CN105940111B

CN105940111B - 从3-羟基羧酸经3-羟基羧基-核苷酸制备烯烃

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Publication number: CN105940111B
Application number: CN201480074731.9A
Authority: CN
Inventors: M·阿尼斯莫瓦; M·阿拉尔; P·马利埃
Original assignee: Global Bioenergies SA; Scientist of Fortune SA
Current assignee: Global Bioenergies SA; Scientist of Fortune SA
Priority date: 2013-12-03
Filing date: 2014-12-02
Publication date: 2020-03-27
Anticipated expiration: 2034-12-02
Also published as: AU2014359396B2; CN105940111A; JP2016538871A; CA2930530A1; US10017787B2; US20160298139A1; EP3077524A1; WO2015082447A1; BR112016012531A2; AU2014359396A1

Abstract

本申请描述了从3‑羟基羧酸经3‑羟基羧基‑核苷酸制备烯烃(例如丙烯、乙烯、1‑丁烯、异丁烯、异戊烯、丁二烯或异戊二烯)的方法。

Description

从3-羟基羧酸经3-羟基羧基-核苷酸制备烯烃

本发明涉及经生物学过程生成烯烃的方法。更具体而言，本发明涉及从3-羟基羧酸经3-羟基羧基-核苷酸制备烯烃(例如丙烯、乙烯、1-丁烯、异丁烯、异戊烯、丁二烯或异戊二烯)的方法。

目前，大量的化合物都源自石油化学制品。烯烃类(例如乙烯、丙烯、不同的丁烯、或者戊烯)用于塑料工业，例如用于生产聚丙烯或聚乙烯，以及用于其它化学工业领域及燃料领域。

乙烯，最简单的烯烃，处于工业有机化学的核心：其是世界上最广泛生产的有机化合物。其特别是用于生产聚乙烯，主要的塑料。乙烯还可以经反应(氧化、卤化)转化为许多工业上可使用的产品。

丙烯类似地发挥重要作用：其聚合作用获得塑料物质聚丙烯。该产品关于抗力、密度、固体性、变形性和透明度的技术特性是不等的。聚丙烯的世界产量自从1954年其发明以来持续增加。

丁烯以四种形式存在，其中一种，异丁烯，进入了甲基叔丁基醚(MTBE) 的组成，其是一种用于汽车燃料的抗爆剂。异丁烯还可以用于生产异辛烯，其随后可以还原成异辛烷(2,2,4-三甲基戊烷)；异辛烷非常高的辛烷值使其成为所谓“汽油”发动机的最佳燃料。

戊烯、己烯和庚烯根据双键的位置和构型以许多种形式存在。这些产物具有实际工业应用，但不如乙烯、丙烯或丁烯重要。

全部这些烯烃类目前都是经石油产品的催化裂解来制备(或者在己烯的情况下，从煤炭或天然气通过Fisher-Tropsch法的衍生物制备)。因此，其成本自然与油价挂钩。此外，催化裂解有时与大量的技术困难相关，其增加了加工的复杂性和生产成本。在烯烃化学家族中，异戊二烯(2-甲基-1,3- 丁二烯)是萜类基序，其经聚合作用产生橡胶。其它萜类可以通过化学、生物或混合途径开发为有用的产品，例如生物燃料，或用于制造塑料。WO2008/113041提出了一种用于从重新获得的资源制备烃类的生物学方法，其中微生物转化一种包含脂肪酰基链的底物。烯烃类的制备，特别是末端烯烃(在2位单-或二-取代的乙烯：H₂C＝C(R¹)(R²))明显地较少进行深入研究。已经描述了通过酵母菌小红酵母进行的异戊酸向异丁烯的转化 (Fujii T.等人,Appl.Environ.Microbiol.,1988,54:583)，但是表现为非常低的转变率数值(k_cat是1x10^-5sec^-1)的该反应的效能远远达不到工业应用的要求。通过该方法进行的异丁烯的大规模生物合成似乎是非常不令人满意的，因为其需要一分子的亮氨酸合成并降解以形成一分子的异丁烯。并且，催化该反应的酶使用血红素作为辅因子，其自身很难在细菌中重组表达并提高酶参数。已经描述了勉强能够天然地从异戊酸制备异丁烯的其它微生物；所得产率甚至比用小红酵母所得的那些更低(Fukuda H.等人,Agric. Biol.Chem.,1984,48:1679)。

相同的研究也在丙烯的天然制备中有描述：许多微生物能够产生丙烯，但仍具有非常低的产率。很久以来已经知道通过植物制备乙烯(Meigh等人, 1960,Nature,186:902)。按照所述的代谢途径，甲硫氨酸是乙烯的前体 (Adams和Yang,PNAS,1979,76:170)。还已经描述了2-酮戊二酸的转化 (Ladygina N等人,Process Biochemistry 2006,41:1001)。由于乙烯的二碳分子的制备消耗四碳或五碳分子前体，这些途径显示其工业应用在物质上和能量上是不利的。

WO2010/001078描述了通过使用具有脱羧酶活性的酶进行的3-羟基链烷酸的酶促转化来制备烯烃类的方法。该方法是有利的，因为其有助于避免使用石油产品，以降低生产塑料和燃料的成本，并且可以通过允许碳以固体形式储存而具有相当大的全球环境影响。尽管在WO 2010/001078 中所述的方法可以通过酶促反应来制备烯烃，其仍然需要可以扩大至工业规模的在生物***中能够制备烯烃的进一步方法。本申请满足了该需要。

本发明涉及制备烯烃的方法，其特征在于其包括3-羟基羧化物通过生物学方法、特别是酶方法的转化，其中3-羟基羧化物在第一个步骤中经酶促转化为3-羟基羧基-核苷酸(nucleotidylate(也可称为核苷酸酯))，并且其中由此制备的3-羟基羧基-核苷酸随后转化为烯烃。在第一个步骤中3-羟基羧化物向3-羟基羧基-核苷酸的酶促转化包括核苷酸化反应。制备的3-羟基羧基-核苷酸向烯烃的转化包括二氧化碳的消除和脱核苷酸化反应。

当用于本发明时，后缀“羧化物/羧酸/羧酸盐”可以互换地代表羧酸离子 (COO-)或羧酸(COOH)。

如本文所用的术语“3-羟基羧化物”代表与以下通式I对应的分子：

其中R¹和R³独立地选自氢(-H)、甲基(-CH₃)、乙基(-CH₂-CH₃)、异丙基(-CH₂(CH₃)₂)、乙烯基(-CH＝CH₂)和异丙烯基(-C(CH₃)＝CH₂)，且其中 R²和R⁴独立地选自氢(-H)和甲基(-CH₃)。

按照本发明的方法，3-羟基羧化物是和与以下通式II对应的协同底物一起进行酶促转化：

其中X是选自

O-PO₃H₂ 单磷酸酯，

O-PO₂H-O-PO₃H₂ 二磷酸酯，和

O-SO₃H 硫酸酯，

且其中Y是选自

OH 羟基，和

O-PO₃H₂ 单磷酸酯，

且其中Z是核碱基，选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶和次黄嘌呤，

且其中W是选自氢(-H)和羟基(OH)，

得到以下通式III的对应的3-羟基羧基-核苷酸：

其中R¹、R²、R³和R⁴具有与上文式I所述相同的含义，且其中W、 Y和Z具有与上文式II所述相同的含义。

按照本发明的方法，由此制备的3-羟基羧基-核苷酸进一步转化为烯烃。

通过本发明方法制备的烯烃是与以下通式IV对应的分子：

其中R¹、R²、R³和R⁴具有与上文式I所述相同的含义。

在优选的实施方案中，按照本发明方法转化的3-羟基羧化物是选自下表1中所述的3-羟基羧化物，且转化为表1中所示的对应的烯烃。

表1

如上文所述，按照本发明的方法，3-羟基羧化物首先转化为3-羟基羧基-核苷酸。这是通过核苷酸化反应完成，即其中核苷酸基从协同底物(式 II)转移至3-羟基羧化物的羧基基团。该通用反应如图1所示。

式II的协同底物的实例是核糖核苷酸类，例如ATP、CTP、GTP、 UTP和ITP，优选ATP，以及ADP、CDP、GCP、UDP和IDP，优选 ADP。其它实例是脱氧核糖核苷酸类，例如dATP、dCTP、dGTP、dTTP 和dITP。其它实例是3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸酯(PAPS)或腺苷-5’-磷酸硫酸酯(APS)。

在优选的实施方案中，Z是腺嘌呤。在另一项优选的实施方案中，Z 是腺嘌呤且W是H。在另一项优选的实施方案中，Z是腺嘌呤，W是H 且X是单磷酸酯或二磷酸酯。在另一项优选的实施方案中，Z是腺嘌呤， W是H，X是硫酸酯且Y是OH或单磷酸酯。在另一项特别优选的实施方案中，Z是腺嘌呤，W和Y是OH。在另一项优选的实施方案中，Z是腺嘌呤，W是H且Y是OH。在进一步优选的实施方案中，Z是腺嘌呤，W 和Y是OH且X是单磷酸酯或二磷酸酯。在另一项优选的实施方案中，Z 是腺嘌呤，W是OH，X是硫酸酯，Y是OH或单磷酸酯。

在优选的实施方案中，3-羟基羧化物在本发明方法的第一个步骤中转化产生3-羟基羧基-腺苷酸。

在一项优选的实施方案中，式II的协同底物是ATP或ADP，且第一次酶促转化是腺苷酰化。该反应的概要如图2所示。生成烯烃的整个反应流程图如图3所示。

按照本发明的方法，3-羟基羧化物向3-羟基羧基-核苷酸的转化可以优选地通过酶促反应完成，特别是通过使用催化核苷酸基转移到分子上的酶。

在本发明方法的一项实施方案中，归类为“形成腺苷酸的酶”的酶类用于3-羟基羧化物向3-羟基羧基-核苷酸的转化。术语“形成腺苷酸的酶” 理解为含义是能够催化以下反应的酶：

底物+ATP→底物-腺苷酸+二磷酸

(参见例如Schmelz和Naismith(Curr.Opin.Struc.Biol.19(2009), 666-671；Linne等人,FEBS Letters 581(2007),905-910)。尽管ATP被称为协同底物，已知形成腺苷酸的酶可以使用其它协同底物例如ADP、UTP、 CTP、GTP和ITP。因此，在本发明范围内术语“形成腺苷酸”并非限定所述酶类仅产生腺苷酸化的产物，而是仅用作用于本领域的确定术语，还涵盖了可以使用其它如式II所定义的协同底物的各种酶类的可能性。优选地，核苷酸基部分所转移到的底物上的基团是羧基。如Schmelz和 Naismith(在上述引文中)所述，通过将正常羟基离去基团转化为腺苷单磷酸酯，腺苷酸化酶将非反应性的羧酸活化。这些酶类具有以下在不同数据库中引用的共有结构特征：

1.InterPro数据库(InterPro44.0；2013年9月25日披露)

IPR020845，结合AMP，保守位点 (http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/IPR020845)

IPR000873(http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/IPR000873)

2.Prosite

PS00455(http://prosite.expasy.org/PS00455)

描述：推定的结合AMP的结构域标志

模式：

[LIVMFY]-{E}-{VES}-[STG]-[STAG]-G-[ST]-[STEI]-[SG]-x-[PASLI VM]-[KR].

(入口名AMP_BINDING；登录号PS00455；Entry type PATTERN； Date MAY-1991(CREATED)；DEC-2004(DATA UPDATE)；OCT-2013 (INFO UPDATE).Pattern [LIVMFY]-{E}-{VES}-[STG]-[STAG]-G-[ST]-[STEI]-[SG]-x-[PASLIVM]- [KR])

3.Pfam

这些酶类在Pfam数据库中的登录号是PF00501。

形成腺苷酸的酶类是例如Schmelz和Naismith(Curr.Opin.Struc.Biol. 19(2009),666-671)中所述。基于序列分析已经确定了形成腺苷酸的酶的超家族，其可以细分成三个紧密相关的亚家族。

第一个亚家族(称为I类)包含以下亚类：

-非核糖体肽合成酶类(NRPS)的腺苷酸化结构域；

-酰基-或芳基-CoA合成酶；

-(萦光素酶)氧化还原酶；和

-多聚乙酰合酶(PKS)的腺苷酸化结构域。

如下文进一步所述的AMP依赖性的合成酶和连接酶也可归为此类。

第二个亚家族(称为II类)包含：

-氨酰基-tRNA合成酶。

第三个亚家族(称为III类)包含：

-NIS酶类。

NIS酶是涉及不依赖NRPS的铁载体(NIS)合成的酶类。

在优选的实施方案中，本发明方法使用了属于上文所述I类的酶。

在一项实施方案中，所述酶属于I类并且属于包含非核糖体肽合成酶 (NRPS)的腺苷酰化结构域的亚类(Marahiel,Chem.Rev.97(1997), 2651-2673；Sundlov等人,ChemBiol.19(2012),188-198；Sundlov等人, Acta Cryst.D69(2013).1482-1492；May等人,PNAS 99(2002), 12120-12125；Keating,Biochemistry 39(2000),4729-4739)。

在另一项实施方案中，所述酶属于I类并且属于包含酰基-或芳基-CoA 合成酶的亚类(Soupene和Kuypers,Exp Biol Med 233(2008),507-521； Mashek等人,FutureLipidol.2(2007),465-476；Ehlting等人,The Plant Journal 27(2001),455-465)。

在另一项实施方案中，所述酶属于I类并且属于包含(萦光素酶)氧化还原酶类的亚类。此类酶的一个代表性实例以及本发明方法中所用的优选的酶是萤火虫萦光素酶(Oba等人,FEBS Letters 540(2003),251-254)。

在另一项实施方案中，所述酶属于形成腺苷酸的酶的I类并且属于包含多聚乙酰合酶(PKS)的腺苷酰化结构域的亚类。此类酶的代表性实例是白纹黄单孢菌的多聚乙酰-肽合酶(Huang等人,Microbiology 147(2001), 631-642)。

