TW202330610A - 結合至ｃｄ３０及ｃｄ３之抗體 - Google Patents
結合至ｃｄ３０及ｃｄ３之抗體 Download PDFInfo
- Publication number
- TW202330610A TW202330610A TW111138087A TW111138087A TW202330610A TW 202330610 A TW202330610 A TW 202330610A TW 111138087 A TW111138087 A TW 111138087A TW 111138087 A TW111138087 A TW 111138087A TW 202330610 A TW202330610 A TW 202330610A
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- antibody
- amino acid
- heavy chain
- chain variable
- variable region
- Prior art date
Links
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims abstract description 222
- 102100036857 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Human genes 0.000 claims abstract description 196
- 101000851376 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Proteins 0.000 claims abstract description 193
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 71
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 66
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 66
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 54
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 379
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 224
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 191
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 130
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 129
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 128
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 122
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 116
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 109
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 claims description 94
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 claims description 94
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 claims description 57
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 claims description 50
- 208000021519 Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 claims description 50
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 claims description 50
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 25
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 claims description 25
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 25
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 25
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 claims description 22
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 claims description 18
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 claims description 18
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 16
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 15
- 208000027585 T-cell non-Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 claims description 14
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 claims description 12
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 claims description 12
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 11
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 10
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 208000028564 B-cell non-Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 claims description 8
- 208000027190 Peripheral T-cell lymphomas Diseases 0.000 claims description 8
- 208000031672 T-Cell Peripheral Lymphoma Diseases 0.000 claims description 8
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 claims description 8
- 208000020968 mature T-cell and NK-cell non-Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 claims description 8
- 201000006845 reticulosarcoma Diseases 0.000 claims description 8
- 208000029922 reticulum cell sarcoma Diseases 0.000 claims description 8
- 208000031673 T-Cell Cutaneous Lymphoma Diseases 0.000 claims description 7
- 201000007241 cutaneous T cell lymphoma Diseases 0.000 claims description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 7
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 claims description 7
- 201000005962 mycosis fungoides Diseases 0.000 claims description 7
- 208000025638 primary cutaneous T-cell non-Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 claims description 7
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 6
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims description 4
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 claims description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 3
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 2
- 206010073478 Anaplastic large-cell lymphoma Diseases 0.000 claims 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 abstract description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 150
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 100
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 83
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 70
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 70
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 70
- 230000010782 T cell mediated cytotoxicity Effects 0.000 description 64
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 58
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 57
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 57
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 51
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 45
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 42
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 41
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 40
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 39
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 33
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 33
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 32
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 28
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 27
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 25
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 24
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 24
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 24
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 23
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 23
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 23
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 description 22
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 21
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 21
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 20
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 20
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 20
- 102100025137 Early activation antigen CD69 Human genes 0.000 description 19
- 101000934374 Homo sapiens Early activation antigen CD69 Proteins 0.000 description 19
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 19
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 18
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 18
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 18
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 18
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 16
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 16
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 15
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 15
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 14
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 14
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 13
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 13
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 13
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 13
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 12
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 12
- 230000006870 function Effects 0.000 description 12
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 12
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 12
- 208000025205 Mantle-Cell Lymphoma Diseases 0.000 description 11
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 11
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 11
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 11
- 101000611936 Homo sapiens Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 10
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 10
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 10
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 10
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 10
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 10
- -1 FR3 Proteins 0.000 description 9
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 9
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 9
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 9
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 9
- 208000013056 classic Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 9
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 9
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 9
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 9
- 102220084711 rs863225115 Human genes 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 9
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 8
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 8
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 8
- UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N cysteamine Chemical compound NCCS UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229960003151 mercaptamine Drugs 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 8
- 101710117290 Aldo-keto reductase family 1 member C4 Proteins 0.000 description 7
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 7
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 7
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 7
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 102000001398 Granzyme Human genes 0.000 description 6
- 108060005986 Granzyme Proteins 0.000 description 6
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 6
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 5
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 5
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 5
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 5
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 5
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 5
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 5
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 5
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 5
- YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 7-aminoactinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=C(N)C=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 0.000 description 4
- 108700012813 7-aminoactinomycin D Proteins 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 4
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 4
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 4
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 4
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000036541 health Effects 0.000 description 4
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 4
- VYNDHICBIRRPFP-UHFFFAOYSA-N pacific blue Chemical compound FC1=C(O)C(F)=C2OC(=O)C(C(=O)O)=CC2=C1 VYNDHICBIRRPFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- 102100021943 C-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 description 3
- 101710155857 C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 3
- 102100025248 C-X-C motif chemokine 10 Human genes 0.000 description 3
- 101710098275 C-X-C motif chemokine 10 Proteins 0.000 description 3
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 3
- 102000000989 Complement System Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010069112 Complement System Proteins Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 3
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 3
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 3
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 3
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 3
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 3
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 3
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 3
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 3
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 3
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 3
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 3
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 3
- 101710165436 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Proteins 0.000 description 3
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 3
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 3
- 230000005888 antibody-dependent cellular phagocytosis Effects 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000012911 assay medium Substances 0.000 description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 230000009827 complement-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- HKSZLNNOFSGOKW-UHFFFAOYSA-N ent-staurosporine Natural products C12=C3N4C5=CC=CC=C5C3=C3CNC(=O)C3=C2C2=CC=CC=C2N1C1CC(NC)C(OC)C4(C)O1 HKSZLNNOFSGOKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 238000003032 molecular docking Methods 0.000 description 3
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 3
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 3
- HKSZLNNOFSGOKW-FYTWVXJKSA-N staurosporine Chemical compound C12=C3N4C5=CC=CC=C5C3=C3CNC(=O)C3=C2C2=CC=CC=C2N1[C@H]1C[C@@H](NC)[C@@H](OC)[C@]4(C)O1 HKSZLNNOFSGOKW-FYTWVXJKSA-N 0.000 description 3
- CGPUWJWCVCFERF-UHFFFAOYSA-N staurosporine Natural products C12=C3N4C5=CC=CC=C5C3=C3CNC(=O)C3=C2C2=CC=CC=C2N1C1CC(NC)C(OC)C4(OC)O1 CGPUWJWCVCFERF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- QEDXSHCYPROEOK-UHFFFAOYSA-N 3-phosphanylpropanoic acid Chemical compound OC(=O)CCP QEDXSHCYPROEOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 101100463133 Caenorhabditis elegans pdl-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 2
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 2
- 102100031111 Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 17 Human genes 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000946860 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD3 epsilon chain Proteins 0.000 description 2
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 125000003412 L-alanyl group Chemical group [H]N([H])[C@@](C([H])([H])[H])(C(=O)[*])[H] 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001436793 Meru Species 0.000 description 2
- 108090000143 Mouse Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 241000239226 Scorpiones Species 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 102100035794 T-cell surface glycoprotein CD3 epsilon chain Human genes 0.000 description 2
- QHNORJFCVHUPNH-UHFFFAOYSA-L To-Pro-3 Chemical compound [I-].[I-].S1C2=CC=CC=C2[N+](C)=C1C=CC=C1C2=CC=CC=C2N(CCC[N+](C)(C)C)C=C1 QHNORJFCVHUPNH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 2
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 239000000611 antibody drug conjugate Substances 0.000 description 2
- 229940049595 antibody-drug conjugate Drugs 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 2
- 229960000455 brentuximab vedotin Drugs 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 2
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 2
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000000375 direct analysis in real time Methods 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N dithioerythritol Chemical compound SC[C@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000012063 dual-affinity re-targeting Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 2
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 2
- 230000006867 granzyme B production Effects 0.000 description 2
- 208000019691 hematopoietic and lymphoid cell neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000005734 heterodimerization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 150000002505 iron Chemical class 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 2
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 2
