TWI646193B - 抗體恆定區域改變體 - Google Patents
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Abstract
本發明以提供,經由使抗體恆定區域的胺基酸突變而可賦予抗體所希望的醫藥品性質及狀態的恆定區域,以及包含該恆定區域的抗體,作為目的。
本發明人藉由胺基酸序列的突變,成功地提供特別賦予抗體適合作為醫藥品之性質及狀態的恆定區域。根據本發明所提供的恆定區域突變體,透過應用於抗體的製造,明顯地改善異質性(heterogeneity)。亦即,根據本發明所提供的突變,導入抗體的重鏈恆定區域及輕鏈恆定區域,可高度維持抗體的同質性(homogeneity)。更具體地說,可防止因為抗體分子重鏈中的-SS-鍵未鍵結所引起的同質性降低。更者,本發明的較佳實施例中,可改善起因於抗體恆定區域的C端缺失所造成的同質性降低,以及改善抗體的藥物動力。
Description
本發明關於胺基酸序列改變之抗體恆定區域及包含該恆定區域之抗體。
抗體因為在血漿中(血中)安定性高且副作用少,因此作為醫藥品受到矚目。其中,IgG型的抗體藥物多數已上市,也是目前開發的抗體藥物的多數(非專利文獻1、2)。
目前已上市的抗體藥品幾乎為IgG1亞類(subclass)的抗體。IgG1型的抗體可與Fcγ受體結合,可發揮ADCC活性,在作為抗癌抗體醫藥的情形中被認為是有效的。然而,以中和抗原的生物學作用作為目的抗體醫藥中,Fc區域的ADCC等效應物(effector)功能對重要的Fcγ受體的結合,希望排除引起不欲的副作用之可能性(非專利文獻3)。而且已有報導指出,因為Fcγ受體由抗原表現細胞所表現,因此與Fcγ受體結合的分子容易被抗原表現,藉由IgG1的Fc部分與蛋白質或胜肽結合,而增強免疫原性(可使免疫原性增強)(非專利文獻4、專利文獻1)。又在TGN1412的phase 1臨床試驗中發現重大的副作用,其原因之一推測為抗體的Fc部分與Fcγ受體的交互作用(非專利文獻5)。因此,從副作用及免疫原性的觀點考量,以中和抗原的生物學作用作為目的抗體醫藥時,推測不宜與
Fcγ受體結合。
不能完全不與Fcγ受體結合,但降低其結合的方法,考量使IgG抗體的亞型(subtype)由IgG1變為IgG2或IgG4的方法(非專利文獻6)。完全不與Fcγ受體結合的方法,已有報導在Fc區域導入人工突變的方法。例如,抗CD3抗體及抗CD4抗體的抗體效應物功能引起副作用。關於此點,目前進行在Fc區域的Fcγ受體結合部分導入不存在於野生型的胺基酸突變(非專利文獻3、7)之Fcγ受體非結合型的抗CD3抗體及抗CD4抗體的臨床試驗(非專利文獻5、8)。又以IgG1的FcγR結合部位(EU編號第233、234、235、236、327、330、331位)作為IgG2及IgG4的序列,可能製作Fcγ受體非結合型抗體(非專利文獻9、專利文獻2)。但是,這些分子皆以形成自然界不存在的T細胞抗原決定位胜肽之9~12個胺基酸的新胜肽序列出現,有免疫原性風險的考量。至今未有解決此種課題的Fcγ受體非結合型抗體的報告。
抗體C端序列的異質性,已有報導為C端胺基酸的離胺酸(lysine)殘基的缺少、及C端2個胺基酸-甘胺酸(glycine)、離胺酸(lysine)的缺少所造成的C端胺基酸乙醯化(非專利文獻12),希望在醫藥品開發上不存在上述的異質性。
而且,對於一般皮下投予製劑必須為高濃度製劑者,考量IgG型的抗體製劑的情形,從安全性等觀點,一般以約100mg/mL的製劑為限(非專利文獻13),確保高濃度下的安全性為課題。但是,至此未有藉由在恆定區域導入胺基酸置換而改善高濃度下的IgG安定性之報告。另外,也考慮藉由改善
抗體的血中動態而減少投予量本身的方法,以取代高濃度的抗體。延長抗體的血漿中半衰期的方法,已報導恆定區域的胺基酸置換(非專利文獻14、15),但是從免疫原性的風險觀點來看,不宜將自然界不存在的序列導入恆定區域中。
又每當將抗體開發為醫藥品,其蛋白質的物性,尤其同質性極為重要。IgG2的亞型已報導來自樞紐區(hinge region)的雙硫鍵所造成的異質性(非專利文獻10、16、17及18及專利文獻3)。要維持因此造成的目的物質/關聯物質的異質性的製造間差及大量製造成醫藥品是困難的。開發為醫藥品的抗體分子希望儘可能為單一物質。本發明中,異質性的製造間差可理解為,例如製造的單位數量(lot)之間的異質性的差異。製造的單位數量(lot)中的異質性,可藉由測定所製造的抗體分子構造及分子量的多樣性而定量評估。
如此中和抗原的目的抗體醫藥的恆定區域,希望為解決安定性、C端異質性、免疫原性(抗原性)、血中動態、樞紐區的異質性全部之恆定區域序列。特別是,具有較IgG1等天然恆定區域具有更佳的血中動態、且不存在樞紐區的異質性之恆定區域作為抗體醫藥的恆定區域,被認為非常有效。然而,至今未有報導滿足這些所有條件的恆定區域改變體。因此,期望有改善此述課題的抗體恆定區域。
又本發明相關的先前技術文獻如下。
【非專利文獻1】Monoclonal antibody successes in the clinic, Janice M Reichert, Clark J Rosensweig, Laura B
Faden & Matthew C Dewitz, Nature Biotechnology 23, 1073 - 1078 (2005)
【非專利文獻2】Pavlou AK, Belsey MJ., The therapeutic antibodies market to 2008., Eur J Pharm Biopharm. 2005 Apr;59(3):389-96.
【非專利文獻3】Reddy MP, Kinney CA, Chaikin MA, Payne A, Fishman-Lobell J, Tsui P, Dal Monte PR, Doyle ML, Brigham-Burke MR, Anderson D, Reff M, Newman R, Hanna N, Sweet RW, Truneh A. Elimination of Fc receptor- dependent effector functions of a modified IgG4 monoclonal antibody to human CD4. J Immunol. 2000 Feb 15;164(4):1925-33.
【非專利文獻4】Guyre PM, Graziano RF, Goldstein J, Wallace PK, Morganelli PM, Wardwell K, Howell AL. Increased potency of Fc-receptor-targeted antigens. Cancer Immunol Immunother. 1997 Nov-Dec;45(3-4):146- 8.
【非專利文獻5】Strand V, Kimberly R, Isaacs JD. Biologic therapies in rheumatology: lessons learned, future directions. Nat Rev Drug Discov. 2007 Jan;6(1): 75-92.
【非專利文獻6】Gessner JE, Heiken H, Tamm A, schmidt RE. The IgG Fc receptor family. Ann Hematol. 1998 Jun;76(6):231-48.
【非專利文獻7】Cole MS, Anasetti C, Tso JY. Human IgG2 variants of chimeric anti-CD3 are nonmitogenic to T cells. J Immunol. 1997 Oct 1;159(7):3613-21.
【非專利文獻8】Chau LA, Tso JY, Melrose J, Madrenas J. HuM291(Nuvion), a humanized Fc receptor- nonbinding antibody against CD3, anergizes peripheral blood T cells as partial agonist of the T cell receptor. Transplantation. 2001 Apr 15;71(7): 941-50.
【非專利文獻9】Armour KL, Clark MR, Hadley AG, Williamson LM., Recombinant human IgG molecules lacking Fcgamma receptor I binding and monocyte triggering activities. Eur J Immunol. 1999 Aug;29(8): 2613-24.
【非專利文獻10】Chu GC, Chelius D, Xiao G, Khor HK, Coulibaly S, Bondarenko PV. Accumulation of Succinimide in a Recombinant Monoclonal Antibody in Mildly Acidic Buffers Under Elevated Temperatures. Pharm Res. 2007 Mar 24; 24(6):1145-56
【非專利文獻11】A.J. Cordoba, B.J. Shyong, D. Breen, R.J. Harris, Nonenzymatic hinge region fragmentation of antibodies in solution, J. Chromatogr., B, Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 818 (2005) 115-121.
【非專利文獻12】Johnson KA, Paisley-Flango K, Tangarone BS, Porter TJ, Rouse JC. Cation exchange- HPLC and mass spectrometry reveal C-terminal amidation of an IgG1 heavy chain. Anal Biochem. 2007 Jan 1;360(1):75-83.
【非專利文獻13】Shire SJ, Shahrokh Z, Liu J. Challenges in the development of high protein concentration formulations.
J Pharm Sci. 2004 Jun;93(6):1390-402.
【非專利文獻14】Hinton PR, Xiong JM, Johlfs MG, Tang MT, Keller S, Tsurushita N., An engineered human IgG1 antibody with longer serum half-life., J Immunol. 2006 Jan 1;176(1):346-56.
【非專利文獻15】Ghetie V, Popov S, Borvak J, Radu C, Matesoi D, Medesan C, Ober RJ, Ward ES., Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis., Nat Biotechnol. 1997 Jul;15(7):637-40.
【非專利文獻16】
Wypych J, Li M, Guo A, Zhang Z, Martinez T, Allen MJ, Fodor S, Kelner DN, Flynn GC, Liu YD, Bondarenko PV, Ricci MS,Dillon TM, Balland A., Human IgG2 antibodies display disulfide-mediated structural isoforms., J Biol Chem. 2008 Jun 6;283(23):16194-205.
【非專利文獻17】
Dillon TM, Ricci MS, Vezina C, Flynn GC, Liu YD, Rehder DS, Plant M, Henkle B, Li Y, Deechongkit S, Varnum B, Wypych J, Balland A, Bondarenko PV., Structural and functional characterization of disulfide isoforms of the human IgG2 subclass., J Biol Chem. 2008 Jun 6;283(23):16206-15.
【非專利文獻18】
Martinez T, Guo A, Allen MJ, Han M, Pace D, Jones J, Gillespie R, Ketchem RR, Zhang Y, Balland A., Disulfide
connectivity of human immunoglobulin G2 structural isoforms., Biochemistry. 2008 Jul 15;47(28):7496-508
【專利文獻1】US 20050261229A1
【專利文獻2】WO 99/58572
【專利文獻3】US 2006/0194280
鑑於上述之情況,本發明之目的,提供經由使抗體恆定區域的胺基酸改變而可賦予抗體所希望的醫藥品性質及狀態的恆定區域,以及包含該恆定區域及可變區域的抗體。
本發明人以改變抗體恆定區域的胺基酸序列,朝向改善同質性(C端、樞紐區)、免疫原性、安定性及藥物動力的抗體恆定區域的創造,進行研究。結果,本發明人成功地製作同質性、免疫原性、藥物動力及安定性改善之抗體恆定區域。本發明人更進一步基於該恆定區域,更經由改變胺基酸序列,成功地製作對Fcγ受體結合降低的抗體恆定區域。該抗體的恆定區域具有較天然的IgG1恆定區域優良的藥物動力,且樞紐區的異質性也改善的優良恆定區域。
本發明關於經由抗體恆定區域的胺基酸改變,而具有較優良的安全性、免疫原性風險、物性(安定性、同質性)、且較優良的藥物動力、樞紐區異質性的抗體恆定區域;包含該抗體恆定區域之抗體;包含該抗體之醫藥組成物;以及前述之
製造方法。更具體地說,本發明提供下列[1]~[19]。
[1]一抗體恆定區域,具有在序列識別號24(IgG2恆定區域)的胺基酸序列中,第14位(EU編號第131位)的Cys、第16位(EU編號第133位)的Arg、第103位(EU編號第220位)的Cys、第20位(EU編號第137位)的Glu、第21位(EU編號第138位)的Ser、第147位(EU編號第268位)的His、第234位(EU編號第355位)的Arg、及第298位(EU編號第419位)的Gln,置換為其他胺基酸的胺基酸序列。
[2]如[1]記載之抗體恆定區域,其中第14位的Cys置換為Ser,第16位的Arg置換為Lys,第103位的Cys置換為Ser,第20位的Glu置換為Gly,第21位的Ser置換為Gly,第147位的His置換為Gln,第234位的Arg置換為Gln,第298位的Gln置換為Glu。
[3]如[1]或[2]記載之抗體恆定區域,更具有第325位(EU編號第446位)的Gly及第326位(EU編號第447位)的Lys缺失的胺基酸序列。
[4]一抗體恆定區域,具有在序列識別號24(IgG2恆定區域)的胺基酸序列中,第14位(EU編號第131位)的Cys、第16位(EU編號第133位)的Arg、第103位(EU編號第220位)的Cys、第20位(EU編號第137位)的Glu、第21位(EU編號第138位)的Ser、第147位(EU編號第268位)的His、第234位(EU編號第355位)的Arg、第298位(EU編號第419位)的Gln、第209位(EU編號第330位)的Ala、第210位(EU編號第331位)的Pro、第218位(EU編號第339位)的Thr,置換為其他胺基
酸的胺基酸序列。
[5]如[4]記載之抗體恆定區域,其中第14位的Cys置換為Ser,第16位的Arg置換為Lys,第103位的Cys置換為Ser,第20位的Glu置換為Gly,第21位的Ser置換為Gly,第147位的His置換為Gln,第234位的Arg置換為Gln,第298位的Gln置換為Glu,第209位的Ala置換為Ser,第210位的Pro置換為Ser,第218位的Thr置換為Ala。
[6]如[4]或[5]記載之抗體恆定區域,更具有第325位(EU編號第446位)的Gly及第326位(EU編號第447位)的Lys缺失的胺基酸序列。
[7]一抗體,具有[1]~[6]任一項記載之恆定區域。
[8]一醫藥組合物,包含[7]記載之抗體。
[9]一人κ鏈恆定區域,在第102位~第106位的位置中存在至少1個Cys。
[10]一人κ鏈恆定區域,在第107位的位置不存在Cys。
[11]一人κ鏈恆定區域,在第102位~第106位的位置中存在至少1個Cys,且在第107位的位置不存在Cys。
[12]如[9]~[11]記載之人κ鏈恆定區域,在序列識別號32的胺基酸序列中,第1位~第106位的胺基酸至少有1個缺失。
[13]如[12]記載之人κ鏈恆定區域,其中第102位~第106位的胺基酸至少有1個缺失。
[14]如[13]記載之人κ鏈恆定區域,其中第105位的胺基酸缺失。
[15]如[13]記載之人κ鏈恆定區域,其中第106位的胺基
酸缺失。
[16]如[9]記載之人κ鏈恆定區域,在第102位~第106位的胺基酸至少1個置換為Cys。
[17]如[9]~[11]任一項記載之人κ鏈恆定區域,在第102位~第106位的胺基酸至少1個置換為Cys,且第107位的Cys置換為其他胺基酸或缺失。
[18]一抗體,具有如[9]~[17]任一項記載之人κ鏈恆定區域。
[19]一醫藥組合物,包含如[18]記載之抗體。
[20]一抗體,包含如[1]~[6]任一項記載之重鏈恆定區域及[9]~[17]任一項記載之輕鏈恆定區域。
[21]一醫藥組合物,包含如[20]記載之抗體。
本發明提供將抗體作為醫藥品可賦予所希望的性質及狀態之恆定區域。本發明之恆定區域藉由胺基酸序列的改變,可將抗體的下列性質及狀態,改良為作為醫藥品之適宜狀態。
*抗體異質性的降低:
使編碼某胺基酸序列之DNA表現而得的多胜肽,理論上應成為由相同的胺基酸序列所構成的同質的多胜肽分子。但是當編碼抗體的DNA以適當宿主表現的情形,實際上有多種因素產生結構不同的異質多胜肽。在抗體的製造中,由多種異質多胜肽所構成的抗體集團,可說是異質性高。本發明的恆定區域藉由胺基酸序列的改變去除造成異質性的因素。因此以本發
明的恆定區域構成抗體,可製造異質性低的抗體。換句話說,將本發明所提供的改變導入抗體的重鏈恆定區域,可增加及維持抗體的同質性。抑制抗體的異質性意味著改善異質性,為醫藥品品質維持的重要課題。因此,本發明的恆定區域對包含抗體的醫藥品品質的維持具有貢獻。
*藥物動力的提升:
本發明的較佳實施例,對抗體的藥物動力提升具有貢獻。具體地說,本發明中的抗體恆定區域加入特定的胺基酸殘基的改變時,以此恆定區域所構成的抗體,相較於胺基酸序列未改變者,血中濃度維持連續長的時間。儘可能長時間維持血中濃度者表示,抗體作為醫藥品投予時,以較少量的抗體可維持連續長期的治療效果。或者,抗體的投予間隔延長,投予次數減少。
第1圖顯示IL6R H0-IgG1/L0-k0、IL6R H0-IgG1△K/L0-k0及IL6R H0-IgG1△GK/L0-k0經陽離子交換層析法,對C端所造成的異質性進行評價的結果。圖中,縱座標為280nm的吸光度,橫座標為溶出時間(分)。
第2圖顯示IL6R H0-IgG1/L0-k0及IL6R H0-IgG2/L0-k0經陽離子交換層析法,對雙硫鍵的結合所造成的異質性進行評價的結果。圖中,縱座標為280nm的吸光度,橫座標為溶出時間(分)。
第3圖顯示IgG型抗體及其樞紐區週邊構造(重鏈(H鏈)、
輕鏈(L鏈)的配置及兩者間的雙硫鍵結合)之詳細(此詳細圖為IgG1-k0圖)。
第4圖顯示恆定區域IgG1-k0及IgG2-k0的樞紐區週邊預想的雙硫鍵結合模式。IgG2-k0中推測的各種雙硫鍵結合模式以粗虛線表示。
第5圖顯示恆定區域IgG1-k0及IgG4-k0的樞紐區週邊預想的雙硫鍵結合模式。IgG1-k0及IgG4-k0中連結H鏈及L鏈的雙硫鍵結合模式不同。
第6圖顯示恆定區域SC-k0及CS-k0的樞紐區週邊預測的雙硫鍵結合模式。SC-k0及CS-k0中推測的各種雙硫鍵結合模式以粗虛線表示。
第7圖顯示恆定區域SKSC-k0及M58-k0的樞紐區週邊預測的雙硫鍵結合模式。
第8圖顯示IL6R H0-IgG1/L0-k0、IL6R H0-IgG2/L0-k0、IL6R H0-SC/L0-k0、IL6R H0-CS/L0-k0、IL6R H0-SKSC/L0-k0及IL6R H0-M58/L0-k0經陽離子交換層析法,對雙硫鍵結合的差異所造成的異質性進行評價的結果。圖中,縱座標為280nm的吸光度,橫座標為溶出時間(分)。
第9圖顯示IL6R H0-IgG1/L0-k0、IL6R H0-IgG2/L0-k0、IL6R H0-SC/L0-k0、IL6R H0-CS/L0-k0、IL6R H0-SKSC/L0-k0及IL6R H0-M58/L0-k0經示差掃描量熱儀(DSC)測定的變性曲線。
第10圖顯示抗IL-6受體抗體、抗IL-31受體抗體及抗RANKL抗體中,恆定區域從IgG2-k0變換至M58-k0,而大幅
改善異質性。圖中,縱座標為280nm的吸光度,橫座標為溶出時間(分)。
第11圖顯示以1mg/kg的IL6R H0-IgG1/L0-k0及IL6R H0-M58/L0-k0投予人FcRn轉殖基因鼠時抗體的血漿中濃度變化。圖中,縱座標為抗體的血漿濃度(μg/ml),橫座標為投予後經過的時間(日)。投予的抗體為IL6R H0-IgG1/L0-k0(◆;恆定區域未改變之抗體)、及IL6R H0-M58/L0-k0(◇;恆定區域改變之抗體)。
第12圖顯示恆定區域M58-k0及M66-k0的樞紐週邊預想的雙硫鍵結合模式。
第13圖顯示以1mg/kg的IL6R H0-IgG1/L0-k0、IL6R H0-M58/L0-k0及IL6R H0-M66/L0-k0投予人FcRn轉殖基因鼠時抗體的血漿中濃度變化。圖中,縱座標為抗體的血漿濃度(μg/ml),橫座標為投予後的時間(日)。投予的抗體為IL6R H0-IgG1/L0-k0(◆;恆定區域未改變之抗體)、IL6R H0-M58/L0-k0(◇;恆定區域改變之抗體)、及IL6R H0-M66/L0-k0(●;恆定區域改變之抗體)。
第14圖顯示IL6R H0-IgG1/L0-k0、IL6R H0-IgG2/L0-k0、IL6R H0-M58/L0-k0及IL6R H0-M66/L0-k0經陽離子交換層析法,對雙硫鍵結合的差異所造成的異質性進行評價的結果。圖中,縱座標為280nm的吸光度,橫座標為溶出時間(分)。
第15圖顯示恆定區域M66-k0中預想的2種雙硫鍵結合模式。
第16圖顯示恆定區域M66-k0、M66-k3及M66-k4預想的
樞紐週邊的雙硫鍵結合模式。相當於M66的2個峰的雙硫鍵以粗虛線表示。
第17圖顯示IL6R H0-IgG1/L0-k0、IL6R H0-IgG2/L0-k0、IL6R H0-M58/L0-k0、IL6R H0-M66/L0-k0、IL6R H0-M66/L0-k3及IL6R H0-M66/L0-k4經陽離子交換層析法,對雙硫鍵結合的差異所造成的異質性進行評價的結果。圖中,縱座標為280nm的吸光度,橫座標為溶出時間(分)。
第18圖顯示IL6R H0-IgG1/L0-k0、IL6R H0-IgG2/L0-k0、IL6R H0-M106/L0-k0、IL6R H0-M106/L0-k3及IL6R H0-M106/L0-k4經陽離子交換層析法,對雙硫鍵結合的差異所造成的異質性進行評價的結果。圖中,縱座標為280nm的吸光度,橫座標為溶出時間(分)。
第19圖顯示H0-IgG1/L0-k0、H0-IgG2/L0-k0、H0-M106/L0-k3對各種Fcγ受體的結合。
第20圖顯示IL6R H0-IgG1/L0-k0、IL6R H0-IgG2/L0-k0及IL6R H0-IgG2/L0-k3經陽離子交換層析法,對雙硫鍵結合的差異所造成的異質性進行評價的結果。圖中,縱座標為280nm的吸光度,橫座標為溶出時間(分)。
第21圖顯示以1mg/kg的IL6R H0-M66/L0-k0、IL6R H0-M66/L0-k3、IL6R H0-M106/L0-k3及IL6R H0-IgG2/L0-k3投予人FcRn轉殖基因鼠時抗體的血漿中濃度變化。圖中,縱座標為抗體的血漿濃度(μg/ml),橫座標為投予後的時間(日)。
本發明提供胺基酸序列改變的抗體恆定區域、包
含該恆定區域之抗體、包含該抗體之醫藥組合物、以及前述之製造方法。
抗體的重鏈恆定區域中存在IgG1、IgG2、IgG3、IgG4型的恆定區域。本發明中沒有特別限定,但重鏈恆定區域較佳為人的重鏈恆定區域。又本發明中特別以人IgG2的恆定區域為佳。人IgG2的恆定區域的胺基酸序列為公知(序列識別號24)。作為IgG2的恆定區域,基因多型性的複數個同種異型(allotype)序列已記載於Sequences of proteins of immunological interest,NIH Publication No.91-3242,本發明中也可為其所述的任一者。
又抗體的輕鏈恆定區域中存在κ鏈及λ鏈型的恆定區域。本發明中沒有特別限定,但輕鏈恆定區域為人的輕鏈恆定區域。又本發明中較佳為人的κ鏈恆定區域。人的κ鏈恆定區域為公知(序列識別號32)。作為人的κ鏈恆定區域及人的λ鏈恆定區域,基因多型性的複數個同種異型(allotype)序列已記載於Sequences of proteins of immunological interest,NIH Publication No.91-3242,本發明中也可為其所述的任一者。
而且本發明之胺基酸突變(置換(取代)、缺失、增加及/或***)的抗體恆定區域,限於包含本發明之胺基酸改變者,也可包含其他胺基酸的改變及修飾者。
具體地說,包含下列改變的恆定區域皆包含於本發明中。
*對序列識別號24(人IgG2的恆定區域)的胺基酸序列根據本發明導入改變。
*對已改變的序列識別號24(人IgG2的恆定區域)的胺基
酸序列,根據本發明導入改變。
*對序列識別號24(人IgG2的恆定區域)的胺基酸序列根據本發明導入改變,更導入額外的改變。
同樣地,包含下列改變的恆定區域也包含於本發明。
*對序列識別號32(人的κ鏈恆定區域)的胺基酸序列,根據本發明導入改變。
*對已改變的序列識別號32(人的κ鏈恆定區域)的胺基酸序列,根據本發明導入改變。
*對序列識別號32(人的κ鏈恆定區域)的胺基酸序列,根據本發明導入改變,更導入額外的改變。
同樣地,包含下列改變的恆定區域也包含於本發明。
*對序列識別號37(人的λ鏈恆定區域)的胺基酸序列,根據本發明導入改變。
*對已改變的序列識別號37(人的λ鏈恆定區域)的胺基酸序列,根據本發明導入改變。
*對序列識別號37(人的λ鏈恆定區域)的胺基酸序列,根據本發明導入改變,更導入額外的改變。
又恆定區域以糖鏈結合的情形時,結合的糖鏈可以任何的構造。例如EU編號第297位的糖鏈可為任何的糖鏈構造(較佳為炭藻糖(fucosyl)化的糖鏈),或者不以糖鏈結合也可(例如可能為大腸菌所生產者)。
<胺基酸改變的IgG2恆定區域及包含該恆定區域
之抗體>
本發明提供安全性、異質性、免疫原性及/或藥物動力改善的重鏈恆定區域。本發明又提供包含該重鏈恆定區域之抗體。
更具體地提供,在具有序列識別號24記載之胺基酸序列的重鏈恆定區域(IgG2恆定區域)中,第14位(EU編號第131位)的Cys、第16位(EU編號第133位)的Arg、第103位(EU編號第220位)的Cys、第20位(EU編號第137位)的Glu、第21位(EU編號第138位)的Ser、第147位(EU編號第268位)的His、第234位(EU編號第355位)的Arg、及第298位(EU編號第419位)的Gln,置換為其他胺基酸的胺基酸序列之重鏈恆定區域,及包含該重鏈恆定區域之抗體。
置換後的胺基酸無特別限制,但較佳為第14位的Cys置換為Ser,第16位的Arg置換為Lys,第103位的Cys置換為Ser,第20位的Glu置換為Gly,第21位的Ser置換為Gly,第147位的His置換為Gln,第234位的Arg置換為Gln,第298位的Gln置換為Glu者。
藉由此述之置換,可改善抗體的安定性、免疫原性及/或藥物動力。特別是藉由前述之置換可提供具有較IgG1更優良的藥物動力,且安定性、免疫原性皆優良的重鏈恆定區域,及包含該重鏈恆定區域的抗體。
本發明所提供的重鏈恆定區域可進行至少上述的胺基酸置換,也可同時進行其他胺基酸的改變(置換、缺失、增加及/或***等)及修飾。
再者,本發明藉由在上述重鏈恆定區域中更增加胺基酸的置換,提供對Fcγ受體結合降低的重鏈恆定區域。本發明提供包含該重鏈恆定區域之抗體。
更具體地提供,在具有序列識別號24的胺基酸序列之重鏈恆定區域(IgG2恆定區域)中,第14位(EU編號第131位)的Cys、第16位(EU編號第133位)的Arg、第103位(EU編號第220位)的Cys、第20位(EU編號第137位)的Glu、第21位(EU編號第138位)的Ser、第147位(EU編號第268位)的His、第234位(EU編號第355位)的Arg、第298位(EU編號第419位)的Gln、第209位(EU編號第330位)的Ala、第210位(EU編號第331位)的Pro、第218位(EU編號第339位)的Thr,置換為其他胺基酸的胺基酸序列的重鏈恆定區域,及包含該重鏈恆定區域之抗體。
置換後的胺基酸沒有特別限定,但以第14位的Cys置換為Ser,第16位的Arg置換為Lys,第103位的Cys置換為Ser,第20位的Glu置換為Gly,第21位的Ser置換為Gly,第147位的His置換為Gln,第234位的Arg置換為Gln,第298位的Gln置換為Glu,第209位的Ala置換為Ser,第210位的Pro置換為Ser,第218位的Thr置換為Ala者為佳。