属于上文所述形成腺苷酸的酶的I类的酶被归类为EC 6.2.1超家族。基本上任何归类为EC 6.2.1的酶都可以用于本发明的方法。此类形成腺苷酸的酶的实例是：

EC 6.2.1.1 乙酸:CoA连接酶(形成AMP)；

EC 6.2.1.2 丁酸:CoA连接酶(形成AMP)；

EC 6.2.1.3 长链脂肪酸:CoA连接酶(形成AMP)；

EC 6.2.1.12 4-香豆酸-CoA连接酶；

EC 6.2.1.20 长链脂肪酸:[酰基-载体蛋白]连接酶(形成AMP)；

EC 6.2.1.33 4-氯苯甲酸:CoA连接酶；以及

EC 6.2.1.36 3-羟基丙酸:CoA连接酶(形成AMP)。

全部此类酶具有共同的结构基序，其如InterPro中所引用 (InterPro44.0；2013年9月25日披露)，序号为InterPro IPR020845，结合 AMP，保守位点(http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/IPR020845)和 IPR000873(http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/IPR000873)。这些酶类在 Pfam数据库中的登录号是PF00501。

因此，在一项优选的实施方案中，3-羟基羧化物向对应的3-羟基羧基- 核苷酸的酶促转化可以例如通过使用乙酸:CoA连接酶(形成AMP)(EC 6.2.1.1)来完成。乙酸:CoA连接酶是催化以下反应的酶类：

ATP+乙酸+CoA→AMP+二磷酸+乙酰-CoA

该反应是两步反应，其包括从乙酸和ATP形成乙酰-AMP中间体以及乙酰基基团向CoA的转移。这些酶类存在于从细菌到人类的大部分活的有机体中。

已经在许多有机体中描述了这些酶类的存在，包括原核生物和真核生物，特别是细菌、藻类、真菌、植物和动物，例如酿酒酵母、热醋穆尔氏菌、激烈火球菌、闪烁古球菌、Methanothermobacter thermoautotropicus、联合鬃毛甲烷菌、甲烷八叠球菌属物种、枯草芽孢杆菌、肠沙门氏菌、费氏弧菌(Aliivibrio fischeri)、大肠杆菌、死海盐盒菌、大豆根瘤菌、日本大耳白兔、绵羊、产黄青霉、布拉克须霉、小隐孢子虫、构巢裸孢壳、小眼虫、铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、需氧热棒菌(Pyrobaculum aerophilum)、球形红杆菌、玫瑰杆菌属物种、粗糙链孢霉、辐射松、菠菜、红豆杉属物种、玉米、拟南芥、豌豆、苋属物种、大麦、褐家鼠、小家鼠、旱獭(Mormota monax)、欧洲牛和智人。来自酿酒酵母的酶已经在例如Jogl和Tong (Biochemistry 43(2004),1425-1431)中公开了晶体结构。基本上，任何已知的乙酸:CoA连接酶都可以用于本发明的方法。在本发明的一方面，使用来自酿酒酵母的乙酸:CoA连接酶(Jogl和Tong；在上述引文中)。

在另一项优选的实施方案中，3-羟基羧化物向对应的3-羟基羧基-核苷酸的酶促转化可以例如通过使用丁酸:CoA连接酶(形成AMP)(EC 6.2.1.2) 来完成。丁酸:CoA连接酶是催化以下反应的酶类：

ATP+羧酸+CoA→AMP+二磷酸+酰基-CoA

这些酶类参与丁酸代谢。已经在许多有机体中描述了这些酶类的存在，包括原核生物和真核生物，特别是细菌、藻类、真菌、植物和动物，例如天蓝色链霉菌、鸟分枝杆菌、产黄青霉、多变拟青霉、铜绿假单胞菌、盘状网柱菌(Dictyostelium discoideum)、土拨鼠、绵羊、野猪、欧洲牛、小家鼠、褐家鼠和智人。

在一项优选的实施方案中，3-羟基羧化物向对应的3-羟基羧基-核苷酸的酶促转化可以例如通过使用长链脂肪酸:CoA连接酶(形成AMP)(EC 6.2.1.3)(也称为脂肪酰-CoA合成酶；FACS)来完成。这些酶类催化以下反应：

ATP+长链脂肪酸+CoA→AMP+二磷酸+酰基-CoA

该催化的主要特征之一是腺苷酸化的中间体，即脂肪酰-AMP的形成。该活化步骤包括将脂肪酸的羧基基团经酰基键与AMP的磷酰基连接。

这些酶类通过催化脂肪酰基-CoA的形成在中间代谢中发挥核心作用。因此，它们基本上在全部有机体中出现，并且已被描述，例如酿酒酵母、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、绿针假单胞菌、弧形柄杆菌、结核杆菌、布氏锥虫、构巢裸孢壳、解脂耶氏酵母、恶性疟原虫、诺氏疟原虫、秀丽隐杆线虫、黑腹果萧、高山被孢霉、Thalassiosira pseudonana、北美萤火虫、赤拟谷盗、日本大耳白兔、Komagataella pastoris、源氏萤、Nototheniacoriiceps、豌豆、玉米、拟南芥、榆属物种、欧洲油菜、Agrypnus binodulus、 Bebesia牛、小家鼠、褐家鼠、野猪和智人。原则上，任何已知的长链脂肪酸:CoA连接酶都可以用于本发明的方法。在本发明的一个方面，使用来自大肠杆菌的长链脂肪酸:CoA连接酶。在大肠杆菌中的该酶由fadD基因编码(Weimar等人,J.Biol.Chem.277(2002),29369-29376)。

在另一项优选的实施方案中，3-羟基羧化物向对应的3-羟基羧基-核苷酸的酶促转化可以例如通过使用4-香豆酸-CoA连接酶(EC 6.2.1.12)来完成。4-香豆酸-CoA连接酶是催化以下反应的酶类：

ATP+4-香豆酸+CoA→AMP+二磷酸+4-香豆酰-CoA

4-香豆酸-CoA连接酶以包括腺苷酸中间体形成在内的两步反应催化 4-香豆酸及其它羟基桂皮酸的硫酯的形成。这些酶类涉及苯丙酸类生物合成。已经描述过这些酶类存在于许多有机体中，特别是真核生物，并且特别是真菌和植物，例如酿酒酵母、松草莓、水稻、紫草、枇杷、拟南芥、小立碗藓、芸香、刺槐、烟草、葡萄、Larix cajanderi、兴安落叶松、日本落叶松、Larix kamtschatica、新疆落叶松、俄罗斯落叶松、椰子、辐射松、山茶、Centaureum erythraea、Cephalocereus senilis、连翘、大豆、陆地棉、黑麦草、烟草、水杉、泡桐、欧芹、刚竹、云杉、火炬松、豌豆、侧柏、Polysporus hispidus、毛白杨、颤杨、毛果杨、杨树、欧洲甜樱桃、马铃薯、垂柳、小麦属和小麦。原则上，任何已知的4-香豆酸-CoA连接酶都可以用于本发明的方法。在本发明的一项实施方案中，使用来自拟南芥的4-香豆酸-CoA连接酶(Ehlting等人,Plant J.27(2001),455-465)。

在另一项优选的实施方案中，3-羟基羧化物向对应的3-羟基羧基-核苷酸的酶促转化可以例如通过使用长链脂肪酸:[酰基-载体蛋白]连接酶(形成 AMP)(EC 6.2.1.20)来完成。这些酶类催化以下反应：

ATP+酸+[酰基-载体蛋白]→AMP+二磷酸+酰基-[酰基-载体蛋白]

该催化剂的主要特征之一是腺苷酸化的中间体，即酰基-AMP的形成。该活化步骤包括将酸的羧基基团经酰基键与AMP的磷酰基连接。

这些酶类涉及脂肪酸代谢并出现在许多有机体中。已经描述，例如哈氏弧菌、恶性疟原虫、大肠杆菌、细长聚球藻、聚球藻属物种、胶红类酵母菌、拟南芥和南欧蒜。在哈氏弧菌中该酶由aasS基因编码(Jiang等人, Biochemistry 45(2006),10008-10019)。原则上，任何已知的长链脂肪酸:[酰基-载体蛋白]连接酶都可以用于本发明的方法。在一项实施方案中，使用来自哈氏弧菌的长链脂肪酸:[酰基-载体蛋白]连接酶。

在另一项优选的实施方案中，3-羟基羧化物向对应的3-羟基羧基-核苷酸的酶促转化可以例如通过使用4-氯苯甲酸:CoA连接酶(形成AMP)(EC 6.2.1.33)来完成。4-氯苯甲酸:CoA连接酶是催化以下反应的酶类：

ATP+4-氯苯甲酸+CoA→AMP+二磷酸+4-氯苯甲酰-CoA

这些酶类参与2,4-二氯苯甲酸降解。它们以两步反应来催化4-氯苯甲酰-CoA的形成，包括4-氯苯甲酸与ATP的腺苷酰化、然后酰基从4-氯苯甲酰基-AMP中间体向CoA转移。已经描述这些酶类在细菌例如产碱杆菌属、假单胞菌属和节杆菌属中存在。来自假单胞菌属菌株CBS3的酶是例如Chang等人(Biochemistry 36(1997),15650-15659)所述。

在另一项优选的实施方案中，3-羟基羧化物向对应的3-羟基羧基-核苷酸的酶促转化可以例如通过使用3-羟基丙酸:CoA连接酶(形成AMP)(EC 6.2.1.36)来完成。3-羟基丙酸:CoA连接酶是催化以下反应的酶类：

ATP+3-羟基丙酸+CoA→AMP+二磷酸+3-羟基丙酰-CoA

这些酶类催化3-羟基丙酸/4-羟基丁酸循环中的步骤。

已经描述过这些酶类在例如细菌特别是硫化叶菌(Sulfolobus tokodaii) 和勤奋金属球菌(Alber等人,J.Bacteriol.190(2008),1383-1389)中的存在。来自假单胞菌属菌株CBS3的酶如Chang等人(Biochemistry 36(1997), 15650-15659)中所述。如Chang等人所述，该酶还活化丙酸、丙烯酸、乙酸和丁酸。

在其它优选的实施方案中，3-羟基羧化物向对应的3-羟基羧基-核苷酸的酶促转化可以例如通过使用来自显示如SEQ ID NO:2(还参见Uniprot 登录号A6EZ54)所示的氨基酸序列的栖藻海杆菌(Marinobacter algicola) 的酰基-CoA合成酶来完成。当然，不仅可能使用具有如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的酶，还可以使用显示酰基-CoA合成酶活性的具有相关序列的酶。因此，在本发明方法的一项优选的实施方案中，使用酰基-CoA 合成酶，其包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2至少x％同一性且显示酰基-CoA合成酶活性并如上文所述能够将3-羟基羧化物转化为3-羟基羧基-核苷酸的序列，x是25-100之间的整数，优选30、 35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99。

所附实施例证实该酶能够将例如3-羟基丙酸和ATP、3-羟基戊酸和 ATP、3-羟基戊-4-烯酸和ATP、3-羟基异戊酸和ATP以及3-羟基丁酸和 ATP转化为对应的3-羟基羧基-核苷酸。还如实施例中所示，该酶可以使用ATP或ADP作为协同底物。

在另一项优选的实施方案中，3-羟基羧化物向对应的3-羟基羧基-核苷酸的酶促转化可以例如通过使用来自显示如SEQ ID NO:3(还参见 Uniprot登录号G6YPQ6)所示氨基酸序列的海杆菌Marinobacter manganoxidans的酰基-CoA合成酶来完成。当然，不仅可能使用具有如 SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列的酶，还可以使用显示酰基-CoA合成酶活性的具有相关序列的酶。因此，在本发明方法的一项优选的实施方案中，使用酰基-CoA合成酶，其包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3至少x％同一性且显示酰基-CoA合成酶活性并如上文所述能够将3-羟基羧化物转化为3-羟基羧基-核苷酸的序列，x是25-100之间的整数，优选30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、 91、92、93、94、95、96、97、98或99。

在其它优选的实施方案中，3-羟基羧化物向对应的3-羟基羧基-核苷酸的酶促转化可以例如使用AMP依赖性的合成酶和连接酶来完成。AMP依赖性的合成酶和连接酶具有共同的结构基序，其在InterPro(InterPro44.0； 2013年9月25日披露)中序号为InterProIPR020845，结合AMP，保守位点(http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/IPR020845)和IPR000873 (http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/IPR000873)。原则上，任何AMP依赖性的合成酶和连接酶都可以用于本发明的方法。

在一项优选的实施方案中，该AMP依赖性的合成酶和连接酶是显示如SEQ ID NO:1(还参见Uniprot登录号A1U2F4)所示氨基酸序列的水油海杆菌(Marinobacteraquaeolei)的AMP依赖性的合成酶和连接酶。当然，不仅可能使用具有如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的酶，还可以使用显示AMP依赖性的合成酶和连接酶活性的具有相关序列的酶。因此，在本发明方法的一项优选的实施方案中，使用AMP依赖性的合成酶和连接酶，其包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1至少 x％同一性且显示AMP依赖性的合成酶和连接酶活性并如上文所述能够将 3-羟基羧化物转化为3-羟基羧基-核苷酸的序列，x是25-100之间的整数，优选30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99。

所附实施例证实该酶能够将例如3-羟基丙酸和ATP、3-羟基戊酸和 ATP、3-羟基戊-4-烯酸和ATP、3-羟基异戊酸和ATP以及3-羟基丁酸和 ATP转化为对应的3-羟基羧基-核苷酸。其还显示，当该酶与下文进一步描述的OleC蛋白组合使用时，相应的3-羟基羧基-核苷酸可以进一步转化为对应的烯烃，优选该OleC蛋白来自希瓦氏菌属亚马逊亚种(Shewanella amazonensis)、来自野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)或来自嗜热光全绿丝菌(Chloroflexus aurantiacus)。例如，显示从3-羟基丁酸制备丙烯，或从3-羟基戊酸制备1-丁烯，或从3-羟基戊-4-烯酸制备1,3-丁二烯，或从 3-羟基异戊酸制备异丁烯。因此，在一项优选的实施方案中，本发明方法使用如上文所述水油海杆菌的AMP依赖性的合成酶和连接酶和如下文所述来自希瓦氏菌属亚马逊亚种、来自野油菜黄单胞菌、来自嗜麦芽窄食单胞菌或来自嗜热光全绿丝菌的OleC蛋白。更加优选地，该方法是用于从 3-羟基丁酸制备丙烯，或从3-羟基戊酸制备1-丁烯，或从3-羟基戊-4-烯酸制备1,3-丁二烯，或从3-羟基异戊酸制备异丁烯。

