CN107075530B

CN107075530B - 从3-甲基巴豆酰-CoA产生异丁烯的方法

Info

Publication number: CN107075530B
Application number: CN201580049936.6A
Authority: CN
Inventors: P·马利埃; M·阿拉尔
Original assignee: Global Bioenergies SA; Scientist of Fortune SA
Current assignee: Global Bioenergies SA; Scientist of Fortune SA
Priority date: 2014-09-17
Filing date: 2015-09-16
Publication date: 2021-06-01
Anticipated expiration: 2035-09-16
Also published as: CN107075530A; US20170260548A1; WO2016042011A1; EP3194603A1

Abstract

描述了一种从3‑甲基巴豆酰‑CoA产生异丁烯的方法，所述方法包括步骤：(a)将3‑甲基巴豆酰‑CoA酶促转化成3‑甲基丁酸；和(b)将如此产生的3‑甲基丁酸进一步酶促转化成异丁烯。可以通过首先将3‑甲基巴豆酰‑CoA酶促转化成3‑甲基丁酰‑CoA和将如此产生的3‑甲基丁酰‑CoA进一步酶促转化成3‑甲基丁酸，实现3‑甲基巴豆酰‑CoA转化成3‑甲基丁酸。备选地，可以通过首先将3‑甲基巴豆酰‑CoA酶促转化成3‑甲基巴豆酸并且随后将如此产生的3‑甲基巴豆酸进一步酶促转化成3‑甲基丁酸，实现3‑甲基巴豆酰‑CoA转化成3‑甲基丁酸。

Description

从3-甲基巴豆酰-CoA产生异丁烯的方法

本发明涉及一种从3-甲基巴豆酰-CoA产生异丁烯的方法，所述方法包括步骤：

(a)将3-甲基巴豆酰-CoA酶促转化成3-甲基丁酸；并且

(b)将如此产生的3-甲基丁酸进一步酶促转化成异丁烯。

可以通过首先将3-甲基巴豆酰-CoA酶促转化成3-甲基丁酰-CoA和将如此产生的3-甲基丁酰-CoA进一步酶促转化成3-甲基丁酸，实现3-甲基巴豆酰-CoA转化成3-甲基丁酸。备选地，可以通过首先将3-甲基巴豆酰-CoA酶促转化成3-甲基巴豆酸并且随后将如此产生的3-甲基巴豆酸进一步酶促转化成3-甲基丁酸，实现3-甲基巴豆酰-CoA转化成3-甲基丁酸。

许多的化学化合物目前源自石油化学品。烯类(如乙烯、丙烯、不同的丁烯或例如其他戊烯)在例如用于产生聚丙烯或聚乙烯的塑料工业和在化学工业其他领域和燃料领域中使用。

丁烯以四种形式存在，其中之一，异丁烯(又称作异丁烯)，进入甲基叔丁基醚(MTBE)(汽车燃料用抗爆添加剂)的组合物中。异丁烯也可以用来产生异辛烯，所述异辛烯转而可以还原成异辛烷(2,2,4-三甲基戊烷)；异辛烷的极高辛烷值使其成为所谓“汽油”发动机的最佳燃料。烯类如异丁烯目前通过催化性裂解石油产物(或在己烯的情况下从煤炭或天然气中通过Fischer-Tropsch法的衍生物)产生。生产成本因此与油价紧密相关。另外，催化性裂解有时与增加工艺复杂性和生产成本的巨大技术难题相关。

在与地球化学循环和谐相处的可持续工业运营背景下，需要通过生物途径生产烯类如异丁烯。由于发酵和蒸馏过程已经在食品加工产业中存在，第一代生物燃料由乙醇的发酵生产组成。第二代生物燃料的生产处于探索期，尤其包括生产长链醇(丁醇和戊醇)、萜烯、直链链烷和脂肪酸。两份最新综述提供了这个领域中研究的总体概述：Ladygina等人(Process Biochemistry 41(2006),1001)和Wackett(Current Opinions in ChemicalBiology 21(2008),187)。已经描述异戊酸由小红酵母(Rhodotorula minuta)转化成异丁烯(Fujii等人(Appl.Environ.Microbiol.54(1988),583))，但是但是这种反应的效率，小于每分钟百万分之一或每天约1/1000，远未允许工业应用。反应机理由Fukuda H等人(BBRC201(1994),516)阐明并且涉及通过还原氧代铁基(oxoferryl)Fe^V＝O，使异戊酸脱羧的细胞色素P450酶。通过这种途径大规模生物合成异丁烯似乎是高度不利的，因为它将需要合成和降解一分子的亮氨酸以形成一分子的异丁烯，并且来自小红酵母的细胞色素P450是膜结合型蛋白，致使自身在细菌中难以可溶性形式重组表达。出于全部这些原因，似乎很不可能的是，这种途径可以充当工业利用的基础。已经将其他微生物描述为能够略微地从异戊酸盐天然产生异丁烯；获得的产率甚至低于用小红酵母获得的那些产率(Fukuda等人(Agric.Biol.Chem.48(1984),1679))。

Gogerty等人(Appl.Environm.Microbiol.76(2010),8004-8010)和van Leeuwen等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.93(2012),1377-1387)描述通过酶促转化从乙酰乙酰-CoA产生异丁烯，其中所提出途径的最后步骤是通过利用甲羟戊酸二磷酸脱羧酶转化3-羟基-3-甲基丁酸(也称作3-羟异戊酸(HIV))。WO 2010/001078中也描述了从3-羟基-3-甲基丁酸产生异丁烯的这种反应。在Gogerty等人(见上述引文)和van Leeuwen等人(见上述引文)中，提出通过转化3-甲基-巴豆酰-CoA经3-羟基-3-甲基丁酰-CoA，实现3-羟基-3-甲基丁酸的产生。van Leeuwen等人(见上述引文)还描述了从可再生资源产生异丁烯的多个备选途径，其中之一包括异戊酸(3-甲基丁酸酯)转化成异丁烯，其中通过水解反应从异戊酰-CoA提供异戊酸。提出通过利用4-甲基-2-氧代戊酸:NAD⁺氧化还原酶，从2-氧代异己酸和CoA产生异戊酰-CoA本身。为了进一步改善从可再生资源产生异丁烯的方法的效率和变异性，需要提供可以作为酶促转化成异丁烯的底物使用的前体的备选途径。

通过提供一种从3-甲基巴豆酰-CoA产生异丁烯的方法，本发明满足这种需要，所述方法包括步骤：

(a)将3-甲基巴豆酰-CoA酶促转化成3-甲基丁酸；并且

(b)将如此产生的3-甲基丁酸进一步酶促转化成异丁烯。

根据步骤(a)将3-甲基巴豆酰-CoA转化成3-甲基丁酸(异戊酸)提供了现有技术中所提出途径的备选途径，其将2-氧代异己酸经3-甲基丁酰-CoA(异戊酰-CoA)转化成3-甲基丁酸(异戊酸)。

根据本发明，可以通过不同酶促途径实现3-甲基巴豆酰-CoA转化成3-甲基丁酸。一个可能性是将3-甲基巴豆酰-CoA首先转化成3-甲基丁酰-CoA并且随后将3-甲基丁酰-CoA进一步转化成3-甲基丁酸。另一个可能性将3-甲基巴豆酰-CoA首先转化成3-甲基巴豆酸并且随后将3-甲基巴豆酸进一步转化成3-甲基丁酸。

因此，在一个优选的实施方案中，通过将3-甲基巴豆酰-CoA首先转化成3-甲基丁酰-CoA并且随后将3-甲基丁酰-CoA进一步转化成3-甲基丁酸，实现3-甲基巴豆酰-CoA转化成3-甲基丁酸。因此，本发明涉及一种从3-甲基巴豆酰-CoA产生异丁烯的方法，所述方法包括步骤：

(a)将3-甲基巴豆酰-CoA酶促转化成3-甲基丁酸；并且

(b)将如此产生的3-甲基丁酸进一步酶促转化成异丁烯。

其中通过包括以下步骤的方法实现根据步骤(a)的将3-甲基巴豆酰-CoA酶促转化成3-甲基丁酸：

(a1)将3-甲基巴豆酰-CoA酶促转化成3-甲基丁酰-CoA；并且

(a2)将如此产生的3-甲基丁酰-CoA进一步酶促转化成3-甲基丁酸。

可以例如通过使用分类为EC 1.3._._的酶，实现根据步骤(a1)的将3-甲基巴豆酰-CoA酶促转化成3-甲基丁酰-CoA，即还原3-甲基巴豆酰-CoA中的双键。分类为EC1.3._._的酶是作用于供体分子的CH-CH基团的氧化还原酶。这个亚类含有可逆催化两个碳原子之间碳-碳单键转化成碳-碳双键的酶。依赖于接纳体，将EC 1.3的亚类分类。在一个优选的实施方案中，该酶是分类为EC 1.3._._并使用NADH或NADPH作为辅因子的酶。

在一个特别优选的实施方案中，该酶是使用NADPH作为辅因子的酶。图1中示意性显示使用这种酶的转化过程。在优选的实施方案中，酶选自：

-酰基-CoA脱氢酶(NADP+)(EC 1.3.1.8)；

-烯酰-[酰基载体蛋白]还原酶(NADPH，Si-特异性)(EC 1.3.1.10)；

-顺-2-烯酰辅酶A还原酶(NADPH)(EC 1.3.1.37)；

-反-2-烯酰辅酶A还原酶(NADPH)(EC 1.3.1.38)；

-烯酰-[酰基载体蛋白]还原酶(NADPH，Re-特异性)(EC 1.3.1.39)；和

-巴豆酰辅酶A还原酶(EC 1.3.1.86)。

因此，在一个优选的实施方案中，通过利用酰基-CoA脱氢酶(NADP+)(EC1.3.1.8)，实现3-甲基巴豆酰-CoA转化成3-甲基丁酰-CoA。酰基-CoA脱氢酶是催化以下反应的酶：

