CN109963596B - 长效多特异性分子和相关方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及多特异性分子，如长效多特异性抗体。还公开了相关的方法。

Description

长效多特异性分子和相关方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年10月17日提交的美国临时申请62/408,865的优先权。该申请的内容以其整体在此引入作为参考。
技术领域
本发明主要涉及多特异性分子，特别是，涉及长效多特异性抗体和制备并使用长效多特异性结合分子的方法。
背景技术
多特异性分子，例如双特异性单克隆抗体(BsAb)，是由两个或更多个不同分子(例如单克隆抗体或其抗原结合部分)组成的人工蛋白质或缀合物。双特异性抗体结合两种不同类型的靶标(例如抗原)并可用于治疗特定疾病。双特异性抗体的临床开发始于90年代早期(Canevari,S.等人1995，J.Hematother 4，423-427；Valone，F.H.等人1995，J.Clin.Oncol.13，2281-2292)。直到十年后，第一种双特异性抗体“卡妥索单抗”(商品名Removab)才于2009年被欧洲药品管理局(EMA)批准在欧洲商业使用。第二种双特异性抗体“博纳吐单抗”(商品名Blincyto)在2014年获得美国FDA批准。双特异性抗体已通过以下制备：通过基于两种不同杂交瘤细胞系的体细胞融合的四源杂交瘤(quadroma)技术(Milstein，C.等人1983，Nature，305(5934)：p.537-40)或化学缀合两种不同的单克隆抗体或抗体片段(Brennan，M.，等人，1985Science，229(4708)：p.81-3；Glennie，M.J.，等人，1987J Immunol，139(7)：p.2367-75)或最近的重组和融合技术。然而，制备重组双特异性抗体的挑战是将这种有希望的治疗剂带给患者的巨大障碍(Klein C.等人，2012，MAbs.4(6)：653-663)。此外，这些分子中的一些的较短半衰期也严重限制了它们进一步进入临床。此外，在一些疾病应用中，例如实体肿瘤应用，这些分子中的一些要么太大而不能深入渗透到肿瘤组织中，要么在肿瘤组织中的保留时间有限(Thurber，G.M.等人，2007，J.NuclearMedicine.48(6)：995-999；Minchinton，A.I.等人2006，Nature Reviews Cancer.6：583-592)，其导致较差的治疗结果。因此，需要新的长效双特异性分子和相关的制备方法。
发明内容
本发明通过提供多特异性分子和相关方法解决了上述未满足的需求。
在一方面，本发明提供式Ia
Figure BDA0002029096750000021
的多特异性分子、缀合物或化合物，其中P为非免疫原性聚合物；T为三官能小分子接头部分且具有一个、两个或更多个能与两种不同的蛋白质进行位点特异性缀合的官能团；且A1和A2为任意两种不同或相同的蛋白质。
特别地，本发明一方面提供式Ib的缀合物:
Figure BDA0002029096750000022
其中:
P为非免疫原性聚合物；
B为H、封端基团或不存在，所述封端基团选自C1-50烷基和芳基，其中所述烷基的一个或多个碳可被杂原子替代；
T为具有一个、两个或更多个官能团的多官能接头，其中T和(L1)a之间的连接以及T和(L2)b之间的连接可相同或不同；
L1和L2各自独立地为双官能接头；
a和b各自为选自0-10的整数；
A1和A2可为任何两个不同或相同的蛋白质。例如，A1和A2彼此不同且A1和A2各自独立包括抗体片段、单链抗体或任何其它抗原结合部分或其组合；或A1和A2相同且都为多特异性抗原结合蛋白；且
y为选自1-10的整数。
至少一种蛋白质包括识别结合部分。例如，A1包括第一识别结合部分且A2包括第二识别结合部分。两种不同的蛋白质可为两种不同的抗体或其抗原结合部分。在一个实例中，所述两种抗体分别为结合至细胞毒性细胞上的受体的抗CD3抗体和结合至癌细胞受体的抗CD19抗体。该两种抗体可为单链抗体(SCA或scFv)。
非免疫原性聚合物可选自聚乙二醇(PEG)、葡聚糖、基于碳水化合物的聚合物、聚环氧烷、聚乙烯醇、羟丙基-甲基丙烯酰胺(HPMA)及其共聚物。优选地，非免疫原性聚合物为PEG，如支链PEG或直链PEG或多臂PEG。在那种情况下，直链PEG或支链PEG的至少一个末端用H、甲基或低分子量烷基封端。PEG的总分子量可以是3,000至100,000，例如5,000至80,000、10,000至60,000和20,000至40,000。PEG可以通过永久键或可裂解键与多官能部分连接。
在(L1)a或(L2)b内或(L1)a和蛋白质A1之间或(L2)b和蛋白质A2之间形成连接的官能团(例如，两个位点特异性缀合官能团)可选自巯基、马来酰亚胺、2-吡啶基二硫基(2-pyridyldithio)变体、芳族砜或乙烯基砜、丙烯酸酯、溴代或碘代乙酰胺、叠氮化物、炔烃、二苯并环辛炔(DBCO)、羰基、2-氨基-苯甲醛或2-氨基-苯乙酮基团、酰肼、肟、酰基三氟硼酸钾、O-氨基甲酰基羟胺、反式-环辛烯、四嗪、三芳基膦等。
在一些实施方案中，(L1)a和(L2)b之一可包含由叠氮化物和炔烃形成的连接。(L1)a和(L2)b中另一个可包含由马来酰亚胺和巯基形成的连接。在一些实例中，炔烃可为二苯并环辛炔(DBCO)。在其他实例中，T为赖氨酸，P为PEG，且y为1，而炔烃为二苯并环辛炔(DBCO)。在一些实施方案中，A1和A2之一可衍生自叠氮化物标记的抗体、抗体链、抗体片段或单链抗体，其中所述叠氮化物在各自的(L1)a或(L2)b中缀合至炔烃；A1和A2中另一个可衍生自巯基标记的抗体、抗体链、抗体片段或单链抗体，其中所述巯基在各自的(L1)a或(L2)b中缀合至马来酰亚胺。
上述多特异性分子或化合物可以根据包括以下的方法制备：(i)制备具有末端双官能团的非免疫原性聚合物，所述末端双官能团能够与两种不同的蛋白质或其修饰形式进行位点特异性缀合；和(ii)逐步地将非免疫原性聚合物与两种不同蛋白质或其修饰形式进行位点特异性缀合，以形成式Ia或Ib化合物。在一些实例中，在制备步骤之前，可首先用小分子接头修饰蛋白质。
本发明还提供药物制剂，其包含上述多特异性分子或化合物以及药学上可接受的载体。本发明进一步提供在需要的受试者中治疗疾病的方法，其包括给药有效量的上述多特异性分子或化合物。
在下面的描述中阐述了本发明的一个或多个实施方案的细节。根据说明书和权利要求，本发明的其他特征、目的和优点将显而易见。
附图简述
图1A示意性地说明制备实施例1(化合物2、3、4、5、6)中所述的30kmPEG-Lys(马来酰亚胺)-炔烃的反应方案。
图1B示意性地说明制备实施例2(化合物3a、4a、5a、6a)中所述的40k-Y-PEG-Lys(马来酰亚胺)-炔烃的反应方案。
图1C示意性地说明制备实施例3(化合物4b、5b、6b)中所述的30kmPEG-Lys(马来酰亚胺)-DBCO的反应方案。
图2A示意性地说明了制备实施例5(化合物9-12)中所述的聚乙二醇化单链抗体30kmPEG-SCACD3-SCACD19的反应方案，其使用点击化学而没有Cu催化剂。
图2B示意性地说明了制备实施例6(化合物11a-12a)中所述的聚乙二醇化单链抗体30kmPEG-SCACD3-SCACD19的反应方案，其使用点击化学而没有Cu催化剂。
图3示出实施例7中描述的体外T细胞介导的细胞毒性。
图4示出实施例7中描述的体内药代动力学。
发明详述
本发明涉及新型长效多特异性分子(例如，多特异性或双特异性抗体)以及制备和使用此类分子的相关方法。特别地，本发明提供的多特异性分子是双位点特异性PEG化双特异性抗体(DSP-BsAb)，并且能够结合两种或更多种抗原，或相同抗原的两个或更多个表位。
双特异性单克隆抗体(BsAb)是包含两种不同单克隆抗体的抗原结合片段的人工蛋白质。它结合两种不同类型的抗原或相同抗原的两种不同表位。该方法最广泛使用的应用是在癌症免疫疗法中，其中工程化的BsAb与细胞毒性细胞的受体(例如CD3)和癌细胞的受体(例如CD19)结合，并且重定向细胞毒性细胞例如T细胞以破坏癌细胞。例如，在肿瘤免疫疗法中，由Amgen开发的博纳吐单抗，一种双特异性T细胞接合者(BiTE)，是开发的最成功的疗法之一。
博纳吐单抗是一种用于治疗癌症的双特异性融合抗体。它由两个单链单克隆抗体组成，其分别与CD19和CD3特异性结合，以重定向效应T细胞杀死CD19阳性B癌细胞。然而，与其他重组抗体片段蛋白相似，博纳吐单抗在血液循环过程中很快被清除，必须通过便携式微型泵每周7天、每天24小时连续静脉输注给药(Portell，C.A.等人，2013，ClinPharmacol，5(Suppl 1)：p.5-11)。这种特殊的药物给药对患者顺应性来说是一个很大的挑战，特别是对于幼儿。此外，高感染机会使这些患者处于极大的风险中，最坏的情况甚至导致死亡。此外，由于其半衰期极短，融合的单链双特异性抗体如博纳吐单抗通常在实体瘤中具有非常差的保留时间；因此，重定向效应细胞以破坏实体瘤成功的可能性是非常值得怀疑的。此外，推注注射博纳吐单抗可导致明显中枢神经***(CNS)毒性，这可能是由于抗体渗漏到脑中(Ahmed，M.等人2015年4月，Onco Immunology 4(4))e989776-1-e989776-11)。为了解决这些问题，我们在此公开了一种新的双特异性抗体技术-DSP-BsAb技术。
过去，在重组融合方法出现之前，已经报道了两种抗体或抗体片段的化学缀合以形成BsAb。实际上，首先报道的BsAb是通过以下获得的BsF(ab′)2：胃蛋白酶消化两种兔IgG然后还原，然后再氧化所得Fab'片段。BsF(ab′)2片段的更有效生产使用半胱氨酸反应性同型和异型双官能交联剂实现(Brennan，M.等人1985，Science 229(4708)：81-83，Glennie，M.J.等人1987，J Immunol 139(7)：2367-2375，S.SONGSIVILAI&P.J.LACHMANN.Clin.exp.1990，Immunol.79，315-321)，或通过两个重组表达的Fab'片段之间的直接缀合实现(Shalaby M.R.等人1992，J Exp Med 175(1)：217-225)。尽管已经描述了许多使用抗体片段(Fab或scFv)化学制备双特异性抗体的方法，但是，这些方法中的很多存在各种问题，例如，低缀合产率和纯度或难以大规模生产。
今天，分子生物学的进步使得几乎(如果不是全部)任何一对抗体片段或链都可以在技术上整合到双特异性抗体分子中。然而，制备重组融合双特异性抗体的挑战已经成为临床开发的巨大障碍(Klein C.等人2012，MAbs.4(6)：653–663.)。此外，这些有希望的分子的短半衰期也严重限制了它们进一步进入临床。
自20世纪70年代发明以来，PEG化作为最成功的蛋白质修饰策略之一，已广泛用于制药工业(
Figure BDA0002029096750000051
S.，M.等人，2010，Biotechnology Journal，5(1)：p.113-128；Veronese，F.BioDrugs，22(5)：p.315-329)。众所周知PEG与诸如蛋白质和多肽的治疗性分子的缀合延长了它们的循环半衰期并改善了它们的药代动力学和药效学(美国专利No.4,179,337)。
当使用直链PEG时，存在两种可能的PEG化双特异性抗体形式；一种具有两个不同的抗体或抗原结合部分，其连接在直链PEG的两个末端(形式I)，另一种具有仅在PEG的一个末端连接的两种不同的抗体或抗原结合部分(形式II)。根据具体应用，可以优选地选择一种形式而不是另一种形式。在协同效应的组合疗法的情况下，选择一种形式而非另一种形式并不那么重要，但在聚集细胞毒性效应细胞杀死癌细胞的情况下，具有连接在PEG的两个末端的两种不同抗体或抗原结合部分的形式(形式I)由于至少以下两个原因较差。首先，靶细胞与效应细胞的紧密接近对于形成免疫突触至关重要，从而有效地重定向效应细胞以进行直接裂解(Wuellner，U.等人，2015，Antibodies，4，p.426-440；Bluemel，C.等人，2010，Cancer Immunol Immunother.59(8):p.1197-209)，换句话说，双特异性抗体的两种不同的抗体或抗原结合部分应该彼此非常接近以使肿瘤免疫疗法有效地起作用，但是PEG化双特异性抗体的形式I没有控制两个不同抗原结合部分之间的空间距离的机制，因此不能满足该距离要求。其次，这种形式的PEG链不能自由移动以充分利用其保护通常具有短的消除半衰期的抗原结合部分的潜力。正确的方法是构建聚乙二醇化的双特异性抗体(形式II)，其中两个不同的抗体或抗原结合部分仅连接在PEG的一个末端，如本发明所公开的，留下PEG的另一个末端(在直链PEG的情况下)或多个末端(在分支或多臂PEG的情况下)为游离的，使得PEG可以更有效地保护短寿命的双特异性抗体。利用这种结构形式(形式II)，还提供了所需的免疫突触，用于有效地重新靶向效应细胞以杀死癌细胞。因此，可以预期更好的药代动力学和更好的药效学。
为了在一个PEG末端位点特异性缀合两个不同的抗体片段或单链抗体以形成PEG化的双特异性抗体，PEG的末端官能团例如羟基、羧基等必须转化为末端支化的异型双官能团，它们能够与两种抗体片段或单链抗体进行位点特异性缀合。制备末端支化PEG的方法已在US6756037、US6638499和US6777387中公开，但这些专利中公开的末端支化PEG都不能够与两种不同抗体片段或单链抗体或其他形式的抗原结合部分进行位点特异性缀合。
概念上，PEG化的双特异性抗体可以通过将PEG连接到融合的双特异性抗体来制备。该方法的问题在于制造融合抗体在技术上比制备单抗体片段或单链抗体更具挑战性和困难。本发明公开的另一种方法是分别制备两种不同的抗体片段或单链抗体，然后将这两种抗体片段或单链抗体与PEG化学连接，其间具有三官能小分子部分。
有两种方法可用于将两种不同的抗体片段或单链抗体化学连接至PEG以形成PEG化的双特异性抗体。第一种方法是首先将两种不同的抗体片段或单链抗体进行位点特异性连接，然后进行位点特异性PEG化。该方法的问题在于两种不同抗体片段或单链抗体的偶联。事实证明，偶联过程在鉴定和纯化方面通常是非常具有挑战性的，这仅仅是由于趋于形成这样的抗体片段或单链抗体的二聚体(例如，(scFv1)2和(scFv2)2)，其通常具有与目标化合物(例如，scFv1-scFv2)相似的分子量和物理特征。
另一种方法是使用本发明中公开的DSP-BsAb技术。利用DSP-BsAb技术，可以首先对一个抗体片段或单链抗体进行位点特异性聚乙二醇化，然后与另一抗体片段或单链抗体进行位点特异性缀合。因为聚乙二醇化抗体片段或聚乙二醇化单链抗体与抗体片段或单链抗体或其二聚体具有非常不同的特征，使用这种方法，纯化和表征过程可以非常容易。
本发明提供了制备末端支化PEG的方法，其能够与两种不同的抗体片段或单链抗体如抗CD19和抗CD3进行位点特异性缀合。如本发明所公开的，可以改善双特异性抗体的血液循环半衰期。另外，常规的单特异性(single-specific/mono-specific)/单特异性抗体片段、单链抗体或其抗原结合部分可用于制备本发明的双特异性抗体，这意味着与重组融合双特异性抗体的制备相比制备过程更简单。此外，公开的PEG化双特异性抗体形式具有募集效应细胞以杀死癌细胞的用于肿瘤免疫疗法的优点。此外，由于传统的全长双特异性抗体或其任何衍生物通常太大而不能深入渗透到实体瘤组织中，而传统的单链双特异性抗体或抗体片段或其任何衍生物在实体肿瘤组织中的保留时间有限，本发明公开的DSP-BsAb技术具有平衡双特异性抗体的大小和循环半衰期的能力，并且可为实体瘤提供更有效的治疗。