藉由此述之置換,可改善抗體的安定性、免疫原性及/或藥物動力。
本發明所提供的重鏈恆定區域可進行至少上述的胺基酸置換,也可同時進行其他胺基酸的改變(置換、缺失、增加及/或***等)及修飾。
再者,本發明提供,在上述任一重鏈恆定區域中,更具有第325位(EU編號第446位)的Gly及第326位(EU編號第447位)的Lys缺失的胺基酸序列之重鏈恆定區域,及包含該重鏈恆定區域之抗體。藉由前述之胺基酸缺失可改善C端的異質性。
進行此述之胺基酸改變的重鏈恆定區域的具體例,如具有序列識別號30之胺基酸序列的重鏈恆定區域(M66),或具有序列識別號31之胺基酸序列的重鏈恆定區域(M106)。
前述之重鏈恆定區域為具有對Fcγ受體結合活性降低、免疫原性風險降低、樞紐區的異質性降低、C端的異質性降低、及/或藥物動力提升之性質的理想重鏈恆定區域。
再者,本發明中,除了前述胺基酸的改變,可更增加改善酸性中安定性之胺基酸的改變。
改善在酸性中安定性之胺基酸改變的具體例,如在具有序列識別號24之胺基酸序列的IgG2恆定區域中,第276位(EU編號第397號)的Met置換為其他胺基酸者。其他的胺基酸沒有特別限定,但較佳為Val。藉由使序列識別號24記載之胺基酸序列中,第276位(EU編號第397號)的Met置換為其他胺基酸,可提高抗體在酸性條件下的安定性。
<胺基酸改變的κ鏈恆定區域及包含該κ鏈恆定區域之抗體>
再者,本發明提供為了改善樞紐區的異質性之可能的輕鏈恆定區域。本發明又提供包含該輕鏈恆定區域之抗體。
更具體地提供,在人κ鏈恆定區域中第102位~第106位的位置中存在至少1個Cys之人κ鏈恆定區域,及包含該人κ鏈恆定區域之抗體。例如在具有序列識別號32之胺基酸序列的人κ鏈中,第102位~第106位中存在至少1個Cys,表示在第102位的Phe~第106位的Glu的位置中存在至少1個Cys。
人κ鏈中的第102位~第106位所包含的Cys數目沒有特別限定,但為5個以下,較佳為3個以下,更佳為2個以下,再更佳為1個。
Cys存在的位置沒有特別限制,但是較佳為第104位、第105位、或第106位,更佳為第105位或第106位,特別佳為第106位。
人κ鏈的第102位~第106位中存在至少1個Cys的人κ鏈恆定區域中,該恆定區域所含的胺基酸數目沒有特別限制,但較佳為102個~107個胺基酸,更佳為105個~106個胺基酸,再更佳為106個胺基酸。
製作在第102位~第106位的位置中存在至少1個Cys的人κ鏈恆定區域之方法,沒有特別限制,但可例如下列的方法。也可組合下列之***、置換、缺失。
.第102位~第106位的位置中***至少1個Cys。
.第102位~第106位的胺基酸至少1個以Cys置換。
.第1位~第106位的胺基酸有1~5個胺基酸缺失。
再者,本發明提供在人κ鏈恆定區域中,第107位的位置不存在Cys之人κ鏈恆定區域,及包含該人κ鏈恆定區域之抗體。例如,在具有序列識別號32之胺基酸序列的人κ
鏈中第107位不存在Cys,表示第107位的Cys缺失、置換為其他胺基酸、***其他胺基酸、移到其他位置等。較佳的人κ鏈恆定區域,可列舉為第107位的Cys缺失、移到其他位置、或置換為其他胺基酸的人κ鏈恆定區域。
本發明之人κ鏈恆定區域的較佳態樣可列舉為,在人κ鏈恆定區域中第102位~第106位的位置存在至少1個Cys,且在第107位的位置不存在Cys的人κ鏈恆定區域。
此述之人κ鏈恆定區域的較佳例,可列舉如第1位~第106位的胺基酸之至少1個缺失的人κ鏈恆定區域。例如具有序列識別號32之胺基酸序列的人κ鏈恆定區域中,第106位的Glu缺失的情形,第107位的Cys移動至第106位,因此形成第106位存在Cys、第107位不存在Cys的人κ鏈恆定區域。胺基酸缺失的部位沒有特別限定,較佳在第102位~第106位的胺基酸的至少1個缺失者,更佳為第105位或第106位的胺基酸缺失者。
又缺失的胺基酸數目沒有特別限制,但通常為1~5個,較佳為1~3個,更佳為1個或2個,更佳可為1個胺基酸缺失。
此述人κ鏈恆定區域之較佳例,可列舉第105位的胺基酸缺失之人κ鏈恆定區域,或第106位的胺基酸缺失之人κ鏈恆定區域。
上述人κ鏈恆定區域的其他較佳態樣,例如第102位~第106位的胺基酸之至少1個置換為Cys,且第107位的Cys缺失或置換為其他胺基酸之人κ鏈恆定區域。置換為Cys
的胺基酸數目沒有特別限定,通常為1~5個,較佳為1~3個,更佳為1個或2個,再更佳為1個。
置換為Cys的部位沒有特別限定,但較佳的置換部位可例如第105位或第106位。
此述之人κ鏈恆定區域的較佳例,例如第105位的Gly置換為Cys,且第107位的Cys缺失或置換為其他胺基酸之人κ鏈恆定區域,或者,第106位的Glu置換為Cys,且第107位的Cys缺失或置換為其他胺基酸之人κ鏈恆定區域。本發明之人κ鏈恆定區域的具體例,可列舉具有序列識別號33(k3)之胺基酸序列的人κ鏈恆定區域,或具有序列識別號34(k4)之胺基酸序列的人κ鏈恆定區域。
本發明之人κ鏈恆定區域,除了上述胺基酸的改變以外,也可進行其他的胺基酸改變。只要進行上述的胺基酸改變,再進行其他胺基酸的改變及修飾之人κ鏈恆定區域,也包含於本發明之人κ鏈恆定區域。
經由使用本發明之人κ鏈恆定區域,可減少樞紐區的異質性。特別是,如具有序列識別號30(M66)或序列識別號31(M106)之胺基酸序列的重鏈恆定區域,只有EU編號219或EU編號220之其中一個為Cys之重鏈恆定區域(例如只有EU編號219為Cys之重鏈恆定區域)與本發明之κ鏈恆定區域組合,具有效果。
<胺基酸改變的λ鏈恆定區域及包含該λ鏈恆定區域之抗體>
再者,本發明提供為了改善樞紐區的異質性之可能的輕鏈
恆定區域。本發明又提供包含該輕鏈恆定區域之抗體。
更具體地提供,在人λ鏈恆定區域中第99位~第103位的位置中存在至少1個Cys之人λ鏈恆定區域,及包含該人λ鏈恆定區域之抗體。例如在具有序列識別號37之胺基酸序列的人λ鏈中,第99位~第103位的位置中存在至少1個Cys,表示在第99位的Val~第103位的Glu的位置存在至少1個Cys。
人λ鏈的第99位~第103位所包含的Cys數目沒有特別限定,但為5個以下,較佳為3個以下,更佳為2個以下,再更佳為1個。
Cys存在的位置沒有特別限制,但是較佳為第101位、第102位、或第103位,更佳為第102位或第103位,特別佳為第103位。
人λ鏈的第99位~第103位存在至少1個Cys的人λ鏈恆定區域中,該恆定區域所含的胺基酸數目沒有特別限制,但較佳為100個~103個胺基酸,更佳為102個~103個胺基酸,再更佳為103個胺基酸。
製作在第99位~第103位的位置存在至少1個Cys的人λ鏈恆定區域之方法,沒有特別限制,但可例如下列的方法。也可組合下列之***、置換、缺失。
.第99位~第103位的位置***至少1個Cys。
.第99位~第103位的胺基酸之至少1個以Cys置換。
.第1位~第103位的胺基酸有1~5個胺基酸缺失。
再者,本發明提供在人λ鏈恆定區域中,第104位的位置不存在Cys之人λ鏈恆定區域,及包含該人λ鏈恆定
區域之抗體。例如,在具有序列識別號37之胺基酸序列的人λ鏈中第104位不存在Cys,表示第104位的Cys缺失、置換為其他胺基酸、其他胺基酸***、移到其他位置等。較佳的人λ鏈恆定區域,可列舉為第104位的Cys缺失、移到其他位置、或置換為其他胺基酸的人λ鏈恆定區域。
本發明之人λ鏈恆定區域的較佳態樣可列舉為,在人λ鏈恆定區域中第99位~第103位的位置存在至少1個Cys,且在第104位的位置不存在Cys的人λ鏈恆定區域。
此述之人λ鏈恆定區域的較佳例,可列舉如第1位~第103位的胺基酸之至少1個缺失的人λ鏈恆定區域。例如具有序列識別號37之胺基酸序列的人λ鏈恆定區域中,第103位的Glu缺失的情形,第104位的Cys移動至第103位,因此形成第103位存在Cys、第104位不存在Cys的人λ鏈恆定區域。胺基酸缺失的部位沒有特別限定,較佳在第99位~第103位的胺基酸之至少1個缺失,更佳為第102位或第103位的胺基酸缺失。
又缺失的胺基酸數目沒有特別限制,但通常為1~5個,較佳為1~3個,更佳為1個或2個,更佳可為1個胺基酸缺失。
此述人λ鏈恆定區域之較佳例,可列舉第102位的胺基酸缺失之人λ鏈恆定區域,或第103位的胺基酸缺失之人λ鏈恆定區域。
上述人λ鏈恆定區域的其他較佳態樣,例如第99位~第103位的胺基酸之至少1個置換為Cys,且第104位的
Cys缺失或置換為其他胺基酸之人λ鏈恆定區域。置換為Cys的胺基酸數目沒有特別限定,通常為1~5個,較佳為1~3個,更佳為1個或2個,再更佳為1個。
置換為Cys的部位沒有特別限定,但較佳的置換部位可例如第102位或第103位。
此述之人λ鏈恆定區域的較佳例,例如第102位的Thr置換為Cys,且第104位的Cys缺失或置換為其他胺基酸之人λ鏈恆定區域,或者,第103位的Glu置換為Cys,且第104位的Cys缺失或置換為其他胺基酸之人λ鏈恆定區域。本發明之人λ鏈恆定區域的具體例,可列舉具有序列識別號38之胺基酸序列的人λ鏈恆定區域,或具有序列識別號39之胺基酸序列的人λ鏈恆定區域。
本發明之人λ鏈恆定區域,除了上述胺基酸的改變以外,也可進行其他的胺基酸改變。只要進行上述的胺基酸改變,再進行其他胺基酸的改變及修飾之人λ鏈恆定區域也包含於本發明之人λ鏈恆定區域。
經由使用本發明之人λ鏈恆定區域,可減少樞紐區的異質性。特別是,如具有序列識別號30(M66)或序列識別號31(M106)之序列的重鏈恆定區域,只有EU編號219或EU編號220之其中一個為Cys之重鏈恆定區域(例如只有EU編號219為Cys之重鏈恆定區域)與本發明之λ鏈恆定區域組合,具有效果。
再者,雖不拘於特定理論,但使用本發明的人κ鏈恆定區域或人λ鏈恆定區域而降低樞紐區的異質性之理由,
以κ鏈為例,下述的考量也是可能的
如第15圖所示,在人κ鏈恆定區域的第107位的位置之半胱胺酸(Cys),可與抗體中所含的2個H鏈之EU編號第219位的半胱胺酸(Cys),形成雙硫鍵。此2種雙硫鍵的存在,考量產生樞紐區的異質性。
另一方面,本發明之人κ鏈恆定區域之半胱胺酸(Cys)的位置向N端移動,此半胱胺酸(Cys)與一邊的H鏈EU編號第219位的半胱胺酸(Cys)距離變遠,與2個H鏈中另一邊的H鏈EU編號第219位的半胱胺酸(Cys)無法形成雙硫鍵。此結果考量降低了樞紐區的異質性(第16圖)。因此,人κ鏈恆定區域的半胱胺酸(Cys)與一邊的H鏈EU編號第219位的半胱胺酸(Cys)的距離變遠,考量可減輕樞紐區的異質性。根據相同方法,人λ鏈恆定區域中,也由於與一邊的H鏈EU編號第219位的半胱胺酸(Cys)的距離變遠,考量可減輕樞紐區的異質性。
<來自人以外的動物之κ鏈恆定區域及包含該κ鏈恆定區域之抗體>
再者,本發明的輕鏈恆定區域的改變,也可以來自人以外的動物之輕鏈恆定區域作為對象。來自人以外的動物之輕鏈恆定區域,例如小鼠抗體的κ鏈恆定區域(序列識別號40)、大鼠抗體的κ鏈恆定區域(序列識別號41)、兔抗體的κ鏈恆定區域(序列識別號42或43)等,但不限於此。
因此,本發明提供在小鼠抗體κ鏈恆定區域或大鼠抗體κ鏈恆定區域中,第102位~第106位的位置中存在至少1個Cys之小鼠抗體κ鏈恆定區域或大鼠抗體κ鏈恆定區
域,及包含該恆定區域之抗體。例如在具有序列識別號40之胺基酸序列的小鼠抗體κ鏈恆定區域或具有序列識別號41之胺基酸序列的大鼠抗體κ鏈恆定區域中,第102位~第106位中存在至少1個Cys,表示在第102位的Phe~第106位的Glu的位置中存在至少1個Cys。
又本發明提供在兔抗體κ鏈恆定區域(序列識別號42)中,第99位~第103位的位置中存在至少1個Cys之兔κ鏈恆定區域,及包含該兔κ鏈恆定區域之抗體。例如在具有序列識別號42之胺基酸序列的兔κ鏈恆定區域中,第99位~第103位中存在至少1個Cys,代表在第99位的Phe~第103位的Asp的位置中存在至少1個Cys。
又本發明提供在兔抗體κ鏈恆定區域(序列識別號43)中,第101位~第105位的位置中存在至少1個Cys之兔κ鏈恆定區域,及包含該兔κ鏈恆定區域之抗體。例如在具有序列識別號43之胺基酸序列的兔κ鏈恆定區域中,第101位~第105位中存在至少1個Cys,代表在第101位的Phe~第105位的Asp的位置中存在至少1個Cys。
小鼠κ鏈恆定區域的第102位~第106位、大鼠κ鏈恆定區域的第102位~第106位、兔κ鏈恆定區域(序列識別號42)的第99位~第103位、或兔κ鏈恆定區域(序列識別號43)的第101位~第105位所包含的Cys數目沒有特別限定,但為5個以下,較佳為3個以下,更佳為2個以下,再更佳為1個。
又Cys存在的位置沒有特別限制,但是當小鼠κ
鏈恆定區域或大鼠κ鏈恆定區域的情形,較佳為第104位、第105位、或第106位,更佳為第105位或第106位,特別佳為第106位。
當為兔κ鏈恆定區域(序列識別號42)的情形,較佳為第101位、第102位、或第103位,更佳為第102位或第103位,特別佳為第103位。
當為兔κ鏈恆定區域(序列識別號43)的情形,較佳為第103位、第104位、或第105位,更佳為第104位或第105位,特別佳為第105位。
此述之κ鏈恆定區域中,該恆定區域所含的胺基酸數目沒有特別限制,但當小鼠κ鏈恆定區域或大鼠κ鏈恆定區域的情形,較佳為102個~107個胺基酸,更佳為105個~106個胺基酸,再更佳為106個胺基酸。
又當為兔κ鏈恆定區域(序列識別號42)的情形,較佳為99個~104個胺基酸,更佳為102個~103個胺基酸,再更佳為103個胺基酸。
又當為兔κ鏈恆定區域(序列識別號43)的情形,較佳為101個~106個胺基酸,更佳為104個~105個胺基酸,再更佳為105個胺基酸。
製作在第102位~第106位的位置中存在至少1個Cys的小鼠或大鼠κ鏈恆定區域之方法,沒有特別限制,但可例如下列的方法。也可組合下列之***、置換、缺失。
.第102位~第106位的位置中***至少1個Cys。
.第102位~第106位的胺基酸之至少1個以Cys置換。
.第1位~第106位的胺基酸有1~5個胺基酸缺失。
製作在第99位~第103位的位置中存在至少1個Cys的兔κ鏈恆定區域之方法,沒有特別限制,但可例如下列的方法。也可組合下列之***、置換、缺失。
.第99位~第103位的位置中***至少1個Cys。
.第99位~第103位的胺基酸之至少1個以Cys置換。
.第1位~第103位的胺基酸有1~5個胺基酸缺失。
製作在第101位~第105位的位置中存在至少1個Cys的兔κ鏈恆定區域之方法,沒有特別限制,但可例如下列的方法。也可組合下列之***、置換、缺失。
.第101位~第105位的位置中***至少1個Cys。
.第101位~第105位的胺基酸之至少1個以Cys置換。
.第1位~第105位的胺基酸有1~5個胺基酸缺失。
再者,本發明提供在小鼠κ鏈恆定區域或大鼠κ鏈恆定區域中,第107位的位置不存在Cys之小鼠κ鏈恆定區域或大鼠κ鏈恆定區域,及包含該κ鏈恆定區域之抗體。例如,在具有序列識別號40之胺基酸序列的小鼠κ鏈恆定區域或具有序列識別號41之胺基酸序列的大鼠κ鏈恆定區域中,第107位不存在Cys,表示第107位的Cys缺失、置換為其他胺基酸、其他胺基酸***、移到其他位置等。較佳的κ鏈恆定區域,可列舉為第107位的Cys缺失、移到其他位置、或置換為其他胺基酸的κ鏈恆定區域。
本發明之κ鏈恆定區域的較佳態樣,例如κ鏈恆定區域中第102位~第106位的位置存在至少1個Cys,且第107位的
位置不存在Cys的κ鏈恆定區域。
此述之κ鏈恆定區域的較佳例,可列舉如第1位~第106位的胺基酸之至少1個缺失的κ鏈恆定區域。例如具有序列識別號40或41之胺基酸序列的κ鏈恆定區域中,第106位的Glu缺失的情形,第107位的Cys移動至第106位,因此形成第106位存在Cys、第107位不存在Cys的κ鏈恆定區域。胺基酸缺失的部位沒有特別限定,較佳在第102位~第106位的胺基酸的至少1個缺失者,更佳為第105位或第106位的胺基酸缺失者
又缺失的胺基酸數目沒有特別限制,但通常為1~5個,較佳為1~3個,更佳為1個或2個,更佳可為1個胺基酸缺失。
此述κ鏈恆定區域之較佳例,可列舉第105位的胺基酸缺失之κ鏈恆定區域,或第106位的胺基酸缺失之κ鏈恆定區域。
又上述之第107位的位置不存在Cys的小鼠κ鏈恆定區域或大鼠的κ鏈恆定區域的其他較佳態樣,例如第102位~第106位的胺基酸之至少1個置換為Cys,且第107位的Cys缺失或置換為其他胺基酸之κ鏈恆定區域。置換為Cys的胺基酸數目沒有特別限定,通常為1~5個,較佳為1~3個,更佳為1個或2個,再更佳為1個。
置換為Cys的部位沒有特別限定,但較佳的置換部位可例如第105位或第106位。
此述之κ鏈恆定區域的較佳例,例如第105位的Asn置換為Cys,且第107位的Cys缺失或置換為其他胺基酸之人κ鏈恆定區域,或者,第106位的Glu置換為Cys,且第107位的
Cys缺失或置換為其他胺基酸之κ鏈恆定區域。
本發明之小鼠κ鏈恆定區域或大鼠κ鏈恆定區域,除了上述胺基酸的改變以外,也可進行其他的胺基酸改變。只要進行上述的胺基酸改變,再進行其他胺基酸的改變及修飾之κ鏈恆定區域也包含於本發明之κ鏈恆定區域。
再者,本發明提供在兔κ鏈恆定區域(序列識別號42)中,第104位的位置不存在Cys之兔κ鏈恆定區域,及包含該κ鏈恆定區域之抗體。例如,在具有序列識別號42之胺基酸序列的兔κ鏈恆定區域中第104位不存在Cys,表示第104位的Cys缺失、置換為其他胺基酸、其他胺基酸***、移到其他位置等。較佳的κ鏈恆定區域,可列舉為第104位的Cys缺失、移到其他位置、或置換為其他胺基酸的κ鏈恆定區域。
本發明之κ鏈恆定區域的較佳態樣可列舉為,在κ鏈恆定區域中第99位~第103位的位置存在至少1個Cys,且在第104位的位置不存在Cys的κ鏈恆定區域。
此述之κ鏈恆定區域的較佳例,可列舉如第1位~第103位的胺基酸之至少1個缺失的κ鏈恆定區域。例如具有序列識別號42之胺基酸序列的κ鏈恆定區域中,第103位的Asp缺失的情形,第104位的Cys移動至第103位,因此形成第103位存在Cys、第104位不存在Cys的κ鏈恆定區域。胺基酸缺失的部位沒有特別限定,較佳在第99位~第103位的胺基酸的至少1個缺失,更佳為第102位或第103位的胺基酸缺失。
又缺失的胺基酸數目沒有特別限制,但通常為1~5個,較佳為1~3個,更佳為1個或2個,更佳可為1個胺基酸缺失。
此述κ鏈恆定區域之較佳例,可列舉第102位的胺基酸缺失之κ鏈恆定區域,或第103位的胺基酸缺失之κ鏈恆定區域。
又上述第104位的位置不存在Cys的兔κ鏈恆定區域的其他較佳態樣,例如第99位~第103位的胺基酸之至少1個置換為Cys,且第104位的Cys缺失或置換為其他胺基酸之κ鏈恆定區域。置換為Cys的胺基酸數目沒有特別限定,通常為1~5個,較佳為1~3個,更佳為1個或2個,再更佳為1個。
置換為Cys的部位沒有特別限定,但較佳的置換部位可例如第102位或第103位。
此述之κ鏈恆定區域的較佳例,例如第102位的Gly置換為Cys,且第104位的Cys缺失或置換為其他胺基酸之人κ鏈恆定區域,或者,第103位的Asp置換為Cys,且第104位的Cys缺失或置換為其他胺基酸之κ鏈恆定區域。
本發明之兔κ鏈恆定區域,除了上述胺基酸的改變以外,也可進行其他的胺基酸改變。只要進行上述的胺基酸改變,再進行其他胺基酸的改變及修飾之κ鏈恆定區域也包含於本發明之κ鏈恆定區域。
再者,本發明提供在兔κ鏈恆定區域(序列識別號43)中,第106位的位置不存在Cys之兔κ鏈恆定區域,及包含該κ鏈恆定區域之抗體。例如,在具有序列識別號43之胺基酸序列的兔κ鏈恆定區域中,第106位不存在Cys,表示第106位的Cys缺失、置換為其他胺基酸、其他胺基酸***、移到其他位置等。較佳的κ鏈恆定區域,可列舉為第106位的Cys缺失、移到其他位置、或置換為其他胺基酸的κ鏈恆定區
域。
本發明之κ鏈恆定區域的較佳態樣可列舉為,在κ鏈恆定區域中第101位~第105位的位置存在至少1個Cys,且在第106位的位置不存在Cys的κ鏈恆定區域。
此述之κ鏈恆定區域的較佳例,可列舉如第1位~第105位的胺基酸之至少1個缺失的κ鏈恆定區域。例如具有序列識別號43之胺基酸序列的κ鏈恆定區域中,第105位的Asp缺失的情形,第106位的Cys移動至第105位,因此形成第105位存在Cys、第106位不存在Cys的κ鏈恆定區域。胺基酸缺失的部位沒有特別限定,較佳在第101位~第105位的胺基酸的至少1個缺失,更佳為第104位或第105位的胺基酸缺失。
又缺失的胺基酸數目沒有特別限制,但通常為1~5個,較佳為1~3個,更佳為1個或2個,更佳可為1個胺基酸缺失。
此述κ鏈恆定區域之較佳例,可列舉第104位的胺基酸缺失之κ鏈恆定區域,或第105位的胺基酸缺失之κ鏈恆定區域。
又上述之第106位的位置不存在Cys之兔κ鏈恆定區域的其他較佳態樣,例如第101位~第105位的胺基酸之至少1個置換為Cys,且第106位的Cys缺失或置換為其他胺基酸之κ鏈恆定區域。置換為Cys的胺基酸數目沒有特別限定,通常為1~5個,較佳為1~3個,更佳為1個或2個,再更佳為1個。
置換為Cys的部位沒有特別限定,但較佳的置換部位可例如第104位或第105位。
此述之κ鏈恆定區域的較佳例,例如第104位的Gly置換為Cys,且第106位的Cys缺失或置換為其他胺基酸之人κ鏈
恆定區域,或者,第105位的Asp置換為Cys,且第106位的Cys缺失或置換為其他胺基酸之κ鏈恆定區域。
本發明之兔κ鏈恆定區域,除了上述胺基酸的改變以外,也可進行其他的胺基酸改變。只要進行上述的胺基酸改變,再進行其他胺基酸的改變及修飾之κ鏈恆定區域也包含於本發明之κ鏈恆定區域。
再者,本發明提供一抗體,包含具有如上述任一者記載之胺基酸改變的重鏈恆定區域。又本發明提供一抗體,包含具有如上述任一者記載之胺基酸改變的輕鏈恆定區域。再者,本發明提供一抗體,包含具有如上述任一者記載之胺基酸改變的重鏈恆定區域、及具有如上述任一者記載之胺基酸改變的輕鏈恆定區域。本發明之抗體中的胺基酸改變包含根據本說明書之記載全部可能特定的改變及其組合。
又本發明提供一抗體,包含具有如上述任一者記載之胺基酸改變的輕鏈恆定區域之輕鏈,及包含至少1個Cys置換為其他胺基酸的重鏈恆定區域。重鏈恆定區域沒有特別限定,但較佳為IgG2恆定區域。當重鏈恆定區域為IgG2恆定區域的情形時,被置換的Cys沒有特別限定,例如EU編號第131位(序列識別號24的第14位)、EU編號第219位(序列識別號24的第102位)、EU編號第220位(序列識別號24的第103位)的Cys的至少1個置換為其他胺基酸的恆定區域。當2個Cys置換為其他胺基酸的情形,其組合沒有特別限定,例如EU編號第131位及EU編號第219位的組合、EU編號第131位及EU編號第220位的組合。
再者,本發明提供一抗體,包含具有如上述任一者記載之胺基酸改變之輕鏈恆定區域的輕鏈,及具有EU編號第219位(序列識別號24的第102位)為Cys、EU編號第220位(序列識別號24的第103位)不為Cys的重鏈恆定區域之重鏈。重鏈恆定區域沒有特別限定,但較佳為IgG2恆定區域,較佳為M66或M106。抗體恆定區域可為1個或複數個胺基酸(例如20個胺基酸以內,10個胺基酸以內等)經置換、缺失、增加及/或***。
構成本發明抗體之可變區域,可為辨識任意抗原之可變區域。作為本發明之較佳可變區域,可為顯示具有抗原中和作用之抗體可變區域。例如具有IL6受體、IL31受體、RANKL的中和作用之抗體的可變區域,可作為構成本發明之抗體的可變區域。
本發明之抗體只要是具有上述抗體恆定區域,不限定抗原種類、抗體來源等,任何抗體皆可。抗體的來源沒有特別限定,但可列舉人抗體、小鼠抗體、大鼠抗體、兔抗體等。又本發明之抗體也可為鑲嵌抗體(chimera antibody)、人型化抗體、完全人型化抗體等。本發明之抗體的較佳態樣可列舉如人型化抗體。
本發明之抗體分子通常包含重鏈及輕鏈。重鏈,除了恆定區域外,也可包含可變區域。可變區域也可包含不只人及人以外的動物種之可變區域。更者,可從來自小鼠等人以外的種的可變區域,移植CDR,使可變區域人型化。以重鏈及輕鏈所構成的抗體分子可為寡聚合物。具體地說,可為單量體、二量體、或以上的寡聚合物。
上述的抗體恆定區域與具有生理活性的胜肽、抗原結合胜肽等多種分子結合,也可成為融合蛋白。
本發明之抗體,如為包含上述任一者記載之恆定區域的抗體,則也包含其修飾物。
抗體修飾物,例如,與聚乙二醇(PEG)及細胞阻礙性物質等各種分子結合的抗體。此述之抗體修飾物可經由使本發明之抗體進行化學性修飾而獲得。抗體的修飾方法為此領域中已確立者。
再者,本發明之抗體也可為雙特異性抗體(bispecific antibody)。所謂雙特異性抗體是在同一抗體分子內具有辨識不同抗原決定位的可變區之抗體,但是該抗原決定位可存在於不同的分子中,也可存在於同一分子中。
上述抗體恆定區域可使用作為對任意抗原的抗體恆定區域,抗原沒有特別限定。
本發明之抗體可以該技術領域中公知方法製作。例如將1個或複數個胺基酸殘基以目的的其他胺基酸取代之方法,例如部位特異性變異誘發法(Hashimoto-Gotoh,T,Mizuno,T,Ogasahara,Y,and Nakagawa,M.(1995)An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis.Gene 152,271-275、Zoller,MJ,and Smith,M.(1983)Oligonucleotide- directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors.Methods Enzymol.100,468-500、Kramer,W,Drutsa,V,Jansen,HW,Kramer,B,Pflugfelder,M,and Fritz,HJ(1984)The gapped duplex DNA
approach to oligonucleotide-directed mutation construction.Nucleic Acids Res.12,9441-9456、Kramer W,and Fritz HJ(1987)Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods.Enzymol.154,350-367、Kunkel,TA(1985)Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.Proc Natl Acad Sci U S A.82,488-492)。使用此方法可將抗體的恆定區域所希望的胺基酸置換為目的的其他胺基酸。又,可使1個或複數個胺基酸殘基缺失。
抗體取得的其他態樣,首先根據此技術領域週知方法,取得與目的抗原結合的抗體。已取得的抗體如為非人的動物抗體,也可為人型化者。抗體的結合活性可以此領域公知方法測定。其次,使抗體的恆定區域中1個或複數個胺基酸殘基置換為目的的其他胺基酸或使其缺失。
本發明關於一抗體之製造方法,包括下列(a)及(b)步驟之使重鏈恆定區域的胺基酸殘基及/或輕鏈恆定區之胺基酸殘基改變。
(a)使編碼恆定區域中1個或複數個胺基酸殘基置換為目的的其他胺基酸或使其缺失的重鏈、及/或恆定區域中的1個或複數個胺基酸殘基置換為目的的其他胺基酸或使其缺失的輕鏈之DNA表現的步驟;(b)回收步驟(a)的表現產物之步驟。
重鏈恆定區域之胺基酸殘基的改變,如下例示,但不限於此。
(1)在IgG2恆定區域(序列識別號24之胺基酸序列)中,第
14位(EU編號第131位)的Cys置換為Ser、第16位(EU編號第133位)的Arg置換為Lys、第103位(EU編號第220位)的Cys置換為Ser、第20位(EU編號第137位)的Glu置換為Gly、第21位(EU編號第138位)的Ser置換為Gly、第147位(EU編號第268位)的His置換為Gln、第234位(EU編號第355位)的Arg置換為Gln、及第298位(EU編號第419位)的Gln置換為Glu。根據此種置換,可製造安定性提升的抗體、及免疫原性及/或藥物動力改善的抗體。
(2)在IgG2恆定區域(序列識別號24之胺基酸序列)中,第14位(EU編號第131位)的Cys置換為Ser、第16位(EU編號第133位)的Arg置換為Lys、第103位(EU編號第220位)的Cys置換為Ser、第20位(EU編號第137位)的Glu置換為Gly、第21位(EU編號第138位)的Ser置換為Gly、第147位(EU編號第268位)的His置換為Gln、第234位(EU編號第355位)的Arg置換為Gln、第298位(EU編號第419位)的Gln置換為Glu、第209位(EU編號第330位)的Ala置換為Ser、第210位(EU編號第331位)的Pro置換為Ser、第218位(EU編號第339位)的Thr置換為Ala。經由此述之置換,可製造與Fcγ受體結合降低的抗體。
(3)在IgG2恆定區域(序列識別號24之胺基酸序列)中,第325位(EU編號第446位)的Gly及第326位(EU編號第447位)的Lys缺失。經由此述之缺失,可製造改善C端的異質性之抗體。
(4)在IgG2恆定區域(序列識別號24之胺基酸序列)中,第
276位(EU編號第397位)的Met置換為Val。經由此述之置換,可製造在酸性條件下安定性提升的抗體。
又輕鏈恆定區域的胺基酸殘基的改變,可列舉如下例,但不限於此。經由下列的改變,可使樞紐區的異質性降低。
(1)人κ鏈恆定區域(序列識別號32的胺基酸序列)、小鼠κ鏈恆定區域(序列識別號40的胺基酸序列)或大鼠κ鏈恆定區域(序列識別號41的胺基酸序列),在第102位~第106位的位置中存在至少1個Cys之胺基酸置換或缺失。
(2)人κ鏈恆定區域(序列識別號32的胺基酸序列)、小鼠κ鏈恆定區域(序列識別號40的胺基酸序列)或大鼠κ鏈恆定區域(序列識別號41的胺基酸序列)中,在第107位的位置中不存在Cys之胺基酸置換或缺失。