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- JXYWFNAQESKDNC-BTJKTKAUSA-N (z)-4-hydroxy-4-oxobut-2-enoate;2-[(4-methoxyphenyl)methyl-pyridin-2-ylamino]ethyl-dimethylazanium Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O.C1=CC(OC)=CC=C1CN(CCN(C)C)C1=CC=CC=N1 JXYWFNAQESKDNC-BTJKTKAUSA-N 0.000 description 1
- OGMADIBCHLQMIP-UHFFFAOYSA-N 2-aminoethanethiol;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCCS OGMADIBCHLQMIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IIQFOVQMXGABDP-UHFFFAOYSA-N 3-ethyl-2-[(3-ethyl-6-sulfo-2h-1,3-benzothiazol-2-yl)diazenyl]-2h-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound S1C2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N(CC)C1N=NC1N(CC)C2=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C2S1 IIQFOVQMXGABDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VDABVNMGKGUPEY-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein succinimidyl ester Chemical compound C=1C(O)=CC=C2C=1OC1=CC(O)=CC=C1C2(C1=C2)OC(=O)C1=CC=C2C(=O)ON1C(=O)CCC1=O VDABVNMGKGUPEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940126670 AB-836 Drugs 0.000 description 1
- 108091007504 ADAM10 Proteins 0.000 description 1
- 108091007505 ADAM17 Proteins 0.000 description 1
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 description 1
- 235000007652 Arbutus Nutrition 0.000 description 1
- 240000008327 Arbutus unedo Species 0.000 description 1
- 241000945470 Arcturus Species 0.000 description 1
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- 102100024217 CAMPATH-1 antigen Human genes 0.000 description 1
- 238000011357 CAR T-cell therapy Methods 0.000 description 1
- 229940124293 CD30 monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 108010065524 CD52 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 101100476210 Caenorhabditis elegans rnt-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102100025470 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 8 Human genes 0.000 description 1
- 241000256135 Chironomus thummi Species 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 102000008130 Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010049894 Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases Proteins 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N Deuterium Chemical group [2H] YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100039673 Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 10 Human genes 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000000579 Epigen Human genes 0.000 description 1
- 108010016906 Epigen Proteins 0.000 description 1
- OTMSDBZUPAUEDD-UHFFFAOYSA-N Ethane Chemical compound CC OTMSDBZUPAUEDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000690301 Homo sapiens Aldo-keto reductase family 1 member C4 Proteins 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101000914320 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 8 Proteins 0.000 description 1
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 1
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 1
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 1
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001117317 Homo sapiens Programmed cell death 1 ligand 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001116548 Homo sapiens Protein CBFA2T1 Proteins 0.000 description 1
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 description 1
- 101000946843 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 description 1
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 1
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 244000131316 Panax pseudoginseng Species 0.000 description 1
- 235000005035 Panax pseudoginseng ssp. pseudoginseng Nutrition 0.000 description 1
- 235000003140 Panax quinquefolius Nutrition 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 102100024216 Programmed cell death 1 ligand 1 Human genes 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000662 T-lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 1
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 description 1
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 108010004469 allophycocyanin Proteins 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 238000009175 antibody therapy Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 210000000649 b-lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- BFPSDSIWYFKGBC-UHFFFAOYSA-N chlorotrianisene Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(Cl)=C(C=1C=CC(OC)=CC=1)C1=CC=C(OC)C=C1 BFPSDSIWYFKGBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 108010047295 complement receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000006834 complement receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000003271 compound fluorescence assay Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 229910052805 deuterium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- CEJLBZWIKQJOAT-UHFFFAOYSA-N dichloroisocyanuric acid Chemical compound ClN1C(=O)NC(=O)N(Cl)C1=O CEJLBZWIKQJOAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002050 diffraction method Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 235000008434 ginseng Nutrition 0.000 description 1
- 229940049906 glutamate Drugs 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical class N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 235000019410 glycyrrhizin Nutrition 0.000 description 1
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 1
- 102000054751 human RUNX1T1 Human genes 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000005305 interferometry Methods 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000019420 lymphoid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 231100001083 no cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000006548 oncogenic transformation Effects 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229940029358 orthoclone okt3 Drugs 0.000 description 1
- 229940043515 other immunoglobulins in atc Drugs 0.000 description 1
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 230000006461 physiological response Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 235000013930 proline Nutrition 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 238000010405 reoxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 210000003752 saphenous vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 230000014723 transformation of host cell by virus Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 108091007466 transmembrane glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/526—CH3 domain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
Abstract
本發明關於結合至CD3及CD30之多特異性抗體。本發明進一步提供包含本發明之抗體之醫藥組成物、編碼該抗體之核酸、生產該抗體之宿主細胞、生產該抗體之方法、及該抗體之用途，特別用於癌症治療。
Description
本發明關於結合至CD30及CD3之多特異性抗體。本發明進一步提供包含抗體之醫藥組成物、編碼抗體之核酸、生產抗體之宿主細胞、生產抗體之方法、及抗體之用途，特別用於癌症治療。
亦稱為Ki-1或TNFRSF8之CD30為120 kD跨膜糖蛋白受體且為腫瘤壞死因子受體(TNFR)超級家族的一員(Smith等人之(1994) Cell 76: 959-962)。CD30為單程I型膜蛋白，在其細胞外結構域中具有六個富集半胱胺酸的重複序列(Durkop等人之(1992) Cell 68: 421-427)。另外，已於患有發炎疾病(包括潰瘍性結腸炎(UC))(Giacomelli等人之Clin Exp Immunol. 1998;111:532-5)及CD30陽性血液惡性腫瘤(Josimovic-Alasevic等人之(1989) Eur J Immunol)的患者之血清中檢測出可溶性形式的CD30 (sCD30)。sCD30代表CD30之細胞外部分以細胞膜錨定之金屬蛋白酶(諸如TACE/ADAM17和ADAM10)的切割產物(Nagata等人之PNAS 2005；Hansen等人之FASEB, 2004)。
在正常組織中，CD30表現主要局限於活化之T和B淋巴細胞亞群(Bowen等人之(1996) J Immunol. 156:442-9；Shanebeck等人之(1995) Eur J Immunol. 25:2147-53)。已在多種淋巴球性腫瘤中檢測出CD30表現。經典的霍奇金氏(Hodgkin)淋巴瘤(cHL)和退行性大細胞淋巴瘤(ALCL)顯示高的CD30表現水平。典型地在cHL中發現的大多數李-斯二氏(Reed-Sternberg)(RS)細胞特別地對CD30呈陽性(Frizzera等人之(1992) Semin. Diagn. Pathol. 9: 291-296)。
例如，靶向CD30之抗體-藥物共軛體侖妥昔單抗維朵汀(brentuximab vedotin)(BV；SGN-35)已用於或已建議用於治療癌症，諸如cHL、ALCL和CTCL (Younes等人之J Clin Oncol. 2012 Jun 20;30(18):2183-9；Pro等人之Blood. 2017 Dec 21;130(25):2709-2717；Shea等人之Curr Hematol Malig Rep. 2020 Feb;15(1):9-19)。正在開發四價雙特異性CD30xCD16A抗體AFM13作為cHL和CD30陽性淋巴瘤的經NK細胞媒介之免疫療法(Rothe等人之Blood. 2015 Jun 25;125(26):4024-31)。
此外，正在開發用於cHL和CD30陽性淋巴瘤的靶向CD30之CAR-T細胞療法。其他的CD30抗體已說明於WO2003059282 (Medarex)、US8257706 (Seattle genetics)、US20100239571 (Seattle genetics)、WO2007040653 (US government & Health)和WO20160177846 (Affimed)中。
Pohl等人(1993 Int. J. Cancer, 54: 820-827)說明由生產CD30單株抗體HRS-3之融合瘤細胞與生產CD3單株抗體OKT-3之融合瘤細胞融合產生之CD3xCD30雙特異性抗體OKT-3/HRS-3 (雜交融合瘤技術)。
WO2008119567說明CD30及CD3跨物種特異性雙特異性單鏈分子的產生及特性。
US20200095330說明自兩種抗CD30選殖株(命名為8D10和10C2)與抗CD3 (Orthoclone OKT-3)之化學異源共軛生成之CD3xCD30雙特異性抗體。
然而，該等CD3xCD30雙特異性抗體中沒有一者於臨床環境中進行過測試。
因此，對改進的靶向CD30之癌症療法有需求。對有效、安全、具有良好的可製造性及/或具有長的保存期限之靶向CD30之化合物有需求。
本發明關於結合人類和食蟹猴CD30及CD3之T細胞接合抗體。本發明人發現一些CD30結合抗體係以雙價(單株)型式很好地結合至表現CD30之細胞，但以具有單價CD30結合之雙特異性型式展現強力降低的結合及細胞毒性。鑑定出具有強力單價CD30結合以及極佳的腫瘤細胞毒殺之雙特異性抗體。此外，鑑定出具有功能性失活的Fc主鏈之雙特異性抗體，因為其極佳的穩定性及溶解性而適合於開發成醫藥產品。
在一個態樣中，本發明關於多特異性抗體，其包含：
(i) CD30結合區，其包含第一重鏈可變區，該第一重鏈可變區包含分別以SEQ ID NO：1、2和3列出之CDR1、CDR2和CDR3序列，及第一輕鏈可變區，該第一輕鏈可變區包含分別以SEQ ID NO：4、5和6列出之CDR1、CDR2和CDR3序列，及
(ii) CD3結合區，其包含第二重鏈可變區，該第二重鏈可變區包含分別以SEQ ID NO：7、8和9列出之CDR1、CDR2和CDR3序列，及第二輕鏈可變區，該第二輕鏈可變區包含分別以SEQ ID NO：10、11和12列出之CDR1、CDR2和CDR3序列。
在進一步的態樣中，本發明關於編碼根據本發明之多特異性抗體之核酸構築體或核酸構築體之組合。
在進一步的態樣中，本發明關於包含根據本發明之核酸構築體之表現載體或遞送媒劑。
在進一步的態樣中，本發明關於能夠生產根據本發明之多特異性抗體之重組宿主細胞，其中宿主細胞包含一或多種編碼根據本發明之多特異性抗體之核酸構築體。
在進一步的態樣中，本發明關於醫藥組成物，其包含根據本發明之多特異性抗體及醫藥上可接受的載劑。
在進一步的態樣中，本發明關於用作為例如治療癌症之藥劑的根據本發明之多特異性抗體、核酸構築體、遞送媒劑或醫藥組成物。
在甚至進一步的態樣中，本發明關於生產根據本發明之多特異性抗體之方法。
定義
如本文所使用之術語「抗體」意欲指免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的片段或其任一者之衍生物，其在典型的生理及/或腫瘤特異性條件下具有特異性結合至抗原的能力，具有很長時間段的半生期，諸如至少約30分鐘、至少約45分鐘、至少約一小時、至少約兩小時、至少約四小時、至少約8小時、至少約12小時、至少約24小時或更長、至少約48小時或更長、至少約3、4、5、6、7或更多天等或任何其他相關功能性定義的期間(諸如足以誘導、促進、增強及/或調節與抗體結合至抗原相關聯的生理反應之時間及/或足以使抗體內化之時間)。抗體包含可與抗原相互作用之結合區(或可於本文使用之結合結構域，兩者兼具相同的涵義)，結合區包含免疫球蛋白分子或類似者之重鏈及輕鏈兩者的可變區。抗體可包含抗體(Ab)的恆定區，其可媒介免疫球蛋白與宿主組織或因子(包括免疫系統的各種細胞(諸如效應子細胞)及補體系統的組分(諸如C1q，補體活化之經典途徑中的第一組分))之結合。
在本發明之上下文中，術語「抗體」包括單株抗體(mAb)、抗體樣多肽、嵌合抗體、人類抗體、人源化抗體、以及保留特異性結合至抗原(抗原結合片段)的能力之「抗體片段」或「其片段」，其係由任何已知的技術提供，諸如酵素切割、肽合成和重組DNA技術。術語「抗體」包括雙、三或多特異性抗體及/或具有更多修飾之抗體，例如抗體-藥物共軛體及/或抗體在IgG Fc結構域中具有修飾之抗體。如根據本發明所定義之抗體可為任何同型或不具有同型(例如scFv抗體)，除非本文的揭示另有其他限制。
已顯示抗體的抗原結合功能可由全長抗體的片段來執行。涵蓋在術語「抗體」內之結合片段的實例包括(i) Fab’或Fab片段，由輕鏈可變結構域(VL)、重鏈可變結構域(VH)、輕鏈恆定區(CL)及重鏈恆定區結構域1 (CH1)結構域所組成之單價片段或如WO 2007/059782中所述之單價抗體；(ii) F(ab')
2片段，包含在樞紐區由雙硫鍵連結的兩個Fab片段之雙價片段；(iii) Fd片段，基本上由VH及CH1結構域所組成；(iv) Fv片段，基本上由抗體之單臂的VL及VH結構域所組成；(v) dAb片段，Ward等人之Nature 341, 544‑546 (1989)，其基本上由VH結構域所組成且亦稱為結構域抗體，Holt等人之Trends Biotechnol‑. 2003 Nov;21(11):484-90；(vi)駱駝科動物或奈米抗體，Revets等人之Expert Opin Biol Ther. 2005 Jan;5(1):111-24，及(vii)經單離之互補決定區(CDR)。此外，儘管Fv片段的兩個結構域VL及VH係以單獨的基因編碼，但是彼等可使用重組方法藉由能使彼等成為單一蛋白鏈之合成連結子接合，其中VL及VH區配對形成單價分子(稱為單鏈抗體或單鏈Fv (scFv)，參見例如Revets等人之Expert Opin Biol Ther. 2005 Jan;5(1):111-24及Bird等人之Science 242, 423‑426 (1988))。此等單鏈抗體涵蓋在術語抗體內，除非上下文另有註明或明確地指示。儘管此等片段通常包括在抗體的涵義內，但是彼等全體且各自獨立為本發明獨特的特性，展現不同的生物學性質及效用。在本發明之上下文中的該等及其他有用的抗體片段於本文進一步討論。
作為最終產物或作為通過受控之臂交換(cFEA)以產生例如雙特異性抗體的中間物之抗體可自不同的試管內或活體外表現或生產系統生產及收集，例如自經重組修飾之宿主細胞、自融合瘤或使用支持編碼抗體之核酸序列的試管內轉錄及/或轉譯之細胞提取物的系統。
如本文所使用之術語「免疫球蛋白重鏈」或「免疫球蛋白的重鏈」意欲指免疫球蛋白的重鏈之一。重鏈典型地由重鏈可變區(在本文縮寫為VH)及重鏈恆定區(在本文縮寫為CH)所組成，其限定免疫球蛋白之同型。重鏈恆定區典型地由三個結構域所組成，CH1、CH2和CH3。如本文所使用之術語「免疫球蛋白」意欲指結構相關的糖蛋白類別，其典型地由兩對多肽鏈、一對低分子量輕(L)鏈及一對重(H)鏈所組成，所有四種鏈可能由雙硫鍵交互連接。免疫球蛋白的結構已經完整地特性化(參見例如Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W.編輯之2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))。在免疫球蛋白的結構內，兩個重鏈係經由所謂的「樞紐區」中的雙硫鍵交互連接。與重鏈一樣，各輕鏈典型地由幾個區所組成；輕鏈可變區(在本文縮寫為VL)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區典型地由一個結構域CL所組成。此外，VH及VL區可進一步細分成高可變區(hypervariability)(或高可變區(hypervariable region)，其在序列及/或結構限定環形式上可為高可變的)，其亦稱為互補決定區(CDR)，以稱為框架區(FR)的更保守型區域穿插。各VH及VL典型地由三個CDR及四個FR所組成，以下列順序自胺基端排列至羧基端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
當本文使用術語「半分子(half molecule)」、「Fab臂」及「臂」時，其係指重鏈-輕鏈對。當說明雙特異性抗體包含「源自」第一抗體之半分子抗體及「源自」第二抗體之半分子抗體時，術語「源自」表示雙特異性抗體係藉由以任何已知的方法重組來自該第一及第二抗體中之各者的該半分子成為所得雙特異性抗體而產生。在此上下文中，「重組」不意欲受限於任何特定的重組方法，且因此包括用於產生本文所述之雙特異性抗體的所有方法，包括例如藉由半分子交換來重組，以及在核酸水平及/或通過在同一細胞中的兩個半分子之共表現來重組。
當本文之抗體或其結構域或區的上下文中使用術語「第一」及「第二」時，其僅意欲於容易參考而不意欲指示特定的相對位置或類似者。
如本文所使用之術語「抗原結合區」或「結合區」係指能夠結合至抗原之抗體的區域。抗原可為任何分子，諸如多肽、蛋白質、多醣或其組合。抗原可例如呈現於細胞、細菌或病毒體上。術語「抗原」及「標靶」在本發明之上下文中可交換使用，除非與上下文牴觸。術語「抗原結合區」及「抗原結合位點」在本發明之上下文中可交換使用，除非與上下文牴觸。
如本文所使用之術語「
K D」(M)係指特定的抗體-抗原相互作用之平衡解離常數且藉由
k d除以
k a而獲得。
K D亦可稱為「結合親和性」。
如本文所使用之術語「
k d」(sec
-1)係指特定的抗體-抗原相互作用之解離速率常數。該值亦稱為k
off值或解離速率(off-rate)。
如本文所使用之術語「
k a」(M
-1x sec
-1)係指特定的抗體-抗原相互作用之締合速率常數。該值亦稱為k
on值或締合速率(on-rate)。
如本文所使用之術語「結合」係指抗體與預定抗原或標靶之結合，當以使用抗體作為配體及抗原作為分析物之生物膜干涉法測定時，典型地具有對應於1E
-6M或更小的
K D之結合親和性，例如5E
-7M或更小、1E
-7M或更小，諸如5E
-8M或更小，諸如1E
-8M或更小，諸如5E
-9M或更小，諸如1E
-9M或更小，諸如1E
-10M更小，或諸如1E
-11M或更小，且以對應於比其結合至除了預定抗原或密切相關抗原以外的非特異性抗原(例如BSA、酪蛋白)之親和性低至少10倍的
K D之親和性結合至預定抗原，諸如低至少100倍，例如低至少1,000倍，諸如低至少10,000倍，例如低至少100,000倍。
如本文所使用之術語「CD30」係指人類分化群30蛋白質，亦稱為TNFRSF8 (腫瘤壞死因子受體超級家族成員8)。CD30係於各種物種中發現，且因此術語「CD30」可能不限於人類CD30，除非與上下文牴觸。人類CD30之序列係以SEQ ID NO：39列出。
如本文所使用之術語「CD3」係指人類分化群3蛋白質，其為T細胞共受體蛋白複合物的一部分且由四個不同的鏈所組成。CD3係於各種物種中發現，且因此術語「CD3」可能不限於人類CD3，除非與上下文牴觸。在哺乳動物中，複合物含有CD3γ (gamma)鏈(人類CD3γ鏈UniProtKB/Swiss-Prot No P09693或食蟹猴CD3γ UniProtKB/ Swiss-Prot No Q95LI7)、CD3δ (delta)鏈(人類CD3δ UniProtKB/Swiss-Prot No P04234或食蟹猴CD3δ UniProtKB/ Swiss-Prot No Q95LI8)、兩個CD3ε (epsilon)鏈(人類CD3ε：UniProtKB/Swiss-Prot No P07766，其序列在本文併入為SEQ ID NO：42；食蟹猴CD3ε UniProtKB/ Swiss-Prot No Q95LI5；或恆河猴CD3ε UniProtKB/Swiss-Prot No G7NCB9)及CD3ζ鏈(zeta)鏈(人類CD3ζ UniProtKB/ Swiss-Prot No P20963、食蟹猴CD3ζ UniProtKB/Swiss-Prot No Q09TK0)。該等鏈係與稱為T細胞受體(TCR)之分子締合且在T淋巴細胞中產生活化訊息。TCR及CD3分子一起包含TCR複合物。
術語「抗體結合區」係指抗原區，其包含抗體結合之表位。抗體結合區可藉由使用生物膜干涉法之表位分倉、藉由丙胺酸掃描或藉由結構域置換(shuffle)檢定法(使用抗原構築體，其中抗原區係與另一物種之該區交換且測定抗體是否仍結合至抗原結合)來測定。在抗體結合區內涉及與抗體相互作用之胺基酸可藉由藉由氫/氘交換質譜術及/或藉由與其抗原結合之抗體的結晶學來測定。
術語「表位」意指以抗體特異性結合之抗原決定位。表位經常由分子的表面群組所組成，諸如胺基酸、糖側鏈或其組合，且經常具有特定的三維結構特性以及特定的電荷特性。構形及非構形表位的區別在於在變性溶劑或其他破壞蛋白質或其多聚體的三維結構之劑的存在下失去與前者，但不失去與後者之結合。表位可包含直接涉及結合之胺基酸殘基及不直接涉及結合之其他胺基酸殘基，諸如以抗體(當其結合至抗原時)有效地阻斷或覆蓋之胺基酸殘基。
如本文所使用之術語「單株抗體」、「單株Ab」、「單株抗體組成物」、「mAb」或類似者係指單一分子組成物之抗體分子製品且典型地展示對特定表位之單一結合特異性及親和性。單株抗體典型地可由相同的細胞製成，該等細胞全部為獨特的親本細胞之選殖株，諸如融合瘤、穩定的細胞株或類似者。據此，術語「人類單株抗體」係指展示單一結合特異性之抗體，其具有源自人類種系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區。人類單株抗體可由融合瘤生產，該融合瘤包括自基因轉殖或染色體轉殖非人類動物(諸如基因轉殖小鼠)獲得的B細胞，其具有包含人類重鏈轉殖基因及輕鏈轉殖基因之基因組，與不朽化細胞融合。人類單株抗體可源自人類B細胞或血漿細胞。單株抗體亦可自經重組修飾之宿主細胞或使用支持編碼抗體之核酸序列的試管內轉錄及/或轉譯之細胞提取物的系統來生產。
如本文所使用之術語「同型」係指以重鏈恆定區基因編碼之免疫球蛋白類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE,或IgM)或其任何異型(諸如IgG1m(za)和IgG1m(f))。再者，各重鏈同型可與kappa (κ)或lambda (λ)輕鏈組合。
當本文使用術語「全長抗體」時，其係指包含一個重鏈及輕鏈配對或兩個重鏈及輕鏈配對之抗體(例如親本或變異體抗體)，各配對含有重鏈及輕鏈恆定結構域和可變結構域，諸如通常在該同型之野生型抗體的重鏈-輕鏈配對中發現。因此，例如全長IgG1抗體含有VH、CH1、CH2、CH3、樞紐、VL和CL結構域。當與全長親本或野生型抗體相比時，在全長變異抗體中的重鏈及輕鏈恆定結構域和可變結構域可特別含有修飾及/或改進抗體的功能性質之胺基酸取代。根據本發明之全長抗體可由包含以下步驟之方法生產：(i)將CDR序列選殖至一或多個包含完整重鏈及輕鏈序列之適合載體中，及(ii)將所獲得的具有重鏈及輕鏈序列之適合載體表現在適合的表現系統中。當自CDR序列或完全可變區序列開始時，則生產全長抗體係在熟習的技術人員之知識範圍內。因此，熟習的技術人員知道如何依照本發明產生全長抗體。
如本文所使用之術語「人源化抗體」係指基因工程化非人類抗體，其含有人類抗體恆定結構域及經修飾以含有高水平的人類可變結構域之序列同源性的非人類可變結構域。這可藉由將共同形成抗原結合位點之非人類抗體互補決定區(CDR)移植至同源性人類受體框架區(FR)上來達成(參見例如WO92/22653和EP0629240)。為了完全重建親本抗體之結合親和性及特異性，可能需要以來自親本抗體(亦即非人類抗體)的一些框架殘基取代一些人類框架區殘基(回復突變)。結構同源性建模可助於鑑定框架區中對抗體之結合性質重要的胺基酸殘基。因此，人源化抗體可包含非人類CDR序列、原始的人類框架區(其視需要地包含一或多個胺基酸回復突變至非人類胺基酸序列)及完全人類恆定區。視需要地可應用額外的胺基酸修飾(其不一定為回復突變)以獲得具有較佳的特性之人源化抗體，諸如特別有用的親和性和生化性質，例如包括避免脫醯胺作用及/或改進製造之修飾。此外，CDR及/或框架區可經修飾以改進對抗原之親和性，例如經由親和性成熟程序。
如本文所使用之術語「人類抗體」係指具有源自人類種系免疫球蛋白序列的可變區和恆定區之抗體。人類抗體可包括未以人類種系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如藉由試管內隨機或位點特異性誘變或藉由活體內體細胞突變所引入之突變)。然而，如本文所使用之術語「人類抗體」不意欲包括其中已將源自其他哺乳動物物種(諸如小鼠)的種系之CDR序列移植至人類框架序列上之抗體。本發明之人類單株抗體可以各種技術生產，包括習知的單株抗體方法，例如Kohler和Milstein
, Nature256: 495 (1975)之標準的體細胞細胞雜交技術。儘管以體細胞細胞雜交程序較佳，但是原則上可使用其他用於生產單株抗體之技術，例如B淋巴細胞之病毒或致癌轉變或使用人類抗體基因庫之噬菌體顯示技術。人類單株抗體可使用攜帶部分人類免疫系統而非小鼠系統之基因轉殖或染色體轉殖小鼠(諸如HCo12 小鼠(參見例如WO 03/059282)或類似者)產生。
如本文所使用之術語「Fc區」係指在抗體的兩個重鏈多肽之N端至C端方向上包含至少樞紐區、CH2區和CH3區之區域。Fc多肽典型地經醣化。抗體之Fc區可媒介免疫球蛋白與宿主組織或因子(包括免疫系統的各種細胞(諸如效應子細胞)及補體系統的組分)之結合。Fc區典型地亦結合FcRn及蛋白質A。
如本文所使用之詞組「對應於位置…上的胺基酸之胺基酸」或類似者係指人類IgG1重鏈中的胺基酸位置號碼。在其他的免疫球蛋白中，對應的胺基酸位置可藉由與人類IgG1比對來找到。除非上下文另有其他陳述或牴觸，否則恆定區序列之胺基酸在本文係根據Eu編號索引編號(在Kabat, E.A.等人之1991, Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition - US Department of Health and Human Services, NIH publication No. 91-3242, pp 662, 680, 689中所述)。因此，一個序列中「對應於」另一序列中的胺基酸或區段之胺基酸或區段為使用標準的序列比對程式(諸如比對、ClustalW或類似程式)典型地在預設的設定下與其他胺基酸或區段比對之胺基酸或區段，且與人類IgG1重鏈具有至少50%、至少80%、至少90%或至少95%之同一性。如何比對序列或序列中的區段且從而測定序列中對應於根據本發明之胺基酸位置的位置被認為是本技術中所熟知的。