因此，本发明解决了以上讨论的的问题且改善了双特异性抗体技术。
I.缀合物
在本发明一个方面，提供式(Ia)的化合物:
Figure BDA0002029096750000071
其中P为非免疫原性聚合物；T为多官能部分，如三官能小分子接头部分，其官能团中的两个能与两种不同的蛋白质进行位点特异性缀合。A1和A2为任意两种不同的蛋白质，如抗体片段或单链抗体或其它形式的抗体或这些的任意组合。
特别地，本发明一方面提供式Ib的缀合物:
Figure BDA0002029096750000081
其中:
P为非免疫原性聚合物；
B为H、封端基团或不存在，所述封端基团选自C1-50烷基和芳基，其中所述烷基的一个或多个碳可被杂原子替代；
T为多官能接头，其中T和(L1)a之间的连接和T和(L2)b之间的连接可相同或不同；
L1和L2各自独立地为双官能接头；
a和b各自为选自0-10的整数；
A1和A2彼此相同或不同且A1和A2各自独立包括抗体片段、单链抗体或任何其它形式的抗体或多特异性抗体或其组合；且
y为选自1-10的整数。
缀合物的P部分可由多种非免疫原性聚合物制备。优选地，该聚合物为水溶性。聚合物的实例包括葡聚糖、基于碳水化合物的聚合物、聚环氧烷、聚乙烯醇和其它类似的非免疫原性聚合物。其他示例性聚合物包括聚(亚烷基醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(羟基烷基甲基丙烯酰胺)、聚(羟基烷基甲基丙烯酸酯)、聚(糖)、聚(α-羟基酸)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯基醇)、聚磷腈、聚噁唑啉、聚(N-丙烯酰基吗啉)或其共聚物或三聚物。该聚合物可为直链或支链的。聚合物的平均分子量范围为约100至约100,000道尔顿，如约3,000至约100,000道尔顿，包括所有子范围。
该聚合物可包括能够官能化、活化或缀合至反应配偶体的端基。端基的非限制性实例包括羟基、氨基、羧基、巯基和卤素。在一些实施方案中，所述聚合物为聚乙二醇(PEG)。
在一些实施方案中，y为1且式Ib表示具有聚合物侧链的缀合物。末端B可作为封端基团。
在一些实施方案中，y为2、3、4、5或6且式Ib表示包含支化聚合物部分的缀合物。在一些实施方案中，[B–P]y中的Bs为低分子量C1-10烷基如甲基、乙基和丁基，其中一个或多个碳可被杂原子(例如O、S和N)代替。
聚合物部分P
在一些实施方案中，P代表PEG部分。在一些实施方案中，提供了制备末端支化异型双官能PEG的方法，其能够与两种不同蛋白质例如抗体片段或单链抗体进行位点特异性缀合。在一些实施方案中，还提供了制备能够延长血液循环半衰期的PEG化双特异性单链抗体的方法。
在示例性实施方案中，PEG的末端官能团如羟基或羧基等被活化并与三官能小分子部分例如Boc保护的赖氨酸缀合以形成末端支化的异型双官能PEG。然后通过与具有炔基的小分子间隔基偶联，将新形成的羧基转化为炔基。Boc去保护后的裸氨基与另一个具有马来酰亚胺基团的小分子间隔基缀合，形成末端支化的马来酰亚胺/炔异型双官能PEG。得到的马来酰亚胺/炔烃末端支化异型双官能PEG连续与巯基标记的单链抗体和叠氮化物标记的单链抗体进行位点特异性缀合，形成聚乙二醇化的单链双特异性抗体，其提供比没有聚乙二醇化的单链双特异性抗体更长的血液循环半衰期。
式(Ia)或(Ib)的聚乙二醇化的双特异性抗体可以通过以下方法制备，所述方法包括通过将PEG末端官能团(例如羟基、羧基等)转化为末端支化的异型双官能团以形成末端支化的异型双官能PEG，例如末端支化马来酰亚胺/炔烃异型双官能PEG。在本发明的一些实施方案中，P部分可衍生自下式PEG：
Figure BDA0002029096750000091
其中:
n为约10至2300的整数以优选提供总分子量为10000至40000或更大的聚合物，如果需要的话。B为甲基或其它低分子量烷基或-CH2(CH2)mF。B的非限制性实例包括甲基、乙基、异丙基、丙基和丁基。M为0至10。F为末端官能团如羟基、羧基、巯基、卤素、氨基等，其能够被官能化、活化和/或缀合三官能小分子化合物。
在本发明的另一个实施方案中，该方法也可以用替代的支链PEG进行。支链P部分可衍生自下式的化合物：
Figure BDA0002029096750000101
其中:
PEG是聚乙二醇。m是大于1的整数，以优选提供总分子量为10000至40000或更大的聚合物，如果需要的话。B是甲基或其他低分子量烷基。L是连接两个或更多个PEG的官能连接部分。这种连接部分的实例是：任何氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸、赖氨酸或1,3-二氨基-2-丙醇、三乙醇胺、任何5或6元芳环或连接有多于两个官能团的脂肪族环等。S是任何不可裂解的间隔基。F是末端官能团，例如羟基，羧基，硫醇，氨基等。i是0或1。当i等于0时，该式变为：
Figure BDA0002029096750000102
其中：PEG、m、B或L的定义具有以上相同的含义。
在相关的方面，提供了具有多臂聚合物部分的缀合物，其具有下式:
Figure BDA0002029096750000103
其中B用作连接至2、3、4、5、6、7或8个聚合物臂的核心。核心B的结构可以是对称的或不对称的、直链的或环状的。在一些实施方案中，B是饱和脂族基团。核的一个或多个碳可以用杂原子如氧、硫或氮代替。当与聚合物臂一起时，核B可以是多元醇、多硫醇或多胺的残基。实例包括但不限于甘油、三羟甲基丙烷、季戊四醇、山梨糖醇和甘油的低聚物。
在本发明的一些实施方案中，多臂聚合物部分可衍生自下式的结构。
Figure BDA0002029096750000104
其中:
n为整数且为约10至1200，m为整数且大于1，以优选提供总分子量为10000至40000或更大的聚合物，如果需要的话。F为末端官能团如羟基、羧基、巯基、氨基等。B为是连接有两个或更多个PEG的非官能连接部分。B的结构可以是对称的或不对称的、直链的或环状的饱和脂族基，且B的一个或多个碳可以被杂原子如氧、硫或氮代替。
本发明的方法也可以用替代的聚合物质如葡聚糖、基于碳水化合物的聚合物、聚环氧烷、聚乙烯醇或其它类似的非免疫原性聚合物进行，这些聚合物的末端基团能够被官能化或活化以转化为异型双官能团。上述列表仅是说明性的，并非旨在限制适用于本发明的非抗原性聚合物的类型。
三官能接头T
T表示三官能接头，其连接P、(L1)a和(L2)b。T可以衍生自具有三个官能团的任何组合的分子，其非限制性实例包括羟基、氨基、肼基、羧基、巯基、和卤素。在三官能接头中的官能团可以相同或不同。在一些实施方案中，可以保护一个或两个官能团以实现与其他反应配偶体的选择缀合。文献中已知多种保护基团，包括例如March的Advanced OrganicChemistry(第三版，1985，Wiley and Sons，New York)。在T与另一反应配偶体之间的反应之前或之后，官能团也可以转化为其他基团。例如，羟基可以转化为甲磺酸酯基或甲苯磺酸酯基。卤素可以被叠氮基替代。T的酸性官能团可以通过与带有末端炔烃的氨基偶联而转化为炔官能团。
在示例性实施方案中，T衍生自赖氨酸、1,3-二氨基-2-丙醇或三乙醇胺。这些分子上的一个或多个官能团可被保护以用于选择性反应。在一些实施方案中，T衍生自BOC-保护的赖氨酸。
双官能接头L1和L2
接头L1和L2都包括接头链(linker chain)、内部连接(linkage)和/或末端连接。接头链和/或连接(内部或末端)可独立选自-(CH2)aC(O)NR1(CH2)b-、-(CH2)aO(CH2CH2O)c-、-(CH2)a杂环基-、-(CH2)aC(O)-和-(CH2)aNR1-、-CR1＝N-NR1-、-CR1＝N-O-、-CR1＝N-NR2-CO-、-N＝N-CO-、-S-S-，其中a、b和c各自为选自0至25的整数，包括所有亚单元；且R1和R2独立表示氢或C1-C10烷基。
接头L1和L2中的杂环基连接基(无论其在内部位置还是末端位置)可衍生自基于马来酰亚胺基的部分。合适的前体的非限制性实例包括4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷甲酸N-琥珀酰亚胺基酯(SMCC)、N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧基-(6-酰胺基己酸酯)(LC-SMCC)、κ-马来酰亚胺基十一烷酸N-琥珀酰亚胺基酯(KMUA)、γ-马来酰亚胺基丁酸N-琥珀酰亚胺基酯(GMBS)、ε-马来酰亚胺己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(EMCS)、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N-(α-马来酰亚胺基乙酰氧基)-琥珀酰亚胺酯(AMAS)、琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺基丙酰胺基基)己酸酯(SMPH)、4-(对-马来酰亚胺基苯基)-丁酸N-琥珀酰亚胺基酯(SMPB)、和N-(对-马来酰亚胺基苯基)异氰酸酯(PMPI)。
在一些其它非限制性示例性实施方案中，各接头单元也可衍生自基于卤代乙酰基的部分，其选自N-琥珀酰亚胺基-4-(碘乙酰基)-氨基苯甲酸酯(SIAB)，碘乙酸N-琥珀酰亚胺基酯(SIA)，溴乙酸N-琥珀酰亚胺基酯(SBA)，或3-(溴乙酰胺基)丙酸N-琥珀酰亚胺基酯(SBAP)。
或者，接头的杂环基连接基可为由不同接头部分的缀合形成的四唑基或***基。因此，杂环基也作为连接点。
在一些实施方案中，(L1)a和(L2)b各自包括:
X1-(CH2)aC(O)NR1(CH2)bO(CH2CH2O)c(CH2)dC(O)-或
X3-(CH2)aC(O)NR1(CH2)bO(CH2CH2O)c(CH2)dX2(CH2)eN R2，
其中X1、X2和X3可相同或不同且独立表示杂环基；
a、b、c、d和e各自为选自1-25的整数；且
R1和R2独立表示氢或C1-C10烷基。
在一些实施方案中，X1和/或X3衍生自基于马来酰亚胺基的部分。在一些实施方案中，X2表示***基或四唑基。在一些实施方案中，R1和R2各自表示氢。在一些实施方案中，a、b、c、d和e各自独立地选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。
连接基
本发明的缀合物的不同部分可以通过各种化学键连接。实例包括但不限于酰胺、酯、二硫键、醚、氨基、氨基甲酸酯、肼、硫醚和碳酸酯。例如，可以活化PEG部分(P)的末端羟基，然后与赖氨酸(T)偶联，以在式Ia或Ib的P和T之间提供所需的连接点。同时，T和L1或L2之间的连接基团可以是由接头L1或L2的氨基与赖氨酸(T)的羧基之间的反应产生的酰胺。取决于缀合物的所需特征，合适的连接基团也可以掺入抗体部分(A)和相邻接头(L1或L2)之间以及L1或L2的各个接头之间或之内。
在一些实施方案中，缀合物的不同部分之间的连接基团可以衍生自一对官能团的偶联，所述官能团彼此具有固有的化学亲和力或选择性。这些类型的偶联或环形成允许位点特异性缀合以引入特定蛋白质或抗体部分。导致位点特异性缀合的这些官能团的非限制性实例包括巯基、马来酰亚胺、2'-吡啶基二硫基变体、芳族或乙烯基砜、丙烯酸酯、溴代或碘代乙酰胺、叠氮化物、炔烃、二苯并环辛炔(DBCO)、羰基、2-氨基-苯甲醛或2-氨基-苯乙酮基、酰肼、肟、酰基三氟硼酸钾、O-氨基甲酰基羟胺、反式环辛烯、四嗪、和三芳基膦。
合成
合成的关键步骤可以通过以下实施方案说明。一旦选择了所需的PEG，使用任何本领域公认的方法将PEG的末端官能团如羟基、羧基等转化为末端支化的异型双官能团。概括地说，末端支化的异型双官能PEG如末端支化异型双官能马来酰亚胺/炔烃PEG是在碱如4-二甲基氨基吡啶(DMAP)、吡啶等的存在下，使用N-羟基琥珀酰亚胺活化PEG的末端羟基或羧基而制备，其使用试剂如二(N-琥珀酰亚胺基)碳酸酯(DSC)、三光气等(在末端羟基的情况下)或偶联试剂如N,N′-二异丙基碳化二亚胺(DIPC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)等(在末端羧基的情况下)，以形成活化的PEG。
接下来，在碱如二异丙胺(DIPE)存在下，使活化的PEG与三官能小分子如赖氨酸衍生物H-Lys(Boc)-OH反应，形成具有游离羧基和Boc保护的氨基的末端支化的异型双官能PEG。如本领域普通技术人员所理解的，如果需要，PEG的其他已知末端官能团如卤素、氨基、巯基等和其它已知的三官能小分子可用作相同目的的替代物。三官能小分子的实例包括含有三个官能团(NH2、NHNH2、COOH、OH、C＝OX、N＝C＝X、S、酸酐、卤素、马来酰亚胺、C＝C、C＝C等)的任何组合的分子或其受保护的形式。
然后通过与具有炔基如1-氨基-3-丁炔或NH2-DBCO的小分子间隔基偶联，将末端支化的羧基/Boc氨基异型双官能PEG转化为末端支化炔烃/Boc氨基异型双官能PEG。用酸如三氟乙酸(TFA)处理末端支化的炔烃/Boc氨基异型双官能PEG，得到末端支化的炔烃/胺异双功能PEG。目标末端支化的炔烃/马来酰亚胺异型双官能PEG通过使末端支化的炔烃/胺异型双官能PEG与另一种具有马来酰亚胺基团的小分子间隔基如NHS-PEG2-马来酰亚胺反应而获得。该末端支化的炔烃/马来酰亚胺异型双官能PEG能够连续地与巯基标记的抗体和叠氮化物标记的抗体进行位点特异性缀合。
单独地，可以使用本领域已知的各种技术产生两种单链抗体(SCA)片段，抗CD3(SCACD3)和抗CD19(SCACD19)。在一个实例中，它们使用含有pPICZ载体的EasySelectTM毕赤酵母表达试剂盒通过重组DNA技术在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastorius)中制备。合成抗体(如抗CD3 VH-VL和抗CD19 VL-VH)的基因并将其克隆到pPIZA表达载体中并在巴斯德毕赤酵母X33菌株中转化。通过甲醇诱导SCA的表达并通过Ni-螯合树脂纯化。为了促进随后的缀合，通过重组DNA技术将位点特异性官能团如巯基***到单链抗体的VH和VL之间的接头中(Yang，K.等人，2003，Protein Eng 16(10)：761-770)。纯SCA通过色谱法获得。如本领域普通技术人员所理解的，如果需要，其他已知的位点特异性官能团也可以通过重组DNA技术***SCA的VH和VL之间的接头中作为相同目的的替代物。
为了制备聚乙二醇化单链双特异性抗体，末端支链炔烃/马来酰亚胺异型双官能PEG与遗传***的SCACD3的游离巯基官能团发生位点特异性反应，产生PEG-(SCACD3)-炔烃，而SCACD19与小分子叠氮化物/马来酰亚胺双官能接头进行位点特异性缀合，产生叠氮化物-SCACD19。纯化的叠氮化物-SCADCD19和纯化的PEG-(SCACD3)-炔烃通过叠氮化物-炔烃点击化学进行位点特异性反应，以形成目标PEG化的单链双特异性抗体PEG-SCACD3/SCACD19。
除了本发明中使用的巯基/马来酰亚胺和叠氮化物/炔烃的位点特异性缀合基团对之外，如本领域普通技术人员所理解的，其他已知的位点特异性缀合基团对，如巯基/2'-吡啶基二硫基对；巯基/砜对；DBCO/叠氮化物对；反式环辛烯/四嗪对；羰基/酰肼对；羰基/肟对；叠氮化物/三芳基膦对；酰基三氟硼酸钾/O-氨基甲酰基羟胺对，如果需要，可以被类似地设计并用作相同目的的替代物。上述位点特异性缀合基团对的列表仅仅是说明性的，并不旨在限制适用于本发明的位点特异性缀合基团对的类型。
术语的定义