在其它优选的实施方案中，3-羟基羧化物向对应的3-羟基羧基-核苷酸的酶促转化可以例如通过使用AMP依赖性的合成酶和连接酶来完成，例如显示如SEQ ID NO:4(还参见Uniprot登录号R4WRJ4)所示伯霍尔德杆菌属物种的AMP依赖性的合成酶和连接酶。当然，不仅可能使用具有如 SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的酶，还可以使用显示AMP依赖性的合成酶和连接酶活性的具有相关序列的酶。因此，在本发明方法的一项优选的实施方案中，使用AMP依赖性的合成酶和连接酶，其包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4具有至少x％同一性且显示 AMP依赖性的合成酶和连接酶活性并如上文所述能够将3-羟基羧化物转化为3-羟基羧基-核苷酸的序列，x是25-100之间的整数，优选30、35、 40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、 96、97、98或99。

所附的实施例证明了该酶能够将例如3-羟基丙酸和ATP、3-羟基戊酸和ATP、3-羟基戊-4-烯酸和ATP、3-羟基异戊酸和ATP以及3-羟基丁酸和ATP转化为相应的3-羟基羧基-核苷酸。实施例中还显示该酶可利用 ATP或ADP作为协同底物。还显示，当该酶与下文所述的OleC蛋白、优选来自希瓦氏菌属亚马逊亚种或来自光伏希瓦氏菌(Shewanellaloihica)的 OleC蛋白联合使用时，相应的3-羟基羧基-核苷酸能够进一步被转化为对应的烯烃。例如，这显示了从3-羟基丁酸制备丙烯或者从3-羟基戊酸制备 1-丁烯或者从3-羟基戊-4-烯酸制备1,3-丁二烯。因此，在优选的实施方案中，本发明的方法利用上文所述的伯霍尔德杆菌属物种的AMP依赖性的合成酶和连接酶和下文所述的来自希瓦氏菌属亚马逊亚种或来自光伏希瓦氏菌的OleC蛋白。更优选的，该方法是用于从3-羟基丁酸制备丙烯或者从3-羟基戊酸制备1-丁烯或者从3-羟基戊-4-烯酸制备1,3-丁二烯。

在另一个优选的实施方案中，将3-羟基羧化物经酶促转化为相应的3- 羟基羧基-核苷酸可以例如通过使用下述的酶来实现：AMP依赖性的合成酶和连接酶，例如恶臭假单胞菌的AMP依赖性的合成酶和连接酶，其显示如SEQ ID NO:5所示氨基酸序列(也参见Uniprot登录号A5W2K0)。当然，不仅有可能使用具有如SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的酶，而且可使用显示AMP依赖性的合成酶和连接酶活性的具有相关序列的酶。因此，在一个优选的实施方案中，本发明的方法利用AMP依赖性的合成酶和连接酶，其包含如SEQ ID NO:5所示氨基酸序列或者包含与SEQ ID NO:5 具有至少x％同一性且显示AMP依赖性的合成酶和连接酶活性并能够将 3-羟基羧化物转化为如上所述的3-羟基羧基-核苷酸的序列，其中x为 25-100的整数，优选30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、 90、91、92、93、94、95、96、97、98或99。

所附的实施例证明了该酶能够将例如3-羟基丙酸和ATP、3-羟基戊酸和ATP、3-羟基戊-4-烯酸和ATP、3-羟基异戊酸和ATP以及3-羟基丁酸和ATP转化为相应的3-羟基羧基-核苷酸。

在另一个优选的实施方案中，将3-羟基羧化物经酶促转化为相应的3- 羟基羧基-核苷酸可以例如通过使用下述的酶来实现：中链脂肪酸-CoA连接酶，例如食油假单胞菌(Pseudomonas oleovorans)的中链脂肪酸-CoA连接酶，其显示如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列(也参见van Beilen等人, Mol.Biol.6(1992),3121-3136和Uniprot登录号Q00594)。当然，不仅有可能使用具有如SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的酶，而且可使用显示中链脂肪酸-CoA连接酶活性的具有相关序列的酶。因此，在一个优选的实施方案中，本发明的方法利用中链脂肪酸-CoA连接酶，其包含如SEQ ID NO: 6所示氨基酸序列或者包含与SEQ ID NO:6具有至少x％同一性且显示中链脂肪酸-CoA连接酶活性并能够将3-羟基羧化物转化为如上所述的3-羟基羧基-核苷酸的序列，其中x为25-100的整数，优选30、35、40、45、 50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、 98或99。

所附的实施例证明了该酶能够将例如3-羟基戊-4-烯酸和ATP转化为相应的3-羟基羧基-核苷酸。

在另一个优选的实施方案中，本发明的方法使用属于上述的形成腺苷酸的酶的II类。这类酶包括氨酰基-tRNA合成酶。属于此类的酶被分类为 EC 6.1.1.(Woese等人,Microbiology and Molecular Biology Reviews,64 (2000),202-236)。

在另一个优选的实施方案中，本发明的方法使用属于上述的形成腺苷酸的酶的III类。这类酶包括不依赖NRPS的铁载体(NIS)腺苷酸化酶 (Challis,Chem.Bio.Chem,6(2005),601-611)。

在本发明方法的另一个实施方案中，使用被分类为“羧酸还原酶 (CAR)”的酶将3-羟基羧化物转化为3-羟基羧基-核苷酸。

术语“羧酸还原酶”是指能够催化以下反应的酶：

脂肪酸+ATP+NADPH→脂肪醛+AMP+二磷酸+ NADP⁺

这些酶的一般功能是例如在Akhtar等人(PNAS 110(2013),87-92)的文章中描述。这些酶具有在不同数据库中引用的上述形成腺苷酸的酶的以下共同结构特征：

InterPro数据库(InterPro44.0；2013年9月25日披露)

IPR000873(http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/IPR000873)

1.Prosite

PS00455(http://prosite.expasy.org/PS00455)

描述：推定的结合AMP的结构域特征

模式：

[LIVMFY]-{E}-{VES}-[STG]-[STAG]-G-[ST]-[STEI]-[SG]-x-[PASLI VM]-[KR].

(入口名AMP_BINDING；登录号PS00455；Entry type PATTERN； Date MAY-1991(CREATED)；DEC-2004(DATA UPDATE)；OCT-2013 (INFO UPDATE).Pattern LIVMFY]-{E}-{VES}-[STG]-[STAG]-G-[ST]-[STEI]-[SG]-x-[PASLIVM]-[ KR])

2.Pfam

这些酶在Pfam数据库中的登录号是PF00501。

此外，所述CAR酶可以被分类为形成腺苷酸的酶，因为它们在第一步催化特征为形成腺苷酸的酶反应，即，它们通过将普通的羟基离去基团转化为腺苷单磷酸，从而激活脂肪酸的未活化的羧酸。具体而言，通过CAR 酶催化的该反应按照下式催化整个反应：

脂肪酸+ATP+NADPH→脂肪酰-腺苷酸+PP_i+NADPH →脂肪醛+AMP+P_i+NADP⁺

在一个优选的实施方案中，羧酸还原酶是分类为EC 1.2.99.6的酶。在另一个优选的实施方案中，所述NADPH依赖性的羧酸还原酶是来自象牙海岸诺卡氏菌(Nocardiaiowensis)的羧酸还原酶，其显示SEQ ID NO:7的氨基酸序列(Uniprot Q6RKB1；Venkitasubramanian等人,Enzyme and Microbial Technology 42(2008),130-137)。当然，不仅有可能使用具有如 SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的酶，而且可使用显示NADPH依赖性的羧酸还原酶活性的具有相关序列的酶。因此，在一个优选的实施方案中，本发明的方法利用NADPH依赖性的羧酸还原酶，其包含如SEQ ID NO:7 所示氨基酸序列或者包含与SEQID NO:7具有至少x％同一性且显示 NADPH依赖性的羧酸还原酶活性并能够将3-羟基羧化物转化为如上所述的烯烃的序列，其中x为25-100的整数，优选30、35、40、45、50、55、 60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99。

实施例显示了使用来自象牙海岸诺卡氏菌的NADPH依赖性羧酸还原酶(与来自希瓦氏菌属亚马逊亚种的OleC蛋白组合)，从3-羟基丁酸制备丙烯或者从3-羟基戊酸制备1-丁烯或者从3-羟基戊-4-烯酸制备1,3-丁二烯。因此，在优选的实施方案中，本发明的方法是用于从3-羟基丁酸制备丙烯或者从3-羟基戊酸制备1-丁烯或者从3-羟基戊-4-烯酸制备1,3-丁二烯，并且所用的酶是羧酸还原酶，特别是NADPH依赖性的羧酸还原酶，最优选上文所述的来自象牙海岸诺卡氏菌的酶与下文所述的OleC蛋白、最优选来自希瓦氏菌属亚马逊亚种的OleC蛋白组合。

如上文所述，如式II所示的任何协同底物可以用于本发明的方法。优选其中Z是腺嘌呤的协同底物，尤其是协同底物ATP或ADP。但是，在其他实施方案中，所述协同底物可以是其中Z是其他核碱的协同底物，例如鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或次黄嘌呤。这在Tanaka等人(Eur. J.Biochem.98(1979),165-172)和Alber等人(J.Bacteriol.190(2007)的文章中报道过，形成腺苷酸的酶也能够使用其他协同底物，例如ATP以外的 ADP、UTP、CTP、GTP和ITP。

如上文所述，所得到的3-羟基羧基-核苷酸按照本发明的方法进一步转化为对应的烯烃。该转化是通过二氧化碳的消除而实现的，即，脱羧反应，其中核苷酸部分和CO₂被释放。该反应的一般流程显示于图4A。

具体而言，将3-羟基羧基-核苷酸转化为对应的烯烃是通过酶促脱羧反应实现，即，利用酶而实现脱羧反应。在优选的实施方案中，所述3-羟基羧基-核苷酸是3-羟基羧基-腺苷酸。相应的反应流程显示于图5。

适合的酶特别是通常被称为OleC蛋白的酶。

在一个优选的实施方案中，用于本发明的方法第一步的酶，即，将3- 羟基羧化物转化为3-羟基羧基-核苷酸的酶与用于本发明的方法第二步的酶不同，所述第二步的酶是将3-羟基羧基-核苷酸转化为对应的烯烃的酶。具体而言，在一个优选的实施方案中，用于本发明的方法第一步的酶，即，将3-羟基羧化物转化为3-羟基羧基-核苷酸的酶不是下文定义的OleC蛋白。

将3-羟基羧基-核苷酸转化为对应的烯烃可以通过将3-羟基羧基-核苷酸直接转化为烯烃而实现。或者，也可能将3-羟基羧基-核苷酸首先转化为 3-羟基核苷酸基-羧酸，随后转化为对应的烯烃(参见图4B)。这已经在Janice Alina Frias的博士论文中描述过(2011；明尼苏达大学,USA)，其中特别是 OleC蛋白有可能催化这样的反应，即，羧基-核苷酸首先转化为核苷酸基- 羧酸、然后再进一步转化。

因此，在优选的实施方案中，本发明的方法第二步所用的酶是OleC 蛋白。所述OleC蛋白是AMP依赖性连接酶/合酶超家族的成员(LuxE；形成酰基-腺苷酸/硫酯，乙酰-CoA合成酶样(Sukovich等人,Appl.Environ. Microbiol.76(2010),3850-3862))，并且已知参与聚烯烃生物合成(Frias等人,Acta Cryst.F6(2010),1108-1110)。聚烯烃已知为头对头脂肪酸缩合的生物合成路径的产物，该路径依赖于表示为ole的基因(烯烃生物合成)，特别是ole ABCD基因簇(Sukovich等人,Appl.Environ.Microbiol.76(2010), 3842-3849和Sukovich等人,Appl.Environ.Microbiol.76(2010), 3850-3862)。由OleABCD催化的反应的一般流程显示于图29。Wang和 Lu(frontiers in Bioengineering andBiotechnology 1(2013)；Article 10)描述了脂肪酸衍生物的克莱森缩合是由OleA催化产生β-酮酸，其能够自发脱羧而形成酮类。OleC参与由OleA产生的β-酮酸中间体的进一步反应 (Frias等人,J.Biol.Chem.286(2011)10930-10938；Sukovich等人,Appl.Environ.Microbiol.76(2010),3842-3849)。

因此，本发明所用的术语“OleC蛋白”是指一种AMP依赖性连接酶/ 合酶。更优选的，它是指这种AMP依赖性连接酶/合酶，其能够归属为 LuxE/AMP连接酶家族。对LuxE/AMP连接酶家族的归属通常是基于蛋白质的结构特征，例如其较大的N末端结构域序列。

OleC蛋白在结构上的特征是它们具有AMP结合结构域。优选的，所述OleC蛋白显示如以下任一数据库所定义的AMP结合结构域：

1.InterPro数据库(InterPro44.0；2013年9月25日披露)

IPR000873(http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/IPR000873)

2.Prosite

PS00455(http://prosite.expasy.org/PS00455)

描述：推定的结合AMP的结构域特征

模式：

[LIVMFY]-{E}-{VES}-[STG]-[STAG]-G-[ST]-[STEI]-[SG]-x-[PASLI VM]-[KR].

