JP5767641B2 - アセトンとアセチル−coaから酵素によって3−ヒドロキシ−3−メチル酪酸を製造する方法 - Google Patents
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Description
−HMGCoA還元酵素での変換による筋細胞膜に傷がない状態の増強
−mTOR経路を介したタンパク質合成の強化
−ユビキチン経路の阻害を介したタンパク質分解の抑制
3−ヒドロキシ−3−メチル酪酸は、筋肉がタンパク質の破壊と闘い、筋肉の修復を助け高い耐久性を維持するように作用するものと仮定されている。これまでに、病院の集中治療室内にいる慢性閉塞性肺疾患を有する患者、HIVおよび癌に伴う筋肉の衰弱、および、外傷を受けた重傷被害者の役に立つことが説明されている。従ってこれは、ボディービルのための筋肉増強剤として、および、筋肉の衰弱を回避するための医薬品としての用途のために商業的に注目されている。米国特許第7026507号は、固形状のナトリウム3−ヒドロキシ−3−メチル酪酸塩の製造方法を説明しており、その方法において、第一の処理工程で、4,4−ジメチルオキセタン−2−オンを水酸化ナトリウム水溶液と反応させ、ナトリウム3−ヒドロキシ−3−メチル酪酸塩の溶液を形成し、続いて適切な場合に濃縮した後、この溶液を次の処理工程で合成シリカに適用するが、ここで得られた生成物を適切な場合に乾燥させる。
(1) アセトンのオキソ(すなわちC=O)基の炭素原子と、式(I):
で示される活性化されたアセチル基を提供する化合物のメチル基に相当する炭素原子(C 2 )との間の共有結合の形成を触媒することができる酵素を用いた、アセトンと、式(I)で示される活性化されたアセチル基を提供する化合物との酵素による変換を含む3−ヒドロキシ−3−メチル酪酸の製造方法。
(2) Xが補酵素Aである、(1)に記載の方法。
(3) Xがアシルキャリアータンパク質である、(1)に記載の方法。
(4) 前記酵素が、HMGCoAシンターゼ(EC2.3.3.10)の活性を有する酵素であるか、または、前記酵素が、C−C結合を切断/縮合するリアーゼ、例えばHMGCoAリアーゼ(EC4.1.3.4)の活性を有する酵素であるか、または、前記酵素が、PksGタンパク質である、(1)または(2)に記載の方法。
(5) 前記変換が、アセトンを生産して請求項1に記載の酵素を発現することができる生物の存在下で認識されることを特徴とする、(1)〜(4)のいずれか一項に記載の方法。
(6) (a)アセトンを生産できる特性;および、(b)アセトンのオキソ(すなわちC=O)基の炭素原子と、式(1)で示される活性化されたアセチル基を提供する化合物のメチル基に相当する炭素原子(C 2 )との間の共有結合の形成を触媒することができる酵素を発現する特性;を特徴とする組換え生物。
(7) 前記酵素が、HMGCoAシンターゼ(EC2.3.3.10)の酵素活性、および/または、例えばHMGCoAリアーゼ(EC4.1.3.4)、および/または、PksGタンパク質のようなC−C結合を切断/縮合するリアーゼの酵素活性を有する酵素である、(6)に記載の生物。
(8) 前記生物が、もともとアセトンを生産する能力を有する生物であり、好ましくはクロストリジウム属、バチルス属、または、シュードモナス属に属する微生物、より好ましくはクロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)種、クロストリジウム・ベイジェリンキ(Clostridium beijerinckii)種、クロストリジウム・セルロリティカム(Clostridium cellulolyticum)種、バチルス・ポリミクサ(Bacillus polymyxa)種、または、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)種に属する微生物である、(6)または(7)に記載の生物。
(9) 前記生物が、本来アセトンを生産しないが、(a)生物中でアセトン生産を可能にするのに必要な遺伝子を導入することによってアセトンを生産できるように遺伝子組換えされている生物から誘導される、(6)または(7)に記載の生物。
(10) 前記生物が、光合成することができる生物である、(9)に記載の方法。
(11) 3−ヒドロキシ−3−メチル酪酸を生産するための(7)〜(10)のいずれか一項に記載の生物の使用。