(3)人κ鏈恆定區域(序列識別號32的胺基酸序列)、小鼠κ鏈恆定區域(序列識別號40的胺基酸序列)或大鼠κ鏈恆定區域(序列識別號41的胺基酸序列)中,在第102位~第106位的位置中存在至少1個Cys,且在第107位的位置中不存在Cys之胺基酸置換或缺失。
(4)人κ鏈恆定區域(序列識別號32的胺基酸序列)、小鼠κ鏈恆定區域(序列識別號40的胺基酸序列)或大鼠κ鏈恆定區域(序列識別號41的胺基酸序列)中,在第1位~第106位的胺基酸之至少1個缺失。
(5)人κ鏈恆定區域(序列識別號32的胺基酸序列)、小鼠κ鏈恆定區域(序列識別號40的胺基酸序列)或大鼠κ鏈恆定區域
(序列識別號41的胺基酸序列)中,在第102位~第106位的胺基酸之至少1個缺失。
(6)人κ鏈恆定區域(序列識別號32的胺基酸序列)、小鼠κ鏈恆定區域(序列識別號40的胺基酸序列)或大鼠κ鏈恆定區域(序列識別號41的胺基酸序列)中,在第105位的胺基酸缺失。
(7)人κ鏈恆定區域(序列識別號32的胺基酸序列)、小鼠κ鏈恆定區域(序列識別號40的胺基酸序列)或大鼠κ鏈恆定區域(序列識別號41的胺基酸序列)中,在第106位的胺基酸缺失。
(8)人κ鏈恆定區域(序列識別號32的胺基酸序列)、小鼠κ鏈恆定區域(序列識別號40的胺基酸序列)或大鼠κ鏈恆定區域(序列識別號41的胺基酸序列)中,在第102位~第106位的胺基酸之至少1個置換為Cys。
(9)人κ鏈恆定區域(序列識別號32的胺基酸序列)、小鼠κ鏈恆定區域(序列識別號40的胺基酸序列)或大鼠κ鏈恆定區域(序列識別號41的胺基酸序列)中,在第102位~第106位的胺基酸之至少1個置換為Cys,且第107位的Cys置換為其他胺基酸或缺失。
(10)人λ鏈恆定區域(序列識別號37的胺基酸序列)或兔κ鏈恆定區域(序列識別號42的胺基酸序列)中,在第99位~第103位存在至少1個Cys之胺基酸置換或缺失。
(11)人λ鏈恆定區域(序列識別號37的胺基酸序列)或兔κ鏈恆定區域(序列識別號42的胺基酸序列)中,在第104位不存在Cys之胺基酸置換或缺失。
(12)人λ鏈恆定區域(序列識別號37的胺基酸序列)或兔κ
鏈恆定區域(序列識別號42的胺基酸序列)中,在第99位~第103位存在至少1個Cys,且第104位的位置不存在Cys之胺基酸置換或缺失。
(13)人λ鏈恆定區域(序列識別號37的胺基酸序列)或兔κ鏈恆定區域(序列識別號42的胺基酸序列)中,在第1位~第103位的胺基酸之至少1個缺失。
(14)人λ鏈恆定區域(序列識別號37的胺基酸序列)或兔κ鏈恆定區域(序列識別號42的胺基酸序列)中,在第99位~第103位的胺基酸之至少1個缺失。
(15)人λ鏈恆定區域(序列識別號37的胺基酸序列)或兔κ鏈恆定區域(序列識別號42的胺基酸序列)中,在第102位的胺基酸缺失。
(16)人λ鏈恆定區域(序列識別號37的胺基酸序列)或兔κ鏈恆定區域(序列識別號42的胺基酸序列)中,在第103位的胺基酸缺失。
(17)人λ鏈恆定區域(序列識別號37的胺基酸序列)或兔κ鏈恆定區域(序列識別號42的胺基酸序列)中,在第99位~第103位的胺基酸之至少1個置換為Cys。
(18)人λ鏈恆定區域(序列識別號37的胺基酸序列)或兔κ鏈恆定區域(序列識別號42的胺基酸序列)中,在第99位~第103位的胺基酸之至少1個置換為Cys,且第104位的Cys置換為其他胺基酸或缺失。
(19)兔κ鏈恆定區域(序列識別號43的胺基酸序列)中,第101位~第105位的胺基酸存在至少1個Cys之胺基酸置換或
缺失。
(20)兔κ鏈恆定區域(序列識別號43的胺基酸序列)中,第106位的位置不存在Cys之胺基酸置換或缺失。
(21)兔κ鏈恆定區域(序列識別號43的胺基酸序列)中,在第101位~第105位存在至少1個Cys,且第106位的位置不存在Cys之胺基酸置換或缺失。
(22)兔κ鏈恆定區域(序列識別號43的胺基酸序列)中,在第1位~第105位的胺基酸至少1個缺失。
(23)兔κ鏈恆定區域(序列識別號43的胺基酸序列)中,在第101位~第105位的胺基酸至少1個缺失。
(24)兔κ鏈恆定區域(序列識別號43的胺基酸序列)中,在第104位的胺基酸缺失。
(25)兔κ鏈恆定區域(序列識別號43的胺基酸序列)中,在第105位的胺基酸缺失。
(26)兔κ鏈恆定區域(序列識別號43的胺基酸序列)中,在第101位~第105位的胺基酸至少1個置換為Cys。
(27)兔κ鏈恆定區域(序列識別號43的胺基酸序列)中,在第101位~第105位的胺基酸至少1個置換為Cys,且第106位的Cys置換為其他胺基酸或缺失。
又本發明提供一製造抗體的方法,包括將編碼具有本發明之胺基酸改變的重鏈恆定區域之抗體重鏈的多核苷酸及/或編碼具有本發明之胺基酸改變的輕鏈恆定區域之抗體輕鏈的多核苷酸導入載體,培養含有該載體之宿主細胞的步驟。
更具體地提供,包括下列步驟之具有本發明之胺基酸改變的重鏈恆定區域及/或具有本發明之胺基酸改變的輕鏈恆定區域之抗體的製造方法。
(a)將編碼具有本發明之胺基酸改變的重鏈恆定區域之抗體重鏈的多核苷酸及/或編碼具有本發明之胺基酸改變的輕鏈恆定區域之抗體輕鏈的多核苷酸導入載體,培養含有該載體之宿主細胞的步驟。
(b)經由上述基因取得編碼的抗體重鏈及/或抗體輕鏈之步驟。
重鏈恆定區域之胺基酸的改變,例如上述(1)~(4)記載之胺基酸置換及胺基酸缺失,但不限於此。
輕鏈恆定區域之胺基酸的改變,例如上述(1)~(27)記載之胺基酸置換及胺基酸缺失,但不限於此。
本發明之抗體的製造方法,首先使編碼抗體重鏈之DNA,其為編碼恆定區域中1個或複數個胺基酸殘基置換為目的的其他胺基酸或缺失之重鏈的DNA,及/或編碼抗體輕鏈之DNA,其為編碼恆定區域中1個或複數個胺基酸殘基置換為目的的其他胺基酸或缺失之輕鏈的DNA表現。編碼恆定區域中1個或複數個胺基酸殘基置換為目的的其他胺基酸或缺失之重鏈及/或恆定區域中1個或複數個胺基酸殘基置換為目的的其他胺基酸或缺失之輕鏈的DNA,例如取得編碼野生型的重鏈及/或輕鏈之DNA的恆定區域部分,編碼該恆定區域中特定胺基酸的密碼子(codon)可經由編碼目的的其他胺基酸導入適當的置換後而得。
又預先設計編碼使野生型重鏈之恆定區域中1個或複數個胺基酸殘基置換為目的的其他胺基酸或缺失的蛋白質之DNA,藉由化學合成該DNA,也可獲得編碼恆定區域中1個或複數個胺基酸殘基置換為目的的其他胺基酸或缺失之重鏈及/或恆定區域中1個或複數個胺基酸殘基置換為目的的其他胺基酸或缺失之輕鏈的DNA。
胺基酸置換及缺失的種類不限於此述者,但列舉如本說明書記載之置換及缺失。
又,編碼恆定區域中1個或複數個胺基酸殘基置換為目的的其他胺基酸或缺失之重鏈及/或恆定區域中1個或複數個胺基酸殘基置換為目的的其他胺基酸或缺失之輕鏈的DNA,部分的DNA可分別製造。部分DNA的組合,例如編碼可變區域的DNA及編碼恆定區域之DNA,或編碼Fab區域的DNA及編碼Fc區域的DNA等,但不限於此述之組合。
使上述DNA表現之方法,例如下述之方法。例如使編碼重鏈可變區域之DNA及編碼重鏈恆定區域的DNA一起導入表現載體中,構築重鏈表現載體。同樣地,使編碼輕鏈可變區域之DNA及編碼輕鏈恆定區域的DNA一起導入表現載體中,構築輕鏈表現載體。此述之重鏈、輕鏈的基因也可導入單一的載體。表現載體例如可使用SV40病毒載體、EB病毒載體、BPV(papillomavirus)病毒載體等,但不限於此。
藉由上述方法製作之抗體表現載體,轉形至宿主細胞。宿主細胞可使用CHO細胞(Chinese hamster卵巢)等上述細胞,及其他的大腸桿菌、酵母菌及枯草菌等的微生物及動
植物個體(Nature Biotechnology 25,563-565(2007)、Nature Biotechnology 16,773-777(1998)、Biochemical and Biophysical Research Communications 255,444-450(1999)、Nature Biotechnology 23,1159-1169(2005)、Journal of Virology 75,2803-2809(2001)、Biochemical and Biophysical Research Communications 308,94-100(2003))。又可使用來自人胎兒腎癌細胞的HEK298H細胞。又轉形較佳使用lipofectin法(R.W.Malone et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,6077(1989),P.L.Felgner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,7413(1987)、electroporation法、磷酸鈣法(F.L.Graham & A.J.van der Eb,Virology 52,456-467(1973))、DEAE-Dextran法等。
抗體的製造中,其次回收表現產物。表現產物的回收,可進行例如培養轉形體後,從轉形體的細胞內或培養液中分離抗體、純化。抗體的分離及純化可適當組合離心、硫酸銨分層、鹽析、超過濾膜過濾、lq、FcRn、蛋白A、蛋白G柱、親和性層析法、離子交換層析法、膠過濾層析法等之方法。
本發明提供如上述製造之抗體。即本發明關於可經由如下步驟製造之抗體。
(a)使編碼包含可變區域及恆定區域之抗體重鏈及輕鏈之DNA,以宿主細胞表現的步驟;(b)回收(a)中表現的抗體之步驟。
上述方法中,重鏈及輕鏈的恆定區域之胺基酸序列,以根據本發明所提供的上述恆定區域為特徵。本發明之較佳態樣中,重鏈的恆定區域由例如序列識別號24、26~31所示
之胺基酸序列所構成。編碼該胺基酸序列的鹼基序列所構成的DNA,如與編碼重鏈可變區域之DNA連結,可形成編碼抗體重鏈之DNA。又輕鏈的恆定區域由例如序列識別號32~34、37~39所示之胺基酸序列所構成。由編碼該胺基酸序列的鹼基序列所構成的DNA,如與編碼可變區域之DNA連結,可形成編碼抗體輕鏈之DNA。
如上所述,構成本發明之抗體的可變區域可為辨識任何抗原之可變區域。構成本發明抗體之可變區域沒有特別限定,但可例示如下列的可變區域。
例如具有IL6受體中和作用的抗體時,重鏈可變區域例如具有序列識別號5所示之胺基酸序列之人型化抗體的重鏈中CDR1、CDR2、CDR3之可變區域。又輕鏈可變區域例如具有序列識別號2所示之胺基酸序列之人型化抗體的輕鏈中CDR1、CDR2、CDR3之可變區域。
例如當具有IL-31受體中和作用的抗體的情形,重鏈可變區域可例如具有序列識別號13之胺基酸序列的人型化抗體之重鏈中的CDR1、CDR2、CDR3之可變區域。又輕鏈的可變區域可例如具有序列識別號12之胺基酸序列的人型化抗體之輕鏈中的CDR1、CDR2、CDR3之可變區域。
例如當具有RANKL中和作用的抗體的情形,重鏈可變區域可例如具有序列識別號17之胺基酸序列的人型化抗體之重鏈中的CDR1、CDR2、CDR3之可變區域。又輕鏈的可變區域可例如具有序列識別號16之胺基酸序列的人型化抗體之輕鏈中的CDR1、CDR2、CDR3之可變區域。
構成重鏈可變區域及輕鏈可變區域之胺基酸序列只限於維持其抗原結合活性者,容許1個或複數個胺基酸殘基的改變及/或修飾。本發明中,抗體可變區域改變的情形,較佳為保留其CDR胺基酸序列者。經由CDR的胺基酸序列的保留,可維持可變區域的抗原結合活性。可變區域中容許改變的胺基酸數目,通常為1~10個,例如1~5個,較佳為1或2個胺基酸。
例如可變區域N端的麩醯胺酸(Glutamine)經焦麩胺酸(pyroglutamyl)化而修飾為焦麩胺酸(pyroglutamic acid),為此領域中已知的修飾。因此,本發明之抗體,當其重鏈N端為麩醯胺酸的情形時,本發明之抗體包含修飾為焦麩胺酸的可變區域。
又本發明之改變包含上述胺基酸之置換、缺失、增加及/或***、及此述之組合。
再者,本發明提供編碼具有本發明之胺基酸改變的抗體恆定區域之基因。編碼本發明之恆定區域的基因為DNA、RNA等,也可以為任何的基因。
再者,本發明提供包含該基因的載體。載體的種類可根據導入該載體的宿主細胞,由熟知此技術領域之人士適當選擇,例如可使用上述載體。
再者,本發明關於經上述載體轉形之宿主細胞。宿主細胞可由該技術領域之人士適宜選擇,例如可使用上述之宿主細胞。
再者,本發明關於本發明之恆定區域之製造方法,包括培養該宿主細胞,回收表現的本發明之恆定區域之步
驟。
<經由重鏈恆定區域之胺基酸改變的抗體功能改變>
本發明關於使抗體功能提升之方法,包括使序列識別號24記載之人IgG2恆定區域之胺基酸改變之步驟。又本發明關於藉由包含上述步驟之方法所製造之抗體。抗體的功能提升例如抗體安定性的提升、免疫原性的降低、藥物動力的改善等,但不限於此。本發明之方法包含下列(a)~(h)之步驟。
(a)序列識別號24的第14位(EU編號第131位)的Cys置換為其他胺基酸的步驟。
(b)序列識別號24的第16位(EU編號第133位)的Arg置換為其他胺基酸的步驟。
(c)序列識別號24的第103位(EU編號第220位)的Cys置換為其他胺基酸的步驟。
(d)序列識別號24的第20位(EU編號第137位)的Glu置換為其他胺基酸的步驟。
(e)序列識別號24的第21位(EU編號第138位)的Ser置換為其他胺基酸的步驟。
(f)序列識別號24的第147位(EU編號第268位)的His置換為其他胺基酸的步驟。
(g)序列識別號24的第234位(EU編號第355位)的Arg置換為其他胺基酸的步驟。
(h)序列識別號24的第298位(EU編號第419位)的Gln置換為其他胺基酸的步驟。
置換後的胺基酸沒有特別限制,較佳為第14位的Cys置換為Ser,第16位的Arg置換為Lys,第103位的Cys置換為Ser,第20位的Glu置換為Gly,第21位的Ser置換為Gly,第147位的His置換為Gln,第234位的Arg置換為Gln,第298位的Gln置換為Glu。
本發明之方法只要包含上述步驟者即可,也可包含其他胺基酸的改變(置換、缺失、增加及/或***)及修飾、或其他步驟。胺基酸的改變及修飾之方法沒有特別限定,可進行如上述的部位特異性突變誘發法及實施例記載的方法。
再者,本發明之方法,除上述步驟以外,為了使C端的異質性降低,也可進一步包含使第325位(EU編號第446位)的Gly及第326位(EU編號第447位)的Lys缺失的步驟。
再者,本發明關於使抗體功能提升之方法,包含使序列識別號24記載之人IgG2恆定區域之胺基酸改變之步驟。本發明再關於由包含上述步驟之方法所製造之抗體。抗體的功能提升例如抗體安定性的提升、免疫原性的降低、安全性的提升、藥物動力的改善等,但不限於此。本發明之方法包含下列(a)~(k)之步驟。
(a)序列識別號24的第14位(EU編號第131位)的Cys置換為其他胺基酸的步驟。
(b)序列識別號24的第16位(EU編號第133位)的Arg置換為其他胺基酸的步驟。
(c)序列識別號24的第103位(EU編號第220位)的Cys置換為其他胺基酸的步驟。
(d)序列識別號24的第20位(EU編號第137位)的Glu置換為其他胺基酸的步驟。
(e)序列識別號24的第21位(EU編號第138位)的Ser置換為其他胺基酸的步驟。
(f)序列識別號24的第147位(EU編號第268位)的His置換為其他胺基酸的步驟。
(g)序列識別號24的第234位(EU編號第355位)的Arg置換為其他胺基酸的步驟。
(h)序列識別號24的第298位(EU編號第419位)的Gln置換為其他胺基酸的步驟。
(i)序列識別號24的第209位(EU編號第330位)的Ala置換為其他胺基酸的步驟。
(j)序列識別號24的第210位(EU編號第331位)的Pro置換為其他胺基酸的步驟。
(k)序列識別號24的第218位(EU編號第339位)的Thr置換為其他胺基酸的步驟。
置換後的胺基酸沒有特別限制,較佳為第14位的Cys置換為Ser,第16位的Arg置換為Lys,第103位的Cys置換為Ser,第20位的Glu置換為Gly,第21位的Ser置換為Gly,第147位的His置換為Gln,第234位的Arg置換為Gln,第298位的Gln置換為Glu,第209位的Ala置換為Ser,第210位的Pro置換為Ser,第218位的Thr置換為Ala。
本發明之方法只限於包含上述步驟者,也可包含其他胺基酸的改變(置換、缺失、增加及/或***)、或修飾、其
他步驟。胺基酸的改變及修飾之方法沒有特別限定,可進行如上述的部分特異性突變誘發法及實施例記載的方法。
再者,本發明之方法,除上述步驟以外,為了使C端的異質性降低,也可進一步包含使第325位(EU編號第446位)的Gly及第326位(EU編號第447位)的Lys缺失的步驟。
而且,本發明關於使抗體血中動態(藥物動力)提升之方法,藉由控制(或改變)抗體恆定區域的雙硫鍵結合模式。抗體恆定區域沒有特別限定,但較佳控制抗體輕鏈恆定區域(κ鏈恆定區域或λ鏈恆定區域)及IgG2恆定區域之間的雙硫鍵結合模式。
具體地說,本發明關於使抗體藥物動力提升之方法,包括使重鏈恆定區域EU編號219的Cys與輕鏈C端區域的Cys之間形成特異性雙硫鍵結合之步驟。
上述步驟中,可進一步包含使重鏈恆定區域EU編號220的Cys與輕鏈C端區域的Cys之間不形成雙硫鍵。
本發明之方法中,不必全部的抗體皆在重鏈恆定區域EU編號219的Cys與輕鏈C端區域的Cys之間形成雙硫鍵,例如有80%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、再更佳為99%以上的抗體在重鏈恆定區域EU編號219的Cys與輕鏈C端區域的Cys之間形成雙硫鍵。
重鏈EU編號219的Cys與輕鏈C端區域的Cys之間形成雙硫鍵的步驟也可經由任何方法進行,例如可藉由重鏈EU編號220(序列識別號24的第103位)的Cys置換為其他胺基酸而進行。藉由重鏈EU編號220的Cys置換為其他胺基
酸,使存在於輕鏈C端的Cys與重鏈EU編號220之間不形成雙硫鍵,而存在於輕鏈C端的Cys與重鏈EU編號219(序列識別號24的第102位)的Cys之間形成雙硫鍵。
本發明中,EU編號220的Cys及EU編號131的Cys也可置換為其他胺基酸。置換後的胺基酸沒有特別限定,但例如可置換為Ser。
本發明之方法中,輕鏈C端區域的Cys,例如是人κ鏈恆定區域的情形,通常為存在於第102位~第106位(例如序列識別號32記載之人κ鏈恆定區域第102位~第106位)區域的Cys,較佳為存在於第104位~第106位區域的Cys。又例如是人λ鏈恆定區域的情形,通常為存在於第99位~第105位(例如序列識別號37記載之人λ鏈恆定區域第99位~第105位)區域的Cys,較佳為存在於第102位~第104位區域的Cys。
本發明方法所使用之IgG2恆定區域也可為,從序列識別號24記載之胺基酸有1或複數個(例如20個胺基酸以內、10個胺基酸以內等)之胺基酸缺失、置換、增加及/或***。又本發明之方法所使用的IgG2可包含本說明書所記載之特定的可能改變或上述之組合。
又本發明之方法所使用的人κ鏈恆定區域,可為序列識別號32記載之胺基酸序列有1或複數個(例如20個胺基酸以內、10個胺基酸以內等)之胺基酸缺失、置換、增加及/或***。
又本發明之方法所使用的人λ鏈恆定區域的情形,可為序列識別號37記載之胺基酸序列有1或複數個(例如20個胺基酸以內、10個胺基酸以內等)之胺基酸缺失、置換、增加及/
或***。
又本發明之方法所使用的人κ鏈恆定區域、人λ鏈恆定區域,可包含本說明書所記載之特定的可能改變或上述之組合。
重鏈恆定區域EU編號219的Cys與輕鏈C端區域的Cys之間形成雙硫鍵的抗體,與重鏈恆定區域EU編號220的Cys與輕鏈C端區域的Cys之間形成雙硫鍵的抗體相比,顯然為藥物動力高者。因此,本發明提供藉由重鏈恆定區域EU編號219的Cys與輕鏈C端區域的Cys之間形成雙硫鍵而使藥物動力提升的抗體。本發明之方法為用於做為醫藥品具有優良及高藥物動力之抗體的製作。
<藉由輕鏈恆定區域的胺基酸改變的抗體功能改變>
本發明關於使樞紐區的異質性降低的方法,包括在序列識別號32記載之人κ恆定區域、在序列識別號40記載之小鼠κ鏈恆定區域、或在序列識別號41記載之大鼠κ鏈恆定區域中,在第102位~第106位導入至少1個Cys的步驟。本發明再關於經由包含上述步驟之方法所製造之抗體。
本發明中,所謂在第102位~第106位導入至少1個Cys,表示在人κ鏈恆定區域的第102位~第106位中存在至少1個Cys的狀態。
再者,本發明關於使樞紐區的異質性降低的方法,包括在序列識別號32記載之人κ恆定區域、在序列識別號40記載之小鼠κ鏈恆定區域、或在序列識別號41記載之大鼠κ鏈恆定區域中,在第107位的Cys消失(缺失)的步驟。本
發明再關於經由包含上述步驟之方法所製造之抗體。
本發明中,所謂在第107位的Cys消失,表示在人κ鏈恆定區域的第107位不存在Cys的狀態。
本發明更關於使樞紐區的異質性降低的方法,包括在序列識別號32記載之人κ鏈恆定區域、在序列識別號40記載之小鼠κ鏈恆定區域、或在序列識別號41記載之大鼠κ鏈恆定區域中,
(a)在第102位~第106位導入至少1個Cys的步驟,及(b)在第107位的Cys消失(缺失)的步驟。
本發明再關於經由包含上述步驟之方法所製造之抗體。
本發明中,在第102位~第106位導入至少1個Cys的步驟及在第107位的Cys消失(缺失)的步驟,也可以單一步驟進行。
在第102位~第106位導入至少1個Cys的步驟中,導入的Cys數目沒有特別限定,但為5個以下,較佳為3個以下,更佳為2個以下,再更佳為1個。
導入Cys的位置沒有特別限制,但較佳為第104位、第105位、或第106位,更佳為第105位或第106位,特別佳為第106位。
在第102位~第106位導入至少1個Cys的步驟之具體例,例如下列之步驟。也可組合此述之步驟。
.在第102位~第106位的位置***至少1個Cys的步驟。
.在第102位~第106位的胺基酸至少1個以Cys置換的步驟。
.在第1位~第106位的胺基酸之中有1~5個胺基酸缺失的步驟。
在第107位的Cys消失的步驟之具體例,例如下列之步驟。
.使第107位的Cys缺失的步驟。
.第107位的Cys置換為其他胺基酸的步驟。
.使第107位的位置***其他胺基酸的步驟。
.藉由使第1位~第106位的胺基酸至少1個缺失,而使第107位的Cys移動至其他位置的步驟。
本發明之方法(使樞紐區的異質性降低的方法、增強對FcRn的結合之方法,包括在序列識別號32記載之人κ鏈恆定區域、在序列識別號40記載之小鼠κ鏈恆定區域、或在序列識別號41記載之大鼠κ鏈恆定區域中,(a)在第102位~第106位導入至少1個Cys的步驟,及(b)在第107位的Cys消失(缺失)的步驟)的較佳態樣,例如在人κ鏈恆定區域的第1位~第106位的胺基酸中有1~5個胺基酸缺失的步驟。藉由在第1位~第106位中有1~5個胺基酸缺失,使第107位的Cys移動至第102位~第106位,因此第102位~第106位中導入至少1個Cys的步驟及第107位的Cys消失的步驟可同時進行。
胺基酸缺失的部位沒有特別限制,但較佳為第102位~第106位的胺基酸有至少1個缺失,更佳為在第105位或第106位的胺基酸有缺失。
又缺失的胺基酸數目沒有特別限定,通常為1~5個,較佳為1~3個,更佳為1個或2個,再更佳為1個胺基酸。
此述之步驟的較佳例,可列舉下列之步驟,但不限定於此。
.使第105位的胺基酸缺失的步驟,或.使第106位的胺基酸缺失的步驟。
又本發明之方法的較佳其他態樣,例如包含(a)第102位~第106位的胺基酸的至少1個置換為Cys的步驟,及(b)第107位的Cys缺失或置換為其他胺基酸的步驟。
置換為Cys的胺基酸數目沒有特別限定,但通常為1~5個,較佳為1~3個,更佳為1或2個,再更佳為1個。置換為Cys的部位沒有特別限定,但較佳的置換部位可例如第105位或第106位。
此述之步驟的具體例,例如為人κ鏈恆定區域的情形,可列舉(a)第105位的Gly或第106位的Glu置換為Cys的步驟;及(b)第107位的Cys缺失或置換為其他胺基酸的步驟。
又為小鼠及大鼠κ鏈恆定區域的情形,可列舉(a)第105位的Asn或第106位的Glu置換為Cys的步驟;及(b)第107位的Cys缺失或置換為其他胺基酸的步驟。
本發明關於使樞紐區的異質性降低的方法,包括在序列識別號37記載之人λ鏈恆定區域、或在序列識別號42記載之兔κ鏈恆定區域中,在第99位~第103位導入至少1個Cys
的步驟。本發明更關於由包含上述步驟之方法所製造的抗體。
本發明中,所謂在第99位~第103位導入至少1個Cys,表示在人λ鏈恆定區域的第99位~第103位存在至少1個Cys的狀態。
本發明再關於使樞紐區的異質性降低的方法,包括在序列識別號37記載之人λ鏈恆定區域、或在序列識別號42記載之兔κ鏈恆定區域中,使第104位的Cys消失(缺失)的步驟。本發明更關於由包含上述步驟之方法所製造的抗體。
本發明中,所謂使第104位的Cys消失,表示在人λ鏈恆定區域的第104位的位置不存在Cys的狀態。
再者,本發明關於使樞紐區的異質性降低的方法,包括在序列識別號37記載之人λ鏈恆定區域、或在序列識別號42記載之兔κ鏈恆定區域中,(a)在第99位~第103位導入至少1個Cys的步驟,及(b)在第104位的Cys消失(缺失)的步驟。
本發明中,所謂在第99位~第103位導入至少1個Cys的步驟及使第104位的Cys消失的步驟,也可以單一步驟進行。
在第99位~第103位導入至少1個Cys的步驟中,導入的Cys數目沒有特別限定,但為5個以下,較佳為3個以下,更佳為2個以下,再更佳為1個。
Cys的導入位置沒有特別限定,但較佳為第101位、第102位、或第103位,更佳為第102位或第103位,再更佳為第103位。
在第99位~第103位導入至少1個Cys的步驟之
具體例,可例如下列之步驟。也可為下列步驟之組合。
.在第99位~第103位的位置***至少1個Cys的步驟。
.在第99位~第103位的胺基酸至少1個以Cys置換的步驟。
.在第1位~第103位的胺基酸之中有1~5個胺基酸缺失的步驟。
使第104位的Cys消失的步驟之具體例,例如下列之步驟,但不限於此。
.使第104位的Cys缺失的步驟。
.使第104位的Cys置換為其他胺基酸的步驟。
.使第104位的位置***其他胺基酸的步驟。
.藉由使第1位~第103位的胺基酸至少1個缺失,而使第105位的Cys移動至其他位置的步驟。
本發明之方法(使樞紐區的異質性降低的方法,包括在序列識別號37記載之人λ鏈恆定區域、或在序列識別號42記載之兔κ鏈恆定區域中,(a)在第99位~第103位導入至少1個Cys的步驟,及(b)在第104位的Cys消失的步驟)的較佳態樣,例如包括在人λ鏈恆定區域的第1位~第103位中有1~5個胺基酸缺失的步驟。藉由在第1位~第103位中有1~5個胺基酸缺失,使第104位的Cys移動至第99位~第103位,因此第99位~第103位中導入至少1個Cys的步驟及第104位的Cys消失的步驟可同時進行。
胺基酸缺失的部位沒有特別限制,但較佳為第99位~第103位的胺基酸有至少1個缺失,更佳為在第102位或
第103位的胺基酸有缺失。
又缺失的胺基酸數目沒有特別限定,通常為1~5個,較佳為1~3個,更佳為1個或2個,再更佳為1個胺基酸缺失。
此述之步驟的較佳例,可列舉下列之步驟,但不限定於此。
.使第102位的胺基酸缺失的步驟,或.使第103位的胺基酸缺失的步驟。
又本發明之方法的較佳其他態樣,例如包含(a)第99位~第103位的胺基酸的至少1個置換為Cys的步驟,及(b)第104位的Cys缺失或置換為其他胺基酸的步驟。
置換為Cys的胺基酸數目沒有特別限定,但通常為1~5個,較佳為1~3個,更佳為1或2個,再更佳為1個。置換為Cys的部位沒有特別限定,但較佳的置換部位可例如第102位或第103位。
此述之步驟的具體例,例如為人λ鏈恆定區域的情形,可列舉下列之步驟,但不限於此。
(a)第102位的Thr或第103位的Glu置換為Cys的步驟;及(b)第104位的Cys缺失或置換為其他胺基酸的步驟。
又為序列識別號42記載之兔κ鏈恆定區域的情形,可列舉下列之步驟,但不限於此。
(a)第102位的Gly或第103位的Asp置換為Cys的步驟;及
(b)第104位的Cys缺失或置換為其他胺基酸的步驟。
本發明關於使樞紐區的異質性降低的方法,包括在序列識別號43記載之兔κ鏈恆定區域中,在第101位~第105位導入至少1個Cys的步驟。本發明更關於由包含上述步驟之方法所製造的抗體。
本發明中,所謂在第101位~第105位導入至少1個Cys,表示在大鼠κ鏈恆定區域的第101位~第105位存在至少1個Cys的狀態。
本發明再關於使樞紐區的異質性降低的方法,包括在序列識別號43記載之兔κ鏈恆定區域中,使第106位的Cys消失(缺失)的步驟。本發明更關於由包含上述步驟之方法所製造的抗體。
本發明中,所謂使第106位的Cys消失,表示在兔κ鏈恆定區域的第106位的位置不存在Cys的狀態。
再者,本發明關於使樞紐區的異質性降低的方法,包括或在序列識別號43記載之兔κ鏈恆定區域中,(a)在第101位~第105位導入至少1個Cys的步驟,及(b)在第106位的Cys消失的步驟。
本發明中,所謂在第101位~第105位導入至少1個Cys的步驟及使第106位的Cys消失的步驟,也可以單一步驟進行。
在第101位~第105位導入至少1個Cys的步驟中,導入的Cys數目沒有特別限定,但為5個以下,較佳為3個以下,更佳為2個以下,再更佳為1個。
Cys的導入位置沒有特別限定,但較佳為第103位、第104
位、或第105位,更佳為第104位或第105位,再更佳為第105位。
在第101位~第105位導入至少1個Cys的步驟之具體例,可例如下列之步驟。也可為下列步驟之組合。
.在第101位~第105位的位置***至少1個Cys的步驟。
.在第101位~第105位的胺基酸至少1個以Cys置換的步驟。
.在第1位~第105位的胺基酸之中有1~5個胺基酸缺失的步驟。
使第106位的Cys消失的步驟之具體例,例如下列之步驟,但不限於此。
.使第106位的Cys缺失的步驟。
.使第106位的Cys置換為其他胺基酸的步驟。
.使第106位的位置***其他胺基酸的步驟。