3.Pfam

这些酶在Pfam数据库中的登录号是PF00501。

此外，术语“OleC蛋白”是指由ole ABCD基因簇/操纵子编码的蛋白质。

功能上来说，OleC蛋白的特征是其参与如上所述的聚烯烃生物合成，特别是参与源自烷基-CoA的长链烯烃的生物合成(参见图29)。

优选地，所述OleC蛋白是来自属于选自以下的属的生物体：希瓦氏菌属、嗜冷单胞菌属(Psychromonas)、狭长平胞属、黄单胞菌属和绿曲菌属，更优选来自属于选自以下的种的生物体：希瓦氏菌属亚马逊亚种、光伏希瓦氏菌、嗜麦芽窄食单胞菌、野油菜黄单胞菌和嗜热光全绿丝菌。甚至更优选希瓦氏菌属亚马逊亚种(菌株ATCC BAA-1098/SB2B)、光伏希瓦氏菌(菌株ATCC BAA-1088/PV-4)、嗜麦芽窄食单胞菌(菌株R551-3)、野油菜黄单胞菌(菌株ATCC 33913/NCPPB 528/LMG568)或嗜热光全绿丝菌 (菌株ATCC 29364/DSM637/Y-4-fl)。在特别优选的实施方案中，所述的酶是OleC酶，其序列显示于UniprotA1S4T5、Uniprot A3QDN4、Uniprot B4SSJ3、Uniprot Q8PDW6和Uniprot B9LEI2。

在优选的实施方案中，将3-羟基羧基-核苷酸经酶促转化为对应的烯烃可以例如通过使用下述的酶来实现：来自希瓦氏菌属亚马逊亚种的OleC 蛋白，其显示SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列(也参见Uniprot登录号 A1S4T5)。当然，不仅有可能使用具有如SEQ IDNO:8所示氨基酸序列的酶，而且可使用显示OleC蛋白活性的具有相关序列的酶。因此，在一个优选的实施方案中，本发明的方法利用OleC蛋白，其包含如SEQ ID NO: 8所示氨基酸序列或者包含与SEQ ID NO:8具有至少x％同一性且显示 OleC蛋白活性并能够将3-羟基羧基-核苷酸转化为如上所述的烯烃的序列，其中x为30-100的整数，优选35、40、45、50、55、60、65、70、75、 80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99。

在另一个优选的实施方案中，将3-羟基羧基-核苷酸经酶促转化为对应的烯烃可以例如通过使用下述的酶来实现：光伏希瓦氏菌的OleC蛋白，其显示SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列(也参见Uniprot登录号 A3QDN4)。当然，不仅有可能使用具有如SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的酶，而且可使用显示OleC蛋白活性的具有相关序列的酶。因此，在一个优选的实施方案中，本发明的方法利用OleC蛋白，其包含如SEQ ID NO: 9所示氨基酸序列或者包含与SEQ ID NO:9具有至少x％同一性且显示 OleC蛋白活性并能够将3-羟基羧基-核苷酸转化为如上所述的烯烃的序列，其中x为30-100的整数，优选35、40、45、50、55、60、65、70、75、 80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99。

在另一个优选的实施方案中，将3-羟基羧基-核苷酸经酶促转化为对应的烯烃可以例如通过使用下述的酶来实现：嗜麦芽窄食单胞菌的OleC蛋白，其显示SEQ ID NO:10所示的序列(也参见Uniprot登录号B4SSJ3)。当然，不仅有可能使用具有如SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的酶，而且可使用显示OleC蛋白活性的具有相关序列的酶。因此，在一个优选的实施方案中，本发明的方法利用OleC蛋白，其包含如SEQ ID NO:10所示氨基酸序列或者包含与SEQ ID NO:10具有至少x％同一性且显示OleC 蛋白活性并能够将3-羟基羧基-核苷酸转化为如上所述的烯烃的序列，其中 x为30-100的整数，优选35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、 90、91、92、93、94、95、96、97、98或99。

在另一个优选的实施方案中，将3-羟基羧基-核苷酸经酶促转化为对应的烯烃可以例如通过使用下述的酶来实现：野油菜黄单胞菌的OleC蛋白，其显示SEQ ID NO:11所示的序列(也参见Uniprot登录号Q8PDW6)。当然，不仅有可能使用具有如SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的酶，而且可使用显示OleC蛋白活性的具有相关序列的酶。因此，在一个优选的实施方案中，本发明的方法利用OleC蛋白，其包含如SEQ ID NO:11所示氨基酸序列或者包含与SEQ ID NO:11具有至少x％同一性且显示OleC蛋白活性并能够将3-羟基羧基-核苷酸转化为如上所述的烯烃的序列，其中x 为30-100的整数，优选35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、 90、91、92、93、94、95、96、97、98或99。

在另一个优选的实施方案中，将3-羟基羧基-核苷酸经酶促转化为对应的烯烃可以例如通过使用下述的酶来实现：嗜热光全绿丝菌的OleC蛋白，其显示SEQ ID NO:12所示的序列(也参见Uniprot登录号B9LEI2)。当然，不仅有可能使用具有如SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的酶，而且可使用显示OleC蛋白活性的具有相关序列的酶。因此，在一个优选的实施方案中，本发明的方法利用OleC蛋白，其包含如SEQ ID NO:12所示氨基酸序列或者包含与SEQ ID NO:12具有至少x％同一性且显示OleC蛋白活性并能够将3-羟基羧基-核苷酸转化为如上所述的烯烃的序列，其中x为 30-100的整数，优选35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、 91、92、93、94、95、96、97、98或99。

在一个优选的实施方案中，本发明的方法是用于制备异丁烯，且所述 3-羟基羧化物是3-羟基-3-甲基丁酸(3-羟基异戊酸)。整体转化的通用反应流程如图6A所示。在优选的实施方案中，3-羟基-3-甲基丁酸转化为相应的 3-羟基羧基-核苷酸是使用ATP或ADP作为协同底物进行，且所得3-羟基羧基-核苷酸是3-羟基-3-甲基丁酰-腺苷酸(3-羟基异戊酰-腺苷酸)。相应的反应流程分别如图6B和C所示。

在另一个优选的实施方案中，本发明的方法是制备丙烯的方法，且3- 羟基羧化物是3-羟基丁酸。整体转化的通用反应流程如图7A所示。在优选的实施方案中，3-羟基丁酸转化为相应的3-羟基羧基-核苷酸是使用ATP 或ADP作为协同底物进行，且所得3-羟基羧基-核苷酸是3-羟基丁酰-腺苷酸。相应的反应流程分别如图7B和C所示。

在另一个优选的实施方案中，本发明的方法是制备1,3-丁二烯的方法，且3-羟基羧化物是3-羟基戊-4-烯酸。整体转化的通用反应流程如图8A所示。在优选的实施方案中，3-羟基戊-4-烯酸转化为相应的3-羟基羧基-核苷酸是使用ATP或ADP作为协同底物进行，且所得3-羟基羧基-核苷酸是 3-羟基戊-4-烯酰基-腺苷酸。相应的反应流程分别如图8B和C所示。

本发明方法中所用的酶可以是天然存在的酶，或其可以是衍生自天然存在的酶的酶，例如通过引入突变或其它改变，如改变或提高酶的活性、稳定性等(也参见下文更加详细的描述)。

当本发明涉及用于如上文所述3-羟基羧化物向3-羟基羧基-核苷酸转化的形成腺苷酸的酶时，所提及的形成腺苷酸的酶还包含衍生自该形成腺苷酸的酶的酶，其如上文所述能够催化3-羟基羧化物向3-羟基羧基-核苷酸的转化，但对其天然底物仅具有低的亲和性，或者不再接受其天然底物。

当本发明涉及某些用于如上文所述3-羟基羧基-核苷酸向对应的烯烃转化的酶时，所提及的酶还包含衍生自此类酶的酶，其如上文所述能够催化3-羟基羧基-核苷酸向对应的烯烃转化，但对其天然底物仅具有低的亲和性，或者不再接受其天然底物。

本发明方法中所用的酶的优选底物的修饰使得提高了本发明方法的各反应底物的转化，并且减少了由于酶对其天然底物作用而产生的不期望的副产物。修饰和/或提高蛋白质的所希望的酶促活性的方法是本领域技术人员熟知的，并且包括例如随机诱变或定点诱变以及随后的具有所需特性的酶的选择或所谓“定向进化”方法。

例如，对于在原核细胞的基因工程，编码酶的核酸分子可被引入质粒，其通过DNA序列的重组允许诱变或序列修饰。标准方法(参见Sambrook 和Russell(2001)，MolecularCloning:A Laboratory Manual，CSH出版社，Cold Spring Harbor，NY，USA)允许进行碱基交换或添加天然或合成的序列。DNA片段可以通过应用片段的接头和连接体来彼此连接。此外，可以使用提供合适的限制性位点或去除剩余DNA或限制性位点的工程措施。在这些情况下，在其中***、删除或替换都是可能的，可以使用体外诱变、“引物修复”、限制或连接。一般情况下，序列分析、限制性分析和生物化学和分子生物学的其它方法是作为分析方法进行。然后检测所得的酶变体的酶活性，特别是其转化底物的能力，所述底物是如本发明方法的各反应中所指示的底物，而不是可以用于本发明方法的背景中的不同酶类相关的如上文所述的其天然底物。实施例描述了用于测定与本发明方法的反应相关的酶催化反应的能力的分析方法。

具有对其天然底物低亲和性或不再接受其天然底物的酶的修饰版本可以来自天然存在的酶或从已修改的、优化的或合成产生的酶衍生。

用于本发明方法中的酶可以是蛋白质的天然版本或合成蛋白质以及已经化学合成或在生物***中或经重组方法生成的蛋白质。所述酶也可以被化学修饰，例如，用于改善它的/它们的稳定性、抗性(例如对温度)，便于其纯化或其在载体上的固定。酶可以以分离的形式、纯化形式，以固定化形式使用，以从合成酶的细胞中获得的粗的或部分纯化的提取物，以化学合成的酶，以重组产生的酶，以微生物生成它们的形式等使用。因此，用于本发明的酶可以是天然的或合成的，可经化学、生物或基因方法产生。其还可以进行化学修饰，例如为了提高其活性、抗性、特异性、纯化或将其固定在载体上。

还可想到在本发明的方法中使用融合蛋白质，其一方面包含将3-羟基羧化物转化为3-羟基羧基-核苷酸所需的腺苷酸-形成酶的催化结构域，另一方面包含OleC蛋白。

本发明的方法可以在体内或体外实施。体外反应应当理解为该反应不使用细胞，即，无细胞的反应。因此，体外优选是指无细胞的***。在一项实施方案中，术语“体外”的含义是在分离的酶(或任选地包含可能需要的辅因子的酶***)存在下。在一项实施方案中，该方法中所用的酶类是以纯化形式使用。在另一项实施方案中，该方法所用的酶类在反应中是作为非纯化提取物存在，或以非裂解的细菌形式，从而节省蛋白质纯化的成本。

为了进行体外过程，将反应底物和酶在允许酶活化且发生酶促转化的条件(缓冲剂、温度、协同底物、辅因子等)下温育。反应进行足够的时间以产生对应的烯烃。烯烃的产生可以通过本领域已知的方法检测，例如可能与质谱检测或火焰离子化检测(FID)连接的气相色谱。

所述酶类可以是允许酶促反应发生的任何适合的形式。它们可以是纯化或部分纯化或以粗的细胞提取物或部分纯化的提取物形式。也可能所述酶类是固定在适合的载体上。

本发明的体外方法可以以一锅式反应进行，即将底物与上述向对应的烯烃转化所必需的酶类在一个反应混合物中组合，并将反应进行足够的时间以生成烯烃。或者，该方法还可以通过以连续的方式完成不同的步骤来进行，即通过首先将3-羟基羧化物与一种或多种酶类混合，并使得反应开始生成3-羟基羧基-核苷酸，并随后加入一种或多种其它酶类，将3-羟基羧基-核苷酸进一步转化为对应的烯烃。

所产生烯烃的回收可以包括一个步骤或多个步骤。例如，该烯烃可以使用标准技术例如吸附/解吸、气提、分馏进行回收。所产生的烯烃从CO₂中的分离可以在低温下经CO₂压缩来完成。CO₂还可以用极性溶剂例如乙醇胺除去。

在另一项实施方案中，本发明的方法是在培养基中进行，在生物体、优选微生物的存在下，其产生如上文所述可以将3-羟基羧化物转化为3-羟基羧基-核苷酸的酶且其还产生如上文所述进一步将3-羟基羧基-核苷酸转化为对应的烯烃所必需的酶。该生物体或微生物也是本发明的一项目的。

如果使用天然表达所需酶活性之一的(微)生物体，可能改变该(微)生物体使得该活性在(微)生物体中过表达。这可以例如通过在相应基因的启动子区域引发突变从而产生确保所述基因更高表达的启动子。或者，还可能将该基因突变从而使得酶显示更强的活性。通过使用表达将3-羟基羧化物转化为3-羟基羧基-核苷酸所必需的酶并且还产生如上文所述进一步将3- 羟基羧基-核苷酸转化为对应的烯烃所必需的酶的(微)生物体，其可能直接在培养基中实施本发明的方法，而不需要分离或纯化所述酶类。

但是，本发明优选地排除在自然界中发现的以其在自然界中存在的水平表达如上文所述的酶的天然存在的微生物。相反，本发明的和用于本发明方法的微生物优选地是非天然存在的微生物，无论其是已被遗传修饰以表达(包括过表达)在其基因组中非正常地存在的本发明的外源性酶，还是已被工程化以过表达外源性酶。

因此，本发明所用的酶类和(微)生物体优选地是非天然存在的酶类或 (微生物)，即它们是与天然存在的酶类或微生物显著不同的酶类或(微)生物体，且其未在自然界出现过。关于酶类，它们优选天然存在的酶类的变体，其未在自然界中出现过。此类变体包括例如突变体，特别是通过分子生物学方法制备的，其显示改良的特性，例如更高的酶活性、更高的底物特异性、更强的温度抗性等。关于所述(微)生物体，它们优选地是如上文所述的基因修饰的生物体，其由于基因修饰而与天然存在的生物体不同。基因修饰的生物体是非天然存在的生物体，即，其不是在自然界发现的，且其由于引入外源的核苷酸分子而基本上与天然存在的生物体不同。

