ES2536548T3

ES2536548T3 - Método para la producción enzimática de ácido 3-hidroxi-3-metilbutírico a partir de acetona y acetil-CoA

Info

Publication number: ES2536548T3
Application number: ES10765977.3T
Authority: ES
Inventors: Philippe Marlière
Original assignee: Scientist of Fortune SA
Current assignee: Scientist of Fortune SA
Priority date: 2009-09-15
Filing date: 2010-09-14
Publication date: 2015-05-26
Anticipated expiration: 2030-09-14
Also published as: IL218245A0; EP2478109B1; CN102597254B; JP5767641B2; DK2478109T3; BR112012005737A8; MY159420A; US9556460B2; HUE025695T2; RU2012114690A; CA2772279A1; MX2012003224A; AU2010297362B2; RU2573389C2; US20150240271A1; KR101774064B1; PE20121436A1; CN102597254A; EP2478109A1; WO2011032934A1

Abstract

Un método para la producción de ácido 3-hidroxi-3-metilbutírico, que comprende la conversión enzimática de acetona y un compuesto que proporciona un grupo acetilo activado caracterizado por la siguiente fórmula (I):**Fórmula** en la que X es S-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-5 NH-CO-CH(OH)-C(CH3)2-CH2-O-PO2H-O-PO2H-C10H13N5O7P (coenzima A), usando una enzima que es capaz de catalizar la formación de un enlace covalente entre el átomo de carbono del grupo oxo (es decir, el C>=O) de acetona y el átomo de carbono (C2) correspondiente al grupo metilo de dicho compuesto que proporciona un grupo acetilo activado según la fórmula (I), y en el que dicha enzima es una enzima que tiene la actividad de una HMG CoA sintasa (EC 2.3.3.10).

Description

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Staphylococcus o Streptococcus muestran solamente alrededor de 20% de identidad con aquellas de HMG CoA sintasa humana y aviar. En algunas fuentes, se da a conocer que las HMG CoA sintasas bacterianas y sus contrapartes animales muestran solamente alrededor de 10% de identidad de secuencia global (Sutherlin et al, J. Bacteriol. 184 (2002), 4065-4070). Sin embargo, los restos de aminoácidos implicados en las reacciones de 5 acetilación y condensación están conservados entre HMG CoA sintasas bacterianas y eucariotas (Campobasso et al., J. Biol. Chem. 279 (2004), 44883-44888). Se ha determinado la estructura tridimensional de tres enzimas HMG CoA sintasas, y en principio los aminoácidos cruciales para la reacción enzimática están bien caracterizados (Campobasso et al., loc. cit.; Chun et al., J. Biol. Chem. 275 (2000), 17946-17953; Nagegowda et al., Biochem. J. 383 (2004), 517-527; Hegardt, Biochem. J. 338 (1999), 569-582). En eucariotas, existen dos formas para la HMG

10 CoA sintasa, es decir, una forma citosólica y una forma mitocondrial. La forma citosólica desempeña un papel clave en la producción de colesterol y otros isoprenoides, y la forma mitocondrial está implicada en la producción de cuerpos cetónicos.

En principio, en el contexto de la presente invención se puede usar cualquier enzima HMG CoA sintasa, en particular procedente de organismos procariotas o eucariotas.

15 Las HMG CoA sintasas procariotas se describen, por ejemplo, de Staphylococcus aureus (Campobasso et al., loc. cit.; número de acceso Uniprot Q9FD87), Staphylococcus epidermidis (número de acceso Uniprot Q9FD76), Staphylococcus haemolyticus (número de acceso Uniprot Q9FD82), Enterococcus faecalis (Sutherlin et al., loc. cit.; número de acceso Uniprot Q9FD7), Enterococcus faecium (número de acceso Uniprot Q9FD66), Streptococcus pneumonia (número de acceso Uniprot Q9FD56), Streptococcus pyogenes (número de acceso Uniprot Q9FD61) y

20 Methanobacterium thermoautotrophicum (número de acceso AE000857), Borrelia burgdorferi (número de acceso NCBI BB0683).