(12) (7)〜(10)のいずれか一項に記載の生物を含む組成物。
(13) (i)アセトン;および、(ii)式(I):
で示される活性化されたアセチル基を提供する化合物;および、(iii)アセトンのオキソ(すなわちC=O)基の炭素原子と、式(I)で示される活性化されたアセチル基を提供する化合物のメチル基に相当する炭素原子(C 2 )との間の共有結合の形成を触媒することができる酵素、を含む組成物。
(14) 3−ヒドロキシ−3−メチル酪酸を生産するための(1)に記載の酵素の使用。
(15) アセトンと、以下の式(I):
で示される活性化されたアセチル基を提供する化合物との酵素による変換を含む、3−ヒドロキシ−3−メチル酪酸を生産するためのアセトンの使用。
本発明に係るプロセスで用いられるHMGCoAシンターゼは、天然に存在するHMGCoAシンターゼでもよいし、または、天然に存在するHMGCoAシンターゼから誘導されるHMGCoAシンターゼであってもよく、このような誘導は、例えば突然変異導入によってなされるものでもよいし、または、例えば酵素活性、安定性などを改変または改善するその他の改変によってなされるものでもよい。
本発明に係るプロセスで用いられるPksGタンパク質は、天然に存在するPksGタンパク質であってもよいし、または、例えば酵素活性、安定性などを変更または改善する突然変異またはその他の変更の導入によって天然に存在するPksGタンパク質から誘導されるPksGタンパク質であってもよい。
原核生物のHMGCoAリアーゼとしては、例えば、ブルセラ・アボルタス(Brucella abortus)(ユニプロット受託番号Q2YPL0およびB2S7S2)、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)(ユニプロット受託番号O34873)、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)(上記で引用したFu et al.)、シュードモナス・シリンガエ(Pseudomonas syringae)(ユニプロット受託番号Q4ZTL2、および、Q4ZRW6)、シュードモナス・メバロニイ(Pseudomonas mevalonii)(ユニプロット受託番号P137Q3)、シュワネラ・ピエゾトレランス(Shewanella piezotolerans)(ユニプロット受託番号B8CRY9)、セルビブリオ・ジャポニカス(Cellvibrio japonicus)(ユニプロット受託番号B3PCQ7)、アゾトバクター・ビネランジ(Azotobacter vinelandii)(ユニプロット受託番号C1DJK8、および、C1DL53)、ヘルミニモナス・アルセニコキシダンス(Herminiimonas arsenicoxydans)(ユニプロット受託番号A4G1F2)、および、ブルクホルデリア・セノセパシア(Burkholderia cenocepacia)(ユニプロット受託番号A2VUW7)由来のものが挙げられる。
本発明に係るプロセスで用いられるHMGCoAリアーゼは、天然に存在するHMGCoAリアーゼであってもよいし、または、例えば酵素活性、安定性などを変更または改善する突然変異またはその他の変更の導入によって天然に存在するHMGCoAリアーゼから誘導されるHMGCoAリアーゼであってもよい。
基質としてアセトンを受容するが基質としてアセトアセテートに対して低い親和性しか有さないかまたは基質としてアセトアセテートを受容しなくなったHMGCoAリアーゼの改変型は、天然に存在するHMGCoAリアーゼから誘導することもできるし、または、すでに改変された、最適化された、または、計画的に合成されたHMGCoAリアーゼから誘導することもできる。
インビトロでの反応は、細胞を用いない反応、すなわち無細胞反応のことと理解されている。インビトロでの方法を行うことに関して、この反応のための基質および酵素/酵素(複数)を、酵素/酵素(複数)を活性化して酵素による変換を引き起こすような条件(緩衝液、温度、補因子など)下でインキュベートする。このような反応は、3−ヒドロキシ−3−メチル酪酸塩が生産されるのに十分な時間進行させることができる。3−ヒドロキシ−3−メチル酪酸塩および/または3−ヒドロキシ−3−メチルブチリル−CoAの生産は、それらを誘導体化した後に薄層クロマトグラフィー、LC/MS、および、比色分析によって分離した後に標準化合物と比較することによって検出が可能である。