通过过表达上文所述的外源性或内源性酶，所述酶的浓度基本上比在自然界中发现的更高，其可以随后令人意外地增强使用各种酶的非天然形式的本发明的反应。优选地，过表达的酶的浓度是总宿主细胞蛋白质的至少5％、10％、20％、30％或40％。

“非天然”底物应当理解为不与自然界中各种酶起作用的分子，尽管其可能事实上在微生物中与内源性酶共存。该“非天然”底物不被自然界中的微生物转化，因为其他底物是优选的(例如“天然底物”)。因此，本发明意图在自然界中未发现的环境中使用非天然底物与上文所述的酶类。

在一项实施方案中，本发明或本发明方法中所用的(微)生物体是生物体，优选微生物，其已经被基因修饰而包含一个或多个外源核酸分子，所述分子编码一种或多种上文所述的与将3-羟基羧化物转化为3-羟基羧基- 核苷酸相关的酶，且其还产生如上文所述进一步将3-羟基羧基-核苷酸转化为对应的烯烃所必需的酶。本文中的术语“外源”或“外源的”的含义是该核酸分子不是在所述生物体/微生物中天然存在的。该含义是其不在生物体/微生物中以相同结构或在相同位点存在。在一个优选的实施方案中，该外源核酸分子是包含启动子和编码各种酶的编码序列的重组分子，其中驱动编码序列表达的启动子相对于编码序列是异源性的。在本文中异源性的含义是该启动子不是天然启动所述编码序列表达的启动子，而是天然启动另一种不同编码序列表达的启动子，即，其来自另一种基因，或者是合成的启动子或嵌合启动子。优选地，该启动子是对于该生物体/微生物异源性的启动子，即不在各自的生物体/微生物中天然存在的启动子。甚至更加优选的，该启动子是诱导型启动子。在不同类型的生物体中、特别是在微生物中启动表达的启动子是本领域技术人员熟知的。

在其它实施方案中，该核酸分子对于生物体/微生物是外源的，其中所编码的酶对于该生物体/微生物不是内源性的，即，不是由未被基因修饰的生物体/微生物所天然表达。换言之，所编码的酶对于生物体/微生物而言是异源性的。该外源的核酸分子可以以染色体外的形式例如作为质粒存在于生物体/微生物中，或者稳定地整合在染色体内。优选稳定整合。因此，所述基因修饰可以包括例如将编码相应酶的基因整合到染色体，或者从包含酶编码序列上游的启动子的质粒表达所述酶类，该启动子和编码序列优选地源自不同的生物体，或者任何其它本领域技术人员已知的方法。

本发明所用的生物体可以是原核生物或真核生物，优选地，它们是例如细菌、酵母、真菌或霉菌的微生物，或者植物细胞或动物细胞。在特定的实施方案中，该微生物是细菌，优选埃希氏杆菌属、产碱杆菌属或芽孢杆菌属，甚至更优选的菌种是大肠杆菌、富养产碱菌或巨大芽孢杆菌。

在另一个优选的实施方案中，该微生物是真菌，更优选酵母菌属、裂殖酵母菌属、曲霉菌属、毕赤酵母、木霉属或克鲁维酵母属的菌属的真菌，甚至更优选以下菌种：酿酒酵母、裂殖酵母菌丝、黑曲霉、里氏木霉、巴斯德毕赤酵母、或乳酸克鲁维酵母的物种。

在另一项优选的实施方案中，本发明的方法使用表达能够催化3-羟基羧化物转化为3-羟基羧基-核苷酸的酶并且还产生如上文所述能够进一步催化3-羟基羧基-核苷酸转化为对应烯烃的酶的光合微生物。优选地，所述微生物是光合作用菌或微藻类。在其它实施方案中，该微生物是藻类，更加优选属于硅藻类的藻类。

还可以想到，在本发明的方法中使用一种产生如上文所述催化3-羟基羧化物转化为3-羟基羧基-核苷酸的酶的微生物，以及另一种产生如上文所述催化3-羟基羧基-核苷酸转化为对应烯烃的酶的微生物。

在另一个优选的实施方案中，本发明的方法利用多细胞生物体，其表达能够催化3-羟基羧化物转化为3-羟基羧基-核苷酸的酶并且还产生如上文所述能够催化3-羟基羧基-核苷酸转化为对应烯烃的酶。该生物体的实例是植物或动物。

本发明还涉及与本发明的方法相关的如上文所述的(微)生物。

在特别优选的实施方案中，所述方法包括在标准培养条件下(30-37℃，在1大气压下，在允许需氧菌生长的发酵罐中)或在非标准条件下(例如，与适温生物的培养条件相对应的较高温度)培养微生物。

在一项实施方案中，本发明的方法使用生物体，优选微生物，其是嗜温的且其可以在大约30℃-37℃的温度下培养。

在另一个优选的实施方案中，本发明的方法使用生物体，优选微生物，其是嗜温的且其可以在更高温度例如高于60℃下培养。

在另一项实施方案中，本发明的方法包括提供生物体的步骤(优选地该微生物带有各种酶活性或以(细胞)培养物形式的活性，优选地以液体细胞培养物的形式)、培养该生物体的随后步骤(优选地该微生物在发酵罐中(通常指生物反应器)在允许各种酶表达的适合的条件下进行)，还包括引发如上文所述本发明方法的酶促转化的步骤。适合的发酵罐或生物反应器装置和发酵条件是本领域技术人员已知的。生物反应器或发酵罐是指支持生物活性环境的本领域已知的任何制造或设计的装置或***。因此，生物反应器或发酵罐可以是个容器，在其中进行化学/生物化学过程，例如本发明的方法，其涉及生物体，优选微生物和/或生物化学活性物质，即来自于上文所述的生物体的酶或包含上文所述酶的生物体。在生物反应器或发酵罐中，该过程可以是需氧的或厌氧的。这些生物反应器通常是圆筒状的，且可以以从升到立方米范围的尺寸，并且通常用不锈钢制成。在此方面，不受理论束缚的情况下，该发酵罐或生物反应器可以以适合培养生物体、优选微生物的方式设计，例如分批培养、补料分批培养、灌注培养或恒化培养，它们通常全部都是本领域内已知的。

所述培养基可以是适合培养所述各种生物体或微生物的任何培养基。

在其它实施方案中，本发明的方法是在烯烃以气体状态生成的条件下进行。在该情况下，进一步优选该方法在微量需氧的条件下进行。这意味着限制注入空气的量，从而使在包含烯烃的气体流出物中残余氧的浓度最小化。

在另一项实施方案中，本发明的方法进一步包括收集从反应中脱出的气体烯烃的步骤。因此，在优选的实施方案中，该方法是在用于反应过程中收集气体形式烯烃的***存在下进行。

实际上，短链烯烃，特别是乙烯、丙烯、丁烯异构体和1,3-丁二烯，在室温和大气压下为气体状态。因此本发明的方法不需要从液体培养基中提取产物，在工业规模下进行该提取步骤通常非常昂贵。气体烃类的抽取与储存及其可能的后续物理分离及化学转化可以按照本领域技术人员已知的任何方法进行。

在特定的实施方案中，该方法还包括检测以气相存在的烯烃(例如丙烯、乙烯、异丁烯或1,3-丁二烯)。在空气或其它气体环境中产生的化合物的存在，即使是少量，也可以通过使用多种技术检测，并且特别是使用带有红外或火焰离子化检测的或者与质谱偶联的气相色谱***。

在特定的实施方案中，将本发明方法产生的烯烃通过使用本领域技术人员已知的技术缩合，随后任选地还原，以产生更长链的烯烃或更长链的烷烃。例如，异丁烯可以用于合成异辛烷：连续进行该反应的催化方法已经被充分描述。

在另一项实施方案中，本发明的方法中所用的生物体是植物。原则上可以使用任何可能的植物，即单子叶植物或双子叶植物。优选使用可以在农业上有意义的规模进行培养的植物，且其允许生产大量的生物质。实例是草，例如黑麦草属、谷类如黑麦、小麦、大麦、燕麦、小米、玉米，其它淀粉储存植物如马铃薯、或糖储存植物如甘蔗或甜菜。还可以使用烟草或蔬菜植物，例如西红柿、胡椒、黄瓜、茄子等。其它可能是使用油类储存植物例如油菜籽、橄榄等。还可以使用树，特别是快速生长的树，例如桉树、杨树或橡胶树(巴西三叶胶)。

当本发明的方法在体内通过使用提供各种酶活性的生物体/微生物进行时，该生物体、优选微生物是在允许该酶反应发生的适合的培养条件下培养。特定的培养条件取决于所用的特定生物体/微生物，但是是本领域技术人员熟知的。培养条件通常按照其允许编码用于各反应的酶的基因表达的方式来选择。为了在培养的某些阶段提高和调节某些基因表达，许多方法是本领域技术人员已知的，例如通过化学引诱物或通过温度变动的基因表达诱导。

在特别优选的实施方案中，本发明的方法是通过使用生物体、优选微生物来进行，其产生按照本发明的方法转化的式I的3-羟基羧化物。3-羟基烷酸是3-羟基羧酸的一部分，且由许多生物体天然产生，特别是微生物，例如伯霍尔德杆菌属(Rocha等人,WorldJ.Microbiol.Biotechnol.24 (2008),427-431)、色杆菌属(Steinbüchel等人,Appl.Microbiol.Biotechnol. 39(1993),443-449)和芽孢杆菌属(Singh等人,MicrobialCell Factories 8 (2009),38)的细菌。因此，例如Steinbüchel等人(在上述引文中)报道了3- 羟基丁酸在青紫色素杆菌中生成。此外，产生3-羟基羧酸例如3-羟基丁酸的代谢途径是众所周知的(参见例如Tokiwa和Ugwu(J.Biotechnol.132 (2007),264-272)以及Jian等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.82(2009), 995-1003))。除此之外，几种相应的合成途径已经引入其它生物体中，例如大肠杆菌(参见例如Zhao等人(FEMS Microbiol.Lett.218(2003),59-64)； Madison和Huisman(Microbiol.Mol.Biol.Rev.63(1999),21-53)；Tseng等人(Appl.Environ.Microbiol.75(2009),3137-3145))。

本发明方法中所用的酶可以是天然存在的酶，或天然存在的酶所衍生的酶，例如通过引入突变或其它改变，例如改变或提高酶活性、稳定性等。

修饰和/或提高蛋白质的所需酶活性的方法是本领域技术人员熟知的，包括例如随机诱变或定点诱变以及随后选择具有所需特性的酶或者所谓 “定向进化”的方法。

例如，对于原核细胞中的基因修饰，可以将编码相应的酶的核苷酸分子引入质粒中，其允许通过DNA序列重组的诱变或序列修饰。标准方法(参见Sambrook和Russell(2001),Molecular Cloning:A Laboratory Manual, CSH出版社,Cold Spring Harbor,NY,USA)允许进行碱基交换或添加天然或合成的序列。DNA片段可以通过使用与该片段互补的接头和连接体来连接。此外，可以使用提供适合的限制位点或去除多余DNA或限制位点的工程措施。在这些情况下，在其中***、删除或替换都是可能的，可以使用体外诱变、“引物修复”、限制或连接。一般情况下，序列分析、限制性分析和生物化学和分子生物学的其它方法是作为分析方法进行。然后使用上文所述的分析方法，检测所得的酶变体的所需活性，例如酶活性，并特别是检测其提高的酶活性。

如上文所述，本发明方法中所用的或本发明组合物中所包含的微生物可以是经引入编码相应的酶的核酸分子进行基因修饰的微生物。因此，在优选的实施方案中，该微生物是重组微生物，其已被基因修饰从而具有至少一种如上文所述用于本发明方法转化的酶的提高的活性。这可以例如用编码相应的酶的核酸转化该微生物来完成。微生物基因修饰的详细描述将在下文进一步提供。优选地，引入微生物中的核酸分子是对于该微生物异源性/外源性的核酸分子，即其不是所述微生物中天然存在的。

在本发明的全文中，“提高的活性”的含义是在基因修饰的微生物中酶的表达和/或活性比相应的未修饰的微生物高至少10％，优选至少20％，更加优选至少30％或50％，甚至更加优选至少70％或80％，且特别优选至少90％或100％。在甚至更加优选的实施方案中，表达和/或活性的提高可以是至少150％，至少200％或至少500％。在特别优选的实施方案中，该表达比相应的非修饰的微生物中高至少10倍，更加优选至少100倍且甚至更加优选至少1000倍。

术语“提高的”表达/活性还包括相应的非修饰的微生物不表达相应的酶的情况，因此在非修饰的微生物中相应的表达/活性是零。优选地，过表达的酶的浓度是总宿主细胞蛋白质的至少5％、10％、20％、30％或40％。

细胞中给定蛋白质的表达水平的检测方法是本领域技术人员熟知的。在一项实施方案中，通过检测相应蛋白质的量来完成表达水平的检测。相应的方法是本领域技术人员熟知的，且包括蛋白质印迹、ELISA等。在另一项实施方案中，通过检测相应RNA的量来完成表达水平的检测。相应的方法是本领域技术人员熟知的，且包括例如Northern印迹。

在本发明的全文中，术语“重组”的含义是微生物被基因修饰，以便与野生型或非修饰的微生物相比包含编码如上文所定义的酶的核酸分子。编码如上文所定义的酶的核酸分子可以单独或作为载体的一部分使用。

该核酸分子可以进一步包含可操作地连接到包含在核酸分子中的聚核苷酸的表达控制序列。如本说明书全文中所用的术语“操作性连接”或“可操作地连接”，是指一种或多种表达控制序列和在与表达控制序列相容的条件下实现表达的待表达的聚核苷酸中的编码区域之间的连接。

表达包括异源性DNA序列的转录，优选地转录为可翻译的mRNA。确保在真菌及在细菌中表达的调控元件是本领域技术人员熟知的。它们包括启动子、增强子、终止信号、导向信号等。实例在下文与载体相关的解释中进一步提供。