本发明所用的术语“烷基”是指烃链，通常长度为约1-25个原子。这种烃链优选但不要求一定是饱和的，并且可以是支链或直链，但通常优选直链。术语C1-10烷基包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9和10个碳的烷基。类似地，C1-25烷基包括具有1-25个碳的所有烷基。示例性的烷基包括甲基、乙基、异丙基、正丁基、正戊基、2-甲基-1-丁基、3-戊基、3-甲基-3-戊基等。如本发明所用，当提及三个或更多个碳原子时，“烷基”包括环烷基。除非另有说明，否则烷基可以是取代的或未取代的。
如本发明所用的术语“官能团”是指在有机合成的正常条件下可以使用的基团，以在与其连接的实体和另一个实体之间形成共价连接，所述另一个实体通常具有另外的官能团。“双官能接头”是指具有两个官能团的接头通过缀合物的其他部分形成两个连接。
如本发明所用的术语“衍生物”是指具有另外的结构部分的化学修饰的化合物，其目的是引入新的官能团或调节原始化合物的性质。
如本发明所用的术语“保护基”是指在一些反应条件下防止或阻止分子中特定化学反应性官能团反应的部分。各种保护基团在本领域中是公知的，并且描述于例如T.W.Greene和G.M.Wuts，Protecting Groups in Organic Synthesis，Third Edition，Wiley，New York，1999，和P.J.Kocienski，Protecting Groups，Third Ed.，ThiemeChemistry，2003，以及其中引用的参考文献。
如本发明所用的术语“PEG”或“聚(乙二醇)”是指聚(环氧乙烷)。用于本发明的PEG通常包含—(CH2CH2O)n—的结构。PEG可具有多种分子量、结构或几何形状。PEG基团可包含在典型的合成反应条件下不易经历化学转化的封端基团。封端基团的实例包括–OC1-25烷基或–O芳基。
如本发明所用的术语“接头”是指用于连接互连部分(例如抗体和聚合物部分)的原子或原子集合。接头可以是可裂解的或不可裂解的。用于缀合物的各种接头的制备已经在文献中描述，包括例如Goldmacher等，Antibody-drug Conjugates and Immunotoxins:From Pre-clinical Development to Therapeutic Applications,Chapter 7,in LinkerTechnology and Impact of Linker Design on ADC properties,Edited by PhillipsGL；Ed.Springer Science and Business Media,New York(2013)。可裂解接头包含可在一些生物或化学条件下裂解的基团或部分。实例包括酶促可裂解的二硫键接头、1,4-或1,6-苄基消除、三甲基锁定***、基于N,N-二(羟乙基)甘氨酸的自裂解***、酸不稳定的甲硅烷基醚接头和其他光不稳定接头。
如本发明所用的术语“连接基团”或“连接基”是指连接化合物或缀合物的不同部分的官能团或部分。连接基的实例包括但不限于酰胺、酯、氨基甲酸酯、醚、硫醚、二硫键、腙、肟、和氨基脲、碳化二亚胺、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团和酯酶不稳定基团。例如，接头部分和聚合物部分可以通过酰胺或氨基甲酸酯连接基彼此连接。
如本发明所用的术语“多臂”或“多臂的”是指聚合物的几何形状或总体结构，是指具有2个或更多个与“核”分子或结构连接的含聚合物的“臂”的聚合物。因此，多臂聚合物可具有2、3、4、5、6、7、8个臂或更多个臂。
II.多特异性分子和抗体
本发明包括具有两种或更多种不同识别特异性的多特异性分子。本发明的多特异性分子是指包含结合第一靶标的第一识别结合部分和结合第二靶标的第二识别结合部分的分子。在一个具体实施方案中，识别结合部分中的一个或两个是抗体或其抗原结合部分。
抗体
本发明的多特异性分子可以使用任何分离的抗体制备，特别是单克隆抗体，例如结合不同抗原或表位的人单克隆抗体。优选地，抗体是人抗体，尽管抗体也可以是例如鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或其组合。
结构组分
单克隆抗体技术允许以特异性结合单克隆抗体或其片段的形式产生特异性结合剂。为了产生单克隆抗体或其片段，可以使用常规杂交瘤技术。或者，单克隆抗体或其片段可通过使用scFv(单链可变区)、特别是人scFv的噬菌体文库获得(参见例如美国专利号5,885,793、WO 92/01047、WO 99/06587)。
在一个实施方案中，本发明的多特异性分子中的至少一个识别结合部分是单价抗体片段。在一个实施方案中，单价抗体片段衍生自单克隆抗体。单价抗体片段包括但不限于Fab、Fab'-SH、单结构域抗体、F(ab')2、Fv和scFv片段。因此，在一个实施方案中，单价抗体片段选自Fab、Fab'-SH、单结构域抗体、F(ab')2、Fv和scFv片段。在一个实施方案中，本发明公开的多特异性分子的识别结合部分中的至少一个是单结构域抗体，或单克隆抗体的scFv或Fab片段，或Fab'片段。
多特异性分子中的一个或多个识别结合部分也可以是双抗体或单域抗体。双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的(参见例如EP 0 404097，WO 93/01161，Hudson，P.J.，等人，Nat.Med.9(2003)129-134，和Holliger，P.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448)。如Hudson，P.J.，等人，Nat.Med.9(2003)129-134中所述的三抗体和四抗体也可用于多特异性分子中的识别结合部分。单域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在一些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(Domantis，Inc.，Waltham，Mass.；美国专利6,248,516)。
多特异性分子中的识别结合部分可以是Fv，其是含有完整抗原结合位点并且没有恒定区的最小抗体片段。关于scFv的综述，参见例如Plueckthun，The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies，vol.113，Rosenburg和Moore(eds.)，(Springer-Verlag，NewYork，1994)，pp.269-315，WO 93/16185，美国专利5,571,894，美国专利5,587,458。通常，六个超可变区(HVR)赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使单个可变域(或仅包含三个对抗原特异的HVR的一半的Fv)也具有识别和结合其抗原的能力。
在一个实施方案中，单价抗体片段是双链Fv，其由紧密、非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。在一个实施方案中，单价抗体片段是单链Fv(scFv)，其由通过柔性肽接头共价连接的一个重链可变域和一个轻链可变域组成。
抗体的Fab片段含有重链和轻链可变域以及轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端添加少数残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH表示Fab'，其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离巯基。
已经开发了各种技术用于产生抗体片段。传统上，抗体片段可以通过蛋白水解消化全长抗体获得(参见，例如，Morimoto，K.，等人，J.Biochem.Biophys.Meth.24(1992)107-117，Brennan，M.，等人，Science 229(1985)81-83)。例如，木瓜蛋白酶消化全长抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，其各自具有单个抗原结合位点，以及残留的“Fc”片段。关于一些抗体片段的综述，参见Hudson，P.J.，等人，Nat.Med.9(2003)129-134。
抗体片段也可以通过重组方法直接产生。Fab、Fv和scFv抗体片段都可以在例如大肠杆菌中表达和分泌，因此，允许容易地产生大量这些片段。可以根据标准程序从抗体噬菌体文库中分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌中回收Fab'-SH片段(Carter，P.，等人，Bio/Technology 10(1992)163-167)。哺乳动物细胞***也可用于表达，并且如果需要，还可以分泌抗体片段。
靶点
已知许多针对细胞表面分子和/或其配体的治疗性抗体。这些抗体可用于在多特异性分子中选择和构建定制的特异性识别结合部分。实例包括博纳吐单抗/BLINCYTORituxan/MabThera/利妥昔单抗、H7/奥瑞珠单抗、Zevalin/Ibrizumomab、Arzerra/奥伐木单抗(CD20)、HLL2/依帕珠单抗、Inotuzomab(CD22)、Zenapax/达克珠单抗、Simulect/巴利昔单抗(CD25)、赫赛汀/曲妥单抗、帕妥珠单抗(Her2/ERBB2)、Mylotarg/吉妥珠单抗(CD33)、Raptiva/依法珠单抗(Cd11a)、Erbitux/西妥昔单抗(EGFR、表皮生长因子受体)、IMC-1121B(VEGF受体2)、Tysabri/那他珠单抗(a4β1和α4β7整联蛋白的α4-亚单位)、ReoPro/阿昔单抗(gpIIb-gpIIa和αvβ3-整联蛋白)、Orthoclone OKT3/Muromonab-CD3(CD3)、Benlysta/贝利木单抗(BAFF)、Tolerx/Oteliximab(CD3)、Soliris/依库丽单抗(C5补体蛋白)、Actemra/托珠单抗(IL-6R)、Panorex/依决洛单抗(EpCAM、上皮细胞粘附分子)、CEA-CAM5/Labetuzumab(CD66/CEA、癌胚抗原)、CT-11(PD-1、程序性死亡-1T-细胞抑制受体、CD-d279)、H224G11(c-Met受体)、SAR3419(CD19)、IMC-A12/Cixutumumab(IGF-1R、***1受体)、MEDI-575(PDGF-R、血小板-衍生的生长因子受体)、CP-675、206/曲美目单抗(细胞毒性T淋巴细胞抗原4)、RO5323441(胎盘生长因子或PGF)、HGS1012/马帕木单抗(TRAIL-R1)、SGN-70(CD70)、Vedotin(SGN-35)/本妥昔单抗(CD30)和ARH460-16-2(CD44)。
本发明公开的多特异性结合分子/多特异性抗体可用于制备药物以治疗例如肿瘤疾病、心血管疾病、传染病、炎性疾病、自身免疫性疾病、代谢(例如，内分泌)疾病、或神经学(例如神经退行性)疾病。这些疾病的示例性非限制性实例为阿尔茨海默病、非霍奇金淋巴瘤、B-细胞急性和慢性淋巴性白血病、伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、毛细胞性白血病、急性和慢性骨髓性白血病、T-细胞淋巴瘤和白血病、多发性骨髓瘤、神经胶质瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症、癌(如口腔、胃肠道、结肠、胃、肺道、肺、乳腺、卵巢、***、子宫、子宫内膜、宫颈、膀胱、胰腺、骨、肝、胆囊、肾、皮肤、和睾丸的癌)、黑素瘤、肉瘤、神经胶质瘤和皮肤癌、急性特发性血小板减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、西登哈姆氏舞蹈病、重症肌无力、***性红斑狼疮、狼疮性肾炎、风湿热、多腺体综合征、大疱性类天疱疮、糖尿病、Henoch-Schonlein紫癜、链球菌感染后肾炎、结节性红斑、Takayasu动脉炎、Addison疾病、类风湿性关节炎、多发性硬化、肉样瘤病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病、结节性多动脉炎、强直性脊柱炎、Goodpasture综合征、闭塞性血栓性脉管炎、Sjogren综合征、原发性胆汁性肝硬化、Hashimoto甲状腺炎、甲状腺毒症、硬皮病、慢性活动性肝炎、多发性肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常天疱疮、Wegener肉芽肿病、膜性肾病、肌萎缩侧索硬化、脊髓痨、巨细胞动脉炎/多肌痛、恶性贫血、快速进行性肾小球性肾炎、牛皮癣、或纤维化肺泡炎。
许多细胞表面标志物及其配体是已知的。例如，已报道癌细胞表达至少一种下列细胞表面标志物和/或配体，包括但不限于，碳酸酐酶IX、甲胎蛋白、α-辅肌动蛋白-4、A3(对A33抗体特异的抗原)、ART-4、B7-1、B7-H1、Ba-733、BAGE、BrE3-抗原、CA125、CAMEL、CAP-1、CASP-8/m、CCCL19、CCCL21、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CDS、CD8、CD1-1A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD137、CD138、CD147、CD154、CDC27、CDK-4/m、CDKN2A、CTLA-4、CXCR4、CXCR7、CXCL12、HIF-1-α、结肠-特异性抗原-p(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、c-met、DAM、EGFR、EGFRvIII、EGP-1、EGP-2、ELF2-M、Ep-CAM、Flt-1、Flt-3、叶酸受体、G250抗原、GAGE、GROB、HLA-DR、HM1.24、人体绒毛膜***(HCG)及其亚单位、HER2/neu、HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF-1)、HSP70-2M、HST-2或1a、IGF-1R、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、***-1(IGF-1)、KC4-抗原、KS-1-抗原、KS 1-4、LAG3、Le-Y、LDR/FUT、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、MAGE、MAGE-3、MART-1、MART-2、NY-ESO-1、TRAG-3、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、MUM-1/2、MUM-3、NCA66、NCA95、NCA90、胰腺癌粘蛋白、PD-1及其受体、PD-L1、PD-L2、胎盘生长因子、p53、PLAGL2、***酸磷酸酶、PSA、PRAME、PSMA、P1GF、ILGF、ILGF-1R、IL-6、IL-25、RS5、RANTES、T101、SAGE、5100、存活蛋白、存活蛋白-2B、TAC、TAG-72、生腱蛋白、TIM3(T-细胞免疫球蛋白和包含粘蛋白-结构域-3)、TRAIL受体、TNF-α、Tn-抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、VEGFR、ED-B纤连蛋白、WT-1、17-1A-抗原、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5、血管发生标志物、bcl-2、bcl-6、Kras、cMET、致癌基因标志物和致癌基因产物(参见，例如，Sensi等人，Clin.Cancer Res.12(2006)5023-5032；Parmiani等人，J.Immunol.178(2007)1975-1979；Novellino等人，癌症Immunol.Immunother.54(2005)187-207)。因此，识别这种特异性细胞表面受体或其配体的抗体可用于本发明的多特异性分子中的特异性和选择性识别结合部分，其靶向和结合与疾病相关的多个/众多细胞表面标志物或配体。