上記で説明した反応工程1および2、ならびにそれらを触媒する酵素はアセトン合成に固有のものではなく、様々な生物で見出すことができる。それに対して、アセトアセテート脱炭酸酵素(EC4.1.1.4)によって触媒される反応工程3は、アセトンを生産することができる生物でしか見出されない。
上述した酵素の酵素活性、具体的にはHMGCoAシンターゼ、および/または、C−C結合を切断/縮合するリアーゼ、例えばHMGCoAリアーゼ、および/または、PksGタンパク質の酵素活性を測定する方法はそれぞれ当業界でよく知られており、上述した通りである。
その他の実施態様において、用語「組換え」は、生物が、それぞれの酵素の発現が、それに相当する非遺伝子組換え生物と比較して増加するように、上記で定義されたような本来その生物中に存在する酵素の発現を制御する調節領域で遺伝子組換えされていることを意味する。高いという用語における「より高い発現」の意味を、以下でさらに説明する。
特に好ましい実施態様において、上記微生物は、藻類であり、より好ましくは珪藻に属する藻類である。
(a) アセトンを生産できる特性
(b) アセトンのオキソ(すなわちC=O)基の炭素原子と、上記で定義されたように活性化されたアセチル基を提供する化合物のメチル基に相当する炭素原子(C2)との間の共有結合の形成を触媒することができる酵素、好ましくはHMGCoAシンターゼ(EC2.3.3.10)の活性を有する酵素、および/または、C−C結合を切断/縮合するリアーゼの活性を有する酵素、例えばHMGCoAリアーゼ(EC4.1.3.4)、および/または、PksGタンパク質を発現する特性
本発明に係る生物中で発現される酵素、具体的にはHMGCoAシンターゼ、C−C結合を切断/縮合するリアーゼ、例えばHMGCoAリアーゼ、および/または、PksGタンパク質の源、性質、特性、配列などに関しては、本発明に係る方法に関してすでに上述したことと同じものが適用される。
特に好ましい実施態様において、上記微生物は、藻類であり、より好ましくは珪藻に属する属に由来する藻類である。
(a) アセトンを生産できる特性
(b) アセトンのオキソ(すなわちC=O)基の炭素原子と、上記で定義されたような活性化されたアセチル基を提供する化合物のメチル基に相当する炭素原子(C2)との間の共有結合の形成を触媒することができる酵素、好ましくはHMGCoAシンターゼ(EC2.3.3.10)の活性を有する酵素、および/または、C−C結合を切断/縮合するリアーゼの活性を有する酵素、例えばHMGCoAリアーゼ(EC4.1.3.4)、および/または、3−ヒドロキシ−3−メチル酪酸を生産するためのPksGタンパク質を発現する特性
すなわち、本発明はまた、本発明に係る生物/微生物の3−ヒドロキシ−3−メチル酪酸を生産するための使用にも関する。
さらに本発明はまた、(i)アセトン;および、(ii)上記で定義されたような活性化されたアセチル基を提供する化合物;および、(iii)アセトンのオキソ(すなわちC=O)基の炭素原子と、上記で定義されたような活性化されたアセチル基を提供する化合物のメチル基に相当する炭素原子(C2)との間の共有結合の形成を触媒することができる酵素を含む組成物にも関する。
さらに本発明はまた、3−ヒドロキシ−3−メチル酪酸を生産するために、アセトンのオキソ(すなわちC=O)基の炭素原子と、上記で定義されたような活性化されたアセチル基を提供する化合物のメチル基に相当する炭素原子(C2)との間の共有結合の形成を触媒することができる酵素の使用にも関する。
最終的に、本発明はまた、上記で定義されたようなアセトンと活性化されたアセチル基を提供する化合物との酵素による変換を含む、3−ヒドロキシ−3−メチル酪酸を生産するためのアセトンの使用にも関する。好ましい実施態様において、酵素による変換は、本発明に係る方法に関して上述したような酵素、より好ましくはHMGCoAシンターゼの酵素活性を有する酵素、および/または、C−C結合を切断/縮合するリアーゼの酵素活性を有する酵素、例えばHMGCoAリアーゼ、および/または、PksGタンパク質によって達成され、最も好ましくは本発明に係る生物の使用によって達成される。
図2:HMG−CoAシンターゼによって触媒される反応の反応スキームである。
図4:PksGタンパク質によって触媒される反応を含むpksX経路反応の反応スキームである。