.藉由使第1位~第105位的胺基酸至少1個缺失,而使第106位的Cys移動至其他位置的步驟。
本發明之方法(使樞紐區的異質性降低的方法,包括在序列識別號43記載之兔κ鏈恆定區域中,(a)在第101位~第105位導入至少1個Cys的步驟,及(b)在第106位的Cys消失的步驟)的較佳態樣,例如包括在兔κ鏈恆定區域的第1位~第105位中有1~5個胺基酸缺失的步驟。藉由在第1位~第105位中有1~5個胺基酸缺失,使第106位的Cys移動至第101位~第105位,因此第101位~第105位中導入至少1個Cys的步驟及第106位的Cys消失的步驟可同時進行。
胺基酸缺失的部位沒有特別限制,但較佳為第101位~第105位的胺基酸有至少1個缺失,更佳為在第104位或第105位的胺基酸有缺失。
又缺失的胺基酸數目沒有特別限定,通常為1~5個,較佳為1~3個,更佳為1個或2個,再更佳為1個胺基酸缺失。
此述之步驟的較佳例,可列舉下列之步驟,但不限定於此。
.使第104位的胺基酸缺失的步驟,或.使第105位的胺基酸缺失的步驟。
又本發明之方法的較佳其他態樣,例如包含(a)第101位~第105位的胺基酸的至少1個置換為Cys的步驟,及(b)第106位的Cys缺失或置換為其他胺基酸的步驟。
置換為Cys的胺基酸數目沒有特別限定,但通常為1~5個,較佳為1~3個,更佳為1或2個,再更佳為1個。置換為Cys的部位沒有特別限定,但較佳的置換部位可例如第104位或第105位。
此述之步驟的具體例,可列舉下列之步驟,但不限於此。
(a)第104位的Gly或第105位的Asp置換為Cys的步驟;及(b)第106位的Cys缺失或置換為其他胺基酸的步驟。
本發明之方法只限於包含上述步驟者,也可包含其他步驟,例如其他胺基酸的改變(置換、缺失及/或***)的步
驟或修飾的步驟。
<包含抗體之醫藥組合物>
本發明提供包含本發明之抗體或本發明之恆定區域的醫藥組合物。再者,本發明提供在重鏈恆定區域EU編號219的Cys與輕鏈C端區域的Cys之間形成雙硫鍵的抗體比例為80%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、再更佳為99%以上的抗體醫藥組合物。
本發明之醫藥組合物可在除了抗體或恆定區域以外,再加入醫藥容許載體,以公知方法製劑化。例如以水或水以外的藥學容許液之無菌性溶液,或以懸浮液劑型的注射劑型態,非經口地使用。例如藥學上容許之載體或劑體,具體為,滅菌水及生理食鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、界面活性劑、安定劑、香味劑、賦形劑、載劑、防腐劑、結合劑等適當組合。可根據一般認知的製藥實施所要求的單位用量型態混和後,進行製劑化。此述製劑化中的有效成分量可為指示範圍之適當容量者。
注射用的無菌組成物可使用注射用蒸餾水的載劑,根據一般製劑實施方法作成處方。
注射用的水溶液例如生理食鹽水、含葡萄糖或其他輔助藥之等張液,例如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇、氯化鈉等,適當的溶解輔助劑例如醇類,具體地如乙醇、多元醇,例如丙二醇、聚乙二醇,非離子界面活性劑,例如聚多梨糖醇80(TM),可與HCO-50併用。
油性液,例如芝麻油、大豆油,溶解輔助劑例如苯甲酸苄酯,可併用苯甲醇。又緩衝劑例如磷酸鹽緩衝劑、乙
酸鈉緩衝液、無痛化劑,例如鹽酸普魯卡因(procaine);穩定劑例如苯甲醇、酚,可調配抗氧化劑。調製的注射液通常充填於適當的安瓶中。
投予較佳為非經口投予,具體例如注射劑型、經鼻投予劑型、經肺投予劑型、經皮投予劑型等。注射劑型例如靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射等,藉此可全身性或局部投予。
又可根據患者的年齡、症狀選擇適宜投予方法。含有抗體或編碼抗體之多核苷酸之醫藥組成物之投予量,可選擇例如每次每1kg體重為0.0001mg~1000mg之範圍。或者,例如可選擇每位患者0.001~100000mg/body之範圍的投予量,但是不必受限於此數值。投予量、投予方法可根據患者體重及年齡、症狀等而變動,此技術領域之人士可適當選擇。
本說明書中所使用之胺基酸以三個字母標示及以1個字母標示的對應胺基酸,如下所示。
丙胺酸;Ala;A
精胺酸;Arg;R
天冬醯胺酸;Asn;N
天冬胺酸;Asp;D
半胱胺酸;Cys;C
麩醯胺酸;Gln;Q
麩胺酸;Glu;E
甘胺酸;Gly;G
組胺酸;His;H
異白胺酸;Ile;I
白胺酸;Leu;L
離胺酸;Lys;K
甲硫胺酸;Met;M
***酸;Phe;F
脯胺酸;Pro;P
絲胺酸;Ser;S
蘇胺酸;Thr;T
色胺酸;Trp;W
酪胺酸;Tyr;Y
纈胺酸;Val;V
而且本說明書中所引用的全部先前技術作為參照,併入本說明書內。
[實施例1]IgG分子的C端異質性的改善
H鏈C端△GK抗體的表現載體的構築
IgG抗體的H鏈C端序列之異質性已知為C端胺基酸的離胺酸(Lysine)缺失及C端的2個胺基酸甘胺酸(glycine)及離胺酸(lysine)兩者缺失所造成的C端羧基醯胺化(Anal Biochem.2007 Jan 1;360(1):75-83)。抗IL-6受體抗體的TOCILIZUMAB,其主成分為鹼基序列上存在的C端胺基酸離胺酸為轉譯後修飾而缺失的序列,但離胺酸殘存的副成分及甘胺酸、離胺酸兩者缺失所造成的C端羧基醯胺化的副成分,也存在異質性。為了維持目的物質/關聯物質的異質性之製造間差及作為醫藥品不易大量製造而使成本增加,希望儘可能為單
一物質。抗體作為醫藥品,在開發上希望降低上述之異質性。因此做為醫藥品的開發上,希望不存在C端的異質性。
此處,為了使C端胺基酸的異質性降低,進行目的C端胺基酸的改變。具體地說,天然型IgG1的H鏈恆定區域的C端離胺酸及甘胺酸,事先使其在鹼基序列上缺失。藉由C端的2個胺基酸,離胺酸及甘胺酸的缺失,檢討是否可抑制C端胺基酸醯胺化。
使用參考例1之方法,製作H鏈為H0-IgG1(胺基酸序列識別號1)、L鏈為L0-k0(胺基酸序列識別號2)所構成之TOCILIZUMAB(以下簡稱為IL6R H0/L0-IgG1),再對於編碼H鏈EU編號第447位的Lys及/或EU編號第446位的Gly之鹼基序列,導入使其作為終止密碼子的突變。藉此製作C端1個胺基酸離胺酸(EU編號第447位)預先缺失的抗體H鏈之H0-IgG1△K(胺基酸序列識別號3)、C端2個胺基酸的甘胺酸(EU編號第446位)、離胺酸(EU編號第447號)預先缺失的抗體H鏈H0-IgG1△GK(胺基酸序列識別號4)的表現載體。
H鏈為H0-IgG1(胺基酸序列識別號1)、L鏈為L0-k0(胺基酸序列識別號2)所構成IL6R H0-IgG1/L0-k0,H鏈為H0-IgG1△K(胺基酸序列識別號3)、L鏈為L0-k0(胺基酸序列識別號2)所構成IL6R H0-IgG1△GK/L0-k0,及H鏈為H0-IgG1△GK(胺基酸序列識別號4)、L鏈為L0-k0(胺基酸序列識別號2)所構成IL6R H0-IgG1△GK/L0-k0,其表現及精製以參考例1記載之方法實施。
H鏈C端△GK抗體的陽離子交換層析法分析
精製的抗體異質性的評價經陽離子交換層析法實施。使用ProPac WCX-10,4×250mm(Dionex)做為柱,移動相A使用25mmol/L MES/NaOH,pH 6.1,移動相B使用25mmol/L MES/NaOH,250mmol/L NaCl,pH 6.1,以適當的流量及梯度實施。精製的IL6R H0/L0-IgG1、IL6R H0-IgG1△GK/L0-k0及IL6R H0-IgG1△GK/L0-k0以陽離子交換層析法的評估,結果如第1圖所示。
此結果發現,不只H鏈恆定區域C端的離胺酸,H鏈恆定區域C端的離胺酸及甘胺酸兩者預先在鹼基序列上缺失者,開始顯示可能降低C端胺基酸的異質性。從人抗體恆定區IgG1、IgG2、IgG4中,C端序列成為EU編號(參考Sequences of proteins of immunological interest,NIH Publication No.91-3242)第447位為離胺酸、第446位為甘胺酸者,以此檢討發現的C端胺基酸異質性降低的方法,考慮也可適用於IgG2恆定區域及IgG4恆定區域或其改變體。
[實施例2]維持天然型IgG2安定性及降低異質性的新穎恆定區域
天然型IgG1及天然型IgG2的異質性
以效應物(effector)功能等殺傷標靶細胞之針對腫瘤的抗體醫藥的情形,較佳為具有效應物功能的IgG1恆定區域(isotype),但在藉由中和標靶抗原的功能之抗體醫藥或必須避免對標靶細胞形成結合而殺傷之抗體醫藥的情形,不宜與Fcγ受體結合。
使與Fcγ受體的結合降低的方法,考慮將IgG抗
體的同型物(isotype)由IgG1改變為IgG2或IgG4的方法(Ann Hematol.1998 Jun;76(6):231-48),從與Fcγ受體的結合及各同型物的藥物動力的觀點來看,IgG4較IgG2為所希望者(Nat Biotechnol.2007 Dec;25(12):1369-72)。另一方面,每當以抗體作為醫藥品開發,其蛋白質的物性,特別是均一性及安全性極為重要,IgG2同型物已知有極多來自樞紐區的雙硫鍵的結合差異所造成的異質性(J Biol Chem.2008 Jun 6;283(23):16194-205;J Biol Chem.2008 Jun 6;283(23):16206-15;Biochemistry.2008 Jul 15;47(28):7496-508)。
此處,製作實際具有天然型IgG1恆定區域的IL6R H0-IgG1/L0-k0及天然型IgG2恆定區域的IL6R H0-IgG2/L0-k0,進行兩者的異質性評價。以實施例1製作的H鏈為IL6R H0-IgG1(胺基酸序列識別號1),L鏈為IL6R L0-k0(胺基酸序列識別號2)所構成的IL6R H0-IgG1/L0-k0,及H鏈恆定區域變換為IgG2之H鏈為IL6R H0-IgG2(胺基酸序列識別號5),L鏈為IL6R L0-k0(胺基酸序列識別號2)所構成的IL6R H0-IgG2/L0-k0,其表現及精製以參考例1記載之方法實施。
具有天然型IgG1恆定區域的IL6R H0-IgG1/L0-k0及具有天然型IgG2恆定區域的IL6R H0-IgG2/L0-k0之來自雙硫鍵之異質性的評估方法,藉由陽離子交換層析法進行評價。柱使用ProPac WCX-10(Dionex),移動相A使用20mM醋酸鈉,pH5.0,移動相B使用20mM醋酸鈉,1M NaCl,pH5.0,使用適切流量及梯度實施。其結果如第2圖所示,具有天然型
IgG2恆定區域的IL6R H0-IgG2/L0-k0出現複數個峰,與僅由單一主峰所構成的具有天然型IgG1恆定區域的IL6R H0-IgG1/L0-k0相比,明顯可見異質性高。
IgG型的抗體之樞紐區週邊構造詳細如第3圖所示。IgG抗體在樞紐區附近,H鏈及L鏈(或兩個H鏈)形成雙硫鍵。此雙硫鍵結合模式如下記載,根據IgG型的抗體同型物而有差異。天然型IgG1的樞紐區中的雙硫鍵,因為是如第4圖所示的單一模式,因此不存在因雙硫鍵所造成的異質性,在陽離子交換層析法中溶出約單一主峰。另一方面,天然型IgG2的樞紐區中的雙硫鍵,如第3圖所示,天然型IgG2的樞紐區中具有2個雙硫鍵(EU編號第219位及第220位)。此樞紐區的2個雙硫鍵所鄰接的半胱胺酸(cystein)為存在於H鏈CH1區(domain)的EU編號第131位的半胱胺酸(cystein)及L鏈C端的半胱胺酸(cystein),形成2量化的對方H鏈在同一樞紐區存在2個半胱胺酸(cystein)。因此,IgG2的樞紐區週邊以H2L2會合的狀態,總計有8個半胱胺酸鄰接。因此,天然型IgG2因雙硫鍵的結合不同存在多種異質性,顯然異質性高。
維持來自此述雙硫鍵的結合不同所造成的目的物質/關聯物質的異質性之製造間差,且作為醫藥品大量製造不易,造成成本增加,希望儘可能為單一物質。因此,以IgG2同型物之抗體作為醫藥品開發上,希望不使安定性減少,但降低來自雙硫鍵的異質性。實際上,在US20060194280(A1)中,天然型IgG2在離子交換層析法分析中觀察到來自雙硫鍵結合的多種異質性,亦報導其峰之間的生物活性不同。使該異質峰
(heteropeak)單一化的方法,US20060194280(A1)報導為在精製步驟中的再摺疊(refolding),但由於製造中使用上述步驟花費成本煩雜,較佳製作藉由胺基酸置換形成雙硫鍵為單一模式的IgG2突變體,藉此希望使異質性單一化。然而,至今未有關於使雙硫鍵結合形成單一模式之IgG2突變體的報告,同樣地未有關於不降低安定性但減少來自雙硫鍵之異質性的IgG2突變體之報告。
結合H鏈及L鏈的雙硫鍵模式所帶來對安全性的影響
天然型IgG1中,IgG1的H鏈恆定區域序列(胺基酸序列識別號23)的H鏈EU編號第220位的半胱胺酸及L鏈第214位(參考Sequences of proteins of immunological interest,NIH Publication No.91-3242的編號)的半胱胺酸,形成雙硫鍵(Nat Biotechnol.2007 Dec;25(12):1369-72,Anal Chem.2008 Mar 15;80(6):2001-9)。另一方面,天然型IgG4中,IgG4的H鏈恆定區域序列(胺基酸序列識別號25)的H鏈EU編號第131位的半胱胺酸及L鏈第214位(參考Sequences of proteins of immunological interest,NIH Publication No.91-3242的編號)的半胱胺酸,形成雙硫鍵(Nat Biotechnol.2007 Dec;25(12):1369-72、Protein Sci.1997 Feb;6(2):407-15)。此述天然型IgG1及天然型IgG4中,已報導H鏈及L鏈的結合使雙硫鍵的結合模式不同。天然型IgG1及天然型IgG4的雙硫鍵模式如第5圖所示。然而,至今未有關於結合H鏈及L鏈的雙硫鍵模式所帶來對安全性的影響之報告。
以實施例1製造之H鏈為IL6R H0-IgG1(胺基酸序列識別號1),L鏈為IL6R L0-k0(胺基酸序列識別號2)所構成的IL6R H0-IgG1/L0-k0,及H鏈恆定區域變換為IgG4的H鏈為IL6R H0-IgG4(胺基酸序列識別號6),L鏈為IL6R L0-k0(胺基酸序列識別號2)所構成的IL6R H0-IgG4/L0-k0之表現及精製,以參考例1記載之方法實施。
安定性的評估方法,進行示差掃描量熱儀(DSC)的熱變性中間溫度(Tm值)的評價(N-DSCII、Calorimety Sceince Corporation製)。熱變性中間溫度(Tm值)為安定性指標,作為醫藥品,為了製作安定的製劑,希望熱變性中間溫度(Tm值)高者(J Pharm Sci.2008 Apr;97(4):1414-26)。將精製的IL6R H0-IgG1/L0-k0及IL6R H0-IgG4/L0-k0對20mM醋酸鈉、150mM的NaCl、pH6.0的溶液進行透析(EasySEP,TOMY),以約0.1mg/mL的蛋白質濃度,40℃至100℃的1℃/min昇溫速度進行DSC測定。所得的DSC變性曲線計算原始Fab部分的Tm值,如表1所示。由此顯示IgG1較IgG4具有較高的Fab部分的Tm值。此Tm值的差異判斷是來自結合H鏈及L鏈的雙硫鍵結合模式的差異,H鏈及L鏈的雙硫鍵結合模式為,H鏈EU編號第131位的半胱胺酸及L鏈的第214位((參考Sequences of proteins of immunological interest,NIH Publication No.91-3242的編號)的半胱胺酸為雙硫鍵結合的情形,相較於H鏈EU編號第220位的半胱胺酸及L鏈第214位(參考Sequences of proteins of immunological interest,NIH Publication No.91-3242的編號)的半胱胺酸的雙硫鍵結合情形,顯示熱安定性大幅降低。
各種天然型IgG2突變體的製作
作為降低天然型IgG2因雙硫鍵結合差異造成異質性的方法,考慮只將存在於H鏈樞紐區的EU編號第219位的半胱胺酸改變為絲胺酸(serine)的方法,及只將第220位的半胱胺酸改變為絲胺酸(serine)的方法(Biochemistry.2008 Jul 15;47(28):7496-508.)。具體為,天然型IgG2的H鏈恆定區域(胺基酸序列識別號24)中EU編號第219位的半胱胺酸改變為絲胺酸(serine)的H鏈恆定區域SC(序列識別號26),及EU編號第220位的半胱胺酸改變為絲胺酸(serine)的H鏈恆定區域CS(序列識別號27)。然而,上述H鏈恆定區域之SC及CS,如第6圖所示,天然型IgG2的雙硫鍵結合模式並非單一,為複數個模式,其中,上述H鏈EU編號第131位的半胱胺酸及L鏈第214位(參考Sequences of proteins of immunological interest,NIH Publication No.91-3242的編號)的半胱胺酸形成雙硫鍵結合,存在安定性下降之不良的雙硫鍵結合模式。
此處,不採取安定性下降的雙硫鍵結合模式,作為形成單一雙硫鍵結合模式的H鏈恆定區域,考慮對SC(序列識別號26),進一步將H鏈EU編號第131位的半胱胺酸及第133位的精胺酸(arginie)分別改變為絲胺酸(serine)及離胺酸(lysine)之H鏈恆定區域SKSC(序列識別號28)。對此,為了進一步改善免疫原性及藥物動力,將H鏈EU編號第137位的麩
醯胺酸(glutamine)改變為甘胺酸(glycine),第138位的絲胺酸(serine)改變為甘胺酸(glycine),第268位的組胺酸(histidine)改變為麩醯胺酸(glutamine),第355位的精胺酸(arginine)改變為麩醯胺酸(glutamine),第419位的麩醯胺酸(glutamine)改變為麩胺酸(glutamic acid),更為了避免H鏈C端的異質性,考慮H鏈恆定區域的C端離胺酸(lysine)及甘胺酸(glycine)事先在鹼基序列上缺失之M58(序列識別號29)。對於此述之H鏈恆定區域之SKSC及M58,如第7圖所示,不採用安定性降低之雙硫鍵結合模式,而考慮形成單一雙硫鍵結合模式。
此處,IL6R H0-SC(胺基酸序列識別號7)、IL6R H0-CS(胺基酸序列識別號8)、IL6R H0-SKSC(胺基酸序列識別號9)、IL6R H0-M58(胺基酸序列識別號10)的表現載體之構築,以參考例1記載之方法實施。L鏈使用IL6R L0-k0(胺基酸序列識別號2),H鏈為利用多種H鏈的IL6R H0-IgG1/L0-k0、IL6R H0-IgG2/L0-k0、及天然型IgG2突變體之IL6R H0-SC/L0-k0、IL6R H0-CS/L0-k0、IL6R H0-SKSC/L0-k0及IL6R H0-M58/L0-k0,其表現及精製以參考例1記載之方法實施。
各種天然型IgG2突變體的陽離子交換層析法分析
各種天然型IgG2突變體的異質性評估方法,使用上述記載之陽離子交換層析法之方法實施。IL6R H0-IgG1/L0-k0、IL6R H0-IgG2/L0-k0、及天然型IgG2突變體之IL6R H0-SC/L0-k0、IL6R H0-CS/L0-k0、IL6R H0-SKSC/L0-k0及IL6R H0-M58/L0-k0經陽離子交換層析法進行評價之結果,如第8
圖所示。
結果第8圖所示,將H鏈恆定區域從IgG1變換為IgG2者,異質性增大,但是將H鏈恆定區域變換為SKSC及M58者,異質性大幅降低。另一方面,H鏈恆定區域為SC的情形,與H鏈恆定區域為SKSC的情形,同樣地異質性降低,但H鏈恆定區域為CS的情形異質性未充分地改善。
各種天然型IgG2分子突變體的DSC分析
一般為了將抗體作為醫藥品開發,除減少異質性外,為了調配安定的製劑,希望具有高的安定性。此處,IL6R H0-IgG1/L0-k0、IL6R H0-IgG2/L0-k0、及天然型IgG2突變體之IL6R H0-SC/L0-k0、IL6R H0-CS/L0-k0、IL6R H0-SKSC/L0-k0及IL6R H0-M58/L0-k0的安定性評估方法,同上述之示差掃描量熱儀(DSC)進行熱變性中間溫度(Tm值)的評價(VP-DSC、Microcal社製)。將精製的抗體對20mM醋酸鈉、150mM的NaCl、pH6.0的溶液進行透析(EasySEP,TOMY),以約0.1mg/mL的蛋白質濃度,40℃至100℃的1℃/min昇溫速度進行DSC測定。所得的DSC變性曲線如第9圖所示,Fab部分的Tm值,如表2所示。
相對於IL6R H0-IgG1/L0-k0及IL6R H0-IgG2/L0-k0WT-IgG1的Fab部分的Tm值幾乎相同為約94℃(IgG2的部分低約1℃),IL6R H0-SC/L0-k0及IL6R H0-CS/L0-k0的Tm值為約86℃,與IL6R H0-IgG1/L0-k0及IL6R H0-IgG2/L0-k0相比,Tm值明顯降低。另一方面,IL6R H0-SKSC/L0-k0、IL6R H0-M58/L0-k0的Tm值為約94℃,幾乎與IL6R H0-IgG1/L0-k0及IL6R H0-IgG2/L0-k0相同。
作為H鏈恆定區域,SC及CS的安定性較IgG1及IgG2明顯降低,考量是因為形成安定性降低之雙硫鍵結合模式。根據上述,H鏈EU編號第131位的半胱胺酸及L鏈第214位(參考Sequences of proteins of immunological interest,NIH Publication No.91-3242的編號)的半胱胺酸雙硫鍵結合的情形,Fab部分的安定性降低。考慮在SC及CS中的安定性降低,也存在形成該雙硫鍵結合之分子種類。因此從安定性的觀點,考量H鏈EU編號第131位的半胱胺酸(cysteine)也改變為絲胺酸(serine)之H鏈恆定區域SKSC及M58,作為醫藥品是優良的。
又,比較DSC變性曲線的情形,對於IL6R H0-IgG1/L0-k0、IL6R H0-SKSC/L0-k0、IL6R H0-M58/L0-k0的Fab部分的變性峰陡(sharp)且單一,IL6R H0-SC/L0-k0及IL6R H0-CS/L0-k0與其相比,Fab部分的變性峰廣(broad),IL6R H0-IgG2/L0-k0被認為在Fab部分的變性峰的低溫側為肩峰(shoulder peak)。DSC的變性峰在單一成分的情形中顯示通常陡(sharp)的變性峰,但當Tm不同的複數個成分(即異質性)存
在的情形,變性峰成為廣的(broad)。亦即,H鏈恆定區域IgG2、SC及CS存在複數個成分,SC及CS暗示天然型IgG2的異質性不能充分降低的可能性。因此考慮,野生型的IgG2的異質性,不僅與樞紐區的H鏈EU編號第219位及第220位的半胱胺酸有關,也與CH1區(domain)的H鏈EU編號第131位的半胱胺酸兩方有關,為了降低DSC上的異質性,不僅必須改變樞紐部位的半胱胺酸,也要改變CH1區(domain)的半胱胺酸。因此從異質性的觀點來看,考量H鏈EU編號第131位的半胱胺酸也要改變為絲胺酸的H鏈恆定區域SKSC及M58的部分,作為醫藥品是優良的。
如上所述,作為使來自IgG2樞紐區的異質性降低的H鏈恆定區域,只將樞紐部分的半胱胺酸置換為絲胺酸的H鏈恆定區域SC及CS,在異質性及安定性觀點不充分,除樞紐部位的半胱胺酸外,存在於CH1區的H鏈EU編號第131位的半胱胺酸也置換為絲胺酸者,發現始可維持與IgG2相同的安定性且大幅降低異質性。
多種抗體中天然型IgG2突變體(M58-k0)的異質性改善效果
作為抗IL-6受體抗體以外的抗體,使用抗IL-31受體抗體IL31R H0-IgG1/L0-k0(H鏈胺基酸序列,序列識別號11,L鏈胺基酸序列,序列識別號12)、抗RANKL抗體RANKL H0-IgG1/L0-k0(H鏈胺基酸序列,序列識別號15,L鏈胺基酸序列,序列識別號16)。對於各抗體,分別製作H鏈定區域由IgG1變換為IgG2的IL31R H0-IgG2/L0-k0(H鏈胺基酸
序列,序列識別號13,L鏈胺基酸序列,序列識別號12)及RANKL H0-IgG2/L0-k0(H鏈胺基酸序列,序列識別號17,L鏈胺基酸序列,序列識別號16),而且H鏈恆定區域由IgG1變換為M58之IL31R H0-M58/L0-k0(H鏈胺基酸序列,序列識別號14,L鏈胺基酸序列,序列識別號12)及RANKL H0-M58/L0-k0(H鏈胺基酸序列,序列識別號18,L鏈胺基酸序列,序列識別號16)之表現載體。該表現及精製以參考例1記載之方法實施。
異質性的評估方法,使用與上述相同之方法,經陽離子交換層析法(IEC)進行評價,結果如第10圖所示。如第10圖所示,不僅抗IL-6受體抗體,抗IL-31受體抗體及抗RANKL抗體中,H鏈恆定區域由IgG1變換為IgG2者,異質性增大,H鏈恆定區域由IgG2變換為M58者,確認在任一抗體中的異質性皆可降低。因此,存在於H鏈的CH1區之EU編號第131位的半胱胺酸及存在於H鏈樞紐區之EU編號第219位的半胱胺酸,經由改變為絲胺酸,不管可變區域的抗體序列及抗原種類,顯示可降低來自天然型IgG2的異質性。
[實施例3]新穎恆定區域M58-K0之藥物動力的改善效果
IgG型抗體的藥物動力
IgG分子的血漿中滯留性長(消失慢)者,作為IgG分子的補救受體(salvage receptor),是因為已知的FcRn功能(Nat Rev Immunol.2007 Sep;7(9):715-25)。經由胞飲作用(pynocytosis)進入內囊胞(endosome)的IgG分子,在內囊胞內的酸性條件下
(pH6.0附近),與內囊胞內表現的FcRn結合。無法與FcRn結合的IgG分子進入溶酶體(lysosome),經溶酶體分解,但與FcRn結合的IgG分子移行至細胞表面,在血漿中的中性條件下(pH7.4附近),自FcRn解離,再回到血漿中。
IgG型的抗體已知有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4,但在人的血漿中半衰期已有報導為,IgG1、IgG2為約36日,IgG3為約29日,IgG4為16日(Nat Biotechnol.2007 Dec;25(12):1369-72),IgG1及IgG2的血漿中滯留性為最長者。一般而言,抗體醫藥的同型物為IgG1、IgG2、IgG4,但進一步提升此述IgG抗體的藥物動力之方法,已報導以改變IgG恆定區域之序列而提升對上述人FcRn的結合性方法(J Biol Chem.2007 Jan 19;282(3):1709-17、J Immunol.2006 Jan 1;176(1):346-56)。
由於小鼠FcRn及人FcRn存在種間差異(Proc Natl Acad Sci U S A.2006 Dec 5;103(49):18709-14),為了預測改變恆定區域序列之IgG抗體的人中血漿中滯留性,希望評價對人FcRn的結合評價及在人FcRn轉殖基因鼠中的血漿中滯留性(Int Immunol.2006 Dec;18(12):1759-69)。
IgG1-k0及M58-k0對人FcRn的結合比較
人FcRn的製造以參考例2記載之方法實施。對人FcRn的結合評價使用Biacore 3000,以與固定於感應晶片的Protein L或兔抗人IgG κ鏈抗體結合的抗體,作為分析物(analyte),其與人FcRn相互作用之時,由人FcRn的結合量,計算親和性(affinity;KD)。具體地,使用含有150mM NaCl的50mM Na-
磷酸緩衝液、pH6.0為running buffer,藉由胺偶合(amine coupling)使Protein L或兔抗人IgG κ鏈抗體固定於感應晶片CM5(BIACORE)。之後,分別將IL6R H0-IgG1/L0-k0及IL6R H0-M58/L0-k0以含有0.02%的Tween20的running buffer稀釋、注射,使與晶片上的抗體結合後,培養人FcRn,評價對人FcRn抗體的結合性。
親和性的計算,使用軟體BIAevaluation。由所得的感應圖,求得人FcRn注射結束後立即對抗體的hFcRn結合量,將其套用steady state affinity法,計算對人FcRn的抗體親和性。
IL6R H0-IgG1/L0-k0及IL6R H0-M58/L0-k0對人FcRn的結合性評價依BIAcore進行之結果,如表3所示,顯示IL6R H0-M58/L0-k0的結合性較IL6R H0-IgG1/L0-k0高出約1.4倍。
人FcRn轉殖基因鼠中IgG1-k0及M58-k0的藥物動力比較
人FcRn轉殖基因鼠(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg line 276 +/+小鼠,Jackson Laboratories)中的體內動力評價如下述進行。將IL6R H0-IgG1/L0-k0及IL6R H0-M58/L0-k0別以1mg/kg的投予量靜脈內單次投予各小鼠,適時採血。採集的血液立即以4℃、15,000rpm離心15分鐘,得到血漿。分離的血漿至實施
測定前保存於設定為-20℃之冰箱中。血漿中濃度以ELISA法測定(參考參考例3)。
IL6R H0-IgG1/L0-k0及IL6R H0-M58/L0-k0在人FcRn轉殖基因鼠中的血漿中滯留性評價結果,如第11圖所示,IL6R H0-M58/L0-k0,相較於IL6R H0-IgG1/L0-k0,確認藥物動力提升。如上所述,IL6R H0-M58/L0-k0對人FcRn的結合性,相較於IL6R H0-IgG1/L0-k0,認為是提升的。
多種抗體中IgG1-k0及M58-k0對人FcRn的結合之比較
如上所述,抗IL6受體抗體IL6R H0-IgG1/L0-k0中,藉由H鏈恆定區域從IgG1變換為M58,對人FcRn的結合性提升,在人FcRn轉殖基因鼠中顯示藥物動力提升。此處,對於抗IL6受體抗體以外的IgG1抗體,也檢討是否可藉由H鏈恆定區域從IgG1變換為M58而提升藥物動力。