这种酶存在于多种生物中，包括真核生物和原核生物，如植物、动物、真菌和细菌。例如已经在欧洲牛(Bos taurus)、褐家鼠(Rattus novegicus)、小家鼠(Mus musculus)、鸽属物种(Columba sp.)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、本氏烟草(Nicotianabenthamiana)、韭葱(Allium ampeloprasum)、纤细裸藻(Euglena gracilis)、白假丝酵母(Candida albicans)、Streptococcus collinus、球形红杆菌(Rhodobacter sphaeroides)和耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)中描述该酶。

在又一个优选的实施方案中，通过利用烯酰-[酰基载体蛋白]还原酶(NADPH，Si-特异性)(EC 1.3.1.10)，实现3-甲基巴豆酰-CoA转化成3-甲基丁酰-CoA。烯酰-[酰基载体蛋白]还原酶(NADPH，Si-特异性)是催化以下反应的酶：

这种酶存在于多种生物中，包括真核生物和原核生物，如植物、真菌和细菌。例如，已经在红花(Carthamus tinctorius)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、Streptococcus collinus，肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)、大肠杆菌(Escherichia coli)和肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)中描述该酶。

在又一个优选的实施方案中，通过利用顺-2-烯酰辅酶A还原酶(NADPH)(EC1.3.1.37)，实现3-甲基巴豆酰-CoA转化成3-甲基丁酰-CoA。顺-2-烯酰辅酶A还原酶(NADPH)是催化以下反应的酶：

已经据称这种酶出现在大肠杆菌(Escherichia coli)中。

在又一个优选的实施方案中，通过利用反-2-烯酰辅酶A还原酶(NADPH)(EC1.3.1.38)，实现3-甲基巴豆酰-CoA转化成3-甲基丁酰-CoA。反-2-烯酰辅酶A还原酶(NADPH)是催化以下反应的酶：

这种酶存在于多种生物中，包括真核生物和原核生物，如植物、动物和细菌。例如已经在智人(Homo sapien)、褐家鼠、小家鼠、豚鼠(Cavia porcellus)、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)、蝴蝶兰(Phalaenopsis amabilis)、陆地棉(Gossypiumhirsutum)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、Streptococcus collinu和大肠杆菌中描述该酶。

在又一个优选的实施方案中，通过利用烯酰-[酰基载体蛋白]还原酶(NADPH，Re-特异性)(EC 1.3.1.39)，实现3-甲基巴豆酰-CoA转化成3-甲基丁酰-CoA。烯酰-[酰基载体蛋白]还原酶(NADPH，Re-特异性)是催化以下反应的酶：

这种酶存在于多种生物中，包括真核生物和原核生物，如动物和细菌。例如已经在原鸡(Gallus gallus)、鸽、褐家鼠(Rattus norvegicus)、豚鼠(Cavia porcellus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和牙龈卟啉单胞菌中描述该酶。

在又一个优选的实施方案中，通过利用巴豆酰-CoA还原酶(EC1.3.1.86)，实现3-甲基巴豆酰-CoA转化成3-甲基丁酰-CoA。巴豆酰-CoA还原酶是催化以下反应的酶：

这种酶存在于多种生物中，包括真核生物和原核生物，如动物、真菌和细菌。例如已经在欧洲牛(Bos taurus)、Salinospora tropica、艰难梭菌(Clostridium difficile)、Streptomyces collinus、肉桂地链霉菌(Streptomyces cinnamonensis)和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)中描述该酶。

在另一个特别优选的实施方案中，该酶是使用NADH作为辅因子的酶。图2中示意性显示使用这种酶的转化过程。在优选的实施方案中，酶选自：

-烯酰-[酰基载体蛋白]还原酶(NADH)(EC 1.3.1.9)；和

-反-2-烯酰辅酶A还原酶(NAD+)(EC 1.3.1.44)。

因此，在一个优选的实施方案中，通过利用烯酰-[酰基载体蛋白]还原酶(NADH)(EC 1.3.1.9)，实现3-甲基巴豆酰-CoA转化成3-甲基丁酰-CoA。烯酰-[酰基载体蛋白]还原酶(NADH)是催化以下反应的酶：

这种酶存在于多种生物中，包括真核生物和原核生物，如植物和细菌。例如已经在拟南芥(Arabidopsis thaliana)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、结核分枝杆菌、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)、鼻疽伯克霍尔德菌(Birkholderia mallei)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、幽门螺杆菌(Helicobacter pyloris)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)和许多其他生物中描述该酶。

在又一个优选的实施方案中，通过利用反-2-烯酰辅酶A还原酶(NAD⁺)(EC1.3.1.44)，实现3-甲基巴豆酰-CoA转化成3-甲基丁酰-CoA。反-2-烯酰辅酶A还原酶(NAD⁺)是催化以下反应的酶：

这种酶存在于多种生物中，包括真核生物和原核生物，如植物、动物和细菌。例如已经在褐家鼠、纤细裸藻(Euglena gracilis)，耻垢分枝杆菌，荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)，丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)，溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)，铜绿假单胞菌，结核分枝杆菌和齿垢密螺旋体(Treponemadenticola)中描述该酶。

在另一个优选实施方案中，该酶是分类为EC 1.3.8并且使用黄素辅基作为接纳体的酶。图3中示意性显示使用这种酶的转化过程。在优选的实施方案中，该酶是异戊酰-CoA脱氢酶(EC 1.3.8.4)。异戊酰-CoA脱氢酶是催化以下反应的酶：

这种酶存在于多种生物中，包括真核生物和原核生物，如植物、动物、真菌和细菌。例如已经在智人、欧洲牛、褐家鼠、小家鼠、豚鼠、家蚕(Bombix mori)、秀丽隐杆线虫、马铃薯(Solanum tuberosum)、拟南芥、豌豆(Pisum sativum)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、铜绿假单胞菌和盐生盐杆菌(Halobacterium salinarum)中描述该酶。

在另一个实施方案中，可以例如通过利用liuA基因编码的来自粘球菌属物种(Myxococcus sp.)的酶，实现3-甲基巴豆酰-CoA转化成3-甲基丁酰-CoA(Li等人,Angew.Chem.Int.Ed.52(2013),1304-1308)。这种酶(AibC、LiuA)注释为氧化还原酶及注释为属于锌结合脱氢酶家族。显示该酶使用NADH作为辅因子，将3-甲基巴豆酰-CoA还原成3-甲基丁酰-CoA。所述蛋白质的氨基酸序列按Uniprot登录号Q1D4I2可获得。

在一个特别优选的实施方案中，这种酶具有如SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列或显示与SEQ ID NO:3至少x％同源性并具有氧化还原酶活性的氨基酸序列，其中x是30和100之间的整数，优选地是35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中这种酶能够如上文中所述那样将3-甲基巴豆酰-CoA转化成3-甲基丁酰-CoA。

优选地，通过将各自序列与上述SEQ ID NOs任一个的氨基酸序列比较，确定同一性的程度。当比较的序列不具有相同的长度时，同一性程度优选地指较短序列中与较长序列内氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数或指较长序列中与较短序列内氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数。可以根据本领域熟知的方法，优选地使用合适的计算机算法(如CLUSTAL)确定序列同一性程度。

当使用Clustal分析方法来确定特定序列是否与参考序列例如有80％同一性时，对于氨基酸序列的比较，可以使用默认设置或者设置优选如下：矩阵：blosum 30；开放空位罚分：10.0；延伸空位罚分：0.05；延迟发散(Delay divergent)：40；空位分隔距离：8。对于核苷酸序列比较，延伸空位罚分优选地设置至5.0。

优选地，在序列的整个长度范围内计算同一性的程度。

可以通过不同的酶促转化，实现根据步骤(a2)的将3-甲基丁酰-CoA转化成3-甲基丁酸。一个可能性借助水解反应直接转化。另一个可能性是借助CoA-转移酶催化的反应直接转化并且第三个可能性是借助磷酸3-甲基丁酰酯的两步骤转化。这三个选项将在下文中进一步讨论。

在一个实施方案中，可以通过包括在水解酶反应中利用硫酯水解酶(EC 3.1.2；下文中称作硫酯酶)将3-甲基丁酰-CoA酶促转化成3-甲基丁酸的步骤的方法，实现根据步骤(a2)将3-甲基丁酰-CoA转化成3-甲基丁酸。

硫酯酶(TE；也称作硫酯水解酶)是分类为EC 3.1.2的酶。目前，将硫酯酶分类为EC3.1.2.1至EC 3.1.2.27，并且对于未分类TE，分类为EC3.1.2.-。Cantu等人(ProteinScience 19(2010),1281-1295)描述了存在就一级结构而言彼此不相关的23个硫酯酶家族。然而，假定相同家族的全部成员均具有基本上相同的三级结构。硫酯酶水解羰基和硫原子之间的硫酯键。