在一些实施方案中，对于癌症/肿瘤的治疗，使用靶向肿瘤相关抗原(TAA)的多特异性结合分子/多特异性抗体，例如Herberman,"Immunodiagnosis of Cancer",Fleishered.,"The Clinical Biochemistry of Cancer",page 347(American Association ofClinical Chemists,1979)和美国专利4,150,149；美国专利4,361,544；和美国专利4,444,744中报道的那些。
关于肿瘤相关抗原的报道包括Mizukami等人，Nature Med.11(2005)992-997；Hatfield等人，Curr.Cancer Drug Targets 5(2005)229-248；Vallbohmer等人，J.Clin.Oncol.23(2005)3536-3544；和Ren等人，Ann.Surg.242(2005)55-63)，关于所鉴定的TAA，每个都通过引用并入本发明。当疾病涉及淋巴瘤、白血病或自身免疫性疾病时，靶向的抗原可选自CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD54、CD67、CD74、CD79a、CD80、CD126、CD138、CD154、CXCR4、B7、MUC1或1a、HM1.24、HLA-DR、生腱蛋白、VEGF、P1GF、ED-B纤连蛋白、致癌基因、致癌基因产物(例如，c-met或PLAGL2)、CD66a-d、坏死抗原、IL-2、T101、TAG、IL-6、MIF、TRAIL-R1(DR4)和TRAIL-R2(DR5)。
针对上述抗原的抗体可用作结合位点或部分以制备本发明的双特异性抗体。可以针对两种不同的靶标制备许多双特异性抗体。
抗原对的实例包括CD19/CD3、BCMA/CD3、HER家族的不同抗原组合(EGFR、HER2、HER3)、IL17RA/IL7R、IL-6/IL-23、IL-1-β/IL-8、IL-6或IL-6R/IL-21或IL-21R、ANG2/VEGF、VEGF/PDGFR-β、血管内皮生长因子(VEGF)受体2/CD3、PSMA/CD3、EPCAM/CD3、选自VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3的抗原的组合、FLT3、c-FMS/CSF1R、RET、c-Met、EGFR、Her2/neu、HER3、HER4、IGFR、PDGFR、c-KIT、BCR、整联蛋白和具有选自以下水溶性配体的MMP：VEGF、EGF、PIGF、PDGF、HGF、和血管生成素、ERBB-3/C-MET、ERBB-2/C-MET、EGF受体1/CD3、EGFR/HER3、PSCA/CD3、C-MET/CD3、内皮唾酸蛋白/CD3、EPCAM/CD3、IGF-1R/CD3、FAPΑLPHA/CD3、EGFR/IGF-1R、IL 17A/F、EGF受体1/CD3、和CD19/CD16。双特异性抗体的其他实例可具有(i)针对抗原的糖表位的第一特异性，所述抗原选自Lewis x-、Lewis b-和Lewis y-结构、Globo H-结构、KH1、Tn-抗原、TF-抗原和粘蛋白的碳水化合物结构、CD44、糖脂和鞘糖脂类、如Gg3、Gb3、GD3、GD2、Gb5、Gm1、Gm2、和sialyltetraosylceramide，和(ii)针对ErbB受体酪氨酸激酶的第二特异性，所述ErbB受体酪氨酸激酶选自EGFR、HER2、HER3和HER4。GD2与第二抗原结合位点组合，其与免疫细胞相关，该免疫细胞选自T-淋巴细胞、NK细胞、B-淋巴细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、间充质干细胞、神经干细胞。
可以使用本发明公开的方法将单特异性或双特异性抗体与另一种单特异性或双特异性抗体连接在一起以制备多特异性抗体。通过使用已经可用的单特异性或双特异性治疗性结合实体，例如上述那些治疗性抗体，可以实现所需多特异性结合分子的快速且容易的生产。通过组合两种或更多种单一治疗分子以同时靶向和结合两种或更多种不同表位，从而定制产生多特异性治疗，由此，与单一治疗分子相比，可以预期加合/协同效应。
在一些实施方案中，本发明的多特异性分子使用特异性相互作用并显示对下列靶对的可测量亲和力的抗体对制备。
Figure BDA0002029096750000211
Figure BDA0002029096750000221
Figure BDA0002029096750000231
在一个优选的实施方案中，双特异性分子是两种抗体或其抗原结合片段的缀合物，它们分别与CD3和CD19特异性相互作用并对CD3和CD19显示出可测量的亲和力。每种抗体与人CD3或CD19结合，KD为1x10-6M或更小，例如，1x10-7M，5x10-8M，1x10-8M，5x10-9M，1x10- 9M或更小，或KD为1x10-8M至1x10-10M。评估抗体对抗原的结合能力的试验是本领域已知的，包括例如ELISA，蛋白质印迹和RIA。抗体的结合动力学(例如，结合亲和力)也可以通过本领域已知的标准测定来评估，例如通过Biacore分析。
在一些实施方案中，第一或第二识别结合部分包括感兴趣的抗体的重链和轻链、或相应的CDR1、CDR2和CDR3。例如，每个识别结合部分可以是单链抗体Fv区(scFv)。使用Kabat***描述CDR区(Kabat，E.A.，等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and HumanServices，NIH公开号91-3242)。下面列出的是抗CD3 scFv和抗CD19 scFv的氨基酸序列。
抗CD3 scFv序列(SEQ ID No：1):
Figure BDA0002029096750000241
抗CD19 scFv序列(SEQ ID No：2):
Figure BDA0002029096750000242
修饰
在一些实施方案中，抗体的VH和/或VL氨基酸序列可以与上述序列具有82％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性并保留相应的抗原结合活性和特异性。具有与上述序列的VH和VL区具有高(即80％或更高)同源性的VH和VL区的抗体可通过以下获得：诱变(如，定点诱变或PCR-介导的诱变)编码上述重链和轻链、或相关CDR1、CDR2和CDR3的核酸分子，然后使用本发明描述的功能测定测试所编码的改变的抗体的保留功能。
如本发明所用的，两个氨基酸序列之间的百分比同源性等同于两个序列之间的百分比同一性。两个序列之间的同一性百分比是这两个序列共有的相同位置的数目的函数(即，％同源性＝相同位置的数目/位置的总数目x100)，其中考虑到了为了两个序列的最佳比对所需要引入的缺口的数目和每个缺口的长度。两个序列之间的序列比较和同一性百分比的确定可以使用如下文的非限制性实例中描述的数学算法实现。
两个氨基酸序列之间的同一性百分比可以使用已整合入ALIGN程序(2.0版本)的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.，4:11-17(1988))的算法来确定，其使用PAM120权重残基表、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分。此外，两个氨基酸序列之间的同一性百分比可以使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com获得)的GAP程序的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48:444-453(1970))算法确定，其使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重和1、2、3、4、5或6的长度权重。
另外地或可选地，本发明的蛋白序列可进一步作为“查询序列”用于进行公共数据库的检索，例如，鉴定相关序列。此类检索可以使用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的XBLAST程序(2.0版本)进行。BLAST蛋白质检索可以用XBLAST程序、得分＝50、字长＝3进行，以获得与本发明的抗体分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的缺口比对，可以如Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中描述的使用缺口BLAST。当利用BLAST和缺口BLAST程序时，可以使用各自程序(如，XBLAST和NBLAST)的缺省参数。(参见www.ncbi.nlm.nih.gov)。
在一些实施方案中，本发明的识别结合部分包含：包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中这些CDR序列中的一个或多个包含基于本发明描述的优选抗体的指定氨基酸序列或其保守修饰，并且其中所述抗体保留了所需功能性质。
如本发明所述，术语“保守序列修饰”是指不显著影响或改变含有所述氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。此类保守修饰包括氨基酸取代、增加和缺失。可通过本领域已知的标准技术诸如定点诱变和PCR-介导的诱变向本发明的抗体引入修饰。保守氨基酸取代是其中将氨基酸残基取代为具有相似侧链的氨基酸残基的氨基酸取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中已经定义。这些家族包括：
具有碱性侧链(如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，
酸性侧链(如，天冬氨酸、谷氨酸)，
不带电荷的极性侧链(如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，
非极性侧链(如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)，
β-分支侧链(如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和
芳族侧链(如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。
因此，本发明的抗体的CDR区内的一个或多个氨基酸残基可以取代为来自相同侧链家族的其他氨基酸残基，并且可以使用本发明描述的功能测定测试改变的抗体的保留功能。
本发明的识别结合部分可以使用具有本发明所公开的一种或多种VH和/或VL序列的抗体作为起始材料来制备，以改造处修饰的抗体，该修饰的抗体与起始抗体相比可以具有改变的性质。可以通过修饰一个或两个可变区(即VH和/或VL)例如一个或多个CDR区内和/或一个或多个框架区内的一个或多个残基来改造抗体。另外地或可选地，可以通过修饰恒定区内的残基来改造抗体，例如改变该抗体的效应子功能。
可以进行的一种可变区工程化是CDR移植。抗体主要通过位于六个重链和轻链CDR中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。由于这个原因，CDR内的氨基酸序列比CDR外的序列在各个抗体之间更加多样化。由于CDR序列负责大多数抗体-抗原相互作用，因此通过构建如下的表达载体能够表达模拟特定天然存在抗体的性质的重组抗体：该表达载体包含来自特定天然存在抗体的CDR序列，该CDR序列被移植到来自具有不同性质的不同抗体的框架序列上(参见，例如，Riechmann，L.等人(1998)Nature 332:323-327；Jones，P.等人(1986)Nature 321:522-525；Queen，C.等人(1989)Proc.Natl.Acad.参见U.S.A.86:10029-10033；Winter的美国专利5,225,539，和Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
这些框架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或发表的参考文献中获得。例如，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在以下中发现：“VBase”人种系序列数据库(可从www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase获得)，以及Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Departmentof Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242；Tomlinson,I.M.等人(1992)"The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about FiftyGroups of VH Segments with Different Hypervariable Loops"J.Mol.Biol.227:776-798；和Cox,J.P.L.等人(1994)"A Directory of Human Germ-line VH Segments Revealsa Strong Bias in their Usage"Eur.J.Immunol.24:827-836；其内容均通过引用明确并入本发明。作为另一个实例，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在Genbank数据库中发现。
作为对框架区或CDR区内进行的修饰的附加或替代，本发明的抗体可被改造以包括在Fc区域内的修饰，通常用以改变所述抗体的一种或多种功能性质，诸如血浆半衰期、补体结合、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，本发明的抗体还可进行化学修饰(如可以在抗体上连接一个或多个化学部分)或进行修饰以改变其糖基化，同样是为了改变所述抗体的一种或多种功能性质。Fc区的残基编号是Kabat的EU指数编号。
在另一实施方案中，抗体的糖基化可被修饰。例如，可以改变糖基化以增加或减少抗体对抗原或Fc受体的亲和力。例如，此类糖修饰可以通过改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现。例如，可以进行一个或多个氨基酸取代，以造成一个或多个可变区构架糖基化位点的消除，进而消除该位点的糖基化。此方法在美国专利第8008449和6350861号中有进一步的详细描述。
效应子
