’−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトエート）が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に受容可能な塩は、酢酸イオン、コハク酸イオンもしくは他の対イオンのような別の分子の包含を含み得る。対イオンは、親化合物上の電荷を安定化させる任意の有機部分もしくは無機部分であり得る。さらに、薬学的に受容可能な塩は、１つより多くの荷電した原子をその構造内に有し得る。多数の荷電した原子がこの薬学的に受容可能な塩の一部分である場合、多数の対イオンを有し得る。したがって、薬学的に受容可能な塩は、１つもしくはそれより多くの荷電した原子および／または１つもしくはそれより多くの対イオンを有し得る。
「薬学的に受容可能な溶媒和物」は、１つもしくはそれより多くの分子と抗体との会合物をいう。薬学的に受容可能な溶媒和物を形成する溶媒の例としては、水、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ＤＭＳＯ、酢酸エチル、酢酸およびエタノールアミンが挙げられるが、これらに限定されない。
以下の略称が、本明細書中で使用され、示される定義を有する：ＢＭＥはβ−メルカプトエタノール、ＢｏｃはＮ−（ｔ−ブトキシカルボニル）、ｃｉｔはシトルリン（２−アミノ−５−ウレイドペンタン酸）、ｄａｐはドラプロイン（ｄｏｌａｐｒｏｉｎｅ）、ＤＣＣは１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド、ＤＣＭはジクロロメタン、ＤＥＡはジエチルアミン、ＤＥＡＤはジエチルアゾジカルボキシレート、ＤＥＰＣはジエチルホスホリルシアニデート、ＤＩＡＤはジイソプロピルアゾジカルボキシレート、ＤＩＥＡはＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、ｄｉｌはドライソロイシン（ｄｏｌａｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）、ＤＭＡはジメチルアセトアミド、ＤＭＡＰは４−ジメチルアミノピリジン、ＤＭＥはエチレングリコールジメチルエーテル（もしくは１，２−ジメトキシエタン）、ＤＭＦはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ＤＭＳＯはジメチルスルホキシド、ｄｏｅはドラフェニン（ｄｏｌａｐｈｅｎｉｎｅ）、ｄｏｖはＮ，Ｎ−ジメチルバリン、ＤＴＮＢは５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）、ＤＴＰＡはジエチレントリアミンペンタ酢酸、ＤＴＴはジチオトレイトール、ＥＤＣＩは１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩、ＥＥＤＱは２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン、ＥＳ−ＭＳはエレクトロスプレー質量分析、ＥｔＯＡｃは酢酸エチル、ＦｍｏｃはＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）、ｇｌｙはグリシン、ＨＡＴＵはＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、ＨＯＢｔは１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ＨＰＬＣは高速液体クロマトグラフィー、ｉｌｅはイソロイシン、ｌｙｓはリジン、ＭｅＣＮ（ＣＨ３ＣＮ）はアセトニトリル、ＭｅＯＨはメタノール、Ｍｔｒは４−アニシルジフェニルメチル（もしくは４−メトキシトリチル）、ｎｏｒは（１Ｓ、２Ｒ）−（＋）−ノルエフェドリン、ＰＡＢはｐ−アミノベンジルカルバモイル、ＰＢＳはリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７）、ＰＥＧはポリエチレングリコール、Ｐｈはフェニル、Ｐｎｐはｐ−ニトロフェニル、ＭＣは６−マレイミドカプロイル、ｐｈｅはＬ−フェニルアラニン、ＰｙＢｒｏｐはブロモトリ−ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、ＳＥＣはサイズ排除クロマトグラフィー、Ｓｕはスクシンイミド、ＴＦＡはトリフルオロ酢酸、ＴＬＣは薄層クロマトグラフィー、ＵＶは紫外線、およびｖａｌはバリン。
「被検体」とは脊椎動物、例えばヒトなどの哺乳動物である。哺乳動物は、農場の動物（例えば、牛など）、スポーツ動物、ペット（例えばネコ、イヌ、馬など）、霊長類、マウス、ラットを含むが、これらに限定されない。
実施例において示す市販の試薬は、特に明記しない限り製造業者の指示に従って使用した。以下の実施例及び明細書全体にわたってＡＴＣＣ受託番号によって識別される細胞の供与源は、American Type Culture Collection, Manassas, VAである。特に明記しない限り、本発明は、組換えＤＮＡ技術の標準的な手順を用いる。これらは本明細書中及び以下のテキストに記載される。上掲のSambrookら、；Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989)；Innisら、PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Inc.: N.Y., 1990)；Harlowら、Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press: Cold Spring Harbor, 1988)；Gait, Oligonucleotide Synthesis (IRL Press: Oxford, 1984)；Freshney, Animal Cell Culture, 1987；Coliganら、Current Protocols in Immunology, 1991。
本明細書及び特許請求の範囲全体を通して、「含む」なる語彙、又は「含む」ないし「含んでいる」の変形型は、定めた完全体又は完全体の群を包含するもので、任意の他の完全体又は完全体の群を除外するものではない。
様々な追加の用語が本明細書において定義されるか又は特徴付けられる。
組成物および方法
多重特異性抗体および抗体アナログ
本明細書において既述される二重特異性抗体を含む多重特異性抗体、及び抗体アナログを構築するため、少なくとも一つの遊離のスルフヒドリル基を有する抗体断片が得られた。抗体断片は上述の通り、システイン改変抗体を含む親抗体から得ることができる。親抗体は酵素的に切断されて抗体断片を生成し得る。例示的な酵素消化法は、限定されないが、ペプシン、パパインおよびＬｙｓ-Ｃを含む。例示的な抗体断片は、限定されないが、
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ')２、Ｆｖ、ダイアボディ(Ｄｂ)；タンデムダイアボディ(ｔａＤｂ)、直鎖状抗体（米国特許第５６４１８７０号、実施例２；Zapata ら、Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)）；ワンアームド抗体、単一可変ドメイン抗体、ミニボディ(Olafsenら、(2004) Protein Eng. Design & Sel. 17(4):315-323)、単鎖抗体分子、Ｆａｂ発現ライブラリーにより生成した断片、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、ＣＤＲ（相補性決定領域）、及びエピトープ結合断片を含む。抗体断片はまた、前記抗体断片をコードするＤＮＡ断片として、プラスミド発現ベクター又はファージミドベクターへクローン化され、直接大腸菌で発現され得る。抗体の酵素的消化法、ＤＮＡのクローニング及び組換えタンパク質発現法は、当業者に良く知られ、例示的方法は本明細書にて与えられている。
抗体断片は従来の方法を用いて精製され得、還元されて遊離のチオール基を生成する。遊離のチオール基を有する抗体断片は、架橋剤、例えばビスマレイミドと反応させられる。そうして架橋された抗体断片は精製され、次に遊離のチオール基を有する第二の抗体断片と反応させられる。２つの抗体断片が架橋されている最終産物が精製される。所定の実施態様において、各々の抗体断片はＦａｂであり、２つのＦａｂがビスマレミドを介して結合している最終産物は、本明細書において、ビスマレイミド-(チオＦａｂ)２，又はビスＦａｂと称される。
ビスＦａｂを含む、そうした多重特異性抗体及び抗体アナログは、多数の抗体断片の組み合わせ、又は天然型抗体の構造変異体、又は特定の抗体断片の組み合わせを迅速に合成し、望みの活性に関する生物学的アッセイでそれらをスクリーニングすることに利用することができる。
システイン改変抗体
システイン改変抗体は以前に既述されている。米国特許出願公開第２００７／００９２９４０号及びJunutula, J. R. ら、J Immunol Methods 332(1-2):41-52 (2008)。システイン改変抗体は親抗体となり得る。これらは、特定の場所に、典型的には定常領域（例えばＣＬ又はＣＨ1）に遊離のシステインを有する抗体断片を産生するために有用である。システインを含有するために改変された親抗体は、本明細書では「チオＭａｂ」と称され、及びそうしたシステイン改変抗体から生成されたＦａｂ断片は、生産方法によらず、本明細書では「チオＭａｂ」と称される。以前に既述されたように（米国特許出願公開第２００７／００９２９４０号、及びJunutula, J. R.ら、J Immunol Methods 332(1-2):41-52 [2008]）、置換された（「改変された」）システイン（Ｃｙｓ）残基を持つ変異体は、新たに導入された改変システインチオール基の反応性について評価される。チオール反応性値は０から１．０の範囲の相対的な数値用語であり、任意のシステイン改変抗体について測定することができる。反応性チオール基を有することに加えて、チオＭａｂはそれらが抗原結合能を保持するように選択されるべきである。システイン改変抗体の設計、選択、及び調製は以前に詳述されている。米国特許出願公開第２００７／００９２９４０号、及びJunutula, J. R.ら、J Immunol Methods 332(1-2):41-52 （2008）。
そうしたシステイン改変抗体の所定の例示的な軽鎖（ＬＣ）及び重鎖（ＨＣ）のアミノ酸配列、及び対応する野生型配列が以下に記載される（改変さたシステインの位置は太字のイタリック体で下線が引かれている）。改変されたシステインは重鎖又は軽鎖の定常領域へ導入されたため、特定の抗体へのシステインの導入について以下に与えられた場所は、そうした定常領域、若しくは実質的に同様な定常領域を含む任意の抗体において利用することができ得る。
システイン改変抗体はその対応する野生型親抗体の抗原結合能力を保持するため、抗原に、特異的に結合可能である。このような抗原としては、例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、細胞表面レセプタータンパク質および他の細胞表面分子、膜貫通タンパク質、シグナル伝達タンパク質、細胞生存調節因子、細胞増殖調節因子、組織発生もしくは組織分化に関連する（例えば、機能的に寄与することが公知であるかもしくは疑われる）分子、リンホカイン、サイトカイン、細胞周期調節に関与する分子、脈管形成に関与する分子および脈管形成に関連する（例えば、機能的に寄与することが公知であるかもしくは疑われる）分子が挙げられる。腫瘍関連抗原は、分化因子の集団（すなわち、ＣＤタンパク質）であり得る。システイン改変抗体が結合可能である抗原は、上記のカテゴリーの１つの下位集団のメンバーであり得、ここで、このカテゴリーの他の下位集団は、異なる特性（目的の抗原に関連して）を有する他の分子／抗原を含む。
親抗体はまた、米国特許第５８２１３３７号（本明細書中に明白に参考として援用される）の表３において記載されるように、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−１、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−２、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−３、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−４、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−５、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−６、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−７およびｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８（トラスツズマブ、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））から選択されるヒト化抗体であり得る；本明細書中に記載される、ヒト化５２０Ｃ９（国際公開第９３／２１３１９号）抗体およびヒト化２Ｃ４抗体。
多機能性多重特異性抗体及び抗体アナログ
多重特異性抗体及び抗体アナログは、付加的な機能性部分が、多重特異性抗体及び抗体アナログに結合しうるように、修飾された架橋剤で合成することができる。修飾された架橋剤は任意のスルフヒドリル反応性部分の結合を可能とする。一実施態様において、Ｎ-サクシニミジル-Ｓ-アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）をビスマレイミドへ付着させ、ビスマレイミドアセチルチオアセテート（ＢＭａｔａ）を形成する。マスクされたチオール基の脱保護の後に、スルフヒドリル反応性（又はチオール反応性）部分を有する任意の官能基が付着されうる。
例示的なチオール反応性試薬としては、多機能性リンカー試薬、捕獲（すなわち親和性）、標識試薬（例えばビオチンリンカー試薬）、検出標識（例えばフルオロフォア試薬）、固相固定化試薬（例えば、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭ、ポリスチレン又はガラス）、又は薬剤−リンカー中間体を含む。チオール反応性試薬の一例は、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）である。そのような修飾された架橋剤を有する多重特異性抗体又は抗体アナログは、薬剤部分試薬又は他の標識と更に反応され得る。多重特異性抗体又は抗体アナログの薬剤−リンカー中間体との反応は、多重特異性抗体薬剤コンジュゲート又は抗体アナログ薬剤コンジュゲートをそれぞれ与える。
このような手法は、反応基が例えばマレイミド、ヨードアセトアミド、ピリジルジスルフィド、又は他のチオール反応性の結合パートナーである他のチオール反応性試薬のコンジュゲーションに応用されてもよい(Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.；Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2；Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London；Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2；Hermanson, G. in Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press, San Diego, pp. 40-55, 643-671)。パートナーは、細胞傷害性薬剤（例えば、ドキソルビシンまたは百日咳毒素などの毒素など）、フルオロホア、例としてフルオレセイン又はローダミンのような蛍光染料、イメージング又は放射性治療用金属のためのキレート剤、ペプチジル又は非ペプチジル標識ないしは検出用タグ、又はポリエチレングリコールの各種アイソフォームなどのクリアランス-改変剤、第三成分に結合するペプチド、又は他の炭水化物又は親油性剤であり得る。
アルブミン結合性ペプチド（ＡＢＰ）配列（Ｄｅｎｎｉｓら（２００２）「Ａｌｂｕｍｉｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｓ Ａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｓｔｒａｔｅｇｙ Ｆｏｒ Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７７：３５０３５−３５０４３；国際公開第０１／４５７４６号）もまた修飾された架橋を有する多重特異性抗体又は抗体アナログと反応される場合がある。典型的なＡＢＰ配列は（ｉ）Ｄｅｎｎｉｓら（２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７７：３５０３５−３５０４３、表ＩＩＩおよび表ＩＶ、３５０３８ページ；（ｉｉ）米国特許出願公開第２００４０００１８２７号の［００７６］、配列番号９〜２２；及び（ｉｉｉ）米国特許出願公開第０１／４５７４６号の１２−１３ページ、配列番号ｚ１−ｚ１４に記載されている。
変異誘発
出発ポリペプチドのアミノ酸配列改変体をコードするＤＮＡは、当該分野で公知の様々な方法により調製される。これらの方法としては、ポリペプチドをコードする予め調製したＤＮＡの、部位特異的（またはオリゴヌクレオチド媒介）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発およびカセット変異誘発による調製が挙げられるがこれらに限定されない。組換え抗体の改変体は、制限フラグメントの操作によって、または、合成オリゴヌクレオチドを用いた重複伸張ＰＣＲによっても構築され得る。変異誘発プライマーは、システインコドン置換をコードする。標準的な変異誘発技術は、このような変異体システイン操作抗体をコードするＤＮＡを生成するために使用され得る。一般的なガイダンスは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９；およびＡｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９３に見出され得る。
部位特異的変異誘発は、置換改変体（すなわち、変異タンパク質）を調製するための１つの方法である。この技術は、当該分野で周知である（例えば、Ｃａｒｔｅｒら（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：４４３１−４４４３；Ｈｏら（１９８９）Ｇｅｎｅ（Ａｍｓｔ．）７７：５１−５９；およびＫｕｎｋｅｌら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８を参照のこと）。手短に述べると、ＤＮＡの部位特異的変異誘発を実施する際には、出発ＤＮＡは、所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドを、このような出発ＤＮＡの一本鎖に最初にハイブリダイズさせることによって変更される。ハイブリダイゼーションの後、ＤＮＡポリメラーゼは、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、そして出発ＤＮＡの一本鎖をテンプレートとして用いて、第２鎖全体を合成するために用いられる。従って、所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドは、得られる二本鎖ＤＮＡに組み込まれる。部位特異的変異誘発は、発現プラスミドにおいて、変異誘発させるべきタンパク質を発現する遺伝子内で実施され得、そして得られるプラスミドは、所望のシステイン置換変異の導入を確認するために配列決定され得る（Ｌｉｕら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２０２５２−２０２６０）。市販のものを含めたプロトコールおよび形式の部位特異的なもの。例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）。
ＰＣＲ変異誘発はまた、出発ポリペプチドのアミノ酸配列改変体を作製することにも適している。Ｈｉｇｕｃｈｉ（１９９０）ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｐｐ．１７７−１８３，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｉｔｏら（１９９１）Ｇｅｎｅ １０２：６７−７０；Ｂｅｒｎｈａｒｄら（１９９４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：１２６−１３２；およびＶａｌｌｅｔｔｅら（１９８９）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：７２３−７３３を参照のこと。手短に述べると、少量のテンプレートＤＮＡをＰＣＲにおいて出発材料として用いる場合、テンプレートＤＮＡ中の対応する領域と配列がわずかに異なるプライマーは、プライマーがテンプレートと異なる位置のみがテンプレート配列と異なる比較的大量の特異的ＤＮＡ断片を生成するために用いられ得る。
改変体を調製するための別の方法（カセット変異誘発）は、Ｗｅｌｌｓら（１９８５）Ｇｅｎｅ ３４：３１５−３２３によって記載されている技術に基づく。出発材料は、変異させるべき出発ポリペプチドＤＮＡを含むプラスミド（または他のベクター）である。出発ＤＮＡ中の変異させるべきコドンが同定される。同定された変異部位の両側には、ユニークな制限エンドヌクレアーゼ部位が存在しなければならない。このような制限部位が存在しない場合、それらは、出発ポリペプチドＤＮＡ中の適切な位置にこれらを導入するために上記のオリゴヌクレオチド媒介変異誘発方法を使用して生成され得る。プラスミドＤＮＡは、これらの部位で切断されて、ＤＮＡを直鎖状にする。制限部位間にこのＤＮＡの配列をコードするが、所望の変異を含んでいる二本鎖オリゴヌクレオチドは、標準手順を使用して合成される。ここで、オリゴヌクレオチドの２本の鎖は、別々に合成され、次いで標準技術を使用して一緒にハイブリダイズされる。この二本鎖オリゴヌクレオチドは、カセットと呼ばれる。このカセットは、直鎖状にしたプラスミドの末端と適合する５’末端および３’末端を有するように設計され、その結果、これは、このプラスミドに直接連結され得る。このプラスミドはいまや、変異したＤＮＡ配列を含む。コードされたシステイン置換を含んでいる変異体ＤＮＡは、ＤＮＡ配列決定により確認され得る。
単一変異はまた、ＰＣＲベースの変異誘発による、テンプレートとして二本鎖プラスミドＤＮＡを使用したオリゴヌクレオチド指向性変異誘発によっても生成される（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第３版；Ｚｏｌｌｅｒら（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８−５００；Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．およびＳｍｉｔｈ，Ｍ．（１９８２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：６４８７−６５００）。
オリゴヌクレオチドは、ホスホラミダイト合成法（米国特許第４４１５７３２号；米国特許第４４５８０６６号；Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．およびＩｙｅｒ，Ｒ．（１９９２）「Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｂｙ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ ａｐｐｒｏａｃｈ」，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４８：２２２３−２３１１）により調製される。ホスホラミダイト法は、制御された細孔ガラスまたは高度に架橋されたポリスチレンから構成される固体支持体上で（最も一般的には、３’→５’方向に；ここで、３’末端ヌクレオシドは、合成開始時に固体支持体上に結合している）成長しているオリゴヌクレオチド鎖への、反応性３’ホスホラミダイト部分を用いたヌクレオチドモノマー単位の周期的な添加を伴う（米国特許第５０４７５２４号；米国特許第５２６２５３０号）。この方法は、通常、自動化された市販の合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して実施される。オリゴヌクレオチドは、検出、捕捉、安定化または他の目的のための非アイソトープ部分で化学的に標識され得る（Ａｎｄｒｕｓ，Ａ．「Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ５’ ｎｏｎ−ｉｓｏｔｏｐｉｃ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ ｐｒｉｍｅｒｓ」（１９９５）ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐｐ．３９−５４；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９６）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ｐｐ．４０−５５，６４３−６７１；Ｋｅｌｌｅｒ，Ｇ．およびＭａｎａｋ，Ｍ．，ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅｓ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９３），Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１２１−２３）。
抗体の反応性システイン基の検出は、米国特許出願公開第２００７／００９２９４０号及びJunutula, J. R.ら、J Immunol Methods 332(1-2):41-52 (2008)に記載されたように、ＥＬＩＳＡファージ形式（Ｔｈｅ ＰＨＥＳＥＬＥＣＴＯＲ［反応性チオールの選択のためのファージＥＬＩＳＡ］）を用いて行うことができる。
タンパク質の発現および精製
システイン操作抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖をコードする遺伝子および軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）容易に分離され、そして配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの供給源として役立つ。一旦単離されると、このＤＮＡは、発現ベクター内に配置され得、次いで、この発現ベクターは、トランスフェクションしなければ抗体タンパク質を生成しない宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルのＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または他の哺乳動物宿主細胞（例えば、骨髄腫細胞）（米国特許第５８０７７１５号；米国特許出願公開第２００５／００４８５７２号；米国特許出願公開第２００４／０２２９３１０号））へとトランスフェクションされて、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成が得られる。ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８システイン改変抗体の収率は、野生型ｈｕ４Ｄ５Ｆａｂｖ８と類似していた。抗体をコードするＤＮＡの細菌中での組換え発現に関する総説としては、Ｓｋｅｒｒａら（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２５６−２６２およびＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１３０：１５１−１８８が挙げられる。
非常に反応性の高い不対Ｃｙｓ残基を有するシステイン改変抗体（例えば、チオＦａｂ）は、以下によって生成され得る：（ｉ）細菌（例えば、大腸菌）系または哺乳類細胞培養系（国際公開第０１／００２４５号）（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）における発現；ならびに（ｉｉ）一般的なタンパク質精製技術を使用した精製（Ｌｏｗｍａｎら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（１７）：１０９８２−１０９８８）。
例示的な精製手順はとしては、免疫親和性又はイオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ又はＤＥＡＥなど陽イオン交換樹脂でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫安沈殿、及び、例えばＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５を用いるゲル濾過を含む。
一態様にて、固相に固定化したプロテインＡが、本明細書においての完全長抗体産物の免疫親和性精製に用いられる。プロテインＡは黄色ブドウ球菌由来の４１ｋＤの細胞壁タンパク質であり、抗体のＦｃ領域へ高い親和性で結合する。Lindmarkら、(1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13。プロテインＡが固定化された固相は、好ましくはガラス又はシリカ表面を含んでいるカラム、より好ましくは制御された細孔ガラスカラムまたはケイ酸カラムである。幾つかの適用において、不純物の非特異的な付着を防止する試みとして、
カラムはグリセロールなどの試薬でコーティングさる。
精製の第一工程として、上述された細胞培養物由来の調製物が、プロテインＡ固定化固相へアプライされ、目的の抗体をプロテインＡへ特異的結合させる。次いで、固相が洗浄され、固相に非特異的に結合した不純物を除去する。目的の抗体はカオトロピック試薬または中性洗剤を含む溶液へ溶出することにより、固相から回収することができる。例示的なカオトロピック試薬または中性洗剤は、限定されないが、グアニジン塩酸、尿素、リチウム過塩素酸塩、アルギニン、ヒスチジン、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、ツイーン、トリトン、およびＮＰ−４０を含み、それらのすべては市販されている。抗体を、カラム（例えばｍＡｂＳｕｒｅカラム）から溶出後、カオトロピック試薬または中性洗剤を含む溶液へ希釈することで、溶出後の抗体の安定性を維持し、本明細書で記載されるように、更なる操作を可能とする。
標識した多重特異性抗体及び抗体アナログ
本発明の多重特異性抗体及び抗体アナログは、遊離スルフヒドリル基を有する修飾架橋剤で特に合成されたものであり、反応性システインチオール基によって抗体に共有結合可能な任意の標識部分とコンジュゲートされ得る（Ｓｉｎｇｈら（２００２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０４：１４７−１５；Ｈａｒｌｏｗ Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．（１９９９）Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ｌｕｎｄｂｌａｄ Ｒ．Ｌ．（１９９１）Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，第２版，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ）。結合した標識は、以下のために機能し得る：（ｉ）検出可能なシグナルを提供する；（ｉｉ）第２の標識と相互作用して、第１の標識または第２の標識によって提供される検出可能なシグナルを改変して、例えば、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）を与える；（ｉｉｉ）抗原またはリガンドとの相互作用を安定化するかまたは結合親和性を増加させる；（ｉｖ）電荷、疎水性、形状または他の物理的パラメータによる移動性（例えば、電気泳動易動度または細胞浸透性）に影響を及ぼす；または（ｖ）捕捉部分を提供して、リガンド親和性、抗体／抗原結合またはイオン性錯体形成を改変する。
標識された多重特異性抗体は、例えば、特定の細胞、組織または血清における目的の抗原の発現を検出するための診断アッセイに有用であり得る。診断適用に関しては、この抗体は、概して、検出可能な部分によって標識される。一般に以下のカテゴリーに分類され得る多数の標識が利用できる：
（ａ）ラジオアイソトープ（放射性核種）（例えば、３Ｈ、１１Ｃ、１４Ｃ、１８Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８６Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３３Ｘｅ、１７７Ｌｕ、２１１Ａｔまたは２１３Ｂｉ）。ラジオアイソトープ標識抗体は、レセプターを標的とした画像化実験に有用である。抗体は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１巻および２巻、Ｃｏｌｉｇｅｎら編，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、Ｐｕｂｓ．（１９９１）に記載されている技術を用いて、結合するか、キレート化するか、またはさもなければラジオアイソトープ金属を錯体化するリガンド試薬によって標識され得、ここで、この試薬は、抗体の改変されたシステインチオールと反応性である。金属イオンを錯体化し得るキレート化リガンドとしては、ＤＯＴＡ、ＤＯＴＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＴＰＡおよびＴＥＴＡ（Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）が挙げられる。放射性核種は、本発明の抗体−薬剤コンジュゲートとの錯体形成を介して標的化され得る（Ｗｕら（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３（９）：１１３７−１１４６）。