Además, la siguiente Tabla A enumera algunas HMG CoA sintasas conocidas de procariotas:

Tabla A

Número de acceso Swissprot/TrEmbl: Organismo

Q9YAS0: Aeropyrum pernix

A7Z4Y2: Bacillus amyloliquefaciens

P40830|2874037340: Bacillus subtilis

B8G795: Chloroflexus aggregans

A5EUV4: Dichelobacter nodosus

A5FM54: Flavobacterium johnsoniae

Q18GC4: Haloquadratum walsbyi

B9LS15: Halorubrum lacusprofundi

A9B8F0: Herpetosiphon aurantiacus

A2BMY8: Hyperthermus butylicus

Q5FLB7: Lactobacillus acidophilus

Q03QR0: Lactobacillus brevis

Q1GAH5: Lactobacillus delbrueckii

B2GBL1: Lactobacillus fermentum

B1MZ51: Leuconostoc citreum

Q03WZ0: Leuconostoc mesenteroides

A4YH99: Metallosphaera sedula

A5UNI8: Methanobrevibacter smithii

Q58941: Methanocaldococcus jannaschii

Q12UR3: Methanococcoides burtonii

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Número de acceso Swissprot/TrEmbl: Organismo

A6USZ1: Methanococcus aeolicus

A4FWW6: Methanococcus maripaludis

A6UPL1: Methanosarcina mazei

A2STY2: Methanocorpusculum labreanum

Q8TVL0: Methanopyrus_andleri

Q8PYJ0: Methanosarcina mazei

Q2NHU7: Methanosphaera stadtmanae

Q2FPH4: Methanospirillum hungatei

B2HGT6: Mycobacterium marinum

Q3IMZ7: Natronomonas pharaonis

Q8EP69: Oceanobacillus iheyensis

Q04F95: Oenococcus oeni

Q03FU5: Pediococcus pentosaceus

Q6L233: Picrophilds torridus

A6G7N7: Plesiocystis pacifica

A4WJ12: Pyrobaculum arsenaticum

A7NHZ7: Roseiflexus castenholzii

Q8CN06: Staphylococcus epidermidis

Q4L958: Staphylococcus haemolyticus

Q4A0D6: Staphylococcus saprophyticus

B4U364: Streptococcus equi

Q8DUI5: Streptococcus mutans

Q4J933: Sulfolobus acidocaldarius

Q971K8: Sulfolobus tokodaii

Q9HI87: Thermoplasma acidophilum

Q31EW2: Thiomicrospira crunogena

Q51798: Pyrococcus furiosus

A5VJB7: Lactobacillus reuteri

Q7CF79: Streptococcus pyogenes

Q9UWU0: Sulfolobus solfataricus

Se describen HMG CoA sintasas eucariotas, por ejemplo, de hongos, tales como Schizosaccharomyces pombe (números de acceso U32187 y P54874), Saccharomyces cerevisiae (número de acceso P54839), plantas, tales como Arabidopsis thaliana (números de acceso X83882 y P54873), Pinus sylvestris (número de acceso X96386), y animales, tales como Caenorhabditis elegans (número de acceso P54871), Mus musculus (mitocondrial; número de acceso P54869 y Hegardt, Biochem. J. 338 (1999), 569-582), Rattus norvegicus (mitocondrial: número de acceso P22791 y Hegardt, Biochem. J. 338 (1999); citosólica: número de acceso P17425), 569-582), hámster chino