在一些实施方案中，多特异性化合物或分子可以进一步与一个或多个效应子部分缀合，例如细胞毒素剂，如化疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如，蛋白质毒素、细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素、或其片段)、或放射性同位素。
在一些实施方案中，所述效应子部分可为药物，包括但不限于美登醇(参见美国专利5,208,020、美国专利5,416,064、EP 0 425 235)、澳瑞他汀(auristatin)如单甲基澳瑞他汀药物部分DE和DF(MMAE和MMAF，参见美国专利5,635,483、美国专利5,780,588、美国专利7,498,298)、多拉司他汀、刺孢霉素或其衍生物(参见美国专利5,712,374、美国专利5,714,586、美国专利5,739,116、美国专利5,767,285、美国专利5,770,701、美国专利5,770,710、美国专利5,773,001、美国专利5,877,296，Hinman，L.M.，等人，Cancer Res.53(1993)3336-3342，Lode，H.N.，等人，Cancer Res.58(1998)2925-2928)，蒽环类抗生素如道诺霉素或多柔比星(参见Kratz，F.，等人，Current Med.Chem.13(2006)477-523，Jeffrey，S.C.，等人，Bioorg.Med.Chem.Letters 16(2006)358-362，Torgov，M.Y.，等人，Bioconjug.Chem.16(2005)717-721，Nagy，A.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(2000)829-834，Dubowchik，G.M.，等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.12(2002)1529-1532，King，H.D.，等人，J.Med.Chem.45(2002)4336-4343，和美国专利6,630,579)、甲氨蝶呤、长春地辛、紫杉烷如多西紫杉醇、紫杉醇、拉洛他赛(larotaxel)、替司他赛(tesetaxel)和奥他赛(ortataxel)、单端孢霉烯和CC1065。
在其他实施方案中，效应子部分可以是酶活性毒素或其片段，包括但不限于白喉A链，白喉毒素的非结合活性片段，外毒素A链(来自绿脓杆菌)、蓖麻毒素A链(ricin Achain)、相思子毒素A链(abrin A chain)、蒴莲根毒素A链(modeccin A chain)、α-八叠球菌(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹蛋白(dianthin protein)、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)和单孢霉烯族毒素(tricothecenes)。
在其他一些实施方案中，效应子部分可以是放射性原子。有多种放射性同位素可用于生产放射性缀合物。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。当放射性缀合物用于检测时，它可以包括用于闪烁扫描研究的放射性原子，例如Tc99或I123，或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，MRI)的自旋标记，例如I123(再次)、I131、In111、F19、C13、N15、O17、钆、锰或铁。
效应子部分可以使用多种双官能蛋白质偶联剂缀合至如本发明公开的多特异性化合物或分子的任何组分，所述偶联剂如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、酰亚胺酯的双官能衍生物(如己二亚氨盐酸二甲酯)、活性酯(如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、醛(如戊二醛)、二-叠氮基组分(如二(对-叠氮基苯甲酰基)己烷二胺)、双-重氮衍生物(如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟组分(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可以如Vitetta，E.S.，等，Science 238(1987)1098-1104中所述制备蓖麻毒素免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸缀合到复合体上的示例性螯合剂(参见WO94/11026)。用于将毒素部分缀合到如本发明报道的复合体上的接头可以是利于在细胞中释放细胞毒素药物的“可裂解接头”。例如，可以使用酸不稳定接头、肽酶敏感的接头、光不稳定接头、二甲基接头或含二硫键的接头(Chari，R.V.，等人，Cancer Res.52(1992)127-131，美国专利5,208,020)。
效应子部分可缀合至本发明公开的多特异性化合物或分子，但不限于用以下交联剂制备的这种缀合物：包括但不限于，BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，它们为可商购的(例如，来自Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，Ill.，U.S.A)。
组合物
本发明还提供含有本发明的多特异性分子(其与药学上可接受的载体一起配制)的组合物，例如药物组合物。例如，本发明的药物组合物可包含与CD13和CD9结合的多特异性分子。
本发明的治疗制剂可以通过将具有所需纯度的多特异性分子与任选的生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition，Osol，A.Ed.(1980))混合来制备，以冻干制剂或水溶液的形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度下对接受者无毒，且包括缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲铵；苯扎氯铵，苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟苯甲酸烷基酯如对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)蛋白质，如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、或赖氨酸；单糖、二糖、和其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子如钠；金属络合物(例如、Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂如TWEEN、普朗尼克、或聚乙二醇(PEG)。
制剂还可含有一种以上所治疗的具体适应症所必需的活性化合物，优选那些具有互补活性且彼此不产生不利影响的活性化合物。例如，制剂可以进一步包含另一种抗体、细胞毒性剂或化学治疗剂。这些分子合适地以对预期目的有效的量组合存在。
活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、在胶状药物传递***中(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。此类技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.Ed.(1980)。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有多特异性分子的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质以定型产品的形式存在，如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利3,773,919)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOT(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够持续释放分子100天以上，但是一些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当封装的抗体在体内长时间维持时，它们可由于暴露于37℃的潮湿环境而变性或聚集，导致生物学活性损失和免疫原性的改变。可根据相关机制来设计合理的稳定化策略。例如，如果发现聚集机制是经由硫-二硫化物互换而形成分子间S-S键，那么可通过修饰巯基、由酸性溶液冻干、控制含水量、采用适宜添加剂和开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定化。
本发明的药物组合物可以组合疗法给药，即，与其它药剂联合。可用于组合疗法的治疗剂的实例在下面更详细的描述。
用于体内给药的制剂必须是无菌的。这可以通过穿过无菌过滤膜过滤容易地完成。可以如下制备无菌注射溶液：将所需量的活性化合物掺入根据需要含有上文所列举的一种成分或成分的组合的适当溶剂中，随后灭菌微滤。通常，通过将所述活性化合物掺入无菌媒介物来制备分散体，所述媒介物含有基本分散介质和来自上文列举的那些的所需其它成分。就用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末而言，优选的制备方法是从先前无菌过滤的活性成分和任何另外期望成分的溶液产生其粉末的真空干燥和冷冻干燥(冻干法)。
剂量
可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将随正在治疗的受试者和特定施用模式而变化。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常是产生治疗效果的组合物的量。通常，相对于100％，该量范围是约0.01％至约99％的活性成分，优选约0.1％至约70％，最优选约1％至约30％的活性成分，其与药学上可接受的载体组合。
调整剂量方案以提供最佳的所需反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单次推注，可以随时间施用几个分开的剂量，或者可以根据治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。以剂量单位形式配制肠胃外组合物以便于给药和剂量均匀是特别有利的。如本发明所用的剂量单位形式是指适合作为待治疗受试者的单位剂量的物理上离散的单元：每个单元含有预定量的活性化合物，经计算可与所需的药物载体一起产生所需的治疗效果。本发明的剂量单位形式的规格由以下决定并且直接取决于以下：(a)活性化合物的独特特征和要实现的特定治疗效果，和(b)本领域组合这种活性化合物用以治疗个体敏感性中固有的局限性。
对于本发明的多特异性分子的给药，剂量范围为相对于宿主体重，约0.0001至100mg/kg，更通常为0.01至50mg/kg。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg范围内。示例性治疗方案需要每周施用两次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每三个月一次或每三至六个月一次。本发明的多特异性分子的优选剂量方案包括通过静脉内施用1mg/kg体重或3mg/kg体重，使用以下给药方案之一给予多特异性分子：(i)每四周持续六个剂量，然后每三个月；(ii)每三周一次；(iii)3mg/kg体重一次，然后每3周1mg/kg体重。
或者，多特异性分子可作为持续释放制剂给予，其中需要不太频繁的给予。剂量和频率根据患者中多特异性分子的半衰期而变化。一般地，人抗体显示最长的半衰期，然后是人源化抗体、嵌合抗体和非人抗体。给予的剂量和频率能根据该治疗是预防性还是治疗性而变化。预防性应用中，在长时间段中以相对不频繁间隔给予相对较低剂量。一些患者在其余生中继续接受治疗。治疗性应用中，有时需要采用相对较短间隔的相对较高剂量，直到疾病进程降低或终止，且优选直到患者显示部分或完全的疾病症状改善。之后，可给予患者预防性方案。
本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可变化，从而获得就特定患者、组合物、给予模式而言有效达到所需治疗响应的活性成分量，而对患者没有毒性。所选剂量水平取决于多种药代动力学因素，包括所用的本发明特定组合物的活性、给予途径、给予时间、所用特定化合物的***率、治疗持续时间、与所用特定组合物联用的其他药物、化合物和/或材料、所治疗患者的年龄、性别、重量、病症、总体健康和既往病史、和医学领域熟知的其他因素。
“治疗有效剂量”的本发明多特异性分子优选引起疾病症状严重性减小、无疾病症状阶段的频率和持续时间增加、或预防归因于疾病影响的损伤或残疾。例如，对于肿瘤的治疗，相对于未治疗的受试者，“治疗有效剂量”优选抑制细胞生长或肿瘤生长或转移达至少约20％，更优选至少约40％，还更优选至少约60％，还更优选至少约80％。可以在预测人肿瘤功效的动物模型***中评估药剂或化合物抑制肿瘤生长的能力。或者，组合物的这种性质可以通过检查化合物抑制的能力来评估，这种抑制在体外通过本领域技术人员已知的测定进行。治疗有效量的治疗化合物可以减少肿瘤大小、转移或改善受试者的症状。本领域普通技术人员将能够基于诸如受试者的体型、受试者症状的严重性和所选择的特定组合物或给药途径等因素来确定这样的量。
给药
本发明的组合物可以使用本领域已知的多种方法中的一种或多种通过一种或多种给药途径给药。如本领域技术人员所理解的，给药途径和/或方式将根据所需结果而变化。本发明抗体的优选给药途径包括静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其它胃肠外给药途径，例如通过注射或输注。本发明所用的短语“肠胃外给药”是指除肠内和局部给药以外的给药方式，通常通过注射，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹腔内、经气管、皮下、表皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。或者，本发明的多特异性分子可以通过非肠胃外途径给药，例如局部、表皮或粘膜给药途径，例如，鼻内、口服、***、直肠、舌下或局部给药。
活性化合物可以用载体制备，所述载体将保护化合物免于快速释放，例如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微囊化递送***。可以使用可生物降解的，生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类制剂的许多方法是专利的或本领域技术人员通常已知的。参见，例如，Sustained and ControlledRelease Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
治疗组合物可以用本领域已知的医疗装置施用。例如，本发明的治疗组合物可以用无针皮下注射装置施用，例如美国专利No.5399163、5383851、5312335、5064413、4941880、4790824和4596556中公开的装置。用于本发明的众所周知的植入物和组件的实例包括美国专利4487603、4486194、4447233、4447224、4439196和4475196中所述的那些。这些专利通过引用结合到本发明中。许多其他这样的植入物、递送***和组件是本领域技术人员已知的。