画像化実験のための抗体標識として適切な金属−キレート錯体は、以下に開示される：米国特許第５３４２６０６号；米国特許第５４２８１５５号；米国特許第５３１６７５７号；米国特許第５４８０９９０号；米国特許第５４６２７２５号；米国特許第５４２８１３９号；米国特許第５３８５８９３号；米国特許第５７３９２９４号；米国特許第５７５０６６０号；米国特許第５８３４４５６号；Ｈｎａｔｏｗｉｃｈら（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６５：１４７−１５７；Ｍｅａｒｅｓら（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４２：６８−７８；Ｍｉｒｚａｄｅｈら（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１：５９−６５；Ｍｅａｒｅｓら（１９９０）Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ１９９０，Ｓｕｐｐｌ．１０：２１−２６；Ｉｚａｒｄら（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．３：３４６−３５０；Ｎｉｋｕｌａら（１９９５）Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２２：３８７−９０；Ｃａｍｅｒａら（１９９３）Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２０：９５５−６２；Ｋｕｋｉｓら（１９９８）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３９：２１０５−２１１０；Ｖｅｒｅｌら（２００３）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４４：１６６３−１６７０；Ｃａｍｅｒａら（１９９４）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２１：６４０−６４６；Ｒｕｅｇｇら（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０：４２２１−４２２６；Ｖｅｒｅｌら（２００３）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４４：１６６３−１６７０；Ｌｅｅら（２００１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１：４４７４−４４８２；Ｍｉｔｃｈｅｌｌら（２００３）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４４：１１０５−１１１２；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら（１９９９）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１０：１０３−１１１；Ｍｉｅｄｅｒｅｒら（２００４）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４５：１２９−１３７；ＤｅＮａｒｄｏら（１９９８）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４：２４８３−９０；Ｂｌｅｎｄら（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ＆ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ １８：３５５−３６３；Ｎｉｋｕｌａら（１９９９）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４０：１６６−７６；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら（１９９８）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３９：８２９−３６；Ｍａｒｄｉｒｏｓｓｉａｎら（１９９３）Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２０：６５−７４；Ｒｏｓｅｌｌｉら（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ＆ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，１４：２０９−２０。
（ｂ）蛍光標識（例えば、希土類キレート（ユウロピウムキレート）、フルオレセイン型（ＦＩＴＣ、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセインが挙げられる）；ローダミン型（ＴＡＭＲＡが挙げられる）；ダンシル；リサミン；シアニン；フィコエリトリン；テキサスレッド；およびそれらの類似体）。蛍光標識は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（前出）において開示される技術を使用して抗体にコンジュゲートされ得る。蛍光色素および蛍光標識試薬としては、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）およびＰｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から市販されているものが挙げられる。
（ｃ）さまざまな酵素−基質標識が入手可能であるかまたは開示されている（米国特許第４２７５１４９号）。これらの酵素は、一般に、さまざまな技術を使用して測定され得る、色素形成性基質の化学変化を触媒する。例えば、これらの酵素は、基質の色変化を触媒し得、これは分光測光法により測定され得る。あるいは、これらの酵素は、基質の蛍光または化学発光を変更し得る。蛍光の変化を定量する技術は、上記に記載されている。化学発光基質は、化学反応によって電子的に励起されるようになり、その後、（例えば、化学ルミノメーターを使用して）測定され得る光を発し得るかまたは蛍光アクセプターにエネルギーを与える。酵素標識の例としては、以下が挙げられる：ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４７３７４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ））、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼおよびグルコース‐６‐リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環式オキシダーゼ（例えば、ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなど。抗体に酵素を結合させる技術は、Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎら（１９８１）「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ．（Ｊ．ＬａｎｇｏｎｅおよびＨ．Ｖａｎ Ｖｕｎａｋｉｓ編），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，７３：１４７−１６６に記載されている。
酵素−基質の組合せの例としては、例えば以下が挙げられる：
（ｉ）基質として水素ペルオキシダーゼを持つ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ここで、水素ペルオキシダーゼは、色素前駆体（例えば、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）または３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン塩酸塩（ＴＭＢ））を酸化する；
（ｉｉ）発色基質としてのパラ−ニトロフェニルホスフェートを持つアルカリホスファターゼ（ＡＰ）；および
（ｉｉｉ）発色基質（例えば、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）または蛍光発生性基質４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼを持つβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−Ｇａｌ）。
数多くの他の酵素−基質の組合わせが当業者に利用可能である。一般的な総説として、米国特許第４２７５１４９及び米国特許第４３１８９８０号を参照。
標識は、多重特異性抗体又は抗体アナログと間接的に結合され得る。例えば、抗体は、ビオチンと結合し得、そして、前述の３つの幅広いカテゴリーの標識のうちのいずれかが、アビジンまたはストレプトアビジンと結合してもよく、またはその逆であってもよい。ビオチンは、ストレプトアビジンと選択的に結合し、従って、この標識は、この間接的な様式で抗体とコンジュゲートし得る。あるいは、ポリペプチド改変体と標識との間接的な結合を達成するために、ポリペプチド改変体は、小さいハプテン（例えば、ジゴキシン）とコンジュゲートされ、そして前述の異なるタイプの標識のうちの１つが抗ハプテンポリペプチド改変体（例えば、抗ジゴキシン抗体）とコンジュゲートされる。従って、ポリペプチド改変体と標識との間接的なコンジュゲーションが達成され得る（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．（１９９６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）。
そのような標識された多重特異性抗体又は標識された抗体アナログは、任意の公知のアッセイ方法（例えば、ＥＬＩＳＡ、競合結合アッセイ、直接的サンドイッチアッセイおよび間接的サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイ）で使用され得る（Ｚｏｌａ，（１９８７）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）。
検出標識は、結合事象または認識事象を局所決定し、視覚化し、そして定量するために有用であり得る。本発明の標識された多重特異性抗体及び標識された抗体アナログは、細胞表面レセプターを検出し得る。検出可能に標識された抗体の別の用途は、蛍光標識抗体とビーズとをコンジュゲートすることおよびリガンドの結合の際の蛍光シグナルを検出することを含む、ビーズベースの免疫捕捉方法である。類似の結合検出方法論は、抗体−抗原相互作用を測定および検出するために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）効果を利用する。
検出標識（例えば、蛍光色素および化学発光色素）（Ｂｒｉｇｇｓら（１９９７）「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｓｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｄｙｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｔｏ Ａｍｉｎｅｓ ａｎｄ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ」，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｔｒａｎｓ．１：１０５１−１０５８）は、検出可能なシグナルを提供し、そして一般的に標識抗体に適用し得、典型的には以下の特性を有する：（ｉ）標識抗体は、低バックグラウンドを有する非常に高いシグナルを生じるはずであり、その結果、少量の抗体が、無細胞アッセイおよび細胞ベースアッセイの両方において高感度で検出され得る；及び（ｉｉ）標識抗体は、光に安定なはずであり、その結果、重大な光退色なしで、蛍光シグナルが観察され得、モニタリングされ得、そして記録され得る。膜または細胞表面（特に生きた細胞）への標識抗体の細胞表面結合に関する適用については、標識は、典型的には、（ｉｉｉ）有効なコンジュゲート濃度および検出感度を達成する良好な水溶性を有し、及び（ｉｖ）生きた細胞に対して無毒性であり、その結果、細胞の正常な代謝プロセスを破壊せず、早発なる細胞死も引き起こさない。
細胞蛍光強度の直接定量および蛍光標識事象（例えば、ペプチド−色素結合体の細胞表面結合）の計数は、混合および読み取り、生きた細胞またはビーズを用いた非放射性アッセイを自動化したシステム（ＦＭＡＴ（登録商標）８１００ ＨＴＳ Ｓｙｓｔｅｍ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）において行われ得る（Ｍｉｒａｇｌｉａ，「Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ｃｅｌｌ− ａｎｄ ｂｅａｄ−ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ ｍｉｃｒｏｖｏｌｕｍｅ ａｓｓａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」，（１９９９）Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ４：１９３−２０４）。標識抗体の使用としてはまた、以下が挙げられる：細胞表面レセプター結合アッセイ、免疫捕捉アッセイ、蛍光連結免疫吸着材アッセイ（ＦＬＩＳＡ）、カスパーゼ切断（Ｚｈｅｎｇ，「Ｃａｓｐａｓｅ−３ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｂｏｔｈ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ａｎｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｅｖｅｎｔｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｆａｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｖｉｖｏ」，（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：６１８−２３；ＵＳ ６３７２９０７）、アポトーシス（Ｖｅｒｍｅｓ，「Ａ ｎｏｖｅｌ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｎ ｅａｒｌｙ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｌａｂｅｌｌｅｄ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ」（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：３９−５１）および細胞傷害性アッセイ。蛍光定量的マイクロボリュームアッセイ技術は、細胞表面に標的化される分子によるアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを確認するために用いられ得る（Ｓｗａｒｔｚｍａｎ，「Ａ ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ ｍｉｃｒｏｖｏｌｕｍｅ ａｓｓａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」，（１９９９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７１：１４３−５１）。
本発明の標識された多重特異性抗体及び標識された抗体アナログは、例えば以下の生物医学画像化および分子画像化のさまざまな方法および技術による画像化生体マーカーおよびプローブとして有用である：（ｉ）ＭＲＩ（磁気共鳴画像化）；（ｉｉ）ＭｉｃｒｏＣＴ（コンピューター連動断層撮影法）；（ｉｉｉ）ＳＰＥＣＴ（シングルフォトンエミッションコンピューター連動断層撮影法）；（ｉｖ）ＰＥＴ（ポジトロン断層撮影法）（Ｃｈｅｎら（２００４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１５：４１−４９）；（ｖ）生物発光；（ｖｉ）蛍光；および（ｖｉｉ）超音波。免疫シンチグラフィーは、放射性物質で標識された抗体が動物患者またはヒト患者に投与され、そして抗体が局在した身体内部位の画像が撮影される、画像化手順である（米国特許第６５２８６２４号）。画像化生体マーカーは、客観的に測定され得、そして正常な生物学的プロセス、病的なプロセスまたは治療介入への薬理学的応答の指標として評価され得る。生体マーカーは、いくつかのタイプのものであり得る：０型は、疾患の天然の歴史的なマーカーであり、既知の臨床指数（例えば、関節リウマチにおける滑膜炎症のＭＲＩ評価）と長期的に相関する；Ｉ型のマーカーは、作用機構に従って介入の効果を捕捉するが、この機構は、臨床結果と関連しないかもしれない；ＩＩ型マーカーは、生体マーカーの変化または生体マーカーからのシグナルが臨床利益を予測する代理終点として作用して、標的とされた応答（例えば、ＣＴによって関節リウマチにおいて測定される骨腐食）が「確認」される。画像化生体マーカーは、このように、以下のような薬力学的（ＰＤ）治療情報を提供し得る：（ｉ）標的タンパク質の発現、（ｉｉ）標的タンパク質への治療剤の結合（すなわち、選択性）、ならびに（ｉｉｉ）クリアランスおよび半減期薬剤動態データ。研究室ベースの生体マーカーと比較したインビボでの画像化生体マーカーの利点としては、以下が挙げられる：非侵襲的処理、定量可能な全身評価、反復投薬および評価（すなわち、複数の時点）、ならびに前臨床（小動物）から臨床（ヒト）までの結果からの潜在的に移動可能な効果。いくつかの適用に関しては、生体画像化は、前臨床試験における動物実験にとって代わるかまたは動物実験数を最小にする。
放射性核種画像化標識としては、放射性核種（例えば、３Ｈ、１１Ｃ、１４Ｃ、１８Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８６Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３３Ｘｅ、１７７Ｌｕ、２１１Ａｔまたは２１３Ｂｉ）が挙げられる。放射性核種の金属イオンは、キレートリンカー（例えば、ＤＯＴＡ）と錯体形成し得る。ＤＯＴＡ−マレイミド（４−マレイミドブチルアミドベンジル−ＤＯＴＡ）のようなリンカー試薬は、Ａｘｗｏｒｔｈｙら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７（４）：１８０２−１８０７の手順に従って、イソプロピルクロロホルメート（Ａｌｄｒｉｃｈ）によって活性化された４−マレイミド酪酸（Ｆｌｕｋａ）とのアミノベンジル−ＤＯＴＡの反応により調製され得る。ＤＯＴＡ−マレイミド試薬は、本発明による多重特異性抗体又は抗体アナログの修飾された架橋剤の遊離スルフヒドリルと反応し、そして抗体上に金属錯体形成リガンドを提供する（Ｌｅｗｉｓら（１９９８）Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．９：７２−８６）。キレート化リンカー標識試薬（例えば、ＤＯＴＡ−ＮＨＳ）（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸モノ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）は、市販されている（Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）。放射性核種で標識された抗体を用いたレセプター標的画像化は、腫瘍組織への抗体の進行性の蓄積の検出および定量によって、経路活性化のマーカーを提供し得る（Ａｌｂｅｒｔら（１９９８）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８：１２０７−１２１０）。コンジュゲートした放射性金属は、リソソーム分解後、細胞内に維持され得る。
ペプチド標識方法は、周知である。Ｈａｕｇｌａｎｄ，２００３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｒｉｎｋｌｅｙ，１９９２，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．３：２；Ｇａｒｍａｎ，（１９９７）Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ；Ｍｅａｎｓ（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１：２；Ｇｌａｚｅｒら（１９７５）Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｔ．Ｓ．ＷｏｒｋおよびＥ．Ｗｏｒｋ編）Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｌｕｎｄｂｌａｄ，Ｒ．Ｌ．およびＮｏｙｅｓ，Ｃ．Ｍ．（１９８４）Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｖｏｌｓ．Ｉ ａｎｄ ＩＩ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ，Ｇ．（１９８５）「Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」，Ｍｏｄｅｒｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｈ．Ｔｓｃｈｅｓｃｈｅ編，Ｗａｌｔｅｒ ＤｅＧｒｙｔｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ ａｎｄ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；ならびにＷｏｎｇ（１９９１）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．）；Ｄｅ Ｌｅｏｎ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら（２００４）Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．１０：１１４９−１１５５；Ｌｅｗｉｓら（２００１）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１２：３２０−３２４；Ｌｉら（２００２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１３：１１０−１１５；Ｍｉｅｒら（２００５）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１６：２４０−２３７を参照のこと。
充分な近位にある２つの部分、蛍光リポーターおよびクエンチャーで標識したペプチドおよびタンパク質は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を受ける。レポーター基は、典型的には、特定の波長の光で励起されて、最大の明るさでの放出のための適切なストークスシフトを伴ってエネルギーをレセプター基、またはクエンチャー基へ移動させる蛍光色素である。蛍光色素としては、拡張した芳香族性を有する分子、例えば、フルオレセインおよびローダミン、ならびにそれらの誘導体が挙げられる。蛍光リポーターは、インタクトなペプチド中のクエンチャー部分によって、部分的にまたは著しくクエンチされ得る。ペプチダーゼまたはプロテアーゼによってペプチドが切断されると、蛍光の検出可能な増加が測定され得る（Ｋｎｉｇｈｔ，Ｃ．（１９９５）「Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａｙｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅｓ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２４８：１８−３４）。
本発明の標識された多重特異性抗体及び標識された抗体アナログは、親和性精製剤としても使用され得る。このプロセスでは、標識された抗体は、当該分野で周知の方法を用いて、例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ樹脂または濾紙などの固相に固定される。固定された抗体は、精製されるべき抗原を含んでいるサンプルと接触され、その後、支持体が、精製されるべき抗原以外のサンプル中の実質的に全ての物質を除去する適切な溶媒によって洗浄される。精製されるべき抗原は、固定されたポリペプチド改変体に結合される。最後に、この支持体は、抗原をポリペプチド改変体から遊離させる別の適切な溶媒（例えば、グリシン緩衝液（ｐＨ５．０））によって洗浄される。
標識化試薬は、典型的には、反応性官能基を保有し、この反応性官能基は、（ｉ）修飾された架橋剤の遊離のスルフヒドリルと直接反応して、標識された多重特異性抗体及び標識された抗体アナログを形成し得るか、または（ｉｉ）リンカー抗体と反応して、標識された抗体を形成し得る。標識化試薬の反応性官能基としては以下が挙げられる：マレイミド、ハロアセチル、ヨードアセトアミドスクシンイミジルエステル（例えば、ＮＨＳ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）、イソチオシアネート、塩化スルホニル、２，６−ジクロロトリアジニル、ペンタフルオロフェニルエステルおよびホスホラミダイト、しかし、他の官能基もまた使用され得る。
例示的な反応性官能基は、検出可能な標識（例えば、ビオチンまたは蛍光色素）のカルボキシル基置換基のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）である。標識のＮＨＳエステルは、予め成形され得、単離され得、精製され得、そして／もしくは特徴付けられ得るか、またはそれは、インサイツで形成されて抗体の求核基と反応し得る。典型的には、標識のカルボキシル形態は、カルボジイミド試薬（例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド）またはウロニウム（ｕｒｏｎｉｕｍ）試薬（例えば、ＴＳＴＵ（Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート）、ＨＢＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）またはＨＡＴＵ（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）、アクチベーター（例えば、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ））およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドのいくつかの組合せと反応させて、標識のＮＨＳエステルを得ることにより活性化される。いくつかの場合には、標識および抗体は、一工程で、標識のインサイツ活性化および抗体との反応により結合されて、標識−抗体コンジュゲートを形成し得る。他の活性化試薬および結合試薬としては、以下が挙げられる：ＴＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾ−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＴＦＦＨ（Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’”−テトラメチルウロニウム２−フルオロ−ヘキサフルオロホスフェート）、ＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＥＥＤＱ（２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロ−キノリン）、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）、ＤＩＰＣＤＩ（ジイソプロピルカルボジイミド）、ＭＳＮＴ（１−（メシチレン−２−スルホニル）−３−ニトロ−１Ｈ−１，２，４−トリアゾールおよびアリールスルホニルハロゲン化物（例えば、塩化トリイソプロピルベンゼンスルホニル）。
アルブミン結合性ペプチド（ＡＢＰ）含有多重特異性抗体及び抗体アナログ
血漿タンパク質結合は、短命の分子の薬剤動態特性を改善する有効な手段であり得る。アルブミンは、血漿において最も豊富なタンパク質である。血清アルブミン結合性ペプチド（ＡＢＰ）は、組織取り込み、浸透および拡散の変更を含め、融合した活性ドメインタンパク質の薬力学を変更し得る。これらの薬力学的パラメータは、適切な血清アルブミン結合性ペプチド配列の特異的選択により調節され得る（米国特許出願公開第２００４０００１８２７号）。一連のアルブミン結合性ペプチドは、ファージディスプレイスクリーニングにより確認された（Ｄｅｎｎｉｓら（２００２）「Ａｌｂｕｍｉｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｓ Ａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｓｔｒａｔｅｇｙ Ｆｏｒ Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７７：３５０３５−３５０４３；国際公開第０１／４５７４６号）。本発明の化合物は、以下によって教示されるＡＢＰ配列を含む：（ｉ）Ｄｅｎｎｉｓら（２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７７：３５０３５−３５０４３，Ｔａｂｌｅｓ ＩＩＩおよびＩＶ，３５０３８頁；（ｉｉ）米国特許出願公開第２００４０００１８２７号，［００７６］，配列番号９〜２２；および（ｉｉｉ）国際公開第０１／４５７４６号，１２−１３頁，配列番号ｚ１〜ｚ１４。
アルブミン結合（ＡＢＰ）含有多重特異性抗体はマレイミド-ＡＢＰを遊離スルフヒドリル基を持つ修飾された架橋剤を含む多重特異性抗体又は抗体アナログと反応させることにより合成された。
例示的なアルブミン結合性ペプチド配列としては、配列番号２３〜２７に列挙されるアミノ酸配列が挙げられるが、これらに限定されない：
アルブミン結合性ペプチド（ＡＢＰ）配列は、Ｋｄ（ウサギ）＝０．３μＭを有する複数の種（マウス、ラット、ウサギ、ウシ、アカゲザル、ヒヒおよびヒト）由来のアルブミンを結合する。アルブミン結合性ペプチドは、アルブミンと結合することが公知のリガンドと競合せず、かつウサギにおいて２．３時間の半減期（Ｔ１／２）を有する。
薬物コンジュゲート
本発明の多重特異性抗体及び抗体アナログ、特に遊離のスルフヒドリル基を有する修飾された架橋剤で合成されたものは、任意の治療的薬剤、すなわち反応性スルフヒドリル基を介して抗体に共有結合できる薬剤部分とコンジュゲートされ得る。
抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）化合物の例示的実施態様は、多重特異性抗体及び抗体アナログ（各々は以下の議論においてＡｂとして参照される）、および薬剤部分（Ｄ）を含み、ここで、この多重特異性抗体及び抗体アナログは、遊離のスルフヒドリル基（Ｌ）を有する修飾された架橋剤で合成され、その抗体は遊離のスルフヒドリル基を通してＤへと結合している；この構成物は、式Ｉを有する：
ここで、ｐは、１、２、３、または４である。チオール反応性リンカー部分を介して多重特異性抗体及び抗体アナログへと結合し得る薬剤部分の数は、本明細書に記載される方法によって導入される反応性チオールの数により制限される。
抗体−薬剤コンジュゲート化合物（ＡＤＣ）の別の例示的実施態様は、多重特異性抗体又は抗体アナログ（Ａｂ）、アルブミン結合性ペプチド（ＡＢＰ）および薬剤部分（Ｄ）を含み、ここで、この抗体は、リンカー部分（Ｌ）によって薬剤部分と結合しており、そしてこの抗体は、アミド結合または第２のリンカー部分によって、アルブミン結合性ペプチドと結合している；この構成物は、式Ｉａを有する：
ここで、ｐは、１、２、３、または４である
本発明のＡＤＣ化合物は、抗癌活性についての有用性を有するものを含む。特に、この化合物は、薬剤部分（すなわち、毒素）にコンジュゲートした（すなわち、リンカーによって共有結合した）抗体を含む。薬剤が抗体にコンジュゲートしていない場合、この薬剤は、細胞傷害効果または細胞増殖抑制効果を有する。このように、薬剤部分の生物学的活性は、抗体へのコンジュゲーションによって調節される。本発明の抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）は、有効量の細胞傷害剤を腫瘍組織へと選択的に送達し、それにより、より大きな選択性（すなわち、より低い有効用量）が達成され得る。
１つの実施態様では、ＡＤＣの薬剤部分を含む薬剤化合物と比較した場合、本発明のＡＤＣまたはＡＤＣの細胞内代謝産物のバイオアベイラビリティーは、哺乳類において改善される。また、薬剤部分を有しない抗体構成成分と比較した場合、ＡＤＣまたはＡＤＣの細胞内代謝産物のバイオアベイラビリティーは哺乳類において改善される。
薬剤部分
抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）の薬剤部分（Ｄ）は、細胞傷害効果または細胞増殖抑制果を有する、任意の化合物、部分または基を含む。薬剤部分としては、以下が挙げられる：（ｉ）化学療法剤（これは、マイクロチューブリンインヒビター、有糸***インヒビター、トポイソメラーゼインヒビターまたはＤＮＡインターカレーターとして機能し得る）、（ｉｉ）タンパク質毒素（これは、酵素的に機能し得る）、および（ｉｉｉ）ラジオアイソトープ。
例示的な薬剤部分としては、マイタンシノイド、オーリスタチン、ドラスタチン、トリコテセン、ＣＣ１０６５、カリケアマイシンおよび他のエンジイン抗生物質、タキサン、アントラサイクリン、ならびにそれらの立体異性体、同配体、類似体またはそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
メイタンシノイド薬剤部分としての使用に適切なメイタンシン化合物は当分野で周知であり、公知の方法に従って天然の供給源から単離してもよいし、又は遺伝子工学技術及び発酵を用いて産生してもよい(Yu等、(2002) PROC. NAT. ACAD. SCI. (USA) 99:7968-7973を参照)。また、メイタンシノール及びメイタンシノール類似体は、公知の方法に従って合成により調製されてもよい。
例示的なメイタンシノイド薬剤部分には、修飾した芳香族環を有するもの、例えば、Ｃ−１９−デクロロ(米国特許第４２５６７４６号)(アンサマイトシンＰ２のリチウムアルミニウム水素化物の還元によって調製される)；Ｃ−２０−ヒドロキシ(又はＣ−２０−デメチル) ＋／−Ｃ−１９−デクロロ(米国特許第４３６１６５０号及び同第４３０７０１６号)(ストレプトミセス属ないしはアクチノミセス属を用いた脱メチル化又はＬＡＨを用いた脱塩素により調製される)；及びＣ−２０−デメトキシ、Ｃ−２０−アシロキシ(−ＯＣＯＲ)、＋／−デクロロ(米国特許第４２９４７５７号)(アシル塩化物を用いたアシル化により調製される)、及び他の位置に修飾を有するものが含まれる。