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y/o terminador de la transcripción y/o sitios de unión al ribosoma, etc. La técnica anterior ya describe microorganismos que se han modificado genéticamente para que sean capaces de producir acetona. En particular, se han introducido genes procedentes de, por ejemplo, Clostridium acetobutylicum en E. coli permitiendo de ese modo la síntesis de acetona en E. coli, una bacteria que no produce de forma natural acetona (Bermejo et al., Appl. Environ. Microbiol. 64 (1998); 1079-1085; Hanai et al., Appl. Environ. Microbiol. 73 (2007), 7814-7818). En particular, Hanai et al. (lugar citado) muestran que es suficiente introducir una secuencia de ácido nucleico que codifica una acetoacetato descarboxilasa (tal como la de Clostridium acetobutylicum) a fin de lograr la producción de acetona en

E. coli, indicando que las enzimas endógenas en E. coli que catalizan las etapas 1 y 2 de reacción mencionadas anteriormente (es decir, los productos de expresión de los genes atoB y atoAD de E. coli) son suficientes para proporcionar sustrato para la producción de acetona.

En una realización particularmente preferida, el organismo, preferiblemente un microorganismo, empleado en el método según la invención es un organismo/microorganismo recombinante derivado de un organismo/microorganismo que no produce de forma natural acetona pero que se ha modificado genéticamente, como se describe anteriormente, para producir acetona y que expresa una enzima que es capaz de catalizar la formación de un enlace covalente entre el átomo de carbono del grupo oxo (es decir, el C=O) de acetona y el átomo de carbono (C2) correspondiente al grupo metilo del compuesto que proporciona un grupo acetilo activado como se define anteriormente. El término “recombinante”, en este contexto, significa preferiblemente que el organismo es recombinante en el sentido de que se ha modificado genéticamente además para expresar una enzima como se describe anteriormente. El término “recombinante”, en una realización, significa que el organismo está modificado genéticamente para contener una molécula de ácido nucleico extraña que codifica una enzima como se define anteriormente, es decir, una HMG CoA sintasa.

Con respecto a la definición de la expresión “molécula de ácido nucleico extraña”, se aplica lo mismo que ya se ha expuesto anteriormente.

El término “recombinante”, en otra realización, significa que el organismo está modificado genéticamente en la región reguladora que controla la expresión de una enzima como se define anteriormente que aparece de forma natural en el organismo para conducir a un incremento en la expresión de la enzima respectiva en comparación con un organismo correspondiente no modificado genéticamente. El significado de la expresión “mayor expresión” se describe posteriormente más abajo.

Tal modificación de una región reguladora se puede lograr mediante métodos conocidos por la persona experta en la técnica. Un ejemplo es intercambiar el promotor de origen natural por un promotor que permita una mayor expresión,

o modificar el promotor de origen natural para mostrar una mayor expresión. De este modo, en esta realización, el organismo contiene en la región reguladora del gen que codifica una enzima como se define anteriormente una molécula de ácido nucleico extraña que no aparece de forma natural en el organismo y que conduce a una mayor expresión de la enzima en comparación con un organismo correspondiente no modificado genéticamente.

Preferiblemente, tal organismo/microorganismo se caracteriza por que la expresión/actividad de dicha enzima, es decir, la HMG CoA sintasa, es mayor en el organismo/microorganismo recombinante en comparación con el organismo/microorganismo correspondiente no modificado genéticamente. Una “mayor” expresión/actividad significa que la expresión/actividad de la enzima, es decir, la HMG CoA sintasa, en el organismo/microorganismo genéticamente modificado es al menos 10%, preferiblemente al menos 20%, más preferiblemente al menos 30% o 50%, incluso más preferiblemente al menos 70% u 80%, y particularmente preferido al menos 90% o 100% mayor que en el organismo/microorganismo correspondiente no modificado genéticamente. En realizaciones incluso más preferidas, el incremento en la expresión/actividad puede ser al menos 150%, al menos 200%, o al menos 500%. En realizaciones particularmente preferidas, la expresión es al menos 10 veces, más preferiblemente al menos 100 veces, e incluso más preferido al menos 1000 veces mayor que en el organismo/microorganismo correspondiente no modificado genéticamente.