治疗方法
在一个方面，本发明涉及使用上述多特异性分子在体内治疗受试者，从而抑制癌性肿瘤的生长和/或转移。在一个实施方案中，本发明提供抑制受试者中肿瘤细胞的生长和/或限制转移性扩散的方法，包括向受试者施用治疗有效量的多特异性分子。
所治疗的优选癌症的非限制性实例包括慢性或急性白血病，包括急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、乳腺癌、卵巢癌、黑素瘤(例如、转移性恶性黑素瘤)、肾癌(例如透明细胞癌)、***癌(例如激素难治性***癌)、结肠癌和肺癌(例如非小细胞肺癌)。此外，本发明包括难治性或复发性恶性肿瘤，其生长可以使用本发明的抗体来抑制。可使用本发明的方法治疗的其它癌症的实例包括骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌症、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、直肠癌、***区癌症、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、***、***癌、外阴癌、霍奇金疾病、非霍奇金淋巴瘤、食管癌、小肠癌、内分泌***癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、***癌、儿童实体瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经***(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤,肿瘤血管发生、脊髓轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、Kaposi肉瘤、表皮样癌、鳞状上皮细胞癌症、T-细胞淋巴瘤、环境诱导的癌症包括石棉诱导的癌症，以及所述癌症的组合。
如本发明所用，术语“受试者”旨在包括人和非人动物。非人类动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人类灵长类动物、羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖动物和爬行动物，但哺乳动物是首选，如非人类灵长类动物、羊、狗、猫、牛和马。优选的受试者包括需要增强免疫应答的人类患者。该方法特别适用于治疗患有可通过增强免疫应答来治疗的病症的人类患者。
上述治疗也可以与标准癌症治疗组合。例如，它可以与化学治疗方案有效地组合。在这些情况下，可以减少施用的化学治疗剂的剂量(Mokyr，M.等人(1998)Cancer Research58：5301-5304)。
可以用于激活宿主免疫应答的其他抗体可以与本发明的多特异性分子组合使用。这些包括靶向树突细胞表面的分子，其激活DC功能和抗原呈递。例如，抗CD40抗体能够有效地替代T细胞辅助活性(Ridge，J.等人(1998)Nature 393：474-478)，并且可以与本发明的多特异性分子结合使用(Ito，N.等人(2000)Immunobiology 201(5)527-40)。类似地，靶向T细胞共刺激分子的抗体例如CTLA-4(例如，美国专利号5,811,097)、CD28(Haan，J.等人(2014)Immunology Letters 162：103-112)、OX-40(Weinberg，A.等人(2000)Immunol 164：2160-2169)、4-1BB(Melero，I.等人(1997)Nature Medicine 3：682-685(1997)和ICOS(Hutloff，A.等人(1999)Nature 397：262-266)或靶向PD-1的抗体(美国专利号8008449)PD-1L(美国专利号7943743和8168179)也可提供增加水平的T细胞活化。在另一个实例中，本发明的多特异性分子可以与抗肿瘤抗体联合使用，例如RITUXAN(利妥昔单抗)、赫赛汀(曲妥单抗)、BEXXAR(托西莫单抗)、ZEVALIN(替伊莫单抗)、CAMPATH(阿仑单抗)、LYMPHOCIDE(依帕珠单抗)、阿瓦斯丁(贝伐单抗)和TARCEVA(埃罗替尼)等。
术语的定义
术语“肽”、“多肽”和“蛋白”在本发明中可互换地用于描述聚合物中氨基酸残基的排列。除了稀有氨基酸和合成氨基酸类似物之外，肽、多肽或蛋白还可以由标准的20种天然存在的氨基酸组成。它们可以是氨基酸的任何链，无论何种长度或翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)。
“重组”肽、多肽或蛋白质是指通过重组DNA技术产生的肽、多肽或蛋白质；即，由编码所需肽的外源DNA构建体转化的细胞产生。“合成的”肽、多肽或蛋白质是指通过化学合成制备的肽、多肽或蛋白质。当与参考例如细胞、或核酸、蛋白质或载体一起使用时，术语“重组”表示细胞、核酸、蛋白质或载体已通过引入异源核酸或蛋白质或天然核酸或蛋白质的改变而被修饰，或细胞来源于如此修饰的细胞。在本发明范围内的是含有一种或多种上述序列和异源序列的融合蛋白。异源多肽、核酸或基因是源自外来物种，或者，如果来自相同物种，则基本上从其原始形式修饰。如果两个融合结构域或序列在天然存在的蛋白质或核酸中彼此不相邻，则它们彼此是异源的。
“分离的”肽、多肽或蛋白是指已经从与其天然关联的其它蛋白、脂质和核酸分开的肽、多肽或蛋白。多肽/蛋白可以构成纯化制剂干重的至少10％(即，10％至100％之间的任何百分比，例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和99％)。纯度可以通过任何适当的标准方法测量，例如通过柱色谱法，聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析。本发明中描述的分离的多肽/蛋白可以纯化自天然来源、通过重组DNA技术或通过化学方法产生。
“抗原”是指引发免疫反应或与该反应的产物结合的物质。术语“表位”是指抗体或T细胞结合的抗原区域。
如本发明所用，“抗体”以最广泛的含义使用，并且尤其涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们具有所需的生物活性。
如本发明所用，“抗体片段”可以包含完整抗体的一部分，通常包括完整抗体的抗原结合区和/或可变区和/或抗体的保留FcR结合能力的Fc区。抗体片段的实例包括直链抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。优选地，抗体片段保留IgG重链的整个恒定区，并且包括IgG轻链。
如本发明所用，术语“Fc片段”或“Fc区”用于限定免疫球蛋白重链的C末端区。
如本发明使用的术语“单克隆抗体”是指从基本同源抗体的群体获得的抗体，即构成该群体的单个抗体除了可能少量存在的可天然发生的突变以外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，与常规(多克隆)抗体制剂(通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体)相反，各单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。修饰语“单克隆”表明从基本同源的抗体群体获得的抗体的特征，并不理解为需要通过任何特定的方法来产生该抗体。例如，本发明使用的单克隆抗体可以通过杂交瘤方法进行制备(该方法首先在Kohler和Milstein，Nature，256，495-497(1975)中描述，其通过引用方式结合在本发明中)，或者可以通过重组DNA方法进行制备(参见例如美国专利No.4,816,567，其通过引用方式结合在本发明中)。单克隆抗体还可以通过使用例如Clackson等人，Nature，352，624-628(1991)和Marks等人，J Mol Biol，222，581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离，各文献通过引用方式结合在本发明中。
本发明的单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类型或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而该链中的剩余部分与源自另一物种或属于另一抗体类型或亚类的抗体及这些抗体的片段中的相应序列相同或同源，只要它们表现出所需的生物学活性即可(参见美国专利号4,816,567；Morrison等人，Proc Natl Acad Sci USA，81，6851-6855(1984)；Neuberger等人，Nature，312，604-608(1984)；Takeda等人，Nature，314，452-454(1985)；国际专利申请No.PCT/GB85/00392，其各通过引用方式结合在本发明中)。
非人(例如鼠科动物)抗体的“人源化”形式是包含源自非人类免疫球蛋白的最少序列的嵌合抗体。对于绝大部分而言，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的超变区的残基被来自非人物种(供体抗体)(如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物)的具有希望的特异性、亲和力和能力的超变区的残基取代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人类残基取代。此外，人源化抗体可以包含未在受体抗体或供体抗体中出现的残基。进行这些修饰来进一步优化抗体的性能。通常，人源化抗体包括至少一个且通常两个可变域的基本全部，其中所有或基本所有的超变环对应于非人类免疫球蛋白的那些超变环，并且所有或基本所有的FR残基是人免疫球蛋白序列的那些残基。任选地，人源化抗体还包含至少免疫球蛋白恒定区(Fc)的一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区(Fc)。进一步细节可以参见Jones等人，Nature，321，522-525(1986)；Riechmann等人，Nature，332，323-329(1988)；Presta，Curr Op Struct Biol，2，593-596(1992)；美国专利5,225,539，其各通过引用方式结合在本发明中。
“人抗体”是指具有完全人序列的任何抗体，例如可以从人杂交瘤、人噬菌体展示文库或表达人抗体序列的转基因小鼠获得。
术语“药物组合物”是指活性剂与惰性或活性的载体的组合，使得该组合物特别适合于体内或离体的诊断或治疗用途。
如本发明所用，“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。“药学上可接受的载体”在给药于受试者或施用于受试者后不会引起不希望的生理作用。药物组合物中的载体必须是“可接受的”，也意味着它与活性成分相容并且能够稳定它。一种或多种增溶剂可用作药物载体以递送活性剂。药学上可接受的载体的实例包括但不限于生物相容性载体、佐剂、添加剂和稀释剂，以获得可用作剂型的组合物。其他载体的实例包括胶体氧化硅、硬脂酸镁、纤维素和十二烷基硫酸钠。Remington's Pharmaceutical Sciences描述了其他合适的药物载体和稀释剂，以及它们使用的药物必需品。优选地，载体适用于静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(例如，通过注射或输注)。治疗化合物可包括一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指保留母体化合物的所需生物活性并且不会产生任何不期望的毒理学作用的盐(参见例如，Berge，S.M.，等人(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。
本发明所用的术语“细胞毒性剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语旨在包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)，化学治疗剂和毒素，例如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体。
"化疗剂"为用于治疗癌症的化合物。化疗剂的实例包括烷化剂如塞替派和环磷酰胺(CYTOXANTM)；烷基磺酸酯如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶如benzodopa、卡波醌、meturedopa和uredopa；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺包括六甲蜜胺、曲他胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代亚磷酰胺和三羟甲基三聚氰胺；聚乙酸类(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康)；苔藓抑素；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；念珠藻素(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；多拉司他汀；多卡霉素(包括合成类似物、KW-2189和CBI-TMI)；eleutherobin；水鬼蕉碱；sarcodictyin；海绵抑制素；氮芥如苯丁酸氮芥、萘氮芥、环磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、氮芥氧化物盐酸盐、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素如烯二炔抗生素(例如刺孢霉素、参见例如，AgnewChem.Intl.Ed.Engl.33:183-186(1994)；dynemicin，包括dynemicin A；埃斯培拉霉素；以及新制癌菌素发色团和相关色蛋白烯二炔抗生素发色团)、aclacinomysins、放线菌素、authramycin、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、carabicin、caminomycin、嗜癌霉素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、麦考酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、potfiromycin、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢产物如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物如denopterin、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物如安西他滨、阿扎胞苷、6-阿扎胞苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU；雄激素如卡普睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酪；抗肾上腺药如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充物如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；bestrabucil；比生群；edatraxate；defofamine；地美可辛；地吖醌；elformithine；依利醋铵；埃博霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；蘑菇多糖；氯尼达明；美登醇如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；nitracrine；喷司他丁；苯来美特；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；