如本文所使用之術語「樞紐區」係指免疫球蛋白重鏈之樞紐區。因此，例如人類IgG1抗體之樞紐區係對應於根據Eu編號之胺基酸216至230，如在Kabat, E.A.等人之Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition - US Department of Health and Human Services, NIH publication No. 91-3242, pp 662,680,689 (1991)中所列出。然而，樞紐區亦可為如本文所述之其他亞型中任一者。
如本文所使用之術語「CH1區」或「CH1結構域」係指免疫球蛋白重鏈之CH1區。因此，例如人類IgG1抗體之CH1區係對應於根據Eu編號之胺基酸118至215，如Kabat (同出處)中所列出。然而，CH1區亦可為如本文所述之其他亞型中任一者。
如本文所使用之術語「CH2區」或「CH2結構域」係指免疫球蛋白重鏈之CH2區。因此，例如人類IgG1抗體之CH2區係對應於根據Eu編號之胺基酸231至340，如Kabat (同出處)中所列出。然而，CH2區亦可為如本文所述之其他亞型中任一者。
如本文所使用之術語「CH3區」或「CH3結構域」係指免疫球蛋白重鏈之CH3區。因此，例如人類IgG1抗體之CH3區係對應於根據Eu編號之胺基酸341至447，如Kabat (同出處)中所列出。然而，CH3區亦可為如本文所述之其他亞型中任一者。
如本文所使用之術語「經Fc媒介之效應子功能」意欲指結果使多肽或抗體結合至其在細胞膜上的靶標或抗原之功能，其中經Fc媒介之效應子功能可歸因於多肽或抗體之Fc區。經Fc媒介之效應子功能的實例包括(i) C1q結合，(ii)補體活化，(iii)補體依賴性細胞毒性(CDC)，(iv)經抗體依賴性細胞媒介之細胞毒性(ADCC)，(v) Fc-γ受體(FcgR)結合，(vi)經抗體依賴性FcγR媒介之抗原交聯，(vii)抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)，(viii)補體依賴性細胞毒性(CDCC)，(ix)經補體增強之細胞毒性，(x)結合至經抗體媒介之助噬化抗體的補體受體，(xi)助噬素作用，及(xii) (i)至(xi)中任一者之組合。
如本文所使用之術語「惰性(inertness)」、「惰性的(inert)」或「非活化」係指不能夠或具有最小的能力經由個別抗體的兩個Fc區結合任何FcγR、誘導經Fc媒介之FcγR交聯、誘導經FcγR媒介之效應子功能(諸如ADCC和ADCP)、誘導經FcγR媒介之標靶抗原交聯之Fc區，及/或不能夠結合C1q及誘導經補體媒介之效應子功能(諸如CDC和CDCC)之Fc區。抗體之Fc區的惰性可使用抗體以單特異性或雙特異性型式來測試。
在本發明之上下文中，術語「單價抗體」係指可與具有僅一個抗原結合結構域(例如一個Fab臂)的抗原相互作用之抗體分子。在多特異性(諸如雙特異性)抗體之上下文中，「單價抗體結合」係指多特異性抗體與具有僅一個抗原結合結構域(例如一個Fab臂)的抗原之結合。
在本發明之上下文中，術語「單特異性抗體」係指僅對一種抗原、一個表位具有結合特異性之抗體。抗體可為單特異性單價抗體(亦即僅攜帶一個抗原結合區)、單特異性雙價抗體(例如具有兩個相同的抗原結合區之抗體)或單特異性多價抗體((例如具有超過兩個相同的抗原結合區之抗體)。
術語「多特異性抗體」係指具有二或更多個結合二或更多個不同表位的抗原結合結構域之抗體。術語「雙特異性抗體」係指具有兩個結合不同表位的抗原結合結構域之抗體，例如兩個不同的VH及VL區配對、兩個不同的Fab臂或兩個具有不同的CDR區之Fab臂。在本發明之上下文中，雙特異性抗體及多特異性抗體對二或更多個分別不同的表位具有特異性。此等表位可在相同或不同的抗原或標靶上。若表位係在不同的抗原上，此等抗原可在相同的細胞或不同的細胞、細胞類型或結構上，諸如細胞外基質或囊泡和可溶性蛋白質。多特異性及雙特異性抗體可能因此能夠交聯多種抗原，例如兩種不同的細胞。
術語「雙價抗體」係指具有兩個抗原結合區之抗體，其中該抗原結合區可能為相同的且結合至相同的表位或彼等可能為不同的且結合至不同的表位，該不同的表位可能在相同或不同抗原上。因此，雙價抗體可能為單特異性抗體或雙特異性抗體。
術語「胺基酸」及「胺基酸殘基」在本文可交換使用且不應理解為限制。胺基酸為含有胺(-NH
2)及羧基
(-COOH)官能基連同各胺基酸特有的側鏈(R基團)之有機化合物。在本發明之上下文中，胺基酸可基於結構及化學特性分類。因此，胺基酸的類別可能反映在下表中之一或兩者中。
以一種胺基酸取代另一胺基酸可分類成保守型或非保守型取代。在本發明之上下文中，「保守型取代」為以具有類似結構及/或化學特性之另一胺基酸取代一個胺基酸，此為以一種胺基酸殘基取代如以上兩個表中任一者所定義之相同類別的另一胺基酸殘基：例如，保守型取代可為以異白胺酸取代白胺酸，因為該兩者皆為脂族、支鏈疏水物。同樣地，保守型取代的一實例為以麩胺酸取代天冬胺酸，因為該兩者皆為帶負電小殘基。
在本發明之上下文中，在抗體中的取代表示為：原始胺基酸-位置號碼-經取代之胺基酸；
參考公認的胺基酸命名法，使用三字母代碼或一個字母代碼，包括代碼「Xaa」或「X」以表示任何胺基酸殘基。因此，Xaa或X典型地可代表20種天然生成胺基酸中任一者。如本文所使用之術語「天然生成」係指下列胺基酸殘基中任一者：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、離胺酸、精胺酸、組胺酸、天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、色胺酸、苯基丙胺酸、酪胺酸、甲硫胺酸和半胱胺酸。
據此，註記「K409R」或「Lys409Arg」意指抗體包含在胺基酸位置409上以精胺酸取代離胺酸。在給出之位置上的胺基酸取代成為任何其他的胺基酸表示為：原始胺基酸-位置；或例如「K409」。關於其中原始胺基酸及/或經取代之胺基酸可能包含超過一個以上，但不是所有胺基酸之修飾，超過一個以上的胺基酸可以「,」或「/」隔開。例如，在位置409上以精胺酸、丙胺酸或苯基丙胺酸取代離胺酸：「Lys409Arg,Ala,Phe」或「Lys409Arg/ Ala/Phe」或「K409R,A,F」或「K409R/A/F」或「K409成為R,A或F」。此標示在本發明之上下文中可交換使用，但具有相同的涵義及目的。
此外，術語「取代」包含取代成任何一種或其他十九種天然胺基酸，或取代成其他胺基酸，諸如非天然胺基酸。例如，在位置409上的胺基酸K之取代包括下列取代中之各者：409A、409C、409D、409E、409F、409G、409H、409I、409L、409M、409N、409Q、409R、409S、409T、409V、409W、409P和409Y。該等取代亦可標示為K409A、K409C等或K409A,C等或K409A/C/等。以類似方式同樣適用於本文所提及的每一及每個位置，在此具體地包括此等取代中任一者。
如本文所使用之術語「宿主細胞」意欲指其中已引入核酸(諸如表現載體)之細胞。應理解的是此等術語不僅意欲指特定的個體細胞，且亦可包括此細胞的後代。因為特定的修飾可能由於突變或環境影響而在後續世代中發生，所以此後代事實上可能與親本細胞不同，但仍包括在如本文所使用之術語「宿主細胞」的範圍內。重組宿主細胞(亦即用於生產重組蛋白質之宿主細胞)包括例如轉染瘤，諸如CHO細胞、HEK‑293細胞、Expi293F細胞、PER.C6細胞、NS0細胞、淋巴細胞及原核細胞(諸如大腸桿菌)和其他的真核宿主(諸如植物細胞和真菌)。
如本文所使用之術語「轉染瘤」包括表現抗體或標靶抗原之重組真核宿主細胞，諸如CHO細胞、PER.C6細胞、NS0細胞、HEK‑293細胞、Expi293F細胞、植物細胞或真菌(包括酵母細胞)。
出於本發明之目的，在兩個胺基酸序列之間的序列同一性係使用如以EMBOSS套裝之Needle程式 (EMBOSS：歐洲分子生物學開放電腦軟體組(The European Molecular Biology Open軟體Suite)，Rice等人之2000, Trends Genet. 16: 276-277)，較佳為5.0.0版或更新版本中所執行之Needleman-Wunsch演算法(Needleman和Wunsch之1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)以整個參考序列長度來測定。所使用的參數為10之間隙開放罰分(gap open penalty)、0.5之間隙延伸罰分(gap extension penalty)及EBLOSUM62 (BLOSUM62之EMBOSS版)取代矩陣。使用經Needle標記之「最長一致性」的輸出(使用-nobrief選項獲得)作為一致性百分比且如下計算：
(相同的殘基 x 100)/(比對長度-比對的間隙總數目)。
相似殘基的保留性亦可以或可替代地以相似性分數來測量，如藉由使用BLAST程式(例如通過NCBI取得的BLAST 2.2.8，使用標準的設定BLOSUM62，開口間隙=11及延伸間隙=1)來測定。適合的變異體典型地展現與親本或參考序列至少約45%，諸如至少約55%、至少約65%、至少約75%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或更多(例如約99%)的相似性。
本發明之其他態樣及實施態樣
如上述，在第一態樣中，本發明關於多特異性抗體，其包含：
(i) CD30結合區，其包含第一重鏈可變區，該第一重鏈可變區包含分別以SEQ ID NO：1、2和3列出之CDR1、CDR2和CDR3序列，及第一輕鏈可變區，該第一輕鏈可變區包含分別以SEQ ID NO：4、5和6列出之CDR1、CDR2和CDR3序列，及
(ii) CD3結合區，其包含第二重鏈可變區，該第二重鏈可變區包含分別以SEQ ID NO：7、8和9列出之CDR1、CDR2和CDR3序列，及第二輕鏈可變區，該第二輕鏈可變區包含分別以SEQ ID NO：10、11和12列出之CDR1、CDR2和CDR3序列。
在一個實施態樣中，在SEQ ID NO：9中的X為H。在另一實施態樣中，在SEQ ID NO：9中的X為G。
在一個實施態樣中，第一重鏈可變區為人類或經人源化。在另一實施態樣中，第一輕鏈可變區為人類或經人源化。在一個實施態樣中，第二重鏈可變區為人類或經人源化。在另一實施態樣中，第二輕鏈可變區為人類或經人源化。在另一實施態樣中，第一重鏈可變區及第一輕鏈可變區為人類。在另一實施態樣中，第一重鏈可變區及第一輕鏈可變區經人源化。在另一實施態樣中，第二重鏈可變區及第二輕鏈可變區為人類。在另一實施態樣中，第二重鏈可變區及第二輕鏈可變區經人源化。在另一實施態樣中，第一重鏈可變區及第一輕鏈可變區為人類，及第二重鏈可變區及第二輕鏈可變區為人類。在另一實施態樣中，第一重鏈可變區及第一輕鏈可變區為人類，及第二重鏈可變區及第二輕鏈可變區經人源化。
如熟習的技術人員所熟知，抗體之各抗原結合區通常包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，且可變區之各者分別包含三個CDR序列，CDR1、CDR2和CDR3及可能分別包含四個框架序列FR1、FR2、FR3和FR4。此結構較佳地亦可在根據本發明之抗體中發現。在一個實施態樣中，該四個框架序列中之一、二、三或全部為人類框架序列。
如上述，根據本發明之多特異性抗體包含能夠結合至人類CD30之抗原結合區，其序列係以SEQ ID NO：39列出。根據本發明之抗體特別為其中能夠結合至人類CD30之該抗原結合區能夠結合至人類CD30 (諸如表現在細胞，更佳為腫瘤細胞上之CD30分子)的細胞外結構域之抗體。
如所述，抗體包含CD30結合區，其包含第一重鏈可變區，該第一重鏈可變區包含分別以SEQ ID NO：1、2和3列出之CDR1、CDR2和CDR3序列，及第一輕鏈可變區，該第一輕鏈可變區包含分別以SEQ ID NO：4、5和6列出之CDR1、CDR2和CDR3序列。
可變重鏈區及輕鏈區之CDR1、CDR2和CDR3區可使用本技術中已知的方法鑑定。該可變重鏈區及輕鏈區之CDR區已根據IMGT註釋(參見Lefranc, M.-P.之The Immunologist, 7, 132-136 (1999)；Lefranc之Developmental and Comparative Immunology, 27(1), 55-77 (2003))。
在一個實施態樣中，結合至CD30之抗原結合區包含：
˙(第一)重鏈可變區(VH)，其包含SEQ ID NO：13之序列或與SEQ ID NO：13之序列具有至少90%、至少95%、至少97%或至少99%之胺基酸序列同一性之序列；及
˙(第一)輕鏈可變區(VL)，其包含SEQ ID NO：14之序列或與SEQ ID NO：14之序列具有至少90%、至少95%、至少97%或至少99%之胺基酸序列同一性之序列。
在進一步的實施態樣中，根據本發明之抗體包含結合至如本文所定義之CD30的抗原結合區之重鏈可變(VH)區，其中該序列與SEQ ID NO：13相比，包含總共最多1、2、3、4或5個胺基酸取代。
在進一步的實施態樣中，根據本發明之抗體包含結合至如本文所定義之CD30的抗原結合區之輕鏈可變(VL)區，其中該序列與SEQ ID NO：14相比，包含總共最多1、2、3、4或5個胺基酸取代。
在進一步的實施態樣中，第一重鏈可變區包含以SEQ ID NO：13列出之序列及第一輕鏈可變區包含以SEQ ID NO：14列出之序列。
能夠結合人類CD30之此等抗原結合區已說明於例如WO03059282 (Medarex)中，將其併入本文以供參考。
依照本發明之該抗體可在結合至人類CD30之抗原結合區與人類CD30之間以平衡解離常數KD結合，該平衡解離常數係在0.1至20 nM之範圍內，例如在0.5至5 nM之範圍內，諸如在1.5至2 nM之範圍內(單價結合)。該結合親和性可以生物膜干涉法測定。
在一個實施態樣中，本發明之抗體亦可結合食蟹猴CD30 (SEQ ID NO：40)。
如上述，根據本發明之多特異性抗體包含能夠結合至人類CD3之抗原結合區。此外，本發明提供能夠結合人類CD3ε (epsilon)(諸如以SEQ ID NO：22指定之人類CD3ε (epsilon))的根據本發明之抗體。此等抗原結合區能夠結合如呈現在T細胞(諸如初級人類T細胞)上的人類CD3ε (epsilon)。
如所述，抗體包含CD3結合區，其包含第二重鏈可變區，該第二重鏈可變區包含分別以SEQ ID NO：7、8和9列出之CDR1、CDR2和CDR3序列，及第二輕鏈可變區，該第二輕鏈可變區包含分別以SEQ ID NO：10、11和12列出之CDR1、CDR2和CDR3序列。
在一個實施態樣中，結合至CD3之抗原結合區包含：
˙(第二)重鏈可變區(VH)，其包含SEQ ID NO：15之序列或與SEQ ID NO：15之序列具有至少90%、至少95%、至少97%或至少99%之胺基酸序列同一性之序列；及
˙(第二)輕鏈可變區(VL)，其包含SEQ ID NO：16之序列或與SEQ ID NO：16之序列具有至少90%、至少95%、至少97%或至少99%之胺基酸序列同一性之序列。
在進一步的實施態樣中，根據本發明之抗體包含結合至如本文所定義之CD3的抗原結合區之重鏈可變(VH)區，其中該序列與SEQ ID NO：15相比，包含總共最多1、2、3、4或5個胺基酸取代。
在進一步的實施態樣中，根據本發明之抗體包含結合至如本文所定義之CD3的抗原結合區之輕鏈可變(VL)區，其中該序列與SEQ ID NO：16相比，包含總共最多1、2、3、4或5個胺基酸取代。
在進一步的實施態樣中，第二重鏈可變區包含以SEQ ID NO：15列出之序列及第二輕鏈可變區包含以SEQ ID NO：16列出之序列。在一個實施態樣中，在SEQ ID NO：15中的X為H。在另一實施態樣中，在SEQ ID NO：15中的X為G。
能夠結合人類CD3之此等抗原結合區已說明於例如WO2015/001085 (Genmab)中，將其併入本文以供參考。其變異體(諸如包含如以其中X為G的SEQ ID NO：9列出之VH CDR3區之變異體，其對人類CD3結合之親和性比其中X為H的親本抗體低)已已說明於例如WO2017/009442 (Genmab)的實施例2中，將其併入本文以供參考。
依照本發明之該抗體可在結合人類CD3之抗原結合區與人類CD3之間以平衡解離常數KD結合，該平衡解離常數係在5至30 nM之範圍內，諸如在介於10與20 nM之間(單價結合)。
在一個實施態樣中，本發明之抗體亦可結合食蟹猴CD3 (SEQ ID NO：43)。
在進一步的實施態樣中，多特異性抗體包含：
(i) CD30結合區，其包含第一重鏈可變區，該第一重鏈可變區包含以SEQ ID NO：13列出之序列，及第一輕鏈可變區，該第一輕鏈可變區包含以SEQ ID NO：14列出之序列，及
(ii) CD3結合區，其包含第二重鏈可變區，該第二重鏈可變區包含以SEQ ID NO：15列出之序列，及第二輕鏈可變區，該第二輕鏈可變區包含以SEQ ID NO：16列出之序列。
抗體型式
本發明之多特異性抗體可能具有二或更多種特異性，諸如二或三或更多種特異性。此外，多特異性抗體可具有超過一個以上拷貝的CD3及/或CD30之抗原結合區。例如，在一個實施態樣中，抗體具有兩個能夠結合CD3之抗原結合區，諸如兩個結合CD3之相同的的結合區。例如，在另一實施態樣中，抗體具有兩個結合結合CD30之抗原結合區，諸如兩個結合CD30之相同的的結合區。額外的抗原結合區可例如以共價連結至恆定區之scFv的形式存在。
在較佳的實施態樣中，本發明之多特異性抗體為雙特異性抗體。雙特異性抗體的許多不同型式及用途為本技術中已知且由Kontermann之Drug Discov Today, 2015 Jul;20(7):838-47和Mabs之2012 Mar-Apr;4(2):182-97；及Labrijn等人之2019 Nat Rev Drug Discov 18(8) 585-608綜述。根據本發明之雙特異性抗體可不限於任何特定的雙特異性型式或其生產方法。
可在本發明使用之雙特異性抗體分子的實例包含(i)單一抗體，其具有兩個包含不同的抗原結合區之臂；(ii)單鏈抗體，其對兩個不同的標靶具有特異性，例如經由兩個以額外的肽連結子串接連結之scFv；(iii)雙重可變結構域抗體(DVD-Ig)，其中各輕鏈及重鏈含有兩個通過短的肽鍵聯串接之可變結構域(Wu等人之Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-Ig™) Molecule, In: Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010))；(iv)經化學連結之雙特異性(Fab’)2片段；(v) Tandab，其為兩個單鏈雙功能抗體之融合體，得到對標靶抗原中之各者具有兩個結合位點之四價雙特異性抗體；(vi)柔性抗體(flexibody)，其為scFv與雙功能抗體之組合，得到多價分子；(vii)基於蛋白激酶A中的「二聚合及對接(docking)結構域」之所謂的「對接與鎖定(dock and lock)」分子」，當應用於Fab時，其可產生由兩個連結至不同的Fab片段之相同的Fab片段所組成的三價雙特異性結合蛋白；(viii)所謂的Scorpion分子，其包含例如兩個與人類Fab臂的兩個末端融合之scFv；及(ix)雙功能抗體。
不同類別的雙特異性抗體的其他實例包括但不限於(i) IgG樣分子，具有互補的CH3結構域以迫使異二聚合；(ii)重組IgG樣雙重靶向分子，其中分子的兩側各含有至少兩種不同抗體之Fab片段或一部分的Fab片段；(iii) IgG融合分子，其中全長IgG抗體係與額外的Fab片段或部分的Fab片段融合；(iv) Fc融合分子，其中單鏈Fv分子或穩定之雙功能抗體係與重鏈恆定結構域、Fc區或其部分融合；(v) Fab融合分子，其中不同的Fab片段融合於一起，與重鏈恆定結構域、Fc區或其部分融合；及(vi)基於ScFv和雙功能抗體之抗體及重鏈抗體(例如結構域抗體、奈米抗體)，其中不同的單鏈Fv分子或不同的雙功能抗體或不同的重鏈抗體(例如結構域抗體、奈米抗體)彼此融合或與另一與重鏈恆定結構域、Fc區或其部分融合之蛋白質或載體分子融合。
具有互補的CH3結構域分子之IgG樣分子的實例包括但不限於三功能抗體(Triomab)/四功能抗體(Quadroma)分子(Trion Pharma/Fresenius Biotech；Roche，WO2011069104)、所謂的旋鈕入孔(Knob-into-Hole)分子(Genentech，WO9850431)、CrossMAb (Roche，WO2011117329)和靜電匹配分子(Amgen，EP1870459和WO2009089004；Chugai，US201000155133；Oncomed，WO2010129304)、LUZ-Y分子(Genentech，Wranik等人之J. Biol. Chem. 2012, 287(52): 43331-9, doi； 10.1074/jbc.M112.397869. Epub 2012 Nov 1)、DIG抗體和PIG抗體分子(Pharmabcine，WO2010134666、WO2014081202)、鏈交換工程化(Strand Exchange Engineered)結構域抗體(SEEDbody)分子(EMD Serono，WO2007110205)、Biclonics分子(Merus，WO2013157953)、FcΔAdp分子(Regeneron，WO201015792)、雙特異性IgG1和IgG2分子(Pfizer/Rinat，WO11143545)、Azymetric支架分子(Zymeworks/Merck，WO2012058768)、mAb-Fv分子(Xencor，WO2011028952)、雙價雙特異性抗體(WO2009080254)及DuoBody®分子(Genmab A/S，WO2011131746)。
重組IgG樣雙重靶向分子的實例包括但不限於雙重靶向(DT)-Ig分子(WO2009058383)、二合一(Two-in-one)抗體(Genentech；Bostrom等人之2009. Science 323, 1610-1614.)、交聯Mab (卡門諾斯癌症中心(Karmanos Cancer Center))、mAb2 (F-Star，WO2008003116)、Zybody分子(Zyngenia；LaFleur等人之MAbs. 2013 Mar-Apr;5(2):208-18)、具有共同輕鏈之通道(Crucell/Merus，US7,262,028)、κ/λbody
TM分子 (NovImmune，WO2012023053)和CovX抗體(CovX/Pfizer；Doppalapudi, V.R.等人之2007. Bioorg. Med. Chem. Lett. 17,501-506.)。
IgG融合分子的實例包括但不限於雙重可變結構域(DVD)-Ig分子(Abbott，US7,612,181)、雙重結構域雙頭抗體(Unilever；Sanofi Aventis，WO20100226923)、IgG樣雙特異性分子(ImClone/Eli Lilly，Lewis等人之Nat Biotechnol. 2014 Feb;32(2):191-8)、Ts2Ab (MedImmune/AZ；Dimasi等人之J Mol Biol. 2009 Oct 30;393(3):672-92)和BsAb分子(Zymogenetics，WO2010111625)、HERCULES分子(Biogen Idec，US007951918)、scFv融合分子(Novartis)、scFv融合分子(Changzhou Adam Biotech Inc，CN 102250246)及TvAb分子(Roche，WO2012025525、WO2012025530)。
Fc融合分子的實例包括但不限於ScFv/Fc融合體(Pearce等人之Biochem Mol Biol Int. 1997 Sep;42(6):1179-88)、SCORPION分子(Emergent BioSolutions/Trubion，Blankenship JW等人之AACR 100th Annual meeting 2009 (Abstract # 5465)；Zymogenetics/BMS，WO2010111625)、雙重親和性再靶向技術(Fc系DART)分子(MacroGenics，WO2008157379、WO2010080538)和雙重(ScFv)2-Fab分子(國家抗體醫學研究中心(National Research Center for Antibody Medicine)-中國)。
Fab融合雙特異性抗體的實例包括但不限於F(ab)2分子(Medarex/AMGEN；Deo等人之J Immunol. 1998 Feb 15;160(4):1677-86.)、雙重作用或雙Fab分子(Genentech，Bostrom等人之2009. Science 323, 1610-1614.)、對接及鎖定(DNL)分子(ImmunoMedics，WO2003074569、WO2005004809)、雙價雙特異性分子(Biotecnol，Schoonjans之J Immunol. 2000 Dec 15;165(12):7050-7.)及Fab-Fv分子(UCB-Celltech，WO 2009040562 A1)。
基於ScFv、雙功能抗體之抗體及結構域抗體的實例包括但不限於雙特異性T細胞銜接抗體(Engager)(BiTE)分子(Micromet，WO2005061547)、串接雙功能抗體分子(TandAb) (Affimed) Le Gall等人之Protein Eng Des Sel. 2004 Apr;17(4):357-66.)、DART分子(MacroGenics，WO2008157379、WO2010080538)、單鏈雙功能抗體分子(Lawrence之FEBS Lett. 1998 Apr 3;425(3):479-84)、TCR樣抗體(AIT，ReceptorLogics)、人類血清白蛋白ScFv融合體(Merrimack，WO2010059315)和COMBODY分子(Epigen Biotech, Zhu等人之Immunol Cell Biol. 2010 Aug;88(6):667-75.)、雙重靶向奈米抗體(Ablynx，Hmila等人之FASEB J. 2010)和雙重靶向僅重鏈結構域抗體。
在一個實施態樣中，本發明之雙特異性抗體為雙功能抗體、交叉抗體或經由受控之Fab臂交換所獲得的雙特異性抗體(諸如WO2011131746 (Genmab)中所述)。
在一個實施態樣中，本發明之抗體為雙特異性DuoBody®分子(Genmab A/S，WO2011131746)。
本發明之多特異性(諸如雙特異性)抗體可為任何同型。例示性同型包括但不限於人類IgG1、IgG2、IgG3和IgG4同型中任一者。抗體較佳地可選擇為人類IgG1同型，如實例中所示。可使用人類輕鏈恆定區κ或λ中任一者或兩者，例如以SEQ ID NO：53和54列出之序列。例如，在一個實施態樣中，涉及CD30結合之輕鏈包含κ恆定區及涉及CD3結合之輕鏈包含λ恆定區。在一個實施態樣中，本發明之抗體的兩個重鏈具有IgG1同型。在一個實施態樣中，雙特異性抗體的兩個重鏈分別具有IgG1和IgG4同型。雙特異性抗體較佳地可選擇為人類IgG1同型，如實例中所示。所選擇之同型的重鏈及其Fc區序列視需要地且較佳地可於樞紐、CH2及/或CH3區中進行修飾，能夠產生雙特異性抗體及/或引入惰性。
在一個實施態樣中，本發明之多特異性抗體包含由第一和第二Fc多肽所組成之Fc區。
在一個實施態樣中，第一Fc多肽及第一重鏈可變區包含在相同的多肽鏈內，且其中第二Fc多肽及第二重鏈可變區包含在相同的多肽鏈內。
第一和第二Fc多肽可分別具有任何同型，包括任何人類同型，諸如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgD、IgM或IgA同型或混合同型。Fc區較佳為人類IgG1、IgG2、IgG3、IgG4同型或混合同型。在一個實施態樣中，該Fc區為人類IgG1 Fc區。
在進一步的實施態樣中，多特異性抗體為如本文所定義之全長抗體。
根據本發明之抗體可包含在Fc區中的修飾，使得抗體成為惰性或非活化抗體。因此，在本文所揭示之抗體中，一或兩個重鏈可經修飾，使得抗體誘導經Fc媒介之效應子功能達到在程度上比相同(除了不包含該修飾以外)的抗體小。經Fc媒介之效應子功能可藉由測定在T細胞上經Fc媒介之CD69表現(亦即由於經CD3抗體媒介之Fcγ受體依賴性CD3交聯所致的CD69表現，例如在WO2015001085中所述)、藉由結合至Fcγ受體、藉由結合至C1q或藉由誘導經Fc媒介之FcγR交聯來測量。重鏈恆定序列特別地可經修飾，當與野生型(未經修飾)抗體相比時，使得經Fc媒介之CD69表現降低至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少99%或100%，其中該經Fc媒介之CD69表現係以基於PBMC之功能檢定法測定，例如以WO2015001085的實施例3中所述之流式細胞測量術。重鏈及輕鏈恆定序列之修飾亦可導致C1q與該抗體之結合降低。當與未經修飾之抗體相比時，可降低至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少97%或100%，且C1q結合可以ELISA測定。再者，Fc區可經修飾，使得該抗體媒介經Fc媒介之T細胞增殖與未經修飾之抗體相比，降低至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少99%或100%，例如在曲線的直線部分，其中該T細胞增殖係以基於PBMC之功能檢定法測量。
已開發範圍廣泛不同的非活化抗體型式，其中已將胺基酸取代及其組合引入IgG1同型抗體之恆定重鏈區中以消除經Fc媒介之效應子功能(例如Chiu等人之Antibodies 2019 Dec; 8(4): 55；Liu等人之Antibodies, 2020 Nov 17;9(4):64; 29(10):457-66；Shields等人之J Biol Chem. 2001 Mar 2;276(9):6591-604)。
可經修飾之胺基酸位置(例如在IgG1同型抗體中)的實例包括位置L234和L235。在一個實施態樣中，第一及/或第二Fc多肽包含對應於在人類IgG1重鏈中位置L234及/或L235上的胺基酸之胺基酸取代，其中取代較佳地分別針對F和E，其中胺基酸位置係根據Eu編號所定義。
應理解的是除了胺基酸位置L234和L235之修飾以外，亦可修飾其他位置。因此，在進一步的實施態樣中，第一和第二Fc多肽包含對應於位置L234和L235上的胺基酸分別針對F和E之胺基酸取代，且第一及/或第二Fc多肽另包含對應於在人類IgG1重鏈中位置G236上的胺基酸之胺基酸取代，其中取代較佳地針對R。
在另一實施態樣中，第一和第二Fc多肽包含對應於位置L234和L235上的胺基酸分別針對F和E之胺基酸取代，且第一和第二Fc多肽另包含對應於在人類IgG1重鏈中位置G236上的胺基酸之胺基酸取代，其中取代較佳地針對R。
在另一實施態樣中，第一和第二Fc多肽包含對應於位置L234和L235上的胺基酸分別針對F和E之胺基酸取代，且第一及/或第二Fc多肽另包含對應於在人類IgG1重鏈中位置D265上的胺基酸之胺基酸取代，其中取代較佳地針對A。
在另一實施態樣中，第一和第二Fc多肽包含對應於位置L234和L235上的胺基酸分別針對F和E之胺基酸取代，且第一和第二Fc多肽另包含對應於在人類IgG1重鏈中位置D265上的胺基酸之胺基酸取代，其中取代較佳地針對A。
在另一實施態樣中，第一和第二Fc多肽之一包含對應於位置L234、L235和G236上的胺基酸分別針對F、E和R之胺基酸取代，且另一Fc多肽包含對應於位置L234、L235E和D265上的胺基酸分別針對F、E和A之胺基酸取代。
在進一步的實施態樣中，第一Fc多肽包含對應於位置L234、L235和G236上的胺基酸分別針對F、E和R之胺基酸取代，且第二Fc多肽包含對應於位置L234、L235E和D265上的胺基酸分別針對F、E和A之胺基酸取代，其中胺基酸位置係根據Eu編號所定義。
例如，具有此等Fc區取代之恆定區係以例如SEQ ID NO：45、46、49、50、51和52提供，其可與不具有此等取代之SEQ ID NO：44相比。在一個實施態樣中，本發明之抗體包含選自由SEQ ID NO：45、46、49、50、51和52所組成之群組的序列。
在一個實施態樣中，本發明之多特異性或雙特異性抗體包含Fc區，其包含第一和第二CH3區，該第一和第二CH3區為不同的，且使得該第一和第二CH3區之間的異二聚相互作用比該第一和第二CH3區的每一同二聚相互作用更強。該等相互作用的更多細節及如何可達成提供於WO2011131746和WO2013060867 (Genmab)中，將該等特此併入以供參考。穩定的異二聚抗體可以例如WO 2008/119353和WO 2011/131746所提供之所謂的Fab臂交換而以高產量獲得，該獲得係以兩種在CH3區中僅含有很少的不對稱突變之同二聚合起始抗體為基礎。
在特別的實施態樣中，本發明提供抗體，其中在對應於人類IgG1重鏈中之K409的位置上之胺基酸為該第一Fc多肽中的R及在對應於人類IgG1重鏈中之F405的位置上之胺基酸為該第二Fc多肽中的L，或反之亦然。
在進一步的實施態樣中，在對應於K409之位置上的胺基酸為第一Fc多肽中的R，及其中在對應於F405之位置上的胺基酸為第二Fc多肽中的L。
因此，在一個實施態樣中，在第一Fc多肽中，在對應於人類IgG1重鏈中的選自由：T366、L368、K370、D399、F405、Y407和K409所組成之群組的位置之位置上的胺基酸中至少一者已被取代，且在第二Fc多肽中，在對應於人類IgG1重鏈中的選自由：T366、L368、K370、D399、F405、Y407和K409所組成之群組的位置之位置上的胺基酸中至少一者已被取代，且其中在第一和第二Fc多肽中的該取代不在相同的位置上，其中胺基酸位置係根據Eu編號所定義。例如，具有此等Fc區取代之恆定區係以例如SEQ ID NO：47、48、49、50、51和52提供，其可與不具有此取代之SEQ ID NO：44相比。在一個實施態樣中，本發明之抗體包含選自由SEQ ID NO：47、48、49、50、51和52所組成之群組的序列。
較佳地，在對應於F405之位置上的胺基酸為第一Fc多肽中的L及在對應於K409之位置上的胺基酸為第二Fc多肽中的R，或反之亦然。
因此，在一個實施態樣中，第一和第二Fc多肽之一包含對應於位置L234、L235、G236和F405上的胺基酸分別針對F、E、R和L之胺基酸取代，且另一Fc多肽包含對應於位置L234、L235E、D265和K409上的胺基酸分別針對F、E、A和R之胺基酸取代。
在另一實施態樣中，第一和第二Fc多肽之一包含對應於位置L234、L235、G236和F405上的胺基酸分別針對F、E、R和L之胺基酸取代，且另一Fc多肽包含對應於位置L234、L235E、D265和F405上的胺基酸分別針對F、E、A和L之胺基酸取代。
在進一步的實施態樣中，本發明關於多特異性抗體，其包含：
(i) CD30結合區，其包含第一重鏈可變區，該第一重鏈可變區包含分別以SEQ ID NO：1、2和3列出之CDR1、CDR2和CDR3序列，及第一輕鏈可變區，該第一輕鏈可變區包含分別以SEQ ID NO：4、5和6列出之CDR1、CDR2和CDR3序列，及
(ii) CD3結合區，其包含第二重鏈可變區，該第二重鏈可變區包含分別以SEQ ID NO：7、8和9列出之CDR1、CDR2和CDR3序列，及第二輕鏈可變區，該第二輕鏈可變區包含分別以SEQ ID NO：10、11和12列出之CDR1、CDR2和CDR3序列；
其中多特異性抗體為雙特異性抗體，且包含由第一和第二Fc多肽所組成之Fc區；
其中第一Fc多肽及第一重鏈可變區包含在相同的多肽鏈內，及其中第二Fc多肽及第二重鏈可變區包含在相同的多肽鏈內；
其中第一Fc多肽包含對應於位置L234、L235和G236上的胺基酸分別針對F、E和R之胺基酸取代，且第二Fc多肽包含對應於位置L234、L235和D265上的胺基酸分別針對F、E和A之胺基酸取代，其中胺基酸位置係根據Eu編號所定義；及
其中在對應於K409之位置上的胺基酸為第一Fc多肽中的R，及其中在對應於F405之位置上的胺基酸為第二Fc多肽中的L。
在進一步的實施態樣中，本發明關於多特異性抗體，其包含：
(i) CD30結合區，其包含第一重鏈可變區，該第一重鏈可變區包含分別以SEQ ID NO：1、2和3列出之CDR1、CDR2和CDR3序列，及第一輕鏈可變區，該第一輕鏈可變區包含分別以SEQ ID NO：4、5和6列出之CDR1、CDR2和CDR3序列，及
(ii) CD3結合區，其包含第二重鏈可變區，該第二重鏈可變區包含分別以SEQ ID NO：7、8和9列出之CDR1、CDR2和CDR3序列，及第二輕鏈可變區，該第二輕鏈可變區包含分別以SEQ ID NO：10、11和12列出之CDR1、CDR2和CDR3序列；
其中多特異性抗體為雙特異性抗體，且包含由第一和第二Fc多肽所組成之Fc區；
其中第一Fc多肽及第一重鏈可變區包含在相同的多肽鏈內，及其中第二Fc多肽及第二重鏈可變區包含在相同的多肽鏈內；