用于核酸分子的启动子相对于其来源和/或待表达的基因而言可以是同源性或异源性的。适合的启动子是例如提供自身进行组成性表达的启动子。但是，还可以使用受外部影响决定仅在确定的时间点活化的启动子。人工和/或化学诱导型启动子可以用于本文。

载体可以进一步包含表达控制序列，其与包含于载体内的所述聚核苷酸可操作地连接。这些表达控制序列可以适合于确保细菌或真菌中的可翻译的RNA的转录及合成。

此外，可能经分子生物学通用的方法在聚核苷酸中***不同的突变(参见例如Sambrook和Russell(2001),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,CSH出版社,ColdSpring Harbor,NY,USA)，从而合成可能具有修饰后的生物学特性的聚核苷酸。点突变的引入可以想到在例如影响多肽的生物活性或调控的氨基酸序列修饰的位点进行。

此外，可以制备具有修饰后的底物或产物特异性的突变体。优选地，该突变体显示提高的活性。或者，可以制备催化活性被消除但不丧失底物结合活性的突变体。

另外，将突变引入编码如上文所定义的酶的聚核苷酸中可使得由所述聚核苷酸编码的酶的基因表达率和/或活性降低或升高。

对于基因修饰的细菌或真菌，编码如上文所定义的酶的聚核苷酸或者这些分子的部分可以引入质粒，其允许通过DNA序列重组的诱变或序列修饰。标准方法(参见Sambrook和Russell(2001),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,CSH出版社,ColdSpring Harbor,NY,USA)允许进行碱基交换或添加天然或合成的序列。DNA片段可以通过应用片段的接头和连接体彼此连接。此外，可以使用提供适合的限制位点或去除多余DNA或限制位点的工程措施。在这些情况下，在其中***、删除或替换都是可能的，可以使用体外诱变、“引物修复”、限制或连接。一般情况下，序列分析、限制性分析和生物化学和分子生物学的其它方法是作为分析方法进行。

因此，按照本发明的重组微生物可以由基因修饰的真菌或细菌产生，其包含将上文所述聚核苷酸、核酸分子或载体引入真菌或细菌。

表达编码各种酶的聚核苷酸是为了产生具有任何上文所述活性的多肽。不同表达***的概述例如包含在Methods in Enzymology 153(1987), 385-516、Bitter等人(Methods in Enzymology 153(1987),516-544)和 Sawers等人(Applied Microbiologyand Biotechnology 46(1996),1-9)、 Billman-Jacobe(Current Opinion inBiotechnology 7(1996),500-4)、 Hockney(Trends in Biotechnology 12(1994),456-463)、Griffiths等人, (Methods in Molecular Biology 75(1997),427-440)中。酵母表达***的概述是例如由Hensing等人(Antonie van Leuwenhoek 67(1995),261-279)、Bussineau等人(Developments in Biological Standardization 83(1994), 13-19)、Gellissen等人(Antonie van Leuwenhoek 62(1992),79-93,Fleer (Current Opinion inBiotechnology 3(1992),486-496)、Vedvick(Current Opinion in Biotechnology 2(1991),742-745)和Buckholz(Bio/Technology 9 (1991),1067-1072)所提供。

表达载体已经在文献中被广泛描述。通常，它们不仅包含选择标记基因和确保在所选择的宿主细胞中复制的复制起点，而且还包含细菌或病毒启动子，以及在大部分情况下用于转录的终止信号。在启动子和终止信号之间一般而言有至少一个限制位点或聚合连接体，其使得编码DNA序列能够***。天然控制相应基因转录的DNA序列如果其在所选择的宿主生物体中是活化的，那么可以用作启动子序列。但是，该序列还可以被其它启动子序列交换。可能使用确保基因组成性表达的启动子和允许基因表达的刻意控制的诱导型启动子。具有这些特性的细菌和病毒启动子序列在文献中有详细描述。用于在微生物(例如大肠杆菌、酿酒酵母)中表达的调控序列在文献中有充分地描述。允许下游序列特别高的表达的启动子是例如 T7启动子(Studier等人,Methods in Enzymology 185(1990),60-89)、 lacUV5、trp、trp-lacUV5(DeBoer等人,in Rodriguez and Chamberlin(Eds),Promoters,Structure and Function；Praeger,New York,(1982),462-481； DeBoer等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983),21-25)、lp1、rac(Boros等人,Gene 42(1986),97-100)。诱导型启动子优选地用于多肽的合成。这些启动子经常比组成型启动子获得更高的多肽产率。为了获得最佳的多肽的量，经常使用两阶段方法。首先，将宿主细胞在最适宜的条件下培养直至达到相对高的细胞密度。在第二个步骤中，根据所用启动子的类型来诱导转录。在这方面，tac启动子特别适合，其可以被乳糖或IPTG(＝异丙基-β-D-半乳糖硫吡喃糖苷)诱导(deBoer等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80(1983), 21-25)。转录的终止信号也在文献中有描述。

宿主细胞用上述的多核苷酸或载体转化可以通过标准方法进行，例如 Sambrook和Russell(2001),Molecular Cloning:A Laboratory Manual, CSH Press,Cold SpringHarbor,NY,USA；Methods in Yeast Genetics,A Laboratory Course Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press,1990 中所述。将宿主细胞培养在符合所用具体宿主细胞要求，特别是符合pH 值、温度、盐浓度、通气、抗生素、维生素、微量元素等要求的营养培养基中。

本发明还涉及生物体，优选微生物，其产生用于如上文所述的将3-羟基羧化物转化为3-羟基羧基-核苷酸并进一步将3-羟基羧基-核苷酸转化为对应的烯烃所必需的酶。因此，本发明特别涉及表达如上文所定义的以下蛋白的(微)生物：

(a)形成腺苷酸的酶；和

(b)OleC蛋白。

关于在所述微生物中表达的酶的优选实施方案，其同样如上文的本发明方法所述的那样应用。在一个优选的实施方案中，(a)的所述形成腺苷酸的酶不是Olec蛋白。在优选的实施方案中，所述生物体是重组生物体，其含义是由于引入编码至少一种上述酶的至少一个核酸分子而进行了基因修饰。优选所述核酸分子对于所述生物体而言是外源的，这表示其不是天然存在于该生物体。

因此，本发明还涉及生物体，优选微生物，其包含编码上述(a)所定义的酶的核酸分子并且包含编码上述(b)所定义的酶的核酸分子。在优选的实施方案中，至少一个所述核酸分子对于该生物体而言是异源的，这表示其不是天然存在于该生物体。所述微生物优选是细菌、酵母或真菌。在另一个优选的实施方案中，所述生物体是植物或非人的动物。关于其他优选的实施方案，其同样如上文的本发明方法所述的那样应用。

在优选的实施方案中，本发明的微生物也产生式I的3-羟基羧化物，其将按照本发明的方法进行转化。

此外，本发明还涉及组合物，其包含本发明所述的微生物、适合的培养基以及式I的3-羟基羧化物或能够被所述微生物转化为式I的3-羟基羧化物的碳源。

本发明还涉及组合物，其包含形成腺苷酸的酶和式I的3-羟基羧化物，条件是所述形成腺苷酸的酶不是3-羟基丙酰-CoA合成酶，且所述3-羟基羧化物不是3-羟基丙酸。

本发明还涉及组合物，其包含

(a)OleC蛋白；和

(b)式III的3-羟基羧基-核苷酸。

此外，本发明还涉及组合物，其包含如上文所定义的

(a)形成腺苷酸的酶，和

(b)OleC蛋白。

在优选的实施方案中，所述组合物还包含式I的3-羟基羧化物。在另一个优选的实施方案中，所述(a)的形成腺苷酸的酶不是OleC蛋白。

本发明还涉及形成腺苷酸的酶在用于如上文所述将式I的3-羟基羧化物转化为式III的3-羟基羧基-核苷酸中的用途。

而且，本发明还涉及OleC蛋白在用于如上文所述将式III的3-羟基羧基-核苷酸转化为式IV的烯烃中的用途。

本发明还涉及包含下述酶的组合在用于如上文所述将式I的3-羟基羧化物转化为式IV的烯烃中的用途：

(a)形成腺苷酸的酶；

(b)OleC蛋白。

在一个优选的实施方案中，所述(a)的形成腺苷酸的酶不是OleC蛋白。

关于所述不同组分的优选实施方案，其同样如上文的本发明方法所述的那样应用。

本发明的其他方面和优点将在以下实施例中描述，提供它们是为了举例说明的目的而不是为了限制范围。

本申请引用的各出版物、专利、专利申请或其他文献以其整体引入本文作为参考。

图1：显示了将3-羟基羧化物转化为3-羟基羧基-核苷酸的一般反应流程。

图2A显示了将3-羟基羧化物和作为协同底物的ATP转化为3-羟基羧基-腺苷酸的一般反应流程。图2B显示了将3-羟基羧化物和作为协同底物的ADP转化为3-羟基羧基-腺苷酸的一般反应流程。

图3：显示了将3-羟基羧化物和作为协同底物的ATP或ADP转化为 3-羟基羧基-腺苷酸并进一步将其转化为烯烃的一般反应流程。

图4：A：显示了将3-羟基羧基-核苷酸转化为对应的烯烃的一般反应流程。

B：显示了将3-羟基羧基-核苷酸经3-羟基核苷酸基-羧酸转化为对应的烯烃的反应流程。

图5：显示了将3-羟基羧基-腺苷酸转化为对应的烯烃的一般反应流程。

图6：A：显示了通过使用本发明的方法将3-羟基-3-甲基丁酸转化为异丁烯的一般流程。

B：显示了采用本发明的方法，使用ATP作为协同底物将3-羟基-3- 甲基丁酸转化为异丁烯的一般流程。

C：显示了采用本发明的方法，使用ADP作为协同底物将3-羟基-3- 甲基丁酸转化为异丁烯的一般流程。

图7：A：显示了采用本发明的方法，将3-羟基丁酸转化为丙烯的一般流程。

B：显示了采用本发明的方法，使用ATP作为协同底物将3-羟基丁酸转化为丙烯的一般流程。

C：显示了采用本发明的方法，使用ADP作为协同底物将3-羟基丁酸转化为丙烯的一般流程。

图8：A：显示了采用本发明的方法，将3-羟基戊-4-烯酸转化为1,3- 丁二烯的一般流程。

B：显示了采用本发明的方法，使用ATP作为协同底物将3-羟基戊-4- 烯酸转化为1,3-丁二烯的一般流程。

C：显示了采用本发明的方法，使用ADP作为协同底物将3-羟基戊-4- 烯酸转化为1,3-丁二烯的一般流程。

图9：显示了二磷酸或单磷酸的定量试验的流程，其通过在360nm吸光度的增加来监测2-氨基-6-巯基-7-甲基嘌呤的形成。

图10：显示了通过记录在360nm的2-氨基-6-巯基-7-甲基嘌呤吸光度的增加来监测一些所研究的酶对3-羟基丙酸的腺苷酰化活性。

图11：显示了通过记录在360nm的2-氨基-6-巯基-7-甲基嘌呤吸光度的增加来监测一些所研究的酶对R-3-羟基戊酸的腺苷酰化活性。

图12：显示了通过记录在360nm的2-氨基-6-巯基-7-甲基嘌呤吸光度的增加来监测一些所研究的酶对(R,S)-3-羟基戊-4-烯酸的腺苷酰化活性。

图13：显示了通过记录在360nm的2-氨基-6-巯基-7-甲基嘌呤吸光度的增加来监测一些所研究的酶对3-羟基异戊酸的腺苷酰化活性。

图14：显示了通过记录在360nm的2-氨基-6-巯基-7-甲基嘌呤吸光度的增加来监测一些所研究的酶对(R,S)-3-羟基丁酸的腺苷酰化活性。

图15：显示了对于由来自栖藻海杆菌的酰基-CoA合酶催化的(R,S)-3- 羟基丁酸的腺苷酰化反应，作为协同底物浓度的函数的速率曲线。该反应通过记录在360nm的2-氨基-6-巯基-7-甲基嘌呤吸光度的增加来监测。

图16：显示了对于由来自伯霍尔德杆菌属物种的AMP依赖性合成酶/ 连接酶催化的(R,S)-3-羟基丁酸的腺苷酰化反应，作为协同底物浓度的函数的速率曲线。该反应通过记录在360nm的2-氨基-6-巯基-7-甲基嘌呤吸光度的增加来监测。

图17：显示了由来自伯霍尔德杆菌属物种的AMP依赖性合成酶/连接酶催化的(R,S)-3-羟基丁酸的腺苷酰化反应的电喷雾MS谱。MS分析显示在m/z值为432.2处的3-羟基丁酰-腺苷酸的脱单质子形式，[M-H]^-。

图18：显示了由来自伯霍尔德杆菌属物种的AMP依赖性合成酶/连接酶催化的R-3-羟基戊酸的腺苷酰化反应的电喷雾MS谱。MS分析显示在 m/z值为446.3处的3-羟基戊酰-腺苷酸的脱单质子形式，[M-H]^-。

图19：显示了由来自伯霍尔德杆菌属物种的AMP依赖性合成酶/连接酶催化的3-羟基异戊酸的腺苷酰化反应的电喷雾MS谱。MS分析显示在 m/z值为446.2处的3-羟基异戊酰-腺苷酸的脱单质子形式，[M-H]^-。

图20：显示了由来自伯霍尔德杆菌属物种的AMP依赖性合成酶/连接酶催化的(R,S)-3-羟基戊-4-烯酸的腺苷酰化反应的电喷雾MS谱。MS分析显示在m/z值为444.3处的3-羟基戊-4-烯酰-腺苷酸的脱单质子形式， [M-H]^-。