El término “mayor” expresión/actividad también cubre la situación en la que el organismo/microorganismo correspondiente no modificado genéticamente no expresa dicha enzima, es decir, una HMG CoA sintasa, de forma que la expresión/actividad correspondiente en el organismo/microorganismo no modificado genéticamente es cero. Con respecto a los métodos para medir el nivel de expresión o actividad, se aplica lo mismo que ya se ha dicho anteriormente.

El término “organismo”, como se usa en el contexto de la presente invención, se refiere en general a cualquier tipo posible de organismo, en particular organismos eucariotas, organismos procariotas y arqueobacterias. El término incluye animal no humano, plantas, hongos, bacterias y arqueobacterias. El término también incluye células aisladas

o agregados celulares de tales organismos, como tejido o callo.

En una realización preferida, el organismo es un microorganismo. El término “microorganismo”, en el contexto de la presente invención, se refiere a células procariotas, en particular bacterias, así como a hongos, tales como levaduras, y también a algas y arqueobacterias. En una realización preferida, el microorganismo es una bacteria. En principio, se puede usar cualquier bacteria. Las bacterias preferidas a emplear en el procedimiento según la invención son bacterias del género Bacillus, Clostridium, Pseudomonas o Escherichia. En una realización

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particularmente preferida, la bacteria pertenece al género Escherichia, e incluso más preferido a la especie Escherichia coli.

En otra realización preferida, el microorganismo es un hongo, más preferiblemente un hongo del género Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Aspergillus o Trichoderma, e incluso más preferiblemente de la especie Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Aspergillus niger o de la especie Trichoderma reesei.

En todavía otra realización preferida, el microorganismo es un microorganismo fotosintéticamente activo, tal como bacterias que son capaces de llevar a cabo la fotosíntesis, o microalgas.

En una realización particularmente preferida, el microorganismo es un alga, más preferiblemente un alga que pertenece a las diatomeas.

Si se usan microorganismos en el contexto del método de la presente invención, también es concebible llevar a cabo el método según la invención de una manera en la que se empleen dos tipos de microorganismos, es decir, un tipo que produce acetona y un tipo que usa la acetona producida por el primer tipo de microorganismos para convertirla con la ayuda de una enzima como se define aquí anteriormente.

Cuando el procedimiento según la invención se lleva a cabo in vivo usando microorganismos que proporcionan la actividad/actividades enzimáticas respectivas, los microorganismos se cultivan en condiciones de cultivo adecuadas que permiten la producción de la reacción o reacciones enzimáticas. Las condiciones de cultivo específicas dependen del microorganismo específico empleado, pero son bien conocidas por la persona experta en la técnica. Las condiciones de cultivo se escogen generalmente de una manera tal que permiten la expresión de los genes que codifican las enzimas para las reacciones respectivas. La persona experta en la técnica conoce diversos métodos para mejorar y ajustar de forma fina la expresión de ciertos genes en ciertas etapas del cultivo, tal como la inducción de la expresión génica por inductores químicos o mediante un desplazamiento de la temperatura.

En otra realización preferida, el organismo empleado en el método según la invención es un organismo que es capaz de fotosíntesis, tal como una planta o microalga. En principio, se puede usar cualquier planta posible, es decir, una planta monocotiledónea o una planta dicotiledónea. Es preferible usar una planta que se puede cultivar a una escala agrícolamente significativa y que permita producir grandes cantidades de biomasa. Los ejemplos son gramíneas como Lolium, cereales como centeno, cebada, avena, mijo, maíz, y otras plantas que almacenan almidón, como patata, o plantas que almacenan azúcar, como caña de azúcar o remolacha azucarera. También es concebible el uso de tabaco o de plantas de vegetales tales como tabaco, pimiento, pepino, berenjena, etc. Otra posibilidad es el uso de plantas que almacenan aceite, tales como colza, olivos, etc. También es concebible el uso de árboles, en particular árboles de crecimiento rápido tales como eucalipto, álamo o árbol del caucho (Hevea brasiliensis).