图4中示意性显示由硫酯酶催化将3-甲基丁酰-CoA转化成3-甲基丁酸。

在优选的实施方案中，本发明方法中用于将3-甲基丁酰-CoA转化成3-甲基丁酸的硫酯酶选自：

-乙酰-CoA水解酶(EC 3.1.2.1)；

-棕榈酰-CoA水解酶(EC 3.1.2.2)；

-3-羟异丁酰-CoA水解酶(EC 3.1.2.4)；

-油酰-[酰基载体蛋白]水解酶(EC 3.1.2.14)；

-ADP依赖性短链酰基-CoA水解酶(EC 3.1.2.18)；

-ADP-依赖性中等链酰基-CoA水解酶(EC 3.1.2.19)；和

-酰基-CoA水解酶(EC 3.1.2.20)。

因此，在一个优选的实施方案中，通过利用乙酰-CoA水解酶(EC3.1.2.1)，实现3-甲基丁酰-CoA直接转化成3-甲基丁酸。乙酰-CoA水解酶是催化以下反应的酶：

乙酰-CoA+H₂O→乙酸+CoA

这种酶存在于多种生物中，包括真核生物和原核生物，如植物、动物、真菌和细菌。例如已经在褐家鼠(Uniprot登录号：Q99NB7)、小家鼠、野猪(Sus scrofa)、欧洲牛、原鸡、阔鼻小目(Platyrrhini)、绵羊(Ovis aries)、仓鼠(Mesocricetus auratus)、猪蛔虫(Ascaris suum)、智人(Uniprot登录号：Q8WYK0)、豌豆、黄瓜(Cucumis sativus)、大黎属物种(Panicus sp.)、蓖麻(Ricinus communis)、马铃薯、菠菜(Spinacia oleracea)、玉蜀黍(Zea mays)、大豆(Glycine max)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、白假丝酵母(Candida albicans)、布氏锥虫(Trypanosomabrucei)、枯氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、Trypanosoma dionisii、Trypanosomavespertilionis、法式短膜虫(Crithidia fasciculate)、氨基戊酸梭菌(Clostridiumaminovalericum)、发酵氨基酸球菌(Acidaminococcus fermaentans)、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)和巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)中描述该酶。

在另一个优选的实施方案中，通过利用棕榈酰-CoA水解酶(EC3.1.2.2)，实现3-甲基丁酰-CoA直接转化成3-甲基丁酸。棕榈酰-CoA水解酶是催化以下反应的酶：

棕榈酰-CoA+H₂O→棕榈酸+CoA

这种酶存在于多种生物中，包括真核生物和原核生物，如植物、动物、真菌和细菌。例如已经在拟南芥(Uniprot登录号：Q8GYW7)、豌豆、菠菜、Bumilleriopsis filiformis、绿色独球藻(Eremosphaera viridis)、梯接转板藻(Mougeotia scalaris)、纤细裸藻(Euglena gracilis)、橙黄红酵母(Rhodotorula aurantiaca)、酿酒酵母、褶皱假丝酵母(Candida rugosa)、秀丽隐杆线虫、小家鼠(Uniprot登录号：P58137)、智人(Homosapiens)、阔鼻小目、欧洲牛、家犬(Canis lupus familiaris)、野猪、Cavia procellus、鸽属物种、中国仓鼠(Cricetulus griseus)、仓鼠、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、褐家鼠、欧洲野兔(Oryctolagus cuniculus)、原鸡、绿头鸭(Anas platyrhynchos)、结核分枝杆菌、草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)、耻垢分枝杆菌、醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter colcaceticus)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、幽门螺杆菌(Helicobacter pyloris)、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、球形红杆菌(Rhodobactershpaeroides)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)和大肠杆菌中描述该酶。

在又一个优选的实施方案中，通过利用3-羟异丁酰-CoA水解酶(EC3.1.2.4)，实现3-甲基丁酰-CoA直接转化成3-甲基丁酸。3-羟异丁酰-CoA水解酶是催化以下反应的酶：

3-羟异丁酰-CoA+H₂O→3-羟异丁酸+CoA

这种酶存在于多种生物中，包括真核生物和原核生物，如植物、动物、真菌和细菌。例如已经在拟南芥、智人、家犬(Canus lupus familiaris)、褐家鼠、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和铜绿假单胞菌中描述该酶。

在又一个优选的实施方案中，通过利用油酰-[酰基载体蛋白]水解酶(EC3.1.2.14)，实现3-甲基丁酰-CoA直接转化成3-甲基丁酸。油酰-[酰基载体蛋白]水解酶是催化以下反应的酶：

油酰-[酰基载体蛋白]+H₂O→油酸+[酰基载体蛋白]

这种酶存在于多种植物和细菌中。例如已经在拟南芥、韭葱、南瓜(Curcurbitamoschata)、Cuphea calophylla、萼距花(cuphea hookeriana)、披针叶萼距花(Cuphealanceolata)、Cuphea wrightii、加州月桂(Umbellularia californica)、芫荽(Coriandrum sativum)、菠菜、油棕属物种(Elaeis sp.)、油棕(Elaeis guineensis)、大豆(Glycine max)、鳄梨(Persea americana)、豌豆(Pisum sativum)、白芥(Sinapis alba)、美洲榆(Ulmus Americana)、玉蜀黍(Zea mays)、芥菜(Brassica juncea)、欧洲油菜(Brassica napus)、Brassica rapa subsp.campestris、麻疯树(Jatropha curcas)、蓖麻(Ricinus communis)、樟(Cinnamomum camphorum)、四叶澳洲坚果(Macadamiatetraphylla)、杧果(Magnifera indica)、长叶马府油树(Madhuca longifolia)、毛白杨(Populus tomentosa)、蜡梅(Chimonanthus praecox)、陆地棉(Gossypium hirsutum)、藏榄(Diploknema butyracea)、向日葵(Helianthus annuus)和化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)中描述该酶。

在又一个优选的实施方案中，通过利用ADP-依赖性短链酰基-CoA水解酶(EC3.1.2.18)，实现3-甲基丁酰-CoA直接转化成3-甲基丁酸。ADP-依赖性短链酰基-CoA水解酶是催化以下反应的酶：

酰基-CoA+H₂O→羧化物+CoA

这种酶存在于多种动物中并且例如已经在小家鼠、褐家鼠和仓鼠中描述。

在又一个优选的实施方案中，通过利用ADP-依赖性中等链酰基-CoA水解酶(EC3.1.2.19)，实现3-甲基丁酰-CoA直接转化成3-甲基丁酸。ADP-依赖性中等链酰基-CoA水解酶是催化以下反应的酶：

酰基-CoA+H₂O→羧化物+CoA

这种酶存在于多种动物中并且例如已经在褐家鼠和仓鼠中描述。

在又一个优选的实施方案中，通过利用酰基-CoA水解酶(EC 3.1.2.20)，实现3-甲基丁酰-CoA直接转化成3-甲基丁酸。酰基-CoA水解酶是催化以下反应的酶：

酰基-CoA+H₂O→羧化物+CoA

这种酶存在于多种生物中，包括真核生物和原核生物，如植物、动物、真菌和细菌。例如已经在拟南芥、橙黄红酵母、Bumilleriopsis filiformis、绿色独球藻、纤细裸藻、小家鼠、褐家鼠、智人、野猪、欧洲牛、家犬、豚鼠、Cricetus griseus、黑腹果蝇、绿头鸭、原鸡、秀丽隐杆线虫、酿酒酵母属、褶皱假丝酵母、大肠杆菌、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、链霉菌属物种(Streptomycessp.)、天蓝色链霉菌、粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)、铜绿假单胞菌、地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsis mediterranei)、醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)、幽门螺杆菌、球形红杆菌和草分枝杆菌中描述该酶。

在优选的实施方案中，酰基-CoA水解酶是来自大肠杆菌或来自流感嗜血杆菌的酶，更优选地是来自大肠杆菌的YciA酶或其来自流感嗜血杆菌的密切相关的同源物HI0827(Zhuang等人,Biochemistry 47(2008),2789-2796)。在另一个优选实施方案中，乙酰-CoA水解酶是来自智人的酶(Cao等人,Biochemistry 48(2009),1293-1304)。已经报道来自流感嗜血杆菌的酶能够催化3-甲基丁酰-CoA转化成3-甲基丁酸(Zhuang等人,参见上述引文)。

在另一个实施方案中，可以通过包括在转移酶反应中利用CoA-转移酶(EC 2.8.3)将3-甲基丁酰-CoA酶促转化成3-甲基丁酸的步骤的方法，实现根据步骤(a2)的将3-甲基丁酰-CoA转化成3-甲基丁酸。

图5中示意性显示由CoA-转移酶催化将3-甲基丁酰-CoA转化成3-甲基丁酸。

CoA-转移酶存在于来自全部后代品系的生物中。大部分的CoA-转移酶属于两个熟知酶家族(下文中称作家族I和II)并且存在已经在细菌无氧代谢途径中鉴定的第三个家族。描述不同家族的综述可以在Heider(FEBS Letters 509(2001),345-349)中找到。

例如，家族I含有以下CoA-转移酶：

对于3-氧代酸：按EC 2.8.3.5或EC 2.8.3.6分类的酶；

对于短链脂肪酸：按EC 2.8.3.8或EC 2.8.3.9分类的酶；

对于戊烯二酸：按EC 2.8.3.12分类的酶；

对于琥珀酸：琥珀酰-CoA:乙酸CoA-转移酶，即按EC 2.8.3.18分类的酶(还参见Mullin等人,Biochemistry 51(2012),8422-34；Mullin等人,J.Bacteriol.190(2006),4933-4940)。

家族I的大部分酶天然地使用琥珀酰-CoA或乙酰-CoA作为CoA供体。这些酶含有处于不同聚集状态的两个不相似亚基。已经鉴定到两个保守氨基酸序列基序：

Prosites项PS01273

(http://prosite.expasy.org/cgi-bin/prosite/prosite-search-ac？PDOC00980)