また、例示的なメイタンシノイド薬剤部分には、修飾を有するもの、例えば、Ｃ−９−ＳＨ(米国特許第４４２４２１９号)(Ｈ２Ｓ又はＰ２Ｓ５を有するメイタンシノールの反応により調製される)；Ｃ−１４−アルコキシメチル(デメトキシ／ＣＨ２ ＯＲ)(米国特許第４３３１５９８号)；Ｃ−１４−ヒドロキシメチル又はアシロキシメチル(ＣＨ２ＯＨ又はＣＨ２ＯＡｃ) (米国特許第４４５０２５４号)；Ｃ−１５−ヒドロキシ／アシロキシ(米国特許第４３６４８６６号)(ストレプトミセス属によるメイタンシノールの変換によって調製される)；Ｃ−１５−メトキシ(米国特許第４３１３９４６号及び同第４３１５９２９号)(トレウィア ヌドロフローラ(Trewia nudlflora)より単離)；Ｃ−１８−Ｎ−デメチル(米国特許第４３６２６６３号及び第４３２２３４８号)(ストレプトミセス属によるメイタンシノールの脱メチル化により調製される)；及び、４,５−デオキシ(米国特許第４３７１５３３号)(メイタンシノールの三塩化チタン／ＬＡＨ還元により調製される)が含まれる。結合の種類に応じて、メイタンシン化合物上の多くの位置は結合位置として有用であることが知られている。例えば、エステル結合を形成するために、水酸基を有するＣ−３位置、ヒドロキシメチルによって修飾されたＣ−１４位置、水酸基によって修飾されたＣ−１５位置、及び水酸基を有するＣ−２０位置はすべて適する。
００００
式Ｉの抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）の薬剤部分（Ｄ）は、以下の構造を有するメイタンシノイドを含み、
ここで、破線はＤの硫黄原子の抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）のリンカー（Ｌ）への共有結合を意味する。Ｒは独立にＨ、又は、メチル、エチル、１−プロピル、２−プロピル、１−ブチル、２−メチル−１−プロピル、２−ブチル、２−メチル−２−プロピル、１−ペンチル、２−ペンチル、３−ペンチル、２−メチル−２−ブチル、３−メチル−２−ブチル、３−メチル−１−ブチル、２−メチル−１−ブチル、１−ヘキシル、２−ヘキシル、３−ヘキシル、２−メチル−２−ペンチル、３−メチル−２−ペンチル、４−メチル−２−ペンチル、３−メチル−３−ペンチル、２−メチル−３−ペンチル、２，３−ジメチル−２−ブチル、及び３，３−ジメチル−２−ブチルから選択されるＣ１−Ｃ６アルキルでありうる。アミド基を硫黄原子へ結合するアルキレン鎖は、メタニル、エタニル、又はプロピルであり得、すなわちｍは１、２、又は３である。
マイタンシン化合物は、マイクロチューブリンタンパク質であるチュービュリンの重合阻害によって有糸***中の微小管の形成を阻害することによって、細胞増殖を阻害する（Ｒｅｍｉｌｌａｒｄら（１９７５）Ｓｃｉｅｎｃｅ １８９：１００２−１００５）。マイタンシンおよびマイタンシノイドは非常に細胞傷害性であるが、癌治療におけるそれらの臨床用途は、それらの乏しい腫瘍選択性に主に起因しているそれらの重篤な全身副作用によって大いに制限されている。マイタンシンを用いた臨床試験は、中枢神経系および胃腸系に対する深刻な副作用に起因して中断された（Ｉｓｓｅｌら（１９７８）Ｃａｎ．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｒｅｖ．５：１９９−２０７）。
マイタンシノイド薬剤部分は、抗体−薬剤コンジュゲートにおいて魅力的な薬剤部分である。なぜなら、これらは以下であるからである：（ｉ）発酵または化学修飾、発酵産物の誘導体化によって調製するために比較的アクセス可能である、（ｉｉ）非ジスルフィドリンカーを通した抗体に対するコンジュゲーションに適している官能基を用いた誘導体化が可能である、（ｉｉｉ）血漿中で安定である、および（ｉｖ）様々な腫瘍細胞株に対して有効である（米国特許出願公開第２００５／０１６９９３３号；国際公開第２００５／０３７９９２号；米国特許第５２０８０２０号）。
他の薬剤部分と同様に、マイタンシノイド薬剤部分の全ての立体異性体（すなわち、Ｄのキラル炭素におけるＲ配置およびＳ配置の任意の組合せ）は、本発明の化合物について意図される。一つの実施態様では、マイタンシノイド薬剤部分（Ｄ）は、以下の立体化学を有する：
マイタンシノイド薬剤部分の例示的実施態様としては、以下の構造を有する、以下が挙げられる：ＤＭ１、（ＣＲ２）ｍ＝ＣＨ２ＣＨ２；ＤＭ３、（ＣＲ２）ｍ＝ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）；およびＤＭ４、（ＣＲ２）ｍ＝ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２：
リンカーは、連結のタイプに依存して、さまざまな位置においてマイタンシノイド分子に結合され得る。例えば、エステル結合は、従来の結合技術を使用してヒドロキシル基との反応により形成され得る。この反応は、ヒドロキシル基を有しているＣ−３位、ヒドロキシメチルにより修飾されるＣ−１４位、ヒドロキシル基により修飾されるＣ−１５位およびヒドロキシル基を有しているＣ−２０位で生じ得る。好ましい実施態様では、この結合は、マイタンシノールまたはマイタンシノール類似体のＣ−３位で形成される。
式Ｉの抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）の薬剤部分（Ｄ）はまた、ドラスタチンおよびそれらのペプチド類似体および誘導体（オーリスタチン）を含む（米国特許第５６３５４８３号；同第５７８０５８８号）。ドラスタチンおよびオーリスタチンは、微小管力学、ＧＴＰ加水分解、ならびに核および細胞の***を妨げることが示された（Ｗｏｙｋｅら（２００１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５（１２）：３５８０−３５８４）。ドラスタチンおよびオーリスタチンは、抗癌活性（ＵＳ ５６６３１４９）および抗真菌性活性を有する（Ｐｅｔｔｉｔら（１９９８）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４２：２９６１−２９６５）。さまざまな形態のドラスタチン薬剤部分またはオーリスタチン薬剤部分は、ペプチド薬剤部分のＮ（アミノ）末端またはＣ（カルボキシル）末端を通して抗体に共有結合され得る（国際公開第０２／０８８１７２号；Ｄｏｒｏｎｉｎａら（２００３）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１（７）：７７８−７８４；Ｆｒａｎｃｉｓｃｏら（２００３）Ｂｌｏｏｄ １０２（４）：１４５８−１４６５）。
薬剤部分としては、ドラスタチン、オーリスタチン（米国特許第５６３５４８３号；米国特許第５７８０５８８号；米国特許第５７６７２３７号；米国特許第６１２４４３１号）、ならびにそれらの類似体および誘導体が挙げられる。ドラスタチンおよびオーリスタチンは、微小管力学、ＧＴＰ加水分解、ならびに核および細胞の***を妨げることが示されている（Ｗｏｙｋｅら（２００１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５（１２）：３５８０−３５８４）。ドラスタチンおよびオーリスタチンは、抗癌活性（米国特許第５６６３１４９号）および抗真菌性活性を有する（Ｐｅｔｔｉｔら（１９９８）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４２：２９６１−２９６５）。ドラスタチン薬剤部分またはオーリスタチン薬剤部分は、ペプチド薬剤部分のＮ（アミノ）末端またはＣ（カルボキシル）末端を通して抗体に結合され得る（国際公開第０２／０８８１７２号）。
代表的なオーリスタチンの実施態様としては、以下で開示される、Ｎ末端に連結されたモノメチルオーリスタチン薬剤部分ＤＥおよびＤＦが挙げられる：国際公開第２００５／０８１７１１号；Senterら、Proceedings of the American Association for Cancer Research,45巻, 抄録番号６２３（２００４年３月２８日に公開）。
式Ｉの抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）の薬剤部分（Ｄ）としては、Ｎ末端を通して抗体へと連結される、以下の構造を有するモノメチルオーリスタチン薬剤部分ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦが挙げられる：
典型的には、ペプチドベースの薬物部分は、二個以上のアミノ酸および／またはペプチド断片の間でペプチド結合を形成することにより調製され得る。このようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の分野では周知である液相合成法（Ｅ．Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ａｎｄ Ｋ． Ｌｕｅｂｋｅ，「Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」，ｖｏｌｕｍｅ １，７６−１３６頁，１９６５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓを参照のこと）に従って調製され得る。
薬剤部分としては、カリケアマイシン、ならびにその類似体および誘導体が挙げられる。カリケアマイシンファミリーの抗生物質は、ピコモル濃度未満の濃度で二本鎖ＤＮＡ切断を生じ得る。カリケアマイシンファミリーの結合体の調製に関しては、米国特許第５７１２３７４号；米国特許第５７１４５８６号；米国特許第５７３９１１６号；米国特許第５７６７２８５号；米国特許第５７７０７０１号、米国特許第５７７０７１０号；米国特許第５７７３００１号；米国特許第５８７７２９６号を参照のこと。用いられ得る、カリケアマイシンの構造類似体としては、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１Ｉ、ＰＳＡＧおよびθＩ１が挙げられるが、これらに限定されない（Ｈｉｎｍａｎら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３：３３３６−３３４２（１９９３），Ｌｏｄｅら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５８：２９２５−２９２８（１９９８））。
タンパク質毒素としては、以下が挙げられる：ジフテリアＡ鎖、ジフテリアトキシンの非結合性活性フラグメント、エキソトキシンＡ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ菌由来）、リシンＡ鎖（Ｖｉｔｅｔｔａら（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３８：１０９８）、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、α−サルシン（ｓａｒｃｉｎ）、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ダイアンシン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａインヒビター、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓインヒビター、ゲロニン、マイトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）およびトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）（国際公開第９３／２１２３２号）。
治療用ラジオアイソトープとしては、以下が挙げられる：３２Ｐ、３３Ｐ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、１５３Ｓｍ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１２ＰｂおよびＬｕの放射性同位元素。
ラジオアイソトープまたは他の標識は、公知の方法で結合体中に組み込まれ得る（Ｆｒａｋｅｒら（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．８０：４９−５７；「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ」，Ｃｈａｔａｌ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９８９）。炭素１４標識された１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体に対する放射性核種の結合体化のための例示的なキレート剤である（国際公開第９４／１１０２６号）。
リンカー
「リンカー」(Ｌ)は、一又は複数の薬剤部分(Ｄ)と抗体ユニット(Ａｂ)を連結させて、式Ｉの多重特異性抗体−薬剤コンジュゲート又は抗体−薬剤コンジュゲート(ＡＤＣ)を形成させるために用いられうる、二官能性部分又は多機能性部分である。ＡＤＣは、薬剤及び抗体への結合について反応性機能を有するリンカーを用いて簡便に調製されうる。抗体ユニット(Ａｂ)は、リンカー試薬、薬剤部分又は薬剤-リンカー中間体の官能基と結合を形成することができる。
一態様では、リンカーは、抗体又は抗体断片に存在する求核性システインに反応することができる求電子性基を有する反応部位を有する。抗体又は抗体断片のシステインチオールは、リンカー上の求電子性基と反応することができ、リンカーに共有結合する。有用な求電子性の基には、マレイミド及びハロアセトアミド基を含むが、これらに限定されるものではない。
Ｋｌｕｓｓｍａｎら（２００４）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １５（４）：７６５−７７３の７６６ページに記載されるコンジュゲート法、および実施例４のプロトコールによれば、システイン改変された抗体は、マレイミドまたはα−ハロカルボニルのような求電子性の官能基で、リンカー試薬または薬剤−リンカー中間体と反応する。
一実施態様では、ＡＤＣのリンカーＬは以下の式を有する。
このとき、
−Ａ−は、抗体(Ａｂ)のシステインチオールに共有結合したストレッチャーユニットであり、
ａは０又は１であり、
各々の−Ｗ−は、独立したアミノ酸ユニットであり、
ｗはそれぞれ、０から１２の範囲の整数であり、
−Ｙ−は、薬剤部分に共有結合したスペーサーユニットであり、そして、ｙは０、１又は２である
ストレッチャーユニット
ストレッチャユニット(−Ａ−)は、存在する場合には、抗体ユニットをアミノ酸ユニット(−Ｗ−)に連結することができる。この点に関しては、抗体(Ａｂ)は、ストレッチャーの求電子性官能基と結合を形成することができる遊離のシステインチオール基又は他の遊離のチオール基を有する。この実施態様の代表的なストレッチャーユニットが式ＩＩＩａおよびＩＩＩｂの括弧内に示されており、このときＡｂ、−Ｗ−、−Ｙ−、−Ｄ、ｗ及びｙは前記に定義した通りであり、Ｒ１７は、(ＣＨ２)ｒ、Ｃ３−Ｃ８ カルボシクリル、Ｏ−(ＣＨ２)ｒ、アリーレン、(ＣＨ２)ｒ−アリーレン、−アリーレン−(ＣＨ２)ｒ−、(ＣＨ２)ｒ−(Ｃ３−Ｃ８ カルボシクリル)、(Ｃ３−Ｃ８ カルボシクリル)−(ＣＨ２)ｒ、Ｃ３−Ｃ８ ヘテロシクリル、(ＣＨ２)ｒ−(Ｃ３−Ｃ８ ヘテロシクリル)、−(Ｃ３−Ｃ８ ヘテロシクリル)−(ＣＨ２)ｒ−、−(ＣＨ２)ｒＣ(Ｏ)ＮＲｂ(ＣＨ２)ｒ−、−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｒ−、−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｒ−ＣＨ２−、−(ＣＨ２)ｒＣ(Ｏ)ＮＲｂ(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｒ−、−(ＣＨ２)ｒＣ(Ｏ)ＮＲｂ(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｒ−ＣＨ２−、−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｒＣ(Ｏ)ＮＲｂ(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｒ−、−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｒＣ(Ｏ)ＮＲｂ(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｒ−ＣＨ２−、及び−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｒＣ(Ｏ)ＮＲｂ(ＣＨ２)ｒ−から選択される二価のラジカルであり、ＲｂはＨ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、フェニル又はベンジルであり、そして、ｒは独立に、１から１０の範囲の整数である。
アリーレンには、親芳香族環システムから２つの水素原子を除去して誘導される６〜２０の炭素原子の二価の芳香族炭化水素ラジカルが含まれる。代表的なアリーレン基には、ベンゼン、置換されたベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニルなどから誘導されたラジカルが含まれるが、これらに限定されるものではない。
ヘテロシクリル基には、一又は複数の環原子がヘテロ原子、例えば窒素、酸素及び硫黄である環系を含む。複素環ラジカルは、１〜２０の炭素原子とＮ、Ｏ、Ｐ及びＳから選択される１〜３のヘテロ原子を含む。複素環は、３〜７員環を有する単環(２〜６の炭素原子とＮ、Ｏ、Ｐ及びＳから選択される１〜３のヘテロ原子)又は７〜１０員環を有する二環 (４〜９の炭素原子とＮ、Ｏ、Ｐ及びＳから選択される１〜３のヘテロ原子)、例えばビシクロ[４,５]系、[５,５]系、[５,６]系、又は[６,６]系であり得る。複素環は、Ｐａｑｕｅｔｔｅ，Ｌｅｏ Ａ．；「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｍｏｄｅｒｎ Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」（Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９６８）、特に、第１章、第３章、第４章、第６章、第７章、および第９章；「Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ａ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ」（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９５０〜現在）、特に、第１３巻、第１４巻、第１６巻、第１９巻、および第２８巻；ならびにＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９６０）８２：５５６６に記載される。
複素環の例には、例として、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ピリジル、ジヒドロピリジル、テトラヒドロピリジル (ピペリジル)、チアゾリル、テトラヒドロチオフェニル、硫黄酸化型テトラヒドロチオフェニル、ピリミジニル、フラニル、チエニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、テトラゾリル、ベンゾフラニル、チアナフタレニル、インドリル、インドレニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンズイミダゾリル、ピペリジニル、４−ピペリドニル、ピロリジニル、２−ピロリドニル、ピロリニル、テトラヒドロフラニル、ビス−テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、ビス−テトラヒドロピラニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、デカヒドロキノリニル、オクタヒドロイソキノリニル、アゾチニル、トリアジニル、６Ｈ−１,２,５−チアジアジニル、２Ｈ,６Ｈ−１,５,２−ジチアジニル、チエニル、チアンスレニル、ピラニル、イソベンゾフラニル、クロメニル、キサンテニル、フェノキサチニル、２Ｈ−ピロリル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、ピラジニル、ピリダジニル、インドリジニル、イソインドリル、３Ｈ−インドリル、１Ｈ−インダゾリル、プリニル、４Ｈ−キノリジニル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、チノリニル、プテリジニル、４ａＨ−カルバゾリル、カルバゾリル、β−カルボリニル、フェナンスリジニル、アクリジニル、ピリミジニル、フェナンスロリニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フラザニル、フェノキサジニル、イソクロマニル、クロマニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピペラジニル、インドリニル、イソインドリニル、キヌクリジニル、モルホリニル、オキサゾリジニル、ベンゾトリアゾリル、ベンズイソキサゾリル、オキシンドリル、ベンズオキサゾリニル、及びイサチノイル。
「カルボシクリル基(Carbocyclyl)」には、単環として３〜７の炭素原子又は二環として７〜１２の炭素原子を有する飽和ないしは不飽和の環が含まれる。単環の炭素環は３〜６の環状原子、より一般的には５又は６の環状原子を有する。二環式の炭素環は、例えばビシクロ[４,５]系、[５,５]系、[５,６]系又は[６,６]系として配置した７〜１２の環状原子、又はビシクロ[５,６]系又は[６,６]系として配置した９又は１０の環状原子を有する。単環の炭素環の例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、１−シクロペント−１−エニル、１−シクロペント−２−エニル、１−シクロペント−３−エニル、シクロヘキシル、１−シクロヘキス−１−エニル、１−シクロヘキス−２−エニル、１−シクロヘキス−３−エニル、シクロヘプチル、及びシクロオクチルが含まれる。
ＩＩＩからＶＩなどの式ＩのＡＤＣのすべての例示的な実施態様から、明確に示していない場合であっても、反応性チオール基の数に応じて、１から４の薬剤部分が抗体に連結している(ｐ＝１〜４)ことが理解される。
図示する式ＩＩＩａのストレッチャーユニットは、Ｒ１７が−(ＣＨ２)５−である、マレイミド−カプロイル(ＭＣ)から得られる。
図示する式ＩＩＩａのストレッチャーユニットは、Ｒ１７が−(ＣＨ２)２−である、マレイミド−プロパノイル(ＭＰ)から得られる。
他の図示する式ＩＩＩａのストレッチャーユニットは、Ｒ１７が−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｒ−ＣＨ２−であり、ｒが２である。
他の図示する式ＩＩＩａのストレッチャーユニットは、Ｒ１７が−(ＣＨ２)ｒＣ(Ｏ)ＮＲｂ(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｒ−ＣＨ２−であり、ＲｂがＨであり、各々のｒが２である。
他の図示する式ＩＩＩｂのストレッチャーユニットは、Ｒ１７が−(ＣＨ２)５−である。
他の実施態様では、ストレッチャーユニットは、抗体ユニットの硫黄原子とストレッチャーユニットの硫黄原子との間のジスルフィド結合により、抗体ユニットへと連結される。この実施態様の代表的なストレッチャーユニットは、式ＩＶの括弧内で表され、Ｒ１７、Ａｂ−、−Ｗ−、−Ｙ−、−Ｄ、ｗ及びｙは前記に定義する通りである。
さらに他の実施態様では、ストレッチャーの反応基は、抗体の遊離したシステインチオール又は他の遊離したチオールと結合することができるチオール反応性の官能基を含む。チオール反応性の官能基の例には、限定するものではないが、マレイミド、α−ハロアセチル、活性エステル、例として、スクシンイミドエステル、４−ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、無水物、酸クロリド、塩化スルホニル、イソシアネート及びイソチオシアネートが含まれる。この実施態様の代表的なストレッチャーユニットは、式Ｖａ及びＶｂの括弧内に表され、このとき、−Ｒ１７−、Ａｂ−、−Ｗ−、−Ｙ−、−Ｄ、ｗ及びｙは前記に定義した通りである。
別の実施形態において、リンカーは、分枝の多官能性リンカー部分を通して、２以上の薬剤部分を１つの抗体へと共有結合させるための、樹状型リンカーであり得る（Ｓｕｎら（２００２）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １２：２２１３−２２１５；Ｓｕｎら（２００３）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １１：１７６１−１７６８；Ｋｉｎｇ（２００２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４３：１９８７−１９９０）。樹状リンカーは、薬剤対抗体の分子比、すなわち、ＡＤＣの効力に関連する負荷を高め得る。こうして、システイン操作された抗体が、１つのみの反応性のシステインチオール基を有する場合、多数の薬剤部分が、樹状リンカーを介して結合され得る。
アミノ酸ユニット
リンカーはアミノ酸残基を含んでいてもよい。アミノ酸ユニット(−Ｗｗ−)は、存在する場合には、抗体(Ａｂ)を本発明の抗体−薬剤コンジュゲート(ＡＤＣ)の薬剤部分(Ｄ)に連結する。
−Ｗｗ−は、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、デカペプチド、ウンデカペプチド又はドデカペプチドのユニットである。アミノ酸ユニットを含むアミノ酸残基には、天然に生じるもの、並びにシトルリンなどの微量アミノ酸及び天然に生じないアミノ酸類似体が含まれる。各々の−Ｗ−ユニットはそれぞれ、以下の括弧内で示す式を有し、ｗは、０から１２の範囲の整数である。
ここで、Ｒ１９は、ヒドロゲン、メチル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ-ブチル、ベンジル、ｐ-ヒドロキシベンジル、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３、−ＣＨ２ＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＯＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、−(ＣＨ２)３ＮＨＣ(=ＮＨ)ＮＨ２、−(ＣＨ２)３ＮＨ２、−(ＣＨ２)３ＮＨＣＯＣＨ３、−(ＣＨ２)３ＮＨＣＨＯ、−(ＣＨ２)４ＮＨＣ(=ＮＨ)ＮＨ２、−(ＣＨ２)４ＮＨ２、−(ＣＨ２)４ＮＨＣＯＣＨ３、−(ＣＨ２)４ＮＨＣＨＯ、−(ＣＨ２)３ＮＨＣＯＮＨ２、−(ＣＨ２)４ＮＨＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２ＮＨ２、２-ピリジルメチル−、３-ピリジルメチル−、４-ピリジルメチル−、フェニル、シクロヘキシル、
である。
アミノ酸ユニットは、腫瘍関連プロテアーゼを含む一又は複数の酵素によって酵素的に切断され、薬剤部分(−Ｄ)を遊離し、この薬剤部分は、一実施態様では、放出の際にインビボでプロトン化され、薬剤(Ｄ)を提供する。
有用な−Ｗｗ−ユニットは、特定の酵素、例えば腫瘍関連プロテアーゼにより酵素的に切断について設計され、その選択性が最適化されうる。一実施態様において、−Ｗｗ−ユニットは、その切断がカテプシンＢ、Ｃ及びＤ、又はプラスミンプロテアーゼによって触媒されるものである。
例示的な−Ｗｗ−アミノ酸ユニットとしては、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドまたはペンタペプチドが挙げられる。例示的なジペプチドとしては、バリン−シトルリン（ｖｃまたはｖａｌ−ｃｉｔ）、アラニン−フェニルアラニン（ａｆまたはａｌａ−ｐｈｅ）が挙げられる。例示的なトリペプチドとしては、グリシン−バリン−シトルリン（ｇｌｙ−ｖａｌ−ｃｉｔ）およびグリシン−グリシン−グリシン（ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ）が挙げられる。
Ｒ１９が水素以外である場合、Ｒ１９が結合する炭素原子は、キラルである。Ｒ１９が結合する炭素原子の各々は、独立して、（Ｓ）もしくは（Ｒ）の立体配置であるか、または、ラセミ混合物である。したがって、アミノ酸ユニットは、鏡像異性的に純粋であっても、ラセミであっても、ジアステレオマーであってもよい。
スペーサーユニット
スペーサユニット(−Ｙｙ−)は、存在する場合(ｙ＝１又は２)には、アミノ酸ユニットが存在する(ｗ＝１〜１２)場合に、アミノ酸ユニット(−Ｗｗ−)を薬剤部分(Ｄ)に連結する。あるいは、アミノ酸ユニットがない場合には、スペーサーユニットはストレッチャーユニットを薬剤部分に連結する。アミノ酸ユニット及びストレッチャーユニットがともにない(ｗ、ｙ＝０)場合には、スペーサーユニットも薬剤部分を抗体ユニットに連結する。スペーサーユニットは、２つの一般的な型のものである：自己犠牲型および非自己犠牲型。非自己犠牲型スペーサーユニットは、抗体−薬剤コンジュゲート又は薬剤部分−リンカーからアミノ酸ユニットが切断、特に酵素的に切断された後に、スペーサーユニットの一部ないしはすべてが薬剤部分に結合したままとなるものである。グリシン−グリシンスペーサーユニット又はグリシンスペーサーユニットを含むＡＤＣが腫瘍細胞関連プロテアーゼ、癌細胞関連プロテアーゼ又はリンパ球関連プロテアーゼによって酵素的に切断される場合、グリシン−グリシン−薬剤部分又はグリシン−薬剤部分がＡｂ−Ａａ−Ｗｗ−から切断される。一実施態様では、独立した加水分解反応が標的細胞の中で起こり、グリシン−薬剤部分の結合が切断され、薬剤が遊離される。
他の実施態様では、−Ｙｙ−は、フェニレン部分がＱｍに置換しているｐ-アミノベンジルカルバモイル(ＰＡＢ)ユニットであり（スキーム２及び３）、このときＱは−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｏ−(Ｃ１−Ｃ８アルキル)、−ハロゲン、−ニトロ、又は−シアノであり、そして、ｍは０〜４の範囲の整数である。
非自己犠牲型スペーサーユニット(−Ｙ−)の例示的な実施態様は、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、−Ｇｌｙ−、−Ａｌａ−Ｐｈｅ−、−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−である。
一実施態様では、スペーサーユニットがない(ｙ＝０)、又は薬学的に許容可能な塩ないしはその溶媒和化合物である、薬剤部分−リンカー又はＡＤＣが提供される。
あるいは、自己犠牲型のスペーサーユニットを含むＡＤＣは−Ｄを放出しうる。一実施態様では、−Ｙ−はＰＡＢグループのアミノ窒素原子を介して−Ｗｗ−に連結されるＰＡＢグループであり、カルボナート基、カルバメート基又はエーテル基を介して−Ｄに直接連結しており、このときＡＤＣは以下のような例示的な構造を有する。
このとき、Ｑは、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｏ−(Ｃ１−Ｃ８アルキル)、−ハロゲン、−ニトロ、又は−シアノであり、ｍは０〜４の範囲の整数であり、そして、ｐは１から４の範囲である。
自己犠牲型のスペーサーの他の例には、ＰＡＢグループに電子的に類似している芳香族化合物、例として、２-アミノイミダゾール-５-メタノール誘導体(Hay等 (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237)、及びオルトないしはパラ-アミノベンジルアセタールが含まれるが、これらに限定されるものではない。アミド結合加水分解の際に環化されるスペーサーとしては、置換および非置換の４-アミノ酪酸アミド(Rodrigues等 (1995) Chemistry Biology 2:223)、適切に置換されたビシクロ[２.２.１]環系、及び、ビシクロ[２.２.２]環系(Storm等 (1972) J. Amer. Chem. Soc. 94: 5815)、及び２-アミノフェニルプロピオン酸アミド(Amsberry,等 (1990) J. Org. Chem. 55:5867)などが使用され得る。グリシンが置換されたアミン含有薬剤の脱離(Kingsbury等 (1984) J. Med. Chem. 27:1447)もまた、ＡＤＣにおいて有用な自己犠牲型スペーサーの例である。
一実施態様では、スペーサーユニットは、複数の薬剤を組み込んだり解放したりするために使用され得る、分枝のビス（ヒドロキシメチル）スチレン（ＢＨＭＳ）であり、以下の構造：
を有し、２-（４-アミノベンジリデン)プロパン１,３-ジオールデンドリマーユニットを含み(国際公開２００４／０４３４９３号；de Groot等 (2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42: 4490-4494)、Ｑは、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｏ−(Ｃ１−Ｃ８アルキル)、−ハロゲン、−ニトロ、又は−シアノであり、ｍは０〜４の範囲の整数であり、ｎは０又は１であり、そして、ｐは１から４の範囲である。
樹状リンカー
他の実施態様では、リンカーＬは、分岐状の、多機能リンカー部分により一又は複数の薬剤部分を抗体へと共有結合させるための樹状型のリンカーであり得る(Sun等 (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215；Sun等 (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768)。樹状リンカーは抗体に対する薬剤のモル比、すなわち負荷を増し、これはＡＤＣの力価に関連がある。したがって、抗体は１つの反応性チオール基のみを有する場合、多くの薬剤部分が樹状リンカーを介して結合され得る。
以下の樹状リンカー試薬の例示的な実施態様では、クロロエチル窒素マスタード官能基との反応により最大で９つの求核性薬剤部分の試薬がコンジュゲートされることを可能とする。