图21：显示了使用(R,S)-3-羟基丁酸作为底物和ATP作为协同底物的酶促反应和非酶促反应所得到的GC/FID图谱。

图22：显示了如实施例12所述的酶催化的从(R,S)-3-羟基丁酸制备丙烯。

图23：显示了使用(R)-3-羟基戊酸作为底物和ATP作为协同底物的酶促反应和非酶促反应所得到的GC/FID图谱。

图24：显示了如实施例16所述的酶催化的从(R,S)-3-羟基戊-4-烯酸制备1,3-丁二烯。

图25：显示了使用(R,S)-3-羟基戊-4-烯酸作为底物和ATP作为协同底物的酶促反应和非酶促反应所得到的GC/FID图谱。

图26：显示了使用3-羟基异戊酸作为底物和ATP作为协同底物的酶促反应和非酶促反应所得到的GC/FID图谱。

图27：显示了作为ATP浓度的函数的从3-羟基异戊酸形成异丁烯的曲线。反应由以下的酶催化：

N°1：来自伯霍尔德杆菌属物种的AMP依赖性合成酶/连接酶以及来自希瓦氏菌属亚马逊亚种的OleC。

N°2：来自栖藻海杆菌的AMP依赖性合成酶/连接酶以及来自希瓦氏菌属亚马逊亚种的OleC。

图28：显示了作为ADP浓度的函数的从3-羟基异戊酸形成异丁烯的曲线。反应由以下的酶催化：

N°1：来自栖藻海杆菌的AMP依赖性合成酶/连接酶以及来自希瓦氏菌属亚马逊亚种的OleC。

N°2：来自伯霍尔德杆菌属物种的AMP依赖性合成酶/连接酶以及来自希瓦氏菌属亚马逊亚种的OleC。

图29：显示了由Ole ABCD催化的反应流程(Wang和Lu,frontiers inBioengineering an Biotechnology 1(2013),Article 10)。

应当理解，本发明具体涉及了本文所述的特征和方法参数的每个组合，包括一般和/或优选的特征/参数的任何组合。具体而言，本发明具体涉及本文所提供的方法的优选特征(包括所有程度的优选)的所有组合。

在本说明书中，引用了很多文献，包括专利申请。这些文献的内容整体引入本文作为参考，但这并不认为它们与本发明的可专利性相关。更具体而言，所有引用的文献以这样的程度引入作为参考，就如同每个单独的文献被具体和单独地引入作为参考一样。

现在通过以下实施例对本发明进行描述，其仅是说明性的，并不意味着限制本发明的范围。

实施例

实施例1：酶的克隆、表达和纯化

基因合成、克隆和重组蛋白表达

通过寡核苷酸拼接产生从原核生物和真核生物基因组推断出的所研究的酶的序列，以符合大肠杆菌的密码子选择(基因由

商业合成)。一组6个组氨酸密码子***在甲硫氨酸起始密码之后，以提供用于纯化的亲和标记。除了象牙海岸诺卡氏菌的羧酸还原酶基因以外，由此合成的基因被克隆到pET-25b(+)表达载体(载体由

构建)。.

大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(Novagen)按照标准的热休克方法用这些载体转化。转化后的细胞使用ZYM-5052自感培养基(Studier FW, Prot.Exp.Pur.41,(2005),207-234)在振荡下(160rpm)于37℃培养6小时，在28℃或18℃持续蛋白表达过夜(约16小时)。在4℃、10,000rpm离心 20分钟来收集细胞，将细胞沉淀储存在-80℃。

编码来自象牙海岸诺卡氏菌的羧酸还原酶(Uniprot Q6RKB1)的基因由

(Life Technologies)进行密码子优化。

提供的基因构建体是两侧加上PacI和NotI限制酶切位点，在主载体pMK中提供。接着将所合成的基因亚克隆至pUC18的改良版本(New England Biolabs)，其包含改良的多克隆位点(MCS)(WO 2013/007786)。

MG1655大肠杆菌感受态细胞按照标准的热休克方法用该载体转化。转化后的细胞在LB-氨苄西林培养基中，于30℃、160rpm振荡培养24 小时。

在4℃、10,000rpm离心20分钟来收集细胞，将细胞沉淀储存在-80℃。

蛋白纯化和浓缩

将来自200ml培养细胞的细胞沉淀在冰上融解，重悬浮在5ml的50 mM Tris-HClpH 7.5缓冲液中，其包含500mM NaCl、10mM MgCl₂、10％甘油、10mM咪唑和1mM DTT。加入20μl Lysonase(Novagen)。将细胞在室温下温育10分钟，接着转移至冰上20分钟。通过两次超声30秒完成细胞裂解。接着将细菌提取物在4℃、10,000rpm离心20分钟使之澄清。将澄清的细菌裂解物加载至PROTINO-2000Ni-TED柱(Macherey-Nagel)，以便吸附6-His标记的蛋白。洗涤柱子，目标酶用6ml包含300mM NaCl、 10％甘油、1mM DTT和250mM咪唑的50mMTris-HCl pH 7.5缓冲液洗脱。接着将洗脱液浓缩，在Amicon Ultra-4 10kDa滤器单元(Millipore) 上脱盐，将酶重悬浮在包含50mM Tris-HCl pH 7.5、100mM NaCl、10％甘油、1mM DTT的溶液中。在OleC酶的情况下，该重悬浮的缓冲液添加1mM AMP。

通过在NanoDrop 1000分光光度计(Thermo Scientific)上直接UV 280 nm测定来定量蛋白浓度。根据SDS-PAGE分析估计，所纯化的蛋白质纯度在70％-90％之间。

实施例2：用于腺苷酰化酶活性的连续的分光光度法试验，使用3-羟基丙酸作为底物和ATP作为协同底物

编码形成腺苷酸的酶的基因按照实施例1所述的方法进行合成，并随后产生相应的酶。3-羟基丙酸(TCI)储备液在水中制备，并用1M NaOH将 pH调节到7.5。从3-羟基丙酸形成3-羟基丙酰-腺苷酸时伴随着二磷酸的释放，使用

焦磷酸酶测定试剂盒(E6645,Life Technologies)对二磷酸的释放进行定量。

在该试验中，无机焦磷酸酶将二磷酸水解为无机磷酸，磷酸的产生与由嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)催化的2-氨基-6-巯基-7-甲基嘌呤核糖核苷 (MESG)的磷酸解作用偶联。显色产物2-氨基-6-巯基-7-甲基嘌呤通过在360 nm的吸光度监测(图9)。

标准的反应混合物包含：

100mM Tris-HCl pH 7.5

5mM 3-羟基丙酸

2mM MgCl₂

0.1mM DTT

2mM ATP

0.1mg/ml所研究的酶

按照

焦磷酸酶测定试剂盒所述的流程，向反应混合物加入 2-氨基-6-巯基-7-甲基嘌呤核糖核苷(MESG)、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)和无机焦磷酸酶。进行对照反应，其中不加入形成腺苷酸的酶，或者不加入3- 羟基丙酸。每个反应通过加入ATP而启动。反应在96孔板上于37℃进行。在360nm下，在SpectraMax Plus 384紫外/可见光全自动定量酶标仪 (Molecular Devices)上连续监测每个样品以考察2-氨基-6-巯基-7-甲基嘌呤的增加。

一些酶显示出对3-羟基丙酸的腺苷酰化活性(图10)。

实施例3：用于腺苷酰化酶活性的连续的分光光度法试验，使用3-羟基戊酸作为底物和ATP作为协同底物

按照实施例2所述的方法进行分光光度法试验。R-3-羟基戊酸购自 EMPA(瑞士)。R-3-羟基戊酸储备液在水中制备，并用1M NaOH将pH调节到7.5。反应混合物的组成与实施例2中所述的相同，除了使用5mM R-3- 羟基戊酸作为底物替代3-羟基丙酸。进行对照反应，其中不加入形成腺苷酸的酶，或者不加入3-羟基戊酸。每个反应通过加入ATP而启动。反应在 96孔板上于37℃进行。在360nm下，在SpectraMax Plus 384紫外/可见光全自动定量酶标仪(Molecular Devices)上连续监测每个样品以考察2-氨基-6-巯基-7-甲基嘌呤的增加。一些酶显示出对3-羟基戊酸的腺苷酰化活性 (图11)。

实施例4：用于腺苷酰化酶活性的连续的分光光度法试验，使用3-羟基戊-4-烯酸作为底物和ATP作为协同底物

按照实施例2所述的方法进行分光光度法试验。(R,S)-3-羟基戊-4-烯酸(Epsilon Chimie)储备液在水中制备，并用1M NaOH将pH调节到7.5。反应混合物的组成与实施例2中所述的相同，除了使用5mM(R,S)-3-羟基戊 -4-烯酸作为底物替代3-羟基丙酸。进行对照反应，其中不加入形成腺苷酸的酶，或者不加入3-羟基戊-4-烯酸。反应在96孔板上于37℃进行。在 360nm下，在SpectraMax Plus 384紫外/可见光全自动定量酶标仪(Molecular Devices)上连续监测每个样品以考察2-氨基-6-巯基-7-甲基嘌呤的增加。一些酶证明了对3-羟基戊-4-烯酸的腺苷酰化活性(图12)。

实施例5：用于腺苷酰化酶活性的连续的分光光度法试验，使用3-羟基异戊酸作为底物和ATP作为协同底物

按照实施例2所述的方法进行分光光度法试验。3-羟基异戊酸(3-羟基 -3-甲基丁酸)(TCI)储备液在水中制备，并用1M NaOH将pH调节到7.5。反应混合物的组成与实施例2中所述的相同，除了使用5mM 3-羟基异戊酸作为底物替代3-羟基丙酸。进行对照反应，其中不加入形成腺苷酸的酶，或者不加入3-羟基异戊酸。反应在96孔板上于37℃进行。在360nm下，在SpectraMax Plus 384紫外/可见光全自动定量酶标仪(Molecular Devices)上连续监测每个样品以考察2-氨基-6-巯基-7-甲基嘌呤的增加。一些酶证明了对3-羟基异戊酸的腺苷酰化活性(图13)。

实施例6：用于腺苷酰化酶活性的连续的分光光度法试验，使用3-羟基丁酸作为底物和ATP作为协同底物

按照实施例2所述的方法进行分光光度法试验。(R,S)-3-羟基丁酸 (Sigma-Aldrich)储备液在水中制备，并用1M NaOH将pH调节到7.5。反应混合物的组成与实施例2中所述的相同，除了使用5mM(R,S)-3-羟基丁酸作为底物替代3-羟基丙酸。进行对照反应，其中不加入形成腺苷酸的酶，或者不加入3-羟基丁酸。反应在96孔板上于37℃进行。在360nm下，在SpectraMax Plus 384紫外/可见光全自动定量酶标仪(Molecular Devices)上连续监测每个样品以考察2-氨基-6-巯基-7-甲基嘌呤的增加。一些酶证明了对3-羟基丁酸的腺苷酰化活性(图14)。

实施例7：3-羟基丁酸的腺苷酰化研究，使用ATP或ADP作为协同底物。

按照实施例2所述的方法进行分光光度法试验。分析来自栖藻海杆菌的酰基-CoA合酶和来自伯霍尔德杆菌属物种的AMP依赖性合成酶/连接酶对于协同底物的特异性。标准的反应包含：

100mM Tris-HCl pH 7.5

5mM(R,S)-3-羟基丁酸

2mM MgCl₂

0.1mM DTT

0-3.2mM ATP或ADP

0.1mg/ml纯化的酶

按照

焦磷酸酶测定试剂盒所述的流程，向反应混合物加入 2-氨基-6-巯基-7-甲基嘌呤核糖核苷(MESG)、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)和无机焦磷酸酶。采用ADP作为协同底物的试验使用不含无机焦磷酸酶的反应混合物。进行对照试验，其中不加入酶，或者不加入3-羟基丁酸。每个试验通过加入协同底物(ATP或ADP)而启动。在SpectraMax Plus 384紫外/ 可见光全自动定量酶标仪(Molecular Devices)上在360nm连续监测每个样品以考察2-氨基-6-巯基-7-甲基嘌呤的增加。

作为协同底物浓度的函数的2-氨基-6-巯基-7-甲基嘌呤形成速率曲线显示于图15和16。来自栖藻海杆菌的酰基-CoA合酶和来自伯霍尔德杆菌属物种的AMP依赖性的合成酶/连接酶能够使用ATP或ADP作为协同底物催化3-羟基丁酰-腺苷酸的形成。

实施例8：不同的3-羟基羧化物的酶催化的腺苷酰化反应的质谱分析

所研究的酶促反应在以下条件下进行：

50mM Tris-HCl pH 7.5

2mM 3-羟基羧化物

2mM ATP

20mM MgCl₂

100mM NaCl

1mM DTT

2mg/ml纯化的来自伯霍尔德杆菌属物种的AMP依赖性合酶/连接酶

每个反应通过加入ATP而启动，在37℃温育40分钟。

在温育后，将反应混合物采用阴离子模式通过质谱(MS)分析。通常，每15分钟取出各试验的一份等分试样，离心并转移至干净小瓶中。接着将 5μl的等分试样直接注射到质谱仪中。通过接口到电喷雾离子化(ESI)源的 PE SCIEX API 2000四极质谱仪进行检测。使用3-羟基丁酸、3-羟基戊酸、 3-羟基异戊酸和3-羟基戊-4-烯酸作为底物的酶促反应的质谱分别呈现于图 17、18、19、20。对于每个所研究的3-羟基羧化物都证明了在酶催化的反应期间形成3-羟基羧基-腺苷酸。

实施例9：由来自水油海杆菌的AMP依赖性合成酶/连接酶催化的3- 羟基羧化物的腺苷酰化反应的动力学参数

使用实施例2所述的分光光度法试验测定动力学参数。腺苷酰化活性试验的反应混合物包含：

100mM Tris-HCl pH 7.5

0-10mM 3-羟基羧化物

2mM ATP

2mM MgCl₂

0.1mM DTT

0.1mg/ml纯化的来自水油海杆菌的AMP依赖性的合成酶/连接酶

按照

焦磷酸酶测定试剂盒所述的流程，向反应混合物加入 2-氨基-6-巯基-7-甲基嘌呤核糖核苷(MESG)、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)和无机焦磷酸酶。采用不同的3-羟基羧化物的腺苷酰化反应的动力学参数显示于表2。