式中、Xは、S−CH2−CH2−NH−CO−CH2−CH2−NH−CO−CH(OH)−C(CH3)2−CH2−O−PO2H−C10H13N5O7P(補酵素A)、S−CH2−CH2−NH−CO−CH2−CH2−NH−CO−CH(OH)−C(CH3)2−CH2−O−PO2H−ポリペプチド(アシルキャリアータンパク質)、S−CH2−CH2−NH−CO−CH2−CH2−NH−CO−CH(OH)−C(CH3)2−CH2−OH(パンテテイン)、S−CH2−CH2−NH−CO−CH3(N−アセチル−システアミン)、S−CH3(メタンチオール)、S−CH2−CH(NH2)−CO2H(システイン)、S−CH2−CH2−CH(NH2)−CO2H(ホモシステイン)、S−CH2−CH(NH−C5H8NO3)−CO−NH−CH2−CO2H(グルタチオン)、S−CH2−CH2−SO3H(補酵素M)、および、OH(酢酸)を意味する。
図7:ニワトリ(Gallus gallus)(P23228)由来のHMGCoAシンターゼの存在下におけ。アセチル−CoAおよびアセトンからの3−ヒドロキシ−3−メチル酪酸塩の形成のマススペクトルである。
図9:実施例7におけるスタフィロコッカス・エピデルミディス(S. epidermidis)のHMGCoAシンターゼの反応に関するミカエリス−メンテンプロットである。
これらの酵素クラスが、真核生物全体にわたりどの程度の多様性がみられるかを示すために、12のHMG−CoAシンターゼおよび8のHMG−CoAリアーゼのパネルを選択して重複のないタンパク質セットを作製した。ユニバーサル・プロテイン・リソース・データベース・ユニプロット(Universal Protein Resource Database Uniprot)(http://www.uniprot.org/)で複数回の配列ベースおよびテキストベースの検索を行うことによってこれらのタンパク質を同定した。これらははいずれも、対象の酵素クラスに特徴的な保存されたタンパク質ドメインおよびモチーフのような固有の特徴を含む。大量のタンパク質セットをスクリーニングしなくても配列多様性を効果的に調べるために、最初の酵素プールを85%よりも高い相同性を有する配列のクラスターにグループ分けし、続いて各クラスターの代表となる単一の候補配列を選択することにより、最初の酵素プールの範囲を限定した。HMG−CoAシンターゼパネルおよびリアーゼパネルそれぞれからのいずれか2種のタンパク質間におけるタンパク質の配列同一性は、30%〜80%、および、50%〜80%であった。
遺伝子クローニング
真核生物由来のHMG−CoAシンターゼおよびリアーゼをコードする核酸配列を大腸菌(E. coli)のコドンに適合するようにし、化学合成(GeneArt)によって遺伝子を得た。
プラスミドを大腸菌(E. coli)BL21細菌(ノバジェン(Novagen))にエレクトロポレーションし、続いてこれをアンピシリンを含むLB寒天のペトリ皿上に塗り広げた。その培養物を、30℃で、0.5Mのソルビトール、5mMのベタイン、100μg/mlのアンピシリンを含むTB培地上で、穏やかに振盪しながら増殖させた。OD(600nm)が0.8に達したら、IPTGを最終濃度が1mMになるまで添加し、穏やかに振盪しながら20℃で16時間発現させ続けた。続いて細菌の細胞を4℃、10,000rpm、20分の遠心分離で回収し、これを−80℃で凍結させた。
1.6gの細胞ペレットを300mMのNaCl、5mMのMgCl2、1mMのDTT(pH8)を含む50mMのNa2HPO4緩衝液5mlに再懸濁することによって細胞抽出物を製造した。続いてこの調製物に20μlのリソナーゼ(lysonase)(ノバジェン(Novagen))を添加し、これを室温で10分間、および、氷上で20分間インキュベートした。細胞の溶解を、氷上の超音波の水槽中で5分間の超音波破砕処理を3回行うことによって達成し、パルスとパルスとの間に抽出物をホモジナイズした。続いて未精製抽出物を4℃、10,000rpm、20分間の遠心分離で透明化した。
透明な上清を、6−ヒスチジンの尾部を有するタンパク質の特異的な固定が可能なPROTINO−1000NMDAカラム(マッハライ・ナーゲル(Macherey-Nagel))にローディングした。このカラムを洗浄し、酵素を、300mMのNaCl、5mMのMgCl2、1mMのDTT、250mMのイミダゾール(pH8)を含む50mMのNa2HPO4緩衝液4mlで溶出させた。続いて酵素を含む分画を濃縮し、アミコン(Amicon)のウルトラ−410kDaフィルターユニット(ミリポア(Millipore))で脱塩し、0.5mMのDTTを含む40mMのトリスHCl(pH8)250μlに再懸濁した。タンパク質濃度はブラッドフォード法によって測定した。