COA_TRANSF_1,http://prosite.expasy.org/PS01273"；辅酶A转移酶特征标识1(PATTERN)

共有样式：

[DN]-[GN]-x(2)-[LIVMFA](3)-G-G-F-x(3)-G-x-P

和

Prosites项PS01273

(http://prosite.expasy.org/cgi-bin/prosite/prosite-search-ac？PDOC00980)

COA_TRANSF_2，PS01274；辅酶A转移酶特征标识2(样式)

共有样式：

[LF]-[HQ]-S-E-N-G-[LIVF](2)-[GA]

E(谷氨酸)是活性部位残基。

CoA-转移酶家族II由柠檬酸裂合酶(EC 2.8.3.10)和柠檬苹果酸裂合酶(EC2.8.3.11)的同型二聚α-亚基组成。这些酶催化含有共价结合的CoA-衍生物的酰基载体蛋白(ACP)的转移。显示在柠檬酸裂合酶的情况下，这类酶在体外还接受游离CoA-硫酯，如乙酰-CoA、丙酰-CoA、丁酰-CoA(Dimroth等人,Eur.J.Biochem.80(1977),479-488)并且在柠檬苹果酸裂合酶的情况下，在体外还接受乙酰-CoA和琥珀酰-CoA(Dimroth等人,Eur.J.Biochem.80(1977),469-477)。

根据Heider(参见上述引文)，CoA-转移酶家族III由甲酰基-CoA:草酸CoA-转移酶、琥珀酰-CoA:(R)-苄基琥珀酸CoA-转移酶、(E)-肉桂酰-CoA:(R)-苯基乳酸CoA-转移酶和丁酰甜菜碱基-CoA:(R)-肉碱CoA-转移酶组成。家族III的另一个成员是琥珀酰-CoA:L-苹果酸CoA-转移酶，其在橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)的自养CO₂固定中的功能是用琥珀酰-CoA作为CoA供体，将L-苹果酸活化成其CoA硫酯(Friedman S.等人,J.Bacteriol.188(2006),2646-2655)。这个家族的CoA转移酶的氨基酸序列仅与家族I和II的那些显示低序列同一性程度。这些CoA-转移酶存在于原核生物和真核生物中。

在优选的实施方案中，本发明方法中使用的CoA-转移酶是属于如上文所述的家族I或II的CoA-转移酶。

优选地，本发明方法中用于3-甲基丁酰-CoA直接转化成3-甲基丁酸的CoA-转移酶选自：

-乙酸CoA-转移酶(EC 2.8.3.8)；和

-丁酸-乙酰乙酸CoA-转移酶(EC 2.8.3.9)。

因此，在一个优选的实施方案中，通过利用乙酸CoA-转移酶(EC2.8.3.8)，实现3-甲基丁酰-CoA直接转化成3-甲基丁酸。乙酸CoA-转移酶是催化以下反应的酶：

这种酶存在于多种细菌中并且例如已经在Anaerostipes caccae、霍氏真杆菌(Eubacterium hallii)、Faecalibacterium prausnitzii、Roseburia hominis、肠罗氏菌(Roseburia intestinalis)、粪球菌属物种(Coprococcus sp.)和大肠杆菌中描述。

在另一个优选的实施方案中，通过利用丁酸-乙酰乙酸CoA-转移酶(EC2.8.3.9)，实现3-甲基丁酰-CoA直接转化成3-甲基丁酸。丁酸-乙酰乙酸CoA-转移酶是催化以下反应的酶：

这种酶存在于多种生物中，包括真核生物和原核生物，如动物和细菌。例如已经在欧洲牛、梭菌属物种(Clostridium sp.)和大肠杆菌中描述该酶。

如上文提到，还可以备选地通过下述转化实现3-甲基丁酰-CoA转化成3-甲基丁酸，所述转化首先涵盖3-甲基丁酰-CoA转化成磷酸3-甲基丁酰酯及随后磷酸3-甲基丁酰酯转化成3-甲基丁酸。图6中示意性显示相应的反应。这条途径具有产生一分子ATP的优点并且因此如果在体内实施，则在能量学上更有利于细胞。

例如可以通过利用磷酸丁酰转移酶(EC 2.3.1.19)或磷酸乙酰转移酶(EC2.3.1.8)，实现3-甲基丁酰-CoA转化成磷酸3-甲基丁酰酯。

磷酸丁酰转移酶(EC 2.3.1.19)天然地催化以下反应

Wiesenborn等人(Appl.Environ.Microbiol.55(1989),317-322)和Ward等人(J.Bacteriol.181(1999),5433-5442已经描述，磷酸丁酰转移酶(EC 2.3.1.19)可以使用除丁酰基辅酶A(丁酰-CoA)之外的众多底物，尤其乙酰-CoA、丙酰-CoA、异丁酰基-CoA、戊酰-CoA和异戊酰-CoA。

已经描述该酶存在于众多生物中，尤其细菌中和原虫中。在一个实施方案中，该酶来自原虫反刍厚毛虫(Dasytricha ruminantium)。在优选的实施方案中，磷酸丁酰转移酶是来自细菌、优选地来自细菌芽孢杆菌属(Bacillus)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、肠球菌属(Enterococcus)或梭菌属(Clostridium)、更优选地肠球菌属(Enterococcus)或梭菌属(Clostridium)并且甚至更优选地来自巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、枯草芽孢杆菌、溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、丁酸芽胞梭菌(Clostridiumbutyricum)、科氏梭菌(Clostridium kluyveri)、Clostridium saccharoacetobutylicum、生孢梭菌(Clostridium sprorogene)或粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的磷酸丁酰转移酶。最优选地，该酶来自枯草芽孢杆菌(菌株168)(Uniprot登录号P54530)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)，尤其ptb基因(Uniprot登录号F0K6W0)；Wiesenborn等人(Appl.Environ.Microbiol.55(1989)，317-322))编码的酶，或来自粪肠球菌、尤其粪肠球菌MTUP9(Uniprot登录号K4YRE8或Uniprot登录号A0A038BNC2)；Ward等人(J.Bacteriol.181(1999),5433-5442))。对来自Uniprot登录号K4YRE8和Uniprot登录号A0A038BNC2的粪肠球菌的磷酸丁酰转移酶可获得的各序列具有99.3％的序列同源性。更优选来自Uniprot登录号A0A038BNC2下粪肠球菌的磷酸丁酰转移酶可获得的序列。

如提到，在优选的实施方案中，该酶是来自枯草芽孢杆菌(菌株168)(Uniprot登录号P54530)的磷酸丁酰转移酶(EC 2.3.1.19)。在一个特别优选的实施方案中，本发明方法中使用的磷酸丁酰转移酶(EC 2.3.1.19)具有如SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列或显示与SEQ ID NO:8至少x％同源性并具有磷酸丁酰转移酶活性的氨基酸序列，其中x是30和100之间的整数，优选地是35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中这种酶能够如上文中所述那样将3-甲基巴豆酰-CoA转化成3-甲基巴豆酰磷酸。

在另一个优选实施方案中，如所提到，该酶是来自粪肠球菌MTUP9(Uniprot登录号K4YRE8或Uniprot登录号A0A038BNC2)的磷酸丁酰转移酶(EC 2.3.1.19)。在一个特别优选的实施方案中，本发明方法中使用的磷酸丁酰转移酶(EC 2.3.1.19)具有如SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列或显示与SEQ ID NO:9至少x％同源性并具有磷酸丁酰转移酶活性的氨基酸序列，其中x是30和100之间的整数，优选地是35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中这种酶能够如上文中所述那样将3-甲基巴豆酰-CoA转化成3-甲基巴豆酰磷酸。

就测定同一性程度而言，如上文已经阐述的内容同样适用。

磷酸乙酰转移酶(EC 2.3.1.8)天然地催化以下反应

Veit等人(J.Biotechnol.140(2009),75-83)已经描述，磷酸乙酰转移酶还可以使用丁酰-CoA或丙酰-CoA作为底物。

InterPro数据库中这个酶家族的登录号是IPR012147和IPR002505，"http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/IPR002505"_

(http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/IPR012147

http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/IPR002505)

还参见http://pfam.sanger.ac.uk/family/PF01515

已经在多种生物、尤其细菌和真菌中描述这种酶。因此，在一个优选的实施方案中，该酶是来自细菌的酶、优选地以下属的酶：埃希氏菌、绿梭藻属(Chlorogonium)、梭菌属、韦荣球菌属、甲烷八叠球菌属、棒状杆菌属(Corynebacterium)、玫瑰杆菌属(Ruegeria)、沙门氏菌属、固氮菌属(Azotobacter)、慢生根瘤菌属(Bradorhizobium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、穆尔氏菌属、红假单胞菌属、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、链球菌属、栖热袍菌属或芽孢杆菌属(Bacillus)、更优选地以下物种的酶：大肠杆菌、长绿梭藻(Chlorogonium elongatum)、科氏梭菌、丙酮丁醇梭菌、Clostridium acidurici、小韦荣球菌、嗜热甲烷八叠球菌、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、Ruegeriapomeroyi、肠道沙门氏菌、维涅兰德固氮菌(Azotobacter vinelandii)、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、旧金山乳杆菌(Lactobacillus sanfranciscensis)、热醋穆尔氏菌、沼泽红假单胞菌、草木犀中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、化脓性链球菌、海栖热袍菌或枯草芽孢杆菌的酶。在另一个优选实施方案中，该酶是来自真菌、优选地来自酵母属(Saccharomyces)、更优选地来自物种酿酒酵母的酶。