La presente invención también se refiere a un organismo, preferiblemente un microorganismo, que se caracteriza por las siguientes características:

(a): es capaz de producir acetona; y

(b): expresa una enzima que es capaz de catalizar la formación de un enlace covalente entre el átomo de carbono del grupo oxo (es decir, el C=O) de acetona y el átomo de carbono (C2) correspondiente al grupo metilo del compuesto que proporciona un grupo acetilo activado como se define anteriormente, es decir, una enzima con la actividad de una HMG CoA sintasa (EC 2.3.3.10).

Con respecto a la fuente, naturaleza, propiedades, secuencia, etc., de la enzima, es decir, la HMG CoA sintasa, expresada en el organismo según la invención, se aplica lo mismo que lo que se ha expuesto anteriormente en relación con el método según la invención.

En una realización preferida, el organismo según la invención es un organismo, preferiblemente un microorganismo, que tiene naturalmente la capacidad para producir acetona, es decir, la característica (a) mencionada anteriormente es una característica que el organismo, preferiblemente microorganismo, muestra de forma natural. De este modo, preferiblemente el organismo es un microorganismo que pertenece al género Clostridium, Bacillus o Pseudomonas, más preferiblemente a la especie Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Clostridium cellutolyticum, Bacillus polymyxa o Pseudomonas putida.

En otra realización preferida, el organismo, preferiblemente microorganismo, según la invención es un organismo/microorganismo genéticamente modificado derivado de un organismo/microorganismo que no produce de forma natural acetona pero que se ha modificado genéticamente para producir acetona, es decir, introduciendo el gen o genes necesarios para permitir la producción de acetona en el organismo/microorganismo. En principio, cualquier organismo/microorganismo se puede modificado genéticamente de esta manera. Las enzimas responsables de la síntesis de acetona se han descrito anteriormente. Los genes que codifican las enzimas correspondientes son conocidos en la técnica y se pueden usar para modificar genéticamente un organismo dado, preferiblemente microorganismo, para producir acetona.

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En una realización preferida, un organismo/microorganismo modificado genéticamente derivado de un organismo/microorganismo que no produce de forma natural acetona se modifica para que contenga una secuencia nucleotídica que codifica una enzima que cataliza la conversión de acetoacetato en acetona mediante descarboxilación, por ejemplo una acetoacetato descarboxilasa (EC 4.1.1.4). Las secuencias nucleotídicas procedentes de varios organismos que codifican esta enzima son conocidas en la técnica, por ejemplo el gen adc de Clostridium acetobutylicum. Más preferiblemente, el organismo/microorganismo se modifica genéticamente para transformarlo con una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima capaz de catalizar la etapa 2 de reacción mencionada anteriormente de la síntesis de acetona, es decir, la conversión de acetoacetil CoA en acetoacetato.

Incluso más preferiblemente, el organismo/microorganismo se modifica genéticamente para transformarlo con una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima capaz de catalizar la etapa 1 de reacción mencionada anteriormente de la síntesis de acetona, es decir, la condensación de dos moléculas de acetil CoA en acetoacetatil CoA.

En una realización particularmente preferida, el organismo/microorganismo se modifica genéticamente para transformarlo con una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima capaz de catalizar la etapa 1 de reacción mencionada anteriormente de la síntesis de acetona y con una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima capaz de catalizar la etapa 2 de reacción mencionada anteriormente de la síntesis de acetona, o con una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima capaz de catalizar la etapa 1 de reacción mencionada anteriormente de la síntesis de acetona y con una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima capaz de catalizar la etapa 3 de reacción mencionada anteriormente de la síntesis de acetona, o con una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima capaz de catalizar la etapa 2 de reacción mencionada anteriormente de la síntesis de acetona y con una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima capaz de catalizar la etapa 3 de reacción mencionada anteriormente de la síntesis de acetona, o con una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima capaz de catalizar la etapa 1 de reacción mencionada anteriormente de la síntesis de acetona y con una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima capaz de catalizar la etapa 2 de reacción mencionada anteriormente de la síntesis de acetona y con una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima capaz de catalizar la etapa 3 de reacción mencionada anteriormente de la síntesis de acetona.