抗IL6受體抗體以外的抗體,使用抗IL-31受體抗體IL31R H0-IgG1/L0-k0(H鏈胺基酸序列,序列識別號11,L鏈胺基酸序列,序列識別號12)、抗RANKL抗体RANKL H0-IgG1/L0-k0(H鏈胺基酸序列,序列識別號15,L鏈胺基酸序列,序列識別號16)。對於各抗體製作H鏈恆定區域由IgG1變換為M58的IL31R H0-M58/L0-k0(H鏈胺基酸序列,序列識別號14,L鏈胺基酸序列,序列識別號12)及RANKL H0-M58/L0-k0(H鏈胺基酸序列,序列識別號18,L鏈胺基酸序列,序列識別號16),以上述方法評價對人FcRn的結合性。結果如表4所示。
如表4所示,抗IL-31受體抗體及抗RANKL抗體,也將H鏈恆定區域由IgG1變換為M58,與抗IL6受體抗體相同,確認對人FcRn的結合性提升。因此,與可變區域的抗體序列及抗原種類無關,H鏈恆定區域由IgG1變換為M58者,顯示在人的藥物動力提升的可能性。
[實施例4]進一步改善M58-k0的藥物動力之新穎恆定區域M66-k0
新穎恆定區域M66-k0之製作
如實施例2所示之IgG分子的樞紐區的雙硫鍵的結合模式多,顯示對異質性及安定性有影響,實施例3顯示H鏈恆定區域M58較IgG1具有較優良的藥物動力。此處,進一步使樞紐區的雙硫鍵結合模式理想化,考慮是否無法製作較M58顯示更優良的藥物動力之新穎恆定區域,進行檢討。
如第12圖所示,恆定區域M58為H鏈EU編號第131位及第219位的半胱胺酸置換為絲胺酸者,因此H鏈EU編號第220位的半胱胺酸及L鏈第214位(參考Sequences of proteins of immunological interest,NIH Publication No.91-3242的編號)的半胱胺酸形成雙硫鍵。另一方面,如實施例2所示,H鏈EU編號第131位的半胱胺酸及L鏈第214位(參考Sequences of proteins of immunological interest,NIH
Publication No.91-3242的編號)的半胱胺酸形成雙硫鍵的情形,使安定性大幅降低。
此處,如第12圖所示,為了檢討H鏈EU編號第219位的半胱胺酸及L鏈第214位(參考Sequences of proteins of immunological interest,NIH Publication No.91-3242的編號)的半胱胺酸形成雙硫鍵,H鏈EU編號第131位及第220位的半胱胺酸置換為絲胺酸之新穎恆定區域M66(胺基酸序列識別號30),IL6R H0-M66(胺基酸序列識別號19)之表現載體以參考例1記載之方法製作。由H鏈為IL6R H0-M66(胺基酸序列識別號19),L鏈為IL6R L0-k0(胺基酸序列識別號2)所構成的L6R H0-M66/L0-k0,其表現及精製以參考例1記載之方法實施。
人FcRn轉殖基因鼠中IgG1-k0、M58-k0及M66-k0的藥物動力比較
以實施例3記載之方法,使用人FcRn轉殖基因鼠(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg line 276 +/+小鼠、Jackson Laboratories),對IL6R H0-IgG1/L0-k0、IL6R H0-M58/L0-k0及IL6R H0-M66/L0-k0進行藥物動力的評價。
IL6R H0-IgG1/L0-k0、IL6R H0-M58/L0-k0及IL6R H0-M66/L0-k0在人FcRn轉殖基因鼠中血漿中滯留性的評價結果,如第13圖所示,確認IL6R H0-M66/L0-k0較IL6R H0-M58/L0-k0的藥物動力提升。
IL6R H0-M58/L0-k0及IL6R H0-M66/L0-k0的胺基酸序列不同,對於H鏈EU編號第219位及H鏈EU編號第
220位,在IL6R H0-M58/L0-k0中分別為絲胺酸(serine)及半胱胺酸(cysteine),在IL6R H0-M66/L0-k0中分別為半胱胺酸(cysteine)及絲胺酸(serine)。亦即,與L鏈第214位(參考Sequences of proteins of immunological interest,NIH Publication No.91-3242的編號)形成雙硫鍵的位置,在IL6R H0-M58/L0-k0中為H鏈EU編號第220位,在IL6R H0-M66/L0-k0中為H鏈EU編號第219位,兩者的雙硫鍵結合位置不同。
IgG的藥物動力至今未有根據雙硫鍵的結合位置而變化的報告。如J Biol Chem.2008 Jun 6;283(23):16194-205.;J Biol Chem.2008 Jun 6;283(23):16206-15.;Biochemistry.2008 Jul 15;47(28):7496-508.記載,天然型IgG2的雙硫鍵的結合模式(isoform)多數以form A及formB存在,但根據J Biol Chem.2008 Oct 24;283(43):29266-72,上述雙硫鍵結合位置在不同的同型(isoform)之間不改變藥物動力。
由本檢討始發現,IL6R H0-M58/L0-k0及IL6R H0-M66/L0-k0的雙硫鍵結合位置的不同而使藥物動力大大不同。具體地說,將雙硫鍵的結合位置從H鏈EU編號第220位及L鏈第214位(參考Sequences of proteins of immunological interest,NIH Publication No.91-3242的編號),改變至H鏈EU編號第219位及L鏈第214位(參考Sequences of proteins of immunological interest,NIH Publication No.91-3242的編號),發現藥物動力大幅提升。
新穎恆定區域M66-k0的DSC分析
安定性的評價方法,根據實施例2相同的示差掃描量熱儀
(DSC)的熱變性中間溫度(Tm值)之評價(N-DSCII、Calorimety Sceince Corporation製)。將精製的IL6R H0-IgG1/L0-k0、IL6R H0-M58/L0-k0及IL6R H0-M66/L0-k0進行對20mM的醋酸鈉、150mM NaCl、pH6.0的溶液透析(EasySEP,TOMY),以約0.1mg/mL的蛋白質濃度,由40℃至100℃的1℃/min升溫速度,進行DSC測定。從所得的DSC的變性曲線計算原始的Fab部分的Tm值,如表5所示。
如表5所示可知,IL6R H0-M66/L0-k0與IL6R H0-M58/L0-k0具有相同的Tm值。因此顯示,H鏈恆定區域使用H鏈恆定區域M66(胺基酸序列識別號30),與M58(序列識別號29),安定性未降低,但可減少藥物動力。
新穎恆定區域M66-k0之陽離子交換層析法分析
如實施例2記載之方法,對IL6R H0-IgG1/L0-k0、IL6R H0-IgG2/L0-k0、IL6R H0-M58/L0-k0、IL6R H0-M66/L0-k0進行陽離子交換層析法進行評價,結果如第14圖所示。
結果如第14圖所示,相對於H鏈恆定區域M58的單一峰,H鏈恆定區域M66觀察到2個大的峰。同樣地,在IL-31受體抗體中,觀察到H鏈恆定區域M58為單一峰,H鏈恆定區域M66為2個大的峰。
M58的EU編號第219位、第220位分別為絲胺酸
及半胱胺酸,M66的第219位、第220位分別為半胱胺酸及絲胺酸。只有這個差異,M66較M58的藥物動力大幅提升。然而,另一方面,M66中具有M58沒有的新峰,被認為有異質性,M66顯示存在2成分的異質性(isoform)。
[實施例5]M66-k0的異質性藉由L鏈恆定區域的突變而改善的新穎恆定區域M66-k3、M66-k4
新穎恆定區域M66-k3、M66-k4的製作
實施例4中確認的IL6R H0-M66/L0的異質性(2種成分)判斷為H鏈及L鏈的雙硫鍵結合模式的不同所形成。亦即,L鏈(k0胺基酸序列識別號32)的C端第214位(參考Sequences of proteins of immunological interest,NIH Publication No.91-3242的編號)的半胱胺酸(胺基酸序列識別號32之k0中的第107位的半胱胺酸),可與兩邊的H鏈的H鏈EU編號第219位的半胱胺酸,形成雙硫鍵,因此考量可檢出如第15圖所示之2種雙硫鍵的結合模式之2種成分。此處,為了使異質性降低(只形成1種成分),考量如第16圖所示之L鏈的半胱胺酸,與任一方的H鏈的H鏈EU編號第219位的半胱胺酸,可形成雙硫鍵者為佳。此處,以降低異質性為目的,考慮將上述L鏈C端的半胱胺酸位置向N端移動。藉此,L鏈C端的半胱胺酸與一邊的H鏈的H鏈EU編號第219位的半胱胺酸距離變遠,且只能與另一邊的H鏈的H鏈EU編號第219位的半胱胺酸形成雙硫鍵。使L鏈C端的半胱胺酸的位置向N端移動的方法,檢討使L鏈C端附近的胜肽鏈長度變短。具體地說,檢討使天然型L鏈恆定區域k0(胺基酸序列識別號32)的第106
位的麩胺酸(glutamic acid)缺失的抗體之新穎L鏈恆定區域k3(胺基酸序列識別號33),使天然型L鏈恆定區域k0(胺基酸序列識別號32)的第105位的甘胺酸(glycine)缺失的抗體之新穎L鏈恆定區域k4(胺基酸序列識別號34)。此處,L鏈恆定區域為具有k3的IL6R L0-k3(胺基酸序列識別號21)及具有k4的IL6R L0-k4(胺基酸序列識別號22)之表現載體,根據參考例1之方法製作。
H鏈為IL6R H0-M66(胺基酸序列識別號19)、L鏈為IL6R L0-k3(胺基酸序列識別號21)所構成的IL6R H0-M66/L0-k3,及H鏈為IL6R H0-M66(胺基酸序列識別號19)、L鏈為IL6R L0-k4(胺基酸序列識別號22)所構成的IL6R H0-M66/L0-k4,其表現及精製如參考例1記載之方法實施。
新穎恆定區域M66-k3、M66-k4的陽離子交換層析法分析
根據實施例2記載之方法,對IL6R H0-IgG1/L0-k0、IL6R H0-IgG2/L0-k0、IL6R H0-M58/L0-k0、IL6R H0-M66/L0-k0、IL6R H0-M66/L0-k3及IL6R H0-M66/L0-k4經陽離子交換層析法進行評價,結果如第17圖所示。
結果如第17圖所示,H0-M66/L0-k0中觀察到2個峰為單一峰,而H0-M66/L0-k3及H0-M66/L0-k4中觀察到與H0-M58/L0-k0相同的單一峰。藉此使L鏈C端附近的胜肽鏈長度變短,使L鏈C端的半胱胺酸向N端移動,只可與一邊的H鏈的H鏈EU編號第219位形成雙硫鍵,顯示可降低異質
性。
藉由天然型IgG2的雙硫鍵的結合模式而降低異質性(isoform)(J Biol Chem.2008 Jun 6;283(23):16194-205.、J Biol Chem.2008 Jun 6;283(23):16206-15.)的方法,至此檢討H鏈恆定區域的半胱胺酸置換為絲胺酸的方法,但本實施例中一開始顯示使L鏈恆定區域C端的半胱胺酸位置移動,可降低異質性者。至今無關於使L鏈恆定區域C端的半胱胺酸位置移動的L鏈恆定區域之報告。
又L鏈C端的半胱胺酸的位置向N端移動的方法,除上述記載者以外,也可考慮如天然型L鏈恆定區域k0(胺基酸序列識別號32)的第104位的精胺酸(arginine)缺失的方法、天然型L鏈恆定區域k0(胺基酸序列識別號32)的第103位的天冬醯胺酸(asparagine)缺失的方法、或天然型L鏈恆定區域k0(胺基酸序列識別號32)的第106位的麩胺酸(glutamic acid)置換為半胱胺酸的方法,更將第107位的半胱胺酸置換為半胱胺酸以外的胺基酸之方法。
本實施例中的人L鏈恆定區域使用κ鏈(k0,胺基酸序列識別號32),但對於λ鏈恆定區域(胺基酸序列識別號37),可適用相同方法。λ鏈恆定區域中,胺基酸序列識別號37的第104位存在半胱胺酸,但(參考Sequences of proteins of immunological interest,NIH Publication No.91-3242編號中第214位)存在半胱胺酸,因此可考慮,使第103位麩胺酸(glutamic acid)缺失的方法、使第102位蘇胺酸(threonine)缺失的方法、使第101位脯胺酸(proline)缺失的方法、使第100位丙胺酸
(alanine)缺失的方法等,或使天然型λ鏈恆定區域(胺基酸序列識別號37)的第103位的麩胺酸(glutamic acid)置換為半胱胺酸(cysteine)的方法,更將第104位的半胱胺酸置換為半胱胺酸以外的胺基酸之方法等。
新穎恆定區域M66-k0、M66-k3對人FcRn的結合評價
IgG已知與FcRn以2價的親和力(avidity)結合(Traffic.2006 Sep;7(9):1127-42.)。以實施例3之方法,使IgG固定於感應晶片上,作為分析物流入FcRn,使IgG與FcRn以1價的親和力(avidity)結合。此處,為了更模擬生物體內,本實施例中將FcRn固定於感應晶片上,作為分析物流入IgG,評價IgG與FcRn以2價親和力(avidity)的結合。使用Biacore T100(GE Helthcare),對固定在感應晶片上的FcRn,將H0-IgG1/L0-k0、H0-M58/L0-k0、H0-M66/L0-k0及H0-M66/L0-k3作為分析物流入,實施改變體在pH6.0中對人FcRn的親和性分析。
固定化及交互作用分析的方法如下。首先利用胺偶合(amine coupling),於感應晶片CM4(GE Healthcare)上以約2000RU固定化人FcRn。胺偶合使用的試劑為乙醇胺(GE Healthcare)、50mM NaOH溶液(GE Healthcare)、NHS(GE Healthcare)、EDC(GE Healthcare),移動相使用HBS-EP+溶液(10倍的HBS-EP+溶液(GE Healthcare)稀釋使用)。繼續對固定化人FcRn的感應晶片,3分鐘注入作為分析物的抗體,觀測人FcRn與抗體的結合後,以5分鐘流入移動相,觀測各改變體從人FcRn的解離。測定全程在25℃實施,移動相使用10mM
Cit pH6.0、150mM NaCl、0.05% Tween20。
對所得的感應柱結合相3分鐘內,使用Biacore T100 Evaluation Software(GE Healthcare),計算結合速度常數ka(1/Ms)及解離速度常數kd(1/s),再由此數值計算解離常數KD(M),如表6所示。
如實施例3、4所示,人FcRn轉殖基因鼠中H0-IgG1/L0-k0、H0-M58/L0-k0及H0-M66/L0-k0的藥物動力與這些抗體在本測定系統中對人FcRn的結合相關。H0-M66/L0-k3,與H0-M66/L0-k0相比,顯示對人FcRn的結合為相同或以上,因此,人FcRn轉殖基因鼠中的藥物動力與H0-M66/L0-k0為相同或以上。
新穎恆定區域M66-k3、M66-k4的DSC評價
安定性的評價方法,根據實施例2相同的示差掃描量熱儀(DSC)的熱變性中間溫度(Tm值)之評價(N-DSCII、Calorimety Sceince Corporation製)。將精製的IL6R H0-IgG1/L0-k0 IL6R、H0-M66/L0-k0、IL6R H0-M66/L0-k3及IL6R H0-M66/L0-k4進行對20mM的醋酸鈉、150mM NaCl、pH6.0的溶液透析(EasySEP,TOMY),以約0.1mg/mL的蛋白質濃度,由40℃至100℃的1℃/min升溫速度,進行DSC測定。從所得的DSC的變性曲線計算原始的Fab部分的Tm值,如表7所示。
如表7所示可知,IL6R H0-M66/L0-k3及IL6R H0-M66/L0-k4具有與H0-M66/L0-k0相同的Tm值。因此,藉由使用L鏈恆定區域為k3(胺基酸序列識別號33)或k4(胺基酸序列識別號34),與天然型L鏈恆定區域k0(胺基酸序列識別號32)相比,顯示安定性未降低而可減少異質性者。
H鏈的H鏈EU編號第219位及L鏈第214位(參考Sequences of proteins of immunological interest,NIH Publication No.91-3242的編號)形成雙硫鍵的H0-M66/L0-k0,顯示存在如第14圖所示之2種同型體(isoform),此2成分存在如第15圖所示的2個雙硫鍵的結合模式,只將H鏈EU編號第137位及H鏈EU編號第220位的半胱胺酸置換為絲胺酸,顯示不能完全避免來自天然型IgG2的異質性。此處,使L鏈恆定區域C端的半胱胺酸位置移動所形成的H0-M66/L0-k3或H0-M66/L0-k4,始顯示可能避免來自天然型IgG2雙硫鍵結合的異質性。H0-M66/L0-k3,與H0-M66/L0-k0相比,安定性及對人FcRn的結合沒有降低,而且藉由實施例1所示之H鏈C端的△GK的改變,也可避免來自H鏈C端的異質性,因此,作為抗體的H鏈/L鏈恆定區域,M66/k3或M66/k4被考慮是極為有用的。
[實施例6]使M66/k3對Fcγ受體的結合降低的
M106-k3
新穎恆定區域M106-k3的製作
中和抗原,在目的抗體醫藥中,具有Fc區域的ADCC等效應物(effector)功能並非必要,因此,與Fcγ受體的結合為不必要的。從免疫原性及副作用的觀點來考量,與Fcγ受體結合為不佳的可能性也被考慮(Nat Rev Drug Discov.2007 Jan;6(1):75-92.、Ann Hematol.1998 Jun;76(6):231-48.)。例如人型化抗IL-6受體IgG1抗體TOCILIZUMAB,與IL-6受體特異性結合,以中和其生物學作用,可利用作為與風濕性關節炎等IL-6相關的疾病之治療藥,與Fcγ受體結合為不必要的。
使與Fcγ受體結合降低的方法,考慮使IgG1抗體的同型(isotype)由IgG1改變為IgG2或IgG4同型(isotype)的方法(Ann Hematol.1998 Jun;76(6):231-48.)。完全不與Fcγ受體結合的方法,已報導於Fc區域導入人工改變的方法。例如抗CD3抗體及抗CD4抗體因為抗體效應物機能引起副作用,因此在Fc區域的Fcγ受體結合部位中導入不存在於野生型序列的胺基酸突變(J Immunol.2000 Feb 15;164(4):1925-33.、J Immunol.1997 Oct 1;159(7):3613-21.)之Fcγ受體非結合型的抗CD3抗體及抗CD4抗體的臨床試驗,目前正在進行(Nat Rev Drug Discov.2007 Jan;6(1):75-92、Transplantation.2001 Apr 15;71(7):941-50.)。又已報導IgG1的FcγR結合部位(EU編號第233、234、235、236、327、330、331位)形成為IgG2(EU編號第223、234、235、236位)及IgG4(EU編號第327、330、331位)的序列,以製造Fcγ受體非結合型抗體是可能的
(US 20050261229A1)。然而,在IgG1中導入上述全部突變,出現形成不存在於自然界的T-cell抗原決定位胜肽之9個胺基酸的新胜肽序列,考量免疫原性的風險變高。作為醫藥品的開發上,希望免疫原風險極力地降低。
為了解決上述課題,檢討IgG2的恆定區域的改變。IgG2的恆定區域中,FcγR結合部位中EU編號第233、234、235、236位為非結合型,但FcγR結合部位中EU編號第330、331位為與非結合型的IgG4為不同序列,因此,EU編號第330、331位的胺基酸必須要改變為IgG4序列(Eur J Immunol.1999 Aug;29(8):2613-24中的G2△a)。然而,IgG4的EU編號第339位的胺基酸為丙胺酸(alanine),IgG2者為蘇胺酸(threonine),因此只將EU編號第330、331位的胺基酸改變為IgG4序列,會出現形成不存在於自然界的T-cell抗原決定位胜肽之9個胺基酸的新胜肽序列,而產生免疫原性。此處,除上述改變外,重新使IgG2的EU編號第339位的Thr改變為Ala,顯示可能防止新的胜肽序列出現。此處,檢討將上述突變導入恆定區域M66(胺基酸序列識別號30)的恆定區域M106(胺基酸序列識別號31)。此處,H鏈恆定區域為具有M106之IL6R H0-M106(胺基酸序列識別號20)之表現載體,根據參考例1之方法製作。
H鏈為IL6R H0-M106(胺基酸序列識別號20)、L鏈為IL6R L0-k0(胺基酸序列識別號2)所構成的IL6R H0-M106/L0-k0;H鏈為IL6R H0-M106(胺基酸序列識別號20)、L鏈為IL6R L0-k3(胺基酸序列識別號21)所構成的
IL6R H0-M106/L0-k3;及H鏈為IL6R H0-M106(胺基酸序列識別號20)、L鏈為IL6RL0-k4(胺基酸序列識別號22)所構成的IL6R H0-M106/L0-k4之表現及精製,以參考例1記載之方法實施。
新穎恆定區域M106-k3的陽離子交換層析法分析
根據實施例2記載之方法,對IL6R H0-IgG1/L0-k0、IL6R H0-IgG2/L0-k0、IL6R H0-M106/L0-k0、IL6R H0-M106/L0-k3及IL6R H0-M106/L0-k4經陽離子交換層析法進行評價,結果如第18圖所示。
結果如第18圖所示,H0-M106/L0-k0中的2個峰為單一峰,H0-M106/L0-k3及H0-M106/L0-k4中,觀察到與H0-M66/L0-k3及H0-M66/L0-k4相同的單一峰。藉此,H鏈恆定區域改變體M106中也與H鏈恆定區域改變體M66相同,使L鏈C端附近的胜肽鏈長度變短,使L鏈C端的半胱胺酸向N端移動,只可與一邊的H鏈的H鏈EU編號第219位形成雙硫鍵結合,顯示可降低異質性。
新穎恆定區域M106-k3對各種Fcγ受體的結合評價
H0-IgG1/L0-k0、H0-IgG2/L0-k0及H0-M106/L0-k3對Fcγ受體的結合評價,使用FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa之活性化Fcγ受體進行評價。
對Fcγ受體的結合評價使用Biacore T100(GE Healthcare),對於固定在感應晶片上的Protein L所捕捉的抗體,與人Fcγ受體交互作用,比較其結合量而進行。具體地說,
running buffer使用HBS-EP+(GE Healthcare),ProteinL(ACTIgen)經胺偶合(amine coupling)固定於感應晶片CM5(Biacore)上。之後,H0-IgG1/L0-k0、H0-IgG2/L0-k0、H0-M106/L0-k3捕捉於感應晶片上的Protein L,以running buffer及以running buffer稀釋為10μg/mL的FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa(R&D systems)作為分析物,進行交互作用。此時,由於各抗體被Protein L的捕捉量要一定有其困難,因此進行為了使各抗體被Protein L的捕捉量成為一定的修正。具體地說,從對各抗體的各人Fcγ受體的結合量,各抗體的捕捉量所得的值除以只有與running buffer交互作用時的結合量,所得值乘以100,作為常態化反應(normalized response)。
使用常態化反應(normalized response),比較各抗體與各人Fcγ受體的結合強度,結果如第19圖所示。根據該結果,H0-M106/L0-k3對各種活性化Fcγ受體的結合性較天然存在的IgG1大為減弱,而且也較H0-IgG2/L0-k0為弱,新穎恆定區域M106-k3對Fcγ受體的結合也明顯較天然型的IgG2弱。因此,使用H0-M106/L0-k3,來自經由Fcγ受體而進入APC的免疫原性風險及來自ADCC等效應物機能的副作用,可能也較天然型的IgG2減少。
[實施例7]IgG2-k3的陽離子交換層析法分析
H鏈為IL6R H0-IgG2(胺基酸序列識別號5)、L鏈為IL6R L0-k3(胺基酸序列識別號21)所構成的IL6R H0-IgG2/L0-k3之表現及精製,以參考例1記載之方法實施。使用實施例2記載之方法,對IL6R H0-IgG1/L0-k0及IL6R H0-IgG2/L0-k0及
IL6R H0-IgG2/L0-k3經陽離子交換層析法進行評價,結果如第20圖所示。
結果如第20圖所示,IgG2-k0被認為有異質性,但IgG2-k3的異質性降低。IgG2-k0之天然型IgG2因具有複數個雙硫鍵結合模式,被認為具有異質性,但只有使L鏈C端附近的胜肽鏈長度變短,使L鏈C端的半胱胺酸向N端移動(IgG2-k3),顯示異質性可減少。
[實施例8]人FcRn轉殖基因鼠中IgG1-k0、M66-k0、M66-k3、M106-k3、IgG2-k3的藥物動力比較
以實施例3記載之方法,使用人FcRn轉殖基因鼠(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg line 276 +/+小鼠、Jackson Laboratories)對IL6R H0-IgG1/L0-k0、IL6R H0-M66/L0-k0、IL6R H0-M66/L0-k3、IL6R H0-M106/L0-k3及IL6R H0-IgG2/L0-k3進行藥物動力的評價。
IL6R H0-M66/L0-k0、IL6R H0-M66/L0-k3、IL6R H0-M106/L0-k3及IL6R H0-IgG2/L0-k3在人FcRn轉殖基因鼠中的血漿中滯留性評價之結果,如第21圖所示,與IL6R H0-M66/L0-k0相比,確認IL6R H0-M66/L0-k3的藥物動力提升。此結果反映實施例5所確認的與FcRn的結合評價之結果。L鏈恆定區域k3(胺基酸序列識別號33)為天然型L鏈恆定區域k0(胺基酸序列識別號32)的第106位的麩胺酸(glutamic acid)缺失的L鏈,考量藉由將L鏈由L0-k0置換為L0-k3,使血漿中滯留性提升。FcRn與H鏈恆定區域之Fc部分結合,一般而言,L鏈恆定區域不影響抗體的藥物動力,因此實際上至今未
有報告說明在人FcRn轉殖基因鼠中藉由L鏈恆定區域的胺基酸置換而使藥物動力提升。本檢討始顯示L鏈恆定區域以胺基酸置換者,藥物動力獲得改善。而且IL6R H0-M106/L0-k3的血漿中滯留性較L6R H0-M66/L0-k3提升。
根據本檢討,恆定區域M66-k3、M106-k3、IgG2-k3在陽離子交換層析法之評估中,溶出單一峰,對Fcγ受體的結合較天然型IgG1顯著減弱,而且在人FcRn轉殖基因鼠中的藥物動力較天然型IgG1大幅提升。
[參考例1]抗體的表現載體及抗體的表現及精製
編碼目的抗體H鏈及L鏈之鹼基序列的基因,以PCR等此技術領域之人士公知的方法進行。胺基酸置換的導入,使用QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)或PCR等此技術領域之人士公知的方法進行。所得的質體片段***動物細胞表現載體,製作目的的H鏈表現載體及L鏈表現載體。所得的表現載體之鹼基序列以此技術領域之人士公知的方法決定。抗體的表現使用下列方法進行。將來自人胎兒腎癌細胞的HEK293H株(Invitrogen)懸浮於含有10%胎牛血清(Invitrogen)的DMEM培養基(Invitrogen),以5~6×105個/mL細胞密度接種於接種細胞用的盤(dish)(直徑10cm,CORNING),每盤接種10mL,在CO2培養箱(37℃、5% CO2)內培養過夜之後,吸除培養基,添加CHO-S-SFM-II(Invitrogen)培養基6.9mL。調製的質體經lipofection法導入細胞。回收所得的培養上清液後,離心(約2000g、5分間、室溫)去除細胞,再通過0.22μm濾器MILLEX(R)-GV(Millipore),滅菌,得到培養上清液。
從所得的培養上清液,以rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)此技術領域之人士公知的方法精製抗體。精製的抗體濃度,使用分光儀測定在280nm的吸光度。得到的值經PACE法算出吸光係數,使用該吸光係數計算抗體濃度(Protein Science 1995;4:2411-2423)。
[參考例2]人FcRn的調製
FcRn為FcRn與β2-微球蛋白(microglobulin)的複合體。依已公開的人FcRn基因序列(J.Exp.Med.180(6),2377-2381(1994))製作寡DNA引子。以人cDNA(Human Placenta Marathon-Ready cDNA,Clontech)作為模板,使用上述製作的引子經PCR法調製編碼全長基因的DNA片段。將得到的DNA片段作為模板,經PCR法增殖編碼含有訊息區域的細胞外區域(Met1-Leu290)的DNA片段,將其***動物細胞表現載體(人FcRn胺基酸序列識別號:35)。相同地,根據已公開的人β2-微球蛋白的基因序列(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99(26),16899-16903(2002))製作寡DNA引子。以人cDNA(Hu-Placenta Marathon-Ready cDNA,CLONTECH)為模板,使用上述製作的引子,經PCR法調製編碼全長基因的DNA片段。將得到的DNA片段作為模板,經PCR法增殖編碼含有訊息區域的β2-微球蛋白全長(Met1-Met119)的DNA片段,將其***動物細胞表現載體(人β2-微球蛋白胺基酸序列 序列識別號:36)。
可溶型人FcRn的表現以下列步驟進行。將上述調製的人FcRn及人β2-微球蛋白的質體使用10%胎牛血清(Invitrogen)經lipofection導入來自人胎兒腎癌細胞的
HEK293H株(Invitrogen)。所得的培養上清液經回收後,使用IgG Sepharose 6 Fast Flow(Amersham Biosciences)根據(J Immunol.2002 Nov 1;169(9):5171-80.)方法純化。之後以HiTrap Q HP(GE Healthcare)純化。