例如可以通过使用丁酸激酶(EC 2.7.2.7)、分枝链脂肪酸激酶(EC2.7.2.14)、丙酸激酶(EC 2.7.2.15)或乙酸激酶(EC 2.7.2.1)，实现磷酸3-甲基丁酰酯转化成3-甲基丁酸。

丁酸激酶(EC 2.7.2.7)天然地催化以下反应

例如Hartmanis(J.Biol.Chem.262(1987),617-621)已经描述，丁酸激酶可以使用除丁酸之外的众多底物，例如戊酸，异丁酸、异戊酸和乙酸乙烯酯。已经在多种生物、尤其细菌中描述这种酶。在一个优选的实施方案中，该酶来自细菌，优选地来自梭菌属、丁酸弧菌属、栖热袍菌属、肠球菌属、乳杆菌属或地芽孢杆菌属的细菌。优选梭菌属、乳杆菌属或地芽孢杆菌属。更优选地，该酶来自以下细菌物种：丙酮丁醇梭菌、Clostridiumproteoclasticum、酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)、酪酸梭菌(Clostridiumbutyricum)、巴斯德梭菌,(Clostridium pasteurianum)、破伤风形梭菌(Clostridiumtetanomorphum)、溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio firbrosolvens)，亨氏丁酸弧菌(Butyrivibrio hungatei)、海栖热袍菌、耐久肠球菌(Enterococcus durans)、粪肠球菌、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)(Uniprot登录号K0N529)或地芽孢杆菌属物种(Geobacillus sp.)(Uniprot登录号L8A0E1)。优选丙酮丁醇梭菌、干酪乳杆菌W56或地芽孢杆菌属物种GHH01。对于丙酮丁醇梭菌，已经描述两种丁酸激酶：丁酸激酶1(Uniprot登录号：Q45829)和丁酸激酶II(Uniprot登录号：Q97II19)。优选地，该酶是来自丙酮丁醇梭菌的buk基因编码的酶(Hartmanis(J.Biol.Chem.262(1987),617-621))或已经在粪肠球菌中发现的这种酶的同源物(Ward等人(J.Bacteriol.181(1999),5433-5442))。

如提到的，在优选的实施方案中，该酶是来自干酪乳杆菌W56(Uniprot登录号K0N529)的丁酸激酶(EC 2.7.2.7)。在一个特别优选的实施方案中，本发明方法中使用的丁酸激酶(EC 2.7.2.7)具有如SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列或显示与SEQ ID NO:10至少x％同源性并具有丁酸激酶活性的氨基酸序列，其中x是30和100之间的整数，优选地是35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中这种酶能够如上文中所述那样将磷酸3-甲基巴豆酰酯转化成3-甲基巴豆酸。

在另一个优选实施方案中，该酶是来自地芽孢杆菌属物种GHH01(Uniprot登录号L8A0E1)的丁酸激酶(EC 2.7.2.7)。在一个特别优选的实施方案中，本发明方法中使用的丁酸激酶(EC 2.7.2.7)具有如SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列或显示与SEQ ID NO:11至少x％同源性并具有丁酸激酶活性的氨基酸序列，其中x是30和100之间的整数，优选地是35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中这种酶能够如上文中所述那样将磷酸3-甲基巴豆酰酯转化成3-甲基巴豆酸。

分枝链脂肪酸激酶(EC 2.7.2.14)天然地催化以下反应

已经描述这种酶存在于众多细菌中。因此，在一个优选的实施方案中，该酶是来自细菌、优选地来自螺旋体属(Spirochaeta)或栖热袍菌属，更优选地来自海栖热袍菌的酶。

丙酸激酶(EC 2.7.2.15)天然地催化以下反应

这种酶存在于众多细菌中，尤其肠杆菌科中。因此，在一个优选的实施方案中，该酶是来自细菌、优选地来自沙门氏菌属或埃希氏菌属，更优选地来自肠道沙门氏菌或大肠杆菌的酶。

乙酸激酶(EC 2.7.2.1)天然地催化以下反应

已经描述该酶存在于众多生物中，尤其细菌和真核生物中。在一个优选的实施方案中，该酶来自细菌、优选地来自以下属细菌：甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、隐球酵母属(Cryptococcus)、乙醇杆菌属(Ethanoligenens)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、玫瑰杆菌属(Roseovarius)、链球菌属(streptococcus)、沙门氏菌属(Salmonella)、无胆甾原体属(Acholeplasma)、不动杆菌属(Acinetobacter)、阿耶罗菌属(Ajellomyces)、芽孢杆菌属(Bacillus)、疏螺旋体属(Borrelia)、毛壳霉属(Chaetomium)、梭菌属(Clostridium)、球孢子菌属(Coccidioides)、鬼伞属(Coprinopsis)、隐球酵母属(Cryptococcus)、贪铜菌属(Cupriavidus)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、肠球菌属(Enterococcus)、埃希氏菌(Escherichia)、乙醇杆菌属，土芽孢杆菌属(Geobacillus)、螺杆菌属(Helicobacter)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、李斯特氏菌属(Listeria)、中间原体属(Mesoplasma)、穆尔氏菌属(Moorella)、支原体(Mycoplasma)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、红假单胞菌属(Rhodospeudomonas)、Roseovarius，沙门氏菌属(Salmonella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、栖热袍菌属(Thermotoga)或韦荣球菌属(Veillonella)，更优选地来自以下细菌物种：嗜热甲烷八叠球菌(Methanosarcina thermophila)、新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)、哈尔冰乙醇杆菌(Ethanoligenens harbinense)，产丙酸丙酸杆菌(Propionibacterium acidipropionici)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、肠链球菌(Streptococcus enterica)、化脓性链球菌、莱氏无胆甾原体(Acholeplasma laidlawii)、醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)、荚膜阿耶罗菌(Ajellomyces capsulatus)、枯草芽孢杆菌，伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、球毛壳霉(Chaetomium globosum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、热纤梭菌(Clostridium thermocellum)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、灰盖鬼伞(Coprinopsis cinerea)、新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)、钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)、普通脱硫弧菌(Desulfovibrio vulgaris)、粪肠球菌、大肠杆菌、哈尔冰乙醇杆菌、嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)、幽门螺杆菌、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、旧金山乳杆菌(Lactobacillus sanfranciscensis)、乳酸乳杆菌(Lactococcus lactis)、单核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、Mesoplasma florum、醋酸甲烷八叠球菌、马氏甲烷八叠球菌、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae)、Oceanobacillus iheyensis、费氏丙酸杆菌(Propionibacteriumfreudenreichii)、产丙酸丙酸杆菌(Propionibacterium acidipropionici)、沼泽红假单胞菌(Rhodospeudomonas palustris)、肠道沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、海栖热袍菌(Thermotoga maritime)或小韦荣球菌(Veillonella parvula)。

在另一个优选实施方案中，该酶是来自真菌的酶，优选地来自以下真菌属的酶：曲霉属(Aspergillus)、赤霉属(Gibberella)、肉座菌属(Hypocrea)、巨座壳属(Magnaporthe)、暗球腔菌属(Phaeosphaeria)、平革菌属(Phanerochaete)、疫霉属(Phytophthora)、核盘菌属(Sclerotinia)、Uncinocarpus、黑粉菌属(Ustilago)或脉孢菌属(Neurospora)的酶，甚至更优选地来自以下真菌物种的酶：烟曲霉(Aspergillusfumigates)、构巢曲霉、玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)、红褐肉座菌属(Hypocreajecorina)，稻卵孢球腔菌(Magnaporthe grisea)、Phaeosphaeria nodorum，黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、橡树疫霉(Phytophthora ramorum)、大豆疫霉(Phytophthora sojae)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、Uncinocarpus reesii、玉米黑粉菌(Ustilago maydis)或粗糙链孢霉(Neurospora crassa)。

在又一个优选的实施方案中，该酶是来自植物或藻类的酶，优选地来自衣藻属(Chlamydomonas)的酶、甚至更优选地来自物种莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的酶。

在另一个实施方案中，该酶来自内阿米巴属(Entamoeba)的生物，更优选地来自物种溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)。

已经显示上文提到的适于将磷酸3-甲基丁酰酯转化成3-甲基丁酸的酶家族是进化相关的并且含有共同的序列特征标识。这些特征标识在PROSITE数据库中提到并且描述：

http://prosite.expasy.org/cgi-bin/prosite/nicedoc.pl？PS01075

Gao等人(FEMS Microbiol.Lett.213(2002),59-65)已经描述了基因修饰的大肠杆菌细胞，所述细胞已经转化，尤其用分别编码磷酸丁酰转移酶(EC 2.3.1.19)和丁酸激酶(EC 2.7.2.7)的丙酮丁醇梭菌ptb基因和buk基因转化。已经显示这些大肠杆菌细胞能够产生D-(-)-3-羟基丁酸(3HB)。

如上文描述，也可以通过将3-甲基巴豆酰-CoA首先转化成3-甲基巴豆酸并且随后将3-甲基巴豆酸进一步转化成3-甲基丁酸实现3-甲基巴豆酰-CoA转化成3-甲基丁酸，即其中通过包括以下步骤的方法实现根据步骤(a)的将3-甲基巴豆酰-CoA酶促转化成3-甲基丁酸：

(aI)将3-甲基巴豆酰-CoA酶促转化成3-甲基巴豆酸；并且

(aII)将如此产生的3-甲基巴豆酸进一步酶促转化成3-甲基丁酸。

可以通过不同的酶促转化，实现根据步骤(aI)的将3-甲基巴豆酰-CoA转化成3-甲基巴豆酸。一个可能性借助水解反应直接转化。另一个可能性是借助CoA-转移酶催化的反应直接转化并且第三个可能性是借助磷酸3-甲基巴豆酰酯的两步骤转化。这三个选项将在下文中进一步讨论。