Figure BDA0002029096750000391
雷佐生；根霉素；sizofuran；螺旋锗；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯(尤其是T-2毒素、verracurin A、杆孢菌素A和anguidine)；尿烷；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷("Ara-C")；环磷酰胺；塞替派；紫杉烷、例如紫杉醇(
Figure BDA0002029096750000392
Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)和多西他赛(
Figure BDA0002029096750000393
Rhone-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；诺安托；替尼泊苷；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；卡培他滨；和上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。该定义还包括作用于调节或抑制对肿瘤的激素作用的抗激素试剂，如抗***类，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、酮替芬、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬(Fareston)；和抗雄激素如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；和上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
如本发明所用，“治疗”(treating或treatment)是指向患有疾病或有发展疾病风险的受试者施用化合物或药剂，目的是治愈、缓解，减轻、补救、延缓其发作、预防或改善疾病、疾病的症状、继发于疾病的疾病状态或对疾病的易感性。
“有效量”是指赋予治疗对象治疗效果所需的活性化合物/药剂的量。如本领域技术人员所认识到的，有效剂量将根据所治疗病症的类型、给药途径、赋形剂的使用以及与其他治疗性治疗共同使用的可能性而变化。***病症的治疗有效量的组合是与未治疗的动物相比将导致例如肿瘤尺寸减小、肿瘤灶数量减少或肿瘤生长减慢的量。
如本发明所公开的，提供了许多值范围。应当理解，除非上下文另有明确规定，否则还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值，至下限单位的十分之一。在所述范围内的任何规定值或中间值与所述范围内的任何其他陈述或中间值之间的每个较小范围都包含在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在该范围内或排除在该范围外，并且在较小范围内包括任一个、零个或两个限制的每个范围也包括在本发明内，受制于规定的范围内任何特别排除的限制。在所述范围包括一个或两个限制的情况下，排除那些包括的限制之一或两者的范围也包括在本发明中。
术语“约”通常是指所示数字的加或减10％。例如，“约10％”可表示9％至11％的范围，“约1”可表示0.9-1.1。从上下文中可以明显看出“约”的其他含义，例如四舍五入，因此，例如“约1”也可以表示0.5至1.4。
实施例
实施例1.制备30kmPEG-Lys(马来酰亚胺)-炔烃(图1A)
制备30kmSC-PEG(化合物2):
将25g 30kmPEG-OH(MW＝30000，1当量)与360mL试剂甲苯共沸2小时以去除75mL甲苯/水。共沸后，将溶液冷却至45-50℃。将166mg三光气(0.67当量)添加至PEG，然后添加131.8mg无水吡啶(2当量)。反应物在50℃搅拌3小时。然后添加239.8mgN-羟基琥珀酰亚胺(2.5当量)，然后添加164.8g无水吡啶(2.5当量)。将反应混合物在50℃在氮气下搅拌过夜。过滤吡啶盐。溶剂用旋转蒸发器去除，且残余物从2-丙醇重结晶。分离的产物在真空烘箱中在40℃干燥以得到23g 30kmSC-PEG。
制备30kmPEG-Lys(Boc)-OH(化合物3):
将369mg H-lys(boc)-OH(3当量)、646.5mg DIEA(10当量)和15g30kmSCPEG(1当量)在100mL DMF和150ml DCM中混合。将混合物在室温搅拌过夜。过滤掉不溶物质。去除溶剂且将残余物从2-丙醇重结晶。将分离的产物在40℃真空干燥以得到12.8g 30kmPEG-Lys(Boc)-OH。
制备30kmPEG-Lys(Boc)-炔烃(化合物4):
将11g 30kmPEG-Lys(Boc)-OH(1当量)溶于110mL DCM且冷却至0-5℃。添加101.4mg 1-氨基-3-丁炔(4当量)，然后添加402.6mg DMAP(9当量)和422.4mg EDC(6eq)。将混合物在0-5℃搅拌1小时。去除冷却且反应在室温过夜。去除溶剂且残余物从2-丙醇重结晶。分离的产物在40℃真空干燥以得到10.4g 30kmPEG-Lys(Boc)-炔烃。
制备30kmPEG-Lys-炔烃(化合物5):
将10g 30kmPEG-lys(Boc)-炔烃用150mL TFA/DCM(1:2)在室温处理1hr。真空去除溶剂。残余物从***/DCM重结晶。分离的产物在40℃真空干燥以得到9.5g 30kmPEG-Lys-炔烃。
制备30kmPEG-Lys(马来酰亚胺)-炔烃(化合物6):
将9g 30kmPEG-lys-炔烃(1当量)溶于90mL DCM。在0/5℃先后添加774mg DIEA(20eq)和281mg NHS-PEG2-Mal(2.2eq)。将混合物在室温搅拌过夜。去除溶剂且残余物从2-丙醇重结晶。分离的产物真空干燥以得到8g 30kmPEG-Lys(马来酰亚胺)-炔烃。
实施例2.制备40kY-PEG-Lys(马来酰亚胺)-炔烃(图1B)
制备40k-Y-PEG-Lys(Boc)-OH(化合物3a):
将246mg H-lys(boc)-OH(4当量)、323mg DIEA(10当量)和10g40k-Y-PEG-NHS(1当量)在100mL DMF和100ml DCM中混合。将混合物在室温搅拌过夜。过滤掉不溶物质。去除溶剂且残余物从2-丙醇重结晶。分离的产物在40℃真空干燥以得到9.1g 40k-Y-PEG-Lys(Boc)-OH。
制备40k-Y-PEG-Lys(Boc)-炔烃(化合物4a):
将9g 40k-Y-PEG-Lys(Boc)-OH(1当量)溶于90mL DCM且冷却至0-5℃。添加62.3mg1-氨基-3-丁炔(4当量)，然后添加247mg DMAP(9当量)和259mg EDC(6eq)。将混合物在0-5℃搅拌1小时。去除冷却且将反应物在室温过夜。去除溶剂且残余物从2-丙醇重结晶。分离的产物在40℃真空干燥以得到8.4g 40k-Y-PEG-Lys(Boc)-炔烃。
制备40k-Y-PEG-Lys-炔烃(化合物5a):
将8.2g 40k-Y-PEG-lys(Boc)-炔烃用120mL TFA/DCM(1:2)在室温处理1hr。真空去除溶剂。残余物从***/DCM重结晶。分离的产物在40℃真空干燥以得到7.9g 40k-Y-PEG-Lys-炔烃。
制备40k-Y-PEG-Lys(马来酰亚胺)-炔烃(化合物6a):
将7.68g 40k-Y-PEG-lys-炔烃(1当量)溶于80mL DCM。在0/5℃先后添加495mgDIEA(20eq)和204mg NHS-PEG2-Mal(2.5eq)。将混合物在室温搅拌过夜。去除溶剂且残余物从2-丙醇重结晶。分离的产物真空干燥以得到7.24g 40k-Y-PEG-Lys(马来酰亚胺)-炔烃。
实施例3.制备30kmPEG-Lys(马来酰亚胺)-DBCO(图1C)
制备30kmPEG-Lys(Boc)-DBCO(化合物4b):
将6g 30kmPEG-Lys(Boc)-OH(1当量)溶于60mL DCM且冷却至0-5℃。添加221.1mgNH2-DBCO(4当量)，然后添加219.6mg DMAP(9当量)和230.4mg EDC(6eq)。将混合物在0-5℃搅拌1小时。去除冷却且反应物在室温过夜。去除溶剂且残余物从2-丙醇重结晶。分离的产物在40℃真空干燥以得到5.7g 30kmPEG-Lys(Boc)-炔烃。
制备30kmPEG-Lys-DBCO(化合物5b):
在室温将5.7g 30kmPEG-lys(Boc)-DBCO用86mL TFA/DCM(1:2)处理1hr。真空去除溶剂。残余物从***/DCM重结晶。分离的产物在40℃真空干燥以得到5.5g 30kmPEG-Lys-炔烃。
制备30kmPEG-Lys(马来酰亚胺)-DBCO(化合物6b):
将5.5g 30kmPEG-lys-DBCO(1当量)溶于55mL DCM。在0/5℃先后添加473mg DIEA(20eq)和195mg NHS-PEG2-Mal(2.5eq)。将混合物在室温搅拌过夜。去除溶剂且残余物从2-丙醇重结晶。分离的产物真空干燥以得到5.1g 30kmPEG-Lys(马来酰亚胺)-DBCO。
实施例4.制备SCACD3和SCACD19
使用含有pPICZ载体的EasySelectTM毕赤酵母表达试剂盒，通过重组DNA技术在巴斯德毕赤酵母中制备单链抗体(SCA)片段抗CD3(SCACD3)和抗CD19(SCACD19)。合成编码抗CD3VH-VL和抗CD19VL-VH的基因并将其克隆到pPIZA表达载体中并在巴斯德毕赤酵母X33菌株中转化。通过甲醇诱导SCA的表达并通过Ni-螯合树脂纯化。为了促进随后的缀合，通过重组DNA技术将位点特异性官能团巯基***到VH和VL之间的接头中用于SCACD3和SCACD19。通过色谱法获得纯SCACD3和SCADCD19。下面列出了SCACD3和SCACD19的DNA序列。
pUC57中SCACD3的DNA序列(SEQ ID NO：3):
Figure BDA0002029096750000421
pUC57中SCACD19的DNA序列(SEQ ID NO：4):
Figure BDA0002029096750000431
实施例5.使用点击化学在没有Cu催化剂的情况下制备30kmPEG-(SCACD3)SCACD19(图2A)
制备叠氮化物-PEG10-马来酰亚胺(化合物9):
将15mg 4-马来酰亚胺基丁酸N-琥珀酰亚胺基酯(1当量)与38mg叠氮基-dPEG10-胺(1.5当量)在200μl DMSO中在室温反应45分钟。所得化合物叠氮化物-PEG10-马来酰亚胺直接用于下一步而不用进一步纯化。
制备叠氮化物-SCACD19(化合物10):
将31mg SCACD19(1当量)(1-5mg/ml)通过20mM Tris，1.5％PEG600，pH8.0中的2-8mM TCEP-HCl还原30分钟。将还原的SCADCD19(1当量)添加至200μl双官能接头叠氮化物-PEG10-马来酰亚胺(50当量)中。将混合物涡旋且在振动器中在室温保持3小时。反应通过100μl 200mM半胱氨酸在室温淬灭10分钟。过量接头叠氮化物-PEG10-马来酰亚胺通过脱盐柱HiPrepTM26/10(Cat#17-5087-01，GE Healthcare，NJ)使用20mM Tris，1.5％PEG600，pH8.0缓冲液、然后通过CaptoTMQ(GE Healthcare，NJ)柱去除。收集源自CaptTMQ的级分且通过SimplerBlueTM染色的SDS-PAGE分析。基于SDS-PAGE图谱，汇集所需化合物叠氮化物-SCACD19级分，浓缩至1-5mg/ml且储存在冰箱中用于进一步使用。
制备30kmPEG-Lys(SCACD3)-DBCO(化合物11):
将24mg SCACD3(1当量)(1-5mg/ml)通过20mM磷酸钠、1.5％PEG600、pH6.0中的2-5mM TCEP-HCl还原30min，将还原的24mg SCADCD3(1当量)与20mM磷酸钠、1.5％PEG600、pH6.0中的264mg 30KmPEG-Lys(马来酰亚胺)-DBCO(10当量)混合。将混合物涡旋且在振动器中在室温保持约3小时。将30kmPEG-Lys(SCACD3)-DBCO通过用20mM磷酸钠、1.5％PEG600、pH6.0预平衡的20mL CM Sepgharose Fast Flow(GE Healthcare)柱纯化。装载样品后，将柱通过10CV平衡缓冲液洗涤以完全洗涤掉游离PEG，然后通过0.5M NaCl洗脱。收集级分且通过SimplerBlueTM和碘染色的SDS-PAGE分析。基于SDS-PAGE图谱，汇集30kmPEG-Lys(SCACD3)-DBCO，且浓缩至1-5mg/ml。缓冲液更换为PBS以用于进一步使用。
制备30kmPEG-SCACD3/SCACD19(化合物12):
通过在PBS中在室温下以1：1摩尔比的点击化学过夜实现30kmPEG-Lys(SCACD3)-DBCO(化合物11)与叠氮化物-SCACD19(化合物10)的缀合。如下进行目标PEG化双特异性抗体30kmPEG-SCACD3/SCACD19的纯化：首先通过使用20mM Tris，pH8.0缓冲液的HiPrepTM26/10脱盐柱，然后是DEAE Fast Flow Sepharose(GE Healthcare，NJ)和CM Fast FlowSepharose(GE Healthcare)。所有柱色谱纯化均与上述方法类似地进行。收集级分并通过SimplerBlueTM和碘染色的SDS-PAGE分析。基于SDS-PAGE图谱，合并最终的双特异性抗体产物并在PBS，pH7.4中浓缩至～1mg/ml。通过SEC-HPLC和基于细胞的活性测定确认目标化合物。
实施例6.在没有Cu催化剂的情况下使用点击化学制备30kmPEG-(SCACD3)SCACD19(图2B)
制备30kmPEG-Lys(SCACD3)-炔烃(化合物11a):
将24mg SCACD3(1当量)(1-5mg/ml)通过20mM磷酸钠、1.5％PEG600、pH6.0中的2-5mM TCEP-HCl还原30min。将还原的24mg SCADCD3(1当量)与20mM磷酸钠、1.5％PEG600、pH6.0中的264mg 30KmPEG-Lys(马来酰亚胺)-炔烃(10当量)混合。将混合物涡旋且在振动器中在室温保持约3小时。将30kmPEG-Lys(SCACD3)-炔烃(化合物11a)通过用20mM磷酸钠、1.5％PEG600、pH6.0平衡的20mL CM Sepgharose Fast Flow(GE Healthcare)柱纯化。装载样品后，将柱通过10CV平衡缓冲液洗涤以完全洗涤掉游离PEG，然后通过0.5M NaCl洗脱。收集级分且通过SimplerBlueTM和碘染色的SDS-PAGE分析。基于SDS-PAGE图谱，汇集30kmPEG-Lys(SCACD3)-炔烃，且浓缩至1-5mg/ml。缓冲液更换为PBS以用于进一步使用。