[參考例3]小鼠中的抗體血漿中濃度的測定
小鼠血漿中抗體濃度的測定,根據使用抗人IgG抗體的ELISA法,各抗體作為標準品使用,以此技術領域中公知方法測定。
本發明為有用於作為醫藥品投予生物體之抗體的製造。更具體地說,包含本發明恆定區域之抗體,因為異質性低,在維持醫藥品的品質上為有利的。換言之,包含本發明恆定區域之抗體作為醫藥品利用時,可穩定地供給均質的抗體。例如,對IL6受體的抗體,TOCILIZUMAB(俗名),為用於自體免疫疾病等治療的人型化抗體。因此,例如將該抗體的恆定區域根據本發明提供的恆定區置換,可穩定地維持其品質。
又本發明提供藉由改變恆定區域的胺基酸序列,使藥物動力改善之抗體。根據本發明改善藥物動力的抗體,在生物體中,連續較長的時間維持活性。因此,例如對IL6受體的抗體TOCILIZUMAB(俗名)的恆定區域,根據本發明提供的恆定區域置換,可成為藥物動力改善,在生物體內的作用濃度連續較長時間維持的抗體。
<110> 中外製藥股份有限公司(CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA)
<120> 抗體恆定區域改變體
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<151> 2009-03-19
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Claims (17)
- 一種人輕鏈恆定區域改變體,該人輕鏈恆定區域改變體為在序列識別號32的胺基酸序列中,第102位~第106位的胺基酸之至少1個為Cys,在第107位的位置不存在Cys,且依據情況第1位~第106位的胺基酸之中10個胺基酸以內的胺基酸為其他胺基酸或缺失的人κ鏈恆定區域改變體,其中,包含前述人輕鏈恆定區域改變體之抗體,相較於包含為序列識別號32之天然人κ鏈恆定區域的人輕鏈恆定區域的抗體,抗體樞紐區的異質性降低。
- 如申請專利範圍第1項所述之人輕鏈恆定區域改變體,其中在序列識別號32的胺基酸序列中,第102位~第106位的胺基酸之至少1個為Cys。
- 如申請專利範圍第1或2項所述之人輕鏈恆定區域改變體,其中在序列識別號32的胺基酸序列中,在第107位的Cys置換為其他胺基酸或缺失。
- 如申請專利範圍第1至3項之任一項所述之人輕鏈恆定區域改變體,其中在序列識別號32的胺基酸序列中,第1位~第106位的胺基酸之1個至5個為缺失。
- 一種人輕鏈恆定區域改變體,該人輕鏈恆定區域改變體為在序列識別號32的胺基酸序列中,第102位~第106位的胺基酸之至少1個為缺失,且依據情況第1位~第106位的胺基酸之中10個胺基酸以內的胺基酸為其他胺基酸或缺失的人κ鏈恆定區域改變體,其中,包含前述人輕鏈恆定區域改變體之抗體,相較於包含為序列識別號32之天然人κ鏈恆定區域的人輕鏈恆定區域的抗體,抗體樞紐區的異質性降低。
- 如申請專利範圍第5項所述之人輕鏈恆定區域改變體,其中第105位的胺基酸缺失。
- 如申請專利範圍第5項所述之人輕鏈恆定區域改變體,其中第106位的胺基酸為缺失。
- 一種人輕鏈恆定區域改變體,該人輕鏈恆定區域改變體為在序列識別號37的胺基酸序列中,第99位~第103位的胺基酸之至少1個為Cys,在第104位的位置不存在Cys,且依據情況第1位~第103位的胺基酸之中10個胺基酸以內的胺基酸為其他胺基酸或缺失的人λ鏈恆定區域改變體,其中,包含前述人輕鏈恆定區域改變體之抗體,相較於包含為序列識別號37之天然人λ鏈恆定區域的人輕鏈恆定區域的抗體,抗體樞紐區的異質性降低。
- 如申請專利範圍第8項所述之人輕鏈恆定區域改變體,其中在序列識別號37的胺基酸序列中,第99位~第103位的胺基酸之至少1個為Cys。
- 如申請專利範圍第8或9項所述之人輕鏈恆定區域改變體,其中在序列識別號37的胺基酸序列中,在第104位的Cys置換為其他胺基酸或缺失。
- 如申請專利範圍第8至10項之任一項所述之人輕鏈恆定區域改變體,其中在序列識別號37的胺基酸序列中,第1位~第103位的胺基酸之1個至5個為缺失。
- 一種人輕鏈恆定區域改變體,該人輕鏈恆定區域改變體為在序列識別號37的胺基酸序列中,第99位~第103位的胺基酸之至少1個為缺失,且依據情況第1位~第103位的胺基酸之中10個胺基酸以內的胺基酸為其他胺基酸或缺失的人λ鏈恆定區域改變體,其中,包含前述人輕鏈恆定區域改變體之抗體,相較於含有為序列識別號37之天然人λ鏈恆定區域的人輕鏈恆定區域的抗體,抗體樞紐區的異質性降低。
- 如申請專利範圍第12項所述之人輕鏈恆定區域改變體,其中第102位的胺基酸缺失。
- 如申請專利範圍第12項所述之人輕鏈恆定區域改變體,其中第103位的胺基酸缺失。
- 如申請專利範圍第1至14項之任一項所述之人輕鏈恆定區域改變體,其與序列識別號30或序列識別號31的重鏈恆定區改變體組合使用。
- 一種抗體,包含如申請專利範圍第1至15項之任一項所述之人輕鏈恆定區域改變體。
- 一種組合物,包含如申請專利範圍第16項所述之抗體。
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Families Citing this family (62)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101374454B1 (ko) | 2005-03-31 | 2014-03-17 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 회합제어에 의한 폴리펩티드 제조방법 |
EP2006381B1 (en) | 2006-03-31 | 2016-02-03 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for controlling blood pharmacokinetics of antibodies |
EP4218801A3 (en) * | 2006-03-31 | 2023-08-23 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antibody modification method for purifying bispecific antibody |
SG193868A1 (en) | 2007-09-26 | 2013-10-30 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Modified antibody constant region |
PL2202245T3 (pl) | 2007-09-26 | 2017-02-28 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Sposób modyfikowania punktu izoelektrycznego przeciwciała poprzez podstawienie aminokwasu w cdr |
ES2834741T3 (es) | 2007-12-05 | 2021-06-18 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Anticuerpo anti-NR10 y uso del mismo |
RU2454604C2 (ru) * | 2008-02-01 | 2012-06-27 | АйЭйчАй КОРПОРЕЙШН | Пламенный нагреватель |
ES2563483T3 (es) | 2008-04-11 | 2016-03-15 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Molécula de unión a antígeno capaz de unirse repetidamente a dos o más moléculas de antígeno |
TWI440469B (zh) * | 2008-09-26 | 2014-06-11 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Improved antibody molecules |
EP2826789A1 (en) * | 2009-03-19 | 2015-01-21 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antibody constant region variant |
JP5717624B2 (ja) | 2009-03-19 | 2015-05-13 | 中外製薬株式会社 | 抗体定常領域改変体 |
WO2010131733A1 (ja) | 2009-05-15 | 2010-11-18 | 中外製薬株式会社 | 抗axl抗体 |
WO2011037158A1 (ja) | 2009-09-24 | 2011-03-31 | 中外製薬株式会社 | 抗体定常領域改変体 |
WO2011108714A1 (ja) | 2010-03-04 | 2011-09-09 | 中外製薬株式会社 | 抗体定常領域改変体 |
GB201014033D0 (en) | 2010-08-20 | 2010-10-06 | Ucb Pharma Sa | Biological products |
MY166429A (en) | 2010-11-17 | 2018-06-26 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Multi-specific antigen-binding molecule having alternative function to function of blood coagulation factor viii |
US20140234340A1 (en) | 2010-11-30 | 2014-08-21 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly |
SG10201609665PA (en) | 2011-02-25 | 2017-01-27 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | FcɣRIIb-SPECIFIC Fc ANTIBODY |
CN103702682A (zh) | 2011-04-21 | 2014-04-02 | 科罗拉多州立大学董事会法人团体 | 治疗视神经脊髓炎的组合物和方法 |
JP5997151B2 (ja) | 2011-06-30 | 2016-09-28 | 中外製薬株式会社 | ヘテロ二量化ポリペプチド |
TW201817744A (zh) | 2011-09-30 | 2018-05-16 | 日商中外製藥股份有限公司 | 具有促進抗原清除之FcRn結合域的治療性抗原結合分子 |
JP6322411B2 (ja) | 2011-09-30 | 2018-05-09 | 中外製薬株式会社 | 複数の生理活性を有する抗原の消失を促進する抗原結合分子 |
EP3680251A1 (en) * | 2011-09-30 | 2020-07-15 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecules for promoting elimination of antigens |
KR102398736B1 (ko) | 2011-10-31 | 2022-05-16 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 중쇄와 경쇄의 회합이 제어된 항원 결합 분자 |
CA3233142A1 (en) | 2011-11-30 | 2013-06-06 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Drug containing carrier into cell for forming immune complex |
GB201203051D0 (en) * | 2012-02-22 | 2012-04-04 | Ucb Pharma Sa | Biological products |
GB201203071D0 (en) * | 2012-02-22 | 2012-04-04 | Ucb Pharma Sa | Biological products |
TWI617577B (zh) * | 2012-02-24 | 2018-03-11 | 中外製藥股份有限公司 | 經FcγRIIB促進抗原消失之抗原結合分子 |
CN107964042B (zh) * | 2012-05-30 | 2022-04-19 | 中外制药株式会社 | 靶组织特异性抗原结合分子 |
CA2882272C (en) | 2012-08-24 | 2023-08-29 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Fc.gamma.riib-specific fc region variant |
US10766960B2 (en) | 2012-12-27 | 2020-09-08 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Heterodimerized polypeptide |
TWI635098B (zh) | 2013-02-01 | 2018-09-11 | 再生元醫藥公司 | 含嵌合恆定區之抗體 |
EP2982689B1 (en) | 2013-04-02 | 2020-08-26 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Fc region variant |
SG11201601424PA (en) | 2013-08-28 | 2016-03-30 | Stemcentrx Inc | Site-specific antibody conjugation methods and compositions |
JP6534615B2 (ja) | 2013-09-27 | 2019-06-26 | 中外製薬株式会社 | ポリペプチド異種多量体の製造方法 |
US10053511B2 (en) | 2013-11-06 | 2018-08-21 | Abbvie Stemcentrx Llc | Anti-claudin antibodies and methods of use |
KR102284503B1 (ko) | 2013-12-04 | 2021-07-30 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 화합물의 농도에 따라 항원 결합능이 변화되는 항원 결합 분자 및 그의 라이브러리 |
AU2014361856A1 (en) | 2013-12-12 | 2016-06-30 | Abbvie Stemcentrx Llc | Novel anti-DPEP3 antibodies and methods of use |
JP2017514143A (ja) | 2014-02-21 | 2017-06-01 | アッヴィ・ステムセントルクス・エル・エル・シー | メラノーマに使用するための抗dll3抗体および薬物コンジュゲート |
TWI701042B (zh) | 2014-03-19 | 2020-08-11 | 美商再生元醫藥公司 | 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物 |
TW201617368A (zh) | 2014-09-05 | 2016-05-16 | 史坦森特瑞斯公司 | 新穎抗mfi2抗體及使用方法 |
MA40764A (fr) | 2014-09-26 | 2017-08-01 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité |
ES2809455T3 (es) | 2014-11-17 | 2021-03-04 | Regeneron Pharma | Métodos para tratamiento tumoral usando anticuerpo biespecífico CD3xCD20 |
TWI758928B (zh) | 2014-11-21 | 2022-03-21 | 美商必治妥美雅史谷比公司 | 抗cd73抗體及其用途 |
PL3221346T3 (pl) | 2014-11-21 | 2021-03-08 | Bristol-Myers Squibb Company | Przeciwciała ze zmodyfikowanym regionem stałym łańcucha ciężkiego |
SG11201700841QA (en) | 2014-12-19 | 2017-03-30 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Anti-myostatin antibodies, polypeptides containing variant fc regions, and methods of use |
CN107108729A (zh) | 2015-02-05 | 2017-08-29 | 中外制药株式会社 | 包含离子浓度依赖性的抗原结合结构域的抗体,fc区变体,il‑8‑结合抗体,及其应用 |
AU2016224409B2 (en) | 2015-02-27 | 2021-01-28 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Composition for treating IL-6-related diseases |
ES2846748T3 (es) | 2015-03-30 | 2021-07-29 | Regeneron Pharma | Regiones constantes de cadenas pesadas con unión reducida a receptores Fc gamma |
US11142587B2 (en) | 2015-04-01 | 2021-10-12 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for producing polypeptide hetero-oligomer |
US20180271998A1 (en) | 2015-12-04 | 2018-09-27 | Merrimack Pharmaceuticals, Inc. | Disulfide-stabilized fabs |
JP7141336B2 (ja) | 2015-12-25 | 2022-09-22 | 中外製薬株式会社 | 抗ミオスタチン抗体および使用方法 |
EP3398965A4 (en) | 2015-12-28 | 2019-09-18 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | METHOD FOR PROMOTING THE EFFICACY OF PURIFYING A POLYPEPTIDE CONTAINING AN FC REGION |
MX2018010988A (es) | 2016-03-14 | 2019-01-21 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Farmaco terapeutico que induce lesion celular para usarse en terapia de cancer. |
CA3026050A1 (en) | 2016-08-05 | 2018-02-08 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Composition for prophylaxis or treatment of il-8 related diseases |
SG10201607778XA (en) | 2016-09-16 | 2018-04-27 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use |
US11129906B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-09-28 | David Gordon Bermudes | Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria |
EP3620531A4 (en) | 2017-05-02 | 2021-03-17 | National Center of Neurology and Psychiatry | METHOD OF PREDICTION AND EVALUATION OF THERAPEUTIC EFFECT IN DISEASES RELATING TO IL-6 AND NEUTROPHILS |
CA3093729A1 (en) | 2018-03-15 | 2019-09-19 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Anti-dengue virus antibodies having cross-reactivity to zika virus and methods of use |
KR20210054528A (ko) | 2018-08-31 | 2021-05-13 | 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. | Cd3/c20 이중특이적 항체에 대한 사이토카인 방출 증후군을 경감시키는 투약 전략 |
KR20230118573A (ko) * | 2020-11-11 | 2023-08-11 | 에이치큐 한 | 액티빈/tgf-베타 및 rankl의 이작용성 길항제 및 이의 용도 |
CN115947830B (zh) * | 2022-12-27 | 2023-09-12 | 优洛生物(上海)有限公司 | 一种经改造的抗体、其制备方法及其用途 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006071877A2 (en) * | 2004-12-27 | 2006-07-06 | Progenics Pharmaceuticals (Nevada), Inc. | Orally deliverable and anti-toxin antibodies and methods for making and using them |
Family Cites Families (218)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1986006718A1 (en) | 1985-05-17 | 1986-11-20 | The Australian National University | Antimalarial compounds |
US5260203A (en) | 1986-09-02 | 1993-11-09 | Enzon, Inc. | Single polypeptide chain binding molecules |
US5004697A (en) | 1987-08-17 | 1991-04-02 | Univ. Of Ca | Cationized antibodies for delivery through the blood-brain barrier |
US5670373A (en) | 1988-01-22 | 1997-09-23 | Kishimoto; Tadamitsu | Antibody to human interleukin-6 receptor |
US5322678A (en) | 1988-02-17 | 1994-06-21 | Neorx Corporation | Alteration of pharmacokinetics of proteins by charge modification |
US5126250A (en) | 1988-09-28 | 1992-06-30 | Eli Lilly And Company | Method for the reduction of heterogeneity of monoclonal antibodies |
CA1332367C (en) | 1988-09-28 | 1994-10-11 | Richard Mark Bartholomew | Method for the reduction of heterogeneity of monoclonal antibodies |
GB8916400D0 (en) | 1989-07-18 | 1989-09-06 | Dynal As | Modified igg3 |
US5859205A (en) | 1989-12-21 | 1999-01-12 | Celltech Limited | Humanised antibodies |
AU668349B2 (en) | 1991-04-25 | 1996-05-02 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Reconstituted human antibody against human interleukin 6 receptor |
US5468634A (en) | 1991-06-24 | 1995-11-21 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Axl oncogene |
US6136310A (en) | 1991-07-25 | 2000-10-24 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Recombinant anti-CD4 antibodies for human therapy |
US5639641A (en) | 1992-09-09 | 1997-06-17 | Immunogen Inc. | Resurfacing of rodent antibodies |
ZA936260B (en) | 1992-09-09 | 1994-03-18 | Smithkline Beecham Corp | Novel antibodies for conferring passive immunity against infection by a pathogen in man |
BR9204244A (pt) | 1992-10-26 | 1994-05-03 | Cofap | Ferro fundido cinzento |
EP0671951A4 (en) | 1992-12-01 | 1997-05-21 | Protein Design Labs Inc | HUMANIZED ANTIBODIES REACTING WITH L-SELECTIN. |
US5888510A (en) | 1993-07-21 | 1999-03-30 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Chronic rheumatoid arthritis therapy containing IL-6 antagonist as effective component |
UA40577C2 (uk) | 1993-08-02 | 2001-08-15 | Мерк Патент Гмбх | Біспецифічна молекула, що використовується для лізису пухлинних клітин, спосіб її одержання, моноклональне антитіло (варіанти), фармацевтичний препарат, фармацевтичний набір (варіанти), спосіб видалення пухлинних клітин |
IL107742A0 (en) | 1993-11-24 | 1994-02-27 | Yeda Res & Dev | Chemically-modified binding proteins |
US5945311A (en) | 1994-06-03 | 1999-08-31 | GSF--Forschungszentrumfur Umweltund Gesundheit | Method for producing heterologous bi-specific antibodies |
DE4419399C1 (de) | 1994-06-03 | 1995-03-09 | Gsf Forschungszentrum Umwelt | Verfahren zur Herstellung von heterologen bispezifischen Antikörpern |