スペーサーユニットの別の実施形態において、自己犠牲型の２，６−ビス（ヒドロキシメチル）−ｐ−クレゾールデンドリマー単位および２，４，６−トリス（ヒドロキシメチル）−フェノールデンドリマー単位（国際公開第２００４／０１９９３号；Ｓｚａｌａｉら（２００３）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：１５６８８−１５６８９；Ｓｈａｍｉｓら（２００４）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２６：１７２６−１７３１；Ａｍｉｒら（２００３）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４２：４４９４−４４９９）を有する分枝の樹状リンカーは、本発明の化合物におけるリンカーとして使用され得る。
別の実施形態において、Ｄ部分は同じである。
なお別の実施形態において、Ｄ部分は異なる。
１つの態様において、スペーサーユニット（−Ｙｙ−）は、式（Ｘ）〜（ＸＩＩ）によって表れる：
ここで、Ｑは、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−ハロゲン、−ニトロまたは−シアノであり；そしてｍは、０〜４の範囲の整数である；
式Ｉの抗体−薬剤コンジュゲート化合物の実施態様としては、ＸＩＩＩａ（ｖａｌ−ｃｉｔ）、ＸＩＩＩｂ（ＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ）、ＸＩＩＩｃ（ＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ）：
が挙げられる。
式Ｉａの抗体−薬剤コンジュゲート化合物の他の例示的な実施態様としては、ＸＩＶａ−ｅ：
が挙げられ、ここでＸは：
であり、
Ｙは：
であり、
Ｒは、独立して、ＨまたはＣ１−Ｃ６アルキルであり；そして、ｎは、１〜１２である。
別の実施態様において、リンカーは、抗体に存在する求電子性基に対して反応性の求核性基を有する反応性の官能基を有する。抗体上の有用な求電子性基としては、アルデヒド基およびケトンカルボニル基が挙げられるがこれらに限定されない。リンカーの求核性基のヘテロ原子は、抗体上の求電子性基と反応して、抗体ユニットへの共有結合を形成し得る。リンカー上の有用な求核性基としては、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、およびアリールヒドラジドが挙げられるがこれらに限定されない。抗体上の求電子性基は、リンカーへの結合に好都合な部位を提供する。
典型的には、ペプチド型のリンカーは、２以上のアミノ酸および／またはペプチド断片間にペプチド結合を形成することによって調製され得る。このようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の分野で周知の、液相合成法（Ｅ．ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＫ．Ｌｕｅｂｋｅ（１９６５）「Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」，第１巻，ｐｐ ７６−１３６，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）に従って調製され得る。
リンカー中間体は、スペーサー単位、ストレッチャー単位およびアミノ酸単位を含む、反応のあらゆる組み合わせまたは順序で組み立てられ得る。スペーサーユニット、ストレッチャーユニットおよびアミノ酸ユニットは、自然状態では求電子性、求核性またはフリーラジカルである、反応性の官能基を使用し得る。反応性の官能基としては、以下：
が挙げられるがこれらに限定されず、ここで、Ｘは、脱離基（例えば、Ｏ−メシル、Ｏ−トシル、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ）；またはマレイミドである。
別の実施形態において、リンカーは、可溶性または反応性を調節する基で置換され得る。例えば、帯電した置換基（例えば、スルホネート（−ＳＯ３ −）またはアンモニウム）は、ＡＤＣを調製するために使用される合成経路に依存して、試薬の水溶性を高め、そして、リンカー試薬の、抗体または薬剤部分とのカップリング反応を促進するか、または、Ａｂ−Ｌ（抗体−リンカー中間体）のＤとのカップリング反応、またはＤ−Ｌ（薬剤−リンカー中間体）のＡｂとのカップリング反応を促進し得る。
本発明の化合物は、明らかに、リンカー試薬を用いて調製されたＡＤＣ：ＢＭＰＥＯ、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、およびスルホ−ＳＭＰＢ、およびＳＶＳＢ（スクシニミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）；ならびにビス−マレイミド試薬を用いて調製されたＡＤＣ：ＤＴＭＥ、ＢＭＢ、ＢＭＤＢ、ＢＭＨ、ＢＭＯＥ、ＢＭ（ＰＥＯ）３、およびＢＭ（ＰＥＯ）４（これらは、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｃｕｓｔｏｍｅｒ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １１７，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ．６１１０５ Ｕ．Ｓ．Ａ，Ｕ．Ｓ．Ａ １−８００−８７４−３７２３，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ＋８１５−９６８−０７４７から市販されている）を意図するが、これらに限定されない。２００３−２００４ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ａｎｄ Ｃａｔａｌｏｇの４６７〜４９８ページを参照のこと。ビス−マレイミド試薬は、連続的または同時の様式で、システイン改変された抗体又は抗体断片のチオール基の、チオール含有薬剤部分、標識、またはリンカー中間体への結合を可能にする。システイン改変された抗体、薬剤部分、標識またはリンカー中間体のチオール基と反応性である、マレイミド以外の他の官能基としては、ヨードアセタミド、ブロモアセタミド、ビニルピリジン、ジスルフィド、ピリジルジスルフィド、イソシアネートおよびイソチオシアネートが挙げられる。
有用なリンカー試薬はまた、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．（Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）のような他の市販の供給源から入手され得るか、または、Ｔｏｋｉら（２００２）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：１８６６−１８７２；Ｗａｌｋｅｒ，Ｍ．Ａ．（１９９５）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６０：５３５２−５３５５；Ｆｒｉｓｃｈら（１９９６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．７：１８０−１８６；米国特許第６２１４３４５号；国際公開第０２／０８８１７２号；米国特許出願公開第２００３１３０１８９号；米国特許出願公開第００３０９６７４３号；国際公開第０３／０２６５７７号；国際公開第０３／０４３５８３号；および国際公開第０４／０３２８２８号に記載される手順に従って合成され得る。
式（ＩＩＩａ）のストレッチャーは、以下のリンカー試薬：
ここで、ｎは１〜１００の範囲の整数であり、Ｔは−Ｈ又は−ＳＯ３Ｎａであり；
ここで、ｎは０〜３の範囲の整数であり；
を、アミノ酸単位のＮ末端と反応させることによって、リンカーへと導入され得る。
ストレッチャーユニットは、以下の二官能性試薬：
を、アミノ酸単位のＮ末端と反応させることによって、リンカーへと導入され得、上記式において、ＸはＢｒまたはＩである。この式のストレッチャー単位はまた、以下の二官能性試薬：
を、アミノ酸単位のＮ末端と反応させることによって、リンカーへと導入され得る。
式（Ｖａ）のストレッチャー単位は、以下の中間体：
を、アミノ酸単位のＮ末端と反応させることによって、リンカーへと導入され得る。
以下に示される式：
のイソチオシアネートストレッチャーは、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，（１９７５）８７（１４），５１７に記載されるようにして、イソチオシアナトカルボン酸クロリドから調製され得、上記式において、−Ｒ１７−は、本明細書中に記載されるとおりである。
マレイミドストレッチャーと、パラ−アミノベンジルカルバモイル（ＰＡＢ）自己犠牲型スペーサーとを有する、例示的なバリン−シトルリン（ｖａｌ−ｃｉｔまたはｖｃ）ジペプチドリンカー試薬は、以下の構造：
を有し、上記構造において、Ｑは、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−ハロゲン、−ニトロまたは−シアノであり；そして、ｍは、０〜４の範囲の整数である。
マレイミドストレッチャーユニットと、ｐ−アミノベンジル自己犠牲型スペーサーユニットとを有する、例示的なｐｈｅ−ｌｙｓ（Ｍｔｒ）ジペプチドリンカー試薬は、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋら（１９９７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，３８：５２５７−６０に従って調製され得、そして、以下の構造：
を有し、上記構造において、Ｍｔｒは、モノ−４−メトキシトリチルであり、Ｑは、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−ハロゲン、−ニトロまたは−シアノであり；そして、ｍは、０〜４の範囲の整数である。
本発明の例示的な抗体−薬剤コンジュゲート化合物としては、以下：
が挙げられ、ここで、Ｖａｌはバリンであり；Ｃｉｔはシトルリンであり；ｐは、１、２、３または４であり；そして、Ａｂは、多重特異性抗体又は抗体アナログである。メイタンシノイド薬剤部分ＤＭ１が、ＢＭＰＥＯリンカーを介して、トラスツズマブのチオール基に連結された他の例示的な抗体薬剤コンジュゲートは、以下の構造：
を有し、上記構造において、Ａｂは抗体であり；ｎは、０、１または２であり；そして、ｐは、１、２、３または４である。
抗体−薬剤コンジュゲートの調製
式ＩのＡＤＣは、当業者に公知の有機化学反応、条件および試薬を用いて、いくつかの経路によって調製され得る：（１）共有結合を介して、抗体−リンカー中間体Ａｂ−Ｌを形成するための、システイン改変された抗体のシステイン基のリンカー試薬との反応、その後の、活性化された薬剤部分Ｄとの反応；および（２）共有結合を介して、薬剤−リンカー中間体Ｄ−Ｌを形成するための、薬剤部分の求核性基のリンカー試薬との反応、その後の、システイン改変された抗体のシステイン基との反応。コンジュゲーションの方法（１）および（２）は、種々のシステイン改変された抗体、薬剤部分およびリンカーを用いて行われ、式Ｉの抗体−薬剤コンジュゲートを調製し得る。
抗体のシステインチオール基は、求核性であり、そして、リンカー試薬および薬剤−リンカー中間体上の求電子性基と反応して共有結合を形成し得る。この求電子性基としては、以下が挙げられる：（ｉ）ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメートおよび酸ハロゲン化物のような活性なエステル；（ｉｉ）アルキル、およびハロアセタミドのようなベンジルハライド；（ｉｉｉ）アルデヒド基、ケトン基、カルボキシル基、およびマレイミド基；ならびに（ｉｖ）スルフィド交換による、ピリジルジスルフィドを含む、ジスルフィド。薬剤部分上の求核性基としては、リンカー部分およびリンカー試薬上の求電子性基と反応して共有結合を形成し得る、アミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、およびアリールヒドラジドを含むが、これらに限定されない。
メイタンシンは、例えば、Ｍａｙ−ＳＳＣＨ３へと変換され得、これは、遊離チオールであるＭａｙ−ＳＨへと還元され、そして、修飾された抗体と反応して（Ｃｈａｒｉら（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２：１２７−１３１）ジスルフィドリンカーと、メイタンシノイド−抗体イムノコンジュゲートを生成し得る。ジスルフィドリンカーを用いた抗体−メイタンシノイドコンジュゲートが報告されている（国際公開第０４／０１６８０１号；米国特許第号６８８４８７４号；米国特許出願公開第２００４／０３９１７６ Ａ１号；国際公開第０３／０６８１４４号；米国特許出願公開第２００４／００１８３８ Ａ１号；米国特許第６４４１１６３号、同第５２０８０２０号、同第５４１６０６４号；国際公開第０１／０２４７６３号）。ジスルフィドリンカーＳＰＰは、リンカー試薬Ｎ−スクシニミジル４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエートを用いて構築される。
特定の条件下では、システイン改変された抗体又は抗体断片は、ＤＴＴ（クリーランド試薬、ジチオスレイトール）またはＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロリド；Ｇｅｔｚら（１９９９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ ２７３：７３−８０；Ｓｏｌｔｅｃ Ｖｅｎｔｕｒｅｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いた処理によって、リンカー試薬とのコンジュゲーションのために反応性にされ得る。ＣＨＯ細胞において発現させた、全長のシステイン改変されたモノクローナル抗体又はＦａｂ（チオＭａｂ；チオＦａｂ）を、約５０倍過剰のＴＣＥＰを用いて３７℃にて３時間還元し、新しく導入されたシステイン残基と、培養培地中に存在するシステインとの間に形成し得る、ジスルフィド結合を還元した。この還元されたチオＭａｂ又はチオＦａｂを希釈して、１０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ５中でＨｉＴｒａｐ Ｓカラムにロードし、そして、０．３Ｍ 塩化ナトリウムを含むＰＢＳで溶出した。ジスルフィド結合を、室温にて、一晩、希（２００ｎＭ）硫酸銅（ＣｕＳＯ４）水溶液を用いて、親のＭａｂ中に存在するシステイン残基間に再度確立させた。当該分野で公知の他の酸化物質、すなわち、酸化剤および酸化条件が使用され得る。周囲の空気の酸化もまた有効である。この、穏やかで、部分的な再酸化段階は、高い忠実度で、効率的に鎖内ジスルフィドを形成する。約１０倍過剰の薬剤−リンカー中間体、例えば、ＢＭ（ＰＥＯ）４−ＤＭ１を加え、混合し、そして、室温にて約１時間静置させて、コンジュゲーション化を行い、抗体−薬剤コンジュゲートを形成する。このコンジュゲーション混合物を、ゲル濾過して、ＨｉＴｒａｐ Ｓカラムにロードし、このカラムを通して溶出して、過剰の薬剤−リンカー中間体と他の不純物とを除去した。
インビトロ細胞増殖アッセイ
一般に、抗体、例えば本発明の多重特異性抗体又は抗体アナログ、又は本発明の抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）の細胞毒性または細胞増殖抑制活性は、レセプタータンパク質（例えば、ＨＥＲ２）を有する哺乳動物細胞を、細胞培養培地中のＡＤＣの抗体に暴露し；約６時間〜約５日間のある期間にわたって細胞を培養し；そして、細胞の生存度を測定することによって測定される。細胞ベースのインビトロアッセイを用いて、本発明の多重特異性抗体、抗体アナログ又はＡＤＣの生存度（増殖）、細胞傷害性、およびアポトーシスの誘導（カスパーゼの活性化）を測定した。
多重特異性抗体、抗体アナログ又はＡＤＣのインビトロ能力を、細胞増殖アッセイによって測定した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙは、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａルシフェラーゼの組換え発現に基づいた市販の（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、均質なアッセイである（米国特許第５５８３０２４号；同第５６７４７１３号および同第５７００６７０号）。この細胞増殖アッセイは、代謝的に活性な細胞の指標である、存在するＡＴＰの定量化に基づいて、培養物中の生細胞の数を決定する（Ｃｒｏｕｃｈら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１６０：８１−８８；米国特許第６６０２６７７号）。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）アッセイは、９６ウェル形式で行い、自動化ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）に適応させた（Ｃｒｅｅら（１９９５）ＡｎｔｉＣａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ ６：３９８−４０４）。均質なアッセイ手順は、単一の試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ）を直接、血清補充培地中で培養した細胞に加える工程を必要とする。細胞の洗浄、培地の除去、および複数回のピペッティングの工程は必要とされない。この系は、試薬を加え、混合してから１０分以内に、３８４ウェルの形式で１５細胞／ウェル程度の数を検出する。これらの細胞は、多重特異性抗体、抗体アナログ又はＡＤＣで継続的に処理され得るか、または、多重特異性抗体、抗体アナログ又はＡＤＣで処理され、そして、抗体又はＡＤＣから分離され得る。一般に、簡単に、すなわち、３時間処理した細胞は、継続的に処理した細胞と同様の効力の作用を示した。
均質な「添加−混合−測定」の形式は、細胞の溶解と、存在するＡＴＰの量に比例する発光シグナルの生成とをもたらす。ＡＴＰの量は、培養物中に存在する細胞の数に直接比例する。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ａｓｓａｙは、使用される細胞の型および培地に依存して、一般には５時間よりも長い半減期を有する、ルシフェラーゼ反応により生成される「グロー型」の発光シグナルを生成する。生細胞は、相対発光単位（ＲＬＵ）に反映される。基質カブトムシルシフェリンは、組換えホタルルシフェラーゼによって酸化的に脱炭酸され、同時にＡＴＰのＡＭＰへの変換を伴い光子を生成する。延長された半減期は、試薬注入器を使用する必要性を排除し、そして、複数のプレートの連続した処理、または、バッチモードの処理のための柔軟性を提供する。この細胞増殖アッセイは、種々のマルチウェル形式（例えば、９６ウェル形式または３８４ウェル形式）で使用され得る。データは、ルミノメーターまたはＣＣＤカメラ撮像装置によって記録され得る。発光の出力は、経時的に測定される相対光単位（ＲＬＵ）として表される。あるいは、発光からの光子が、シンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）の存在下で、シンチレーションカウンターにおいて計数され得る。光単位は、次いで、１秒あたりのＣＰＳカウントとして表され得る。
インビボ投与
本発明の多重特異性抗体、抗体アナログ又は抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）は処置されるべき状態に適した任意の経路で投与され得る。そのような抗体は、典型的には、非経口的に、すなわち、注入、皮下、筋肉内、静脈内、皮内、クモ膜下腔および硬膜外に投与される。
薬学的処方物
本発明の治療用の多重特異性抗体、抗体アナログ又は抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）の薬学的処方物は、代表的に、非経口投与（すなわちボーラス注射、静脈内注射、腫瘍内注射）のために、薬学的に受容可能な非経口ビヒクルと共に、単位投薬注射可能形態で調製される。所望の程度の純度を有する多重特異性抗体、抗体アナログ、抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）は、必要に応じて、薬学的に受容可能な希釈剤、キャリア、賦形剤もしくは安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８０）第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．編）と、凍結乾燥処方物形態もしくは水溶液形態で混合される。
受容可能な希釈剤、担体、賦形剤および安定化剤は、レシピエントに対して、使用される投薬量および濃度において非毒性であり、そして緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液および他の有機酸の緩衝液）；抗酸化剤（アスコルビン酸およびメチオニンを含む）；保存剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコールもしくはベンジルアルコール；メチルパラベンもしくはプロピルパラベンのようなアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリジンのようなアミノ酸；単糖類、二糖類、および他の炭水化物（グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む）；ＥＤＴＡのようなキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールのような糖類；ナトリウムのような塩形成性対イオン；金属複合体（たとえばＺｎ−タンパク質複合体）；および／または非イオン性界面活性剤（例えばＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭもしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。例えば、凍結乾燥化抗ＥｒｂＢ２抗体処方物は、国際公開第９７／０４８０１号に記載され、明白に本明細書中に参考として援用される。
活性な薬学的成分もまた、例えばコアセルベーション技術によるかもしくは界面重合体化により調製されるマイクロカプセル（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース−マイクロカプセルもしくはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）中、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）中、またはマクロエマルジョン中に含まれ得る。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０）において開示される。
徐放性調製物もまた、調製され得る。徐放性調製物の適切な例としては、ＡＤＣを含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、成形された物質の形態（例えば、フィルムもしくはマイクロカプセル）である。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３７７３９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（例えば、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドからなる注射可能ミクロスフェア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
インビボ投与のために使用される処方物は、無菌でなければならず、このことは、濾過滅菌膜を通した濾過によって容易に達成される。
この処方物は、上記の投与経路に適した処方物を含む。この処方物は、単位投薬形態で簡便に提供され得、そして、製薬の分野で周知の任意の方法によって調製され得る。技術および処方物は、一般に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）において見出される。このような方法は、活性成分を１種以上の補助的成分を構成するキャリアと会合させる工程を包含する。一般に、処方物は、活性成分を液体担体もしくは微細に分割した個体担体またはその両方と均一にかつしっかりと（ｉｎｔｉｍａｔｅｌｙ）会合させ、必要な場合、製品を成形することによって、調製される。
本発明の水性懸濁液は、活性物質を、水性懸濁液の製造のために適した賦形剤と混合して含有する。このような賦形剤としては、懸濁化剤（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クロスカルメロース、ポピドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントおよびアラビアゴム）、ならびに分散化剤もしくは湿潤剤（例えば、天然に存在するホスファチド（例えば、レシチン）、アルキレンオキシドと脂肪酸との濃縮産物（例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン）、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの濃縮産物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、エチレンオキシドと脂肪酸および無水ヘキシトールに由来する部分エステルとの濃縮産物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）が挙げられる。水性懸濁液はまた、エチルｐ−ヒドロキシ−ベンゾアートもしくはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシ−ベンゾアートのような１種以上の保存剤、１種以上の着色剤、１種以上の香味添加剤、および１種以上の甘味剤（例えば、ショ糖もしくはサッカリン）を含み得る。
薬学的組成物は、無菌注射可能水性懸濁液もしくは無菌注射可能油性懸濁液のような、無菌注射可能調製物の形態であり得る。この懸濁液は、上述した適切な分散化剤もしくは湿潤剤および懸濁化剤を用いて、公知技術にしたがって処方され得る。無菌注射可能調製物はまた、例えば、１，３−ブタン−ジオール中の溶液のような非毒性非経口受容可能希釈剤もしくは非毒性非経口受容可能溶媒中の無菌注射可能溶液もしくは無菌注射可能懸濁液であってもよく、または凍結乾燥粉末として調製されてもよい。受容可能なビヒクルおよび溶媒の中で、水、リンガー液および等張塩化ナトリウム溶液が使用され得る。さらに、無菌の不揮発性油が、溶媒もしくは懸濁媒体として、従来使用され得る。この目的のために、任意の混合の不揮発性油が使用され得、これらとしては、合成のモノグリセリドもしくはジグリセリドが挙げられる。さらに、脂肪酸（例えばオレイン酸）が、注射可能薬の調製において同様に使用され得る。
担体物質と合わせられて単回投薬形態を形成する活性成分の量は、処置される宿主および投与の特定の様式に依存して変動する。例えば、静脈内注入を意図される水溶液は、約３０ｍＬ／時間の速度での適切な容量の注入が生じ得るために、溶液１ｍｌあたり約３〜５００μｇの活性成分を含有し得る。
非経口投与のために適した処方物は、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬および処方物を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る無菌注射可能水溶液および非水性無菌注射可能溶液、ならびに懸濁化剤および増粘剤を含有し得る水性無菌懸濁液および非水性無菌懸濁液が挙げられる。
タンパク質治療薬の経口投与は、腸における加水分解もしくは変性に起因して好ましくないが、経口投与に適する多重特異性抗体、抗体又はＡＤＣの処方物は、各々所定量の多重特異性抗体、抗体又はＡＤＣを含有するカプセル、カシェ剤もしくは錠剤として、別個の単位で調製され得る。
この処方物は、単位用量容器もしくは多回用量容器（例えば、密閉されたアンプルおよびバイアル）に梱包され得、そして、注射のために、使用直前の無菌液体キャリア（例えば水）の添加のみを必要とする凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ（凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）））状態で保存され得る。即席注射溶液および即席注射懸濁液は、以前に記載した類の無菌の粉末、顆粒および錠剤から調製される。所定の単位投薬処方物は、活性成分の、本明細書中上で挙げたような日用量もしくは単位日下位用量を含むか、または、その適切な一部分を含む。
上で定義したように、少なくとも１種の活性成分を、獣医学用担体と共に含有する獣医学用組成物もしたがってまた提供される。獣医学用担体は、組成物の投与の目的のために有用な物質であり、固体、液体もしくは気体の物質であり得、これらは、獣医学分野で受容可能であるかさもなければ不活性であり、そして活性成分と適合性である。これらの獣医学的組成物は、非経口投与されても、経口投与されても、または任意の他の所望の経路によって投与されてもよい。
治療的使用
本明細書に記載された多重特異性抗体、抗体アナログ及びＡＤＣは治療的適用に用いられ得る。例えば、そのような抗体及び抗体断片及び抗体−薬剤コンジュゲートは、腫瘍（前癌性、非転移性、転移性、悪性腫瘍（例えば、早期癌）を含む）の処置、アレルギー性疾患または炎症性疾患の処置、又は自己免疫疾患の処置、又は癌（例えば、乳癌、大腸癌、肺癌、腎細胞癌、神経膠腫、卵巣癌）、アレルギー性疾患又は炎症性疾患、又は自己免疫疾患を発症するリスクにある被検体の処置のために用いられ得る。
癌なる用語は、前癌性増殖、良性腫瘍及び悪性腫瘍を含む増殖性疾患の集合を包含するが、これらに限定されない。良性腫瘍は発生部位に局在したままで、浸潤、侵入または遠隔部位に転移する能力を持たない。悪性腫瘍はその周囲の他の組織へ侵入し損傷を与える。それらは開始場所から離脱し、通常血液もしくはリンパ節が位置するリンパ系を介して体の別の部位へ拡散する（転移する）能力を獲得することもできる。原発性腫瘍はそれらが生じた組織の型により分類され；転移性腫瘍はその癌が由来した組織型により分類される。時間の経過とともに、悪性腫瘍の細胞はより異常になり、正常細胞のようには見えない。がん細胞の外見の変化は腫瘍悪性度と呼ばれ、癌細胞は、高分化、中分化、分化の乏しい、又は未分化であると説明される。高分化型細胞はかなり正常な外見であり、それが由来する正常細胞に似ている。未分化細胞は非常に異常となりもはやその細胞の起源を究明することが不可能である。
腫瘍は固形腫瘍又は非固形腫瘍又は軟部腫瘍であって良い。軟部腫瘍の例は、白血病（例えば、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、成人急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、成熟Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、前リンパ球性白血病、または有毛細胞白血病）、又はリンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、またはホジキン病）を含む。固形腫瘍は、血液、骨髄、またはリンパ系以外の体組織の任意の癌を含む。固形腫瘍はさらに、上皮細胞由来のものと、非上皮細胞由来のものに分けることができる。上皮細胞の固形腫瘍の例は、消化管、大腸、***、前立腺、肺、腎臓、肝臓、膵臓、卵巣、頭頸部、口腔、胃、十二指腸、小腸、大腸、肛門、胆嚢、唇、鼻咽頭、皮膚、子宮、男性性器、泌尿器、膀胱、および皮膚の腫瘍を含む。非上皮由来の固形腫瘍は肉腫、脳腫瘍、および骨腫瘍を含む。
上皮癌は一般的に良性腫瘍から前浸潤ステージ（上皮内癌など）、基底膜を貫通して上皮下の間質に侵入した悪性癌へと進化する。多重特異性抗体、抗体アナログ、及びＡＤＣもまたこうした治療用途に用いることができ、とりわけＨＥＲ２を結合する抗体は、乳癌、大腸癌、肺癌、腎細胞癌、神経膠腫、または卵巣癌の治療に用いることができる。
本発明の組成物が投与される候補にある他の被検体は、血管結合組織の異常増殖、赤瘡、後天性免疫不全症候群、動脈閉塞、アトピー性角膜炎、細菌性潰瘍、ベーチェット疾患、血液が媒介する腫瘍、頸動脈閉塞性疾患、脈絡叢血管新生、慢性炎症、慢性網膜剥離、慢性ブドウ膜炎、慢性 硝子体炎、コンタクトレンズ疲労、角膜移植片拒絶、角膜血管新生、角膜移植片血管新生、クローン病、イールズ病、流行性角結膜炎、真菌潰瘍、単純ヘルペス感染、帯状ヘルペス感染、過粘稠度症候群、カポシ肉腫、白血病、脂質変性、ライム病、周縁表皮剥離、モーレン潰瘍、ハンセン病以外のマイコバクテリア感染、近視、眼性新生血管疾患、視神経窩、オスラー-ウェーバー症候群(オスラー-ウェーバー-ランデュ)、骨関節炎、パジェット病、毛様体扁平部炎、類天疱瘡、phylectenulosis、多発動脈炎、レーザー後合併症、原生動物の感染、弾性線維性偽性黄色腫、翼状片角膜炎乾燥、放射状角膜切開、網膜血管新生、未熟児の網膜症、水晶体後繊維増殖、類肉腫、強膜炎、鎌状赤血球貧血、シェーグレン症候群、固形腫瘍、シュタルガルト病、スティーブンジョンソン病、上辺縁角膜炎、梅毒、全身狼瘡、テリアン周縁変性、トキソプラズマ症、ユーイング肉腫の腫瘍、神経芽細胞腫の腫瘍、骨肉腫の腫瘍、網膜芽細胞腫の腫瘍、横紋筋肉腫の腫瘍、潰瘍性大腸炎、静脈閉塞、ビタミンＡ欠乏、ヴェゲナー肉芽腫、糖尿病と関係している望ましくない脈管形成、寄生虫病、異常な創傷治癒、手術、損傷又は外傷後の肥大(例えば急性の肺損傷／ＡＲＤＳ)、体毛成長の阻害、***および黄体形成の阻害、移植の阻害および子宮における胚発達の阻害を有するか、又は発症するリスクにある。