在一个实施方案中，可以通过直接转化，即通过包括在水解反应中利用硫酯酶(EC3.1.2)将3-甲基巴豆酰-CoA酶促转化成3-甲基巴豆酸的步骤的方法，实现根据步骤(aI)的将3-甲基巴豆酰-CoA转化成3-甲基巴豆酸。图7中示意性显示由硫酯酶催化将3-甲基巴豆酰-CoA转化成3-甲基巴豆酸。

上文已经描述硫酯酶并且如上文已经阐述的相同内容也适用于本发明方法的这个实施方案。在这种情况下，可能值得注意的是，已经报道来自大肠杆菌，流感嗜血杆菌和智人的酰基-CoA水解酶(EC 3.1.2.20)能够接受3-甲基巴豆酰-CoA(也称作β-甲基巴豆酰-CoA)作为底物。

特别优选来自大肠杆菌的酰基-CoA硫酯酶2(Uniprot P0AGG2；SEQ ID NO:12)和来自恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的酰基-CoA硫酯酶II(Uniprot Q88DR1；SEQ IDNO:13)。

在另一个实施方案中，可以通过直接转化，即通过包括在转移酶反应中利用CoA-转移酶(EC 2.8.3)将3-甲基巴豆酰-CoA酶促转化成3-甲基巴豆酸的步骤的方法，实现根据步骤(aI)将3-甲基巴豆酰-CoA转化成3-甲基巴豆酸。

图8中示意性显示由CoA-转移酶催化将3-甲基巴豆酰-CoA转化成3-甲基巴豆酸。

上文已经描述CoA-转移酶并且如上文已经阐述的相同内容也适用于本发明方法的这个实施方案。

如上文提到，还可以备选地通过下述转化实现3-甲基巴豆酰-CoA转化成3-甲基巴豆酸，所述转化首先包括3-甲基巴豆酰-CoA转化成磷酸3-甲基巴豆酰酯及随后磷酸3-甲基巴豆酰酯转化成3-甲基巴豆酸。图9中示意性显示相应的反应。

例如可以通过利用磷酸丁酰转移酶(EC 2.3.1.19)或磷酸乙酰转移酶(EC2.3.1.8)，实现3-甲基巴豆酰-CoA转化成磷酸3-甲基巴豆酰酯。上文已经关于3-甲基丁酰-CoA转化成磷酸3-甲基丁酰酯描述这些酶，并且上文已经描述的相同内容也适用于当前实施方案。

可以通过利用按EC 2.7.2分类的酶，即作为以羧基作为接纳体的磷酸转移酶分类的酶，实现将磷酸3-甲基巴豆酰酯转化成3-甲基巴豆酸。在优选的实施方案中，例如可以通过使用丁酸激酶(EC 2.7.2.7)、分枝链脂肪酸激酶(EC 2.7.2.14)、丙酸激酶(EC2.7.2.15)或乙酸激酶(EC 2.7.2.1)，实现磷酸3-甲基巴豆酰酯转化成3-甲基巴豆酸。上文已经关于磷酸3-甲基丁酰酯转化成3-甲基丁酸描述这些酶，并且上文已经描述的相同内容也适用于当前实施方案。

在上述方法步骤(aI)中获得的3-甲基巴豆酸根据上述方法的步骤(aII)进一步酶促转化成3-甲基丁酸。这种转化例如可以通过利用分类为2-烯酸还原酶(EC 1.3.1.31)的酶实现。图10中示意性显示该反应。2-烯酸还原酶是天然催化以下反应的酶：

这种酶存在于多种生物中，包括真核生物和原核生物，如动物、真菌和细菌。例如已经在菊苣(Cichorium intybus)、地钱(Marchantia polymorpha)、番茄(Solanumlycopersicum)、灰绿犁头霉(Absidia glauca)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、桔青霉(Penicillium citrinum)；红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、酿酒酵母、科氏梭菌、双酶梭菌(Clostridium bifermentans)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌病、戈氏梭菌(Clostridium ghonii)、芒氏梭菌(Clostridium mangenotii)、海洋梭菌(Clostridium oceanicum)、索氏梭梭菌(Clostridium sordellii)、生孢梭菌、斯氏梭菌(Clostridium sticklandii)、酪丁酸梭菌、无色杆菌属物种(Achromobacter sp.)、伯克霍尔德菌属物种(Burkholderia sp.)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、干酪乳杆菌、恶臭假单胞菌、希瓦氏菌属物种(Shewanella sp.)、伯氏耶尔森菌(Yersiniabercovieri)、枯草芽孢杆菌、热醋穆尔氏菌和厌氧消化链球菌(Peptostreptococcusanaerobius)中描述该酶。已经例如在Tischler等人(Eur.J.Bioche.97(1979),103-112)中描述梭菌科(Clostridiae)的烯醇还原酶。

根据本发明方法产生的3-甲基丁酸可以进一步酶促转化成异丁烯，优选地通过氧化脱羧转化。图11a中示意性显示该反应。

这种转化可以通过本领域已知的手段和方法或通过如下文进一步所述的新手段实现。

已经在van Leeuwen等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.93(2012),1377-1387)中描述的一个可能包括使用来自小红酵母的细胞色素P450，其中已经报道所述细胞色素P450能够催化3-甲基丁酸(异戊酸)转化成异丁烯(Fukud等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.21(1994),516-522和Fukud等人,J.Biochem.119(1996),314-318)。这种细胞色素P450称作P450rm。它是一种膜蛋白，尤其微粒体蛋白，并且已经注释为“异丁烯形成酶和苯甲酸4-羟化酶”。因此，在一个优选的实施方案中，通过利用细胞色素P450，更优选地小红酵母细胞色素P450，实现3-甲基丁酸转化成异丁烯。这种酶序列在Uniprot登录号Q12668下可获得。在一个特别优选的实施方案中，这种酶具有如SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列或显示与SEQ ID NO:4至少x％同源性并具有细胞色素P450活性的氨基酸序列，其中x是30和100之间的整数，优选地是35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，其中这种酶能够催化3-甲基丁酸(异戊酸)转化成异丁烯。

根据本发明的一个特别优选的实施方案，通过酶促催化的氧化脱羧，将3-甲基丁酸酶促转化成异丁烯，其中所述的氧化脱羧由形成烯烃的细胞色素P450脂肪酸脱羧酶催化。术语“形成烯烃的细胞色素P450脂肪酸脱羧酶”指属于cyp152家族并且具有使脂肪酸脱羧至末端烯烃的能力的细胞色素P450。通常而言，P450形成一个多功能蛋白庞大的超家族并且根据它们的序列相似性分成不同的CYP家族(Ortiz de Montellano,P.R.(编著),2005,Cytochrome P450:structure,mechanism and biochemistry,第3版,KluwerAcademics,New York,NY)。Belcher等人(J.Biol.Chem.289(2014),6535-6550；图2)显示cyp152家族成员的概况及其***发育关系。cyp152家族成员的特征在于，它们是与P450单加氧酶具有序列同源性的胞质血红素蛋白。这种类型的酶由细菌(例如少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)、枯草芽孢杆菌和本文中提到的那些)产生。与单加氧反应以及常见P450催化的过氧化物旁路反应的那些周转速率相比，催化周转速率高。催化的反应是在α-和/或β-位置羟化脂肪酸：

脂肪酸+H₂O₂＝3-或2-羟基脂肪酸+H₂O

如Rude等人(Appl.Environ.Microbiol.77(2011),1718-1727)报道，一些cyp152P450酶具有脱羧能力和脂肪酸羟化能力(在α-和/或β-位置)，提示其催化性机制中存在共有的反应中间体和支持一种反应超过另一种反应的特定结构性决定因素。

更优选地，术语“形成烯烃的细胞色素P450脂肪酸脱羧酶”指细菌Jeotgalicoccussp.ATCC 8456的形成烯烃的CYP450脂肪酸脱羧酶或具有脂肪酸脱羧能力的高度相关酶。细菌Jeotgalicoccus sp.ATCC 8456的形成烯烃的CYP450脂肪酸脱羧酶在下文中称作“Ole TJE”。在文献中，这种酶也称作“CYP152L1”(Belcher等人,J.Biol.Chem.289(2014),6535-6550)。

Ole T JE已经在细菌Jeotgalicoccus sp.ATCC 8456中作为形成末端烯烃的脂肪酸脱羧酶鉴定(Rude等人,Appl.Environm.Microbiol.77(2011)，1718-1727)。编码该蛋白质的基因的核苷酸序列已经在GenBank中按照登录号HQ709266提交并且归因于序列同源性，已经将它归属至P450peroxygenase的cyp152酶家族(Rude等人，参见上述引文)。该蛋白质序列按Uniprot登录号：E9NSU2可获得。如Rude等人中报道(参见上述引文)，Jeotgalicoccus sp.ATCC8456能够产生具有18至20个C原子的末端烯烃。Belcher等人(参见上述引文)已经报道，Ole T JE紧密结合于一系列长链脂肪酸并且产生一系列饱和脂肪酸(C12–C20)的终端烯形式。

虽然已经在文献中描述Ole T JE使用长链脂肪酸作为底物，但是发明人令人惊讶地发现，Ole T JE可以实际上接受3-甲基丁酸作为底物并且将它转化成异丁烯。

在优选的实施方案中，Ole T JE是这样的酶，所述酶

(a)包含如SEQ ID NO:1中所示的序列或与SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列至少60％同一性的序列；并且