其中第一Fc多肽包含對應於位置L234、L235和D265上的胺基酸分別針對F、E和A之胺基酸取代，且第二Fc多肽包含對應於位置L234、L235和D265上的胺基酸分別針對F、E和A之胺基酸取代，其中胺基酸位置係根據Eu編號所定義；及
其中在對應於K409之位置上的胺基酸為第一Fc多肽中的R，及其中在對應於F405之位置上的胺基酸為第二Fc多肽中的L。
在一個實施態樣中，本發明之抗體包含下列或由下列所組成：以SEQ ID NO：17和19列出之重鏈序列及以SEQ ID NO：18和20列出之輕鏈序列。
在進一步的實施態樣中，本發明之抗體包含下列或由下列所組成：以SEQ ID NO：17和19列出之重鏈序列及以SEQ ID NO：18和20列出之輕鏈序列，且該抗體為雙特異性抗體。
在一個實施態樣中，本發明之抗體包含下列或由下列所組成：以SEQ ID NO：17和35列出之重鏈序列及以SEQ ID NO：18和20列出之輕鏈序列。
在一個實施態樣中，本發明之抗體包含下列或由下列所組成：以SEQ ID NO：55和19列出之重鏈序列及以SEQ ID NO：18和20列出之輕鏈序列。
在一個實施態樣中，本發明之抗體包含下列或由下列所組成：以SEQ ID NO：55和35列出之重鏈序列及以SEQ ID NO：18和20列出之輕鏈序列。
在又進一步的實施態樣中，本發明之抗體為bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR或bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR。在再進一步的實施態樣中，本發明之抗體為bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR。
以SEQ ID NO：44至52和55列出之恆定區序列不包括C端離胺酸(K)。然而，在人類中發現的衍生出該等Fc區的天然生成之序列中，此C端離胺酸可作為開讀框的一部分存在。在重組抗體的細胞培養物生產期間中，此端離胺酸可以內源性羧肽酶之蛋白水解切割，得到具有相同序列，但缺少C端離胺酸之恆定區。出於製造抗體的目的，可自序列省略編碼此端離胺酸之DNA，得以生產不具有離胺酸之抗體。自編碼抗體之序列省略C端離胺酸可增加有關C端離胺酸存在的抗體之同質性。自編碼或不編碼此端離胺酸的核酸序列生產之抗體在序列及功能上實質上相同，因為當例如使用基於CHO之生產系統生產之抗體時，C端離胺酸通常具有高的加工程度(Dick, L.W.等人之Biotechnol. Bioeng. 2008;100: 1132-1143)。因此，應理解的是可產生不編碼或不具有C端離胺酸的依照本發明之抗體，諸如本文所列出。出於製造目的，因此可產生不具有C端離胺酸之抗體。
在替代的實施態樣中，根據本發明之多特異性抗體不為包含Fc區之經典的全長抗體。例如，在一個實施態樣中，
(i) CD30結合區及/或CD3結合區為Fab，
(ii) CD30結合區及/或CD3結合區為scFv，
(iii) CD30結合區為Fab及CD3結合區為scFv，或
(iv) CD30結合區為scFv及CD3結合區為Fab。
結合、細胞毒性及T細胞活化
可結合至人類CD3及人類CD30的如本文所述之抗體(諸如雙特異性抗體)可有利地靶向T細胞至表現人類CD30之癌細胞，從而誘導經T細胞媒介之該癌細胞毒殺。
如所述，依照本發明之抗體較佳為惰性，且此外，抗體包含下列特性中之一或多者：
a) 當使用例如本文實施例中所述之流式細胞測量術測試時，能夠結合至表現CD30之人類腫瘤細胞，諸如SU-DHL-1細胞、SUP-M2細胞、DL-40細胞、KARPAS-299細胞、L-82細胞、SR-786細胞、L-540細胞、KM-H2細胞、L-1236細胞、JVM-2細胞、HH細胞、NCEB-1細胞及/或HDLM-2細胞，
b) 當如本文實施例中所述方式檢定時，當使用例如經純化之PBMC、ADCC效應子細胞或T細胞作為效應子細胞時，能夠媒介表現CD30之人類腫瘤細胞的濃度依賴性細胞毒性，
c) 當如本文實施例中所述方式檢定時，當使用例如經純化之PBMC或T細胞作為效應子細胞時，能夠媒介一或多種選自由下列所組成之群組的表現人類CD30之腫瘤細胞株的濃度依賴性細胞毒性：MCF-7、MDA-MB-468、SK-BR3、NIH-OVCAR-3、HCC1954和NCI-H1650，
d) 例如當如本文實施例中所述方式檢定時，能夠在表現CD30之人類腫瘤細胞存在下於試管內誘導T細胞增殖，
e) 當如本文實施例中所述方式檢定時，能夠在一或多種選自由下列所組成之群組的表現CD30之人類腫瘤細胞株存在下於試管內活化T細胞：SU-DHL-1細胞、L-428細胞、KI-JK細胞和HDLM-2細胞，
f) 當如本文實施例中所述方式檢定時，能夠以T細胞於試管內誘導劑量依賴性細胞激素及顆粒酶B生產，
g) 當如本文實施例中所述方式檢定時，能夠不導致T細胞自相殘殺，儘管CD30表現在活化之T細胞亞族群上，及/或
h) 當如本文實施例中所述方式檢定時，能夠誘導經T細胞媒介之細胞毒性，即使在sCD30的存在下。
在一個實施態樣中，當如本文實施例中所述方式檢定時，諸如使用L-428腫瘤細胞及以流式細胞測量術測量時，如本文所述之抗體係以低於0.045 μg/ml，諸如低於0.045 μg/ml，如低於0.040 μg/ml，諸如低於0.035 μg/ml，如低於0.030 μg/ml，諸如低於0.025 μg/ml，如低於0.020 μg/ml之EC
50濃度誘導經T細胞媒介之細胞毒性。
在進一步的實施態樣中，當如本文實施例中所述方式檢定時，諸如使用L-428腫瘤細胞及以流式細胞測量術測量時，如本文所述之抗體誘導經T細胞媒介之細胞毒性時，其具有大於80%，諸如大於85%，如大於90%之最大溶胞作用。
在一個實施態樣中，當如本文實施例中所述方式檢定時，諸如使用L-428腫瘤細胞及以流式細胞測量術測量時，如本文所述之抗體誘導CD4
+T細胞活化，具有低於0.05 μg/ml，諸如低於0.045 μg/ml，如低於0.04 μg/ml，諸如低於0.035 μg/ml，如低於0.03 μg/ml之CD25表現的EC
50濃度。在進一步的實施態樣中，當如本文實施例中所述方式檢定時，諸如使用L-428腫瘤細胞及以流式細胞測量術測量時，如本文所述之抗體誘導CD8
+T細胞活化，具有低於0.005 μg/ml，諸如低於0.001 μg/ml，如低於0.0009 μg/ml，諸如低於0.0008 μg/ml，如低於0.0007 μg/ml之CD25表現的EC
50濃度。
在一個實施態樣中，當如本文實施例中所述方式檢定時，諸如使用L-428腫瘤細胞及以流式細胞測量術測量時，如本文所述之抗體誘導CD4
+T細胞活化，具有低於0.004 μg/ml，諸如低於0.003 μg/ml，如低於0.002 μg/ml，諸如低於0.001 μg/ml，如低於0.0009 μg/ml之CD69表現的EC
50濃度。在進一步的實施態樣中，當如本文實施例中所述方式檢定時，諸如使用L-428腫瘤細胞及以流式細胞測量術測量時，如本文所述之抗體誘導CD8
+T細胞活化，具有低於0.0035 μg/ml，諸如低於0.0030 μg/ml，如低於0.0025 μg/ml，諸如低於0.0020 μg/ml，如低於0.0015 μg/ml之CD69表現的EC
50濃度。
在一個實施態樣中，當如本文實施例中所述方式檢定時，諸如使用L-428腫瘤細胞及以流式細胞測量術測量時，如本文所述之抗體誘導CD4
+T細胞活化，具有低於0.01 μg/ml，諸如低於0.008 μg/ml，如低於0.007 μg/ml，諸如低於0.006 μg/ml，如低於0.005 μg/ml之PD-1表現的EC
50濃度。在進一步的實施態樣中，當如本文實施例中所述方式檢定時，諸如使用L-428腫瘤細胞及以流式細胞測量術測量時，如本文所述之抗體誘導CD8
+T細胞活化，具有低於0.007 μg/ml，諸如低於0.006 μg/ml，如低於0.005 μg/ml，諸如低於0.004 μg/ml，如低於0.003 μg/ml之PD-1表現的EC
50濃度。
檢定法可以熟習的技術人員一般已知的方式執行，且可視需要地包含4：1之效應子細胞對靶細胞之比例(E：T)及/或視需要地72小時之培育期。檢定法能以例如以下方式執行：提供腫瘤細胞，較佳為經標記之腫瘤細胞，諸如L-428腫瘤細胞；添加如本文所述之抗體，較佳地連續稀釋；提供T細胞，較佳為經標記之T細胞，效應子對標靶之比例為4：1之E：T，且培育72小時；視需要地對相關參數(諸如CD4、CD8、CD25、CD69及/或PD-1)進行染色，且最後使用流式細胞測量術(如FACS)分析細胞。活細胞%及/或T細胞增殖/活化可自熟習本技術領域者一般已知的分析所獲得的數據計算。
生產本發明之抗體
可使用傳統方法(諸如雜交融合瘤)及化學共軛方法(Marvin和Zhu (2005) Acta Pharmacol Sin 26:649)製備本發明之多特異性(諸如雙特異性)抗體。由不同的重鏈及輕鏈所組成之兩種抗體在宿主細胞中的共表現導致除了所欲雙特異性抗體以外，亦導致可能的抗體產物之混合物，其接著可以例如親和性層析術或類似方法單離。
如所提及，亦可使用在不同的抗體構築體共表現後有利於形成功能性雙特異性產物之策略，例如由Lindhofer等人之(1995 J Immunol 155:219)所述之方法。生產不同抗體的大鼠和小鼠融合瘤之融合導致數量有限的異二聚蛋白質，因為經優先物種限制之重鏈/輕鏈配對。促進異二聚體的形成超越同二聚體之策略為「旋鈕入孔」策略，其中在第一重鏈多肽上引入突起及在第二重鏈多肽中引入對應的空腔，使得突起可位於該兩個重鏈界面之空腔中，以促進異二聚體形成且阻礙同二聚體形成。「突起」係藉由以較大的側鏈置換來自第一多肽之界面的小胺基酸側鏈來構建。與突起相同或類似大小的補償「空腔」係藉由以較小的胺基酸側鏈置換大胺基酸側鏈而在第二多肽之界面中創建(美國專利5,731,168)。EP1870459 (Chugai)和WO2009089004 (Amgen)說明不同的抗體結構域在宿主細胞中共表現後有利於形成異二聚體之其他策略。在該等方法中，構成兩個CH3結構域中的CH3-CH3界面之一或多個殘基係經帶電胺基酸置換，使得在靜電上不利於同二聚體形成，而在靜電上有利於異二聚體形成。WO2007110205 (Merck)又說明另一策略，其中利用在IgA與IgG CH3結構域之間的差異性促進異二聚合。
用於生產雙特異性抗體之另一試管內方法已說明於WO2008119353 (Genmab)中，其中雙特異性抗體係藉由在還原條件下培育後在兩種單特異性IgG4樣或IgG4樣抗體之間的「Fab臂」或「半分子」交換(重鏈與附著之輕鏈交換)來形成。所得產物為具有兩個可能包含不同序列的Fab臂之雙特異性抗體。
用於製備本發明之雙特異性CD3xCD30抗體之較佳方法包括在WO2011131746和WO13060867 (Genmab)中所述之方法，其包含以下步驟：
a) 提供包含Fc區之第一抗體，該Fc區包含第一CH3區；
b) 提供包含第二Fc區之第二抗體，該Fc區包含第二CH3區，
其中第一抗體為CD3抗體及第二抗體為CD3抗體，或反之亦然；
其中該第一和第二CH3區之序列不同，且使得該第一和第二CH3區之間的異二聚相互作用比該第一和第二CH3區的每一同二聚相互作用更強；
c) 將該第一抗體與該第二抗體一起在還原條件下培育；以及
d) 獲得該雙特異性CD3xCD30抗體。
同樣地，本發明關於生產根據本發明之多特異性(諸如雙特異性)抗體之方法，其包含
a) 提供第一同二聚抗體，其包含如本文所述之CD30結合區，及第二同二聚抗體，其包含如本文所述之CD3結合區，其中該抗體包含Fc區且視需要地含有如本文所述之其他特徵，
其中第一及第二抗體的第一和第二CH3區之序列不同，且使得第一和第二CH3區之間的異二聚相互作用比第一和第二CH3區的每一同二聚相互作用更強；
b) 將第一抗體與第二抗體一起在足以容許在樞紐區中的半胱胺酸經歷雙硫鍵異構化之還原條件下培育；以及
c) 獲得如本文所述的本發明之異二聚多特異性抗體，其包含第一抗體之第一免疫球蛋白重鏈和第一免疫球蛋白輕鏈及第二抗體之第二免疫球蛋白重鏈和第二免疫球蛋白輕鏈。
在一個實施態樣中，將該第一抗體與該第二抗體一起在足以容許在樞紐區中的半胱胺酸經歷雙硫鍵異構化之還原條件下培育，其中在所得異二聚抗體中的該第一與第二抗體之間的異二聚相互作用使得在37℃下24小時後在0.5 mM GSH下不發生Fab臂交換。
不受理論的限制，在步驟c)中，將親本抗體之樞紐區中的重鏈雙硫鍵還原，且所得半胱胺酸接著能夠與另一親本抗體分子(最初具有不同的特異性)之半胱胺酸殘基形成重鏈間雙硫鍵。在此方法的一個實施態樣中，在步驟c)中之還原條件包含添加還原劑，例如選自由下列所組成之群組的還原劑：2-巰乙胺(2-MEA)、二硫蘇糖醇(DTT)、二硫赤蘚糖醇(dithioerythritol)(DTE)、麩胱甘肽、參(2-羧乙基)膦(TCEP)、L-半胱胺酸和β-巰乙醇，較佳地選自由下列所組成之群組的還原劑：2-巰乙胺、二硫蘇糖醇和參(2-羧乙基)膦。在較佳的實施態樣中，還原劑為2-巰乙胺。在進一步的實施態樣中，步驟c)包含將條件恢復成為非還原或低還原，例如藉由移除還原劑，例如藉由脫鹽。
在進一步的態樣中，本發明關於單特異性抗體，其包含
(i) CD30結合區，其包含第一重鏈可變區，該第一重鏈可變區包含分別以SEQ ID NO：1、2和3列出之CDR1、CDR2和CDR3序列，及第一輕鏈可變區，該第一輕鏈可變區包含分別以SEQ ID NO：4、5和6列出之CDR1、CDR2和CDR3序列，及
(ii) 由第一和第二Fc多肽所組成之Fc區，其中第一和第二Fc多肽包含對應於位置L234和L235上的胺基酸分別針對F和E之胺基酸取代，且其中第一和第二Fc多肽另包含對應於在人類IgG1重鏈中位置G236上的胺基酸之胺基酸取代，其中取代較佳地針對R，其中胺基酸位置係根據Eu編號所定義。
在一個實施態樣中，第一重鏈可變區包含以SEQ ID NO：13列出之序列及第一輕鏈可變區包含以SEQ ID NO：14列出之序列。
在進一步的態樣中，本發明關於單特異性抗體，其包含
(i) CD3結合區，其包含第二重鏈可變區，該第二重鏈可變區包含分別以SEQ ID NO：7、8和9列出之CDR1、CDR2和CDR3序列，及第二輕鏈可變區，該第二輕鏈可變區包含分別以SEQ ID NO：10、11和12列出之CDR1、CDR2和CDR3序列，及
(ii) 由第一和第二Fc多肽所組成之Fc區，其中第一和第二Fc多肽包含對應於位置L234和L235上的胺基酸分別針對F和E之胺基酸取代，且其中第一和第二Fc多肽另包含對應於在人類IgG1重鏈中位置G236上的胺基酸之胺基酸取代，其中取代較佳地針對R，其中胺基酸位置係根據Eu編號所定義。
在一個實施態樣中，在SEQ ID NO：9中的X為H。在另一實施態樣中，在SEQ ID NO：9中的X為G。在一個實施態樣中，第二重鏈可變區包含以SEQ ID NO：15列出之序列及第二輕鏈可變區包含以SEQ ID NO：16列出之序列。
在一個實施態樣中，上文提及之單特異性抗體為全長抗體。較佳地在對應於人類IgG1重鏈中的選自由：T366、L368、K370、D399、F405、Y407和K409所組成之群組的位置之位置上的胺基酸中至少一者已被取代，其中較佳地在對應於F405之位置上的胺基酸為L或在對應於K409之位置上的胺基酸為R。
在進一步的態樣中，本發明關於生產多特異性抗體之方法，其包含
a) 提供如上文所述之第一單特異性CD30抗體及包含下列的第二抗體：
(i) CD3結合區，其包含第二重鏈可變區，該第二重鏈可變區包含分別以SEQ ID NO：7、8和9列出之CDR1、CDR2和CDR3序列，及第二輕鏈可變區，該第二輕鏈可變區包含分別以SEQ ID NO：10、11和12列出之CDR1、CDR2和CDR3序列，及
(ii) 由第一和第二Fc多肽所組成之Fc區，其中第一和第二Fc多肽包含在人類IgG1重鏈中對應於位置L234和L235上分別針對F和E的胺基酸之胺基酸取代及對應於位置D265上針對A的胺基酸之胺基酸取代，
或
提供如本文所述之第二單特異性CD3抗體及包含下列的第一抗體：
(i) CD30結合區，其包含第二重鏈可變區，該第二重鏈可變區包含分別以SEQ ID NO：1、2和3列出之CDR1、CDR2和CDR3序列，及第二輕鏈可變區，該第二輕鏈可變區包含分別以SEQ ID NO：4、5和6列出之CDR1、CDR2和CDR3序列，及
(ii) 由第一和第二Fc多肽所組成之Fc區，其中第一和第二Fc多肽包含對應於位置L234和L235上的胺基酸分別針對F和E之胺基酸取代及對應於在人類IgG1重鏈中位置D265上的胺基酸針對A之胺基酸取代，
其中第一及第二抗體的第一和第二CH3區之序列不同，且使得第一和第二CH3區之間的異二聚相互作用比第一和第二CH3區的每一同二聚相互作用更強；其中較佳地在對應於F405之位置上的胺基酸為第一CH3區中的L及在對應於K409之位置上的胺基酸為第二CH3區中的R，或反之亦然，
b) 將第一抗體與第二抗體一起在足以容許在樞紐區中的半胱胺酸經歷雙硫鍵異構化之還原條件下培育；以及
c) 獲得包含第一抗體之第一免疫球蛋白重鏈和第一免疫球蛋白輕鏈及第二抗體之第二免疫球蛋白重鏈和第二免疫球蛋白輕鏈之多特異性抗體。
在一個實施態樣中，本發明關於生產如本文所述之多特異性抗體之方法，其包含
a) 提供如本文所述之第一單特異性CD30抗體及包含下列的第二抗體：
(i) CD3結合區，其包含第二重鏈可變區，該第二重鏈可變區包含分別以SEQ ID NO：7、8和9列出之CDR1、CDR2和CDR3序列，及第二輕鏈可變區，該第二輕鏈可變區包含分別以SEQ ID NO：10、11和12列出之CDR1、CDR2和CDR3序列，及
(ii) 由第一和第二Fc多肽所組成之Fc區，其中第一和第二Fc多肽包含對應於位置L234和L235上的胺基酸分別針對F和E之胺基酸取代及對應於在人類IgG1重鏈中位置D265上的胺基酸針對A之胺基酸取代，
其中第一及第二抗體的第一和第二CH3區之序列不同，且使得第一和第二CH3區之間的異二聚相互作用比第一和第二CH3區的每一同二聚相互作用更強；其中較佳地在對應於K409之位置上的胺基酸為第一CH3區中的R及在對應於F405之位置上的胺基酸為第二CH3區中的L，
b) 將第一抗體與第二抗體一起在足以容許在樞紐區中的半胱胺酸經歷雙硫鍵異構化之還原條件下培育；以及
c) 獲得包含第一抗體之第一免疫球蛋白重鏈和第一免疫球蛋白輕鏈及第二抗體之第二免疫球蛋白重鏈和第二免疫球蛋白輕鏈之多特異性抗體。
本發明進一步關於以如本文所述之方法獲得的多特異性抗體。
在上述方法中，提供能夠結合至CD30及/或CD3之第一或第二同二聚抗體的步驟可包含以下步驟
-提供用於生產該抗體或該抗體類的含有表現載體之細胞；及
-容許細胞生產該抗體或該抗體類，且隨後，
-獲得該抗體或該抗體類，從而提供該抗體或該抗體類。
在此方法的一個實施態樣中，該第一及/或第二同二聚抗體為全長抗體。
第一及第二同二聚抗體之Fc區可為任何同型，包括但不限於IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在此方法的一個實施態樣中，該第一及該第二同二聚抗體兩者之Fc區為IgG1同型。在另一實施態樣中，該同二聚抗體之Fc區中之一者為IgG1同型及其他為IgG4同型。在後者的實施態樣中，所得雙特異性抗體包含IgG1之Fc區及IgG4之Fc區，且可能因此具有關於效應子功能活化之關心的中間性質。
在進一步的實施態樣中，同二聚起始抗體之一已經工程化而不結合蛋白質A，因此容許藉由使產物通過蛋白質A管柱而使異二聚抗體與同二聚起始抗體單離，移除流穿物(flow-through)，且自蛋白質A管柱溶析異二聚抗體，以獲得經純化之異二聚抗體組成物。
如上述，同二聚起始抗體的第一和第二CH3區之序列可能不同，且使得該第一和第二CH3區之間的異二聚相互作用比該第一和第二CH3區的每一同二聚相互作用更強。該等相互作用的更多細節及如何可達成提供於WO2011131746和WO2013060867 (Genmab)中，將該等以其全文特此併入以供參考。
穩定的雙特異性CD3xCD30抗體可特別地使用本發明之上述方法而以高產量獲得，該方法係以兩種分別結合CD30及CD3且於CH3區中僅含有很少的相當保守型不對稱突變之同二聚起始抗體為基礎。不對稱突變意指該第一和第二CH3區之序列含有在不同位置上的胺基酸取代。
本發明之多特異性(諸如雙特異性)抗體亦可藉由編碼單細胞中的第一和第二多肽之構築體的共表現來獲得。
因此，在進一步的態樣中，本發明關於編碼根據本發明之多特異性抗體之核酸構築體或核酸構築體之組合，及關於包含此(a)核酸構築體之表現載體或表現載體之組合。
此外，本發明關於能夠生產根據本發明之多特異性抗體之重組宿主細胞，其中宿主細胞包含一或多種編碼根據本發明之多特異性抗體之核酸構築體。
據此，本發明亦關於生產根據本發明之多特異性抗體之方法，其包含
(i)將本發明之重組宿主細胞在其中生產抗體的條件下培養，且
(ii)將生產之多特異性抗體與培養物單離。
在一個實施態樣中，該方法包含以下步驟：
a) 提供第一核酸構築體，其編碼包含第一抗體重鏈之第一Fc區和第一抗原結合區的第一多肽，該第一Fc區包含第一CH3區，
b) 提供第二核酸構築體，其編碼包含第二抗體重鏈之第二Fc區和第二抗原結合區的第二多肽，該第二Fc區包含第二CH3區，
其中該第一和第二CH3區之序列不同，且使得該第一與第二CH3區之間的異二聚合相互作用比該第一和第二CH3區的每一同二聚相互作用更強，視需要地其中該第一和第二核酸構築體編碼該第一及第二抗體之輕鏈序列，
c) 該第一和第二核酸構築體共表現在宿主細胞中，且
d) 自細胞培養物獲得該異二聚蛋白質。
較佳地，在對應於F405之位置上的經編碼之胺基酸為第一CH3區中的L及在對應於K409之位置上的經編碼之胺基酸為第二CH3區中的R，或反之亦然。
用於生產抗體之適合的表現載體(包括啟動子、增強子等)及適合的宿主細胞為本技術中所熟知。宿主細胞的實例包括酵母、細菌和哺乳動物細胞，諸如諸如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)或人類，諸如人類胚胎腎(HEK)細胞。
如本文所定義之核酸或一或多種核酸類可為RNA或DNA。如本文所定義之核酸或一或多種核酸類可用於表現在哺乳動物細胞中。因此，本發明此外提供包含如本文所定義之核酸或包含如本文所定義之一或多種核酸類的細胞或細胞類。
在本發明之上下文中，核酸可為表現載體，其可為任何適合的載體，包括染色體、非染色體和合成核酸載體(包含一組適合的表現控制元件之核酸序列)。此等載體的實例包括SV40之衍生物、細菌質體、噬菌體DNA、桿狀病毒、酵母質體、衍生自質體與噬菌體DNA之組合的載體和病毒核酸(RNA或DNA)載體。在一個實施態樣中，編碼CD30或CD3抗體之核酸包含在裸DNA或RNA載體中，包括例如線性表現元件(如在例如Sykes和Johnston之Nat Biotech 17, 355 59 (1997)中所述)、緊密核酸載體(如在例如US 6,077,835及/或WO 00/70087中所述)、質體載體(諸如pBR322、pUC 19/18或pUC 118/119)、尺寸最小的「微型(midge)」核酸載體(如在例如Schakowski等人之Mol Ther 3, 793 800 (2001)中所述)或經沉澱之核酸載體構築體，諸如經CaP04沉澱之構築體(如在例如WO200046147、Benvenisty和Reshef之PNAS USA 83, 9551 55 (1986)、Wigler等人之Cell 14, 725 (1978)及Coraro和Pearson之Somatic Cell Genetics 7, 603 (1981)中所述)。此等核酸載體及其用途為本技術中所熟知(參見例如US 5,589,466和US 5,973,972)。
在一個實施態樣中，載體適合於CD30抗體及/或CD3抗體在細菌細胞中表現。此等載體的實例包括表現載體(諸如BlueScript (Stratagene))、pIN載體(Van Heeke & Schuster之J Biol Chem 264, 5503 5509 (1989))、pET載體(Novagen, Madison WI)及類似者。
表現載體亦可為或可替代為適合於酵母系統中表現之載體。可使用適合於酵母系統中表現之任何載體。適合的載體包括例如包含組成型或可誘導型啟動子(諸如α因子、醇氧化酶和PGH)之載體(綜述於：F. Ausubel等人編輯之Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience New York (1987)，及Grant等人之Methods in Enzymol 153, 516 544 (1987)中)。
核酸及/或表現載體亦可包含編碼分泌/定位序列之核酸序列，其可靶向多肽(諸如新生多肽鏈)至周質空間或細胞培養基中。此等序列為本技術中已知，且包括分泌前導序列或訊息肽。核酸及/或表現載體可包含促成核酸表現(亦即轉錄及/或轉譯)之任何適合的元件，使得(雙特異性)抗體之組分表現。核酸及/或載體係與任何適合的啟動子、增強子及其他促成表現之元件締合。此等元件的實例包括強表現啟動子(例如人類CMV IE啟動子/增強子，以及RSV、SV40、SL3 3、MMTV和HIV LTR啟動子)、有效的poly (A)終止序列、質體產物於大腸桿菌中的複製起點、作為可選標誌物的抗生素抗性基因及/或方便的選殖位點(例如聚連結子)。核酸亦可包含可誘導型啟動子，其與組成型啟動子(諸如CMV IE)相反。
組成物及(醫療)用途
此外，本發明提供包含如本文所定義之抗體的組成物。此組成物較佳為醫藥組成物，亦即抗體包含在醫藥上可接受的載劑中。
醫藥組成物可依照習知的技術調配，諸如那些在Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995中所揭示之技術。本發明之醫藥組成物可例如包括稀釋劑、填充劑、鹽類、緩衝劑、清潔劑(例如非離子性清潔劑，諸如Tween-20或Tween-80)、穩定劑(例如糖或無蛋白質胺基酸)、保存劑、組織固定劑、增溶劑及/或適合於包括在醫藥組成物中的其他材料。
醫藥組成物可以任何適合的途徑及模式投予。在一個實施態樣中，醫藥組成物係經靜脈內或皮下注射或輸注投予。
依照本發明之抗體、組成物或醫藥組成物較佳地用作為藥劑。
依照本發明之抗體、組成物或醫藥組成物較佳地用於治療疾病。
本發明之雙特異性抗體可特別地用於治療各種形式的癌症。
在一個態樣中，本發明提供治療個體的癌症之方法，該方法包含投予治療有效量的本發明之多特異性抗體。在進一步的實施態樣中，本發明提供治療個體中涉及表現CD30之細胞的疾患之方法，該方法包含投予治療有效量的本發明之多特異性抗體。
如所述，依照本發明之方法及用途可涵蓋之適合的疾病為癌症。該癌症最佳地以CD30表現為特性。在癌症中的CD30表現可使用本技術中已知的方法容易地測定，諸如PCR、免疫染色或FACS分析，亦即檢測CD30轉錄本及/或蛋白質之表現。如本文所述之能夠結合至人類CD30之抗體可用於例如免疫染色及/或FACS分析或類似分析中。
在一個態樣中，本發明關於用於治療霍奇金氏淋巴瘤或退行性大細胞淋巴瘤的根據本發明之多特異性抗體、組成物或醫藥組成物。
在進一步的態樣中，本發明關於用於治療霍奇金氏淋巴瘤(HL)或非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)的根據本發明之多特異性抗體、組成物或醫藥組成物。
在一個實施態樣中，霍奇金氏淋巴瘤為經典的霍奇金氏淋巴瘤(cHL)。
在一個實施態樣中，非霍奇金氏淋巴瘤為T細胞非霍奇金氏淋巴瘤(T-NHL)或B細胞非霍奇金氏淋巴瘤(B-NHL)。在進一步的實施態樣中，非霍奇金氏淋巴瘤為T細胞非霍奇金氏淋巴瘤(T-NHL)。
在進一步的實施態樣中，T細胞非霍奇金氏淋巴瘤為周邊T細胞淋巴瘤(PTCL)或皮膚T細胞淋巴瘤(CTCL)。在又進一步的實施態樣中，T細胞非霍奇金氏淋巴瘤(T-NHL)為退行性大細胞淋巴瘤(ALCL)。在又進一步的實施態樣中，周邊T細胞淋巴瘤(PTCL)為退行性大細胞淋巴瘤(ALCL)。
在一個實施態樣中，B細胞非霍奇金氏淋巴瘤(B-NHL)為套膜細胞淋巴瘤(MCL)。
在再進一步的實施態樣中，霍奇金氏淋巴瘤(HL)為復發型及難治型霍奇金氏淋巴瘤。在進一步的實施態樣中，霍奇金氏淋巴瘤(HL)為CD30+霍奇金氏淋巴瘤。在又進一步的實施態樣中，霍奇金氏淋巴瘤(HL)為復發型及難治型CD30+霍奇金氏淋巴瘤。在再進一步的實施態樣中，霍奇金氏淋巴瘤(HL)為復發型及難治型CD30+經典的霍奇金氏淋巴瘤。
在再進一步的實施態樣中，非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)為復發型及難治型非霍奇金氏淋巴瘤。在進一步的實施態樣中，非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)為CD30+非霍奇金氏淋巴瘤。在又進一步的實施態樣中，非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)為復發型及難治型CD30+非霍奇金氏淋巴瘤。
在進一步的實施態樣中，用於治療霍奇金氏淋巴瘤(HL)或非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)的根據本發明之多特異性抗體、組成物或醫藥組成物係經或已經靜脈內及/或皮下投予，較佳地經皮下投予。
在進一步的實施態樣中，可使經診斷患有癌症的患者接受癌細胞中的CD30表現之評定，且當檢測出CD30時，其可能在低至高的範圍內，可選擇此患者進行依照本發明之抗體治療。然而，在選擇治療的患者時可能未必需要包括此評定。
本發明之多特異性抗體具有許多試管內及活體內診斷及治療效用，包含涉及表現CD30之細胞的疾患之診斷和治療。例如，抗體可例如於試管內或活體外投予培養物中的細胞，或例如於活體內投予個體以治療、預防及/或診斷多種疾患。如本文所使用之術語「個體」意欲包括人類及非人類個體。
在一個態樣中，本發明關於診斷組成物，其包含根據如本文所揭示之實施態樣中任一者之多特異性抗體。
在一個實施態樣中，診斷組成物為用於篩選及選出自多特異性抗體治療而受惠的那些患者之伴隨診斷。
套組
本發明進一步提供包含如上文所揭示之抗體的配件套組，諸如用作為伴隨診斷/用於鑑定在患者群體內對如上文所定義之抗體的治療具有反應傾向的那些患者，或用於預測該抗體在用於治療患者時的效力或抗腫瘤活性之套組，套組包含如上文所定義之抗體；及使用該套組之用法說明。
在一個實施態樣中，本發明提供用於癌症診斷之套組，其包含容器，該容器包含多特異性CD3xCD30抗體及用於檢測表現CD30之細胞與表現CD3之細胞的交聯之一或多種試劑。試劑可包括例如螢光標籤、酶標籤或其他可檢測標籤。試劑亦可包括二級或三級抗體或用於酶反應之試劑，其中酶反應生產可目測之產物。
在進一步的態樣中，本發明關於用於檢測在投予根據如本文所揭示之實施態樣中任一者之多特異性抗體後在源自患者的樣品中表現CD30之細胞與表現CD3之細胞之間是否發生交聯之方法，其包含以下步驟：
(i) 將樣品與根據如本文所揭示之實施態樣中任一者之多特異性抗體在容許該雙特異性抗體與表現CD30之細胞及表現CD3之細胞之間形成複合物的條件下接觸；及
(ii) 分析是否已形成複合物。
核酸構築體之遞送及遞送媒劑
在進一步的態樣中，本發明關於投予編碼本發明之抗體的活體內表現之核酸構築體。關於編碼抗體的活體內表現之核酸，該核酸典型地以適合於核酸進入個體細胞的形式投予。有不同的方法遞送活體內表現之核酸，且該等方法包括兼具涉及機械及化學方式之方法。例如，此等方法可能包含將核酸電穿孔或紋身在皮膚上(Patel等人之2018, Cell Reports 25, 1982-1993)。適合於核酸投予個體之其他方法包含以適合的調配物投予核酸。
因此，本發明亦關於包含根據本發明之核酸或核酸組合之遞送媒劑。在一些實施態樣中，該遞送媒劑可為脂質調配物。調配物之脂質可為粒子，諸如脂質奈米粒子(LNP)。本發明之核酸或核酸組合可囊封在該粒子內，例如該LNP內。適合於投予個體的活體內表現之核酸的不同的脂質調配物為熟習本技術領域者所熟知的。例如，該脂質調配物典型地可包含脂質、可離子化的胺基脂質、PEG-脂質、膽固醇或其任何組合。
用於製備適合於投予個體的核酸以表現治療性抗體之脂質調配物的各種形式及方法為本技術中所熟知的。此等脂質調配物的實例包括但不限於那些在US20180170866 (Arcturus)、EP 2391343 (Arbutus)、WO 2018/006052 (Protiva)、WO2014152774 (Shire Human Genetics)、EP 2 972 360 (Translate Bio)、US10195156 (Moderna)和US20190022247 (Acuitas)中所述者。
據此，在進一步的態樣中，本發明關於用作為藥劑的根據本發明之(a)核酸構築體或根據本發明之遞送媒劑，該藥劑較佳地用於治療癌症，諸如治療霍奇金氏淋巴瘤或退行性大細胞淋巴瘤。
本發明係以下列的實施例進一步例證，不應將其解釋為限制本發明之範圍。
實施例1 - 以經2-MEA誘導之Fab臂交換產生CD3xCD30雙特異性抗體
以下列的抗體用於實施例中：
人源化CD3抗體
如WO2015/001085 (Genmab)的實施例1中所述之IgG1-huCD3-H1L1。IgG1-huCD3-H1L1在本文被稱為「IgG1-huCD3」。
如WO2017/009442 (Genmab)的實施例2中所述之IgG1-huCD3-H1L1-H101G。IgG1-huCD3-H1L1-H101G在本文被稱為「IgG1-huCD3-H101G」。
CD30抗體
亦稱為HuMab 5F11之MDX-060已揭示於WO2003/ 059282 (Medarex)中。hAC10 (或SGN-30)已揭示於US 8257706和US20100239571 (Seattle genetics)中。HRS-3已揭示於WO2016/0177846 (Affimed)中。HeFi-I、T405、T105、T408和T215已揭示於WO 2007/040653 (US government & Health)中。
抗體表現
將抗體序列選殖至pcDNA3.3表現載體(Invitrogen, US)中且以IgG1,κ或IgG1,λ表示，在Fc結構域中具有或不具有Fc靜默及/或DuoBody®技術胺基酸取代(參見下文)。所有的抗體係在無血清條件下使用ExpiFectamine
TM293 (Thermo Fisher Scientific；目錄號A14525)基本上根據製造商的說明在Expi293F
TM細胞(Thermo Fisher Scientific, US；目錄號A14527)中共轉染相關重鏈及輕鏈表現載體來生產。
產生雙特異性抗體
雙特異性抗體係於試管內使用DuoBody®平臺技術產生，亦即如WO2011147986、WO2011131746和WO2013060867 (Genmab)及Labrijn等人(Labrijn等人之PNAS 2013, 110: 5145-50；Gramer等人之MAbs 2013, 5: 962- 973)中所述之經2-MEA誘導之控制型Fab臂交換(cFAE)。為了能以此方法產生雙特異性抗體，產生在CH3結構域中攜帶單一突變之IgG1分子：在一個親本IgG1抗體中的F405L突變(亦即CD3抗體或對照組，HIV-1 gp120特異性抗體)、在其他親本IgG1抗體中的K409R突變(亦即CD30或對照抗體)。除了該等突變以外，親本IgG1抗體包括導致不能與IgG Fc受體(Fc γ受體)及/或補體因子(諸如C1q：L234F、L235E、D265A (FEA；US 2015/0337049)或L234F、L235E、G236R (FER))相互作用之Fc結構域的取代。
Fc靜默及DuoBody®技術突變之組合係標出如下：
L234F、L235E、D265A和F405L：FEAL
L234F、L235E、D265A和K409R：FEAR
L234F、L235E、G236R和K409R：FERR
親本抗體之重鏈(HC)及輕鏈(LC)序列係以下列的SEQ ID NO列出：
IgG1-huCD3-FEAL：SEQ ID NO：19 (HC)和SEQ ID NO：20 (LC)。
IgG1-huCD3-H101G-FEAL：SEQ ID NO：35 (HC)和SEQ ID NO：20 (LC)。
IgG1-CD30-MDX060-FERR：SEQ ID NO：17 (HC)和SEQ ID NO：18 (LC)。
IgG1-CD30-MDX060-FEAR：SEQ ID NO：55 (HC)和SEQ ID NO：18 (LC)。
IgG1-CD30-hAC10-FEAR：SEQ ID NO：21 (HC)和SEQ ID NO：22 (LC)。
IgG1-CD30-HRS-3-FEAR：SEQ ID NO：23 (HC)和SEQ ID NO：24 (LC)。
IgG1-CD30-HeFi-I-FEAR：SEQ ID NO：25 (HC)和SEQ ID NO：26 (LC)。
IgG1-CD30-T405-FEAR：SEQ ID NO：27 (HC)和SEQ ID NO：28 (LC)。