表2

底物	K<sub>M</sub>,mM	k<sub>cat</sub>10<sup>-3</sup>,s<sup>-1</sup>
			3-羟基丙酸	5	40
(R,S)-3-羟基丁酸	2	30
			3-羟基异戊酸	10	7
R-3-羟基戊酸	4	12
			(R,S)-3-羟基戊-4-烯酸	3	23

实施例10：通过来自水油海杆菌的AMP依赖性合成酶/连接酶和OleC 蛋白的联合作用使3-羟基丁酸生成丙烯的分析

按照实施例1所述的方法制备和纯化所研究的酶。所研究的反应在以下条件下进行：

50mM Tris-HCl pH 7.5

50mM(R,S)-3-羟基丁酸

10mM ATP

20mM MgCl₂

100mM NaCl

1mM DTT

2mg/ml纯化的来自水油海杆菌的AMP依赖性的合成酶/连接酶

2mg/ml纯化的来自希瓦氏菌属亚马逊亚种或来自嗜热光全绿丝菌的 OleC蛋白

反应体积是0.3ml。

对于无酶的对照，使用缓冲液代替酶。

不含ATP的对照反应平行进行。

反应在2ml密封小瓶(Interchim)中在37℃温育并同时振荡18小时。使用装配了火焰离子化检测器(FID)的Bruker 450-GC色谱仪，通过气相色谱(GC)分析丙烯生成。使用氮气作为载气，流速为6ml/min。使用在130℃ 的等温模式，将挥发的化合物在GS-氧化铝柱(30m x 0.53mm ID)(Agilent) 上色谱分离。通过与丙烯(Sigma-Aldrich)的标准进行比较，鉴定酶促反应的产物，在这些条件下的丙烯的保留时间是1.57min。

在包含来自水油海杆菌的AMP依赖性合成酶/连接酶和OleC蛋白(表 3)的酶促反应中观察到从3-羟基丁酸显著生成丙烯。上述对照反应未观察到丙烯信号(图21)。

表3

这些数据表明，在试验中存在的这两个酶互补地进行了反应的两个步骤，从3-羟基丁酸生成丙烯：将ATP的腺苷酰基转移到3-羟基丁酸的羧基，随后将反应中间体进行组合的脱乙酰化/脱羧反应得到丙烯。

实施例11：通过来自象牙海岸诺卡氏菌的羧酸还原酶和来自希瓦氏菌属亚马逊亚种的OleC蛋白的联合作用使3-羟基丁酸生成丙烯的分析

所研究的反应在以下条件下进行：

50mM Tris-HCl pH 7.5

10mM(R,S)-3-羟基丁酸

2mM ATP

25mM MgCl₂

100mM NaCl

1mM DTT

2mg/ml纯化的来自象牙海岸诺卡氏菌的羧酸还原酶

2mg/ml纯化的来自希瓦氏菌属亚马逊亚种的OleC蛋白

反应体积是0.3ml。

对于无酶的对照，使用缓冲液代替酶。

反应在2ml密封小瓶(Interchim)中在37℃温育3小时，通过在80℃ 温育1分钟而终止反应。按照实施例10所述的GC-FID方法分析丙烯生成。在含有来自象牙海岸诺卡氏菌的羧酸还原酶和来自希瓦氏菌属亚马逊亚种的OleC蛋白的酶促反应中观察到从3-羟基丁酸显著生成丙烯。测定的丙烯峰面积为16.7任意单位。对照反应未观察到丙烯信号。

实施例12：通过来自伯霍尔德杆菌属物种的AMP依赖性合成酶/连接酶和来自希瓦氏菌属的OleC蛋白的联合作用使3-羟基丁酸生成丙烯的分析

所研究的反应在以下条件下进行：

50mM Tris-HCl pH 7.5

10mM(R,S)-3-羟基丁酸

2mM ATP

25mM MgCl₂

100mM NaCl

1mM DTT

2mg/ml纯化的来自伯霍尔德杆菌属物种的AMP依赖性的合成酶/连接酶

2mg/ml纯化的来自希瓦氏菌属亚马逊亚种或来自光伏希瓦氏菌的 OleC蛋白

反应体积是0.3ml。

反应在2ml密封小瓶(Interchim)中在37℃温育3小时，通过在80℃ 温育1分钟而终止反应。

根据实施例10所述的GC-FID方法分析丙烯生成。在偶联的酶促反应中观察到显著的丙烯生成(图22)。

实施例13：通过来自水油海杆菌的AMP依赖性的合成酶/连接酶和来自希瓦氏菌属亚马逊亚种的OleC蛋白的联合作用使3-羟基戊酸生成1-丁烯的分析

所研究的反应在以下条件下进行：

50mM Tris-HCl pH 7.5

10mM R-3-羟基戊酸

4mM ATP

20mM MgCl₂

100mM NaCl

1mM DTT

2mg/ml纯化的来自水油海杆菌的AMP依赖性的合成酶和连接酶

2mg/ml纯化的来自希瓦氏菌属亚马逊亚种的OleC蛋白

反应体积是0.3ml。

对于无酶的对照，使用缓冲液代替酶。

反应在2ml密封小瓶(Interchim)中在37℃温育并同时振荡16小时。

接着使用装配了火焰离子化检测器(FID)的Bruker 450-GC色谱仪，通过气相色谱(GC)分析1-丁烯生成。使用氮气作为载气，流速为6ml/min。使用在130℃的等温模式，将挥发的化合物在GS-氧化铝柱(30m x 0.53 mm ID)(Agilent)上色谱分离。通过与1-丁烯(Sigma-Aldrich)的标准进行比较，鉴定酶促反应的产物，在这些条件下的1-丁烯的保留时间是2.65min。

在包含来自水油海杆菌的AMP依赖性合成酶/连接酶和来自希瓦氏菌属亚马逊亚种的OleC蛋白的酶促反应中观察到从3-羟基戊酸显著生成1- 丁烯。不含酶的对照反应未观察到1-丁烯信号。

这些数据表明，在试验中存在的这两个酶互补地进行了反应的两个步骤，从3-羟基戊酸生成1-丁烯：将ATP的腺苷酰基转移到3-羟基戊酸的羧基，随后将反应中间体进行组合的脱乙酰化/脱羧反应得到1-丁烯。

实施例14：通过来自象牙海岸诺卡氏菌的羧酸还原酶和来自希瓦氏菌属亚马逊亚种的OleC蛋白的联合作用使3-羟基戊酸生成1-丁烯的分析

所研究的反应在以下条件下进行：

50mM Tris-HCl pH 7.5

10mM R-3-羟基戊酸

2mM ATP

25mM MgCl₂

100mM NaCl

1mM DTT

2mg/ml纯化的来自象牙海岸诺卡氏菌的羧酸还原酶

2mg/ml纯化的来自希瓦氏菌属亚马逊亚种的OleC蛋白

反应体积是0.3ml。

对于无酶的对照，使用缓冲液代替酶。

将反应混合物在2ml密封小瓶(Interchim)中在37℃温育3小时，通过在80℃温育1分钟而终止反应。

根据实施例13所述的GC-FID方法分析1-丁烯生成。酶催化的反应和对照反应显示于图23。

实施例15：通过来自伯霍尔德杆菌属物种的AMP依赖性合成酶/连接酶和来自希瓦氏菌属物种(Shewanella phylum)的OleC蛋白的联合作用使 3-羟基戊酸生成1-丁烯的分析

所研究的反应在以下条件下进行：

50mM Tris-HCl pH 7.5

10mM R-3-羟基戊酸

2mM ATP

25mM MgCl₂

100mM NaCl

1mM DTT

反应体积是0.3ml。按照实施例14所述进行温育试验，并根据实施例 13所述的GC-FID方法进行分析。

表4

实施例16：通过来自水油海杆菌的AMP依赖性的合成酶/连接酶和 OleC蛋白的联合作用使3-羟基戊-4-烯酸生成1,3-丁二烯的分析

所研究的反应在以下条件下进行：

50mM Tris-HCl pH 7.5

50mM(R,S)-3-羟基戊-4-烯酸

10mM ATP

20mM MgCl₂

100mM NaCl

1mM DTT

反应体积是0.3ml

将0.6mg来自水油海杆菌的AMP依赖性合成酶/连接酶和0.6mg的 OleC蛋白加入0.3ml反应混合物。使用仅包含0.6mg来自水油海杆菌的 AMP依赖性合成酶/连接酶的反应混合物作为参照。

反应在2ml密封小瓶(Interchim)中在37℃温育并同时振荡18小时。接着使用装配了火焰离子化检测器(FID)的Bruker 450-GC色谱仪，通过气相色谱(GC)分析1,3-丁二烯生成。使用氮气作为载气，流速为6ml/min。使用在130℃的等温模式，将挥发的化合物在GS-氧化铝柱(30m x 0.53 mm ID)(Agilent)上色谱分离。通过与1,3-丁二烯(Sigma-Aldrich)的标准进行比较，鉴定酶促反应的产物，在这些条件下的1,3-丁二烯的保留时间是 3.22min。

在包含来自水油海杆菌的AMP依赖性合成酶/连接酶和OleC蛋白的酶促反应中观察到从3-羟基戊-4-烯酸显著生成1,3-丁二烯。对照反应观察到对应于3-羟基戊-4-烯酸自发分解的可忽略不计的1,3-丁二烯信号(图 24)。

这些数据表明，在试验中存在的这两个酶互补地进行了反应的两个步骤，从3-羟基戊-4-烯酸生成1,3-丁二烯：将ATP的腺苷酰基转移到3-羟基戊-4-烯酸的羧基，随后将反应中间体进行组合的脱乙酰化/脱羧反应得到 1,3-丁二烯。

实施例17：通过来自象牙海岸诺卡氏菌的羧酸还原酶和来自希瓦氏菌属亚马逊亚种的OleC蛋白的联合作用使3-羟基戊-4-烯酸生成1,3-丁二烯的分析

所研究的反应在以下条件下进行：

50mM Tris-HCl pH 7.5

10mM(R,S)-3-羟基戊-4-烯酸

2mM ATP

25mM MgCl₂

100mM NaCl

1mM DTT

2mg/ml纯化的来自象牙海岸诺卡氏菌的羧酸还原酶

2mg/ml纯化的来自希瓦氏菌属亚马逊亚种的OleC蛋白.

反应体积是0.3ml。

对于无酶的对照，使用缓冲液代替酶。反应在2ml密封小瓶(Interchim) 中在37℃温育3小时，在80℃温育1分钟来终止反应。根据实施例16 所述的GC-FID方法分析1,3-丁二烯的生成。在酶促反应中产生了显著量的丁二烯。在无酶的对照反应中观察到由于3-羟基戊-4-烯酸的自发分解而产生的背景水平的丁二烯(图25)。

实施例18：通过来自伯霍尔德杆菌属物种的AMP依赖性合成酶/连接酶和来自希瓦氏菌属物种(Shewanella phylum)的OleC蛋白的联合作用使 3-羟基戊-4-烯酸生成1,3-丁二烯的分析

所研究的反应在以下条件下进行：

50mM Tris-HCl pH 7.5

10mM(R,S)-3-羟基戊-4-烯酸

2mM ATP

25mM MgCl₂

100mM NaCl

1mM DTT

2mg/ml纯化的来自伯霍尔德杆菌属物种的AMP依赖性合成酶/连接酶

反应体积是0.3ml。按照实施例16所述的方法进行试验温育和分析。在偶联的酶促反应中观察到显著生成1,3-丁二烯，在无酶的对照反应中观察到由于3-羟基戊-4-烯酸的自发分解而产生的可忽略不计的丁二烯信号 (表5)。

表5

实施例19：通过来自水油海杆菌的AMP依赖性的合成酶/连接酶和 OleC蛋白的联合作用使3-羟基异戊酸生成异丁烯的分析

所研究的反应在以下条件下进行：

50mM Tris-HCl pH 7.5

50mM 3-羟基异戊酸

10mM ATP

20mM MgCl₂

100mM NaCl

1mM DTT

反应体积是0.3ml

反应在2ml密封小瓶(Interchim)中在37℃温育并同时振荡18小时。接着使用装配了火焰离子化检测器(FID)的Bruker 450-GC色谱仪，通过气相色谱(GC)分析异丁烯的生成。使用氮气作为载气，流速为6ml/min。使用在130℃的等温模式，将挥发的化合物在GS-氧化铝柱(30m x 0.53mm ID)(Agilent)上色谱分离。通过与异丁烯(Sigma-Aldrich)的标准进行比较，鉴定酶促反应的产物，在这些条件下的异丁烯的保留时间是2.40min。

在包含来自水油海杆菌的AMP依赖性合成酶/连接酶和OleC蛋白的酶促反应中观察到显著生成异丁烯(表6)。无酶的对照反应观察到对应于 3-羟基异戊酸自发分解的可忽略不计的异丁烯信号。

表6

从使用来自水油海杆菌的酶和来自希瓦氏菌属亚马逊亚种的OleC蛋白的偶联反应获得的谱图例子显示于图26。

这些数据表明，在试验中存在的这两个酶互补地进行了反应的两个步骤，从3-羟基异戊酸生成异丁烯：将ATP的腺苷酰基转移到3-羟基异戊酸的羧基，随后将反应中间体进行组合的脱乙酰化/脱羧反应得到异丁烯。

实施例20：作为ATP浓度的函数的异丁烯生成研究

所研究的反应在以下条件下进行：

50mM Tris-HCl pH 7.5

40mM 3-羟基异戊酸

0-32mM ATP

25mM MgCl₂

100mM NaCl

1mM DTT

2mg/ml纯化的形成腺苷酸的酶

2mg/ml纯化的来自希瓦氏菌属亚马逊亚种的OleC蛋白

将反应混合物在2ml密封小瓶(Interchim)中在37℃温育3小时，通过在80℃温育1分钟而终止反应。作为ATP函数的异丁烯生成显示于图 27。

实施例21：作为ADP浓度的函数的异丁烯生成研究

按照实施例20所述的方法进行所研究的反应，使用ADP作为协同底物替代ATP。作为ADP函数的异丁烯生成显示于图28。