Los métodos para preparar el organismo genéticamente modificado mencionado anteriormente, preferiblemente organismos/microorganismos, son bien conocidos en la técnica. De este modo, generalmente, el organismo/microorganismo se transforma con un constructo de ADN que permite la expresión de la enzima respectiva en el organismo/microorganismo. Tal constructo comprende normalmente la secuencia codificante en cuestión enlazada a secuencias reguladoras que permiten la transcripción y traducción en la célula hospedante respectiva, por ejemplo un promotor y/o potenciador y/o terminador de la transcripción y/o sitios de unión al ribosoma, etc. La técnica anterior ya describe organismos, en particular microorganismos que se han modificado genéticamente para que sean capaces de producir acetona. En particular, se han introducido genes procedentes de, por ejemplo, Clostridium acetobutylicum en E. coli permitiendo de ese modo la síntesis de acetona en E. coli, una bacteria que no produce de forma natural acetona (Bermejo et al., Appl. Environ. Microbiol. 64 (1998); 1079-1085; Hanai et al., Appl. Environ. Microbiol. 73 (2007), 7814-7818). En particular, Hanai et al. (lugar citado) muestran que es suficiente introducir una secuencia de ácido nucleico que codifica una acetoacetato descarboxilasa (tal como la de Clostridium acetobutylicum) a fin de lograr la producción de acetona en E. coli, indicando que las enzimas endógenas en E. coli que catalizan las etapas 1 y 2 de reacción mencionadas anteriormente (es decir, los productos de expresión de los genes atoB y atoAD de E. coli) son suficientes para proporcionar sustrato para la producción de acetona.

En una realización adicionalmente preferida, el organismo, preferiblemente un microorganismo, según la invención se modifica genéticamente para expresar una enzima como se define anteriormente que es capaz de catalizar la formación de un enlace covalente entre el átomo de carbono del grupo oxo (es decir, el C=O) de acetona y el átomo de carbono (C2) correspondiente al grupo metilo del compuesto como se define anteriormente que proporciona un grupo acetilo activado. En este contexto, el término “recombinante” significa en un primer aspecto contiene una molécula de ácido nucleico extraña que codifica una enzima que es capaz de catalizar la formación de un enlace covalente entre el átomo de carbono del grupo oxo (es decir, el C=O) de acetona y el átomo de carbono (C2) correspondiente al grupo metilo del compuesto que proporciona un grupo acetilo activado, es decir, una molécula de ácido nucleico extraña que codifica una HMG CoA sintasa. El término “extraño”, en este contexto, significa que la molécula de ácido nucleico no se produce de forma natural en dicho organismo/microorganismo. Esto significa que no aparece en la misma estructura o en la misma localización en el organismo/microorganismo. En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico extraña es una molécula recombinante que comprende un promotor y una secuencia codificante que codifica dicha enzima, es decir, la HMG CoA sintasa, en la que el promotor que conduce la expresión de la secuencia codificante es heterólogo con respecto a la secuencia codificante. Heterólogo, en este contexto, significa que el promotor no es el promotor que conduce de forma natural la expresión de dicha secuencia codificante, sino que es un promotor que conduce de forma natural la expresión de una secuencia codificante diferente, es decir, deriva de otro gen, o es un promotor sintético o un promotor quimérico. Preferiblemente, el promotor es un promotor heterólogo al organismo/microorganismo, es decir, un promotor que no se produce de forma natural en el organismo/microorganismo respectivo. Incluso más preferiblemente, el promotor es un promotor inducible. Los promotores para conducir la expresión en diferentes tipos de organismos, en particular microorganismos, son bien conocidos por la persona experta en la técnica. En otra realización preferida, la molécula

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Figura 9: Gráfica de Michaelis-Menten para la reacción con la HMG CoA sintasa de S. epidermidis descrita en el Ejemplo 7.

Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la invención.

Ejemplo 1

Método bioinformático usado para crear bases de datos de HMG-CoA sintasas y de HMG-CoA liasas (que caen fuera del alcance de las reivindicaciones)

Se seleccionó un 12 HMG-CoA sintasas y 8 HMG-CoA liasas para crear un conjunto no redundante de proteínas con el objetivo de representar la diversidad de estas clases enzimáticas como se encuentran a lo largo de los organismos eucariotas. Estas proteínas se identificaron llevando a cabo búsquedas múltiples a base de secuencias y a base de texto en la base de datos de Universal Protein Resource Uniprot (http://www.uniprot.org/). Todas contienen características únicas tales como dominios proteicos conservados y motivos característicos para la clase enzimática de interés. A fin de cubrir de forma eficaz la diversidad de secuencias sin tener que cribar un gran conjunto de proteínas, el grupo inicial de enzimas se estrechó agrupándolas en agrupamientos de secuencias con homología mayor que 85% y seleccionando entonces una única secuencia candidato representativa de cada agrupamiento. La identidad de las secuencias proteicas osciló de 30% a 80% y de 50% a 80% entre cualesquiera dos proteínas del panel de HMG-CoA sintasas y del panel de liasas respectivamente.

Se aplicó el mismo enfoque para seleccionar las HMG-CoA sintasas y HMG-CoA liasas de organismos procariotas. El conjunto creado contenía 50 proteínas homólogas a HMG-CoA sintasas, incluyendo proteínas pksG, y 59 proteínas homólogas a HMG-CoA liasas.

Ejemplo 2

Clonación, expresión y purificación de una colección de HMG-CoA liasas y HMG-CoA sintasas (que cae fuera del alcance de las reivindicaciones)

Clonación de los genes:

Las secuencia de ácidos nucleicos que codifican HMG-CoA sintasa y liasa de organismo eucariota se optimizaron para la preferencia de codones de E. coli, y los genes se obtuvieron mediante síntesis química (GeneArt).

Los genes que codifican HMG-CoA sintasas y liasas de organismos procariotas se clonaron a partir de ADN genómico de orígenes diferentes mediante técnicas recombinantes habituales. Estos genes se insertaron entonces en los vectores pET 25b y pET 22b que contienen una etiqueta de His (Novagen), respectivamente, para organismos eucariotas y procariotas.

Sobreexpresión en E. coli:

Los plásmidos se electroporaron en bacterias de E. coli BL21 (Novagen), que entonces se extendieron sobre una cápsula de Petri con LB-agar que contiene ampicilina. Los cultivos se hicieron crecer a 30ºC en medio TAMBIÉN, que contiene 0,5 M de sorbitol, 5 mM de betaína, 100 g/ml de ampicilina, en agitación moderada. Cuando la OD (600 nm) alcanzó 0,8, se añadió IPTG a una concentración final de 1 mM, y se llevó a cabo la expresión durante 16 horas a 20ºC con agitación moderada. Las células bacterianas se cosecharon entonces mediante centrifugación a 4ºC, 10.000 rpm, 20 minutos, y se congelaron a -80ºC.

Preparación de los extractos celulares:

Los extractos celulares se preparan resuspendieron 1,6 g de pelete celular en 5 ml de tampón de Na2HPO4 50 mM, que contiene 300 mM de NaCl, 5 mM de MgCl2, 1 mM de DTT pH 8. Entonces se añadieron 20 l de lysonase (Novagen) a las preparaciones, que se incubaron durante 10 min. a temperatura ambiente y 20 min. en hielo. La lisis celular se logra mediante tratamiento con ultrasonidos triple durante 5 minutos en un baño de agua ultrasónico en hielo y homogeneización del extracto entre cada pulso. Los extractos brutos se aclaran entonces mediante centrifugación a 4ºC, 10.000 rpm, 20 minutos.