IgG1-CD30-T105-FEAR：SEQ ID NO：29 (HC)和SEQ ID NO：30 (LC)。
IgG1-CD30-T408-FEAR：SEQ ID NO：31 (HC)和SEQ ID NO：32 (LC)。
IgG1-CD30-T215-FEAR：SEQ ID NO：33 (HC)和SEQ ID NO：34 (LC)。
為了產生雙特異性抗體，將兩種親本抗體以等莫耳比在PBS緩衝液(磷酸鹽緩衝鹽水；8.7 mM HPO
4 2-、1.8 mM H
2PO
4 -、163.9 mM Na
+、140.3 mM Cl
-，pH 7.4)中混合。將2-巰基乙胺-HCl (2-MEA)添加至75 mM之最終濃度中且將反應混合物在31℃下培育5 h。將2-MEA使用10 kDa分子量截留Slide-A-Lyzer架(Thermo Fisher Scientific)根據製造商的方案透析至PBS緩衝液中而移除。將樣品在4℃下儲存隔夜以容許雙硫鍵再氧化及形成完整的雙特異性抗體。如以電灑游離質譜術(ESI-MS)所評估之cFAE的效力為＞95%，如Gramer等人所述(MAbs. 2013 Nov 1; 5(6): 962-973)。
未結合之對照抗體b12
IgG1-b12為HIV-1 gp120特異性抗體(Barbas, CF.之J Mol Biol. 1993 Apr 5; 230(3):812-23)，其於一些實施例中用作為未結合之陰性對照抗體。在本文包括分別以SEQ ID NO：36和37(FEAL)或分別以SEQ ID NO：38和37(FERR)之重鏈序列及輕鏈序列。
實施例2 - 在人類霍奇金氏淋巴瘤(HL)、退行性大細胞淋巴瘤(ALCL)和TLL細胞株中的CD30表現
CD30表面表現水平係在一組HL、ALCL及TLL細胞株(表4)中使用定量性流式細胞測量術(人類IgG校正套組，Biocytex，目錄號CP010)評估。將細胞(5x10
4個細胞/孔)在聚苯乙烯96孔圓底盤(Greiner bio-one，目錄號650180)中與10 µg/mL之IgG1-CD30-MDX060-FERR在50 μL之染色緩衝液(以0.1%之牛血清白蛋白[BSA，fraction V，Roche，目錄號10735086001]及0.02%之NaN3 [Sigma Aldrich，目錄號13412]補充之PBS [Lonza，目錄號BE17-517Q])中於4℃下培育30 min。同時，標準曲線係使用人類IgG校正套組(Biocytex，目錄號CP010)基本上根據製造商的用法說明產生。將每磁珠含有明確數量的人類IgG單株抗體之校正磁珠與相同的經R-PE共軛之二級抗體(Jackson ImmunoResearch, UK；目錄號109-116-098；1：500稀釋)於4℃下避光培育30 min。將細胞及磁珠在FACS緩衝液中清洗且在FACSCelesta流式細胞儀(BD Biosciences, USA)上以流式細胞測量術分析。使用人類IgG校正套組所獲得的標準曲線用於內插每一細胞結合之IgG1-CD30-MDX060-FERR抗體數目(ABC)，該內插係使用GraphPad Prism軟體，表示在細胞表面上表現之CD30分子的數目估計值。
表4和5顯示在除了SUP-T1以外的所有細胞株中皆觀察到高於定量下限(LLOQ)之CD30表現。
實施例3 - CD3xCD30雙特異性抗體與人類霍奇金氏淋巴瘤(HL)和非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)(諸如退行性大細胞淋巴瘤(ALCL)細胞)之結合
CD3xCD30雙特異性抗體與兩種表現CD30之人類腫瘤細胞株SU-DHL-1 (ALCL；ATCC，目錄號ACC 356)和HDLM-2 (HL；ATCC，目錄號CRL-2965)之結合係以流式細胞測量術分析。
將細胞(3x10
4個細胞/孔)在聚苯乙烯96孔圓底盤(Greiner bio-one，目錄號650180)中與連續稀釋的抗體(以3倍稀釋步驟至0.0046至10 μg/mL之範圍)在50 μL之染色緩衝液中於4℃下培育30 min。在染色緩衝液中清洗兩次後，將細胞與50 μL之二級抗體於4℃下培育30 min。使用在染色緩衝液中以1：400稀釋之經R-PE共軛之山羊抗人類IgG (Jackson ImmunoResearch, UK；目錄號109-116-098)作為二級抗體。接下來，將細胞在染色緩衝液中清洗兩次，再懸浮於以TO-PRO-3碘化物(Thermo Fisher Scientific；目錄號T3605；1：8000稀釋)補充之100 μL之染色緩衝液中且在FACSCelesta流式細胞儀(BD Biosciences, USA)上分析。活細胞係基於FSC/SSC及在TOPRO-3染色不存在下進行閘控。結合曲線係以對數轉換數據之非線性迴歸(具有可變斜率的S形劑量反應，四參數)，使用GraphPad Prism V7.02軟體(GraphPad Software，美國加州聖地亞哥)分析。
結果
圖1顯示CD3xCD30雙特異性抗體bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR (A)、bsG1-huCD3-FEALxCD30-hAC10-FEAR (B)、bsG1-huCD3-FEALxCD30-HRS-3-FEAR (C)、BsG1-huCD3-FEALxCD30-HeFi-I-FEAR (D)、bsG1-huCD3-FEALxCD30-T405-FEAR (E)、bsG1-huCD3-FEALxCD30-T105-FEAR (F)、BisIgG1-huCD3-FEALxCD30-T408-FEAR (G)和bsG1-huCD3-FEALxCD30-T215-FEAR (H)與SU-DHL-1 (左圖)和 HDLM-2 (右圖)腫瘤細胞之劑量反應結合曲線。
在1.11 µg/mL之濃度下，當與單特異性、雙價CD30親本抗體IgG1-CD30-MDX060-FEAR、IgG1-CD30-hAC10-FEAR、IgG1-CD30-HRS-3-FEAR和IgG1-CD30-T105-FEAR之結合相比時，bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-hAC10-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-HRS-3-FEAR和bsG1-huCD3-FEALxCD30-T105-FEAR展示類似的結合(圖1I)。
相比之下，在1.11 µg/mL之濃度下，bsG1-huCD3-FEALxCD30-T405-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-T408-FEAR和bsG1-huCD3-FEALxCD30-T215-FEAR與SU-DHL-1及HDLM-2細胞之結合比單特異性、雙價CD30親本抗體IgG1-CD30-T405-FEAR、IgG1-CD30-T408-FEAR和IgG1-CD30-T215-FEAR與SU-DHL-1及HDLM-2細胞之結合低(圖1I)。
總體上，bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-hAC10-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-HRS-3-FEAR、BsG1-huCD3-FEALxCD30-HeFi-I-FEAR和bsG1-huCD3-FEALxCD30-T105-FEAR在1.11 µg/mL之濃度下之結合比bsG1-huCD3-FEALxCD30-T405-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-T408-FEAR和bsG1-huCD3-FEALxCD30-T215-FEAR在相同濃度下之結合高(圖1I)。
包括在該等實驗中的陰性對照抗體BsG1-huCD3-FEALxb12-FEAR未顯示結合至SU-DHL-1及HDLM-2細胞，表明SU-DHL-1及HDLM-2細胞皆不表現CD3。
最後，與雙價型式相比，CD30抗體選殖株T405、T408和T215顯示降低以單價型式之結合，而選殖株MDX060、hAC10、HRS-3和T105顯示以單價及雙價型式有效結合至表現CD30之腫瘤細胞。
圖2顯示bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR與(A) HDLM-2 (HL)、(B) L-428 (HL)、(C) DEL (ALCL)和(D) KI-JK (ALCL)細胞之劑量反應結合曲線。當與單特異性、雙價CD30親本抗體IgG1-CD30-MDX060-FERR相比，BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR展示類似的最大結合。陰性對照抗體bsG1-huCD3-FEALxb12-FEAR、IgG1-huCD3-FEAL和IgG1-b12-FEAL未顯示結合至該等細胞株中任一者，表明該等細胞不在細胞表面上表現CD3。該等數據證實bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEER與HL和ALCL細胞株之有效結合。
表6顯示bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR與HDLM-2、L-428、DEL和KI-JK細胞結合之EC
50值，如在兩個獨立的實驗中所評估。EC
50值的範圍係介於0.05與0.30 µg/mL之間。
圖8、9和10顯示bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR與表現CD30之HL細胞株(圖8)、ALCL細胞株(圖9)和NHL細胞株(圖10)之劑量反應結合曲線。在所有的細胞株中，與單價對照抗體BsG1-b12-FEALxCD30-MDX060-FERR 相比，BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR展示類似的最大結合。單特異性、雙價CD30親本抗體IgG1-CD30-MDX060-FERR顯示與所有細胞株的劑量依賴性結合，但是與BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR相比，顯示較低的最大結合。陰性對照抗體bsG1-huCD3-FEALxb12-FEAR、IgG1-huCD3-FEAL和IgG1-b12-FEAL未顯示結合至該等細胞株中任一者，表明該等細胞不在細胞表面上表現CD3。該等數據證實bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR與HL細胞株、T-NHL (諸如ALCL和CTCL)細胞株和B-NHL (諸如MCL)細胞株之有效結合。
表7顯示bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR與HL、T-NHL和B-NHL細胞株結合之EC
50值，如在2或3個獨立的實驗中所評估。EC
50值的範圍係介於0.12與0.35 µg/mL之間。
實施例4 - 由CD3xCD30雙特異性抗體於試管內誘導經T細胞媒介之細胞毒性及T細胞增殖
CD3xCD30雙特異性抗體係於試管內細胞毒性檢定法中使用CD30陽性腫瘤細胞株作為靶細胞及T細胞作為效應子細胞進行測試。使用CD3陽性ADCC效應子細胞IV型(Clean Cells，法國蒙泰居)或經純化之T細胞(如實施例5中所述)作為T細胞來源以評估CD3依賴性腫瘤細胞毒殺。
將SU-DHL-1 (ALCL)、HuT78 (ALCL)、HDLM-2 (HL)、NCEB-1 (MCL)或L540 (HL)細胞以10,000個細胞/孔之密度接種至聚苯乙烯96孔圓底盤(Greiner bio-one，目錄號650180)中。將效應子細胞在37℃下以0.5 µM CFSE (羧基螢光素琥珀醯亞胺酯；Cell Signalling Technology，麻薩諸塞州丹弗斯(Danvers)；目錄號C34554)經20 min標記且以E：T比例=10：1 (ADCC效應子細胞)或7：1 (經純化之T細胞)添加至腫瘤細胞中。添加連續稀釋的雙特異性CD3xCD30、b12xCD30或CD3xb12抗體或單特異性、雙價CD30抗體(以3倍稀釋至10至0.041 µg/mL之最終濃度範圍)且將細胞在37℃下培育72小時。在一些實驗中，bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR之變異體係與含有對CD3親和性降低的H101G突變之CD3結合臂(WO2017/ 009442，Genmab)一起使用。在以100 μL之染色緩衝液清洗小兩次後，將細胞再懸浮於含有TO-PRO-3碘化物(Thermo Fisher Scientific；目錄號T3605；1：4000稀釋)之染色緩衝液中且在FACSCelesta流式細胞儀(BD Biosciences，USA)上分析。
以5 µM星形孢菌素(staurosporine)(Sigma-Aldrich, US，目錄號S6942)處理之腫瘤細胞樣品的生存力被設定在0%及未經處理之腫瘤細胞樣品的生存力被設定在100%。
「活細胞百分比」係如下計算：
活細胞% = ([樣品細胞數目-經星形孢菌素處理之靶細胞的細胞數目]/[未經處理之靶細胞的細胞數目-經星形孢菌素處理之靶細胞的細胞數目]) x 100
CFSE陽性細胞係以T細胞的絕對數目量度計數以評定T細胞增殖。
劑量反應曲線係以非線性迴歸(具有可變斜率的S形劑量反應)，使用GraphPad Prism V8軟體(GraphPad Software，美國加州聖地亞哥)分析。
結果
CD3xCD30雙特異性抗體係於試管內細胞毒性檢定法中使用CD30陽性腫瘤細胞株SU-DHL-1細胞或HDLM-2細胞作為靶細胞及ADCC效應子細胞IV型細胞(Clean Cells，法國蒙泰居)作為效應子細胞進行測試。
圖3顯示bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR (A)、bsG1-huCD3-FEALxCD30-hAC10-FEAR (B)、bsG1-huCD3-FEALxCD30-HRS-3-FEAR (C)、BsG1-huCD3-FEALxCD30-HeFi-I-FEAR (D)、bsG1-huCD3-FEALxCD30-T405-FEAR (E)、bsG1-huCD3-FEALxCD30-T105-FEAR (F)、bsG1-huCD3-FEALxCD30-T408-FEAR (G)和bsG1-huCD3-FEALxCD30-T215-FEAR (H)對SU-DHL-1 (左圖)或HDLM-2 (右圖)細胞誘導經劑量依賴性T細胞媒介之細胞毒性(如以降低的活細胞%顯示)。
單特異性、雙價CD30抗體IgG1-MDX060-FEAR (A)、IgG1-CD30-hAC10-FEAR (B)、IgG1-CD30-HRS-3-FEAR (C)、IgG1-CD30-HeFi-I-FEAR (D)、IgG1-CD30-T405-FEAR (E)、IgG1-CD30-T105-FEAR (F)、IgG1-CD30-T408-FEAR (G)和IgG1-CD30-T215-FEAR (H)未誘導經T細胞媒介之細胞毒性。對照抗體bsG1-huCD3-FEALxb12-FEAR對SU-DHL-1或HDLM-2細胞亦未誘導經T細胞媒介之細胞毒性。
另外，CD3xCD30雙特異性抗體係於試管內細胞毒性檢定法中使用不同的MCL、ALCL和HL細胞株作為靶細胞及經純化之T細胞或ADCC效應子細胞IV型細胞作為效應子細胞進行測試。與具有親和性降低的CD3結合臂的此抗體之變異體(bsG1-huCD3-H101G-FEALxCD30-MDX060-FEAR)相比，圖4A至B顯示由bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR對SU-DHL-1、HuT78或NCEB-1細胞誘導之經T細胞媒介之細胞毒性更有效力。HDLM-2細胞之類似的最大經T細胞媒介之細胞毒性係由bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR和bsG1-huCD3-H101G-FEALxCD30-MDX060-FEAR誘導(圖4B)。與包括作為對照物的雙價、單特異性抗體IgG1-huCD3-FEAL或IgG1-b12-FEAR培育未對該等細胞株誘導細胞毒性。L540細胞之有效及類似的經T細胞媒介之細胞毒性係由bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR和bsG1-huCD3-H101G-FEALxCD30-MDX060-FEAR在最低的測試濃度下(0.014 µg/mL；圖4C)誘導。對照抗體bsG1-b12-FEALxCD30-MDX060-FEAR或IgG1-MDX060-FEAR對L540細胞未誘導經T細胞媒介之細胞毒性。
最後，bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR對各種表現CD30之MCL、ALCL和HL腫瘤細胞株誘導有效力的毒殺。與具有在位置101上含有G之親和性較低的CD3臂之變異體相比，在CD3臂之VH CDR3的位置101上含有H的BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR更有效力的毒殺表現CD30之MCL和ALCL腫瘤細胞。
在使用HDLM-2細胞(左圖)或NCEB-1細胞(右圖)作為靶細胞之細胞毒性檢定法中，CFSE陽性細胞的數目係以絕對T細胞計數量度評估。圖4D顯示由bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR或bsG1-huCD3-H101G-FEALxCD30-MDX060-FEAR(參見圖4B)對HDLM-2和NCEB-1細胞誘導之經T細胞媒介之細胞毒性係與劑量依賴性增加的T細胞計數相關聯。類似的T細胞數目通常係在此檢定法中與bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR或bsG1-huCD3-H101G-FEALxCD30-MDX060-FEAR培育後計數。在與濃度高於1 µg/mL之bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR培育之NCEB-1細胞的共培養物中注意到T細胞數目減少。對照抗體IgG1-b12-FEAL不影響該等實驗中的T細胞計數。
最後，BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR係在各種表現CD30之ALCL、HL和MCL 腫瘤細胞株的存在下誘導T細胞增殖。
實施例5 - CD3xCD30雙特異性抗體與表現在Expi293F細胞中的人類、食蟹猴或恆河猴CD30之結合
雙特異性CD3xCD30抗體及單特異性、雙價CD30抗體與經人類CD30或食蟹猴CD30瞬時轉染之Expi293細胞的漿膜之結合係以流式細胞測量術分析。
在HEK-293F或HEK-293細胞中的人類、食蟹猴或恆河猴CD30之瞬時表現
產生下列用於各種全長CD30變異體表現的經密碼子最適化之構築體：人類(智人) CD30 (huCD30；Uniprot登錄號P28908)、食蟹猴(長尾獼猴(Macaca fascicularis)) CD30 (mfCD30；Uniprot登錄號A0A2K5VW07)(SEQ ID NO：40)和恆河猴(恆河獼猴(Macaca mulatta)) CD30 (mmCD30；Uniprot登錄號A0A1D5RK03) (SEQ ID NO：41)。構築體含有適合於選殖之限制位點及最適化的科扎克(Kozak)(GCCGCCACC)序列(Kozak, M.之Gene 1999; 234(2):187-208)。將全長人類CD30、食蟹猴和恆河猴CD30密碼子最適化之構築體選殖在哺乳動物表現載體 pcDNA3.3 (Invitrogen)中且使用Expi293F表現平臺(Thermo Fisher Scientific，美國麻薩諸塞州沃爾瑟姆(Waltham)，目錄號A14527)基本上根據製造商的說明表現。在另一組實驗中，全長人類CD30或食蟹猴CD30構築體係表現在HEK-293細胞中。
CD3xCD30雙特異性抗體與表現在Expi293細胞中的人類、食蟹猴或恆河猴CD30之結合
將細胞(3x10
4個細胞/孔)在聚苯乙烯96孔圓底盤(Greiner bio-one，目錄號650180)中與連續稀釋的抗體(以3倍稀釋步驟至0.005至10 μg/mL之範圍)在100 μL之染色緩衝液中於4℃下培育30 min。實驗係以一式兩份的技術執行。在以染色緩衝液清洗兩次後，將細胞在50 µL之二級抗體中於4℃下培育30 min。使用在染色緩衝液中以1：400稀釋之經R-PE共軛之山羊抗人類IgG (Jackson ImmunoResearch, UK；目錄號109-116-098)作為二級抗體。將細胞以染色緩衝液清洗兩次，再懸浮於含有0.4%之EDTA的30 μL之染色緩衝液中且在iQue Screener (Intellicyt Corporation, USA)上分析。結合曲線係使用非線性迴歸(具有可變斜率的S形劑量反應)，使用GraphPad Prism V9.0.0軟體(GraphPad Software，美國加州聖地亞哥)分析。
CD3xCD30雙特異性抗體與表現在HEK293細胞中的人類、食蟹猴或恆河猴CD30之結合
將細胞(3x10
4個細胞/孔)在聚苯乙烯96孔圓底盤(Thermo Scientific，目錄號163320)中與連續稀釋的抗體(以4倍稀釋步驟至0.0002至50 μg/mL之範圍)在50 μL之染色緩衝液中於4℃下培育30 min。實驗係以一式兩份的技術執行。在以染色緩衝液清洗兩次後，將細胞在50 µL之二級抗體中於4℃下培育30 min。使用在染色緩衝液中以1：200稀釋之經R-PE共軛之山羊抗人類IgG (Jackson ImmunoResearch, UK；目錄號109-116-098)作為二級抗體。將細胞以染色緩衝液清洗兩次，再懸浮於含有0.4%之EDTA及以1：10,000稀釋之ToPro-3生存力標誌物(Invitrogen，目錄號T3605)的30 μL之染色緩衝液中。將細胞在iQue Screener (Intellicyt Corporation, USA)上分析。結合曲線係使用非線性迴歸(具有可變斜率的S形劑量反應)，使用GraphPad Prism V9.0.0軟體(GraphPad Software，美國加州聖地亞哥)分析。
CD3xCD30雙特異性抗體與人類T細胞或食蟹猴PBMC之結合
將食蟹猴PBMC (Tebu-Bio，荷蘭；目錄號PBMCMFA-10)或經純化之人類T細胞平舖在聚苯乙烯96孔圓底盤中。T細胞係源自人類供體膚色血球層(Sanquin，荷蘭阿姆斯特丹)且使用RosetteSep人類T細胞富集混合液(Stemcell Technologies，法國，目錄號15061)根據製造商的用法說明單離。將細胞(3x10
4細胞/well)與連續稀釋(以3倍稀釋步驟至0.0001至10 μg/mL之範圍)的抗體IgG1-CD30-MDX060-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR和bsG1-huCD3-FEALxb12-FEAR在50 μL之染色緩衝液中於4℃下培育30 min。在以染色緩衝液清洗兩次後，將細胞在50 μL之經R-PE共軛之二級山羊抗人類IgG抗體中於4℃下培育30 min (1：400稀釋)。在以染色緩衝液清洗兩次後，將T細胞針對T細胞標誌物CD3 (1：100；Miltenyi biotec，選殖株10D12，與APC共軛)、CD4 (1：50；eBioscience，選殖株OKT4，與APC-Cy7共軛)、CD8 (1：100；Biolegend，選殖株RPA-T8，與AF700共軛)及T細胞活化標誌物CD69 (1：50；BD Biosciences，選殖株AB2439，與FITC共軛)、CD25 (1：50；eBioscience，選殖株BC96，與PE-Cy7共軛)和CD279/PD1 (1：50；BD Biosciences，選殖株AEH12.2H7，與BV605共軛)進行染色。將具有Ultracomp磁珠的單一染色樣品(5 µL；Invitrogen，目錄號01-2222-42)用於流式細胞測量儀之補償調整。在4℃下培育30 min後，將細胞以染色緩衝液清洗兩次，再懸浮於100 µL之染色緩衝液中且使用FACS Fortessa (BD Biosciences)分析。數據係使用FlowJo (BD Biosciences)處理。
結果
靶向CD30之雙特異性抗體bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR、bsG1-huCD3-H101G-FEALxCD30-MDX060-FEAR和bsG1-b12-FEALxCD30-MDX060-FEAR顯示未結合至野生型Expi293F細胞(圖5A)，但是展示劑量依賴性結合至經huCD30 (圖5B)或mfCD30 (圖5C)轉染之Expi293F細胞。該等雙特異性抗體之結合可與單特異性、雙價CD30抗體IgG1-CD30-MDX060-FEAR之結合相比。如預期，陰性對照抗體bsG1-huCD3-FEALxb12-FEAR顯示未結合至野生型或經huCD30-或mfCD30-轉染之Expi293F細胞。同樣地，bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR顯示劑量依賴性結合至經huCD30 (圖11A)或mfCD30 (圖11B)轉染之HEK293細胞，陰性對照抗體bsG1-huCD3-FEALxb12-FERR顯示未結合至經huCD30-或mfCD30-轉染之HEK293細胞。這表明靶向CD30之抗體MDX060係以雙價以及單價型式有效地結合至表現在HEK細胞中的人類和食蟹猴CD30兩者。
圖5D顯示CD3xCD30雙特異性抗體bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR及對照雙特異性抗體bsG1-huCD3-FEALxb12-FEAR有效地結合至初級人類和食蟹猴T細胞。這顯示該等靶向CD3之雙特異性抗體有效地結合至內源性地表現在T細胞上的人類和食蟹猴CD3兩者。IgG1-CD30-MDX060雙價、親本抗體未結合至人類或食蟹猴T細胞，表明CD30不表現在該等細胞上。
一組CD3xCD30雙特異性抗體及單特異性親本CD30抗體與經huCD30或mmCD30轉染之Expi293F細胞之結合係以流式細胞測量術評估。CD3xCD30雙特異性抗體bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR (圖6A)、bsG1-huCD3-FEALxCD30-hAC10-FEAR (圖6B)、bsG1-huCD3-FEALxCD30-HRS-3-FEAR (圖6C)、bsG1-huCD3-FEALxCD30-T405-FEAR (圖6E)、bsG1-huCD3-FEALxCD30-T105-FEAR (圖6F)、bsG1-huCD3-FEALxCD30-T408-FEAR (圖6G)和bsG1-huCD3-FEALxCD30-T215-FEAR (圖6H)顯示相等地結合至表現huCD30或mmCD30之細胞。同樣地，親本、單特異性CD30抗體選殖株顯示相等地結合至表現huCD30或mmCD30之細胞。相比之下，bsG1-huCD3-FEALxCD30-HeFi-I-FEAR和親本、單特異性CD30抗體IgG1-CD30-HeFi-I_FEAR顯示結合至huCD30，但不結合至mmCD30 (圖6D)。
實施例6 -以DSF分析評定單特異性和雙特異性非活化抗體變異體的構形穩定性
在恆定重鏈區域中藏匿非活化突變之雙價單特異性CD30、CD3和雙特異性CD3xCD30 IgG1抗體變異體的蛋白質穩定特性係使用微差掃瞄螢光測定法(DSF)評定。
將IgG1-CD30-MDX060-FEAR、IgG1-CD30-MDX060-FERR、IgG1-huCD3-FEAL和BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR樣品在PBS pH 7.4中調配成約1 mg/mL之濃度。
為了評定構形穩定性，DSF係在能夠檢測由外部染料Sypro-Orange（在DMSO中的5000x濃縮，目錄# S5692，Sigma-Aldrich)與IgG展開後暴露的疏水區之結合所引起的螢光強度變化之iQ5多色即時PCR檢測系統(Bio-Rad)中執行。將Sypro-Orange在PBS pH 7.4 (Hyclone GE Healthcare)中稀釋320倍。熱熔化曲線可在控制分析之IgG的逐步熱變性期間自測量增加的螢光導出。因此，在iQ 96孔PCR盤中，將5 µL之抗體溶液(在PBS 中的1 mg/mL)的一式兩份樣品添加至PBS pH 7.4中的20 µL之稀釋的Sypro-Orange中。記錄在25℃至95℃之遞增的溫度範圍下的螢光，每次增量0.5℃之逐步增量及15秒的持續時間加上記錄所有孔之螢光所需的時間。數據係使用Bio-Rad CFX Manager軟體3.0分析及熔點係由軟體以螢光相對於溫度之圖確定。
結果
圖7及表8顯示IgG1-CD30-MDX060-FERR之熔化溫度(T
m)為69.0℃，其比IgG1-CD30-MDX060-FEAR在pH 7.4下的T
m(64.5℃)更高。這表明IgG1-CD30-MDX060-FERR具有比IgG1-CD30-MDX060-FEAR更高的構形穩定性，示意含有FER主鏈之IgG1-CD30-MDX060具有比含有FEA主鏈之IgG1-CD30-MDX060更高的構形穩定性。BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR之熔化溫度經測定為64.5℃，其係介於兩種親本抗體IgG1-huCD3-FEAL (62.5℃)與IgG1-CD30-MDX060-FERR (69.0℃)所測定的T
m之間。
實施例7 - bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR與T細胞和腫瘤細胞同時結合
研究bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR與腫瘤細胞和初始T細胞同時結合。
將自健康的供體單離之冷凍T細胞解凍且在37℃下以0.25 mM Celltrace Violet(Pacific Blue；Invitrogen，目錄號C34557A)經15 min標記。將L-428腫瘤細胞在37℃下以Celltrace FarRed (APC；Invitrogen，目錄號C34564A)經15 min標記且以1：1之E：T比例添加至T細胞中。添加連續稀釋的bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR或對照抗體bsG1-huCD3-FEALxb12-FEAR、bsG1b12FEALxCD30MDX060-FERR或IgG1-b12-FEAL (以3倍稀釋至6×10
-5至10 µg/mL之最終濃度範圍)，且將細胞在4℃下培育2小時。在培育後，添加生存力標誌物7-AAD (BD Bioscience，目錄號559925)(100x最終稀釋)且將細胞在FACS Celesta 流式細胞儀(BD Biosciences)上分析。
結果
圖12顯示bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR誘導CD3
+CD30
+雙陽性事件的形成(在流式細胞測量術染色中表現CellTrace Far Red及Celltrace Violet兩者之細胞)，如腫瘤細胞與T細胞經bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR媒介之交聯的量度(同時結合)。雙陽性事件的增加具有抗體濃度依賴性且顯示出鐘形曲線。在與對照抗體bsG1-huCD3-FEALxb12-FEAR、bsG1b12FEALxCD30MDX060-FERR或IgG1-b12-FEAL培育之樣品中或在不與抗體培育之樣品中(A)未觀察到增加的腫瘤細胞與T細胞交聯。圖12 B顯示bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR與腫瘤細胞及初始T細胞同時結合，如以表現CellTrace Far Red及Celltrace Violet(B)兩者之細胞百分比所檢測。
該等數據表明bsG1huCD3FEALxCD30-MDX060-FERR可同時結合且交聯CD30
+腫瘤細胞和CD3
+T細胞。
實施例8 - 由CD3xCD30雙特異性抗體於試管內誘導經T細胞媒介之細胞毒性及T細胞活化
評估由一組CD3xCD30雙特異性抗體對Karpas-299腫瘤細胞的經T細胞媒介之細胞毒性及相關聯的T細胞活化。評估下列抗體：bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-hAC10-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-HRS-3-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-HeFi-I-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-T105-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-T405-FEAR、bsG1-huCD3-FEALx CD30-T408-FEAR和bsG1-huCD3-FEALx CD30-T215-FEAR。
T細胞係自健康的人類供體膚色血球層(Sanquin，荷蘭阿姆斯特丹)獲得且使用RosetteSep™人類T細胞富集混合液(Stemcell Technologies，法國，目錄號15061)根據製造商的用法說明單離。將T細胞在37℃下以Celltrace Violet (Invitrogen，目錄號C34557A；最終濃度5 μM)經15 min標記。同時，將Karpas-299腫瘤細胞在37℃下以Celltrace FarRed (Invitrogen，目錄號C34564A；最終濃度2 μM)經15 min標記。在標記後，添加5×體積的冰冷DBSI且在RT下培育5分鐘。將細胞沉澱，再懸浮於培養基中且將腫瘤細胞以50,000個細胞/孔之密度接種在96孔盤(Greiner-bio-one，荷蘭，目錄號655180)中。添加連續稀釋的雙特異性CD3xCD30抗體(以3倍稀釋至1,000至0.051 ng/mL之最終濃度範圍)且將盤在RT下培育15 min。將T細胞以4：1之效應子對標靶(E：T)比例添加至腫瘤細胞中且將盤在37℃下培育72小時。在以PBS/0.1%之BSA/0.02%之疊氮化物(染色緩衝液)清洗2次後，將細胞針對T細胞標誌物CD4 (1：50；Biolegend，目錄號300521，與Pacific Blue共軛)、CD8 (1：100；BD Biosciences，與FITC共軛)及T細胞活化標誌物CD69 (1：50；Biolegend，目錄號310934，與BV650共軛)、CD25 (1：100；Invitrogen，目錄號25-0259-42，與PE-Cy7共軛)和CD279/PD-1 (1：50；Biolegend，目錄號329930，與BV605共軛)進行染色。將具有Ultracomp磁珠的單一染色樣品(5 µL；Invitrogen，目錄號01-2222-42)納入且用於流式細胞測量儀之補償調整。在4℃下培育30 min後，將盤以染色緩衝液清洗兩次且將細胞在4℃下以7-AAD (在染色緩衝液中以1：100稀釋)染色10 min。將細胞使用FACS Fortessa (BD Biosciences)分析。數據係使用FlowJo (BD Biosciences)處理。
劑量反應曲線係使用非線性迴歸分析(具有可變斜率的S形劑量反應)，使用GraphPad Prism V7.02軟體(GraphPad Software，美國加州聖地亞哥)產生。
結果