(b)显示借助氧化脱羧将3-甲基丁酸转化成异丁烯的活性。

如上文(a)提到的，该酶包含如SEQ ID NO:1中所示的序列或与SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列有至少60％同一性的序列。SEQ ID NO:1表示Ole T JE蛋白的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，本发明方法中使用的Ole T JE酶是包含如SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列的Ole T JE蛋白。在另一个优选的实施方案中，本发明方法中使用的Ole T JE酶是这样的酶，所述酶在结构上与Ole T JE蛋白相关并且也显示能够借助氧化脱羧将3-甲基丁酸转化成异丁烯的特性。如本文所用，术语“结构上相关的”意指与SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列显示至少60％序列同一性的酶的氨基酸序列。优选地，序列同一性为与SEQ IDNO:1至少70％、更优选地至少80％、85％或90％、甚至更优选地91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和特别优选至少99％。

Ole T JE蛋白的结构/功能分析已经显示，SEQ ID NO:1的位置85中的残基可在Ole T JE蛋白的脱羧活性中发挥作用。在一个优选的实施方案中，本发明方法中使用的酶是具有下述氨基酸序列的酶，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列有至少60％同一性并且其中与SEQ ID NO:1的位置85相对应的氨基酸残基不是谷氨酰胺。在另一个优选的实施方案中，本发明方法中使用的酶是具有下述氨基酸序列的酶，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列有至少60％同一性并且其中与SEQ ID NO:1的位置85相对应的氨基酸残基不是组氨酸。

就测定序列同一性而言，以下应当适用：当比较的序列不具有相同的长度时，同一性程度指较短序列中与较长序列内氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数或指较长序列中与较短序列内氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数。优选地，它指较短序列中与较长序列内氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数。可以根据本领域熟知的方法，优选地使用合适的计算机算法(如CLUSTAL)确定序列同一性程度。

当使用Clustal分析方法来确定特定序列是否与参考序列例如至少60％同一性时，对于氨基酸序列的比较，可以使用默认设置或者设置优选如下：矩阵：blosum 30；开放空位罚分：10.0；延伸空位罚分：0.05；延迟发散(Delay divergent)：40；空位分隔距离：8。对于核苷酸序列比较，延伸空位罚分优选地设置至5.0。

在一个优选实施方案中，ClustalW2是用于氨基酸序列的比较。在配对比较/比对的情况下，优选地选择以下设置：蛋白质权重矩阵：BLOSUM62；空位开放：10；空位延伸：0.1。在多重比较/比对的情况下，优选地选择以下设置：蛋白质权重矩阵：BLOSUM 62；空位开放：10；空位延伸：2；空位距离：5；无末端空位。

优选地，在序列的整个长度范围内计算同一性的程度。

可以由技术人员通过本领域已知的方法鉴定位于与SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列中如下文所示的位置相对应的位置处的氨基酸残基。例如，可以通过将所讨论的序列与SEQ ID NO:1中所示的序列比对并且通过鉴定与SEQ ID NO:1的上述位置对应的位置，鉴定这类氨基酸残基。比对可以用技术人员已知的手段和方法进行，例如通过使用已知的计算机算法如Lipman-Pearson方法(Science 227(1985),1435)或CLUSTAL算法。优选在这种比对中，将最大同源性分配给氨基酸序列中存在的保守氨基酸残基。

在一个优选实施方案中，ClustalW2用于氨基酸序列的比较。在配对比较/比对的情况下，优选地选择以下设置：蛋白质权重矩阵：BLOSUM 62；空位开放：10；空位延伸：0.1。在多重比较/比对的情况下，优选地选择以下设置：蛋白质权重矩阵：BLOSUM 62；空位开放：10；空位延伸：0.2；空位距离：5；无末端空位。

如上文(b)中提到，该酶显示借助氧化脱羧将3-甲基丁酸转化成异丁烯的活性。这种活性可以如所附实施例中所述那样测定。

在另一个实施方案中，通过利用来自溶酪巨球菌(Macrococcus caseolyticus)、优选地来自菌株JCSC5402的细胞色素P450脂肪酸脱羧酶，实现3-甲基丁酸转化成异丁烯。所述蛋白质的氨基酸序列在SEQ ID NO:2(Uniprot登录号：B9EBA0)中显示。当然，使用确切显示这种氨基酸的酶不是唯一可能。还可能使用包含下述序列的酶，所述序列与SEQ IDNO:2中所示的氨基酸序列有至少60％同一性。优选地，序列同一性是与SEQ ID NO:2至少70％、更优选地至少80％、85％或90％、甚至更优选地91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和特别优选至少99％，并且该酶具有将3-甲基丁酸转化成异丁烯的酶活性。就测定序列同一性而言，如上文已经阐述的相同内容适用。

在优选的实施方案中，通过利用与细胞色素P450还原酶组合的细胞色素P450，实现3-甲基丁酸转化成异丁烯。

还原酶可以与细胞色素P450直接融合或它可以作为独立的酶存在。

在一个优选的实施方案中，反应使用NADPH作为还原剂。在这种实施方案中，优选P450还原酶具有NADPH依赖性。一个例子和优选实施方案是来自红球菌属(Rhodococcus)(例如红球菌属物种NCIMB9784)的红球菌融合还原酶(RhFRED)结构域(Robert等人,J.Bacteriol.184(2002),3898-3908)。结合细胞色素P450酶使用或与细胞色素P450酶融合时，所得到的CYP450融合酶的催化活性可以受NADPH驱动。

在又一个优选的实施方案中，反应利用黄素蛋白/黄素氧还蛋白还原酶作为氧化还原介体蛋白。图11b中显示相应的反应方案。例子是来自大肠杆菌的黄素氧还蛋白(Fld)和黄素氧还蛋白还原酶(FdR)(Liu等人,Biotechnology for Biofuels 7(2014),28)。

在另一个优选的实施方案中，反应利用铁氧还蛋白/铁氧还蛋白还原酶作为氧化还原配偶体。

根据另一个可能性，可以优选地通过利用非血红素铁加氧酶，实现3-甲基丁酸酶促转化成异丁烯。已经报道非血红素铁加氧酶能够催化Cn羧酸氧化脱羧成相应的Cn-1末端烯。Rui等人描述借助几个假单胞菌属物种中发现的非血红素铁加氧酶的生物合成中等链1-烯(Rui等人,“Microbial biosynthesis of medium-chain 1-alkenes by non-hemeoxidase”；Proc.Natl.Acad.Sci.,2014年12月8日先于印刷版发表；doi:10.1073/pnas.1419701112)。这些非血红素铁加氧酶的X射线结构显示了具有配位三联体His/His/Glu的常见非血红素铁加氧酶活性部位。已经显示这些非血红素铁加氧酶催化以下反应：

Rui等人描述，所描述的非血红素铁加氧酶对C10至C14的Cn羧酸链长度具有特异性。然而，在本发明的上下文中，能够催化Cn羧酸氧化脱羧成相应的Cn-1末端烯的这些非血红素铁加氧酶可以用来催化根据本发明将3-甲基丁酸转化成异丁烯。

因此，在优选的实施方案中，通过利用来自假单胞菌属物种、优选地来自铜绿假单胞菌、更优选地铜绿假单胞菌菌株UCBPP-PA14、丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonassyringae pv.tomato)、更优选地丁香假单胞菌番茄致病变种菌株DC3000和恶臭假单胞菌、更优选地恶臭假单胞菌菌株F1的能够催化Cn羧酸氧化脱羧成相应的Cn-1末端烯的非血红素铁加氧酶，实现3-甲基丁酸转化成异丁烯。所述蛋白质的氨基酸序列分别在SEQ ID NO:5至7中显示。

当然，使用确切显示这些氨基酸序列SEQ ID NO:5至7中任一者的酶不是唯一可能。还可能使用包含下述序列的酶，所述序列与SEQ ID NO:5至7中所示的任一氨基酸序列有至少60％同一性。优选地，序列同一性是与SEQ ID NO:5至7中任一者至少70％、更优选地至少80％、85％或90％、甚至更优选地91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和特别优选至少99％，并且该酶具有将3-甲基丁酸转化成异丁烯的酶活性。就测定序列同一性而言，如上文已经阐述的相同内容适用。

根据本发明方法转化成3-甲基丁酸的3-甲基巴豆酰-CoA本身可以通过酶促反应(例如3-甲基戊烯二酰-CoA借助脱羧转化成3-甲基巴豆酰-CoA)提供。图12中示意性显示该反应。它可以由不同的酶催化。在一个优选的实施方案中，3-甲基戊烯二酰-CoA借助脱羧转化成3-甲基巴豆酰-CoA由甲基巴豆酰-CoA羧化酶(EC 6.4.1.4)催化。已经描述甲基巴豆酰-CoA羧化酶催化以下反应：

，即羧化，但是它们可以用来催化脱羧反应。甲基巴豆酰-CoA羧化酶存在于多种生物中，包括真核生物和原核生物，如植物、动物、真菌和细菌。例如已经在胡萝卜(Daucuscarota)、大豆(Glycine max)、大麦(Hordeum vulgare)、豌豆、番茄、马铃薯、玉蜀黍、拟南芥属物种、兵豆(Lens culinaris)、智人、欧洲牛、褐家鼠、小家鼠、真鲷(Pagrus major)、构巢裸胞壳(Emericella nidulans)、铜绿假单胞菌、香茅醇假单胞菌(Pseudomonascitronellolis)、发酵氨基酸球菌、大肠杆菌、分枝杆菌物种和无色杆菌属物种(Achromobacter sp.)中描述该酶。