US8017121B2 (en) | 1994-06-30 | 2011-09-13 | Chugai Seiyaku Kabushika Kaisha | Chronic rheumatoid arthritis therapy containing IL-6 antagonist as effective component |
US6309636B1 (en) | 1995-09-14 | 2001-10-30 | Cancer Research Institute Of Contra Costa | Recombinant peptides derived from the Mc3 anti-BA46 antibody, methods of use thereof, and methods of humanizing antibody peptides |
HU223602B1 (hu) | 1994-10-07 | 2004-10-28 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Krónikus reumatoid artritisz kezelésére szolgáló, IL-6 receptor elleni antitestet tartalmazó gyógyszerkészítmény |
CN101011574B (zh) | 1994-10-21 | 2012-10-03 | 岸本忠三 | Il-6受体的抗体在制备药物组合物中的用途 |
US6485943B2 (en) | 1995-01-17 | 2002-11-26 | The University Of Chicago | Method for altering antibody light chain interactions |
US5876950A (en) | 1995-01-26 | 1999-03-02 | Bristol-Myers Squibb Company | Monoclonal antibodies specific for different epitopes of human GP39 and methods for their use in diagnosis and therapy |
BR9604884A (pt) | 1995-02-28 | 1998-05-19 | Procter & Gamble | Preparação de produtos de bebida não carbonatada com estabilidade microbiana superior |
US5731168A (en) | 1995-03-01 | 1998-03-24 | Genentech, Inc. | Method for making heteromultimeric polypeptides |
AU690474B2 (en) | 1995-09-11 | 1998-04-23 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Antibody againts alpha-chain of human interleukin 5 receptor |
US20020147326A1 (en) | 1996-06-14 | 2002-10-10 | Smithkline Beecham Corporation | Hexameric fusion proteins and uses therefor |
US6211150B1 (en) | 1996-07-19 | 2001-04-03 | Amgen Inc. | Analogs of cationic proteins |
US5990286A (en) | 1996-12-18 | 1999-11-23 | Techniclone, Inc. | Antibodies with reduced net positive charge |
US6884879B1 (en) | 1997-04-07 | 2005-04-26 | Genentech, Inc. | Anti-VEGF antibodies |
US7365166B2 (en) | 1997-04-07 | 2008-04-29 | Genentech, Inc. | Anti-VEGF antibodies |
AU751659B2 (en) | 1997-05-02 | 2002-08-22 | Genentech Inc. | A method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components |
US5980893A (en) | 1997-07-17 | 1999-11-09 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Agonist murine monoclonal antibody as a stimulant for megakaryocytopoiesis |
US20020187150A1 (en) | 1997-08-15 | 2002-12-12 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Preventive and/or therapeutic agent for systemic lupus erythematosus comprising anti-IL-6 receptor antibody as an active ingredient |
WO1999018212A1 (fr) | 1997-10-03 | 1999-04-15 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Anticorps humain naturel |
PL201461B1 (pl) | 1998-03-17 | 2009-04-30 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Czynnik zapobiegający lub terapeutyczny do leczenia zapalenia jelita, zawierający antagonistę IL-6 jako składnik aktywny |
JP3998419B2 (ja) | 1998-04-03 | 2007-10-24 | 中外製薬株式会社 | ヒト組織因子(tf)に対するヒト型化抗体およびヒト型化抗体の作製方法 |
GB9809951D0 (en) | 1998-05-08 | 1998-07-08 | Univ Cambridge Tech | Binding molecules |
EP1105427A2 (en) | 1998-08-17 | 2001-06-13 | Abgenix, Inc. | Generation of modified molecules with increased serum half-lives |
JP2002531466A (ja) | 1998-12-01 | 2002-09-24 | プロテイン デザイン ラブス, インコーポレイテッド | γ−インターフェロンに対するヒト化抗体 |
CA2342967A1 (en) | 1998-12-08 | 2000-06-15 | Biovation Limited | Modifying protein immunogenicity |
US6737056B1 (en) | 1999-01-15 | 2004-05-18 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants with altered effector function |
US6972125B2 (en) | 1999-02-12 | 2005-12-06 | Genetics Institute, Llc | Humanized immunoglobulin reactive with B7-2 and methods of treatment therewith |
DK1188830T3 (da) | 1999-06-02 | 2010-04-26 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Nyt hæmopoietinreceptorprotein NR10 |
SK782002A3 (en) | 1999-07-21 | 2003-08-05 | Lexigen Pharm Corp | FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens |
SE9903895D0 (sv) | 1999-10-28 | 1999-10-28 | Active Biotech Ab | Novel compounds |
AU2001249835A1 (en) | 2000-04-03 | 2001-10-15 | Oxford Glycosciences (Uk) Ltd. | Diagnosis and treatment of alzheimer's disease |
WO2001082899A2 (en) | 2000-05-03 | 2001-11-08 | Mbt Munich Biotechnology Ag | Cationic diagnostic, imaging and therapeutic agents associated with activated vascular sites |
AU2000279625A1 (en) | 2000-10-27 | 2002-05-15 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Blood mmp-3 level-lowering agent containing il-6 antgonist as the active ingredient |
EP1355919B1 (en) | 2000-12-12 | 2010-11-24 | MedImmune, LLC | Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof |
KR20090010127A (ko) | 2001-03-07 | 2009-01-28 | 메르크 파텐트 게엠베하 | 하이브리드 이소타입 항체 부분구조를 포함하는 단백질을 위한 발현 기술 |
UA80091C2 (en) | 2001-04-02 | 2007-08-27 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Remedies for infant chronic arthritis-relating diseases and still's disease which contain an interleukin-6 (il-6) antagonist |
WO2002083854A2 (en) | 2001-04-13 | 2002-10-24 | Biogen, Inc. | Antibodies to vla-1 |
KR100877176B1 (ko) | 2001-06-22 | 2009-01-07 | 츄가이 세이야꾸 가부시키가이샤 | 항글리피칸 3항체를 포함하는 세포증식 억제제 |
US20030049203A1 (en) | 2001-08-31 | 2003-03-13 | Elmaleh David R. | Targeted nucleic acid constructs and uses related thereto |
US20030190705A1 (en) | 2001-10-29 | 2003-10-09 | Sunol Molecular Corporation | Method of humanizing immune system molecules |
US20050171339A1 (en) | 2001-12-28 | 2005-08-04 | Izumi Sugo | Method of stabilizing protein |
SI1576112T1 (sl) | 2002-01-18 | 2012-10-30 | Zymogenetics Inc | Multimerni citokinski receptor zcitor17 |
EP2230299B1 (en) | 2002-01-18 | 2011-12-07 | ZymoGenetics, Inc. | Novel cytokine ZCYTOR17 ligand |
US20030224397A1 (en) | 2002-02-11 | 2003-12-04 | Genentech, Inc. | Antibody variants with faster antigen association rates |
US8188231B2 (en) | 2002-09-27 | 2012-05-29 | Xencor, Inc. | Optimized FC variants |
JP2004086862A (ja) | 2002-05-31 | 2004-03-18 | Celestar Lexico-Sciences Inc | タンパク質相互作用情報処理装置、タンパク質相互作用情報処理方法、プログラム、および、記録媒体 |
EP1510943A4 (en) | 2002-05-31 | 2007-05-09 | Celestar Lexico Sciences Inc | INTERACTION PREDICTION DEVICE |
AU2003256266A1 (en) | 2002-06-12 | 2003-12-31 | Genencor International, Inc. | Methods and compositions for milieu-dependent binding of a targeted agent to a target |
EP1382969A1 (en) | 2002-07-17 | 2004-01-21 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Diagnosis and prevention of cancer cell invasion |
TW200407335A (en) | 2002-07-22 | 2004-05-16 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Non-neutralizing antibody to inhibit the inactivation of activated protein C |
WO2004016740A2 (en) | 2002-08-15 | 2004-02-26 | Epitomics, Inc. | Humanized rabbit antibodies |
US7217797B2 (en) | 2002-10-15 | 2007-05-15 | Pdl Biopharma, Inc. | Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis |
GB0224082D0 (en) | 2002-10-16 | 2002-11-27 | Celltech R&D Ltd | Biological products |
US7223393B2 (en) | 2003-02-07 | 2007-05-29 | Pdl Biopharma, Inc | Amphiregulin antibodies and their use to treat cancer and psoriasis |
US20040223970A1 (en) | 2003-02-28 | 2004-11-11 | Daniel Afar | Antibodies against SLC15A2 and uses thereof |
KR101230724B1 (ko) | 2003-03-04 | 2013-02-07 | 알렉시온 파마슈티칼스, 인코포레이티드 | 항원 제공 세포의 내성을 유도함으로써 자가 면역 질환 치료 방법 |
ATE475673T1 (de) | 2003-03-24 | 2010-08-15 | Zymogenetics Inc | Anti-il-22ra antikörper und bindungspartner und verwendungsmethoden bei entzündung |
GB2401040A (en) | 2003-04-28 | 2004-11-03 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Method for treating interleukin-6 related diseases |
WO2004106375A1 (en) | 2003-05-30 | 2004-12-09 | Merus Biopharmaceuticals B.V. I.O. | Fab library for the preparation of anti vegf and anti rabies virus fabs |
PT2272868E (pt) | 2003-06-05 | 2015-07-07 | Genentech Inc | Terapêutica de combinação para distúrbios de células b |
WO2004113387A2 (en) | 2003-06-24 | 2004-12-29 | Merck Patent Gmbh | Tumour necrosis factor receptor molecules with reduced immunogenicity |
WO2005005604A2 (en) | 2003-06-30 | 2005-01-20 | Centocor, Inc. | Engineered anti-target immunoglobulin derived proteins, compositions, methods and uses |
JP2005101105A (ja) | 2003-09-22 | 2005-04-14 | Canon Inc | 位置決め装置、露光装置、デバイス製造方法 |
WO2005035754A1 (ja) | 2003-10-14 | 2005-04-21 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 機能蛋白質を代替する二重特異性抗体 |
AU2003271174A1 (en) | 2003-10-10 | 2005-04-27 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Double specific antibodies substituting for functional protein |
EP1697415A1 (en) | 2003-11-12 | 2006-09-06 | Biogen Idec MA Inc. | NEONATAL Fc RECEPTOR (FcRn)-BINDING POLYPEPTIDE VARIANTS, DIMERIC Fc BINDING PROTEINS AND METHODS RELATED THERETO |
US20050142133A1 (en) | 2003-12-03 | 2005-06-30 | Xencor, Inc. | Optimized proteins that target the epidermal growth factor receptor |
EP2865687A1 (en) | 2003-12-10 | 2015-04-29 | E. R. Squibb & Sons, L.L.C. | IP-10 antibodies and their uses |
AU2004299833B2 (en) | 2003-12-10 | 2009-05-07 | E. R. Squibb & Sons, L.L.C. | Interferon alpha antibodies and their uses |
AR048210A1 (es) | 2003-12-19 | 2006-04-12 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Un agente preventivo para la vasculitis. |
US20050136051A1 (en) | 2003-12-22 | 2005-06-23 | Bernard Scallon | Methods for generating multimeric molecules |
NZ548325A (en) | 2003-12-25 | 2009-07-31 | Kirin Pharma Kk | Mutants of anti-CD40 antibody |
NL1027975C2 (nl) | 2004-01-09 | 2005-12-23 | Pfizer | Antilichamen tegen MAdCAM. |
JP2008505054A (ja) | 2004-02-11 | 2008-02-21 | ワーナー−ランバート カンパニー リミテッド ライアビリティー カンパニー | Il−6アンタゴニストで骨関節炎を治療する方法 |
KR20070035482A (ko) | 2004-03-24 | 2007-03-30 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 인터로킨-6 안타고니스트를 활성성분으로 함유하는내이장해 치료제 |
EP2053062A1 (en) | 2004-03-24 | 2009-04-29 | Xencor, Inc. | Immunoglobin variants outside the Fc region |
WO2005090405A1 (ja) | 2004-03-24 | 2005-09-29 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | インターロイキン-6受容体に対するヒト型化抗体のサブタイプ |
AR048335A1 (es) | 2004-03-24 | 2006-04-19 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Agentes terapeuticos para trastornos del oido interno que contienen un antagonista de il- 6 como un ingrediente activo |
WO2005112564A2 (en) | 2004-04-15 | 2005-12-01 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Germline and sequence variants of humanized antibodies and methods of making and using them |
AR049390A1 (es) | 2004-06-09 | 2006-07-26 | Wyeth Corp | Anticuerpos contra la interleuquina-13 humana y usos de los mismos |
JP2008504289A (ja) | 2004-06-25 | 2008-02-14 | メディミューン,インコーポレーテッド | 部位特異的突然変異誘発による哺乳動物細胞における組換え抗体の産生の増加 |
MX2007000105A (es) | 2004-07-06 | 2007-07-18 | Bioren Inc | Mutagenesis look-through para crear polipeptidos alterados con propiedades mejoradas. |
SI2471813T1 (sl) | 2004-07-15 | 2015-03-31 | Xencor, Inc. | Optimirane Fc variante |
WO2006028936A2 (en) | 2004-09-02 | 2006-03-16 | Genentech, Inc. | Heteromultimeric molecules |
US20060074225A1 (en) | 2004-09-14 | 2006-04-06 | Xencor, Inc. | Monomeric immunoglobulin Fc domains |
EP1799718A1 (en) | 2004-09-14 | 2007-06-27 | National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC) | Vaccine |
TWI309240B (en) | 2004-09-17 | 2009-05-01 | Hoffmann La Roche | Anti-ox40l antibodies |
US7563443B2 (en) | 2004-09-17 | 2009-07-21 | Domantis Limited | Monovalent anti-CD40L antibody polypeptides and compositions thereof |
JP4958555B2 (ja) | 2004-09-22 | 2012-06-20 | 協和発酵キリン株式会社 | 安定化されたヒトIgG4抗体 |
WO2006047350A2 (en) | 2004-10-21 | 2006-05-04 | Xencor, Inc. | IgG IMMUNOGLOBULIN VARIANTS WITH OPTIMIZED EFFECTOR FUNCTION |
NZ554520A (en) * | 2004-10-22 | 2010-03-26 | Amgen Inc | Methods for refolding of recombinant antibodies |
US7462697B2 (en) | 2004-11-08 | 2008-12-09 | Epitomics, Inc. | Methods for antibody engineering |
AU2005335714B2 (en) | 2004-11-10 | 2012-07-26 | Macrogenics, Inc. | Engineering Fc antibody regions to confer effector function |
JPWO2006067847A1 (ja) | 2004-12-22 | 2008-06-12 | 中外製薬株式会社 | フコーストランスポーターの機能が阻害された細胞を用いた抗体の作製方法 |
PT2476705E (pt) | 2004-12-28 | 2016-02-09 | Innate Pharma | Anticorpos monoclonais contra nkg2a |
US20060275282A1 (en) | 2005-01-12 | 2006-12-07 | Xencor, Inc. | Antibodies and Fc fusion proteins with altered immunogenicity |
JP4986633B2 (ja) | 2005-01-12 | 2012-07-25 | 協和発酵キリン株式会社 | 安定化されたヒトIgG2およびIgG3抗体 |
EP1858924A1 (en) | 2005-02-14 | 2007-11-28 | ZymoGenetics, Inc. | Methods of treating skin disorders using an il-31ra antagonist |
KR101374454B1 (ko) | 2005-03-31 | 2014-03-17 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 회합제어에 의한 폴리펩티드 제조방법 |
EP1870458B1 (en) | 2005-03-31 | 2018-05-09 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | sc(Fv)2 STRUCTURAL ISOMERS |
EP1876236B9 (en) | 2005-04-08 | 2015-02-25 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antibody substituting for function of blood coagulation factor viii |
SG161281A1 (en) | 2005-04-15 | 2010-05-27 | Genentech Inc | Hgf beta chain variants |
EP1874816A4 (en) | 2005-04-26 | 2010-08-25 | Medimmune Inc | MODULATION OF THE ANTIBODY EFFECTOR FUNCTION BY "HINGE" DOMENGINE ENGINEERING |