Purificación de proteínas:

Los sobrenadantes transparentes se cargaron en una columna PROTINO-1000 Ni-IDA (Macherey-Nagel) que permite la inmovilización específica de proteínas que portan colas 6 histidinas. La columnas se lavaron, y las enzimas se eluyeron con 4 ml de tampón de Na2HPO4 50 mM, que contiene 300 mM de NaCl, 5 mM de MgCl2, 1 mM de DTT, 250 mM de imidazol pH 8. Las fracciones que contienen la enzima se concentraron entonces y se desalaron en una unidad de filtración de 10 kDa Amicon Ultra-4 (Millipore) y se resuspendieron en 250 l de Tris-HCl 40 mM pH 8, que contiene 0,5 mM de DTT. La concentración de proteína se determina mediante el método de Bradford.

La homogeneidad de las enzimas purificadas varió de 20% a 75%.

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Ejemplo 3

Medida de la actividad de HMG-CoA sintasa usando los sustratos naturales acetoacetil-CoA y acetol-CoA

La actividad de la HMG-CoA sintasa se mide según Clinkenbeard et al. (J. Biol. Chem. 250 (1975), 3108-3116). La mezcla de medio de ensayo estándar para HMG-CoA sintasas contiene 40 mM de Tris-HCl pH 8, 1 mM de MgCl2,

5 100 M de acetoacetil-CoA, 200 M de acetil-CoA, 0,5 mM de DTT, en un volumen total de 1 ml. Las HMG-CoA sintasas mitocondriales se evalúan en ausencia de MgCl2, para evitar la inhibición observada para esta enzima (Reed et al., J. Biol. Chem. 250. (1975), 3117-3123). La reacción se inicia mediante adición de 0,02 mg/ml de enzima.

Se llevó a cabo un ensayo de control en ausencia de enzima. La actividad de HMG-CoA sintasa se mide

10 monitorizando la disminución en la absorbancia a 303 nm que acompaña a la desaparición de la forma enolato de acetoacetil-CoA dependiente de acetil-CoA. Para explicar la desaparición no específica de acetoacetil-CoA, los resultados obtenidos en el ensayo de control que carece de enzima se restaron de los resultados obtenidos en las muestras de ensayo. El coeficiente de absorción aparente para acetoacetil-CoA en las condiciones del ensayo fue 5600 M-1 .

15 Tabla 1: Actividad fisiológica de algunas HMG-CoA sintasas purificadas o enzimas homólogas a HMG CoA sintasas

Número de acceso Uniprot: Organismo Actividad fisiológica mol/min · mg proteína

P54961: Blattella germanica (Cucaracha alemana) 0,02

P23228: Gallus gallus (Pollo) 0,02

Q01581: Homo sapiens (Humano) 0,03

P54873: Arabidopsis thaliana 1,19

P54871: Caenorhabditis elegans 0,23

P54874: Schizosaccharomyces pombe (levadura de fisión) 0,61

P54839: Saccharomyces cerevisiae (levadura de panadero) 0,28

P54872: Dictyostelium discoideum (moho del cieno) 0,09

Q86HL5: Dictyostelium discoideum (moho del cieno) 0,02

Q9M6U3: Brassica juncea 0,02

A5FM54: Flavobacterium johnsoniae 0,02

Q03WZ0: Leuconostoc mesenteroides 0,28

Q2NHU7: Methanosphaera stadtmanae 0,02

Q8CN06: Staphylococcus epidermidis 0,07

Q03QR0: Lactobacillus brevis 0,18

A6UPL1: Methanosarcina mazei 0,01

B2HGT6: Mycobacterium marinum 0,01

Q4L958: Staphylococcus haemolyticus 0,18

Q4A0D6: Staphylococcus saprophyticus 0,08

Q1GAH5: Lactobacillus delbrueckii 0,32

Ejemplo 4

Medida de la actividad de HMG-CoA liasa usando el sustrato natural HMG-CoA (que cae fuera del alcance de las 17

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Claims

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