制备30kmPEG-SCACD3/SCACD19(化合物12a):
30kmPEG-Lys(SCACD3)-炔烃(化合物11a)与叠氮化物-SCACD19(化合物10)的缀合在15μM Cu(I)和30μM三(苄基***基甲基)胺(TBTA)(在DMSO中预制备)的存在下通过点击化学以1:1摩尔比在PBS中在室温过夜而实现。
靶标PEG化双特异性抗体30kmPEG-SCACD3/SCACD19(化合物12a)的纯化类似于实施例5中化合物12所述进行。
实施例7.生物数据(图3和4)
体外T细胞介导的细胞毒性
进行体外bscCD19xCD3细胞毒性测定以评估PEG化双特异性抗体化合物12的细胞毒性效力。该研究用于证明DSP-BsAb技术是制备双特异性抗体的替代技术，其能够募集效应细胞以破坏癌细胞，从而用于肿瘤免疫疗法。使用颜色度量LDH释放测定法测定化合物12的细胞毒性。用GraphPad Prism 6拟合的4参数逻辑非线性回归模型分析半数最大有效浓度(EC50)值。
简而言之，对于该研究，将保持在37℃/5％CO2的完全培养基中的靶Raji细胞(B淋巴瘤细胞系)与不同浓度的化合物12(在添加之前用补充有1％FBS的不含酚红的MEM培养基稀释)一起在37℃孵育0.5小时。通过CD8+T细胞分离试剂盒从PBMC(来自20个健康个体)分离的CD8+T细胞作为效应细胞(E：T比＝5：1)添加。将化合物12、Raji细胞和效应细胞的混合物在37℃/5％CO2下进一步温育24小时。收集上清液以用LDH试剂盒测定细胞活力。读取OD492nm和OD650nm处的吸光度数据。对减去背景(OD650nm)的OD492nm数据进行分析以研究LDH释放。细胞裂解的百分比根据下式计算：
细胞裂解％＝100*(OD样品数据-OD靶细胞加效应细胞)/(OD最大释放–OD最小释放)
结果(平均值±SD，(n＝3))显示在图3中。分析数据列于表1中。EC50值为8.24ng/ml，表明化合物12对靶细胞具有显著的细胞毒性。此外，化合物12还显示出对靶细胞的剂量依赖性杀伤能力。
表1.体外bscCD19xCD3细胞毒性测定的最佳拟合值总结
Figure BDA0002029096750000461
体内药代动力学
本研究旨在证明此处公开的DSP-BsAb技术可以显著延长传统单链双特异性抗体的消除半衰期。在向大鼠静脉注射1mg/kg后测定PEG化的单链双特异性抗体的药代动力学。由于聚乙二醇化缀合物在大鼠中的半衰期通常为人类的5分之一，因此本研究中大鼠中PEG化单链双特异性抗体的半衰期应达到约10小时或更长时间，以便可以每周对人给药一次。
对于该研究，实验如下进行：无肿瘤Sprague-Dawley雄性大鼠(约250g，n＝3)配有两个颈静脉插管(JVC)。在给药前对动物禁食至少12小时直至给药后4小时。随意提供水。通过JVC静脉注射大鼠，单次注射1mg/kg双特异性抗体化合物12。在不同时间点(给药前、30分钟、1、2、4、8、12、24和48小时)，从颈静脉插管或尾静脉取约0.3ml血样并置于含有肝素钠的冷冻管中。将样品在4℃下离心并收集血浆并冷冻直至测定。
通过使用ELISA测定进行药代动力学分析。简言之，首先在2-8℃下用CD19抗原包被微孔板过夜，同时用PBS中的2％BSA封闭表面上的任何非特异性结合位点。在施用大鼠血浆样品之前，用PBS、0.05％v/v Tween 20洗涤平板3x5分钟。在37℃温育1.5小时后，用PBS、0.05％v/v Tween20洗涤平板3×5分钟，然后在37℃结合抗PEG抗体1小时。在施加酶联抗体之前，用PBS、0.05％v/v Tween20洗涤平板3x5分钟。然后用酶底物处理平板以显色，并用1N硫酸终止。从校准曲线计算化合物12的血浆浓度并相对于时间作图。结果显示(图4和表2)化合物12在大鼠中提供比博纳吐单抗(t1/2<0.5小时)更长的消除半衰期(T1/2＝27.48小时)，博纳吐单抗是非PEG化形式的单链CD19/CD3双特异性抗体。
表2.药代动力学分析
Figure BDA0002029096750000462
Figure BDA0002029096750000471
前述实施例和优选实施例的描述应被视为说明，而不是限制由权利要求限定的本发明。如将容易理解的，在不脱离如权利要求中所阐述的本发明的情况下，可以利用上述特征的许多变化和组合。这些变化不被视为脱离本发明的范围，并且所有这些变化旨在被包括在所附权利要求的范围内。本发明引用的所有参考文献均以引用的方式整体并入本发明。
序列表
<110> 普林斯顿持久生物技术公司
Liu, Shu-Min
Wu, Dechun
<120> 长效多特异性分子和相关方法
<130> 150064-00103
<150> 62/408,865
<151> 2016-10-17
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单链抗体Fv
<400> 1
Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Cys Gly Ser Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln
130 135 140
Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr
145 150 155 160
Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala
180 185 190
Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr
195 200 205
Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr
210 215 220
Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Glu Leu Lys
<210> 2
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单链抗体Fv
<400> 2
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr
85 90 95
Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Cys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
115 120 125
Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser Ser
130 135 140
Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp
145 150 155 160
Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
165 170 175
Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys
180 185 190
Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met
195 200 205
Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala
210 215 220
Arg Arg Glu Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
225 230 235 240
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
245 250
<210> 3
<211> 732
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单链抗体(SCA)片段
<400> 3
gacatcaaac tgcaacaaag cggtgctgaa ctggcacgtc cgggcgcatc cgtcaaaatg 60
agctgtaaga cctcgggcta taccttcacc cgttacacga tgcattgggt caagcagcgt 120
ccgggtcaag gtctggaatg gattggttat atcaacccgt ctcgtggcta caccaactac 180
aaccagaagt tcaaggataa ggcaaccctg accacggaca aaagctctag tacggcttat 240
atgcaactgt cctcactgac ctctgaagat agtgcggtgt attactgcgc ccgctattac 300
gatgaccact attgtctgga ctactggggc cagggtacca cgctgacggt gtcgagcgtt 360
gaaggcggtt ccggcggttc aggcggttcg ggcggtagcg gcggtgttga tgacattcag 420
ctgacccaat caccggcaat catgagcgct tctccgggtg aaaaggttac catgacgtgc 480
cgtgcgtcta gttccgtcag ttatatgaat tggtaccagc aaaagtctgg tacgagtccg 540
aaacgttgga tttatgatac ctccaaagtc gcaagcggtg tgccgtaccg tttcagtggt 600
tccggttcag gcacctcgta tagcctgacg atctcatcga tggaagccga agatgcggcc 660
acctattact gtcaacaatg gagtagtaac ccgctgacct ttggcgctgg cacgaaactg 720
gaactgaaat gt 732
<210> 4
<211> 753
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单链抗体(SCA)片段
<400> 4
gacattcaac tgacgcaatc cccggcttcc ctggcggtct cgctgggtca acgcgcaacc 60
atctcgtgta aagcatcgca atcggtcgat tatgacggcg attcctatct gaactggtac 120
cagcaaattc cgggtcagcc gccgaagctg ctgatctacg atgcgagtaa tctggtctcc 180
ggcattccgc cgcgtttttc cggttcaggc tcgggtacgg acttcaccct gaacatccat 240
ccggtggaaa aagttgatgc ggccacctat cactgccagc aatctacgga agacccgtgg 300
acctttggcg gtggcacgaa gctggaaatt aaaggtggcg gtggcagcgg tggcggtggc 360
tctggtggcg gtggcagtca ggtgcaactg cagcaaagcg gtgcagaact ggtccgtccg 420
ggtagctctg tgaagatctc atgtaaagca tcgggctatg ctttcagttc ctactggatg 480
aattgggtta aacagcgccc gggccaaggt ctggaatgga ttggtcagat ctggccgggc 540
gacggtgata ccaactacaa tggcaaattt aagggtaaag cgacgctgac cgccgatgaa 600
tcatcgagca ccgcatatat gcagctgtct agtctggcaa gcgaagactc tgctgtttac 660
ttctgcgcac gtcgcgaaac cacgaccgtc ggtcgttact actacgctat ggactattgg 720
ggtcaaggca ccaccgttac cgtttcaagt tgc 753

Claims (18)

1.式Ib的化合物:
Figure FDA0003117084760000011
其中:
P为聚乙二醇(PEG)；
B为H或封端基团，所述封端基团选自C1-50烷基和芳基，其中所述烷基的一个或多个碳可被杂原子替代；
T为赖氨酸，其中T和(L1)a之间的连接和T和(L2)b之间的连接可相同或不同；
L1和L2各自独立地为双官能接头，其中(L1)a和(L2)b之一包含由叠氮化物和炔烃形成的连接；
a和b各自为选自0-10的整数；
A1和A2分别为结合至细胞毒性细胞上的受体的抗CD3抗体和结合至癌细胞受体的抗CD19抗体；且
y为1，
其中，PEG的总分子量是10,000至60,000。
2.权利要求1所述的化合物，其中所述两种抗体为单链抗体。
3.权利要求1所述的化合物，其中所述PEG为直链PEG。
4.权利要求1所述的化合物，其中所述PEG为支链PEG。
5.权利要求1-4任一项的化合物，其中B是C1-10烷基。
6.制备根据权利要求1-5任一项所述的式(Ib)的化合物的方法，包括:
(i)制备非免疫原性PEG，其具有能与两种不同的蛋白质或其修饰变体进行位点特异性缀合的末端双官能团，其中所述双官能团位于聚合物的相同末端，其中双官能团的一者包含炔基；和
(ii)将非免疫原性聚合物与两种不同的蛋白质或其修饰变体逐步进行位点特异性缀合以形成式(Ib)的化合物，其中PEG的总分子量是10,000至60,000。
7.式II的化合物:
Figure FDA0003117084760000021
其中:
B为烷基或芳族核，任选取代有O、S、N或其组合；
P为PEG；
T为赖氨酸，其中T和(L1)a之间的连接和T和(L2)b之间的连接可相同或不同；
L1和L2各自独立地为双官能接头；
a和b各自为选自0-10的整数；
x为选自2-8的整数；且
A1和A2分别为结合至细胞毒性细胞上的受体的抗CD3抗体和结合至癌细胞受体的抗CD19抗体。
8.权利要求7所述的化合物，其中x为4、6或8。
9.权利要求7所述的化合物，其中B选自甘油、三羟甲基-丙烷、季戊四醇、山梨醇、和甘油的寡聚物。
10.药物制剂，其包含权利要求1-9任一项的化合物和药学上可接受的载体。
11.权利要求1-9任一项的化合物在制备用于在需要的受试者中治疗疾病的药物中的用途。
12.权利要求11所述的化合物，其中(L1)a和(L2)b中另一个包含由马来酰亚胺和巯基形成的连接。
13.权利要求11和12任一项所述的化合物，其中所述炔烃为二苯并环辛炔(DBCO)。
14.权利要求7-9任一项所述的化合物，其中P为分子量为10,000至40,000的PEG。
15.权利要求1所述的化合物，其中A1和A2的一者是SCACD3(SEQ ID No:3)，且另一者是SCACD19(SEQ ID No.4)。
16.权利要求1所述的化合物，其中PEG的总分子量是20,000至40,000。
17.权利要求1所述的化合物，其中每一个L1和L2包含少于16个整数单元的CH2CH2O。
18.权利要求1所述的化合物，其中每一个L1和L2包含少于6个整数单元的CH2CH2O。
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