実施例3:天然の基質のアセトアセチル−CoAおよびアセチル−CoAを用いたHMG−CoAシンターゼ活性の測定
Clinkenbeard et al. (J. Biol. Chem. 250 (1975), 3108-3116に従ってHMG−CoAシンターゼ活性を測定した。HMG−CoA合成のための標準的な分析培地混合物は、合計体積1ml中に40mMのトリスHCl(pH8)、1mMのMgCl2、100μMのアセトアセチル−CoA、200μMのアセチル−CoA、0.5mMのDTTを含む。ミトコンドリアHMG−CoAシンターゼは、この酵素で観察された阻害を回避するためにMgCl2の非存在下で分析した(Reed et al., J. Biol. Chem. 250 (1975), 3117-3123)。0.02mg/mLの酵素を添加することによって反応を開始させた。
HMG−CoAリアーゼ活性を、Mellanby J et al. (Methods of Enzymatic Analysis; Bergmeyer Ed. (1963), 454-458)に従って測定した。40mMのトリスHCl(pH8)、1mMのMgCl2、0.5mMのDTT、0.4mMのHMG−GoA、0.2mMのNADH、5ユニットの3−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼを含む完全な反応混合物(1ml)を5分間インキュベートし、その後0.005mg/mlのHMG−CoAリアーゼを添加し、続いて反応の進行を340nmにおける吸光度の減少でモニターした。コントロール分析を酵素の非存在下で行った。
3−ヒドロキシ−3−メチル酪酸塩の合成の完全な反応液は、40mMのトリスHCl(pH8)、5〜50mMのアセチル−CoA、100〜500mMのアセトン、1MgCl2(ただしミトコンドリアHMG−CoAシンターゼを除く)、0.5mMのDTT、および、0.2〜8mg/mlの範囲で様々な濃度の酵素を含む。コントロール反応を酵素およびいずれか1種の基質の非存在下で行った。
チャバネゴキブリ(Blattella germanica)(ドイツのゴキブリ)P54961(配列番号6)、
ガルス・ガルス(Gallus gallus)(ニワトリ)P23228(配列番号7)、
ホモ・サピエンス(Homo sapiens)(ヒト)Q01581(配列番号8)、
シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)P54873(CAA58763)(配列番号4)、
カエノラブディティス・エレガンス(Caenorhabditis elegans)P54871(配列番号1)、
シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)(***酵母)P54874(配列番号2)、
サッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)(パン屋で用いる酵母)P54839(配列番号3)、
細胞性粘菌(Dictyostelium discoideum)(変形菌類)Q86HL5(配列番号10)、
ロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)Q03WZ0(配列番号)、
スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)Q8CN06(配列番号11)、
ラクトバチルス・デルブリュッキイ(Lactobacillus delbrueckii)Q1GAH5(配列番号24)、
スタフィロコッカス・ヘモリティカス(Staphylococcus haemolyticus)Q4L958(I98>野生型タンパク質と比較した差V)(配列番号25)。
3−ヒドロキシ−3−メチルブチリル−CoA合成は、放射標識した[2−14C]アセトンの存在下で行った。3−ヒドロキシ−3−メチルブチリル−CoA合成のための完全な反応液は、40mMのトリスHCl(pH8)、5〜50mMのアセチル−CoA、100〜500mMのアセトン、1〜10mMのMgCl2、0.5mMのDTT、および、0.5〜7mg/mlの範囲で様々な濃度の酵素を含む。TLCまたはHPLCで反応混合物を分離した後に生成物の形成を解析した。