PE20061324A1 (es) | 2005-04-29 | 2007-01-15 | Centocor Inc | Anticuerpos anti-il-6, composiciones, metodos y usos |
MY148086A (en) | 2005-04-29 | 2013-02-28 | Rinat Neuroscience Corp | Antibodies directed against amyloid-beta peptide and methods using same |
US8003108B2 (en) | 2005-05-03 | 2011-08-23 | Amgen Inc. | Sclerostin epitopes |
JP5047947B2 (ja) | 2005-05-05 | 2012-10-10 | デューク ユニバーシティ | 自己免疫疾患のための抗cd19抗体治療 |
WO2006132363A1 (ja) | 2005-06-10 | 2006-12-14 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | メグルミンを含有するタンパク質製剤の安定化剤、およびその利用 |
JP5224580B2 (ja) | 2005-06-10 | 2013-07-03 | 中外製薬株式会社 | sc(Fv)2部位特異的変異体 |
WO2007002543A2 (en) | 2005-06-23 | 2007-01-04 | Medimmune, Inc. | Antibody formulations having optimized aggregation and fragmentation profiles |
JP2009500458A (ja) | 2005-07-11 | 2009-01-08 | マクロジェニクス,インコーポレーテッド | ヒト化抗cd16a抗体を用いる自己免疫疾患の治療方法 |
ES2526811T3 (es) | 2005-08-10 | 2015-01-15 | Macrogenics, Inc. | Identificación y modificación de anticuerpos con regiones Fc variantes y métodos de uso de estos |
CN103450359B (zh) | 2005-08-19 | 2018-07-24 | 惠氏有限责任公司 | 抗gdf-8的拮抗剂抗体以及在als和其他gdf-8-相关病症治疗中的用途 |
EP1789435B1 (en) | 2005-09-12 | 2010-02-24 | Industry Foundation of Chonnam National University | A method for production of mature natural killer cell |
US20070134234A1 (en) | 2005-09-29 | 2007-06-14 | Viral Logic Systems Technology Corp. | Immunomodulatory compositions and uses therefor |
AU2006300234B2 (en) | 2005-10-14 | 2013-01-10 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Agents for suppressing damage to transplanted islets after islet transplantation |
CN101330930B (zh) | 2005-10-21 | 2011-11-23 | 中外制药株式会社 | 心脏病治疗剂 |
WO2007060411A1 (en) | 2005-11-24 | 2007-05-31 | Ucb Pharma S.A. | Anti-tnf alpha antibodies which selectively inhibit tnf alpha signalling through the p55r |
EP1977763A4 (en) | 2005-12-28 | 2010-06-02 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | STABILIZER PREPARATION CONTAINING ANTIBODIES |
JP2009528264A (ja) | 2006-01-10 | 2009-08-06 | ザイモジェネティクス,インコーポレイティド | Il−31アンタゴニストを用いて神経組織における疼痛及び炎症を治療する方法 |
KR101459159B1 (ko) | 2006-01-12 | 2014-11-12 | 알렉시온 파마슈티칼스, 인코포레이티드 | Ox-2/cd200에 대한 항체 및 이들의 용도 |
US8771686B2 (en) | 2006-01-27 | 2014-07-08 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Methods for treating a disease involving choroidal neovascularization by administering an IL-6 receptor antibody |
EP2006380A4 (en) | 2006-03-23 | 2010-08-11 | Kyowa Hakko Kirin Co Ltd | AGONIST ANTIBODY AGAINST THE HUMAN THROMBOPOIETINE RECEPTOR |
EP2325209A3 (en) | 2006-03-23 | 2011-08-03 | BioArtic Neuroscience AB | Improved protofibril selective antibodies and the use thereof |
EP4218801A3 (en) | 2006-03-31 | 2023-08-23 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antibody modification method for purifying bispecific antibody |
EP2006381B1 (en) | 2006-03-31 | 2016-02-03 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for controlling blood pharmacokinetics of antibodies |
WO2007116962A1 (ja) | 2006-04-07 | 2007-10-18 | Osaka University | 筋再生促進剤 |
JP5420399B2 (ja) | 2006-05-25 | 2014-02-19 | グラクソ グループ リミテッド | 改変型ヒト化抗インターロイキン−18抗体 |
US8080248B2 (en) | 2006-06-02 | 2011-12-20 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Method of treating rheumatoid arthritis with an IL-6R antibody |
DK2374818T3 (da) | 2006-06-02 | 2013-01-21 | Regeneron Pharma | Højaffinitetsantistoffer mod human IL-6-receptor |
CA2654623C (en) | 2006-06-08 | 2016-07-26 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | An anti-nr10/il-31ra antibody for use in preventing or treating an inflammatory disease |
ES2415655T3 (es) | 2006-06-15 | 2013-07-26 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Anticuerpos monoclonales que reconocen selectivamente Metanfetamina y compuestos similares a Metanfetamina |
US20100034194A1 (en) | 2006-10-11 | 2010-02-11 | Siemens Communications Inc. | Eliminating unreachable subscribers in voice-over-ip networks |
US20110236374A1 (en) | 2007-01-24 | 2011-09-29 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Genetically recombinant antibody composition capable of binding specifically to ganglioside gm2 |
WO2008092117A2 (en) | 2007-01-25 | 2008-07-31 | Xencor, Inc. | Immunoglobulins with modifications in the fcr binding region |
WO2008100995A1 (en) | 2007-02-14 | 2008-08-21 | Vaccinex, Inc. | Humanized anti-cd100 antibodies |
DK2426144T3 (en) | 2007-02-23 | 2019-01-07 | Merck Sharp & Dohme | Manipulated Anti-IL-23P19 Antibodies |
EP2138576A4 (en) | 2007-03-16 | 2011-02-23 | Kyowa Hakko Kirin Co Ltd | ANTI-CLAUDIN-4 ANTIBODY |
CN101802015B (zh) | 2007-03-29 | 2015-05-06 | 根马布股份公司 | 双特异性抗体及其制造方法 |
GB0708002D0 (en) | 2007-04-25 | 2007-06-06 | Univ Sheffield | Antibodies |
EP2155790A1 (en) * | 2007-05-31 | 2010-02-24 | Genmab A/S | Method for extending the half-life of exogenous or endogenous soluble molecules |
EP2031064A1 (de) | 2007-08-29 | 2009-03-04 | Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG | Verfahren zur Steigerung von Proteintitern |
EP2197911A2 (en) | 2007-09-14 | 2010-06-23 | Amgen Inc. | Homogeneous antibody populations |
PL2202245T3 (pl) | 2007-09-26 | 2017-02-28 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Sposób modyfikowania punktu izoelektrycznego przeciwciała poprzez podstawienie aminokwasu w cdr |
WO2009041734A1 (ja) | 2007-09-26 | 2009-04-02 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | ヒトトロンボポエチン受容体に対するアゴニスト抗体 |
SG193868A1 (en) | 2007-09-26 | 2013-10-30 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Modified antibody constant region |
WO2009041621A1 (ja) | 2007-09-26 | 2009-04-02 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 抗il-6レセプター抗体 |
MX2010003158A (es) | 2007-09-28 | 2010-04-14 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Anticuerpo anti-glipicano-3 que tiene cinetica mejorada en plasma. |
JO3076B1 (ar) | 2007-10-17 | 2017-03-15 | Janssen Alzheimer Immunotherap | نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe |
WO2009053368A1 (en) | 2007-10-22 | 2009-04-30 | Merck Serono S.A. | Single ifn-beta fused to a mutated igg fc fragment |
AU2008321835B2 (en) | 2007-11-15 | 2014-11-20 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Monoclonal antibody capable of binding to anexelekto, and use thereof |
ES2834741T3 (es) | 2007-12-05 | 2021-06-18 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Anticuerpo anti-NR10 y uso del mismo |
MX2010006097A (es) | 2007-12-05 | 2010-08-04 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Agentes terapeuticos para tratar el prurito. |
RU2528738C2 (ru) | 2007-12-18 | 2014-09-20 | Биоэллаенс К.В. | Антитела, узнающие углеводсодержащий эпитоп на cd43 и сеа, экспрессируемых на раковых клетках и способы их применения |
JP6157046B2 (ja) | 2008-01-07 | 2017-07-05 | アムジェン インコーポレイテッド | 静電的ステアリング(electrostaticsteering)効果を用いた抗体Fcヘテロ二量体分子を作製するための方法 |
KR101666229B1 (ko) | 2008-02-08 | 2016-10-14 | 메디뮨 엘엘씨 | Fc 리간드 친화성이 감소된 항-IFNAR1 항체 |
ES2563483T3 (es) | 2008-04-11 | 2016-03-15 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Molécula de unión a antígeno capaz de unirse repetidamente a dos o más moléculas de antígeno |
ES2487846T3 (es) | 2008-05-01 | 2014-08-25 | Amgen, Inc. | Anticuerpos anti-hepcindina y métodos de uso |
TWI440469B (zh) | 2008-09-26 | 2014-06-11 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Improved antibody molecules |
WO2010064090A1 (en) | 2008-12-02 | 2010-06-10 | Pierre Fabre Medicament | Process for the modulation of the antagonistic activity of a monoclonal antibody |
AR074438A1 (es) | 2008-12-02 | 2011-01-19 | Pf Medicament | Proceso para la modulacion de la actividad antagonista de un anticuerpo monoclonal |
KR20160062207A (ko) | 2008-12-05 | 2016-06-01 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 항nr10 항체 및 그의 이용 |
JP2010210772A (ja) | 2009-03-13 | 2010-09-24 | Dainippon Screen Mfg Co Ltd | 液晶表示装置の製造方法 |
EP2826789A1 (en) | 2009-03-19 | 2015-01-21 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antibody constant region variant |
JP5717624B2 (ja) | 2009-03-19 | 2015-05-13 | 中外製薬株式会社 | 抗体定常領域改変体 |
EP2233500A1 (en) | 2009-03-20 | 2010-09-29 | LFB Biotechnologies | Optimized Fc variants |
PL2417156T3 (pl) | 2009-04-07 | 2015-07-31 | Roche Glycart Ag | Trójwartościowe, bispecyficzne przeciwciała |
WO2010131733A1 (ja) | 2009-05-15 | 2010-11-18 | 中外製薬株式会社 | 抗axl抗体 |
KR20120027055A (ko) | 2009-06-26 | 2012-03-20 | 리제네론 파라마큐티칼스 인코포레이티드 | 천연 면역글로불린 포맷을 가지는 용이하게 분리된 이중특이성 항체 |
WO2011037158A1 (ja) | 2009-09-24 | 2011-03-31 | 中外製薬株式会社 | 抗体定常領域改変体 |
EP2522724B1 (en) | 2009-12-25 | 2020-02-05 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Polypeptide modification method for purifying polypeptide multimers |
LT2519543T (lt) | 2009-12-29 | 2016-10-10 | Emergent Product Development Seattle, Llc | Heterodimerus rišantys baltymai ir jų panaudojimas |
EP2525813B1 (en) | 2010-01-20 | 2017-01-04 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Anti-ilt5 antibodies and ilt5-binding antibody fragments |
CA2787755A1 (en) | 2010-01-20 | 2011-07-28 | Tolerx, Inc. | Immunoregulation by anti-ilt5 antibodies and ilt5-binding antibody fragments |
CA2791652C (en) | 2010-03-02 | 2018-06-12 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Modified antibody composition |
WO2011108714A1 (ja) | 2010-03-04 | 2011-09-09 | 中外製薬株式会社 | 抗体定常領域改変体 |
SG183867A1 (en) | 2010-03-11 | 2012-10-30 | Rinat Neuroscience Corp | ANTIBODIES WITH pH DEPENDENT ANTIGEN BINDING |
SG10201800757TA (en) | 2010-04-20 | 2018-02-27 | Genmab As | Heterodimeric antibody fc-containing proteins and methods for production thereof |
WO2011133886A2 (en) | 2010-04-23 | 2011-10-27 | Genentech, Inc. | Production of heteromultimeric proteins |
WO2011143545A1 (en) | 2010-05-14 | 2011-11-17 | Rinat Neuroscience Corporation | Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them |
EP2598530A2 (en) | 2010-07-29 | 2013-06-05 | Xencor, Inc. | Antibodies with modified isoelectric points |
WO2012020096A1 (en) | 2010-08-13 | 2012-02-16 | Medimmune Limited | Monomeric polypeptides comprising variant fc regions and methods of use |
JP6167040B2 (ja) | 2010-11-05 | 2017-07-19 | ザイムワークス,インコーポレイテッド | Fcドメイン中に突然変異を有する、安定したヘテロ二量体抗体の設計 |
MX2013005024A (es) | 2010-11-08 | 2013-11-21 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Anticuerpo anti-il-6 receptor administrado subcutaneamente. |
MY166429A (en) | 2010-11-17 | 2018-06-26 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Multi-specific antigen-binding molecule having alternative function to function of blood coagulation factor viii |
EP2699263A4 (en) | 2011-04-20 | 2014-12-24 | Liquidating Trust | METHOD FOR REDUCING AN UNWANTED IMMUNE RESPONSE TO A FOREIGN-LIKE IN A HUMAN PATIENT WITH ANTI-CD4 ANTIBODIES OR CD4-BINDING FRAGMENTS THEREOF OR CD4-BINDING MOLECULES |
CN104114579B (zh) | 2011-10-27 | 2020-01-24 | 健玛保 | 异二聚体蛋白的生成 |
DK2773671T3 (da) | 2011-11-04 | 2021-11-15 | Zymeworks Inc | Udformning af stabilt heterodimert antistof med mutationer i fc-domænet |
JP6280031B2 (ja) | 2012-03-29 | 2018-02-14 | 中外製薬株式会社 | 抗lamp5抗体およびその利用 |
PT2838917T (pt) | 2012-04-20 | 2019-09-12 | Merus Nv | Métodos e meios para a produção de moléculas similares a ig heterodiméricas |
US9540449B2 (en) | 2012-08-13 | 2017-01-10 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-PCSK9 antibodies with pH-dependent binding characteristics |
EP2905290B1 (en) | 2012-10-05 | 2019-12-04 | Kyowa Kirin Co., Ltd. | Heterodimeric protein composition |
AU2013337578C1 (en) | 2012-11-02 | 2018-04-12 | Zymeworks Inc. | Crystal structures of heterodimeric Fc domains |
MX368665B (es) | 2013-03-15 | 2019-10-10 | Abbvie Biotherapeutics Inc | Variantes de fc. |
JP6534615B2 (ja) | 2013-09-27 | 2019-06-26 | 中外製薬株式会社 | ポリペプチド異種多量体の製造方法 |
AU2016224409B2 (en) | 2015-02-27 | 2021-01-28 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Composition for treating IL-6-related diseases |
US11142587B2 (en) | 2015-04-01 | 2021-10-12 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for producing polypeptide hetero-oligomer |
EP3398965A4 (en) | 2015-12-28 | 2019-09-18 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | METHOD FOR PROMOTING THE EFFICACY OF PURIFYING A POLYPEPTIDE CONTAINING AN FC REGION |
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2015
- 2015-04-07 US US14/680,250 patent/US10253091B2/en active Active
- 2015-04-16 JP JP2015084291A patent/JP6305371B2/ja active Active
-
2019
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-
2021
- 2021-11-19 US US17/530,542 patent/US20220064264A1/en active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006071877A2 (en) * | 2004-12-27 | 2006-07-06 | Progenics Pharmaceuticals (Nevada), Inc. | Orally deliverable and anti-toxin antibodies and methods for making and using them |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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TWI544077B (zh) | 2016-08-01 |
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