アレルギー性疾患または炎症性疾患または自己免疫疾患、または多重特異性抗体、抗体アナログ、ビスＦａｂ、ＡＤＣ、あるいは本明細書で記載された方法により作られた任意の別の抗体を用いて処置される疾患の例として、限定するものではないが、関節炎(関節リウマチ(例えば急性の関節炎、慢性の関節リウマチ、痛風性関節炎、急性の痛風性関節炎、慢性炎症性関節炎、変形性関節症、感染性関節炎、ライム関節炎、増殖性関節炎、乾癬の関節炎、椎骨関節炎及び若年性発症関節リウマチ、骨関節炎、関節炎慢性化、関節炎変形、関節炎慢性原発、反応性関節炎、及び強直性脊椎炎)、炎症性過剰増殖性皮膚病、乾癬、例えばプラーク乾癬、滴状乾癬、膿疱性乾癬及び爪乾癬)、皮膚炎、例として接触皮膚炎、慢性接触皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、ヘルペス状の皮膚炎、貨幣状皮膚炎、脂漏性皮膚炎、非特異的皮膚炎、一次刺激物接触皮膚炎及び過敏性皮膚炎、Ｘ連鎖性過剰ＩｇＭ症候群、蕁麻疹、例えば慢性アレルギー性蕁麻疹及び慢性特発性蕁麻疹、例として慢性自己免疫蕁麻疹、多発性筋炎／皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、中毒性上皮性表皮壊死症、強皮症(全身強皮症を含む)、硬化症、例えば全身性硬化症、多発性硬化症(ＭＳ)、例えば脊椎-眼(spino-optical) ＭＳ)、一次進行性ＭＳ(ＰＰＭＳ)及び再発性寛解ＭＳ(ＲＲＭＳ)、進行性全身性硬化症、アテローム性動脈硬化、動脈硬化症、硬化症汎発、失調性硬化症、炎症性腸疾患(ＩＢＤ)(例えばクローン病、自己免疫性胃腸疾患、大腸炎、例えば潰瘍性大腸炎、大腸性潰瘍、微細な大腸炎、膠原性大腸炎、大腸ポリープ、壊死性全腸炎及び経壁の大腸炎、及び自己免疫炎症性腸疾患)、膿皮症壊疽、結節性紅斑、原発性硬化性胆管炎、上強膜炎、呼吸窮迫症候群、例として成人性又は急性の呼吸窮迫症候群(ＡＲＤＳ)、髄膜炎、葡萄膜の全部又は一部の炎症、虹彩炎、脈絡膜炎、自己免疫血液疾患、リウマチ様脊椎炎、リウマチ様関節滑膜炎、突発性聴力障害、ＩｇＥ媒介性疾患、例えばアナフィラキシー及びアレルギー性鼻炎及びアトピー性鼻炎、脳炎、例えばラスマッセンの脳炎及び辺縁及び／又は脳幹脳炎、ブドウ膜炎、例として、前部ブドウ膜炎、急性前ブドウ膜炎、肉芽腫ブドウ膜炎、非顆粒性ブドウ膜炎、水晶体抗原性ブドウ膜炎、後部ブドウ膜炎又は自己免疫ブドウ膜炎、ネフローゼ症候群を有する又は有さない糸球体腎炎(ＧＮ)、例として、慢性又は急性の糸球体腎炎、例として原発性ＧＮ、免疫性ＧＮ、膜性ＧＮ(膜性ネフロパシ)、特発性膜性ＧＮ又は特発性膜性ネフロパシ、膜又は膜性増殖性ＧＮ(ＭＰＧＮ)(タイプＩ及びタイプＩＩを含む)、急速進行性ＧＮ、アレルギー性症状、アレルギー性反応、湿疹、例としてアレルギー性又はアトピー性湿疹、喘息、例えば喘息気管支炎、気管支喘息及び自己免疫喘息、Ｔ細胞の浸潤を伴う症状及び慢性炎症反応、慢性肺炎症性疾患、自己免疫心筋炎、白血球粘着力欠損、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)又は全身性ループスエリテマトーデス、例えば皮膚ＳＬＥ、亜急性の皮膚ＳＬＥ、新生児期ループス症候群(ＮＬＥ)、紅班性狼瘡汎発、ループス(例としてループス腎炎、ループス脳炎、小児ループス、非腎性ループス、腎外ループス、円板状ループス、脱毛症ループス)、若年性開始型(Ｉ型)真正糖尿病、例として小児インシュリン依存性真正糖尿病(ＩＤＤＭ)、成人発症型真正糖尿病(ＩＩ型糖尿病)、自己免疫性糖尿病、特発性の尿崩症、サイトカイン及びＴリンパ球によって媒介される急性及び遅発性過敏症と関係する免疫応答、結核、サルコイドーシス、肉芽腫症、例としてリンパ腫肉芽腫症、ヴェゲナーの肉芽腫症、無顆粒球症、脈管炎、例として血管炎、大血管性血管炎(例えば大脈管脈管炎(リウマチ性多発性筋痛及び巨細胞(高安)動脈炎を含む)、中脈管脈管炎(川崎病及び結節性多発動脈炎を含む)、微小多発動脈炎、ＣＮＳ脈管炎、壊死性血管炎、皮膚性血管炎又は過敏性血管炎、全身性壊死性血管炎、及びＡＮＣＡ関連の脈管炎、例としてチャーグ-ストラウス脈管炎又は症候群(ＣＳＳ))、側頭動脈炎、無形成性貧血、自己免疫無形成性貧血、クームズ陽性貧血症、ダイアモンドブラックファン貧血症、溶血性貧血又は免疫溶血性貧血、例として自己免疫溶血性貧血(ＡＩＨＡ)、悪性貧血(貧血症悪性熱)、アジソン病、純粋な赤血球貧血症又は形成不全(ＰＲＣＡ)、第VIII因子欠損症、血友病Ａ、自己免疫好中球減少症、汎血球減少症、白血球減少症、白血球血管外遊出を伴う疾患、ＣＮＳ炎症性疾患、多器官損傷症候群、例えば敗血症、外傷又は出血の二次症状、抗原-抗体複合体関連疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット又はベーチェット病、カールスマン症候群、グッドパスチャー症候群、レイノー症候群、シェーグレン症候群、スティーブンスジョンソン症候群、類天疱瘡、例えば水疱性類天ぽうそう及び類天疱瘡皮膚、天疱瘡(尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、ペンフィグス粘液膜類天疱瘡及び天疱瘡エリテマトーデスを含む)、自己免疫多腺性内分泌障害、ライター病又は症候群、免疫複合体腎炎、抗体媒介性腎炎、視神経脊髄炎、多発性神経炎、慢性神経障害、例えばＩｇＭ多発性神経炎又はＩｇＭ媒介性神経障害、血小板減少(例えば心筋梗塞患者によるもの)、例えば血栓性血小板減少性紫斑病(ＴＴＰ)、及び自己免疫性又は免疫媒介性血小板減少、例えば慢性及び急性のＩＴＰを含む特発性血小板減少性紫斑病(ＩＴＰ)、自己免疫性精巣炎及び卵巣炎を含む精巣及び卵巣の自己免疫性疾患、一次甲状腺機能低下症、副甲状腺機能低下症、自己免疫内分泌性疾患、例えば甲状腺炎、例えば自己免疫性甲状腺炎、橋本病、慢性甲状腺炎(橋本甲状腺炎)又は亜急性の甲状腺炎、自己免疫甲状腺性疾患、特発性甲状腺機能低下症、グレーブ病、自己免疫多腺性症候群、例として多腺性症候群(又は、多腺性内分泌障害症候群)、腫瘍随伴症候群、例として神経系新生物関連症候群、例えばランバート-イートン筋無力症症候群又はイートン―ランバート症候群、スティッフマン又はスティッフマン症候群、脳脊髄炎、例として、アレルギー性脳脊髄炎又は脳脊髄炎性アレルギー及び実験的アレルギー性脳脊髄炎(ＥＡＥ)、重症筋無力症、例えば胸腺腫関連の重症筋無力症、小脳性退化、神経ミオトニ、眼球クローヌス又は眼球クローヌス筋硬直症候群(ＯＭＳ)及び感覚系神経障害、多病巣性運動神経障害、シーハン症候群、自己免疫肝炎、慢性肝炎、類狼瘡肝炎、巨細胞肝炎、慢性活動性肝炎又は自己免疫慢性活動性肝炎、リンパ系間隙間質性肺炎(ＬＩＰ)、閉塞性細気管支炎(非移植)対ＮＳＩＰ、ギラン‐バレー症候群、ベルガー病(ＩｇＡネフロパシ)、特発性ＩｇＡネフロパシ、線状ＩｇＡ皮膚病、原発性胆管萎縮症、肺線維症、自己免疫腸疾患症候群、セリアック病、コエリアック病、脂肪便症(グルテン腸疾患)、抵抗性スプルー、特発性スプルー、クリオグロブリン血症、アミロトロフィック側索硬化症(ＡＬＳ；筋萎縮性側索硬化症(Lou Gehrig's disease))、冠状動脈疾患、自己免疫性耳疾患、例として、自己免疫内耳疾患(ＡＩＥＤ)、自己免疫聴力障害、眼球クローヌス筋硬直徴候(ＯＭＳ)、多発性軟骨炎、例として、抵抗性又は再発性多発性軟骨炎、肺胞状蛋白症、アミロイドーシス、強膜炎、非癌性リンパ球増多症、一次リンパ球増多症、これにはモノクローナルＢ細胞リンパ球増多症(例えば良性モノクローナル免疫グロブリン症及び未同定の有意なモノクローナル免疫グロブリン血症(monoclonal gammopathy of undetermined significance)、ＭＧＵＳ)が含まれる、末梢性神経障害、腫瘍随伴症候群、チャネル病、例として、癲癇、片頭痛、不整脈、筋疾患、難聴、盲目、周期性麻痺及びＣＮＳのチャネル病、自閉症、炎症性ミオパシ、局所性分節性糸球体硬化症(ＦＳＧＳ)、内分泌性眼障害、ブドウ膜網膜炎、脈絡網膜炎、自己免疫性肝臓病、線維症、多内分泌性不全、シュミット症候群、副腎炎、胃萎縮、初老期痴呆、脱髄性疾患、例として自己免疫脱髄性病、糖尿病性ネフロパシ、ドレスラー症候群、円形脱毛症、ＣＲＥＳＴ症候群(石灰沈着、レイノー現象、食道運動障害、強指症及び毛細管拡張症)、雌雄自己免疫性不妊性、混合性結合組織病、シャーガス病、リウマチ熱、再発性中絶、農夫肺、多形性紅斑、心切開術後症候群、クッシング症候群、愛鳥家肺、アレルギー性肉芽腫性脈管炎、良性リンパ球血管炎、アルポート症候群、肺胞炎、例えばアレルギー性肺胞炎及び繊維化肺胞炎、間隙肺疾患、輸血反応、ハンセン病、マラリア、リーシュマニア症、キパノソミアシス(kypanosomiasis)、住血吸虫症、蛔虫症、アスペルギルス症、サンプター症候群、カプラン症候群、デング熱、心内膜炎、心内膜心筋線維形成、広汎性間質性肺線維形成、間質性肺線維形成、特発性の肺線維形成、嚢胞性線維症、眼内炎、持久性***性紅斑、胎児赤芽球症、好酸性筋膜炎(eosinophilic faciitis)、シャルマン症候群、フェルティー症候群、フィラリア(flariasis)、毛様体炎、例えば慢性毛様体炎、ヘテロ慢性毛様体炎、虹彩毛様体炎、又はＦｕｃｈの毛様体炎)、ヘーノホ-シェーンライン紫斑病、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)感染、エコーウィルス感染、心筋症、アルツハイマー病、パルボウィルス感染、風疹ウィルス感染、種痘後症候群、先天性風疹感染、エプスタインバーウイルス感染、耳下腺炎、エヴァンの症候群、自己免疫性腺機能不全、シドナム舞踏病、連鎖球菌感染後腎炎、閉塞性血栓性血管炎(thromboangitis ubiterans)、甲状腺中毒症、脊髄癆、脈絡膜炎、巨細胞多発性筋痛、内分泌性眼障害、慢性過敏性肺炎、乾性角結膜炎、流行性角結膜炎、特発性腎臓症候群、微小変化ネフロパシ、良性家族性及び乏血-再灌流障害、網膜自己免疫、関節炎症、気管支炎、慢性閉塞性気道疾患、珪肺症、アフタ、アフタ性口内炎、動脈硬化症疾患、アスペルミオジェネース(aspermiogenese)、自己免疫性溶血、ベック病、クリオグロブリン血症、デュピュイトラン拘縮、水晶体過敏性眼内炎、腸炎アレルギー、結節性紅斑、leprosum、特発性顔麻痺、慢性疲労症候群、リウマチ性熱、ハンマンリッチ病、感覚器性(sensoneural)聴力障害、血色素尿症発作(haemoglobinuria paroxysmatica)、性機能低下、回腸炎領域、白血球減少症、単核細胞増加症感染、横移動脊髄炎、一次特発性の粘液水腫、ネフローゼ、眼炎symphatica、精巣炎肉芽腫症、膵炎、多発性神経根炎急性、膿皮症壊疽、Ｑｕｅｒｖａｉｎ甲状腺炎、後天性脾臓萎縮、抗***抗体による不妊性、非悪性胸腺腫、白斑、ＳＣＩＤ及びエプスタインバーウイルス関連疾患、後天性免疫不全症候群(エイズ)、寄生虫病、例えばLesihmania、毒性ショック症候群、食中毒、Ｔ細胞の浸潤を伴う症状、白血球-粘着力欠損、サイトカイン及びＴリンパ球に媒介される急性及び遅発性過敏症関連免疫応答、白血球血管外遊出を伴う疾患、多器官損傷症候群、抗原-抗体複合体媒介性疾患、抗糸球体基底膜疾患、アレルギー性神経炎、自己免疫多腺性内分泌障害、卵巣炎、原発性粘液水腫、自己免疫萎縮性胃炎、交感性眼炎、リウマチ性疾患、混合性結合組織病、ネフローゼ症候群、膵島炎、多内分泌性不全、末梢性神経障害、自己免疫多腺性症候群Ｉ型、成人発症型特発性副甲状腺機能低下症(ＡＯＩＨ)、完全脱毛症、拡張型心筋症、後天性表皮水疱症(ＥＢＡ)、ヘモクロマトーシス、心筋炎、ネフローゼ症候群、原発性硬化性胆管炎、化膿性又は非化膿性副鼻腔炎、急性又は慢性副鼻腔炎、篩骨、正面、上顎骨又は蝶形骨副鼻腔炎、好酸球性関連疾患、例えば好酸球増加症、肺浸潤好酸球増加症、好酸球増加症-筋肉痛症候群、レフラー症候群、慢性好酸性肺炎、熱帯肺好酸球増加症、気管支肺炎アスペルギルス症、アスペルギローム又は好酸球性を含有する肉芽腫、アナフィラキシー、血清陰性脊椎関節炎疹、多内分泌性自己免疫性疾患、硬化性胆管炎、強膜、上強膜、慢性皮膚粘膜カンジダ症、ブラットン症候群、乳児期の一過性低ガンマグロブリン血症、ウィスコット‐アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調症候群、膠原病と関係する自己免疫疾患、リウマチ、神経病学的疾患、虚血性再灌流障害、血圧応答の減退、血管機能不全、antgiectasis、組織損傷、心血管乏血、痛覚過敏、脳虚血、及び脈管化を伴う疾患、アレルギー性過敏症疾患、糸
球体腎炎、再灌流障害、心筋又は他の組織の再灌流損傷、急性炎症性成分を有する皮膚病、急性化膿性髄膜炎又は他の中枢神経系炎症性疾患、眼性及び眼窩の炎症性疾患、顆粒球輸血関連症候群、サイトカイン誘発性毒性、急性重症炎症、慢性難治性炎症、腎盂炎、肺線維症、糖尿病性網膜症、糖尿病性大動脈疾患、動脈内過形成、消化性潰瘍、弁膜炎、及び子宮内膜症などがある。
治療用途に加えて、本発明の抗体は、本明細書に記載の疾患及び症状の診断方法などの診断方法を含む、他の目的のために使用することができる。
併用療法
本発明の多重特異性抗体、抗体アナログ、又は抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）は、例えば抗癌特性を有する第２化合物との、薬学的な併用処方物または併用療法としての投薬レジメンにおいて組み合わされ得る。その薬学的な併用処方物または投薬レジメンの第２化合物は、好ましくは、組み合わせのＡＤＣに対して補完的な活性を有するものであり、それらが互いに悪影響を及ぼさないものである。
第２化合物は、化学療法剤、細胞傷害剤、サイトカイン、成長阻害剤、抗ホルモン剤および／または心臓保護剤(cardioprotectant)であり得る。そのような分子は、意図される目的のために有効な量で適切に組み合わされる。本発明の多重特異性抗体、抗体アナログ、又はＡＤＣを含む薬学的組成物はまた、治療有効量の化学療法剤（例えば、チューブリン形成インヒビター、トポイソメラーゼインヒビター、またはＤＮＡ結合剤）も有し得る。
他の治療レジメンは、抗癌剤の投与と併用され得る。併用療法は、同時または連続的なレジメンとして行われ得る。連続的に投与されるとき、その併用物は、２回以上の投与において投与され得る。その併用投与としては、別個の処方物または単一の薬学的処方物を用いる同時投与、およびいずれかの順序での継続的な投与が挙げられ、ここで、好ましくは、両方（またはすべて）の活性な薬剤が、それらの生物学的活性を同時に発揮する時間がある。
１つの実施態様において、多重特異性抗体、抗体アナログ又はＡＤＣによる処置は、本明細書に同定された抗癌剤及び１つ以上の化学療法剤又は成長阻害剤との併用投与（異なる化学療法剤のカクテルの同時投与を含む）を包む。化学療法剤は、タキサン（例えば、パクリタキセル及びドセタキセル）及び／又はアントラサイクリン系抗生物質を含む。そのような化学療法剤の調製および投薬スケジュールは、製造者の指示に従って、または当業者によって経験的に決定されるように使用され得る。そのような化学療法に対する調製および投薬スケジュールは、Chemotherapy Service”, (1992) Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Mdにも記載されている。
多重特異性抗体、抗体アナログ又はＡＤＣは、抗ホルモン化合物；例えば、タモキシフェンなどの抗エストロゲン化合物；オナプリストン(onapristone)（欧州特許第６１６８１２号）などの抗プロゲステロン；またはフルタミドなどの抗アンドロゲンと、そのような分子に対して公知の投薬量で、併用され得る。処置される癌が、ホルモンと無関係の癌である場合、患者は、予め抗ホルモン治療に供されることがあり、癌がホルモンと無関係になったあと、抗体又はＡＤＣ（および必要に応じて、本明細書中に記載されるような他の薬剤）が、その患者に投与され得る。その患者に、心臓保護剤（その治療に関連する心筋の機能不全を予防するためまたは減少させるために）または１つ以上のサイトカインを同時投与することも有益であり得る。上記の治療レジメンに加えて、患者は、癌細胞の外科的除去および／または放射線治療に供されることがある。
上記の同時投与される薬剤のいずれかに対する適当な投薬量は、現在使用されている量であり、新しく同定された薬剤および他の化学療法剤または処置の併用作用（相乗作用）に起因して、減少され得る。
併用療法は、「相乗作用」をもたらし得、「相乗的な」効果、すなわち、一緒に使用される活性成分がそれらの化合物を別々に使用して生じる効果の合計よりも大きいときに達成される効果を証明し得る。活性成分が：（１）組み合された単位投薬量の処方物で同時に製剤化されて、投与されるか、もしくは同時に送達されるか；（２）交互に、もしくは別個の処方物として平行して、送達されるか；または（３）いくつかの他のレジメンによるものであるとき、相乗効果が達成され得る。交互療法で送達されるとき、相乗効果は、それらの化合物が、例えば、別個の注射器における異なる注射によって、連続的に投与されるか、または送達されるときに、達成され得る。通常、交互療法においては、有効な投薬量の各活性成分は、連続的に、すなわち、一続きで投与されるのに対し、併用療法では、有効な投薬量の２つ以上の活性成分が、一緒に投与される。
所定の例示的な標的分子
本発明の多重特異性抗体及び抗体アナログにより標的にされ得る分子の例は、水溶性の血清タンパク質およびそれらのレセプター及び他の膜結合タンパク質（例えば、アドヘシン）を含むが、これらに限定されない。
他の実施態様において、本発明の抗体アナログは１つのサイトカイン、サイトカイン関連タンパク質、及びサイトカインレセプターを結合することが可能であり、本発明の多重特異性抗体は１つ、２つ又は３つのサイトカイン、サイトカイン関連タンパク質、及びサイトカインレセプターを結合することが可能であり、サイトカイン、サイトカイン関連タンパク質、及びサイトカインレセプターは以下から選択される：ＢＭＰｌ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３Ｂ（ＧＤＦｌＯ）、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ８、ＣＳＦｌ（Ｍ−ＣＳＦ）、ＣＳＦ２（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＣＳＦ３（Ｇ−ＣＳＦ）、ＥＰＯ、ＦＧＦｌ（ａＦＧＦ）、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ３（ｉｎｔ−２）、ＦＧＦ４（ＨＳＴ）、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６（ＨＳＴ−２）、ＦＧＦ７（ＫＧＦ）、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１２Ｂ、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２３、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＩＦＮＡｌ、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＢｌ、ＩＦＮＧ、ＩＦＮＷｌ、ＦＥＬｌ、ＦＥＬｌ（ＥＰＳＥＬＯＮ）、ＦＥＬｌ（ＺＥＴＡ）、ＩＬｌＡ、ＩＬｌＢ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬＩｌ、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１７Ｂ、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２４、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８Ａ、ＩＬ２８Ｂ、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢ３、ＬＴＡ（ＴＮＦ−ｂ）、ＬＴＢ、ＴＮＦ（ＴＮＦ−ａ）、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬ）、ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０リガンド）、ＴＮＦＳＦ９（４−１ＢＢリガンド）、ＴＮＦＳＦｌ０（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦＳＦ１ｌ（ＴＲＡＮＣＥ）、ＴＮＦＳＦ１２（ＡＰＯ３Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１３（Ａｐｒｉｌ）、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４（ＨＶＥＭ−Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＩ）、ＴＮＦＳＦ１８、ＨＧＦ（ＶＥＧＦＤ）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＩＬｌＲ１、ＩＬ１Ｒ２、ＩＬ１ＲＬ１、ＬＬ１ＲＬ２、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ８ＲＡ、ＩＬ８ＲＢ、ＩＬ９Ｒ、ＩＬｌ０ＲＡ、ＩＬｌ０ＲＢ、ＩＬ１ｌＲＡ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１２ＲＢ２、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ１７Ｒ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２２Ｒ、ＩＬ１ＨＹ１、ＩＬｌＲＡＰ、ＩＬ１ＲＡＰＬ１、ＩＬ１ＲＡＰＬ２、ＩＬｌＲＮ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ１８ＢＰ、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＩＬ２２ＲＡ２、ＡＩＦｌ、ＨＧＦ、ＬＥＰ（レプチン）、ＰＴＮ、及びＴＨＰＯ。
その他の実施態様において、標的分子は、ケモカイン、ケモカインレセプター、又はケモカイン関連タンパク質であり、ケモカイン、ケモカインレセプター、又はケモカイン関連タンパク質は以下から選択される：ＣＣＬｌ（Ｉ−３０９）、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１／ＭＣＡＦ）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−Ｉａ）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ−Ｉｂ）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ７（ＭＣＰ−３）、ＣＣＬ８（ｍｃｐ−２）、ＣＣＬＨ（エオタキシン（ｅｏｔａｘｉｎ））、ＣＣＬ１３（ＭＣＰ−４）、ＣＣＬ１５（ＭＩＰ−Ｉｄ）、ＣＣＬ１６（ＨＣＣ−４）、ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）、ＣＣＬ１８（ＰＡＲＣ）、ＣＣＬ１９（ＭＤＰ−３ｂ）、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ−３ａ）、ＣＣＬ２１（ＳＬＣ／エクソダス（ｅｘｏｄｕｓ）−２）、ＣＣＬ２２（ＭＤＣ／ＳＴＣ−Ｉ）、ＣＣＬ２３（ＭＰＩＦ−Ｉ）、ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ−２／エオタキシン−２）、ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫ）、ＣＣＬ２６（エオタキシン−３）、ＣＣＬ２７（ＣＴＡＣＫ／ＩＬＣ）、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬｌ（ＧＲＯｌ）、ＣＸＣＬ２（ＧＲＯ２）、ＣＸＣＬ３（ＧＲ０３）、ＣＸＣＬ５（ＥＮＡ−７８）、ＣＸＣＬ６（ＧＣＰ−２）、ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＬｌＯ（ＩＰ１０）、ＣＸＣＬＩｌ（Ｉ−ＴＡＣ）、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦｌ）、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１６、ＰＦ４（ＣＸＣＬ４）、ＰＰＢＰ（ＣＸＣＬ７）、ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤｌ）、ＳＣＹＥｌ、ＸＣＬｌ（リンホタクチン（ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎ））、ＸＣＬ２（ＳＣＭ−Ｉｂ）、ＢＬＲｌ（ＭＤＲ１５）、ＣＣＢＰ２（Ｄ６／ＪＡＢ６１）、ＣＣＲｌ（ＣＫＲｌ／ＨＭ１４５）、ＣＣＲ２（ｍｃｐ−ｌＲＢ／ＲＡ）、ＣＣＲ３（ＣＫＲ３／ＣＭＫＢＲ３）、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５（ＣＭＫＢＲ５／ＣｈｅｍＲ１３）、ＣＣＲ６（ＣＭＫＢＲ６／ＣＫＲ−Ｌ３／ＳＴＲＬ２２／ＤＲＹ６）、ＣＣＲ７（ＣＫＲ７／ＥＢＩｌ）、ＣＣＲ８（ＣＭＫＢＲ８／ＴＥＲｌ／ＣＫＲ−Ｌｌ）、ＣＣＲ９（ＧＰＲ−９−６）、ＣＣＲＬｌ（ＶＳＨＫｌ）、ＣＣＲＬ２（Ｌ−ＣＣＲ）、ＸＣＲｌ（ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲｌ）、ＣＭＫＬＲｌ、ＣＭＫＯＲｌ（ＲＤＣｌ）、ＣＸ３ＣＲ１（Ｖ２８）、ＣＸＣＲ４、ＧＰＲ２（ＣＣＲｌＯ）、ＧＰＲ３１、ＧＰＲ８１（ＦＫＳＧ８０）、ＣＸＣＲ３（ＧＰＲ９／ＣＫＲ−Ｌ２）、ＣＸＣＲ６（ＴＹＭＳＴＲ／ＳＴＲＬ３３／ボンゾ（Ｂｏｎｚｏ））、ＨＭ７４、ＩＬ８ＲＡ（ＩＬ８Ｒａ）、ＩＬ８ＲＢ（ＩＬ８Ｒｂ）、ＬＴＢ４Ｒ（ＧＰＲ１６）、ＴＣＰｌＯ、ＣＫＬＦＳＦ２、ＣＫＬＦＳＦ３、ＣＫＬＦＳＦ４、ＣＫＬＦＳＦ５、ＣＫＬＦＳＦ６、ＣＫＬＦＳＦ７、ＣＫＬＦＳＦ８、ＢＤＮＦ、Ｃ５Ｒ１、ＣＳＦ３、ＧＲＣＣｌＯ（ＣｌＯ）、ＥＰＯ、ＦＹ（ＤＡＲＣ）、ＧＤＦ５、ＨＤＦｌＡ、ＤＬ８、ＰＲＬ、ＲＧＳ３、ＲＧＳ１３、ＳＤＦ２、ＳＬＩＴ２、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＲＥＭｌ、ＴＲＥＭ２、及びＶＨＬ。
他の実施態様において、本発明の抗体アナログは１つの標的を結合することが可能であり、本発明の多重特異性抗体は１つ以上の標的を結合することが可能であり、該標的は以下から選択される：ＡＢＣＦｌ；ＡＣＶＲｌ；ＡＣＶＲｌＢ；ＡＣＶＲ２；ＡＣＶＲ２Ｂ；ＡＣＶＲＬｌ；ＡＤ０ＲＡ２Ａ；Ａｇｇｒｅｃａｎ；ＡＧＲ２；ＡＩＣＤＡ；ＡＩＦｌ；ＡＩＧｌ；ＡＫＡＰｌ；ＡＫＡＰ２；ＡＭＨ；ＡＭＨＲ２；ＡＮＧＰＴｌ；ＡＮＧＰＴ２；ＡＮＧＰＴＬ３；ＡＮＧＰＴＬ４；ＡＮＰＥＰ；ＡＰＣ；ＡＰＯＣｌ；ＡＲ；ＡＺＧＰｌ（亜鉛−ａ−糖タンパク質）；Ｂ７．１；Ｂ７．２；ＢＡＤ；ＢＡＦＦ（ＢＬｙｓ）；ＢＡＧｌ；ＢＡＩｌ；ＢＣＬ２；ＢＣＬ６；ＢＤＮＦ；ＢＬＮＫ；ＢＬＲｌ（ＭＤＲ１５）；ＢＭＰｌ；ＢＭＰ２；ＢＭＰ３Ｂ（ＧＤＦｌＯ）；ＢＭＰ４；ＢＭＰ６；ＢＭＰ８；ＢＭＰＲｌＡ；ＢＭＰＲｌＢ；ＢＭＰＲ２；ＢＰＡＧｌ（プレクチン（ｐｌｅｃｔｉｎ））；ＢＲ３；ＢＲＣＡｌ；Ｃ１９ｏｒｆｌＯ（ＩＬ２７ｗ）；Ｃ３；Ｃ４Ａ；Ｃ５；Ｃ５Ｒ１；ＣＡＮＴｌ；ＣＡＳＰ１；ＣＡＳＰ４；ＣＡＶｌ；ＣＣＢＰ２（Ｄ６／ＪＡＢ６１）；ＣＣＬｌ（１−３０９）；ＣＣＬＩｌ（エオタキシン）；ＣＣＬ１３（ＭＣＰ−４）；ＣＣＬ１５（ＭＩＰ−Ｉｄ）；ＣＣＬ１６（ＨＣＣ−４）；ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）；ＣＣＬ１８（ＰＡＲＣ）；ＣＣＬ１９（ＭＩＰ−３ｂ）；ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）；ＭＣＡＦ；ＣＣＬ２０（ＭＩＰ−３ａ）；ＣＣＬ２１（ＭＴＰ−２）；ＳＬＣ；エクソダス−２；ＣＣＬ２２（ＭＤＣ／ＳＴＣ−Ｉ）；ＣＣＬ２３（ＭＰＩＦ−１）；ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ−２／エオタキシン−２）；ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫ）；ＣＣＬ２６（エオタキシン−３）；ＣＣＬ２７（ＣＴＡＣＫ／ＩＬＣ）；ＣＣＬ２８；ＣＣＬ３（ＭＴＰ−Ｉａ）；ＣＣＬ４（ＭＤＰ−Ｉｂ）；ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）；ＣＣＬ７（ＭＣＰ−３）；ＣＣＬ８（ｍｃｐ−２）；ＣＣＮＡｌ；ＣＣＮＡ２；ＣＣＮＤｌ；ＣＣＮＥｌ；ＣＣＮＥ２；ＣＣＲｌ（ＣＫＲｌ／ＨＭ１４５）；ＣＣＲ２（ｍｃｐ−ｌＲＢ／ＲＡ）；ＣＣＲ３（ＣＫＲ３／ＣＭＫＢＲ３）；ＣＣＲ４；ＣＣＲ５（ＣＭＫＢＲ５／ＣｈｅｍＲ１３）；ＣＣＲ６（ＣＭＫＢＲ６／ＣＫＲ−Ｌ３／ＳＴＲＬ２２／ＤＲＹ６）；ＣＣＲ７（ＣＫＲ７／ＥＢＩｌ）；ＣＣＲ８（ＣＭＫＢＲ８／ＴＥＲｌ／ＣＫＲ−Ｌｌ）；ＣＣＲ９（ＧＰＲ−９−６）；ＣＣＲＬｌ（ＶＳＨＫｌ）；ＣＣＲＬ２（Ｌ−ＣＣＲ）；ＣＤ１６４；ＣＤ１９；ＣＤｌＣ；ＣＤ２０；ＣＤ１８０（ＲＰ１０５）；ＣＤ２００；ＣＤ３０７（ＦｃＲＨ５）；ＣＤ２２；ＣＤ２４；ＣＤ２８；ＣＤ３；ＣＤ３７；ＣＤ３８；ＣＤ３Ｅ；ＣＤ３Ｇ；ＣＤ３Ｚ；ＣＤ４；ＣＤ４０；ＣＤ４０Ｌ；ＣＤ４４；ＣＤ４５ＲＢ；ＣＤ５２；ＣＤ６９；ＣＤ７２；ＣＤ７４；ＣＤ７９Ａ；ＣＤ７９Ｂ；ＣＤ８；ＣＤ８０；ＣＤ８１；ＣＤ８３；ＣＤ８６；ＣＤＨｌ（Ｅ−カドヘリン（ｃａｄｈｅｒｉｎ））；ＣＤＨ１０；ＣＤＨ１２；ＣＤＨ１３；ＣＤＨ１８；ＣＤＨ１９；ＣＤＨ２０；ＣＤＨ５；ＣＤＨ７；ＣＤＨ８；ＣＤＨ９；ＣＤＫ２；ＣＤＫ３；ＣＤＫ４；ＣＤＫ５；ＣＤＫ６；ＣＤＫ７；ＣＤＫ９；ＣＤＫＮｌＡ（ｐ２１Ｗａｐｌ／Ｃｉｐｌ）；ＣＤＫＮｌＢ（ｐ２７Ｋｉｐｌ）；ＣＤＫＮｌＣ；ＣＤＫＮ２Ａ（Ｐ１６ＩＮＫ４ａ）；ＣＤＫＮ２Ｂ；ＣＤＫＮ２Ｃ；ＣＤＫＮ３；ＣＥＢＰＢ；ＣＥＲｌ；ＣＨＧＡ；ＣＨＧＢ；キチナーゼ（Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ）；ＣＨＳＴ１０；ＣＫＬＦＳＦ２；ＣＫＬＦＳＦ３；ＣＫＬＦＳＦ４；ＣＫＬＦＳＦ５；ＣＫＬＦＳＦ６；ＣＫＬＦＳＦ７；ＣＫＬＦＳＦ８；ＣＬＤＮ３；ＣＬＤＮ７（クローディン（ｃｌａｕｄｉｎ）−７）；ＣＬＮ３；ＣＬＵ（クラスタリン（ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ））；ＣＭＫＬＲｌ；ＣＭＫＯＲｌ（ＲＤＣｌ）；ＣＮＲｌ；ＣＯＬ１８Ａ１；ＣＯＬｌＡｌ；ＣＯＬ４Ａ３；ＣＯＬ６Ａ１；ＣＲ２；ＣＲＰ；ＣＳＦｌ（Ｍ−ＣＳＦ）；ＣＳＦ２（ＧＭ−ＣＳＦ）；ＣＳＦ３（ＧＣＳＦ）；ＣＴＬＡ４；ＣＴＮＮＢｌ（ｂ−カテニン（ｃａｔｅｎｉｎ））；ＣＴＳＢ（カテプシン（ｃａｔｈｅｐｓｉｎ）Ｂ）；ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤｌ）；ＣＸ３ＣＲ１（Ｖ２８）；ＣＸＣＬｌ（ＧＲＯｌ）；ＣＸＣＬ１０（ＩＰ−１０）；ＣＸＣＬＩｌ（Ｉ−ＴＡＣ／ＩＰ−９）；ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦｌ）；ＣＸＣＬ１３；ＣＸＣＬ１４；ＣＸＣＬ１６；ＣＸＣＬ２（ＧＲＯ２）；ＣＸＣＬ３（ＧＲＯ３）；ＣＸＣＬ５（ＥＮＡ−７８／ＬＩＸ）；ＣＸＣＬ６（ＧＣＰ−２）；ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）；ＣＸＣＲ３（ＧＰＲ９／ＣＫＲ−Ｌ２）；ＣＸＣＲ４；ＣＸＣＲ６（ＴＹＭＳＴＲ／ＳＴＲＬ３３／ボンゾ（Ｂｏｎｚｏ））；ＣＹＢ５；ＣＹＣｌ；ＣＹＳＬＴＲｌ；ＤＡＢ２ＩＰ；ＤＥＳ；ＤＫＦＺｐ４５１Ｊ０１１８；ＤＮＣＬｌ；ＤＰＰ４；Ｅ２Ｆ１；ＥＣＧＦｌ；ＥＤＧｌ；ＥＦＮＡｌ；ＥＦＮＡ３；ＥＦＮＢ２；ＥＧＦ；ＥＧＦＲ；ＥＬＡＣ２；ＥＮＧ；ＥＮＯ１；ＥＮＯ２；ＥＮＯ３；ＥＰＨＢ４；ＥＰＯ；ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ−２）；ＥＲＥＧ；ＥＲＫ８；ＥＳＲｌ；ＥＳＲ２；Ｆ３（ＴＦ）；ＦＡＤＤ；ＦａｓＬ；ＦＡＳＮ；ＦＣＥＲｌＡ；ＦＣＥＲ２；ＦＣＧＲ３Ａ；ＦｃＲＨ１；ＦｃＲＨ２；ＦＣＲＬ４；ＦＧＦ；ＦＧＦｌ（ａＦＧＦ）；ＦＧＦ１０；ＦＧＦ１１；ＦＧＦ１２；ＦＧＦ１２Ｂ；ＦＧＦ１３；ＦＧＦ１４；ＦＧＦ１６；ＦＧＦ１７；ＦＧＦ１８；ＦＧＦ１９；ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）；ＦＧＦ２０；ＦＧＦ２１；ＦＧＦ２２；ＦＧＦ２３；ＦＧＦ３（ｉｎｔ−２）；ＦＧＦ４（ＨＳＴ）；ＦＧＦ５；ＦＧＦ６（ＨＳＴ−２）；ＦＧＦ７（ＫＧＦ）；ＦＧＦ８；ＦＧＦ９；ＦＧＦＲ３；ＦＩＧＦ（ＶＥＧＦＤ）；ＦＥＬｌ（ＥＰＳＩＬＯＮ）；ＦＩＬｌ（ＺＥＴＡ）；ＦＬＪ１２５８４；ＦＬＪ２５５３０；ＦＬＲＴｌ（フィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ））；ＦＬＴｌ；ＦＯＳ；ＦＯＳＬｌ（ＦＲＡ−Ｉ）；ＦＹ（ＤＡＲＣ）；ＧＡＢＲＰ（ＧＡＢＡａ）；ＧＡＧＥＢｌ；ＧＡＧＥＣｌ；ＧＡＬＮＡＣ４Ｓ−６ＳＴ；ＧＡＴＡ３；ＧＤＦ５；ＧＦＩ１；ＧＧＴ１；ＧＭ−ＣＳＦ；ＧＮＡＳｌ；ＧＮＲＨｌ；ＧＰＲ２（ＣＣＲｌＯ）；ＧＰＲ３１；ＧＰＲ４４；ＧＰＲ８１（ＦＫＳＧ８０）；ＧＲＣＣｌＯ（ＣｌＯ）；ＧＲＰ；ＧＳＮ（ゲルゾリン（Ｇｅｌｓｏｌｉｎ））；ＧＳＴＰｌ；ＨＡＶＣＲ２；ＨＤＡＣ４；ＨＤＡＣ５；ＨＤＡＣ７Ａ；ＨＤＡＣ９；ＨＧＦ；ＨＩＦｌＡ；ＨＤＰｌ；ヒスタミン及びヒスタミンレセプター；ＨＬＡ−Ａ；ＨＬＡ−ＤＯＢ；ＨＬＡ−ＤＲＡ；ＨＭ７４；ＨＭＯＸｌ；ＨＵＭＣＹＴ２Ａ；ＩＣＥＢＥＲＧ；ＩＣＯＳＬ；ＩＤ２；ＩＦＮ−ａ；ＩＦＮＡｌ；ＩＦＮＡ２；ＩＦＮＡ４；ＩＦＮＡ５；ＩＦＮＡ６；ＩＦＮＡ７；ＩＦＮＢ１；ＩＦＮガンマ；ＤＦＮＷｌ；ＩＧＢＰｌ；ＩＧＦｌ；ＩＧＦｌＲ；ＩＧＦ２；ＩＧＦＢＰ２；ＩＧＦＢＰ３；ＩＧＦＢＰ６；ＩＬ−Ｉ；ＩＬ１０；ＩＬ１０ＲＡ；ＩＬ１０ＲＢ；ＩＬ１１；ＩＬ１１ＲＡ；ＩＬ−１２；ＩＬ１２Ａ；ＩＬ１２Ｂ；ＩＬ１２ＲＢ１；ＩＬ１２ＲＢ２；ＩＬ１３；ＩＬ１３ＲＡ１；ＩＬ１３ＲＡ２；ＩＬ１４；ＩＬ１５；ＩＬ１５ＲＡ；ＩＬ１６；ＩＬ１７；ＩＬ１７Ｂ；ＩＬ１７Ｃ；ＩＬ１７Ｒ；ＩＬ１８；ＩＬ１８ＢＰ；ＩＬ１８Ｒ１；ＩＬ１８ＲＡＰ；ＩＬ１９；ＩＬ１Ａ；ＩＬ１Ｂ；ＩＬｌＦ１０；ＩＬ１Ｆ５；ＩＬ１Ｆ６；ＩＬ１Ｆ７；ＩＬ１Ｆ８；ＩＬ１Ｆ９；ＩＬ１ＨＹｌ；ＩＬ１Ｒｌ；ＩＬ１Ｒ２；ＩＬ１ＲＡＰ；ＩＬ１ＲＡＰＬ１；ＩＬ１ＲＡＰＬ２；ＩＬ１ＲＬ１；ＩＬ１ＲＬ２、ＩＬｌＲＮ；ＩＬ２；ＩＬ２０；ＩＬ２０ＲＡ；ＩＬ２１Ｒ；ＩＬ２２；ＩＬ２２Ｒ；ＩＬ２２ＲＡ２；ＩＬ２３；ＩＬ２４；ＩＬ２５；ＩＬ２６；ＩＬ２７；ＩＬ２８Ａ；ＩＬ２８Ｂ；ＩＬ２９；ＩＬ２ＲＡ；ＩＬ２ＲＢ；ＩＬ２ＲＧ；ＩＬ３；ＩＬ３０；ＩＬ３ＲＡ；ＩＬ４；ＩＬ４Ｒ；ＩＬ５；ＩＬ５ＲＡ；ＩＬ６；ＩＬ６Ｒ；ＩＬ６ＳＴ（糖タンパク質１３０）；ＥＬ７；ＥＬ７Ｒ；ＥＬ８；ＩＬ８ＲＡ；ＤＬ８ＲＢ；ＩＬ８ＲＢ；ＤＬ９；ＤＬ９Ｒ；ＤＬＫ；ＩＮＨＡ；ＩＮＨＢＡ；ＩＮＳＬ３；ＩＮＳＬ４；ＩＲＡＫＩ；ＥＲＡＫ２；ＩＴＧＡｌ；ＩＴＧＡ２；ＩＴＧＡ３；ＩＴＧＡ６（ａ６インテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎ））；ＩＴＧＡＶ；ＩＴＧＢ３；ＩＴＧＢ４（ｂ４インテグリン）；ＪＡＧｌ；ＪＡＫｌ；ＪＡＫ３；ＪＵＮ；Ｋ６ＨＦ；ＫＡＩｌ；ＫＤＲ；ＫＩＴＬＧ；ＫＬＦ５（ＧＣＢｏｘＢＰ）；ＫＬＦ６；ＫＬＫｌＯ；ＫＬＫ１２；ＫＬＫ１３；ＫＬＫ１４；ＫＬＫ１５；ＫＬＫ３；ＫＬＫ４；ＫＬＫ５；ＫＬＫ６；ＫＬＫ９；ＫＲＴ１；ＫＲＴ１９（ケラチン（Ｋｅｒａｔｉｎ）１９）；ＫＲＴ２Ａ；ＫＨＴＨＢ６（毛髪固有Ｈ型ケラチン）；ＬＡＭＡＳ；ＬＥＰ（レプチン）；Ｌｉｎｇｏ−ｐ７５；Ｌｉｎｇｏ−Ｔｒｏｙ；ＬＰＳ；ＬＴＡ（ＴＮＦ−ｂ）；ＬＴＢ；ＬＴＢ４Ｒ（ＧＰＲ１６）；ＬＴＢ４Ｒ２；ＬＴＢＲ；ＭＡＣＭＡＲＣＫＳ；ＭＡＧｏｒＯｍｇｐ；ＭＡＰ２Ｋ７（ｃ−Ｊｕｎ）；ＭＤＫ；ＭＩＢｌ；ミッドカイン（ｍｉｄｋｉｎｅ）；ＭＥＦ；ＭＩＰ−２；ＭＫＩ６７；（Ｋｉ−６７）；ＭＭＰ２；ＭＭＰ９；ＭＳ４Ａ１；ＭＳＭＢ；ＭＴ３（メタロチオネクチン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｃｔｉｎ）−ＩＩＩ）；ＭＴＳＳｌ；ＭＵＣｌ（ムチン（ｍｕｃｉｎ））；ＭＹＣ；ＭＹＤ８８；ＮＡＧ１４；ＮＣＫ２；ニューロカン（ｎｅｕｒｏｃａｎ）；ＮＦＫＢｌ；ＮＦＫＢ２；ＮＧＦＢ（ＮＧＦ）；ＮＧＦＲ；ＮｇＲ−Ｌｉｎｇｏ；ＮｇＲ−Ｎｏｇｏ６６（Ｎｏｇｏ）；ＮｇＲ−ｐ７５；ＮｇＲ−Ｔｒｏｙ；ＮＭＥｌ（ＮＭ２３Ａ）；Ｎ０Ｘ５；ＮＰＰＢ；ＮＲＯＢｌ；ＮＲ０Ｂ２；ＮＲｌＤｌ；ＮＲ１Ｄ２；ＮＲ１Ｈ２；ＮＲ１Ｈ３；ＮＲ１Ｈ４；ＮＲ１Ｉ２；ＮＲ１Ｉ３；ＮＲ２Ｃ１；ＮＲ２Ｃ２；ＮＲ２Ｅ１；ＮＲ２Ｅ３；ＮＲ２Ｆ１；ＮＲ２Ｆ２；ＮＲ２Ｆ６；ＮＲ３Ｃ１；ＮＲ３Ｃ２；ＮＲ４Ａ１；ＮＲ４Ａ２；ＮＲ４Ａ３；ＮＲ５Ａ１；ＮＲ５Ａ２；ＮＲ６Ａ１；ＮＲＰｌ；ＮＲＰ２；ＮＴ５Ｅ；ＮＴＮ４；ＯＤＺｌ；ＯＰＲＤｌ；Ｐ２ＲＸ５；Ｐ２ＲＸ７；ＰＡＰ；ＰＡＲＴｌ；ＰＡＴＥ；ＰＡＷＲ；ＰＣＡ３；ＰＣＮＡ；ＰＤＧＦＡ；ＰＤＧＦＢ；ＰＥＣＡＭｌ；ＰＦ４（ＣＸＣＬ４）；ＰＧＦ；ＰＧＲ；ｐｈｏｓｐｈａｃａｎ；ＰＩＡＳ２；ＰＩＫ３ＣＧ；ＰＬＡＵ（ｕＰＡ）；ＰＬＧ；ＰＬＸＤＣｌ；ＰＰＢＰ（ＣＸＣＬ７）；ＰＰＩＤ；ＰＲｌ；ＰＲＫＣＱ；ＰＲＫＤｌ；ＰＲＬ；ＰＲＯＣ；ＰＲＯＫ２；ＰＳＡＰ；ＰＳＣＡ；ＰＴＡＦＲ；ＰＴＥＮ；ＰＴＧＳ２（ＣＯＸ−２）；ＰＴＮ；ＲＡＣ２（ｐ２１Ｒａｃ２）；ＲＡＲＢ；ＲＧＳｌ；ＲＧＳ１３；ＲＧＳ３；ＲＮＦＩｌＯ（ＺＮＦ１４４）；ＲＯＢＯ２；Ｓ１００Ａ２；ＳＣＧＢ１Ｄ２（リポフィリン（ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｎ）Ｂ）；ＳＣＧＢ２Ａ１（マンマグロビン（ｍａｍｍａｇｌｏｂｉｎ）２）；ＳＣＧＢ２Ａ２（マンマグロビン１）；ＳＣＹＥｌ（内皮単球活性化サイトカイン（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｙｔｏｋｉｎｅ））；ＳＤＦ２；ＳＥＲＰＩＮＡｌ；ＳＥＲＰＩＮＡ３；ＳＥＲＰ１ＮＢ５（マスピン（ｍａｓｐｉｎ））；ＳＥＲＰＩＮＥｌ（ＰＡＩ−Ｉ）；ＳＥＲＰＤＭＦ１；ＳＨＢＧ；ＳＬＡ２；ＳＬＣ２Ａ２；ＳＬＣ３３Ａ１；ＳＬＣ４３Ａ１；ＳＬＩＴ２；ＳＰＰｌ；ＳＰＲＲｌＢ（Ｓｐｒｌ）；ＳＴ６ＧＡＬ１；ＳＴＡＢｌ；ＳＴＡＴ６；ＳＴＥＡＰ；ＳＴＥＡＰ２；ＴＢ４Ｒ２；ＴＢＸ２１；ＴＣＰｌＯ；ＴＤＧＦｌ；ＴＥＫ；ＴＧＦＡ；ＴＧＦＢｌ；ＴＧＦＢｌＩｌ；ＴＧＦＢ２；ＴＧＦＢ３；ＴＧＦＢＩ；ＴＧＦＢＲｌ；ＴＧＦＢＲ２；ＴＧＦＢＲ３；ＴＨｌＬ；ＴＨＢＳｌ（トロンボスポンジン（ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ）−１）；ＴＨＢＳ２；ＴＨＢＳ４；ＴＨＰＯ；ＴＩＥ（Ｔｉｅ−１）；ＴＭＰ３；組織因子；ＴＬＲｌＯ；ＴＬＲ２；ＴＬＲ３；ＴＬＲ４；ＴＬＲ５；ＴＬＲ６；ＴＬＲ７；ＴＬＲ８；ＴＬＲ９；ＴＮＦ；ＴＮＦ−ａ；ＴＮＦＡＥＰ２（Ｂ９４）；ＴＮＦＡＩＰ３；ＴＮＦＲＳＦＩｌＡ；ＴＮＦＲＳＦｌＡ；ＴＮＦＲＳＦｌＢ；ＴＮＦＲＳＦ２１；ＴＮＦＲＳＦ５；ＴＮＦＲＳＦ６（Ｆａｓ）；ＴＮＦＲＳＦ７；ＴＮＦＲＳＦ８；ＴＮＦＲＳＦ９；ＴＮＦＳＦｌＯ（ＴＲＡＩＬ）；ＴＮＦＳＦｌ１（ＴＲＡＮＣＥ）；ＴＮＦＳＦ１２（ＡＰＯ３Ｌ）；ＴＮＦＳＦ１３（エイプリル（