以下の条件で、可変のアセトン濃度および一定のアセチル−CoA濃度(10mM)を用いて反応速度パラメーターを測定した:
40mMのトリスHCl(pH8)、
2mMのMgCl2、
0〜1Mのアセトン。
1mlの反応混合物に3mgの精製した酵素を添加することによって反応を開始させた。続いて混合物を振盪しないで37℃で40時間インキュベートした。
3−ヒドロキシ−3−メチル酪酸塩のイソブテンへの分解を起こす熱化学条件を適用した(Pressman et al., JACS, 1940, 2069-2080):まず反応混合物のpHを6NのHClを用いてpH4に調節し、続いてサンプルをガスクロマトグラフィーバイアル(インターキム(Interchim))に移した。バイアルを密封し、110℃で4時間インキュベートしたところ、3−ヒドロキシ−3−メチル酪酸塩のイソブテンへの分解が起こった。
上部空間のガスを1ミリリットル回収し、FID検出器およびCPシリカプロット(SilicaPlot)カラム(バリアン(Varian))を備えたHP5890ガスクロマトグラフ(HP)に注入した。参照として市販のイソブテンを用いた。イソブテンシグナルから初めにサンプル中に存在する3−ヒドロキシ−3−メチル酪酸塩の量を計算した。
Claims (13)
- 式(I):
で示される活性化されたアセチル基を提供する化合物とアセトンとを酵素によって変換することを含む3−ヒドロキシ−3−メチル酪酸の製造方法であって、
アセトンのオキソ(すなわちC=O)基の炭素原子と、式(I)で示される活性化されたアセチル基を提供する化合物のメチル基に相当する炭素原子(C2)との間の共有結合の形成を触媒することができる酵素であって、HMGCoAシンターゼ(EC2.3.3.10)の活性を有する酵素を用いる、上記方法。 - 前記変換が、アセトンを生産して請求項1に記載の酵素を発現することができる生物の存在下でなされる、請求項1に記載の方法。
- (a)アセトンを生産できる特性;および、
(b)アセトンのオキソ(すなわちC=O)基の炭素原子と、XがS−CH 2 −CH 2 −NH−CO−CH 2 −CH 2 −NH−CO−CH(OH)−C(CH 3 ) 2 −CH 2 −O−PO 2 H−O−PO 2 H−C 10 H 13 N 5 O 7 P(補酵素A)である式(1)で示される活性化されたアセチル基を提供する化合物のメチル基に相当する炭素原子(C2)との間の共有結合の形成を触媒することができる酵素であって、HMGCoAシンターゼ(EC2.3.3.10)の活性を有する酵素を発現する特性;
を特徴とする組換え微生物。 - 前記微生物が、もともとアセトンを生産する能力を有する微生物である、請求項3に記載の微生物。
- クロストリジウム属、バチルス属、または、シュードモナス属に属する微生物である、請求項4に記載の微生物。
- 前記微生物が、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)種、クロストリジウム・ベイジェリンキ(Clostridium beijerinckii)種、クロストリジウム・セルロリティカム(Clostridium cellulolyticum)種、バチルス・ポリミクサ(Bacillus polymyxa)種、または、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)種に属する微生物である、請求項5に記載の微生物。
- 前記微生物が、本来アセトンを生産しないが、(a)生物中でアセトン生産を可能にするのに必要な遺伝子を導入することによってアセトンを生産できるように遺伝子組換えされている生物から誘導される、請求項3に記載の微生物。
- 前記微生物が、光合成することができる微生物である、請求項7に記載の微生物。
- 3−ヒドロキシ−3−メチル酪酸を生産するための、請求項3〜8のいずれか一項に記載の微生物の使用。
- 請求項3〜8のいずれか一項に記載の微生物を含む組成物。
- 3−ヒドロキシ−3−メチル酪酸を生産するための請求項1に記載の酵素の使用。
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