圖13A和B顯示所有的CD3xCD30抗體對Karpas-299細胞誘導經T細胞媒介之細胞毒性。與所有測試之其他選殖株相比，使用CD30選殖株MDX060產生之CD3xCD30雙特異性抗體(bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR和bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR)更有效毒殺Karpas-299細胞。事實上，與使用CD30選殖株HRS-3、HeFi-I、T105、T405、T408或T215產生之CD3xCD30雙特異性抗體(bsG1-huCD3-FEALxCD30-HRS-3-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-HeFi-I-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-T105-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-T405-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-T408-FEAR和bsG1-huCD3-FEALxCD30-T215-FEAR；圖13A)相比，基於MDX060之CD3xCD30雙特異性抗體顯示顯著較低的IC
50值。此外，與使用CD30選殖株hAC10、HeFi-I、T405、T408或T215產生之CD3xCD30雙特異性抗體(bsG1-huCD3-FEALxCD30-hAC10-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-HeFi-I-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-T405-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-T408-FEAR和bsG1-huCD3-FEALxCD30-T215-FEAR；圖13B)相比，bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR和bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR誘導更高的最大毒殺。圖13C和D顯示bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR和bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR比其他CD3xCD30雙特異性抗體中任一者更有效誘導CD25表現(較低的EC
50值)，如CD4
+T細胞(圖13C)或CD8
+T細胞(圖13D)中的T細胞活化量度。觀察到類似的PD-1 (圖13E和F)及CD69 (未顯示出數據)表現結果。在兩種含有FEAR或FERR突變的基於MDX060之CD3xCD30雙特異性抗體之間未觀察到有差別的經T細胞媒介之毒殺或T 細胞活化。
與測試之其他組的CD3xCD30雙特異性抗體相比，雙特異性抗體bsG1-huCD3xCD30-MX060對L-428細胞亦更有效誘導經T細胞媒介之細胞毒性(未顯示出數據)。
由該等實驗中所使用之一組CD3xCD30雙特異性抗體誘導之經T細胞媒介之細胞毒性的平均IC
50濃度和最大溶胞百分比及T細胞活化(CD25表現)之EC
50濃度總結於表9中。
最後，該等數據證明bsG1huCD3xCD30-MDX060比所評估之其他CD3xCD30雙特異性抗體中任一者更有效誘導經T細胞媒介之細胞毒性。
實施例9 - 由bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR於試管內誘導經T細胞媒介之細胞毒性、T細胞增殖及T細胞活化
由bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR對腫瘤細胞之經T細胞媒介之細胞毒性及相關聯的T細胞增殖和活化係在HL和ALCL細胞株中評估。
T細胞係自健康的人類供體膚色血球層(Sanquin，荷蘭阿姆斯特丹)獲得且使用RosetteSep™人類T細胞富集混合液(Stemcell Technologies，法國，目錄號15061)根據製造商的用法說明單離。將T細胞在37℃下以Celltrace Violet (Invitrogen，目錄號C34557A；最終濃度5 μM)經15 min標記。同時，將腫瘤細胞L-428、KI-JK、KM-H2或SUP-M2在37℃下以Celltrace FarRed (Invitrogen，目錄號C34564A；最終濃度2 μM)經15 min標記。在標記後，添加5×體積的冰冷DBSI且在RT下培育5分鐘。將細胞沉澱，再懸浮於培養基中且將腫瘤細胞以50,000個細胞/孔之密度接種在96孔盤(Greiner-bio-one，荷蘭，目錄號655180)中。添加連續稀釋的bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR或對照抗體IgG1-huCD3-FEAL、bsG1-huCD3-FEALxb12-FERR、IgG1-CD30-MDX060-FERR、bsG1-b12-FEALxCD30-MDX060-FERR、IgG1-b12-FEAL (以3倍稀釋至1,000至0.051 ng/mL之最終濃度範圍)且將盤在RT下培育15 min。將T細胞以4：1之效應子對標靶(E：T)比例添加至腫瘤細胞中且將盤在37℃下培育72小時。在以PBS/0.1%之BSA/0.02%之疊氮化物(染色緩衝液)清洗2次後，將細胞針對T細胞標誌物CD4 (1：50；Biolegend，目錄號300521，與Pacific Blue共軛)、CD8 (1：100；BD Biosciences，目錄號345772，與FITC共軛)及T細胞活化標誌物CD69 (1：50；Biolegend，目錄號310934，與BV650共軛)、CD25 (1：100；Invitrogen，目錄號25-0259-42，與PE-Cy7共軛)和CD279/PD-1 (1：50；Biolegend，目錄號329930，與BV605共軛)進行染色。將具有Ultracomp磁珠的單一染色樣品(5 µL；Invitrogen，目錄號01-2222-42)納入且用於流式細胞測量儀之補償調整。在4℃下培育30 min後，將盤以染色緩衝液清洗兩次且將細胞在4℃下以7-AAD (在染色緩衝液中以1：100稀釋)染色10 min。將細胞使用FACS Fortessa (BD Biosciences)分析且將數據使用FlowJo (BD Biosciences)處理。
活的靶細胞百分比係使用以下公式計算：
活的靶細胞% = (在各條件中經單一Celltrace FarRed標記之活細胞的絕對數目/在僅含有靶細胞及T細胞而未添加任何抗體的條件下經單一Celltrace FarRed標記之活細胞的絕對數目) x 100。
T細胞增殖係藉由閘控具有稀釋的Celltrace Violet染色之CD4
+或CD8
+T細胞來評估。擴增指數係使用來自FlowJo之增殖建模工具計算。生成峰經自動化擬合及擴增指數值係根據以下公式計算：
擴增指數 = 細胞總數目/在開始培養時的細胞數目 = (G0 + G1 + G2 + G3 + G4 + G5 + G6)/(G0 + G1:2 + G2:4 + G3:8 + G4:16 + G5:32 + G6:64)。
Gn = 第n個生成峰的細胞數目(具有n = 0至6)。
劑量反應曲線係使用非線性迴歸分析(具有可變斜率的S形劑量反應)，使用GraphPad Prism V7.02軟體(GraphPad Software，美國加州聖地亞哥)產生。
結果
圖14顯示bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR於試管內對L-428 (HL)、KM-H2 (HL)、SUP-M2 (ALCL)和KI-JK (ALCL)細胞株誘導經劑量依賴性T細胞媒介之細胞毒性。將由bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR對L-428和KI-JK細胞誘導之經T細胞媒介之細胞毒性的平均IC50濃度總結於表10中。在與對照抗體IgG1-huCD3-FEAL、bsG1-huCD3-FEALxb12-FERR、IgG1-CD30-MDX060-FERR、bsG1-b12-FEALxCD30-MDX060-FERR、IgG1-b12-FEAL培育之細胞中或在未與抗體培育之樣品中未觀察到細胞毒性。
圖15、16、17和18顯示由bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR對L-428和KI-JK細胞誘導之經T細胞媒介之細胞毒性係與CD4
+和CD8
+T細胞增殖(圖15)及T細胞活化標誌物CD69 (圖16)、CD25 (圖17)和PD-1 (圖18)的表現相關聯。在該等實驗中，由bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR誘導之T細胞增殖及活化之平均EC50濃度總結於表10中。
因此，bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR於試管內對HL和ALCL細胞株誘導經劑量依賴性T細胞媒介之細胞毒性，其係與T細胞增殖及活化相關聯。
實施例10 - 由bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR於試管內誘導細胞激素生產
由bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR誘導之細胞激素及顆粒酶B生產係在上清液中評估，該上清液係在使用L-428靶細胞及健康的供體T細胞的試管內經T細胞媒介之細胞毒性實驗期間收集，如實施例9中所述。將上清液儲存在-20℃下且解凍用於分析。14種不同的細胞激素(CD40、IFNγ、IL-10、IL-12、IL-13、IL-1b、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IP-10、MCP-1、PDL-1、TNFα)及顆粒酶B的濃度係使用由R&D systems客製的基於磁珠之多重免疫檢定法(luminex)測量。
結果
在bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR的存在下，主要觀察到來自L-428細胞與T細胞的共培養物之上清液中增加的顆粒酶B及細胞激素IFNγ、IL-13和TNFα (＞2000 pg/mL)濃度。當與對照抗體IgG1-b12-FEAL相比時，觀察到適度增加的CD40、IL-10、IL-12、IL-1β、IL-2、IL-4、IL6和IP-10細胞激素濃度。與對照抗體IgG1-b12-FEAL相比，IL-8、MCP-1和PDL1水平未受到調節(圖19)。
因此，由bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR經T細胞媒介之細胞毒性及T細胞活化係與劑量依賴性生產之細胞激素及顆粒酶B相關聯。
實施例11 - 使用經純化之T細胞作為效應子細胞，以不同的效應子對標靶比例由bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR於試管內誘導經T細胞媒介之細胞毒性
為了測定在雙特異性抗體bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR的存在下經T細胞媒介之腫瘤細胞毒殺之最適化的效應子對標靶比例，將試管內細胞毒性檢定法使用CD30陽性腫瘤細胞株L-428作為靶細胞及經純化之T細胞作為效應子細胞以不同的效應子對靶細胞(E：T)比例執行。
經T細胞媒介之細胞毒性基本上如實施例9中所述方式評估，除了將T細胞以1：1、2：1、4：1或8：1之不同的效應子對靶細胞(E：T)比例添加至腫瘤細胞中。
結果
圖20A顯示由bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR以所有的E：T比例誘導經劑量依賴性T細胞媒介之細胞毒性，以4：1及8：1之E：T比例觀察到最大的腫瘤細胞毒殺(少於20%之活腫瘤細胞)。與此一致，以所有的E：T細胞比例觀察到CD4
+和CD8
+T細胞增殖，以4：1及8：1之E：T比例最顯著(圖20B至C)。由對照抗體bsG1-huCD3-FEALxb12-FERR以所測試之E：T比例中任一者誘導非特異性經T細胞媒介之細胞毒性或T細胞增殖。
總之，該等數據表明於試管內經bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR對L-428腫瘤細胞誘導之經T細胞媒介之細胞毒性以4：1及8：1之E：T比例最有效。
實施例12 - 由bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR於試管內經T細胞媒介之細胞毒性及T細胞增殖的動力學
為了評估在bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR的存在下經T細胞媒介之腫瘤細胞毒性的動力學，將試管內細胞毒性檢定法使用CD30陽性腫瘤細胞株L-428作為靶細胞及經純化之T細胞作為效應子細胞以不同的培育期間執行。
經T細胞媒介之細胞毒性基本上如實施例9中所述方式評估，除了腫瘤細胞的細胞毒性及T細胞增殖係在24 h、48 h和72 h後評估。
結果
圖21顯示bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR在48 h和72 h後誘導劑量依賴性經T細胞媒介之細胞毒性，而在24 h後未觀察到顯著的經T細胞媒介之細胞毒性。由bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR在72 h後誘導劑量依賴性CD4
+和CD8
+T細胞增殖，而在24 h或48 h後未觀察到T細胞增殖(圖21B和C)。
總之，該等數據顯示bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR係以時間依賴方式誘導對腫瘤細胞的經T細胞媒介之細胞毒性及T細胞增殖。
實施例13 - CD30表現水平與試管內經bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR誘導之經T細胞媒介之細胞毒性的相關性
由bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR對八種表現CD30之腫瘤細胞株的經T細胞媒介之毒殺係如實施例9所述之試管內細胞毒性檢定法使用4：1之E：T比例測定。使用下列細胞株：L-428、KM-H2、DEL、KI-JK、KARPAS-299、SUP-M2、NCEB-1和JVM-2。該等腫瘤細胞株之CD30表現水平係以實施例2中詳述之定量性流式細胞測量術評估。
結果
圖22顯示bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR於試管內對所有細胞株誘導經T細胞媒介之細胞毒性，具有介於68%與98%之間的最大靶細胞毒殺。由bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR經T細胞媒介之最大的腫瘤細胞毒殺係與CD30表現水平有顯著的相關性(圖22A)。
在圖22B中，將bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR的存在下對各細胞株的經T細胞媒介之毒殺的EC
50相對於CD30表現水平繪圖，顯示出負但不顯著的趨勢。
因此，該等數據顯示在CD30表現水平與試管內經bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR誘導之經T細胞媒介之最大細胞毒性之間的正相關性。
實施例14 - 由BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR對活化之T細胞的自相殘殺
經BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR對活化之CD30
+T細胞誘導之T細胞自相殘殺係於試管內評估。
將96孔盤(Greiner-bio-one，荷蘭，目錄號655180)以1 µg/mL之抗人類CD3 (選殖株OKT3，Invitrogen，目錄號16-0037-85)於PBS中的100 µL之溶液塗覆。將盤在37℃下培育4小時。在移除抗體溶液後，將孔以100 µL之PBS清洗。T細胞係自健康的人類供體膚色血球層(Sanquin，荷蘭阿姆斯特丹)獲得且使用RosetteSep™人類T細胞富集混合液(Stemcell Technologies，法國，目錄號15061)根據製造商的用法說明單離。將純化之T細胞以2x10
6個細胞/mL之濃度再懸浮於T細胞培養基(以10%之熱滅活的含鐵之供體牛血清(DBSI；Gibco，目錄號20731-030)及青黴素/鏈黴素(pen/strep；Lonza，目錄號DE17-603E)補充之具有25 mM HEPES及L-麩醯胺酸之羅斯威爾帕克紀念研究所(Roswell Park Memorial Institute)[RPMI]-1640培養基(Lonza，目錄號BE12-115F))中，將100 µL之T細胞懸浮液(含有200,000個T細胞)添加至經抗CD3塗覆之盤的各孔中。此外，將以2 µg/mL之抗CD28 (選殖株CD28.2，Invitrogen，目錄號16-0289-85)及0.05 µg/mL之IL-15 (ThermoFisher，目錄號PHC9151)補充之100 µL之T細胞培養基添加至各孔中。接著將T細胞在37℃下培育96小時。
在96小時後，收集T細胞且將其以2x10
6個細胞/mL之濃度再懸浮於T細胞培養基中。執行流式細胞測量術分析以測量CD30及T細胞活化標誌物的表現。簡言之，將等分的細胞以PBS/0.1%之BSA/0.02%之疊氮化物(染色緩衝液)清洗，以50 µl之1000x稀釋之FVS510生存力染料(BD Biosciences，目錄號564406)染色且在室溫下培育15分鐘。接著將細胞以染色緩衝液清洗，且針對CD30 (1：50；Biolegend，目錄號333906，與PE共軛)、T細胞標誌物CD4 (1：50；Biolegend，目錄號300506，與FITC共軛)、CD8 (1：100；Biolegend，目錄號301028，與AF700共軛)及T細胞活化標誌物CD69 (1：50；Biolegend，目錄號310910，與APC共軛)、CD25 (1：100；Invitrogen，目錄號25-0259-42，與PE-Cy7共軛)和CD279/PD1 (1：50；Biolegend，目錄號329924，與BV605共軛)進行染色。將具有Ultracomp磁珠的單一染色樣品(5 µL；Invitrogen，目錄號01-2222-42)納入且用於流式細胞測量儀之補償調整。在4℃下培育30 min後，將盤以染色緩衝液清洗兩次。將細胞使用FACS Fortessa (BD Biosciences)分析且將數據使用FlowJo (BD Biosciences)處理。
為了評定BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR是否可誘導活化之T細胞的自相殘殺，將經刺激之T 細胞以200,000個細胞/孔之密度接種在96孔盤中。隨後將50 μL之BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR或對照抗體(亦即bsG1-b12-FEALxCD30-MDX060-FERR、bsG1-huCD3-FEALxb12-MDX060-FERR或IgG1-b12)添加至各孔中(在T細胞培養基中以3倍稀釋步驟至0.003至3.3 µg/mL之最終濃度範圍)。將盤在37℃下培育48小時。
在以染色緩衝液清洗2次後，將細胞以FVS510生存力染料染色且隨後針對T細胞標誌物CD4和CD8及T細胞活化標誌物CD69、CD25和CD279/PD1進行染色。流式細胞測量分析係使用FACS Celesta (BD Biosciences)執行且數據係使用FlowJo (BD Biosciences)處理。
劑量反應曲線係使用GraphPad Prism V7.02軟體(GraphPad Software，美國加州聖地亞哥)產生。
結果
圖23顯示細胞標誌物CD25 (T細胞活化)(A)和CD30 (B)係在培育72小時後分別表現在54至63%和21至27%之T細胞中。在培育96小時後進一步誘導CD25和CD30表現(CD25：80至83%和CD30：27至33%)。圖23C顯示BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR、bsG1-b12-FEALxCD30-MDX060-FERR、bsG1-huCD3-FEALxb12-MDX060-FERR或IgG1-b12之劑量增加與活化之T細胞的生存力降低無關聯。
因此，在與BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR培育後，在活化之T細胞亞群上的CD30表現不導致T細胞的自相殘殺。
實施例15 - 以BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR之抗腫瘤活性干擾sCD30
細胞表面CD30的脫落及可溶性CD30 (sCD30)的產生係在17種不同的血液學CD30
+腫瘤細胞株中評估。
在新鮮培養基中接種細胞後三天，自細胞培養物收集的25 µL之未稀釋的上清液中之sCD30濃度係以用於定量檢測人類CD30之ELISA檢定法使用「人類sCD30 ELISA套組」(Invitrogen，目錄號BMS240)依照製造商的用法說明測量。
結果
圖24A顯示在細胞培養物上清液中之sCD30濃度。如所示，在來自不同的細胞株之細胞培養物上清液中檢測出不同濃度的sCD30。圖24B顯示在細胞培養物上清液中之sCD30濃度與CD30膜表現水平有顯著的相關性，如先前於實施例2中所述之定量性流式細胞測量術所測量(人類IgG校正套組，Biocytex，目錄號CP010)。
為了評估sCD30是否可阻斷有效力的經BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR誘導之經T細胞媒介之細胞毒性，在上清液中顯示高水平的sCD30 (129 ng/mL)之DEL腫瘤細胞(ALCL)中評定由BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR經T細胞媒介之細胞毒性。經T細胞媒介之細胞毒性檢定法係如先前所述方式執行(實施例8)。圖24C顯示BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR對此細胞株誘導有效力的經T細胞媒介之細胞毒性，具有86%之最大腫瘤細胞毒殺，表明BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR在sCD30的存在下仍能夠於試管內誘導有效力的經T細胞媒介之細胞毒性。
因此，sCD30濃度因細胞類型而異且與細胞表面上的CD30表現水平有相關性。此外，BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR在sCD30的存在下仍能夠於試管內誘導有效力的經T細胞媒介之細胞毒性。
實施例16 - 使用源於患者之周邊血液單核T細胞作為效應子細胞的bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR之活體外細胞毒性
CD3xCD30雙特異性抗體係於活體外細胞毒性檢定法中使用CD30陽性腫瘤細胞株作為靶細胞及源於初級患者之T細胞作為效應子細胞進行測試。使用源於霍奇金氏淋巴瘤(HL)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)及急性骨髓性白血病(AML)患者之周邊血液單核細胞(PBMC，Discovery Life Sciences，表11)作為T細胞來源以評估CD3依賴性腫瘤細胞毒殺。
將L-428腫瘤細胞在37℃下以Celltrace FarRed (Invitrogen，目錄號C34564A；最終濃度2 μM)經15 min標記。在標記後，添加5×體積的冰冷DBSI且在RT下培育5分鐘。將細胞沉澱，再懸浮於培養基中且將腫瘤細胞以50,000個細胞/孔之密度接種至96孔盤(Greiner-bio-one，荷蘭，目錄號655180)中。添加連續稀釋的bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR及對照抗體IgG1-b12-FEAL (以3倍稀釋至1,000至0.051 ng/mL之最終濃度範圍)且將盤在RT下培育15 min。將PBMC解凍，計數且再懸浮於培養基(RPMI1640/10%之FBS/1%之青黴素-鏈黴素/1% 之麩胺酸)中，然後以8：1之效應子對標靶(E：T)比例添加至腫瘤細胞中且將盤在37℃下培育72小時。在以PBS/0.1%之BSA/0.02%之疊氮化物(染色緩衝液)清洗2次後，將細胞染色以區別使用CD3 (T細胞；Invitrogen，目錄號48-0037)、CD14 (單核細胞/巨噬細胞；Biolegend；目錄號301834)、CD19 (B細胞；Biolegend；目錄號302246)、CD16 (單核細胞/巨噬細胞；BD Biosciences；目錄號556618)、CD56 (NK細胞；BD Biosciences；目錄號564849)和CD66b (顆粒性細胞；Biolegend；目錄號305116)之不同的細胞群。將細胞另外針對T細胞標誌物CD4 (1：50；Biolegend，目錄號300521，與Pacific Blue共軛)、CD8 (1：100；BD Biosciences，目錄號345772，與FITC共軛)及T細胞活化標誌物CD69 (1：50；Biolegend，目錄號310934，與BV650共軛)、CD25 (1：100；Invitrogen，目錄號25-0259-42，與PE-Cy7共軛)和CD279/PD1 (1：50；Biolegend，目錄號329930，與BV605共軛)進行染色。將具有Ultracomp磁珠的單一染色樣品(5 µL；Invitrogen，目錄號01-2222-42)納入且用於流式細胞測量儀之補償調整。在4℃下培育30 min後，將盤以染色緩衝液清洗兩次且將細胞在4℃下以7-AAD (在染色緩衝液中以1：100稀釋)染色10 min。將細胞使用FACS Fortessa (BD Biosciences)分析且將數據使用FlowJo (BD Biosciences)處理。劑量反應曲線係使用非線性迴歸分析(具有可變斜率的S形劑量反應)，使用GraphPad Prism V7.02軟體(GraphPad Software，美國加州聖地亞哥)產生。
活的靶細胞百分比係使用以下公式計算：
活的靶細胞% = (在各條件中經單一Celltrace FarRed標記之活細胞的絕對數目/在僅含有靶細胞及T細胞而未添加任何抗體的條件下經單一Celltrace FarRed標記之活細胞的絕對數目) x 100。
結果
圖25A顯示bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR在72 h後誘導以源自健康的對照供體及不同的HL和NHL患者供體兩者之T細胞對L-428腫瘤細胞媒介之劑量依賴性細胞毒性。細胞毒性係與T細胞活化及增殖相關聯，如以調升之CD69、CD25和PD-1所例證(圖25 B至D)。對照抗體IgG1-b12-FEAL未觀察到經T細胞媒介之細胞毒性。供體E (AML)未觀察到對L-428腫瘤細胞的經T細胞媒介之細胞毒性，其可能歸因於PBMC樣品內的低頻率T細胞(表11)。
總之，該等數據例證來自HL和NHL患者的周邊血液T細胞能夠在bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR的存在下對腫瘤細胞株誘導經T細胞媒介之細胞毒性。
實施例17 - 評估BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR於SCID小鼠中的藥物動力學性質
將11至12週齡的無腫瘤雌性SCID小鼠(C.B-17/ IcrHan®Hsd-PrkdcSCID小鼠，Envigo)(每組3隻小鼠)以單一劑量的1 µg (0.05 mg/kg)、10 µg (0.5 mg/kg)或100 µg (5 mg/kg)之BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR經靜脈內(IV)注射。設定實驗以研究在經靶標媒介之清除不存在下的抗體清除率，因為BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR不與小鼠蛋白質交叉反應。
在投予抗體後10分鐘、4至6小時、24小時、2天、7天、14天和21天自經由臉頰靜脈穿刺或隱靜脈穿刺收集40μL之血液樣品。將血液收集至含有K2-EDTA的小瓶(Sarstedt，Microvette CB300，目錄號16.444.100)中且以10,000 g離心10分鐘。將血漿上清液轉移至經標記之Eppendorf小瓶中且儲存在-80℃下，直到測定血漿IgG濃度。
人類IgG濃度係以總人類IgG 酵素連結免疫吸附檢定法(ELISA)測定。將在4℃下經隔夜塗覆至96孔Microlon ELISA盤(Greiner，德國)的100 μL之PBS (BioTrading，目錄號K654F500PP)中的小鼠抗人類IgG-κ選殖株MH16 (CLB Sanquin，荷蘭；目錄號M1268)以2 µg/mL之濃度用作為捕獲抗體。在室溫(RT)下以PBSA (具有0.2%之牛血清白蛋白[BSA]的PBS)經1小時阻斷盤後，添加在PBSA中連續稀釋的樣品且在RT下在盤振盪器上培育1小時。將盤以300 μL之PBST (以0.05%之Tween 20補充之PBS)清洗三次且隨後在RT下與山羊抗人類IgG 免疫球蛋白(Jackson，賓州西格雷斯(West Grace)；目錄號109-035-098；在以0.2%之BSA補充之PBST中以1：10.000稀釋)培育1小時。將盤以300 μL之PBST清洗三次，然後與2,2’-次偶氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS；Roche，目錄號11112422001和11112597001)避光培育。將反應以添加100 μL之2%草酸(Sigma-Aldrich，目錄號33506)終止，在RT下培育10 min。吸光度係在ELx808吸光度微量盤判讀機(Biotek，佛蒙特州威努斯基(Winooski))上於405 nm下測量。
標準曲線係自PBSTA中進一步稀釋三倍的參考抗體人類IgG1λ (純蛋白質30C，目錄號BP078)產生。使用注射之材料產生第二標準曲線，且該材料係自1 mg/mL (3.6 μL之抗體)濃度於PBSTA中進一步稀釋3倍的 5 mg/kg之劑量製備。
結果
校正曲線係自參考標準物在Microsoft Excel中使用4參數邏輯擬合曲線內插未知物來計算。在血漿樣品中的人類IgG1濃度係自繪製的校正曲線方程式計算(圖26A)，且曲線下的面積(AUC)係使用GraphPad Prism軟體計算。直到血液取樣的最後一天(第21天)之IgG清除率係由公式D*1.000/AUC確定，其中D為注射劑量(1 mg/kg)(圖26B)。
BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR不與小鼠蛋白質交叉反應，且因此能預期藥物動力學性質可與其他未結合之野生型人類IgG1分子相比。所有劑量組之預期的人類IgG血漿濃度經計算為約100 µg/mL (~5 mg/kg)、10 µg/mL (~0.5 mg/kg)或1 µg/mL (~0.05 mg/kg)。來自以0.05 mg/kg處理之動物的樣品於所有的時間點皆不可測量。
BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR之血漿清除率可與常規的人類IgG1之預測的血漿清除率相比。平均最大的人類IgG血漿濃度(Cmax)可與常規的人類IgG1之預測的Cmax相比。
因此，BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR之藥物動力學輪廓可與沒有標靶結合存在下的未攜帶腫瘤之SCID小鼠中對常規的人類IgG1所預測之藥物動力學輪廓相比。
實施例18 - 評估C1q與BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR之結合
補體蛋白質C1q與經膜結合之BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR或產生BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR之親本抗體(亦即IgG1-huCD3-FEAL和IgG1-CD30-MDX060-FERR)之結合係使用表現CD3或CD30之細胞評定。
A. C1q與經BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR結合之表現CD3之細胞之結合
補體蛋白質C1q與經CD3結合之BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR和IgG1-huCD3-FEAL之結合係使用經刺激之人類CD8
+T細胞測試。包括IgG1-CD52-E430G作為陽性對照物，其具有基於CD52抗體CAMPATH-1H之VH及VL結構域及具有富集Fc之主鏈，已知在結合至細胞表面時有效地結合C1q。包括IgG1-b12-FERR和IgG1-b12作為未結合之陰性對照抗體。
人類CD8
+T細胞係自健康的自願者獲得的膚色血球層(Sanquin)使用RosetteSep
™人類CD8
+T細胞富集混合液(Stemcell Technologies，目錄號15023C.2)根據製造商的用法說明以負向選擇純化(富集)。將經純化之T細胞再懸浮於T細胞培養基(以10%之熱滅活的含鐵之供體牛血清(DBSI；Gibco，目錄號20731-030)及青黴素/鏈黴素(pen/strep；Lonza，目錄號DE17-603E)補充之具有25 mM HEPES及L-麩醯胺酸之羅斯威爾帕克紀念研究所[RPMI]-1640培養基(Lonza，目錄號BE12-115F))中。
將抗CD3/CD28磁珠(Dynabeads™人類T活化子CD3/ CD28；ThermoFisher Scientific，目錄號11132D)以PBS清洗且再懸浮於T細胞培養基中。將磁珠以1：1比例添加至富集之人類CD8
+T細胞中且在37℃，5%之CO
2下培育48 h。接下來，使用磁鐵移出磁珠，將細胞在PBS中清洗兩次且再計數。
BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR和IgG1-huCD3-FEAL與活化之CD8
+T細胞之結合係以流式細胞測量術使用BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR和IgG1-huCD3-FEAL (30 μg/mL)及經R-藻紅素(PE)-共軛之山羊抗人類IgG F(ab’)
2(在GMB FACS緩衝液中以1：200稀釋；Jackson ImmunoResearch，目錄號109-116-098)證實。
將活化之CD8
+T細胞接種在96孔圓底盤中(30,000個細胞/孔)、細胞沉澱且再懸浮於30 μL之檢定培養基(以0.1%之[w/v]牛血清白蛋白fraction V (BSA；Roche，目錄號10735086001)及青黴素/鏈黴素補充之具有25 mM HEPES和L-麩醯胺酸之RPMI-1640)中。隨後將50 μL之BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR、IgG1-huCD3-FEAL、IgG1-b12-FERR、IgG1-CD52-E430G或IgG1-b12 (在檢定緩衝液中以3倍稀釋步驟至1.7 × 10
-4至30 μg/mL之最終濃度)添加至每一孔中且在37℃下培育15 min以容許抗體結合至細胞。