Ａｐｒｉｌ））；ＴＮＦＳＦ１３Ｂ；ＴＮＦＳＦ１４（ＨＶＥＭ−Ｌ）；ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＩ）；ＴＮＦＳＦ１８；ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンド）；ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）；ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬ）；ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド）；ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０リガンド）；ＴＮＦＳＦ９（４−１ＢＢリガンド）；ＴＯＬＬＩＰ；Ｔｏｌｌ様レセプター；ＴＯＰ２Ａ（トポイソメラーゼ（ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ）Ｅａ）；ＴＰ５３；ＴＰＭｌ；ＴＰＭ２；ＴＲＡＤＤ；ＴＲＡＦｌ；ＴＲＡＦ２；ＴＲＡＦ３；ＴＲＡＦ４；ＴＲＡＦ５；ＴＲＡＦ６；ＴＲＥＭｌ；ＴＲＥＭ２；ＴＲＰＣ６；ＴＳＬＰ；ＴＷＥＡＫ；ＶＥＧＦ；ＶＥＧＦＢ；ＶＥＧＦＣ；バーシカン（ｖｅｒｓｉｃａｎ）；ＶＨＬＣ５；ＶＬＡ−４；ＸＣＬｌ（リンホタクチン（ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎ））；ＸＣＬ２（ＳＣＭ−Ｉｂ）；ＸＣＲｌ（ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲｌ）；ＹＹｌ；及びＺＦＰＭ２。
所定の実施態様において、本発明により包含される抗体についての１つ以上の分子標的分子はＣＤタンパク質を含み、以下から選択される：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、ＣＤ６４、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ，ＣＤ１８０（ＲＰ１０５）、ＣＤ２００、及びＣＤ３０７（ＦｃＲＨ５）；ＥＧＦレセプター（ＨＥＲ１）から選択されるＥｒｂＢレセプターファミリーのメンバー、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４レセプター；ＬＦＡ−１、Ｍａｃ１、ｐ１５０．９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ、ａｌｐｈａ４／ｂｅｔａ７インテグリン及びａｌｐｈａｖ／ｂｅｔａ３インテグリン（それらのアルファ又はベータサブユニットの何れかを含み、例えば抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＣＤ１８抗体又は抗ＣＤ１１ｂ抗体など））から選択される細胞接着分子；ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃから選択される増殖因子；組織因子（ＴＦ）；アルファインターフェロン（アルファＩＦＮ）；ＴＮＦアルファ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ１７Ａ／Ｆ、ＩＬ−１８、ＩＬ−１３Ｒアルファ１、ＩＬ１３Ｒアルファ２、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−５Ｒ、ＩＬ−９Ｒから選択されるインターロイキン；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３レセプター；肥満（ＯＢ）レセプター；ＣＴＬＡ−４；ＲＡＮＫＬ、ＲＡＮＫ、ＲＳＶＦタンパク質、タンパク質Ｃ。
国際公開第９６／１６６７３号は二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体及び米国特許第５８３７２３４号は二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃγＲＩ抗体を開示する。二重特性抗ＥｒｂＢ２／Ｆｃα抗体は国際公開第９８／０２４６３号に示される。米国特許第５８２１３３７号及び同６４０７２１３号は二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＣＤ３抗体を教授する。ＣＤ３抗原のエピトープ及び第二のエピトープを結合する更なる二重特異性抗体が記載されている。例えば、以下を参照：米国特許第５０７８９９８号（抗ＣＤ３／腫瘍細胞抗原）；米国特許第５６０１８１９号抗ＣＤ３／ＩＬ−２Ｒ；抗ＣＤ３／ＣＤ２８；抗ＣＤ３／ＣＤ４５）；米国特許第６１２９９１４号（抗ＣＤ３／悪性Ｂ細胞抗原）；米国特許第７１１２３２４号（抗ＣＤ３／ＣＤ１９）；米国特許第６７２３５３８号（抗ＣＤ３／ＣＣＲ５）；米国特許第７２３５６４１号（抗ＣＤ３／ＥｐＣＡＭ）；米国特許第７２６２２７６号（抗ＣＤ３／卵巣腫瘍抗原）；及び米国特許第５７３１１６８号（抗ＣＤ３／ＣＤ４ＩｇＧ）。
一実施態様において、この発明の多重特異性抗体は、以下から選択される少なくとも２つの標的分子へ結合する：ＩＬ−ｌアルファ及びＩＬ−ｌベータ、ＩＬ−１２及びＩＬ−１８；ＩＬ−１３及びＩＬ−９；ＩＬ−１３及びＩＬ−４；ＩＬ−１３及びＩＬ−５；ＩＬ−５及びＩＬ−４；ＩＬ−１３及びＩＬ−ｌベータ；ＩＬ−１３及びＩＬ−２５；ＩＬ−１３及びＴＡＲＣ；ＩＬ−１３及びＭＤＣ；ＩＬ−１３及びＭＥＦ；ＩＬ−１３及びＴＧＦ−β；ＩＬ−１３及びＬＨＲアゴニスト；ＩＬ−１２及びＴＷＥＡＫ、ＩＬ−１３及びＣＬ２５；ＩＬ−１３及びＳＰＲＲ２ａ；ＩＬ−１３及びＳＰＲＲ２ｂ；ＩＬ−１３及びＡＤＡＭ８、ＩＬ−１３及びＰＥＤ２、ＩＬ１７Ａ及びＩＬ１７Ｆ、ＣＤ３及びＣＤ１９、ＣＤ１３８及びＣＤ２０；ＣＤ１３８及びＣＤ４０；ＣＤ１９及びＣＤ２０；ＣＤ２０及びＣＤ３；ＣＤ３８及びＣＤ１３８；ＣＤ３８及びＣＤ２０；ＣＤ３８及びＣＤ４０；ＣＤ４０及びＣＤ２０；ＣＤ−８及びＩＬ−６；ＣＤ２０及びＢＲ３、ＴＮＦアルファ及びＴＧＦ−ベータ、ＴＮＦアルファ及びＩＬ−ｌベータ；ＴＮＦアルファ及びＩＬ−２、ＴＮＦアルファ及びＩＬ−３、ＴＮＦアルファ及びＩＬ−４、ＴＮＦアルファ及びＩＬ−５、ＴＮＦアルファ及びＩＬ６、ＴＮＦアルファ及びＩＬ８、ＴＮＦアルファ及びＩＬ−９、ＴＮＦアルファ及びＩＬ−１０、ＴＮＦアルファ及びＩＬ−１１、ＴＮＦアルファ及びＩＬ−１２、ＴＮＦアルファ及びＩＬ−１３、ＴＮＦアルファ及びＩＬ−１４、ＴＮＦアルファ及びＩＬ−１５、ＴＮＦアルファ及びＩＬ−１６、ＴＮＦアルファ及びＩＬ−１７、ＴＮＦアルファ及びＩＬ−１８、ＴＮＦアルファ及びＩＬ−１９、ＴＮＦアルファ及びＩＬ−２０、ＴＮＦアルファ及びＩＬ−２３、ＴＮＦアルファ及びＩＦＮアルファ、ＴＮＦアルファ及びＣＤ４、ＴＮＦアルファ及びＶＥＧＦ、ＴＮＦアルファ及びＭＩＦ、ＴＮＦアルファ及びＩＣＡＭ−１、ＴＮＦアルファ及びＰＧＥ４、ＴＮＦアルファ及びＰＥＧ２、ＴＮＦアルファ及びＲＡＮＫリガンド，．ＴＮＦアルファ及びＴｅ３８；ＴＮＦアルファ及びＢＡＦＦ；ＴＮＦアルファ及びＣＤ２２；ＴＮＦアルファ及びＣＴＬＡ−４；ＴＮＦアルファ及びＧＰ１３０；ＴＮＦα及びＩＬ−１２ｐ４０；ＶＥＧＦ及びＨＥＲ２、ＶＥＧＦ−Ａ及びＨＥＲ２、ＶＥＧＦ−Ａ及びＰＤＧＦ、ＨＥＲ１及びＨＥＲ２、ＶＥＧＦ−Ａ及びＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｃ及びＶＥＧＦ−Ｄ、ＨＥＲ２及びＤＲ５，ＶＥＧＦ及びＩＬ−８、ＶＥＧＦ及びＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ及びＭＥＴレセプター、ＶＥＧＦＲ及びＥＧＦＲ、ＨＥＲ２及びＣＤ６４、ＨＥＲ２及びＣＤ３、ＨＥＲ２及びＣＤ１６、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３；ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）及びＨＥＲ２、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ４、ＩＬ−１３及びＣＤ４０Ｌ、ＩＬ４及びＣＤ４０Ｌ、ＴＮＦＲ１及びＩＬ−１Ｒ、ＴＮＦＲ１及びＩＬ−６Ｒ及びＴＮＦＲ１及びＩＬ−１８Ｒ、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ３、ＭＡＰＧ及びＣＤ２８、ＥＧＦＲ及びＣＤ６４、ＣＳＰＧｓ及びＲＧＭＡ；ＣＴＬＡ−４及びＢＴＮＯ２；ＩＧＦ１及びＩＧＦ２；ＩＧＦ１／２及びＥｒｂ２Ｂ；ＭＡＧ及びＲＧＭＡ；ＮｇＲ及びＲＧＭＡ；ＮｏｇｏＡ及びＲＧＭＡ；ＯＭＧｐ及びＲＧＭＡ；ＰＤＬ−Ｉ及びＣＴＬＡ−４；及びＲＧＭＡ及びＲＧＭＢ．
一実施態様において、この発明の多重特異性抗体はＣＤ３、及び、ＢＬＲ１、ＢＲ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ７２、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ１８０（ＲＰ１０５）、ＣＲ２、ＦｃＲＨ１、ＦｃＲＨ２、ＦｃＲＨ５、ＦＣＥＲ２、ＦＣＲＬ４、ＨＬＡ−ＤＯＢ，及びＮＡＧ１４から選択される少なくとも一つの追加的な標的分子へ結合する。
可溶性抗原又はそれらの断片は、場合によっては他の分子へコンジュゲートし、抗体を産生の免疫原として用いることができる。レセプターのような膜貫通分子については、これらの断片（例えば、レセプターの細胞外ドメイン）が免疫源として用いることができる。あるいは、膜貫通分子を発現する細胞を免疫源として用いることができる。そうした細胞は天然現（例えば癌細胞株）から由来し得、又は膜貫通分子を発現させるために組換え技術によりトランスフォームされた細胞であり得る。別の抗原及び抗体を調製するために有用なそれらの形態は当業者には自明である。
抗体薬剤コンジュゲートの代謝産物
代謝産物が先行技術に対して新規性及び非自明性を有する限りにおいて、本明細書中に記載のＡＤＣ化合物のインビボ代謝産物も、本発明の権利内である。このような生成物は、投与された化合物の、例えば酸化、還元、加水分解、アミド化、エステル化、酵素切断などから生じうる。したがって、本発明は、代謝産物が生じるために十分な時間、本発明の化合物を哺乳動物と接触させることを含む方法によって生成される新規の自明でない化合物を包含する。
代謝産物は一般的には放射性標識された（例えば、１４Ｃ又は３Ｈ））ＡＤＣを調製し、それをラット、マウス、モルモット、サルなどの動物又はヒトに検出可能な用量(例えば、およそ０．５ｍｇ／ｋｇ以上)で非経口的に投与し、代謝が生じるために十分な時間(典型的にはおよそ３０秒から３０時間)をおいて、尿、血液又は他の生体試料からその変換産物を単離することによって同定される。これらの産物は、標識されているので容易に単離される（他は代謝産物で生き残ったエピトープを結合することができる抗体を用いて単離される）。これらの代謝産物の構造は、ＭＳ、ＬＣ／ＭＳ又はＮＭＲ分析など従来の方法で決定される。一般に、代謝産物の分析は当業者に良く知られた従来の薬剤代謝研究と同じ方法で行われる。変換産物はインビボにおいて他で見つけられない限り、本発明のＡＤＣ化合物の治療投与のための診断アッセイにおいて有用である。
イメージング法
他の実施態様において、多重特異性抗体又は抗体は、放射性核種、蛍光色素、バイオルミネセンスを誘発する基質部分、化学発光を誘発する基質部分、酵素、及び診断用、薬剤動態用、治療用の用途によるイメージング実験のための他の検出標識を有する反応性チオールによって標識されてもよい。一般に、標識された多重特異性抗体又は標識された抗体アナログ、すなわち「バイオマーカー」又は「プローブ」は、注入、灌流又は経口摂取によって生きている生物体、例えばヒト、げっ歯動物、又は他の小動物、灌流される臓器、又は組織試料に投与される。プローブの分布は経時的に検出され、画像に表される。
製造品
他の実施態様では、上記の疾患の治療に有用な物質を具備する製造品又は「キット」が提供される。該製造品は容器と該容器上又は該容器に付随するラベル又はパッケージ挿入物を具備する。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、ブリスター包装などが含まれる。容器は、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックから形成されうる。容器は、症状を治療するために有効な多重特異性抗体、抗体、抗体アナログ又はＡＤＣ組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有しうる(例えば、容器は皮下注射針が貫通可能なストッパーを有するバイアル又は静脈内投与溶液バッグでありうる)。組成物中の少なくとも一つの活性薬剤は多重特異性抗体、抗体、抗体アナログ又はＡＤＣである。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が癌などの選択された症状の治療に使用されることを示す。あるいは、もしくは付加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用の静菌水(ＢＷＦＩ)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第二の(又は第三の)容器を更に具備してもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業上及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
以下は、本発明の方法および組成物の例を示す。前述した一般的な説明を前提として、様々な他の実施態様が実施可能であることが理解される。
実施例１ チオＦａｂ及びヒンジ-ｃｙｓ-Ｆａｂの調製、タンパク質産生、及び二重特異性ビスＦａｂの合成
チオＦａｂ及びヒンジ-ｃｙｓ-Ｆａｂの調製
続く反応で用いるために、幾つかのアプローチが、遊離スルフヒドリル基を持つ抗体断片を作製するために用いられた。一つのアプローチにおいて、以前にJunutulaら、J Immunol Methods 332(1-2): 41-52 (2008)に記載されたように、部位特異的変異によりチオＭａｂを作製するために、軽鎖又は重鎖の定常ドメインの様々な位置にて、抗体コンストラクトに導入された。チオＦａｂは２５ｍＭのＴｒｉｓ中でチオＭａｂを１ｍｇ／ｍＬに希釈し、Ｌｙｓ−Ｃ（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ）を用いて酵素の抗体に対する比率が１：１０００において３７℃で１時間酵素的に消化することで酵素的に産生された。Ｌｙｃ−Ｃによる消化は５μＭのプロテアーゼインヒビターのトシル−Ｌ−リジンクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）（Ｂａｃｈｅｍ，Ｔｏｒｒｅｎｃｅ，ＣＡ）で停止し、５ｍＬ Ｈｉ−Ｔｒａｐ ＳＰ ＦＦカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）上の陽イオン交換クロマトグラフィーにより、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液および０から３００ｍＭのＮａＣｌ １０ ＣＶ勾配を用いて精製した。この方法で産生されたチオＦａｂは本明細書にて「酵素によるチオＦａｂ」と称される。その他のアプローチにおいて、改変されたｃｙｓ残基を有するＦａｂをコードするＤＮＡコンストラクト、又はヒンジ領域に一つの天然型のｃｙｓ残基を含む重鎖断片をコードするＤＮＡコンストラクトは、プラスミド発現ベクターへサブクローニングされ大腸菌で直接発現された。この方法で産生されたチオＦａｂは時には「組換えによるチオＦａｂ」と称される。第三のアプローチは、改変されたｃｙｓ残基を欠いた抗体に使用され、ＩｇＧのヒンジ領域に存在する天然のｃｙｓ残基に依存した。この方法は「ヒンジ-ｃｙｓ-Ｆａｂ」を産生するために用いられ、下記の更なる詳細に記載される。
合成反応における使用のための改変システインを含有しない天然抗体由来のヒンジ-ｃｙｓ-Ｆａｂを調製するために、以下の酵素的手順を用いた。次の手順は、トラスツズマブを使用したものの、本手順は、一般に任意のＩｇＧ抗体にも適用可能である。トラスツズマブは、ｐＨ４．５の酢酸ナトリウム緩衝液中でペプシン（１％ｗ／ｗ）で処理することにより消化した。１時間消化した後、?Ｆ（ａｂ’）２は、ＳＰ−ＨＰ陽イオン交換樹脂上での捕獲により消化混合物から単離され、０−１ＭのＮａＣｌの１０ＣＶ塩勾配により精製した。Ｆ（ａｂ’）２はその後２５ｍｍのＭＥＳ、ｐＨ５．８、２ｍＭのＥＤＴＡ、及び３００ｍＭのＮａＣｌを含むバッファー中で還元された。１ｍＭのＴＣＥＰで還元後に、Ｆａｂは５ｍＭのＤＨＡＡを添加して酸化し、重鎖と軽鎖の間にジスルフィドを再形成した。通常、これらの反応条件下では、重鎖と軽鎖の間のジスルフィドのみが形成され、ヒンジ領域の２つのシステインは酸化されないままであったことを観測した。
ヒンジにある二つの遊離チオール（システイン残基）は、その後、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）の１モル当量と反応させた（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。単一修飾型Ｆａｂ、二重修飾型ＦＡｂ及び非修飾型のＦａｂは、その後過剰のビスマレイミド架橋剤と反応させた。これらの反応条件により３つの産物を得た：一つの架橋剤及び一つのＮＥＭを伴うＦａｂ、２つのＮＥＭを伴うＦａｂ、及び一つの架橋剤のみを含むＦａｂ。一つの架橋剤のみを含むＦａｂは遊離のシステインを持たないことが見いだされた。従って、これらの反応条件下で、単一架橋剤は両方のシステインと非常に効果的に反応し、システインが架橋剤により環化されている分子をもたらした。上述の３つの反応産物を含む物質がゲル濾過によって反応混合物から精製され（不要な反応成分を除去し）、同様の方法で調製された他のヒンジ-ｃｙｓ-Ｆａｂへの結合又はチオＦａｂへの結合に用いられた。既述されたように調製され一つの架橋剤、一つの遊離マレイミド及び一つの遊離スルフヒドリルを含有するヒンジ-ｃｙｓ-Ｆａｂ又はチオＦａｂのみが、下記に詳述されるビスＦａｂの合成反応において反応させることができた。
タンパク質の発現及び精製
大腸菌によるタンパク質発現は、前述したように震とうフラスコ中で一晩培養するか又は１０リッターのファーメンターで一晩培養するかの何れかで行った。例えば、Carterら、Biotechnology (N Y) 10(2): 163-7 (1992); Simmonsら、J Immunol Methods 263(1-2): 133-47 (2002)を参照。反応性システイン残基を含むように改変されたトラスツズマブ（完全長ハーセプチン（登録商標））（ｈｕ４Ｄ５-ｔｈｉｏ-Ｍａｂ）の場合、抗体はJunutulaら、J Immunol Methods 332(1-2): 41-52 (2008)に既述されたように発現し精製した。組換えチオＦａｂ又は組換えヒンジ-ｃｙｓ-Ｆａｂを発現する大腸菌細胞ペレットは、２５ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、１２５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ（ＴＥＢ）を含むバッファーに再懸濁し、マイクロフルイダイザーを用いて溶解した。抽出物は綿状ポリエチレンイミン（０．４％）と処置され、１時間撹拌しながらｐＨ９．０へ調整した後、１５０００×ｇで４５分間遠心分離した。チオＦａｂ又はヒンジ-ｃｙｓ-Ｆａｂは、プロテインＧ及び陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて当業者に公知の標準的手順で精製した。具体的には、上清を０．２２ミクロンフィルターを通して濾過した後、直接プロテインＧ樹脂、典型的にはＨｉ−ＴｒａｐプロテインＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）へ適用した。溶出は０．２Ｍの酢酸で行い、続いてＳＰ−ＨＰ陽イオン交換樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で捕獲した。チオＦａｂ又はヒンジ-ｃｙｓ-Ｆａｂは、０−１ＭのＮａＣｌの１０ＣＶの勾配で溶出した。精製されたチオＦａｂはＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び質量分析で特性を評価にした。これらの特性評価は、多くの場合、２７５Ｄａ及び３０６Ｄａの質量の増加を示した。これらの質量の増加は、ビスマレイミドとの架橋のためのチオＦａｂを調製するために、還元及び酸化により除去した、不対システインのジスルフィド付加物であることが判明した。チオＦａｂの還元及び酸化は以下のように行った。最初に、チオＦａｂは、２５ｍＭのＭＥＳ、ｐＨが５．８、３００ｍＬのＮａＣｌ、および５ｍＭのＥＤＴＡを含むバッファー中で、２ｍＭのトリス（２-カルボキシエチル）ホスフィン塩酸(ＴＣＥＰ−ＨＣｌ；ＴＣＥＰとも称される) (Ｐｉｅｒｃｅ［Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ)の添加により２４時間還元した。還元後、タンパク質は５ｍＭのデヒドロアスコルビン酸（ＤＨＡＡ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の添加により酸化した。単離されたチオＦａｂはＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析によって分析され、タンパク質が適切に還元され酸化されたことを確かにした。
ビスＦａｂ合成
図１はビスＦａｂの合成のスキームを示す。ビスＦａｂ合成の第一段階において、不対システインを持つチオＦａｂ又はヒンジ-ｃｙｓ-Ｆａｂが用いられた。一般に、チオＦａｂ又はヒンジ-ｃｙｓ-Ｆａｂは、還元及び酸化が行われる同一バッファー中にタンパク質濃度１ｍｇ／ｍLにて存在した（ＭＥＳ、ｐＨ５．８、２ｍＭのＥＤＴＡ、及び３００ｍＭのＮａＣｌ）（図１、パネル１）。この段階で、ジスルフィド２量体及び架橋された２量体という２つの望ましくない反応産物が存在する可能性がある。この合成段階にてタンパク質濃度１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度が、２量体化がそのタンパク質濃度で最小であったため反応の重要な特徴であることを見いだした。更に、ＥＤＴＡを含む低いｐＨのバッファーを用いることで反応を調節することが２量体化を最小に抑えた。ビスマレイミド架橋剤（Ｑｕａｎｔａ ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ，Ｐｏｗｅｌｌ，ＯＨ）の５倍過剰が反応混合物へ添加された（図１、パネル２）。この５倍過剰の架橋剤は望ましくない２量体化を最小にするのにも役だった。反応は室温（ＲＴ）で又は３７℃で４時間、完結するまでインキュベートされた。次いで、混合物はゲル濾過に適した体積に濃縮した（図１、パネル３）。我々は通常２２ｍＬのＳ−２００ Ｔｒｉｃｏｒｎカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）をμｇからｍｇの量の合成のために用いた。この最初のゲル濾過工程は未使用の架橋剤の除去を可能とし、架橋剤へコンジュゲートした精製されたチオＦａｂ又はヒンジ-ｃｙｓ-Ｆａｂを生じた。上記の条件は典型的には少なくとも９０％か又はそれ以上の所望の産物をもたらした。遊離のチオ−ルのままであるチオＦａｂ又はヒンジ-ｃｙｓ-Ｆａｂは存在せず、全てが不対システインを介して架橋剤へコンジュゲートしたか又は別のチオＦａｂ又はヒンジ-ｃｙｓ-Ｆａｂへジスルフィドにより結合していた。
単離され精製されたチオＦａｂ（又はヒンジ-ｃｙｓ-Ｆａｂ）に架橋剤種を加えた後、第二のチオＦａｂ（又はヒンジ-ｃｙｓ-Ｆａｂ）へ添加され、５ｍｇ／ｍＬ又はそれ以上へ、一般にはゲル濾過に適した体積へ濃縮した（図１、パネル４）。我々は、この合成段階の間、少なくとも５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度が反応を完結へ促進するのに重要であることを見いだした。低いタンパク質濃度は少量の架橋ビスＦａｂ２量体のみを形成する結果となった。理論に拘束されることなく、我々は、架橋されたビスＦａｂ２量体の形成を妨げる立体効果又は粘度に関連した変数が、反応物の濃度を増加させることによって克服されると仮定する。更に、我々は最大６５ｍｇ／ｍＬかつ６５ｍｇ／ｍＬを含むタンパク質濃度の範囲を試験した。我々は、タンパク質濃度が高いほど反応がより速く完了に到達するという、タンパク質濃度と反応時間の相関を見いだした（データ非表示）。室温又は３７℃で２〜２４時間後に、反応は質量分析により測定されて完了した（図１、パネル４）。一般に、一つの試薬が過剰であり最終混合物中に非結合状態のままであった。完了した反応は再びゲル濾過で精製され；今度は、（チオＦａｂの場合）遊離システインアミノ酸を介して不可逆的に架橋した、又は（非改変ヒンジ-ｃｙｓ-Ｆａｂの場合）ヒンジ領域に位置する不対システインを介して不可逆的に架橋した１００ｋＤのビスＦａｂを含む２量体のピークを回収した（図１、パネル４）。両方の工程の間の反応の進行は頻繁に質量分析でモニタリングされ、両方の反応物の存在及びビスＦａｂ産物の形成を明らかに示した（図１、パネル４）。２回目のゲル濾過後の所望の産物の純度を質量分析とＳＤＳ-ＰＡＧＥで決定した。還元及びＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析の際に、不可逆的架橋が還元できない架橋鎖を表わす５０ｋＤのバンドの存在により観察された（図１、パネル５）。上記の小規模での方法を用いて、我々はマイクログラム量の出発物質でマイクログラムの収量を典型的に達成した。更に、大規模で、我々はミルグラム量の出発物質でミリグラムの収量を典型的に達成した。
実施例２ Ｈｅｒ２及びＨｅｒ１を標的にするビスＦａｂの合成及びビスＦａｂのインビトロでの生物学的活性の分析
ビスＦａｂの様々な生物学的活性を探索するために、我々はＨｅｒ軸、具体的にはＨｅｒ２及びＨｅｒ１の成分を標的にするビスＦａｂを合成した。癌細胞の成長を推進する上でのＨｅｒ軸の重要性はよく文書化されており、様々な強力な阻害抗体が容易に利用可能である。例えば、Kumar, R. ら、Semin Oncol 27(6 Suppl 11):84-91; 92-100における議論 (2000); Yarden, Y.ら、Nat Rev Mol Cell Biol 2(2):127-37 (2001); Takai, N.ら、Cancer 104(12):2701-8 (2005); Patel, D.ら、Int J Oncol 34(1):25-32 (2009)を参照。組み合わせ分子は、単一の抗体療法にわたって、追加された、あるいは相乗的な利点を提供することができることが示唆されている。例えば、Ransonら、Oncology 63 Suppl 1:17-24 (2002); Jackson, J.ら、Cancer Res 64(7):2601-9 (2004); Lee-Hoeflich, S. T.ら、Cancer Res 68(14):5878-87 (2008)を参照。このことは、ここで、特に２つのレセプターが活発に共同して腫瘍細胞増殖を促進するような場合である。
我々はＨｅｒ２を標的とする２つの異なる抗体から、及びＨｅｒ１(ＥＧＦＲ)を標的とする２つの異なる抗体から２重特異的ビスＦａｂを産生した。２つのＨｅｒ２標的抗体はペルツズマブ（２Ｃ４）とトラスツズマブ（Ｈｅｒｃ）であった。これらの抗体の両方は、それらがどのようにその標的を結合するかの知識を含み、良く特徴評価された分子である。Nature 421(6924):756-60 (2003); Cancer Cell (4):317-28 (2004).２つのＨｅｒ１標的抗体はＤ１-５及びＣ３-１０１であった。これらの抗体の両方はＦＧＦＲの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）へ結合し、それらがＦＧＦＲのＥＣＤで結合する領域は既知である（国際特許出願公開第２０１０／１０８１２７号）。
それら４つの抗体の各々において、記載のように組換えチオＦａｂが生成された。それから我々は合成マトリックスを用いて、組換え形態のこれら４つのチオＦａｂからビスＦａｂを合成した。我々はおよそ５ｍｇの各チオＦａｂで開始した。異なるチオＦａｂを組合わせて、下記表１の太字に示す１０個の固有の分子を合成した。
表１にリストされた各ビスＦａｂがおよそ１ｍｇ、合成から回収された。ビスＦａｂの各々は表１に示されたようにユニークな識別子（カッコ内の数字）を与えられた。各ビスＦａｂの純度はＳＤＳ-ＰＡＧＥ（図２Ａに示した）、及び質量分析法（データ非表示）で分析された。これらの分子は親抗体と類似して、細胞のシグナル伝達及び細胞増殖を阻害する能力を保持しているかを決定するために試験された。我々は細胞シグナル伝達活性について、２つの特定の読み出し情報、形質転換成長因子（ＴＧＦα）に対する応答におけるＥＧＦＲのリン酸化及びヘレグリン（ＨＲＧ）での処置後のＨｅｒ３のリン酸化を試験した。Ｈｅｒ３のリン酸化アッセイは、ヘレグリンに対して応答したＨｅｒ２のＨｅｒ３との２量体化能を特異的に探索する(Junttila, T. T.ら、Cancer Cell 15(5): 429-40 (2009))。２量体化はＨｅｒ２によるＨｅｒ３のリン酸化を可能としシグナル伝達経路を活性化し、かつこれはハーセプチン（登録商標）及びハーセプチン（登録商標）Ｆａｂｓにより阻害される。同文献。
ビスＦａｂの抗ＥＧＦＲ（抗Ｈｅｒ１）活性を検定するために、ＮＲ６-ＥＧＦ細胞は、ＥＧＦＲのチロシンリン酸化を刺激するため５ｎＭのＴＧＦαで処理され、続いて、指示されたビスＦａｂ（図２Ｂ、上のパネル）を単一用量１０ｎＭで処置された。試験された各々のビスＦａｂ、１１８７、１１８９、１１９０、及び１１９２は、抗ＥＧＦＲ（抗Ｈｅｒ１）抗体のＤ１−５又はＣ３−１０１の何れかに由来する一つのＦａｂを含んでいた。リン酸化活性は、Junttila, T. T.ら、Cancer Cell 15(5): 429-40 (2009)に記載されたように、α-ｐＴｙｒによるウエスタンブロットを探索することで分析した。図２Ｂの上のパネルに示されたように、試験された各々のビスＦａｂは、ＮＲ６-ＥＧＦＲ細胞でＥＧＦＲのリン酸化の強力な阻害作用を示した。エルビタックス（登録商標）（セツキシマブ）は、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｅｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏ.により市販されている、ＥＧＦＲのＥＣＤに特異的に結合し陽性コントロールとして使用されたモノクローナル抗体である。ブロットはαチューブリンで探索され、各レーンのタンパク質負荷を正規化した。