將作為C1q來源之人類血清(20 μL/孔；Sanquin，批號20L15-02)添加至20%之最終濃度。將細胞在冰上培育45 min，隨後以冷的GMB FACS緩衝液清洗兩次，且在4℃下與50 μL之經螢光異硫氰酸鹽(FITC)共軛之兔子抗人類C1q (20 μg/mL之最終濃度(DAKO，目錄號F0254)；在GMB FACS緩衝液中以1：75稀釋)在經別藻藍蛋白共軛之小鼠抗CD8 (BD Biosciences，目錄號555369；在GMB FACS緩衝液中以1：50稀釋)的存在或不存在下於暗處培育30 min。將細胞以冷GMB FACS緩衝液清洗兩次，再懸浮於以2 mM乙二胺四乙酸(EDTA；Sigma-Aldrich，目錄號03690)及4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)生存力染料(1：5,000；BD Pharmingen，目錄號564907)補充之20 μL之GMB FACS緩衝液中。C1q與活細胞之結合(如以DAPI排出所鑑定)係以流式細胞測量術在iQue3 Screener (Intellicyt Corporation)上分析。數據係使用iQue軟體(Intellicyt Corporation ForeCyt Enterprise Client Edition 6.2 [R3]，6.2.652版)分析。結合曲線係使用非線性迴歸分析法(具有可變斜率的S形劑量反應)，使用GraphPad Prism軟體分析。
結果
圖27A顯示雖然觀察到與經膜結合之IgG1-CD52-E430G的劑量依賴性C1q結合，但是未觀察到與經膜結合之BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR或IgG1-huCD3-FEAL，或與未結合之對照抗體之C1q結合。
B. C1q與經BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR結合至表現CD30之細胞之結合
補體蛋白質C1q與經CD30結合之BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR和IgG1-huCD30-MDX060-FERR之結合係使用NCEB-1套膜細胞淋巴瘤細胞測試。包括IgG1-7D8-E430G (抗CD20)作為陽性對照物，其不含有惰性突變且保留結合至C1q的能力。包括IgG1-b12-FERR作為未結合之陰性對照抗體。
將NCEB-1細胞以2×10
6個細胞/mL之濃度懸浮於含有0.1%之牛血清白蛋白(BSA，fraction V，Roche，目錄號10735086001)及1%之青黴素/鏈黴素(Gibco，目錄號15140-122)之檢定培養基(RPMI-1640 (Lonza，瑞士，目錄號BE12-115F))中。將腫瘤細胞(100,000個細胞於50 μL中)添加至96孔圓底盤(Greiner Bio，目錄號650180)中。接下來，將30 μL之BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR、IgG1-CD30-MDX060-FERR或對照抗體(在檢定培養基中以3倍稀釋步驟稀釋至5.6×10
-5至10 μg/mL之最終濃度)添加至每一孔中且在37℃下培育15 min以容許抗體結合至細胞。
將一半的細胞(40 μL之細胞懸浮液，含有抗體)平舖在不同的盤中以檢查抗體結合。BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR和IgG1-CD30-MDX060-FERR與NCEB-1細胞之結合係以流式細胞測量術使用經R-藻紅素(PE)-共軛之山羊抗人類IgG F(ab’)
2(在FACS緩衝液中以1：500稀釋；Jackson ImmunoResearch，目錄號109-116-098)證實。
將人類血清(10 μL/孔；Sanquin，批號21K04-01)添加至剩餘的40 μL之細胞懸浮液中(20%之最終濃度)且在冰上培育45 min，隨後以FACS緩衝液清洗，且在4℃下與25 μL之經FITC共軛之兔子抗C1q抗體(20 μg/mL之最終濃度(DAKO，目錄號F0254)；在FACS緩衝液中稀釋)於暗處培育30 min。將細胞以冷FACS緩衝液清洗，再懸浮於以TO-PRO™-3生存力染料(1：5000；ThermoFisher，目錄號T3605)補充之30 μL之FACS緩衝液中且在iQue3 Screener (Intellicyt Corporation)上測量。數據係使用iQue軟體(Intellicyt Corporation，ForeCyt
Enterprise Client Edition 6.2 [R3]，6.2.652版)分析。結合曲線係使用非線性迴歸分析法(具有可變斜率的S形劑量反應)，使用GraphPad Prism軟體分析。
結果
圖27B顯示雖然觀察到與經膜結合之IgG1-CD20-E430G的劑量依賴性C1q結合，但是未觀察到與經膜結合之BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR或IgG1-CD30-MDX060-FERR，或與未結合之對照抗體之C1q結合。
因此，該等結果證明bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR不結合C1q，證實功能上的惰性主鏈。
[圖1]：雙特異性CD3xCD30抗體及彼等單特異性、雙價CD3及CD30配對物與SU-DHL-1或HDML-2細胞之結合。(A) bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR、bsG1-huCD3- FEALxb12-FEAR、bsG1-b12-FEALxCD30-MDX060-FEAR和IgG1-CD30-MDX060-FEAR，(B) bsG1-huCD3-FEALxCD30- hAC10-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxb12-FEAR和IgG1-CD30-hAC10-FEAR，(C) bsG1-huCD3-FEALxCD30-HRS-3-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxb12-FEAR和IgG1-CD30-HRS-3-FEAR，(D) BsIgG1-huCD3-FEALxCD30-HeFi-I-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxb12-FEAR和IgG1-CD30-HeFi-I-FEAR，(E) bsIgG1-huCD3-FEALxCD30-T405-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxb12-FEAR和IgG1-CD30-T405-FEAR，(F) bsIgG1-huCD3 -FEALxCD30-T105-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxb12-FEAR和IgG1-CD30-T105-FEAR，(G) bsIgG1-huCD3-FEALxCD30- T408-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxb12-FEAR和IgG1-CD30-T408-FEAR，及(H) bsIgG1-huCD3-FEALxCD30-T215-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxb12-FEAR和IgG1-CD30-HRS-3-FEAR與SU-DHL-1細胞(左圖)或HDLM-2細胞(右圖)之劑量依賴性結合。(I) CD3xCD30雙特異性抗體及CD30單特異性抗體以1.11 µg/Ml之濃度與SU-DHL-1 (左圖)或HDLM-2細胞(右圖)之結合。用於CD30臂之抗體選殖株標示在x軸上。所顯示之數據為以一個代表性實驗的流式細胞測量術所測定之平均螢光強度(MFI)值。
[圖2]：bsG1-huCD3xCD30-MDX060與HL和ALCL細胞株之結合。bsG1-huCD3xCD30-MDX060與(A) HDLM-2 (HL)、(B) L-428 (HL)、(C) DEL (ALCL)、或(D) KI-JK (ALCL)細胞之結合係以流式細胞測量術評估。包括雙特異性抗體bsG1-huCD3xb12和bsG1-b12xCD30-MDX060及單特異性抗體IgG1-CD30-MDX060、IgG1-huCD3和IgG1-12作為對照物。如指示，所有的抗體含有FEAL及/或FERR Fc靜默及DuoBody®技術突變於其Fc結構域中。所顯示之數據為以一個代表性實驗的流式細胞測量術所測定之平均螢光強度(MFI)值。
[圖3]：由CD3xCD30雙特異性抗體於試管內誘導SU-DHL-1或HDML-2細胞中的細胞毒性。CD3xCD30雙特異性抗體係於試管內細胞毒性檢定法中使用CD30陽性腫瘤細胞株SU-DHL-1細胞(左圖)或HDLM-2細胞(右圖)作為靶細胞及T細胞(CD3陽性ADCC效應子細胞IV型細胞；Clean Cells，法國蒙泰居(Montaigu))作為效應子細胞進行測試。測試以下抗體：(A) bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR、bsG1-b12-FEALxCD30-MDX060-FEAR和IgG1-CD30-MDX060-FEAR，(B) bsG1-huCD3-FEALxCD30-hAC10-FEAR和IgG1-CD30-hAC10-FEAR，(C) bsG1-huCD3-FEALxCD30-HRS-3-FEAR和IgG1-CD30-HRS-3-FEAR，(D) BsIgG1-huCD3-FEALxCD30-HeFi-I-FEAR和IgG1-CD30-HeFi-I-FEAR，(E) bsIgG1-huCD3-FEALxCD30-T405-FEAR和IgG1-CD30-T405-FEAR，(F) bsIgG1-huCD3-FEALxCD30-T105-FEAR和IgG1-CD30-T105-FEAR，(G) bsIgG1-huCD3-FEALxCD30-T408-FEAR和IgG1-CD30-T408-FEAR，或(H) bsIgG1-huCD3-FEALxCD30-T215-FEAR和IgG1-CD30-HRS-3-FEAR。包括抗體bsG1-huCD3-FEALxb12-FEAR作為所有實驗中的對照物。所顯示之數據為活細胞百分比；各圖之數據係自一個代表性實驗獲得。
[圖4]：由CD3xCD30雙特異性抗體於試管內對幾種ALCL和HL細胞株誘導經T細胞媒介之細胞毒性及T細胞增殖。(A至C) CD3xCD30雙特異性抗體係於試管內細胞毒性檢定法中使用不同的ALCL和HL細胞株作為靶細胞及純化之T細胞(A、B)或ADCC效應子細胞IV型細胞(C)或作為效應子細胞進行測試。CD3xCD30雙特異性抗體含有huCD3-FEAL Fab臂或對CD3具有較低的親和性之huCD3-H101G-FEAL變異體及CD3特異性MDX060-FEAR Fab臂。包括IgG1-huCD3和IgG1-b12 (A、B)或bsG1-b12-FEALxCD30-MDX060-FEAR和IgG1-CD30-MDX060-FEAR (C)作為對照物。所顯示之數據為百分比活細胞；各圖之數據係自一個代表性實驗獲得。(D) CFSE陽性細胞數目係以使用HDLM-2細胞(左圖)或NCEB-1細胞(右圖)作為靶細胞之細胞毒性檢定法中的絕對T細胞計數之量度評估。
[圖5]：CD3xCD30雙特異性抗體與轉染至Expi293F細胞中的全長人類和食蟹猴CD30之結合。(A至C)單價及雙價CD30抗體與野生型Expi293F細胞(A)或與經全長人類CD30 (B)或食蟹猴CD30 (C)瞬時轉染之Expi293F細胞之結合。將細胞與濃度遞增的下列抗體培育：IgG1-CD30-MDX060-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR、bsG1-huCD3-H101G-FEALxCD30-MDX060-FEAR、bsG1-b12-FEALxCD30-MDX060-FEAR和bsG1-huCD3-FEALxb12-FEAR。數據係由兩個技術重複的流式細胞測量術測定之平均螢光強度(MFI)值呈示。(D)抗體IgG1-CD30-MDX060-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR和bsG1-huCD3-FEALxb12-FEAR與人類T細胞或食蟹猴T細胞之結合。數據係以一個代表性實驗的流式細胞測量術所測定之平均螢光強度(MFI)值呈示。
[圖6]：CD3xCD30雙特異性抗體與轉染至Expi293F細胞中的全長人類和恆河猴CD30之結合。單價及雙價CD30抗體與經全長人類CD30 (左圖)或恆河猴CD30 (右圖)瞬時轉染之Expi293F細胞之結合係以流式細胞測量術評估。評估下列抗體：(A) bsG1-huCD3-FEALxCD30-hAC10-FEAR和IgG1-CD30-hAC10-FEAR，(C) bsG1-huCD3-FEALxCD30-HRS-3-FEAR和IgG1-CD30-HRS-3-FEAR，(D) bsIgG1-huCD3-FEALxCD30-HeFi-I-FEAR和IgG1-CD30-HeFi-I-FEAR，(E) bsIgG1-huCD3-FEALxCD30-T405-FEAR和IgG1-CD30-T405-FEAR，(F) bsIgG1-huCD3-FEALxCD30-T105-FEAR和IgG1-CD30-T105-FEAR，(G) bsIgG1-huCD3-FEALxCD30-T408-FEAR和IgG1-CD30-T408-FEAR，或(H) bsIgG1-huCD3-FEALxCD30-T215-FEAR和IgG1-CD30-HRS-3-FEAR。包括抗體bsG1-huCD3-FEALxb12-FEAR作為所有實驗中的陰性對照物。所顯示之數據為以一個代表性實驗的流式細胞測量術所測定之平均螢光強度(MFI)值。
[圖7]：如微差掃瞄螢光測定法(DSF)所測定之具有不同的非活化突變之抗體的熱穩定性。在溫度遞增下的構形蛋白質穩定性係由DSF以一式兩份評估。顯示下列抗體之熔化曲線：(A) IgG1-CD30-MDX060-FEAR在pH 7.4，(B) IgG1-CD30-MDX060-FERR在pH 7.4，(C) IgG1-huCD3-FEAL在pH 7.4，及(D) BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR在pH 7.4。
[圖8]：bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR與HL細胞株之結合。bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR與HL細胞株L-540 (A)、KM-H2 (B)和L-1236 (C)之結合係以流式細胞測量術評估。包括雙特異性抗體bsG1-huCD3-FEALxb12-FERR和bsG1-b12-FEALxCD30-MDX060-FERR及單特異性抗體IgG1-CD30-MDX060-FERR、IgG1-huCD3-FEAL和IgG1-12-FEAL作為對照物。所顯示之數據為以一個代表性實驗的流式細胞測量術所測定之平均螢光強度(MFI)值。
[圖9]：bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR與ALCL細胞株之結合。bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR與ALCL細胞株SUP-M2 (A)、DL-40 (B)、KARPAS-299 (C)、L-82 (D)和SR-786 (E)之結合係以流式細胞測量術評估。包括雙特異性抗體bsG1-huCD3-FEALxb12-FERR和bsG1-b12-FEALxCD30-MDX060-FERR及單特異性抗體IgG1-CD30-MDX060-FERR、IgG1-huCD3-FEAL和IgG1-12-FEAL作為對照物。所顯示之數據為以一個代表性實驗的流式細胞測量術所測定之平均螢光強度(MFI)值。
[圖10]：bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR與NHL細胞株之結合。bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR與(A) SUP-T1 (TLL)、(B) JVM-2 (MCL)、(C) HH (CTCL)和(D) NCEB-1 (MCL)細胞株之結合係以流式細胞測量術評估。包括雙特異性抗體bsG1-huCD3-FEALxb12-FERR和bsG1-b12-FEALxCD30-MDX060-FERR及單特異性抗體IgG1-CD30-MDX060-FERR、IgG1-huCD3-FEAL和IgG1-12-FEAL作為對照物。所顯示之數據為以一個代表性實驗的流式細胞測量術所測定之平均螢光強度(MFI)值。
[圖11]：bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR與轉染至HEK293細胞中的全長人類和恆河猴CD30之結合。bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR與經全長人類CD30 (A)或恆河猴CD30 (B)瞬時轉染之HEK293細胞之結合係以流式細胞測量術評估。包括bsG1-huCD3-FEALxb12-FERR作為陰性對照物。所顯示之數據為以一個代表性實驗的流式細胞測量術所測定之平均螢光強度(MFI)值。
[圖12]：bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR與T細胞及腫瘤細胞之同時結合。bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR與經螢光標記之腫瘤細胞及初始T細胞之同時結合係以流式細胞測量術研究。(A)雙陽性事件係在6×10
-5至10 µg/mL之bsG1huCD3FEALxCD30-MDX060-FERR或對照抗體bsG1-huCD3-FEALxb12-FEAR、bsG1b12FEALxCD30MDX060-FERR或IgG1-b12-FEAL的存在下以總活細胞百分比顯示。在沒有抗體培育之樣品中的雙陽性事件百分比係以虛線標示。(B)在與0.12 µg/mL之 bsG1huCD3FEALxCD30-MDX060-FERR培育之樣品中的雙陽性細胞之閘控策略的例子。
[圖13]：由CD3xCD30雙特異性抗體於試管內誘導經T細胞媒介之細胞毒性及T細胞活化。一組CD3xCD30雙特異性抗體係於試管內細胞毒性檢定法中使用CD30陽性腫瘤細胞株Karpas-299作為靶細胞及自健康的人類供體膚色血球層純化之T細胞作為效應子細胞進行測試。在該等檢定法中，CD25表現係在CD4
+和CD8
+細胞中作為T細胞活化量度評估。測試下列抗體：bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-hAC10-FEAR、bsG1-huCD3-FEALxCD30-HRS-3-FEAR、BsIgG1-huCD3-FEALxCD30-HeFi-I-FEAR、bsIgG1-huCD3-FEALxCD30-T105-FEAR、bsIgG1-huCD3-FEALxCD30-T405-FEAR、bsIgG1-huCD3-FEALxCD30-T408-FEAR和bsIgG1-huCD3-FEALxCD30-T215-FEAR。(A)由CD3xCD30抗體對Karpas-299細胞的細胞毒性之IC
50值。(B)由試驗抗體對Karpas-299細胞之最大細胞毒性百分比。(C-F)由CD3xCD30抗體誘導CD4
+(C、E)或CD8
+(D、F) T細胞中的CD25 (C至D)或PD-1 (E至F)表現之EC
50值。數據係自兩個獨立的實驗獲得，該實驗係以自6個不同的供體獲得的T細胞執行。統計值代表在指示之選殖株與bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR之間的威爾克森配對符號等級檢定(Wilcoxon matched-pairs singed rank test)的結果。NS：不顯著，*：p ＜0.05。
[圖14]：由bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR於試管內經T細胞媒介之細胞株的細胞毒性。由bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR經劑量依賴性T細胞媒介之細胞毒性係於試管內使用L-428 (A)、KM-H2 (B)、SUP-M2 (C)或KI-JK (D)腫瘤細胞株作為靶細胞及經純化之T細胞作為效應子細胞進行測試。包括IgG1-huCD3-FEAL、bsG1-huCD3-FEALxb12-FERR、IgG1-CD30-MDX060-FERR、bsG1-b12-FEALxCD30-MDX060-FERR和IgG1-b12-FEAL作為對照物。所顯示之數據為百分比活細胞，各圖之數據係以一個代表性實驗獲得。
[圖15]：在L-428和KI-JK細胞株中由bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR於試管內之T細胞增殖。T細胞增殖係於經T細胞媒介之細胞毒性檢定法中使用L-428 (A、B)或KI-JK (C、D)作為靶細胞評估。閘控具有稀釋的Celltrace Violet染色之CD4
+(A、C)或CD8
+(B、D) T細胞，且作為T細胞增殖量度之擴增指數係使用來自FlowJo之增殖建模工具計算。
[圖16]：在L-428和KI-JK細胞株中由bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR於試管內的T細胞活化標誌物CD69之表現。T細胞活化係在經T細胞媒介之細胞毒性檢定法中使用L-428 (A、B)或KI-JK (C、D)作為靶細胞評估。T細胞活化標誌物CD69之表現係於CD4
+(A、C)或CD8
+(B、D) T細胞中評估。
[圖17]：在L-428和KI-JK細胞株中由bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR於試管內的T細胞活化標誌物CD25之表現。T細胞活化係在經T細胞媒介之細胞毒性檢定法中使用L-428 (A、B)或KI-JK (C、D)作為靶細胞評估。T細胞活化標誌物CD25之表現係於CD4
+(A、C)或CD8
+(B、D) T細胞中評估。
[圖18]：在L-428和KI-JK細胞株中由bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR於試管內的T細胞活化標誌物PD-1之表現。T細胞活化係在經T細胞媒介之細胞毒性檢定法中使用L-428 (A、B)或KI-JK (C、D)作為靶細胞評估。T細胞活化標誌物PD-1之表現係於CD4
+(A、C)或CD8
+(B、D) T細胞中評估。
[圖19]：由bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR於試管內細胞激素及顆粒酶B生產。14種不同的細胞激素(CD40、IFNγ、IL-10、IL-12、IL-13、IL-1b、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IP-10、MCP-1、PDL-1、TNFα)及顆粒酶B濃度係在使用L-428作為靶細胞的試管內經T細胞媒介之細胞毒性實驗期間收集的上清液中評估。顯示以不同濃度的bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR或對照抗體IgG1-b12-FEAL處理之樣品的細胞激素及顆粒酶B濃度。
[圖20]：在不同的效應子對標靶比例下由bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR於試管內經T細胞媒介之細胞毒性及T細胞增殖。(A)由bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR經劑量依賴性T細胞媒介之細胞毒性係於試管內使用L-428 腫瘤細胞作為靶細胞及經純化之T細胞作為效應子細胞以1：1、2：1、4：1或8：1之E：T比例進行測試。包括bsG1-huCD3-FEALxb12-FERR作為對照抗體。所顯示之數據為自一個代表性實驗所獲得的活細胞百分比。(B、C)具有稀釋的Celltrace Violet染色之CD4
+(B)或CD8
+(C) T細胞百分比係以增殖的T細胞量度顯示。
[圖21]：由bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR於試管內經T細胞媒介之細胞毒性及T細胞增殖的動力學。(A)由bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR經T細胞媒介之細胞毒性的動力學係於試管內使用L-428腫瘤細胞作為靶細胞及經純化之T細胞作為效應子細胞以4：1之E：T比例進行測試。細胞毒性係在24 h、48 h和72 h後評估。包括bsG1-huCD3-FEALxb12-FERR作為對照抗體。所顯示之數據為自一個代表性實驗所獲得的活細胞百分比。(B、C)閘控具有稀釋的Celltrace Violet染色之CD4
+(B)或CD8
+(C) T細胞，且作為細胞毒性檢定法中的T細胞增殖量度之擴增指數係使用來自FlowJo之增殖建模工具計算。
[圖22]：由bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR於試管內經T細胞媒介之細胞毒性及與CD30表現水平的相關性。在由bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR經T細胞媒介之最大毒殺(A)或經T細胞媒介之細胞毒性的IC50濃度(B)相對於CD30表現水平之間的相關性係在八種腫瘤細胞株中評估。使用斯皮爾曼(Spearman)等級相關試驗(GraphPad Prism軟體)評估在經T細胞媒介之細胞毒性(最大毒殺或IC
50)與CD30表現之間的相關程度之統計顯著性。
[圖23]：由bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR的經活化之T細胞的自相殘殺(fratricide)。將經單離之健康的供體T細胞以1 µg/mL之抗CD3 (OKT-3)、1 µg/mL之抗CD28及0.025 µg/mL之IL-15刺激4天。在證實活化(CD25上調)後，將T細胞與濃度遞增的bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR、bsIgG1-ctrlxCD30-MDX-060-FERR、bsIgG1-CD3xb12或IgG1-b12-FEAL培育48小時。經活化之CD30
+T細胞的經BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR誘導之T細胞自相殘殺係測量為以各條件中的活T細胞相對於未添加任何抗體的條件中的活T細胞數目之百分比。(A-B)在以抗CD3、抗CD28和IL-15刺激後72和96小時，在CD4
+或CD8
+T細胞中的CD25
+(A)或CD30
+(B)細胞百分比係以流式細胞測量術測定。(C) T細胞自相殘殺係以相對於未添加任何抗體的條件之T細胞存活百分比顯示。顯示一個代表性T細胞供體的數據。
[圖24]：在CD30
+細胞培養物之上清液中的可溶性CD30及其干擾與BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR之抗腫瘤活性。(A)顯示在不同的血液腫瘤細胞株之上清液中的可溶性CD30 (sCD30)濃度，如以ELISA所測量。(B)在不同的血液腫瘤細胞株，sCD30濃度與如使用定量性流式細胞測量術(人類IgG校正套組-Biocytex)所測定之細胞表面上的CD30分子數目之間的相關性係以斯皮爾曼等級相關試驗(GraphPad Prism軟體)評估。(C) BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR係於試管內細胞毒性檢定法中使用CD30陽性ALCL腫瘤細胞株DEL作為靶細胞及經健康的供體單離之T細胞作為效應子細胞進行測試。包括下列對照抗體：BsG1-b12-FEALxCD30-MDX060-FERR、IgG1-CD30-MDX060-FERR、BsG1-huCD3-FEALxb12-FERR、IgG1-huCD30-FEAL和IgG1-b12-FEAL。所顯示之數據為自一個代表性實驗所獲得的活細胞百分比。
[圖25]：在L-428腫瘤細胞中由bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR於活體外誘導經T細胞媒介之細胞毒性及T細胞增殖。(A) bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR係以活體外細胞毒性檢定法中使用L-428 腫瘤細胞作為靶細胞及源於初級患者之T細胞作為效應子細胞進行測試。使用源於霍奇金氏淋巴瘤(HL)、急性骨髓性白血病(AML)及周邊T細胞淋巴瘤(PTCL)患者之周邊血液單核細胞(PBMC)作為T細胞來源以評估CD3依賴性腫瘤細胞毒殺。包括IgG1-b12-FEAL作為對照物。所顯示之數據為百分比活靶細胞。(B-D) T細胞活化係以PBMC亞群內的CD4
+/CD8
+T細胞上CD69 (B)、CD25 (C)和PD-1 (D)標誌物之上調評估，如以百分比陽性細胞表示。
[圖26]：在SCID小鼠中以靜脈內注射後的BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR之血漿濃度。將SCID小鼠以10 µg (0.5 mg/kg)或100 µg (5 mg/kg)之BsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR的單一IV劑量注射。(A)總人類IgG係以ELISA測定及平均人類IgG1濃度係隨時間繪製。(B)平均清除率係以0.5或5 mg/kg之劑量水平繪製。虛線表示基於小鼠中的未結合之常規人類IgG1的標準分布體積的估計之清除率。
[圖27]：結合至經膜結合之bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR之C1q。C1q與經bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR助噬化、活化之人類CD8
+T細胞或CD30
+NCEB-1細胞之結合係以流式細胞測量術使用經FITC標記之兔子抗C1q抗體評估。(A) bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR、IgG1-huCD3-FEAL或陽性對照抗體IgG1-CD52-E430G與經抗CD3/CD28磁珠刺激之人類CD8
+T細胞在作為C1q來源的正常人類血清存在下之結合。所顯示之數據為來自一個代表性實驗的複製孔之幾何平均螢光強度(gMFI) ± SD。(B) bsG1-huCD3-FEALxCD30-MDX060-FERR、IgG1-CD30-MDX060-FERR或陽性對照抗體IgG1-7D8-E430G與CD30
+NCEB-1細胞在作為C1q來源的正常人類血清存在下之結合。所顯示之數據為來自一個代表性實驗之gMFI。
TW202330610A_111138087_SEQL.xml
Claims (60)
- 一種多特異性抗體，其包含： (i) CD30結合區，其包含第一重鏈可變區，該第一重鏈可變區包含分別以SEQ ID NO：1、2和3列出之CDR1、CDR2和CDR3序列，及第一輕鏈可變區，該第一輕鏈可變區包含分別以SEQ ID NO：4、5和6列出之CDR1、CDR2和CDR3序列，及 (ii) CD3結合區，其包含第二重鏈可變區，該第二重鏈可變區包含分別以SEQ ID NO：7、8和9列出之CDR1、CDR2和CDR3序列，及第二輕鏈可變區，該第二輕鏈可變區包含分別以SEQ ID NO：10、11和12列出之CDR1、CDR2和CDR3序列。
- 如請求項1之多特異性抗體，其中該第一重鏈可變區及/或該第一輕鏈可變區為人類。
- 如請求項1或2之多特異性抗體，其中該第二重鏈可變區及/或該第二輕鏈可變區係經人源化。
- 如前述請求項中任一項之多特異性抗體，其中在SEQ ID NO：9中的X為H。
- 如請求項1至3中任一項之多特異性抗體，其中在SEQ ID NO：9中的X為G。
- 如前述請求項中任一項之多特異性抗體，其中該第一重鏈可變區包含以SEQ ID NO：13列出之序列及該第一輕鏈可變區包含以SEQ ID NO：14列出之序列。
- 如前述請求項中任一項之多特異性抗體，其中該第二重鏈可變區包含以SEQ ID NO：15列出之序列及該第二輕鏈可變區包含以SEQ ID NO：16列出之序列。
- 如前述請求項中任一項之多特異性抗體，其中該多特異性抗體為雙特異性抗體。
- 如前述請求項中任一項之多特異性抗體，其中該多特異性抗體包含由第一和第二Fc多肽所組成之Fc區。
- 如請求項9之多特異性抗體，其中該Fc區為IgG1 Fc區，較佳為人類IgG1 Fc區。
- 如請求項9或10之多特異性抗體，其中該多特異性抗體為全長抗體。
- 如請求項9至11中任一項之多特異性抗體，其包含惰性Fc區。
- 如請求項9至12中任一項之多特異性抗體，其中該第一及/或第二Fc多肽包含對應於在人類IgG1重鏈中位置L234及/或L235上的胺基酸之胺基酸取代，其中該取代較佳地分別取代成F和E，其中該胺基酸位置係根據Eu編號所定義。
- 如請求項12或13之多特異性抗體，其中該第一和第二Fc多肽包含對應於位置L234和L235上的胺基酸分別取代成F和E之胺基酸取代，且其中該第一及/或第二Fc多肽另包含對應於在人類IgG1重鏈中位置G236上的胺基酸之胺基酸取代，其中該取代較佳地取代成R，其中該胺基酸位置係根據Eu編號所定義。
- 如請求項14之多特異性抗體，其中該第一和第二Fc多肽包含對應於位置L234和L235上的胺基酸分別取代成F和E之胺基酸取代，且其中該第一和第二Fc多肽另包含對應於在人類IgG1重鏈中位置G236上的胺基酸之胺基酸取代，其中該取代較佳地取代成R。
- 如請求項12或13之多特異性抗體，其中該第一和第二Fc多肽包含對應於位置L234和L235上的胺基酸分別取代成F和E之胺基酸取代，且其中該第一及/或第二Fc多肽另包含對應於在人類IgG1重鏈中位置D265上的胺基酸之胺基酸取代，其中該取代較佳地取代成A，其中該胺基酸位置係根據Eu編號所定義。
- 如請求項16之多特異性抗體，其中該第一和第二Fc多肽包含對應於位置L234和L235上的胺基酸分別取代成F和E之胺基酸取代，且其中該第一和第二Fc多肽另包含對應於在人類IgG1重鏈中位置D265上的胺基酸之胺基酸取代，其中該取代較佳地取代成A。
- 如請求項12至14中任一項之多特異性抗體，其中該第一和第二Fc多肽之一包含對應於位置L234、L235和G236上的胺基酸分別取代成F、E和R之胺基酸取代，且另一Fc多肽包含對應於位置L234、L235E和D265上的胺基酸分別取代成F、E和A之胺基酸取代，其中該胺基酸位置係根據Eu編號所定義。
- 如請求項18之多特異性抗體，其中該第一Fc多肽及該第一重鏈可變區包含在相同的多肽鏈內，及其中該第二Fc多肽及該第二重鏈可變區包含在相同的多肽鏈內。
- 如請求項19之多特異性抗體，其中該第一Fc多肽包含對應於位置L234、L235和G236上的胺基酸分別取代成F、E和R之胺基酸取代，且該第二Fc多肽包含對應於位置L234、L235E和D265上的胺基酸分別取代成F、E和A之胺基酸取代，其中該胺基酸位置係根據Eu編號所定義。
- 如請求項9至20中任一項之多特異性抗體，其中在該第一Fc多肽中，在對應於人類IgG1重鏈中的選自由：T366、L368、K370、D399、F405、Y407和K409所組成之群組的位置之位置上的胺基酸中至少一者已被取代，且在該第二Fc多肽中，在對應於人類IgG1重鏈中的選自由：T366、L368、K370、D399、F405、Y407和K409所組成之群組的位置之位置上的胺基酸中至少一者已被取代，且其中在該第一和第二Fc多肽中的該取代不在相同的位置上，其中該胺基酸位置係根據Eu編號所定義。
- 如請求項21之多特異性抗體，其中在對應於F405之位置上的該胺基酸為該第一Fc多肽中的L，及其中在對應於K409之位置上的該胺基酸為該第二Fc多肽中的R，或反之亦然。
- 如請求項22之多特異性抗體，其中在對應於K409之位置上的該胺基酸為該第一Fc多肽中的R，及其中在對應於F405之位置上的該胺基酸為該第二Fc多肽中的L。