Ｈｅｒ２-Ｈｅｒ３の２量体化の阻害作用を検定するため、ＭＣＦ７細胞中のＨｅｒ３のヘレグリン（ＨＲＧ）誘導チロシンリン酸化が、Junttila, T. T.ら、Cancer Cell 15(5): 429-40 (2009)に記載のように、抗チロシンウエスタンブロット法によりモニタリングされた。ＭＣＦ７細胞はＨｅｒ３のリン酸化を刺激するため、５ｎＭのＨＲＧで処置され、続いて指示されたビスＦａｂ（図２Ｂ、下のパネル）を５０ｎＭの単一投与により処置された。試験されたビスＦａｂの各々の１１８７、１１９１、１１９２、及び１２０４は、抗Ｈｅｒ２抗体、２Ｃ４に由来する少なくとも一つのＦａｂを含んでいた。 図２Ｂの下のパネルに示すように、試験されたビスＦａｂの各々は、Ｈｅｒ２-Ｈｅｒ３の２量体化の阻害の結果、Ｈｅｒ３のリン酸化の強力な阻害作用を示した。親抗体の２Ｃ４（ペルツズマブ）が陽性コントロールとして使用された。ブロットはαチューブリンで探索され、各レ−ンのタンパク質負荷を正規化した。分子のビスＦａｂ滴定は、その分子が親抗体のＦａｂと類似する効果的な阻害濃度を保持していることを示した（データ非表示）。
次に我々は培養中の細胞増殖における様々なビスＦａｂの作用を調べた。***腫瘍細胞株のＭＤＡ-１７５（ＡＴＣＣ ＨＴＢ-２５）又はＢＴ４７４（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ-２０）を、抗Ｈｅｒ２に由来したＦａｂを含むビスＦａｂを試験するために用いた。ここでは示さない実験において、ＭＤＡ-１７５細胞はＨｅｒ２レセプターを発現することを特定した。ヒトＥＧＦＲ、ＮＲ６-ＥＧＦＲ細胞でトランスフェクトしたマウス線維芽細胞株(Gladingら、J. Biol. Chem. 275:2390-98 [2000]; Cancer Res. 67(3):1228-38 [2007])が抗Ｈｅｒ１由来Ｆａｂを含むビスＦａｂの試験に用いられた。これらの細胞株の各々は標準的な細胞培養手順を用いて維持されおよび伝播された。細胞増殖アッセイについては、細胞はコンフルエンスまで増殖され、培地は新鮮な培地（ＤＭＥＭ：Ｆ１２，１０％のＦＣＳ，ＰｅｎＳｔｒｅｐ，Ｇｌｕｔａｍａｘ）に交換された。細胞はトリプシン処理され、遠心分離により洗浄され、１％の血清を含む新たな培地に交換した。細胞はｍＬあたり２００００細胞の密度へ調整され、２５０μＬが９６穴プレート（５０００細胞／ウエル）の各ウエルに添加された。蒔かれた細胞は一晩増殖させ、次いで翌日抗体試薬（例えばビスＦａｂ）を直接ウエルに添加することにより曝露された。５日間これらの条件にて細胞は増殖され、その後培地はウェルから吸引され、新鮮な培地を２５０μＬで置き換えられた。アラマーブルー（２５μＬ）が各ウエルへ添加され、３７℃で３〜４時間インキュベートした。プレートを５４５／５９０ナノメートル（励起／発光）で蛍光プレートリーダーで読み取った。細胞装飾の量は相対的蛍光単位（ＲＦＵ）で直接報告されるかあるいはコントロールへ正規化することで報告された。
図２Ｃ及び２Ｄは、指示された細胞株で様々なビスＦａｂをその細胞増殖効果について試験した結果を示す。図２ＣはビスＦａｂの１１９１及び１２０４（各々は２つの抗Ｈｅｒ２Ｆａｂを含む）がＭＤＡ-１７５細胞の増殖の最も強力な阻害剤であったことを示す。単一Ｆａｂ分子の２Ｃ４-Ｆａｂ及びＨｅｒｃ-Ｆａｂは少なくとも強力な阻害剤であって、一つの抗Ｈｅｒ２Ｆａｂ及び一つの抗Ｈｅｒ１Ｆａｂを含む抗ビスＦａｂの１１９２は、この実験において、ＭＤＡ-１７５細胞増殖を阻害する能力において中間であった。図２Ｄは、２つの抗Ｈｅｒ１Ｆａｂを含むビスＦａｂ１１９３は、Ｄ１-５（抗Ｈｅｒ１）モノクローナル抗体に類似して、ＮＲＧ−ＥＧＦＲ細胞増殖の強力な阻害剤であったことを示す。一つの抗Ｈｅｒ１Ｆａｂを含むビスＦａｂ、並びにＣ３-１０１-Ｆａｂは、なお増殖阻害活性を示すものの、作用の弱い阻害剤であった。従って、これらの結果は２Ｃ４及びＨｅｒｃ含有ビスＦａｂ（１１９２、１２０４、及び１１９１）は、Ｈｅｒ２を発現するＭＤＡ-１７５細胞での細胞増殖を阻害することが可能であったことを示す。 そして、抗ＥＧＦＲのＦａｂを含むビスＦａｂ（１１８７、１１９０、１１９２、及び１１９３）は、ＥＧＦＲ発現細胞株（ＮＲ６-ＥＧＦＲ）の細胞増殖を阻害することが可能であった。次に、我々は、親抗体の構造類似体である２つのビスＦａｂのインビトロ細胞増殖阻害活性を、その親抗体のインビトロ細胞増殖阻害活性に対して直接比較した。最初の比較は、ＭＤＡ-１７５細胞上のペルツズマブ（２Ｃ４）及びビスＦａｂの１２０４（２Ｃ４Ｖ１１０Ｃ／２Ｃ４Ｖ１１０Ｃ）の間であった。図２Ｅは、この実験におけるＭＤＡ-１７５細胞増殖の阻害において、ＬＣ-１１０Ｃ-結合２Ｃ４ビスＦａｂが二相性活性を示すように見えたことを示す。低濃度（１ｎＭ）にて、ビスＦａｂは増殖を刺激するように見え、一方高濃度では抑制性であった。最大阻害の半分は、親抗体のペルツズマブに比して〜２ｎＭであった。２番目の比較は、Ｈｅｒ２を過剰発現するＢＴ４７４細胞上でのトラスツズマブ及びビスＦａｂの１１８８（ＨｅｒｃＶ１１０Ｃ／ＨｅｒｃＶ１１０Ｃ）の間であった。この実験においては、トラスツズマブＦａｂをも含めた。結果を図２Ｆに示す。上記で議論したペルツズマブ及びビスＦａｂで観察された結果にもとずき、我々はこの実験において、ビスＦａｂの１１８８が、親抗体のトラスツズマブに類似してＢＴ４７４細胞増殖を阻害するであろうことを観察することを期待した。図２Ｆは、期待されたように、トラスツズマブが強くＢＴ４７４細胞増殖を阻害し、トラスツズマブ-Ｆａｂは細胞増殖の阻害作用が弱かったことを示している。驚くべきことに、しかし、ビスＦａｂの１１８８は細胞増殖におけるちょうど逆の作用を有することを観察した。図２Ｆに明瞭に示すように、ビスＦａｂ１１８８は強くＢＴ４７４び細胞増殖を促進した。ＢＴ４７４細胞は、任意の外因性アゴニストの非存在下でも急速に増殖したが、実際にはこの細胞株の既知のアゴニストは存在しない。ＢＴ４７４細胞株のこれらの増殖特性を仮定すると、ビスＦａｂ１１８８はこれらの細胞のアゴニストとして機能し得るであろうという発見は特に驚くべきことでかつ予期せぬことであった。
トラスツズマブのＦａｂアームとビスＦａｂ１１８８のＦａｂとの間の一つの構造的違いはコンジュゲーションの位置である。典型的なＩｇＧ構造で重鎖を介して連結したＦａｂを持つ親抗体に対して、ビスＦａｂ１１８８の２つのチオＦａｂは、その軽鎖を介して可変ドメインと第一定常ドメイン間の位置でコンジュゲートしている。直接レセプターを活性化するＨｅｒ２に対するリガンドは同定されていないため(Yarden, Y.ら、Nat Rev Mol Cell Biol 2(2):127-37 (2001); Jackson, J.ら、Cancer Res 64(7):2601-9 (2004))、ビスＦａｂ及び親抗体の間のそうした構造の違いが、その親のアンタゴニスト活性よりはむしろアゴニスト活性を有するビスＦａｂをもたらすであろうことは予想外であった。従って、これらの条件下でアゴニスト活性を有するトラスツズマブ類似体の同定は極めて驚くべきことであった。構造における他の変種が分子の生物学的活性に影響しうるか疑問に思った。従って、我々はトラスツズマブから派生した４つの異なるチオＦａｂを生成することにより、架橋変異体の構造配列、または類似体ライブラリを開発た。これらは下記に更に詳細を議論する。
実施例３ トラスツズマブ由来ビスＦａｂ構造変異体の合成及び特性評価
上記のマトリックス組換えの手法を使用して、我々はトラスツズマブから派生した一連のビスＦａｂ構造変異体を合成した。我々は、ビスＦａｂを合成するために、４つの異なるチオ付着点を選んだ；その位置の２か所は重鎖にあり位置の２か所は軽鎖にあった。チオ付着点を含むＦａｂは３つの異なる源に由来した；１）抗体由来のチオＦａｂを遊離するためにリジン-Ｃで消化されたシステインによる置換を伴うチオＭａｂ、２）大腸菌で直接発現され精製されたシステインの置換を伴うチオＦａｂ、３）単一の架橋剤をペプシンによる消化後の非改変抗体のヒンジ領域へ連結するため上述の酵素的方法で産生したヒンジ-ｃｙｓ-Ｆａｂ。この方法で別のチオＦａｂとの組換えのためにチオＦａｂにおいて４つの異なる置換点を作り出し、構造変異体のパネルを得た（図３Ａ）。４つの異なる置換点は軽鎖の位置１１０（ＬＣ１１０Ｃｙｓ）、軽鎖の位置２０５（ＬＣ２０５Ｃｙｓ）、重鎖の位置１１８（ＨＣ１１８Ｃｙｓ）、及び重鎖のヒンジ領域（ＨＣＨｇ−Ｃｙｓ）にある。合成はマトリックス形式で行われ、四つのチオＦａｂの組が最初に架橋剤とコンジュゲートされ、次いでお互いに再度組み合わされて１６分子を生成し、そのうち１０は質量と構造において固有であった。チオＦａｂは、合成されたビスＦａｂの固有の識別子及び各ビスＦａｂに対する各チオＦａｂの起源とともに図３Ａに模式的に素描される。合成反応に由来する最終の精製産物は質量分析により特性評価され、試験物質の純度を確実にした。更に、我々はビスＦａｂの分子量を非還元ＳＤＳ-ＰＡＧＥによる分析した（図３Ｂ）。図３Ｂに示すように、全てのビスＦａｂ構造変異体は大きく異なる見かけの分子量を有しており、個々の起源のチオＦａｂは同じ分子量であり、同じ架橋剤が各ビスＦａｂの合成に用いられたことを考慮すると興味深い結果であった。異なる見かけの分子量についての最も可能性のある説明は、結合位置（チオ付着点）が変性条件で起きる直線状に伸長したポリペプチドで観測される構造的変異体を作るとするものである。
次に、トラスツズマブに対して比較して、各々のビスＦａｂ構造変異体をＢＴ４７４細胞増殖におけるその作用について試験した。図３Cは、ＢＴ４７４細胞の増殖において濃度を変化させて（横軸に示される）試験した、個々のビスＦａｂ及び親抗体のトラスツズマブの作用を示す。生細胞をアラマーブルー染色によって判定し、未処理のコントロールに正規化された最大のパーセンテージ （縦軸の％最大）として報告した。図３Ｃに示すように、トラスツズマブビスＦａｂ構造変異体は、親抗体に類似する活性を提示するアンタゴニスト（ビスＦａｂの１３２４、１３２８、及び１３２９）から非常に強力なアゴニスト（ビスＦａｂの１３２１、１３２２、１３２３、及び１３２５）に及ぶ広範囲の活性を示した。興味深いことに、これらのアゴニストのビスＦａｂは、同定された元のアゴニストのビスＦａｂ１１８８よりもより強力なアゴニストであった（図３Ｃ）。このアッセイにおいて、最も強力なアゴニストはビスＦａｂ１２３５であって、ＨｅｒｃＨＣ１１８Ｃｙｓ及びＨｅｒｃＬＣ２０５Ｃｙｓの組合わせである。最終的に、ＢＴ４７４細胞増殖についてビスＦａｂ１３２５の作用をハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）と比較して試験する経時的実験が行われた。図３Ｄに示されるように、ハーセプチン（登録商標）（空白の棒）は実験の過程を通じて細胞増殖を阻害したが、一方ビスＦａｂ１３２５（上向きの斜め縞模様の棒）は細胞増殖を促進し、上述の細胞増殖アッセイと一致している。下向きに傾斜した縞模様の棒は処置を受けていないコントロール細胞を示す。
我々は、分子の特定の物理的な性質に関連して、ビスＦａｂの様々な結合の組み合わせを検討した。図３Ｂに示すように、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析は、異なるビスＦａｂのあいだの見かけの分子量を明らかにした。このことは、しかし、ビスＦａｂのＢＴ４７４細胞増殖の信頼性の高い予測因子ではなかった。最も特記すべきことは、ＢＴ４７４アッセイにおける最強のアゴニスト、ＨｅｒｃＨＣ１１８Ｃｙｓ-ＨｅｒｃＬＣ２０５Ｃｙｓは、強力なアゴニストの見かけの分子量に非常に近接した見かけの分子量を示したことであった。恐らくは架橋部位の位置によるＳＤＳ-ＰＡＧＥ上で観測される泳動の違いに加えて、我々は他の物理的特性を分析した。我々は、スキャッチャード分析、ＳＥＣ-ＭＡＬＳ溶出、分子量及び流体力学的半径によって、標的レセプターに対する内在化、親和性について試験した。指示された分子について、細胞表面の解離定数（Ｋｄ）及び細胞あたりの部位に関する分析結果を下の表２に示す。アゴニスト分子及びアンタゴニスト分子のあいだで有意な違いは観察されなかった。図４はＳｈｏｄｅｘ ＳＥＣ上でのゲル濾過分析を与え、指示された分子の相対保持時間（横軸に示される）（ＲＴ）および流体力学的半径（Ｒｈ）を示している。再び、アゴニスト分子及びアンタゴニスト分子のあいだで有意な違いは観察されなかった。従って、これらの実験は、アゴニスト分子およびアンタゴニスト分子間のこれらの物理的特性の有意な相違点を明らかにせず、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ上の泳動の相違（図３Ｂ）及びＳＥＣにおける保持のわずかなシフト（図４）のみであった。
我々は次いでＨｅｒのシグナル伝達経路を、特にアゴニスト処置後のＢＴ４７４細胞におけるレセプター活性化を調べることにより分析した。Ｈｅｒ２を過剰発現する細胞株、例えばＢＴ４７４において、ハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）は、細胞培養における抗体の抗増殖作用の原因となる、Ｈｅｒ２及びＨｅｒ３のあいだのリガンド非依存的相互作用を阻害する(Junttila, T. T.ら、Cancer Cell 15(5):429-40 (2009))。ハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）によるＨｅｒ２／Ｈｅｒ３相互作用の破壊はＨｅｒ３のリン酸化の損失をもたらしセリン／スレオニンキナーゼ、ＡＫＴの活性の減少をもたらす。同上文献。我々は、ＡＫＴ及びＨｅｒ３のリン酸化について、アゴニストのビスＦａｂ１３２５、アンタゴニストのビスＦａｂ１３２９、親抗体、ハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）、及びリン酸化作用を欠くコントロール抗体、ｇＤの作用を比較した。ＢＴ４７４細胞はこれらの分子の各々で処置された。細胞は処置を開始後、１０分、３０分、及び２時間で回収した。細胞可溶化物 は抗リン酸化（phospho）ＡＫＴ抗体でＥＬＩＳＡによりＡＫＴリン酸化について測定した。結果は図５Ａに示す。アンタゴニストのハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）及びビスＦａｂ１３２９は、ＥＬＩＳＡによる測定でリン酸化ＡＫＴの量を減少させたが、アゴニストのビスＦａｂ１３２５はリン酸化ＡＫＴの量を増加させた（図５Ａ）。抗体及びビスＦａｂ１３２９の阻害活性は１０分で観察され、最大２時間微増が続いた。ビスＦａｂアンタゴニスト１３２９は、実験の最初の３０分間は親抗体よりもわずかに作用が弱かったが、２時間で阻害の同一レベルに到達した（図５Ａ）。アゴニストのビスＦａｂ１３２５は、しかし、１０分後にリン酸化ＡＫＴのレベルの増大をもたらし、そしてリン酸化(phosphor)-ＡＫＴのレベルが処置の２時間の間わずかに上昇が続いた（図５Ａ）。抗体の作用はｇＤで見られ、リン酸化ＡＫＴのレベルが処置後にわずかに上昇する。しかし、その作用は無処置の可変性の範囲内である。リン酸化ＡＫＴを用いるウエスタンブロット分析もまたリン酸化ＡＫＴのレベルがアゴニストのビスＦａｂ１３２５に応答して増加したことを示していた（図５Ｂ、ｐＡＫＴの行をＡＫＴの行と比較する）。
ハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）の処置がリン酸化Ｈｅｒ３のレベルを減少させることが知られているため、我々はまたＨｅｒ３リン酸化のレベルを調べた(Cancer Cell 15(5):429-40 [2009])。これらの実験について、ＢＴ４７４細胞は、ハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）、ビスＦａｂ１３２５，ビスＦａｂ１３２９、又はｇＤで、９６穴プレート中で最大２時間処置された。指示された時間で（１０分、３０分、又は２時間）細胞は可溶化された。細胞可溶化物のウエスタンブロット分析は以下のように実施された。細胞可溶化物はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離され、ニトロセルロース膜に移された。ニトロセルロース膜は指示されたリン酸特異的（ｐＨＥＲ３、ｐＡＫＴ、又はｐＭＡＰＫ）又は非リン酸特異的抗体（ＨＥＲ３、ＡＫＴ、又はＭＡＰＫ）で探索され、指示されたＨｅｒシグナル伝達経路の酵素の活性化状態を評価した。抗チューブリン抗体がコントロールとして使用された。図５Ｂに示すように、抗Ｈｅｒ３リン酸化チロシン抗体を使用するウエスタンブロット分析は、アンタゴニストのハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）及びビスＦａｂ１３２９に応答して、２時間以上にわたって生じた、リン酸化Ｈｅｒ３の特徴的かつ期待された減少を示した（図５Ｂ、ｐＨＥＲ３の行をＨＥＲ３の行と比較）。細胞のｇＤ抗体による処置はＨｅｒ３のリン酸化のレベルに影響を及ぼさなかった（図５Ｂ、ｐＨＥＲ３の行をＨＥＲ３の行と比較）。驚くべきことに、我々は、アンタゴニストのビスＦａｂ１３２５での処置により、リン酸化Ｈｅｒ３の予想された増加を観測しなかった（図５Ｂ、ｐＨＥＲ３の行をＨＥＲ３の行と比較）。実は、アンタゴニストで観察されたものと類似し、２時間以上の時間、リン酸化Ｈｅｒ３の量においてわずかな増大があった（図５Ｂ）。ビスＦａｂ１３２５による処置に応答して、ＭＡＰＫの観察されたリン酸化は（図５Ｂ、ｐＭＡＰＫの行をＭＡＰＫの行と比較）、アゴニストはリガンド誘導活性化に一般に関連した経路を活性化している可能性があることを示している。この驚くべき結果はＨｅｒ２のビスＦａｂアゴニストが働いている機構についての問題を提起している。
従って、我々は次に、細胞がアゴニストのビスＦａｂ１３２５で処置された場合、Ｈｅｒ２のリン酸化に直接的に影響を与えるかについて調査した。ハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）処置が、Ｈｅｒ２のリン酸化状態を有意には変更しないことが以前に示されている。Kito, K. ら、Curr Genomics 9(4):263-74 (2008)。Ｈｅｒ２は基底状態で高度にリン酸化されているため（同文献）、我々は定量的質量分析を用いて、異なる分子に応答した、Ｈｅｒ２のリン酸化部位の変化を探索した。リン酸化マッピング（phospho-mapping）技法を用いて、未処置のＢＴ４７４細胞のＨｅｒ２において数多くの部位が異なるレベルでリン酸化されたことを我々は確定した（図５Ｃ、基底の列）。図５Ｃの表はＨｅｒ２のトリプシン開裂に由来のリン酸化ペプチドの一覧を与えている。小さな太字斜体頭文字で表される各ペプチド配列のアミノ酸は目的とするリン酸化残基を示している。これらの部位の定量的測定は、ハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）での処置後に、未処理細胞と比較してリン酸化ペプチドのリン酸化のレベルでわずかな変化があったことを示している（図５Ｃ及び５Ｅ）。しかし、アゴニストのビスＦａｂ１３２５での処置は、未処置細胞に比してリン酸化の量が増加した幾つかのリン酸化部位を示した（図５Ｃ及び５Ｅ）。いくつかのリン酸化部位もまた、ＰＩ３Ｋ経路のアゴニストで知られたヘルグリンで処置した後で、リン酸化のレベルが上昇した（図５Ｃ及び５Ｅ）。我々はまた統計試験を行った。各ペプチドにおいて、混合効果モデルが、固定効果としての処置とともに及び変量効果としてのサンプルとともに、相対的リン酸化レベルに対してフィットされた。図５Ｅに示すように、多重比較について調整するため、グループの一対比較がＴｕｋｅｙ-Ｋｒａｍｅｒの方法を用いて行われた。これにより各ペプチドに対する多重統計試験の実施に関連する全体の偽陽性率を制御する。要約すると、これらの結果は、増殖につながる細胞のシグナル伝達経路における可能性のあるリガンド非依存的かつＨｅｒ３非依存的活性化を明らかにする。更に、その結果は細胞増殖に関与する更なるシグナル伝達成分の同定へと導くことを可能にし、従って、限定されないが、癌などの細胞増殖性疾患に対する新たな治療標的へと導くこととなる。
実施例４ ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃεＲＩを標的にするビスＦａｂの合成及び特性評価
ビスＦａｂ合成の方法を他の分子標的への一般的適用を試験するため、我々は、ＦｃγＲＩＩｂを標的とする一抗体（５Ａ６）に由来したチオＦａｂ又はヒンジ-ｃｙｓ-Ｆａｂ、及びＦｃεＲＩα（２２Ｅ７）を標的とする一抗体に由来したチオＦａｂ又はヒンジ-ｃｙｓ-Ｆａｂを用いて、２重特異的ビスＦａｂマトリックスを設計した。５Ａ６及び２２Ｅ７抗体は米国特許出願公開第２００６００７３１４２号およびJackmanら、J. Biol. Chem. 285:20850-20859 (2010)に記載されている。ＦｃγＲＩＩｂ細胞表面タンパク質は、近隣のチロシンキナーゼレセプター（例えばＦｃεＲＩα）を脱リン酸化することができるタンパク質チロシンフォスファターゼでり、それらの活性を阻害する。我々は以前に、肥満細胞の表面上のこれらの２つのレセプターを標的とする２重特異的ＩｇＧを記述した（同文献）。更に、我々は、２重特異的抗体がＦｃεＲＩα及びＦｃγＲＩＩｂに結合して架橋し、ヘテロ２量体レセプター複合体を形成して、ＩｇＥのＦｃεＲＩαへの結合によって始まる細胞のシグナル伝達とヒスタミン放出を強く阻害することを示した。同文献。２重特異的ＩｇＧの作用機構にもとずいて、我々は、肥満細胞上でＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃεＲＩαを標的にするビスＦａｂは作用の類似した機構を有するのであろうと仮定する。従って、理論に拘束されることなく、我々は、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃεＲＩαを標的にするビスＦａｂによる処置は、ＦｃγＲＩＩｂの活性化レセプター複合体への補充へと導き、ヒスタミン放出の阻害をもたらすのであろうという仮説を立てる。
ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃεＲＩαを標的にするビスＦａｂを合成するために、ｃｙｓによる置換を軽鎖の位置１１０及び重鎖の位置１２１に有する親抗体の各々からチオＦａｂを生成した。我々はまた、ヒンジ領域に一つのｃｙｓのみを有する親抗体の各々からヒンジ-ｃｙｓ-Ｆａｂを生成した。これらのヒンジ-ｃｙｓ-Ｆａｂは組換えＤＮＡ法を用い、すなわち親抗体ＦａｂのＤＮＡ断片をサブクローニングし、それを大腸菌で発現させた後、精製することによって調製された。全ての組換えＤＮＡ法およびタンパク質精製法は、当業者に良く知られ、おおまかに上述された標準的手順であった。表３はチオ付着点を示し、各ビスＦａｂに対する固有の識別番号（括弧内）を与えるビスＦａｂ合成マトリックスを示す。
我々は以前に、ＦｃεＲＩαおよびＦｃγＲＩＩｂを発現するＲＢＬ細胞株変異体の生成を記述した (Jackmanら、J. Biol. Chem. 285:20850-20859 (2010))。我々は、ＦｃεＲＩαおよびＦｃγＲＩＩｂの両方発現するＲＢＬ細胞からのヒスタミン放出について、表３にリストされたビスＦａｂの各々の作用を試験した。細胞はビスＦａｂの各々の濃度を増加させて処置され、ヒスタミン放出はＥＬＩＳＡにより測定された。結果を図６Ａ-Ｂに示す。見られるように、異なるビスＦａｂは様々な活性を示した。強力なアンタゴニストのいくつかについて、阻害の最高活性値は３７０−１１０ｎｇ／ｍＬの濃度で観測された。恐らくはこれは最大数の阻害複合体が形成される濃度である。より高濃度では、ビスＦａｂの一つのアームがそのレセプターに結合し得、他方のアームは阻害複合体の別のレセプターを結合し得ない。これは、レセプターの２量体化が細胞内シグナルを作り出すために必要とされる場合、幾つかの２量体ホルモンが有する鐘形の活性曲線に類似している（例えばＶＥＧＦおよびそのレセプター）。更に、幾つかの分子は少しも阻害活性を示さなかったが、一つの分子は極端な阻害を示した。これらの結果を図６Ｂに示す。強い阻害を示さなかった４つの分子（１２９９、１３００、１３０１、１３０２）は、少なくとも一つの重鎖の１２１Ｃｙｓ結合を含む。最も強い阻害分子である１３０３はヒンジｃｙｓを介して両方のチオＦａｂに結合している。
実施例５ 修飾されたビスＦａｂ及びインビボ活性
上記ビスＦａｂの一つの特徴は、少なくとも一部は分子のＦｃ領域の欠損が原因である、予測されたインビボでの短い半減期である。所定のインビボでの適用において、ビスＦａｂが天然型抗体に類似した薬物動態学的特性を有することが望ましい。従って、我々は、ビスＦａｂの合成に使うための修飾された架橋剤を作る方法を考案した。以下に詳述されるように、そうした修飾架橋剤の使用は、インビボ半減期を改変するのに有用な試薬、例えば（限定されないが）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の添加を可能とする。更に、本明細書に記述されるように、修飾された架橋剤はイメージング又は検出剤として有用な試薬、例えば（限定されないが）蛍光標識、あるいは細胞傷害性薬物、例えば（限定されないが）モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、又は別の望ましい特性又は機能を持つ試薬、例えば（限定されないが）ｓｉＲＮＡの添加を可能とする。
修飾された架橋剤及び修飾されたビスＦａｂの合成
我々は、任意のスルフヒドリル反応性部分の付着を可能にする修飾された架橋剤を合成する方法を考案した。以下に、我々はＮ-サクシニミジル-Ｓ-アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）をビスマレイミドへ付着させ、所望の官能基を付着させる更なる反応に使用可能な保護されたＳＨ基を有するビスマレイミドアセチルチオアセテート（ＢＭａｔａ）を形成するための方法を記述する。我々は、Ｑｕａｎｔａ ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｐｏｗｅｌｌ，ＯＨから入手したビスマレイミドアミン（分子量５４６．６２）から開始した。六十マイクロモル（３２ｍｇ）が１００μＬのジメチルアミン（ＤＭＡ）に溶解され１ｍｌのアセトニトリルで希釈した。百三十マイクロモル（３１ｍｇ）ＳＡＴＡ（Ｎ-サクシニミジル-Ｓ-アセチルチオアセテート、分子量２３１．２３、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１ｍｌのアセトニトリルに溶解し、ビスマレミド溶液へ添加した。Ｈｅｐｅｓバッファー（カリウム塩、ｐＨ７．１、０．５Ｍ）が最終濃度０．１５Ｍに添加され、反応混合物は４℃で暗所で一晩インキュベートした。混合物は０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で４倍希釈され、その後１０ｘ２５０ｍｍのＣ４カラム上（Ｖｙｄａｃ) で、０．１％のＴＦＡ中で１５−５０％のアセトニトリル勾配により分離した。ビスマレイミドアセチルチオアセテート（分子量６６２．２９）（エレクトロスプレー質量分析法（Ａｇｉｌｅｎｔ ６２１０ ＴＯＦ）による評価）を含む分画がプールされ、真空遠心分離で乾燥させ、−２０℃で保存された。この修飾された架橋剤、ＢＭａｔａを合成する反応を図７Ａに示す。
ＢＭａｔａに結合することができる一つの試薬は、ＰＥＧであり、我々はインビボでの修飾されたビスＦａｂの半減期におけるその作用について調査した。我々は以下の手順に従って、続くＰＥＧとの反応のためＢＭａｔａを含むビスＦａｂを生成した。
ＥＧＦＲ（Ｈｅｒ１）（Ｃ３−１０１ チオＦａｂＶ１１０Ｃ）及びＨｅｒ２（トラスツズマブ（Ｈｅｒｃ）チオＦａｂＶ１１０Ｃ）を標的にするビスＦａｂの一つのロットがＢＭａｔａ架橋剤により生成された。およそ５００ｍｇの修飾されたビスＦａｂが、各チオＦａｂの５００ｍｇを出発物質として用いて合成された。チオＦａｂは大腸菌で発現され上述のように精製された。ビスＦａｂは、まず、ＢＭａｔａをトラスツズマブ チオＦａｂV110Cと化学反応させることにより合成した。複合体はゲル濾過で単離され、Ｃ３-１０１チオＦａｂＶ１１０Ｃと反応させ架橋された２重特異的ポリペプチドを生成した。最終の複合体は再びゲル濾過により単離され、上述のように、質量分析およびＳＤＳ−ＰＡＧＥで特性評価がなされた。
Ｂｍａｔａのマスクされたチオールのため（図７Ａ）、この架橋剤を用いて生成したビスＦａｂは、ヒドロキシルアミンによるブロッキング基の脱保護の後に、マレイミドを含むポリマーでペグ（ＰＥＧ）化に適している。これを行うため、ビスＦａｂはまず、各々約５０−６０ｍｇの複数のアリコートへ分けられた。各アリコートに対して、ｐＨ７．２のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の、１０分の１の体積の０．５Ｍのヒドロキシルアミン、２５ｍＭのＥＤＴＡが添加された。脱保護は、約２時間室温で進行した。ヒドロキシルアミンによる保護基の除去は、４２ダルトンの減少をもたらし、それは質量分析によるチオＦａｂの質量の変化により観察できる（データ非表示）。脱保護の後、ＰＥＧマレイミドの１：１モル等量がビスＦａｂアリコートへ添加され、２〜２０時間反応させた。これにより、ビスＦａｂを単一のＰＥＧを含有するより高分子量種へとほぼ完全なる変換をもたらした（データ非表示）。一般的な反応スキームを図７Ｂに示す。
ＢＭａｔａ架橋ビスＦａｂＣ３−１０１Ｖ１１０Ｃ／ＨｅｒｃＶ１１０Ｃから開始し、幾つか異なる大きさのＰＥＧポリマーが上述した合成反応で用いられ、様々な分子量のＰＥＧを運ぶペグ化したビスＦａｂを生成した。様々なＰＥＧポリマーをマレイミド誘導体として日油株株式会社（日本）から購入した。ＰＥＧ試薬との反応後、ペグ化したビスＦａｂは、２５ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ５．８、３００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ中、Ｓ−２００ゲル濾過で精製された。図８Ａは精製されたビスＦａｂのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。５つの異なる反応産物が、左から右に示される。左から順に、Ｎ-エチルマレイミド（ＮＥＭ）ｃａｐと反応したＢＭａｔａビスＦａｂ、次に線状ＰＥＧ鎖と反応したＢＭａｔａビスＦａｂで、それぞれ２ｋＤａ、１２ｋＤａ及び２０ｋＤａ、そして最後にマレイミド−アルブミン−結合ペプチド、ＡＢＰ、ｍａｌ−Ｈ、ＱＲＬＭＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤＦ（配列番号２４）と反応したＢＭａｔａビスＦａｂ。Nguyenら、Prot. Engineering, Design and Selection 19:291-97 (2006)。ビスＦａｂ-ＡＢＰは、ＡＢＰ部分を、血清アルブミンへの結合を増やすことでビスＦａｂの半減期を増大する手段としてのＰＥＧの代替として調べるために合成した。同文献参照。これらの５つの修飾されたビスＦａｂはゲル濾過クロマトグラフィーで分析され、大きく増加した流体力学的半径を有することが示された。２０ＫのＰＥＧ及び１２ＫのＰＥＧ含有ビスＦａｂ、及びＡＢＰ含有ビスＦａｂが、典型的なヒトＩｇＧ（保持時間２５．２分）よりも著しく速くＳ-２００ゲル濾過で溶出することが観測された（図８Ｂ）。我々は次に、マウスやヌードラットの両方にて、これら５つの修飾されたＣ３-１０１Ｖ１１０Ｃ／ＨｅｒｃＶ１１０ＣビスＦａｂの各々の薬物動態パラメータ（半減期を含む）を調べた。これらの実験及び結果は下記に詳述される。
ビスＦａｂの薬物動態
２つの別個の実験が、Ｃ３−１０１Ｖ１１０Ｃ／ＨｅｒｃＶ１１０Ｃ ビスＦａｂｓのインビトロでの血清半減期に関して、上述したＢＭａｔａ-ＰＥＧ又はＢＭａｔａ-ＡＢＰ修飾の作用を評価するために実施された。単一の５ｍｇ／ｋｇのＩＶボーラス投与がマウス又はヌードラットに投与され、血清に存在するビスＦａｂが最大１４日間分析された。個別のマウスが各データ点において用いられたが、ラットにおいては血清サンプルは実験期間中同一の動物から採取された。
ＥＬＩＳＡアッセイがマウス及びラットの血清中のインタクトな２重特異的ビスＦａｂを検出するために開発された。ＥＬＩＳＡの詳細は以下の通りである。
げっ歯類の血清中のビスＦａｂの濃度がＥＬＩＳＡを用いて決定された。簡潔には、
ＰＢＳ中で１μｇ／ｍｌに希釈されたＥＧＦＲ-Ｆｃ（ジェネンテック試薬）が３８４穴のＭａｘｉｓｏｒｂポリスチレンプレート(Ｎａｌｇａｔｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ カタログ番号４６４７１８)にコーティングされた。１６から７２時間後、被膜は取り除かれ、プレートはブロックバッファー（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／Ｐｒｏｃｌｉｎ ３００）で０．５から３時間ブロックされた。ビスＦａｂの標準物質の希釈（０．１５６から２０ｎｇ／ｍｌ）がアッセイバッファー（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／０．２５％ＣＨＡＰＳ／５ｍＭＥＤＴＡ／０．２％ＢＧＧ／０．３５ＭのＮａＣｌ／１５ｐｐｍのＰｒｏｃｌｉｎ３００）で調製された。サンプル（ラット又はマウスの血清を含むビスＦａｂ）はアッセイバッファー中へ最小希釈の１／１００まで希釈され、その後アッセイの範囲に８倍連続希釈された。ブロックされたプレートは洗浄バッファー（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０）で３回洗浄し、標準物質とサンプルが適切なアッセイウエルに添加された。１時間のインキュベーション後、プレートは洗浄バッファーで６回洗浄された。結合したビスＦａｂはビオチン標識化ＨＥＲ２ ＥＣＤ（ジェネンテック試薬のロット３９５７５−１５−ビオチン化がＮＨＳ-スクシンイミド（Succimide）化学（Ｂｉｏｔｉｎ-Ｘ-ＮＨＳ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｒｇａｎｉｃｓ １０５５４Ｂ−２）を用いて実施された。１時間のインキュベーション後、プレートは洗浄バッファーで６回洗浄され、コンジュゲートバッファー（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／１５ｐｐｍのｒｏｃｌｉｎ３００）中で１／４０，０００に希釈されたストレプトアビジン結合西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＲＰＮ１２３１）が全てのアッセイウエルに添加された。３０分のインキュベーション後、プレートは６回洗浄され、基質のＴＭＢ（ＫＰＬカタログ番号５０−６５−０２）が全てのアッセイウエルに添加された。基質反応は１５−２０分後に１Ｍのリン酸で停止させた。プレートは参照波長６２０ｎｍを用いて４５０ｎｍにて読み取られた。サンプル濃度は４つのパラメーターカーブフィッティングアルゴリズムを用い、結果を標準物質と比較することで決定した。