- 如前述請求項中任一項之多特異性抗體，其包含： (i) CD30結合區，其包含第一重鏈可變區，該第一重鏈可變區包含分別以SEQ ID NO：1、2和3列出之CDR1、CDR2和CDR3序列，及第一輕鏈可變區，該第一輕鏈可變區包含分別以SEQ ID NO：4、5和6列出之CDR1、CDR2和CDR3序列，及 (ii) CD3結合區，其包含第二重鏈可變區，該第二重鏈可變區包含分別以SEQ ID NO：7、8和9列出之CDR1、CDR2和CDR3序列，及第二輕鏈可變區，該第二輕鏈可變區包含分別以SEQ ID NO：10、11和12列出之CDR1、CDR2和CDR3序列； 其中該多特異性抗體為雙特異性抗體，且包含由第一和第二Fc多肽所組成之Fc區； 其中該第一Fc多肽及該第一重鏈可變區包含在相同的多肽鏈內，及其中該第二Fc多肽及該第二重鏈可變區包含在相同的多肽鏈內； 其中該第一Fc多肽包含對應於位置L234、L235和G236上的胺基酸分別取代成F、E和R之胺基酸取代，且該第二Fc多肽包含對應於位置L234、L235和D265上的胺基酸分別取代成F、E和A之胺基酸取代，其中該胺基酸位置係根據Eu編號所定義；及 其中在對應於K409之位置上的該胺基酸為該第一Fc多肽中的R，及其中在對應於F405之位置上的該胺基酸為該第二Fc多肽中的L。
- 如前述請求項中任一項之多特異性抗體，其包含下列或由下列所組成：以SEQ ID NO：17和19列出之重鏈序列及以SEQ ID NO：18和20列出之輕鏈序列。
- 如前述請求項中任一項之多特異性抗體，其包含下列或由下列所組成：以SEQ ID NO：17和19列出之重鏈序列及以SEQ ID NO：18和20列出之輕鏈序列，其中該多特異性抗體為雙特異性抗體。
- 如請求項1至8中任一項之多特異性抗體，其中 (i) 該CD30結合區及/或該CD3結合區為Fab， (ii) 該CD30結合區及/或該CD3結合區為scFv， (iii) 該CD30結合區為Fab及該CD3結合區為scFv，或 (iv) 該CD30結合區為scFv及該CD3結合區為Fab。
- 一種核酸構築體或核酸構築體之組合，其編碼如前述請求項中任一項之多特異性抗體。
- 一種表現載體或表現載體之組合，其包含如請求項28之核酸構築體。
- 一種遞送媒劑，其包含如請求項28之核酸構築體。
- 如請求項30之遞送媒劑，其中該遞送媒劑為粒子。
- 如請求項31之遞送媒劑，其中該粒子為脂質奈米粒子。
- 如請求項32之遞送媒劑，其中該脂質奈米粒子包含脂質、可離子化的胺基脂質、PEG-脂質、膽固醇或其任何組合。
- 一種能夠生產如請求項1至27中任一項之多特異性抗體之重組宿主細胞，其中該宿主細胞包含一或多種編碼如前述請求項中任一項之多特異性抗體之核酸構築體。
- 如請求項34之重組宿主細胞，其中該重組宿主細胞為CHO細胞。
- 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至27中任一項之多特異性抗體及醫藥上可接受的載劑。
- 如請求項1至27中任一項之多特異性抗體、如請求項28之核酸構築體、如請求項30至33中任一項之遞送媒劑、或如請求項36之醫藥組成物，其係用作為藥劑。
- 如請求項1至27中任一項之多特異性抗體、如請求項28之核酸構築體、如請求項30至33中任一項之遞送媒劑、或如請求項36之醫藥組成物，其係用於治療癌症。
- 如請求項1至27中任一項之多特異性抗體、如請求項28之核酸構築體、如請求項30至33中任一項之遞送媒劑、或如請求項36之醫藥組成物，其係用於治療霍奇金氏(Hodgkin’s)淋巴瘤或非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)。
- 如請求項39使用之多特異性抗體、核酸構築體、遞送媒劑、或醫藥組成物，其中非霍奇金氏淋巴瘤為T細胞非霍奇金氏淋巴瘤(T-NHL)。
- 如請求項40使用之多特異性抗體、核酸構築體、遞送媒劑、或醫藥組成物，其中T-NHL為皮膚T細胞淋巴瘤(CTCL)或周邊T細胞淋巴瘤(PTCL)。
- 如請求項39至41中任一項使用之多特異性抗體、核酸構築體、遞送媒劑、或醫藥組成物，其中T細胞非霍奇金氏淋巴瘤(T-NHL)為退行性大細胞淋巴瘤(ALCL)。
- 如請求項39使用之多特異性抗體、核酸構築體、遞送媒劑、或醫藥組成物，其中非霍奇金氏淋巴瘤為B細胞非霍奇金氏淋巴瘤(B-NHL)。
- 如請求項37至43中任一項使用之多特異性抗體、核酸構築體、遞送媒劑、或醫藥組成物，其中該多特異性抗體、該核酸構築體、該遞送媒劑、或該醫藥組成物已經靜脈內及/或皮下投予，較佳地經皮下投予。
- 一種生產如請求項1至27中任一項之多特異性抗體之方法，其包含 (i) 將如請求項34或35之重組宿主細胞在其中生產該抗體的條件下培養，且 (ii) 將該生產之多特異性抗體與培養物單離。
- 一種生產如請求項9至26中任一項之多特異性抗體之方法，其包含 a) 提供包含如請求項1所述之CD30結合區之第一抗體(i)及包含如請求項1所述之CD3結合區之第二抗體(ii)，其中該抗體視需要地包含如請求項2至26所述之其他特徵， 其中該第一及第二抗體包含Fc區，及 其中該第一及第二抗體的該第一和第二CH3區之序列不同，且使得該第一和第二CH3區之間的異二聚相互作用比該第一和第二CH3區的每一同二聚相互作用更強； b) 將該第一抗體與該第二抗體一起在足以容許在樞紐區中的半胱胺酸經歷雙硫鍵異構化之還原條件下培育；以及 c) 獲得包含該第一抗體之第一免疫球蛋白重鏈和第一免疫球蛋白輕鏈和該第二抗體之第二免疫球蛋白重鏈和第二免疫球蛋白輕鏈之多特異性抗體。
- 一種配件套組(kit-of-parts)，諸如用作為伴隨診斷/用於鑑定在患者群體內對如請求項1至27中任一項所定義之抗體的治療具有反應傾向的那些患者之套組，其包含如請求項1至27中任一項所定義之抗體；及使用該套組之用法說明。
- 一種診斷組成物，其包含如請求項1至27中任一項之多特異性抗體。
- 一種抗體，其包含 (i) CD30結合區，其包含第一重鏈可變區，該第一重鏈可變區包含分別以SEQ ID NO：1、2和3列出之CDR1、CDR2和CDR3序列，及第一輕鏈可變區，該第一輕鏈可變區包含分別以SEQ ID NO：4、5和6列出之CDR1、CDR2和CDR3序列，及 (ii) 由第一和第二Fc多肽所組成之Fc區 其中該第一和第二Fc多肽包含對應於位置L234和L235上的胺基酸分別取代成F和E之胺基酸取代，且其中該第一和第二Fc多肽另包含對應於在人類IgG1重鏈中位置G236上的胺基酸之胺基酸取代，其中該取代較佳地取代成R， 其中該胺基酸位置係根據Eu編號所定義。
- 如請求項49之抗體，其中該第一重鏈可變區包含以SEQ ID NO：13列出之序列及該第一輕鏈可變區包含以SEQ ID NO：14列出之序列。
- 如請求項49至50中任一項之抗體，其中該抗體包含下列或由下列所組成：以SEQ ID NO：17列出之該重鏈序列及以SEQ ID NO：18列出之該輕鏈序列。
- 一種抗體，其包含 (i) CD3結合區，其包含第二重鏈可變區，該第二重鏈可變區包含分別以SEQ ID NO：7、8和9列出之CDR1、CDR2和CDR3序列，及第二輕鏈可變區，該第二輕鏈可變區包含分別以SEQ ID NO：10、11和12列出之CDR1、CDR2和CDR3序列，及 (ii) 由第一和第二Fc多肽所組成之Fc區，其中該第一和第二Fc多肽包含對應於位置L234和L235上的胺基酸分別取代成F和E之胺基酸取代，且其中該第一和第二Fc多肽另包含對應於在人類IgG1重鏈中位置G236上的胺基酸之胺基酸取代，其中該取代較佳地取代成R， 其中該胺基酸位置係根據Eu編號所定義。
- 如請求項52之抗體，其中在SEQ ID NO：9中的X為H。
- 如請求項52之抗體，其中在SEQ ID NO：9中的X為G。
- 如請求項52至54中任一項之抗體，其中該第二重鏈可變區包含以SEQ ID NO：15列出之序列及該第二輕鏈可變區包含以SEQ ID NO：16列出之序列。
- 如請求項49至55中任一項之抗體，其中該抗體為全長抗體。
- 如請求項49至56中任一項之抗體，其中在對應於人類IgG1重鏈中的選自由：T366、L368、K370、D399、F405、Y407和K409所組成之群組的位置之位置上的胺基酸中至少一者已被取代，其中較佳地在對應於F405之位置上的該胺基酸為L或在對應於K409之位置上的該胺基酸為R。
- 一種生產多特異性抗體之方法，其包含 a) 提供如請求項49至51或55至57中任一項所述之第一抗體及包含下列的第二抗體： (i) CD3結合區，其包含第二重鏈可變區，該第二重鏈可變區包含分別以SEQ ID NO：7、8和9列出之CDR1、CDR2和CDR3序列，及第二輕鏈可變區，該第二輕鏈可變區包含分別以SEQ ID NO：10、11和12列出之CDR1、CDR2和CDR3序列，及 (ii) 由第一和第二Fc多肽所組成之Fc區，其中該第一和第二Fc多肽包含對應於在人類IgG1重鏈中位置L234和L235上的胺基酸分別取代成F和E之胺基酸取代及對應於位置D265上的胺基酸取代成A之胺基酸取代， 或 提供如請求項52至57中任一項所述之第二抗體及包含下列的第一抗體： (i) CD30結合區，其包含第二重鏈可變區，該第二重鏈可變區包含分別以SEQ ID NO：1、2和3列出之CDR1、CDR2和CDR3序列，及第二輕鏈可變區，該第二輕鏈可變區包含分別以SEQ ID NO：4、5和6列出之CDR1、CDR2和CDR3序列，及 (ii) 由第一和第二Fc多肽所組成之Fc區，其中該第一和第二Fc多肽包含對應於在人類IgG1重鏈中位置L234和L235上的胺基酸分別取代成F和E之胺基酸取代及對應於位置D265上的胺基酸取代成A之胺基酸取代， 其中該第一及第二抗體的該第一和第二CH3區之序列不同，且使得該第一和第二CH3區之間的異二聚相互作用比該第一和第二CH3區的每一同二聚相互作用更強；其中較佳地在對應於F405之位置上的該胺基酸為該第一CH3區中的L及在對應於K409之位置上的該胺基酸為該第二CH3區中的R，或反之亦然， b) 將該第一抗體與該第二抗體一起在足以容許在樞紐區中的半胱胺酸經歷雙硫鍵異構化之還原條件下培育；以及 c) 獲得包含該第一抗體之第一免疫球蛋白重鏈和第一免疫球蛋白輕鏈和該第二抗體之第二免疫球蛋白重鏈和第二免疫球蛋白輕鏈之該多特異性抗體。
- 一種生產如請求項58之多特異性抗體之方法，其包含 a) 提供如請求項49至51或55至57中任一項所述之第一抗體及包含下列的第二抗體： (i) CD3結合區，其包含第二重鏈可變區，該第二重鏈可變區包含分別以SEQ ID NO：7、8和9列出之CDR1、CDR2和CDR3序列，及第二輕鏈可變區，該第二輕鏈可變區包含分別以SEQ ID NO：10、11和12列出之CDR1、CDR2和CDR3序列，及 (ii) 由第一和第二Fc多肽所組成之Fc區，其中該第一和第二Fc多肽包含對應於位置L234和L235上的胺基酸分別取代成F和E之胺基酸取代及對應於在人類IgG1重鏈中位置D265上的胺基酸取代成A之胺基酸取代， 其中該第一及第二抗體的該第一和第二CH3區之序列不同，且使得該第一和第二CH3區之間的異二聚相互作用比該第一和第二CH3區的每一同二聚相互作用更強；其中較佳地在對應於K409之位置上的該胺基酸為該第一CH3區中的R及在對應於F405之位置上的該胺基酸為該第二CH3區中的L， b) 將該第一抗體與該第二抗體一起在足以容許在樞紐區中的半胱胺酸經歷雙硫鍵異構化之還原條件下培育；以及 c) 獲得包含該第一抗體之第一免疫球蛋白重鏈和第一免疫球蛋白輕鏈和該第二抗體之第二免疫球蛋白重鏈和第二免疫球蛋白輕鏈之該多特異性抗體。
- 一種以如請求項58至59中任一項所述之方法獲得的多特異性抗體。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP21201712.3 | 2021-10-08 | ||
| EP21201712 | 2021-10-08 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TW202330610A true TW202330610A (zh) | 2023-08-01 |
Family
ID=78087069
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TW111138087A TW202330610A (zh) | 2021-10-08 | 2022-10-06 | 結合至ｃｄ３０及ｃｄ３之抗體 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11814437B2 (zh) |
| JP (1) | JP2023551744A (zh) |
| AR (1) | AR127298A1 (zh) |
| AU (1) | AU2022361691A1 (zh) |
| CA (1) | CA3234153A1 (zh) |
| TW (1) | TW202330610A (zh) |
| WO (1) | WO2023057571A1 (zh) |
Family Cites Families (73)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6077A (en) | 1849-01-30 | Improved hinged claw-wrench | ||
| US835A (en) | 1838-07-12 | X i i i x | ||
| US5703055A (en) | 1989-03-21 | 1997-12-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery |
| JP4124480B2 (ja) | 1991-06-14 | 2008-07-23 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | 免疫グロブリン変異体 |
| GB9203459D0 (en) | 1992-02-19 | 1992-04-08 | Scotgen Ltd | Antibodies with germ-line variable regions |
| US5731168A (en) | 1995-03-01 | 1998-03-24 | Genentech, Inc. | Method for making heteromultimeric polypeptides |
| KR970029803A (ko) | 1995-11-03 | 1997-06-26 | 김광호 | 반도체 메모리장치의 프리차지 회로 |
| AU751659B2 (en) | 1997-05-02 | 2002-08-22 | Genentech Inc. | A method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components |
| US6355271B1 (en) | 1999-02-03 | 2002-03-12 | Biosante Pharmaceuticals, Inc. | Therapeutic calcium phosphate particles and methods of manufacture and use |
| US6281005B1 (en) | 1999-05-14 | 2001-08-28 | Copernicus Therapeutics, Inc. | Automated nucleic acid compaction device |
| US20100081792A1 (en) | 2001-06-28 | 2010-04-01 | Smithkline Beecham Corporation | Ligand |
| US7241304B2 (en) | 2001-12-21 | 2007-07-10 | Advanced Cardiovascular Systems, Inc. | Flexible and conformable embolic filtering devices |
| US7387776B2 (en) * | 2002-01-09 | 2008-06-17 | Medarex, Inc. | Human monoclonal antibodies against CD30 |
| US20040018557A1 (en) | 2002-03-01 | 2004-01-29 | Immunomedics, Inc. | Bispecific antibody point mutations for enhancing rate of clearance |
| ES2442615T5 (es) | 2002-07-18 | 2023-03-16 | Merus Nv | Producción recombinante de mezclas de anticuerpos |
| WO2005004809A2 (en) | 2003-07-01 | 2005-01-20 | Immunomedics, Inc. | Multivalent carriers of bi-specific antibodies |
| US7288638B2 (en) | 2003-10-10 | 2007-10-30 | Bristol-Myers Squibb Company | Fully human antibodies against human 4-1BB |
| US7235641B2 (en) | 2003-12-22 | 2007-06-26 | Micromet Ag | Bispecific antibodies |
| US7741568B2 (en) | 2005-01-13 | 2010-06-22 | The Wiremold Company | Downward facing receptacle assembly for cable raceway |
| WO2006104989A2 (en) * | 2005-03-29 | 2006-10-05 | Verenium Corporation | Altered antibody fc regions and uses thereof |
| WO2006106905A1 (ja) | 2005-03-31 | 2006-10-12 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 会合制御によるポリペプチド製造方法 |
| WO2007040653A2 (en) | 2005-05-16 | 2007-04-12 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of Health And Human Services National Institutes Of Health | Anti-cd30 antibodies that bind to intact cd30 but not soluble cd30 |
| US7612181B2 (en) | 2005-08-19 | 2009-11-03 | Abbott Laboratories | Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof |
| WO2007059782A1 (en) | 2005-11-28 | 2007-05-31 | Genmab A/S | Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof |
| WO2007109254A2 (en) | 2006-03-17 | 2007-09-27 | Biogen Idec Ma Inc. | Stabilized polypeptide compositions |
| EP1999154B1 (en) | 2006-03-24 | 2012-10-24 | Merck Patent GmbH | Engineered heterodimeric protein domains |
| AT503902B1 (de) | 2006-07-05 | 2008-06-15 | F Star Biotech Forsch & Entw | Verfahren zur manipulation von immunglobulinen |
| US8257706B2 (en) | 2006-08-25 | 2012-09-04 | Seattle Genetics, Inc. | CD30 binding agents and uses thereof |
| WO2008119353A1 (en) | 2007-03-29 | 2008-10-09 | Genmab A/S | Bispecific antibodies and methods for production thereof |
| JP2010524851A (ja) | 2007-04-03 | 2010-07-22 | マイクロメット アーゲー | 種間特異的結合ドメイン |
| JP5718637B2 (ja) | 2007-06-21 | 2015-05-13 | マクロジェニクス，インコーポレーテッド | 共有結合型ダイアボディおよびその使用 |
| EP2535349A1 (en) | 2007-09-26 | 2012-12-19 | UCB Pharma S.A. | Dual specificity antibody fusions |
| US8227577B2 (en) | 2007-12-21 | 2012-07-24 | Hoffman-La Roche Inc. | Bivalent, bispecific antibodies |
| WO2009089004A1 (en) | 2008-01-07 | 2009-07-16 | Amgen Inc. | Method for making antibody fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects |
| WO2010015792A1 (en) | 2008-08-06 | 2010-02-11 | Argenta Discovery Limited | Nitrogen containing heterocyclic compounds useful as bifunctional modulators of m3 receptors and beta-2 receptors |
| JP5397668B2 (ja) | 2008-09-02 | 2014-01-22 | ソニー株式会社 | 記憶素子および記憶装置 |
| WO2010059315A1 (en) | 2008-11-18 | 2010-05-27 | Merrimack Pharmaceuticals, Inc. | Human serum albumin linkers and conjugates thereof |
| CN106432503B (zh) | 2008-12-19 | 2020-03-06 | 宏观基因有限公司 | 共价双抗体及其用途 |
| CA2751342C (en) | 2009-01-29 | 2019-05-07 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Lipid formulations comprising cationic lipid and a targeting lipid comprising n-acetyl galactosamine for delivery of nucleic acid |
| KR20110134494A (ko) | 2009-03-27 | 2011-12-14 | 자이모제네틱스, 인코포레이티드 | 항체-수용체 조합물을 포함하는 다중특이적-결합 단백질을 사용하기 위한 조성물 및 방법 |
| JP2012525149A (ja) | 2009-04-27 | 2012-10-22 | オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド | ヘテロ多量体分子を作製するための方法 |
| KR101224468B1 (ko) | 2009-05-20 | 2013-01-23 | 주식회사 파멥신 | 신규한 형태의 이중표적항체 및 그 용도 |
| US9493578B2 (en) | 2009-09-02 | 2016-11-15 | Xencor, Inc. | Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens |
| CA2781682A1 (en) | 2009-12-04 | 2011-06-09 | Genentech, Inc. | Multispecific antibodies, antibody analogs, compositions, and methods |
| AR080794A1 (es) | 2010-03-26 | 2012-05-09 | Hoffmann La Roche | Anticuerpos bivalentes biespecificos anti- vegf/ anti-ang-2 |
| SG184427A1 (en) | 2010-04-20 | 2012-11-29 | Genmab As | Heterodimeric antibody fc-containing proteins and methods for production thereof |
| WO2011143545A1 (en) | 2010-05-14 | 2011-11-17 | Rinat Neuroscience Corporation | Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them |
| WO2011147986A1 (en) | 2010-05-27 | 2011-12-01 | Genmab A/S | Monoclonal antibodies against her2 |
| RU2608640C2 (ru) | 2010-08-16 | 2017-01-23 | Новиммун С.А. | Способы получения мультиспецифичных и мультивалентных антител |
| CN103068846B9 (zh) | 2010-08-24 | 2016-09-28 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 包含二硫键稳定性Fv片段的双特异性抗体 |
| WO2012025525A1 (en) | 2010-08-24 | 2012-03-01 | Roche Glycart Ag | Activatable bispecific antibodies |
| JP6167040B2 (ja) | 2010-11-05 | 2017-07-19 | ザイムワークス，インコーポレイテッド | Ｆｃドメイン中に突然変異を有する、安定したヘテロ二量体抗体の設計 |
| DK3798230T3 (en) * | 2011-06-06 | 2022-10-31 | Novo Nordisk As | Terapeutiske antistoffer |
| CN102250246A (zh) | 2011-06-10 | 2011-11-23 | 常州亚当生物技术有限公司 | 抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体及其应用 |
| LT2771364T (lt) | 2011-10-27 | 2019-09-10 | Genmab A/S | Heterodimerinių baltymų gamyba |
| NZ630551A (en) | 2012-04-20 | 2017-11-24 | Merus Nv | Methods and means for the production of ig-like molecules |
| AU2013285355A1 (en) | 2012-07-06 | 2015-01-29 | Genmab B.V. | Dimeric protein with triple mutations |
| AU2013348570B2 (en) | 2012-11-21 | 2017-01-12 | Pharmabcine Inc. | Dual-target antibody targeting VEGFR-2 and DLL4, and pharmaceutical composition comprising same |
| LT2970456T (lt) | 2013-03-14 | 2021-08-10 | Translate Bio, Inc. | Būdai ir kompozicijos, skirti mrnr koduojamų antikūnų pristatymui |
| ES2967701T3 (es) | 2013-03-15 | 2024-05-03 | Translate Bio Inc | Mejora sinergística de la entrega de ácidos nucleicos mediante formulaciones mezcladas |
| KR20230073341A (ko) | 2013-07-05 | 2023-05-25 | 젠맵 에이/에스 | 인간화 또는 키메라 cd3 항체 |
| CN107847587B (zh) | 2015-05-04 | 2020-10-09 | 阿菲姆德股份有限公司 | Cd30×cd16抗体与pd-1拮抗剂的联合药物 |
| IL310467A (en) * | 2015-07-15 | 2024-03-01 | Genmab As | Human CD3 antibodies or chimeras |
| AU2016377681B2 (en) | 2015-12-22 | 2021-05-13 | Modernatx, Inc. | Compounds and compositions for intracellular delivery of agents |
| EP3397613A1 (en) | 2015-12-30 | 2018-11-07 | Acuitas Therapeutics Inc. | Lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids |
| WO2018006052A1 (en) | 2016-06-30 | 2018-01-04 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Compositions and methods for delivering messenger rna |
| US10526284B2 (en) | 2016-12-21 | 2020-01-07 | Arcturus Therapeutics, Inc. | Ionizable cationic lipid for RNA delivery |
| US20200239579A1 (en) * | 2017-03-09 | 2020-07-30 | Genmab A/S | Antibodies against pd-l1 |
| EP3642229A1 (en) * | 2017-06-21 | 2020-04-29 | Gilead Sciences, Inc. | Multispecific antibodies that target hiv gp120 and cd3 |
| SG11202000198QA (en) | 2017-08-04 | 2020-02-27 | Genmab As | Binding agents binding to pd-l1 and cd137 and use thereof |
| WO2019204522A1 (en) * | 2018-04-17 | 2019-10-24 | Invenra Inc. | Binding molecules |
| EP3856778A1 (en) | 2018-09-24 | 2021-08-04 | The Medical College of Wisconsin, Inc. | System and method for the development of cd30 bispecific antibodies for immunotherapy of cd30+ malignancies |
| CA3142513A1 (en) * | 2019-06-25 | 2020-12-30 | Gilead Sciences, Inc. | Flt3l-fc fusion proteins and methods of use |
-
2022
- 2022-10-06 WO PCT/EP2022/077817 patent/WO2023057571A1/en active Application Filing
- 2022-10-06 US US17/938,523 patent/US11814437B2/en active Active
- 2022-10-06 JP JP2023538860A patent/JP2023551744A/ja active Pending
- 2022-10-06 CA CA3234153A patent/CA3234153A1/en active Pending
- 2022-10-06 AR ARP220102726A patent/AR127298A1/es unknown
- 2022-10-06 TW TW111138087A patent/TW202330610A/zh unknown
- 2022-10-06 AU AU2022361691A patent/AU2022361691A1/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20230132049A1 (en) | 2023-04-27 |
| AU2022361691A1 (en) | 2024-03-28 |
| AR127298A1 (es) | 2024-01-10 |
| US11814437B2 (en) | 2023-11-14 |
| CA3234153A1 (en) | 2023-04-13 |
| WO2023057571A1 (en) | 2023-04-13 |
| JP2023551744A (ja) | 2023-12-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7290013B2 (ja) | Ｐｄ－ｌ１およびｃｄ１３７に結合する結合物質ならびにその使用 | |
| US11939388B2 (en) | Multispecific antibodies against CD40 and CD137 | |
| JP7293121B2 (ja) | Ｐｄ－ｌ１に対する抗体 | |
| CN107660214B (zh) | 针对cd3和cd20的双特异性抗体 | |
| JP2023051968A (ja) | 多重特異的ＮＫｐ４６結合タンパク質 | |
| JP2019513777A (ja) | 免疫療法薬を標的とする多重特異性抗原結合構築物 | |
| CA2952532A1 (en) | Multispecific antigen binding proteins | |
| TW202200624A (zh) | 抗體 | |
| US20230036284A1 (en) | TREATMENT OF CANCER COMPRISING ADMINISTRATION OF Vg9Vd2 T CELL RECEPTOR BINDING ANTIBODIES | |
| US20200325232A1 (en) | Multispecific antigen binding proteins | |
| JP2024501403A (ja) | ガンマ－デルタｔ細胞受容体に結合する抗体 | |
| JP2023530083A (ja) | Ｈｌａ－ｇ及び別の抗原に対して結合特異性を有する二重特異性免疫細胞エンゲージャー | |
| US11814437B2 (en) | Antibodies binding to CD30 and CD3 | |
| US20240132607A1 (en) | Antibodies binding to cd30 and cd3 | |
| CA3234068A1 (en) | Anti-cd3 monoclonal antibodies and therapeutic constructs |