マウス及びラットの両方において、ＰＥＧのチオＦａｂへの添加は、分子のクリアランスの割合を減少させた（図９Ａ−Ｂ、表４）。２Ｋのペグ化は２つの要因によりクリアランスを減少させることが観察された（図９Ａ−Ｂ、表４）。２０ＫのＰＥＧを添加することで、チオＦａｂの半減期は３０−３５時間まで延長することができた（図９Ａ−Ｂ、表４）。これらの結果はビスＦａｂについて投与の範囲を達成することができ、分子のＰＫは、異なるニーズに適応するために、結合されたＰＥＧの大きさを変えることによって調節が可能であることを示している。ペグ化されてないビスＦａｂのクリアランスは、およそＦ(ａｂ')２にて期待されたものであり、２０Ｋのペグ化ビスＦａｂはＩｇＧに近い半減期とクリアランスを持っていた。更に、１２Ｋ-ビス-Ｆａｂと２０Ｋ-ビス-Ｆａｂとの間に半減期にほとんど相違は無く（図９Ａ−Ｂ、表４）、ＰＥＧが大きくなっても半減期を著しくは増大させ得ないことを示している。最後に、これらの実験において、ＡＢＰ-ビス-Ｆａｂ半減期は非修飾のビスＦａｂに対して有意には延長しなかった（図９Ａ−Ｂ、表４）。更なる薬物動態データが下記の表４に示される。
Ａｌｐｈａ_ＨＬ＝アルファ相の半減期；Ｂｅｔａ_ＨＬ＝ベータ相の半減期；ＡＵＣ＝最後の観測点に至る血清濃度−時間曲線の下の面積；ＣＬ＝クリアランス；Ｃｍａｘ＝投薬期間中に観察された最大濃度；Ｖｓｓ＝定常状態における分布容量；Ｎ／Ａ＝該当しない。
インビボ活性におけるビスＦａｂ
インビボでのマウス異種移植モデルでの研究のため、我々は以下のようにペグ化ビスＦａｂを構築した。我々はまず最初に、Ｈｅｒ２標的化チオＦａｂの２Ｃ４Ｖ１１０Ｃ、及びＥＧＦＲ（Ｈｅｒ１）標的化チオＦａｂのＤ１−５Ｖ１１０Ｃを含有するＢＭａｔａ架橋ビスＦａｂを生成した。このＭａｔａ架橋ビスＦａｂは次にヒドロキシルアミンと２０Ｋのｍａｌ-ＰＥＧの１：１分子等量で反応させてペグ化ビスＦａｂを生成した。そのペグ化ビスＦａｂを精製しＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図１０Ａ）。ペグ化ビスＦａｂはインビトロでのＣａｌｕ３細胞の増殖を阻害する能力について試験された。Ｃａｌｕ３細胞はＨｅｒ２及びＥＧＦＲの両方を発現することが知られている（データ非表示）。アッセイのために、ウエルあたり８５００細胞が播種され、２ｎＭのヘレグリンと５ｎＭのＴＧＦαで処置された。我々は次いでビスＦａｂ及び親抗体の濃度（図１０Ｂの横軸に示された濃度）を可変させてリガンド刺激による細胞増殖をブロックする能力について試験した。アラマーブルー（２５μＬ）が各ウエルに添加され３７℃で３−４時間インキュベートした。プレートは蛍光プレートリーダーで５４５／５９０ｎｍで読み取られた。細胞増殖の量は相対蛍光単位（ＲＦＵ）で直接的に、あるいはコントロールに対しる規格化によるかの何れかで報告された。図１０Ｂはこの実験においてペグ化ビスＦａｂがＣａｌｕ３増殖の強力な阻害剤であったことを示している。実際にそれは親抗体の２Ｃ４及びＤ１−５の何れよりも強力であった。
次に、我々はＳＣＩＤベージュマウスにおいて、２０ＫのＰＥＧ−２Ｃ４Ｖ１１０Ｃ／Ｄ１−５Ｖ１１０ＣビスＦａｂの薬物動態を評価した。Ｃ３−１０１Ｖ１１０Ｃ／ＨｅｒｃＶ１１０ＣビスＦａｂについて上述したように、類似のＥＬＩＳＡベースの捕捉アッセイが、血清中の分子の量を決定するために用いられた。図１１Ａは時間に対する血清濃度をプロットした結果を示し、図１１Ｂは時間に対する血清濃度／投与量をプロットした結果を示す。２０ＫのＰＥＧ-２Ｃ４Ｖ１１０Ｃ／Ｄ１-５Ｖ１１０ＣビスＦａｂは２０ＫのＰＥＧ-Ｃ３-１０１Ｖ１１０Ｃ／ＨｅｒｃＶ１１０ＣビスＦａｂよりも迅速に血清から除かれた（図１１Ａ−Ｂを図９Ａと比較）。宿主の交差反応性が２０ＫのＰＥＧ-２Ｃ４Ｖ１１０Ｃ／Ｄ１-５Ｖ１１０ＣビスＦａｂのより迅速なクリアランスの原因であると考えている。数値データが下の表５に提示され、この実験における２０ＫのＰＥＧ-２Ｃ４Ｖ１１０Ｃ／Ｄ１-５Ｖ１１０ＣビスＦａｂの比較的短い半減期を更に説明している。
＊２時間の時点はデータ解析から除かれた。
ＨＬ-ラムダ_ｚは、排出相に関連した半減期を参照し、ＣＬｏｂｓは観察されたクリアランスを参照し、ＡＵＣｉｎｆ−ｏｂｓは無限大に外挿する血清濃度−時間曲線下の観察面積を参照する。
我々は次に、ＳＣＩＤベージュマウスのＣａｌｕ３異種移植モデルにおいて、親抗体の２Ｃ４及びＤ１-５と比較した２０ＫのＰＥＧ-２Ｃ４Ｖ１１０Ｃ／Ｄ１-５Ｖ１１０ＣビスＦａｂの作用を調べた。我々は５００万のＣａｌｕ３細胞／マウスを注入し、続いて２０ＫのＰＥＧ-２Ｃ４Ｖ１１０Ｃ／Ｄ１-５Ｖ１１０ＣビスＦａｂ（５０ｍｇ／ｋｇ）、２Ｃ４（２５ｍｇ／ｋｇ）、又はＤ１-５（２５ｍｇ／ｋｇ）を毎日注入した。実験の期間中、腫瘍体積が一定期間ごとに測定された（時点は図１２に示される）。図１２に示された結果は、２０ＫのＰＥＧ-２Ｃ４Ｖ１１０Ｃ／Ｄ１-５Ｖ１１０ＣビスＦａｂが、各々の親抗体で観察された有効性に類似して、この濃度で腫瘍の増殖を遅延させる点で効果的であったことを示している。
我々は次いで、上述のＣａｌｕ３異種移植モデルにおいて腫瘍細胞増殖における２０ＫのＰＥＧ-２Ｃ４Ｖ１１０Ｃ／Ｄ１-５Ｖ１１０ＣビスＦａｂの作用を、親抗体の２Ｃ４（ペルツズマブ）及びＤ１-５と比較して、評価するために拡張した研究を実施した。まず、我々は、腫瘍が２倍の大きさになるために要する期間（２×Ｖｏ）として定められる腫瘍が成長するために要する期間、又は腫瘍体積の発達が見られない場合の生存期間を分析した。これらの実験を行うために、５００万のＣａｌｕ３細胞（ＨＢＳＳに懸濁）がＳＣＩＤベージュマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ｆａｃｉｌｉｔｙから入手したマウス）の皮下に接種された。親抗体の２Ｃ４及びＤ１-５が２５ｍｇ／ｋｇ（成分濃度は５ｍｇ／ｍｌ）で腹腔内（ＩＰ）に週１回４週間投薬された。２０ＫのＰＥＧ-２Ｃ４Ｖ１１０Ｃ／Ｄ１-５Ｖ１１０ＣビスＦａｂが５０ｍｇ／ｋｇ（成分濃度は７．５ｍｇ／ｍｌ）で腹腔内（ＩＰ）に２８日間毎日１回投薬された。全ての場合において、初回投与量は２倍の負荷投与量であった（すなわち、５０ｍｇ／ｋｇの２Ｃ４及びＤ１-５［成分濃度は１０ｍｇ／ｍｌ］、及び１００ｍｇ／ｋｇの２０ＫのＰＥＧ-２Ｃ４Ｖ１１０Ｃ／Ｄ１-５Ｖ１１０ＣビスＦａｂ［成分濃度は７．５ｍｇ／ｍｌ］）。
カプラン・マイヤー分析を図１３Ａに示し、一元配置分析を図１３Ｂに示す。次に、我々は、腫瘍が１５００ｍｍ３の体積に到達するのに要する期間として定められる腫瘍が成長するのに要する期間、又は腫瘍体積の発達が見られない場合の生存期間を分析した。カプラン・マイヤー分析を図１４Ａに示し、一元配置分析を図１４Ｂに示す。これらの研究の結果は２０ＫのＰＥＧ-２Ｃ４Ｖ１１０Ｃ／Ｄ１-５Ｖ１１０ＣビスＦａｂが処置用量にて腫瘍細胞増殖を阻害する点で効果的であり、親抗体の各々の有効性にちかずいていることを示している。従って、ここで記述された２重特異的抗体形式は、治療用分子の開発のための有用なプラットフォームである。
議論
Ｈｅｒ２は心臓、***、および神経組織の正常な発達および細胞増殖に関与しており、他の臓器系の発達に関連している。Falls, D. L.ら、Exp Cell Res 284(1):14-30 (2003);Casalini, P.ら、J Cell Physiol 200(3):343-50 (2004); Negro, A.ら、Recent Prog Horm Res 59:1-12 (2004); Britsch, S. Adv Anat Embryol Cell Biol 190:1-65 (2007)。最も特記すべきは乳癌細胞増殖におけるＨｅｒ２の過剰発現の関与、及びハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）の恩恵を受けるであろう乳癌患者を同定するための診断マーカーとしてのＨｅｒ２の過剰発現の用途である。Lee, K. F.ら、Nature 378(6555):394-8 (1995); Erickson, S. L.ら、Development 124(24):4999-5011 (1997); Britsch, S.ら、Genes Dev 12(12):1825-36 (1998); Morris, J. K.ら、Neuron 23(2): 273-83 (1999); Woldeyesus, M. T.ら、Genes Dev 13(19):2538-48 (1999); Lin, W.ら、Proc Natl Acad Sci U S A 97(3):1299-304 (2000); Park, S. K.ら、J Cell Biol 154(6):1245-58 (2001); Leu, M.ら、Development 130(11):2291-301 (2003); Brufsky, A. Am J Clin Oncol. Aug. 11, 2009 (EPub PMID: 19675448)。ハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）は、レセプターの膜貫通領域近傍の細胞外部分の第４番目のドメインに結合するモノクローナル抗体である。(Cho, H. S.ら、Nature 421(6924):756-60 [2003])。Ｈｅｒ２は細胞増殖と分化に寄与する４つのレセプターのファミリーの一員であり、病気の治療の標的でもある(Casalini, P.ら、J Cell Physiol 200(3):343-50 [2004])。複数のレセプターの協調的な作業がしばしば腫瘍細胞の増殖を牽引を担っている(Yarden, Y.ら、Nat Rev Mol Cell Biol 2(2):127-37 (2001); Lee-Hoeflich, S. T.ら、Cancer Res 68(14): 878-87 [2008])。この点において、複数の受容体の活性の中和が、ある種の癌の特に効果的な治療法を与えるために望まれ得る。そのような分子の構築と設計への一つの方法は、２重特異的抗体技術を使用することであり、それによって単一の抗体分子が２つの固有のモノクローナル活性を有する。(Drakeman, D. L.ら、Expert Opin Investig Drugs 6(9):1169-78 (1997); Kontermann, R. E. Acta Pharmacol Sin 26(1):1-9 (2005); Chames, P.ら、Curr Opin Drug Discov Devel 12(2):276-83 [2009])。我々は、そうした分子をスクリーニングし、かつ単一抗体又は抗体の組合わせ以上に増加した有効性を与え得るものを探索するための手段として少なくとも一部が本明細書に記されるビスＦａｂ技術を開発した。我々は、ビスＦａｂの合成プロセスは、二重特異性分子を生成するために、堅牢かつシンプルな方法であることを本明細書で実証してきた。我々は、一般に、ビスＦａｂ分子が両方の親抗体の組み合わされた生物学的活性を有することを特定した。我々は、分子の一価構造による可能性がある、いくつかのビスＦａｂに対する細胞表面親和性のわずかな低下を観察した。しかし、これは多くの方法で相殺することができる。例えば、一つの細胞の表面で２つのレセプターを標的にするビスＦａｂを合成することができ、同じレセプターの２つのドメインが標的となり得、あるいは一価のＦａｂ親和性を増加させることができる。本明細書に記載されたマトリックスアプローチを用いて、Ｈｅｒ２及びＥＧＦＲを標的とする一組のビスＦａｂの合成により、様々なアッセイに十分な量で高純度な分子を得た。細胞ベースのアッセイでビスＦａｂを用いて、我々は幾つか固有の活性を観察した。例えば、ビスＦａｂ１１９１は、特徴的でない急な阻害カーブを持つ細胞増殖の強力な阻害を示した（図２Ｃ）。この分子の興味深い態様は、Ｈｅｒ２の２つの異なるドメインを同時に結合することである。ビスＦａｂの２Ｃ４アームはＥＣＤのドメインＩＩを標的とし、ビスＦａｂのＨｅｒｃアームはドメインＩＶを標的とする(Franklin, M. C.ら、Cancer Cell 5(4):317-28 (2004); Schmitz, K. R.ら、Exp Cell Res 315(4):659-70 [2009])。そのカーブは協同的に見え、同一標的の２つのドメインを結合する分子に特有である作用機構を指している可能性がある。そのような分子は、所定の治療用設定において、単一抗体又は２つの別個のモノクローナル抗体の組合わせ以上に有効性における有利さを与え得る。しかし、その他より目立った知見は、お互い結合しビスＦａｂ１１８８を形成するトラスツズマブ チオＦａｂについてであった。この場合、ビスＦａｂは、Ｆｃ部分を欠き、Ｆａｂが天然のヒンジのジスルフィド結合とは異なる部位で共有結合していることを除いて、単一親抗体に構造的に似ている。ビスＦａｂ１１８８、Ｈｅｒｃ ＬＣ１１０Ｃｙｓ−Ｈｅｒｃ ＬＣ１１０Ｃｙｓは、細胞増殖に予期せぬ上昇を示し、強いアンタゴニストの代わりにアゴニストとして作用した（図２Ｆ）。これは驚くべきことであって、その理由は、その活性が構造的に似た親抗体とは逆であっただけでなく、Ｈｅｒ２を過剰発現するＢＴ４７４細胞の細胞増殖がリガンド依存的ではなく、基底状態で最大限に刺激されると考えられるからである。更に。２つの２Ｃ４Ｆａｂを一緒に結合する別のビスＦａｂは親抗体に似た活性を有していた（図２Ｅ）。理論に拘束されることなく、異なる抗体由来のＦａｂの異なる作用機構は、ビスＦａｂで観察された異なる結果を説明する可能性ある。２Ｃ４はドメインＩＩに結合し、Ｈｅｒ２のそれ自身及び他のＨｅｒファミリーメンバーとの２量体化を阻害するが、トラスツズマブは、ドメインＩＶが２量体化ドメインではないため、異なった複合体形成に影響を与えるように見える。トラスツズマブエピトープは、抗体が、２つのキナーゼドメインの配向を生じさせる膜貫通領域の配向に著しい影響を及ぼし得る場所である、膜貫通領域に極めて近接している(Cho, H. S.ら、Nature 421(6924):756-60 [2003])。キナーゼの活性部位とのアロステリックな相互作用又は別の直接的な相互作用は、抗体もしくはビスＦａｂが、非常に接近した２つのレセプター分子へ結合することにより影響され得る(Bocharov, E. V.ら、J Biol Chem 283(11):6950-6 (2008); Schmitz, K. R.ら、Exp Cell Res 315(4):659-70 [2009])。
１１８８ビスＦａｂはハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）の構造類似体であるため、我々は、結合付着部位を変えることでこれらの分子の機能を変化させるかどうかを更に調べた。我々はまた、異なる起源から調製されたビスＦａｂの作用を調べた。我々は、ペプシンにより消化後の天然型抗体のヒンジ領域を用いて良好な結果を得ることが可能であることを示した。このことは、分子の変異体（システイン改変された）形態を生じることなく、任意の抗体起源をビスＦａｂを構築する開始点として使用することを可能とする。もちろん、チオ付着点はヒンジ領域に限定されるため、所定の構造変異体のみが生成され得る。我々はまた、良好な結果はリジン-Ｃによるタンパク質消化で調製したチオＭａｂ由来のチオＦａｂを用いて得られ得ることを示した。更に、組換えチオＦａｂが構築され、大腸菌で発現され、精製され、良好な結果を同様にもたらすビスＦａｂを作成するために首尾良く用いられた。従って、これらの方法は新規なビスＦａｂの合成及び発見について一般的な機会を与える。
ＨｅｒｃビスＦａｂの結合を変化させることに対する我々の研究は、強力なアゴニスト、アンタゴニスト、及び細胞増殖にほとんど影響を示さない分子にわたる活性の完全なスペクトルを識別することへと導いた。従って、それは、親抗体とは異なる活性を持つ分子を同定することを可能にするであろう。以前に、抗体のヒンジ領域の変化が抗体機能に影響を与えることが示された(Dillon, T. M.ら、J Biol Chem 283(23):16206-15 [2008])。望むべき活性（活性化であろうと抑制性であとうと）を持った抗体を同定すること、又は様々な活性のレベルを持つ抗体を同定することがいつも可能というわけではない。従って、ビスＦａｂ結合変異体は、望まれる活性を更に操作するアプローチを提供している。更に、抗ＣＤ２０抗体についての以前の研究は、抗体がエピトープと相互作用する様式におけるわずかな変化が機能に影響を与え得ることを示した(Ernst, J. A.ら、Biochemistry 44(46):15150-8 [2005])。依って、典型的な抗体改変プログラムは、より強力で、効果的な治療の候補分子を作るのに役立つ、Ｆａｂの共有結合性会合を包むために拡張され得る。
我々はまた、ビスＦａｂアゴニスト１３２５及び１１８８の所定の物理的特性及び生物化学的特性を、強力なビスＦａｂアンタゴニストである、１３２９、及びハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）と比較して調べた。我々は、アゴニストとアンタゴニストの間でＢＴ４７４細胞の表面上のレセプター結合部位の数に違いを見いださなかった。更に、スキャッチャード分析で特定されるように、細胞表面に対する分子の親和性に相違は無かった。そのｋＤは両方の型の分子についておよそ３ｎＭであった。我々はまた、分子量、ゲルろ過による保持、及び分子の各々の流体力学的半径を評価したが、再び我々はこれらの物理的性質には大まかな違いを観察しなかった。ＳＥＣ−ＭＡＬＳ解析による大きな流体力学的半径を有するアゴニスト分子に対する軽微な傾向がみられた；しかしながら観測された違いは誤差の範囲内であった。構造の１つの大きな分析的な差異はＳＤＳ−ＰＡＧＥで観察され、これらの分子は、分子量がほぼ同じであり、ゲル上で大きな泳動の違いを示した。ＳＤＳ-ＰＡＧＥの変性条件は、我々の溶液状態での分析とは相関しなかった。例えば、最強のアゴニストである１３２５は、強いアンタゴニストの１３２４に類似し、両極端の間で泳動したため、ゲルで観察された違いは、活性に関連したパターンを明らかしなかった。これらの分子における一つの大きな相違は、お互いに対するＦｖ領域の配向である。これは、分子間の異なる活性を説明することができる。今回の分析は予測的構造−機能のパターンを明らかにしなかったが、構造−機能のより詳細な研究が、活性相関の理解に対する３次元モデリングアプローチの設計を可能としうる。現時点では、任意の抗体又は抗体の組合わせの機能的変異体は、本明細書に記載の合成マトリックス方法及び目的とする抗体（ｉｅｓ）について利用可能な機能的活性アッセイにもとずいた経験的な方法を用いて容易に同定され得る。トラスツズマブ チオＦａｂの組合わせマトリックスに由来する最強のアゴニスト、１３２５を用いて、我々は、細胞増殖シグナルの伝播に関与するシグナル伝達経路を調査した。シグナル伝達経路を試験するため、最近報告された、トラスツズマブの活性についてよく特徴付けられた分析にとりかかった。ここでは、トラスツズマブはＨｅｒ２を過剰発現する細胞でＨｅｒ２とＨｅｒ３の相互作用を阻害することが示されている(Junttila, T. T.ら、Cancer Cell 15(5):429-40 [2009])。これらの２つのレセプターは、基底状態においてＰＩ３Ｋを補充し活性化する複合体で存在する。このキナーゼの活性化はシグナル伝達の鍵となるキナーゼ、ＡＫＴのリン酸化及び活性化をもたらす。上記の我々の実験において、ＡＫＴはアゴニストのビスＦａｂ１３２５で処置された細胞内で非常に高いレベルでリン酸化された。これは我々が予想したものであり、Ｈｅｒ２について知られた細胞増殖シグナル伝達経路に一致する。予期せず、違ったことは、Ｈｅｒ３のリン酸化レベルがアゴニストの添加で変化しなかったことであった。実は、２時間の時間経過のあいだ、Ｈｅｒ３のリン酸化チロシンのレベルに均一にわずかな減少があるようであった。これは、アゴニストがＡＫＴの活性を刺激するために、Ｈｅｒ２／Ｈｅｒ３相互作用を回避している可能性を示している。これはＨｅｒ２のリン酸化状態を直接変えることで成し遂げられるであろう。我々は、レセプターの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）の個々のリン酸化ペプチドを調べるために、Ｈｅｒ２のリン酸化状態を質量分析で探索した。第一に、我々はＢＴ４７４細胞で基底状態にあるリン酸化された複数のペプチドを同定した。次に我々は、トラスツズマブ処置又は１３２５アゴニスト処置の何れかに応答したＨｅｒ２のリン酸化パーセンテージを調べた。我々は全体で、これらのリン酸化部位の幾つかはアゴニストに対する応答で変化したが、トラスツズマブへの応答では変化しなかったことを観察した。アゴニストはレセプターを更に活性化するが、この活性化はＨｅｒ３のリン酸化の増加をもたらさないように見える。このことはわずかに異なる活性化複合体がシグナルを伝搬している可能性を示しており、ビスＦａｂ１３２５は、Ｈｅｒ３又はリガンドの欠損下においてさえもＨｅｒ２を活性化するために有益であり得ることを示唆している。
従って、Ｈｅｒ２の活性化が有効であり得る可能性のある治療領域を調べた。ハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）と心臓組織の健康状態の関連が実証されている。Chien, K. R. N Engl J Med 354(8):789-90 (2006); Perik, P. J.ら、Eur J Heart Fail 9(2):173-7 (2007); Suter, T. M.ら、J Clin Oncol 25(25):3859-65 (2007)。ハーセプチン(登録商標)(トラスツズマブ)治療の間、心臓毒性が発生する可能性がある。特定の化学療法薬、例えば、アントラサイクリンの存在下で、ハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）処置の間の心臓毒性が発生が著しく上昇することが示されている(Morris, P. G.ら、Breast Cancer Res Treat DOI 10.1007/s10549-008-0172-5 (2008); Popat, S.ら、Nat Clin Pract Oncol 5(6):324-35 [2008])。アントラサイクリンだけで心臓毒性を引き起こし、心筋症およびうっ血性心不全をもたらすことが良く知られている(Annals of Internal Medicine 125(1):47-58 [1996])。アントラサイクリン及びハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）の組合わせに関連した障害は、障害を受けた心臓組織の自然な回復過程における正常なＨｅｒ２の機能が破壊されていることによる可能性がある。従って、我々はハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）で処置された患者の心臓組織で時々観察される作用のためと推論し、Ｈｅｒ２の活性は心臓細胞増殖と関係する可能性があるため(Freedman, N. J.ら、J Am Coll Cardiol 48(7):1448-50 [2006])、Ｈｅｒ２アゴニストは心臓疾患患者のためになり得ることが可能である。近年、前の定説に反して、心筋細胞は、成人の人生の過程で増殖し続けていることが決定的に示された(Bergmann, O., R.ら、Science 324(5923):98-102 (2009); Bersell, K., S.ら、Cell 138(2):257-70 (2009); Doggen, K.ら、J Mol Cell Cardiol 46(1):33-8 [2009])。従って、トラスツズマブ由来アゴニストのビスＦａｂ分子（例えばビスＦａｂ１３２５）は、増殖する成人の心筋細胞においてＨｅｒ２を活性化し得、よって所定の型の心臓疾患の治療のための治療法の先例をもたらすと提案する。
他のいくつかの種類の細胞、組織、細胞のプロセスもまたＨｅｒ２及び他のＨＥＲファミリーメンバーの活性化に依存している。これらのレセプターは、多くの重要なシグナル伝達機能が観察されているリガンドのニューレグリンファミリーによって活性化される。これらの細胞型、組織及び工程は、筋細胞、心筋細胞、シュワン細胞、オリゴデンドロサイト、神経筋シナプス、頭蓋感覚神経、運動及び感覚神経、末梢及び脳神経、交感神経細胞、皮質ニューロン前駆細胞、小脳顆粒細胞、視床下部、副交感神経組織、海馬、心臓組織、心臓弁の発達、房室中隔、増殖、心筋細胞の修復及び生存、血管新生、肺上皮の発達、筋形成、生殖腺形成、胃上皮細胞の増殖を含む。Falls, D. L. Exp Cell Res 284(1):14-30 (2003); Falls, D.L. J. Neurocytol. 32(5-8):619-47 (2003); Britsch, S. Adv Anat Embryol Cell Biol 190:1-65 (2007)。従って、これらの細胞型はＨｅｒ２アゴニストの更なる可能性のある標的である。更に、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＣＳ）の維持と分化は、Ｈｅｒ２の活性に依存し、Ｈｅｒ２アゴニスト分子の別の重要な適用を与え得る(Jones, F. E.ら、Oncogene 18(23):3481-90 (1999); Leone, F., E.ら、J Leukoc Biol 74(4):593-601 (2003)。
我々はまた、更なる分子標的へのビスＦａｂを構築することで、この技術が一般に適用可能かどうかを調べた。我々はＦｃγＲＩＩｂおよびＦｃεＲＩαを標的にするビスＦａｂを合成し、ＦｃεＲＩαおよびＦｃγＲＩＩｂの両方を発現するＲＢＬ細胞からのヒスタミン放出について、各々の作用を試験した。結果は、異なるビスＦａｂは様々な活性を示すことを表わした。
更に我々は、ビスＦａｂの合成における使用のための修飾された架橋剤を作る方法を記載した。我々は、そのような修飾された架橋剤が、インビボで半減期を修飾するために有用な試薬、例えばＰＥＧの添加に有用であることを示した。我々はまた、ビスＦａｂ含有ＰＥＧが、ＰＥＧを欠くビスＦａｂに比べて、インビボ血清半減期を向上させることを示した。最後に、インビボマウス異種移植モデルを用いて、我々はビスＦａｂ含有ＰＥＧが、固形腫瘍を標的とする治療の候補としての可能性を立証する腫瘍細胞増殖の阻害に効果的であることを示した。
我々がビスＦａｂと命名した抗体様分子の合成について、本明細書に記載されたこの新しいアプローチは、分子治療の設計及び基礎研究の支援において有用な新しいツールとなることができる。スクリーニング法として、この技術は例えば、所定の適用のために最も有用な２重特異性の抗体結合を同定するために、若しくはレセプターシグナル伝達経路を探索するツールとして適用できる。それはまた、検出のために迅速かつ確実に分子を生産するために有用であり、そして、別の方法では天然免疫グロブリンの構造で可能ではない広範囲の活性を作り出す新しい機会を提供する。
本発明は、本発明の幾つかの態様の実例として意図された実施例に開示された特定の実施態様による範囲内に限定されるものではなく、機能的に同等である任意の実施態様は、本発明の範囲内にある。実際に、本明細書に示され記載されたものに加えて、本発明の様々な改良が当業者には明らかになり、添付の特許請求の範囲の範囲内に入ることを意図している。

Claims (30)

  1. 多重特異性抗体のパネルを合成する方法であって、第一の単一特異性及び遊離スルフヒドリル基を有する第一の親抗体から得られた第一の抗体断片を、チオ-反応性架橋剤と反応させて、抗体断片−架橋剤部分を生成し、抗体断片−架橋剤部分を、各々が遊離スルフヒドリル基を有する、第一の抗体断片とは異なる単一特異性の、一又は複数の第二の親抗体から得られた三又はそれ以上の付加的抗体断片の各々と対で反応させ、多重特異性抗体のパネルを生成し、付加的抗体断片の各々の遊離スルフヒドリル基が少なくとも三つの異なる位置にあり、
    親抗体の各々が、細胞表面レセプターに結合する、方法。
  2. 第一の親抗体が抗Ｈｅｒ１、抗Ｈｅｒ２、抗ＦｃεＲＩα及び抗ＦｃγＲＩＩｂから選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 第一の親抗体が抗Ｈｅｒ２であり、第二の親抗体が抗Ｈｅｒ１であり、又は第一の親抗体が抗Ｈｅｒ１であり、第二の親抗体が抗Ｈｅｒ２であり、又は第一の親抗体が抗ＦｃγＲＩＩｂであり、第二の親抗体が抗ＦｃεＲＩαであり、又は第一の親抗体が抗ＦｃεＲＩαであり、第二の親抗体が抗ＦｃγＲＩＩｂである、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 第一の抗体断片が抗Ｈｅｒ２から得られ、三又はそれ以上の付加的抗体断片の各々が抗Ｈｅｒ１から得られ、又は第一の抗体断片が抗Ｈｅｒ１から得られ、三又はそれ以上の付加的抗体断片の各々が抗Ｈｅｒ２から得られ、又は第一の抗体断片が抗ＦｃεＲＩαから得られ、三又はそれ以上の付加的抗体断片の各々が抗ＦｃγＲＩＩｂから得られ、又は第一の抗体断片が抗ＦｃγＲＩＩｂから得られ、三又はそれ以上の付加的抗体断片の各々が抗ＦｃεＲＩαから得られる、請求項１又は２に記載の方法。
  5. 抗体アナログのパネルを合成する方法であって、遊離のスルフヒドリル基を有する第一の抗体断片をチオ反応性架橋剤と反応させて、抗体断片−架橋剤部分を生成し、抗体断片−架橋剤部分を遊離のスルフヒドリル基を各々が有する二又はそれ以上の付加的抗体断片の各々と対で反応させて、単離された抗体アナログのパネルを生成し、抗体断片の各々が単一の親抗体から得られ、付加的抗体断片の各々の遊離スルフヒドリル基が少なくともふたつの異なる位置にあり、
    親抗体が、細胞表面レセプターに結合する、方法。
  6. 親抗体が抗Ｈｅｒ１、抗Ｈｅｒ２、抗ＦｃεＲＩα及び抗ＦｃγＲＩＩｂから選択される、請求項５に記載の方法。
  7. 抗Ｈｅｒ２がトラスツズマブ及びペルツズマブから選択される、請求項２、３、４、及び６の何れか一項に記載の方法。
  8. 第一の親抗体が抗Ｈｅｒ２であり、及び第一の抗体断片が配列番号１、２、３、６及び７から選択される軽鎖配列、及び配列番号４、５及び８から選択される重鎖配列を含む、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
  9. 親抗体が抗Ｈｅｒ２であり、第一の抗体断片及び付加的抗体断片が同じ軽鎖配列及び同じ重鎖配列を含み、軽鎖配列が配列番号１、２、３、６及び７から選択され、重鎖配列が配列番号４、５及び８から選択される、請求項５に記載の方法。
  10. 抗Ｈｅｒ１がＤ１-５及びＣ３-１０１から選択される、請求項２、３、４、及び６の何れか一項に記載の方法。
  11. 第一の親抗体が抗Ｈｅｒ１であり、及び第一の抗体断片が配列番号１８、１９、２１、及び２２から選択される軽鎖配列、及び配列番号１７及び２０から選択される重鎖配列を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
  12. 親抗体が抗Ｈｅｒ１であり、第一の抗体断片及び付加的抗体断片が同じ軽鎖配列及び同じ重鎖配列を含み、軽鎖配列が配列番号１８、１９、２１、及び２２から選択され、重鎖配列が配列番号１７及び２０から選択される、請求項６に記載の方法。
  13. 抗ＦｃγＲＩＩｂが５Ａ６である、請求項２、３、４、及び６の何れか一項に記載の方法。
  14. 第一の親抗体が抗ＦｃγＲＩＩｂであり、及び第一の抗体断片が配列番号１１及び１２から選択される軽鎖配列、及び配列番号９及び１０から選択される重鎖配列を含む、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
  15. 親抗体が抗ＦｃγＲＩＩｂであり、第一の抗体断片及び付加的抗体断片が同じ軽鎖配列及び同じ重鎖配列を含み、軽鎖配列が配列番号１１及び１２から選択され、重鎖配列が配列番号９及び１０から選択される、請求項６に記載の方法。
  16. 抗ＦｃεＲＩαが２２Ｅ７である、請求項２、３、４、及び６に記載の方法。
  17. 第一の親抗体が抗ＦｃεＲＩαであり、及び第一の抗体断片が配列番号１５及び１６から選択される軽鎖配列、及び配列番号１３及び１４から選択される重鎖配列を含む、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
  18. 親抗体が抗ＦｃεＲＩαであり、第一の抗体断片及び付加的抗体断片が同じ軽鎖配列及び同じ重鎖配列を含み、軽鎖配列が配列番号１５及び１６から選択され、重鎖配列が配列番号１３及び１４から選択される、請求項６に記載の方法。
  19. チオ反応性架橋剤がビスマレイミド、ビス-アルキルハロゲン化物、ピリジルジスルフィド、ビス-水銀塩、５-チオ-２-ニトロ安息香酸媒介架橋剤、及びビス-チオスルホン酸塩から選択される、請求項１から１８の何れか一項に記載の方法。
  20. チオ反応性架橋剤がビスマレイミドである、請求項１から１９の何れか一項に記載の方法。
  21. 第一の抗体断片、及び／又は付加的抗体断片の各々がシステイン改変抗体から得られる、請求項１から２０の何れか一項に記載の方法。
  22. システイン改変抗体が軽鎖の位置１１０又は位置２０５に置換を含み、残基の番号付けはＥＵ番号付けシステムに従い、該置換がシステインである、請求項２１に記載の方法。
  23. システイン改変抗体が重鎖の位置１１８又は位置１２１に置換を含み、残基の番号付けはＥＵ番号付けシステムに従い、該置換がシステインである、請求項２１又は２２に記載の方法。
  24. 第一の抗体断片、及び／又は付加的抗体断片の各々が天然型抗体から得られ、天然型抗体がペプシンで消化されてＦ(ａｂ')２断片を生成し、Ｆ(ａｂ')２断片が精製され、還元剤で処置された後、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の間にジスルフィドが再形成され、ヒンジ領域のシステイン残基は非酸化のままである条件下で酸化剤により処理される、請求項１から２３の何れか一項に記載の方法。
  25. 架橋剤が保護されたＳＨ基を含む修飾された架橋剤である、請求項１から２４の何れか一項に記載の方法。
  26. 修飾された架橋剤がビスマレイミドアセチルアセテート（ＢＭａｔａ）である、請求項２５に記載の方法。
  27. 修飾された架橋剤を含む抗体が官能基を含む薬剤と更に反応する、請求項２５又は２６に記載の方法。
  28. 薬剤がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルブミン結合ペプチド（ＡＢＰ）、蛍光タグ、放射性イメージング剤、細胞傷害性薬剤、及びｓｉＲＮＡから選択される、請求項２７に記載の方法。
  29. 薬剤がＰＥＧであり、該ＰＥＧが２０００ｍｗ（２Ｋ）ＰＥＧ、１２，０００ｍｗ（１２Ｋ）ＰＥＧ、及び２０，０００ｍｗ（２０Ｋ）ＰＥＧから選択される、請求項２７又は２８に記載の方法。
  30. 付加的抗体断片の各々の遊離スルフヒドリル基が、軽鎖の位置１１０、軽鎖の位置２０５、重鎖の位置１１８、重鎖の位置１２１、及びヒンジ領域の位置からなる群から選択される位置にある、請求項１又は５に記載の方法。
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