在一个优选的实施方案中，3-甲基戊烯二酰-CoA借助脱羧转化成3-甲基巴豆酰-CoA由香叶酰-CoA羧化酶(EC 6.4.1.5)催化。香叶酰-CoA羧化酶天然地催化以下反应：

该酶存在于真核生物和原核生物如植物和细菌中。例如已经在胡萝卜、大豆、玉蜀黍、假单胞菌属物种，铜绿假单胞菌、香茅醇假单胞菌和曼多辛假单胞菌(Pseudomonasmendocina)中描述该酶。

在一个优选的实施方案中，3-甲基戊烯二酰-CoA借助脱羧转化成3-甲基巴豆酰-CoA由3-甲基戊烯二酰-CoA脱羧酶(例如liuB基因编码的黄色粘球菌(Myxococcusxanthus)的3-甲基戊烯二酰-CoA脱羧酶)催化。这个基因编码具有两个亚基AibA和AibB的酶(Li等人,Angew.Chem.Int.Ed.52(2013),1304-1308)。

因此，本发明还涉及一种从3-甲基戊烯二酰-CoA产生异丁烯的方法，其中3-甲基戊烯二酰-CoA首先通过脱羧反应转化成3-甲基巴豆酰-CoA，后者随后如本文上述那样进一步酶促转化成3-甲基丁酸，所述3-甲基丁酸随后进一步转化成异丁烯。

待转化成3-甲基巴豆酰-CoA的3-甲基戊烯二酰-CoA本身可以由天然存在的酶促反应提供，这涉及3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA转化成3-甲基戊烯二酰-CoA并且例如由分类为3-甲基戊烯二酰-辅酶A水合酶(EC 4.2.1.18)的酶催化。图13中示意性显示该反应。3-甲基戊烯二酰-辅酶A水合酶是催化以下反应的酶：

这种酶存在于多种生物中，包括真核生物和原核生物，如植物、动物和细菌。例如已经在普长春花(Catharantus roseus)、智人、欧洲牛、绵羊、不动杆菌属物种和恶臭假单胞菌中描述该酶。

也可以例如通过利用已经例如在黄色粘球菌中鉴定并由liuC基因编码的3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A脱水酶活性，实现3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA转化成3-甲基戊烯二酰-CoA(Li等人,Angew.Chem.Int.Ed.52(2013),1304-1308)。

因此，本发明还涉及一种从3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA产生异丁烯的方法，其中3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA首先转化成3-甲基戊烯二酰-CoA，后者随后通过脱羧反应转化为3－甲基巴豆酰－CoA，其然后如本文上述那样进一步酶促转化成3-甲基丁酸和异丁烯。

转化成3-甲基戊烯二酰-CoA的3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA本身可以酶促提供，例如通过乙酰-CoA和乙酰乙酰-CoA缩合，所述反应由酶3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA合酶(也称作HMG-CoA合酶)天然催化。HMG-CoA合酶按EC 2.3.3.10分类(以前，HMG-CoA合酶已经分类为EC 4.1.3.5，但已经转移至EC 2.3.3.10)。术语“HMG-CoA合酶”指能够催化其中乙酰-CoA与乙酰乙酰-CoA缩合以形成3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA(HMG-CoA)的反应的任何酶(参见图14)。HMG-CoA合酶是甲羟戊酸途径的部分。已经鉴定到合成异戊烯基焦磷酸(IPP)的两条途径，即甲羟戊酸途径和甘油醛3-磷酸-丙酮酸途径。HMG-CoA合酶催化乙酰-CoA与乙酰乙酰-CoA的生物Claisen缩合并且是包括β-酮硫解酶、脂肪酸合酶(β-酮酰载体蛋白合酶)和聚酮化合物合酶的酰基缩合酶超家族的成员。

已经描述各种生物的HMG-CoA合酶。来自众多来源的HMG-CoA合酶的氨基酸序列和及编码这些酶的核酸序列也是可获得的。通常，这些序列仅共有低程度的总体序列同一性。例如，来自葡萄球菌或链球菌的酶仅与人和鸟类HMG-CoA合酶显示约20％同一性。在某些来源中，据报道，细菌HMG-CoA合酶及其动物对应物仅显示约10％的总体序列同一性(Sutherlin等人,J.Bacteriol.184(2002),4065-4070)。然而，涉及乙酰化反应和缩合反应的氨基酸残基在细菌HMG-CoA合酶和真核HMG-CoA合酶之间保守(Campobasso等人,J.Biol.Chem.279(2004),44883-44888)。已经测定三种HMG-CoA合酶的三维结构并且对酶促反应至关重要的氨基酸原则上充分表征(Campobasso等人,参见上述引文；Chun等人,J.Biol.Chem.275(2000),17946-17953；Nagegowda等人,Biochem.J.383(2004),517-527；Hegardt,Biochem.J.338(1999),569-582)。在真核生物中存在两种形式的HMG-CoA合酶，即胞质形式和线粒体形式。胞质形式在胆固醇和其他类异戊二烯的产生中发挥关键作用并且线粒体形式涉及酮体产生。

原则上，任何HMG-CoA合酶可以在本发明背景下使用，尤其来自原核或真核生物的那些酶。

描述了例如来自金黄色葡萄球菌(Campobasso等人，参见上述引文；Uniprot登录号Q9FD87)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)(Uniprot登录号Q9FD76)，溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)(Uniprot登录号Q9FD82)、粪肠球菌(Sutherlin等人，参见上述引文；Unirprot登录号Q9FD7)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)(Uniprot登录号Q9FD66)、肺炎链球菌(Uniprot登录号Q9FD56)、化脓性链球菌(Uniprot登录号Q9FD61)和嗜热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)(登录号AE000857)、伯氏包柔氏螺旋体(NCBI登录号BB0683)的原核HMG-CoA合酶。例如WO2011/032934中描述了其他HMG-CoA合酶。

因此，本发明还涉及一种从乙酰-CoA和乙酰乙酰-CoA产生异丁烯的方法，其中乙酰-CoA和乙酰乙酰-CoA首先如此缩合，从而形成3-羟基-3-甲基戊烯二酰-CoA，其中3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA随后转化成3-甲基戊烯二酰-CoA，后者随后借助脱羧反应转化成3-甲基巴豆酰-CoA，所述3-甲基巴豆酰-CoA随后进一步酶促转化成3-甲基丁酸，所述3-甲基丁酸随后如本文上述那样进一步转化成异丁烯。

在产生3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA中使用的乙酰乙酰-CoA本身可以由酶促反应提供。例如，乙酰乙酰-CoA可以从乙酰-CoA产生，例如，如WO2013/057194中所描述。因此，根据本发明，乙酰-CoA可以例如通过以下反应转化成乙酰乙酰-CoA：

这种反应由称作乙酰-CoAC-乙酰转移酶催化，该酶分类为EC 2.3.1.9。属于这个类别并催化上文所示的使两分子乙酰-CoA转化成乙酰乙酰-CoA和CoA的酶存在于全部生物界别中，即植物、动物、真菌、细菌等，并且已经在文献中广泛描述。已经对多种生物如智人、拟南芥、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和假丝酵母测定这类酶的核苷酸和/或氨基酸序列，这里仅提到一些例子。原则上，可以在本发明的背景下使用任何乙酰-CoA C-乙酰转移酶(EC2.3.1.9)。

备选地，也可以根据以下反应将乙酰-CoA和丙二酰-CoA酶促转化成乙酰乙酰-CoA，实现乙酰乙酰-CoA的提供。

乙酰-CoA+丙二酰-CoA→乙酰乙酰-CoA+CoA+CO₂

这种反应由称作乙酰乙酰-CoA合酶(EC 2.3.1.194)的酶催化。在土壤分离的革兰氏阳性链霉菌属物种菌株CL190中产生类萜的甲羟戊酸途径基因簇中鉴定到编码这种酶的基因(Okamur等人,PNAS USA 107(2010),11265-11270,2010)。另外，最近在大肠杆菌中开发了使用这种酶产生乙酰乙酰-CoA的生物合成途径是(Matsumoto K等人,Biosci.Biotechnol.Biochem,75(2011),364-366)。

因此，在优选的实施方案中，乙酰-CoA酶促转化成所述乙酰乙酰-CoA由单一酶促反应组成，所述反应中乙酰-CoA直接转化成乙酰乙酰-CoA。优选地，通过利用如上文所述的乙酰-CoA乙酰转移酶(EC 2.3.1.9)，实现乙酰-CoA酶促转化成乙酰乙酰-CoA。

备选地，也可以通过包括两个步骤的酶促转化提供乙酰乙酰-CoA，即；

(i)乙酰-CoA酶促转化成丙二酰-CoA；和

(ii)丙二酰-CoA和乙酰-CoA酶促转化成乙酰乙酰-CoA。

优选地，通过使用乙酰-CoA羧化酶(EC 6.4.1.2)，实现乙酰-CoA酶促转化成丙二酰-CoA。这种酶催化以下反应：

乙酰-CoA+ATP+CO₂→丙二酰-CoA+ADP

优选地，通过使用乙酰乙酰-CoA合酶(EC 2.3.1.194)，实现丙二酰-CoA和乙酰-CoA酶促转化成乙酰乙酰-CoA。原则上，可以在本发明的方法中应用任何乙酰-CoA乙酰转移酶(EC 2.3.1.9)、乙酰-CoA羧化酶(EC 6.4.1.2)和/或乙酰乙酰-CoA合酶(EC 2.3.1.194)。

图15示意性地显示从乙酰-CoA产生乙酰乙酰-CoA的可能方式。

因此，本发明还涉及一种从乙酰-CoA产生异丁烯的方法，其中乙酰乙酰-CoA从如上文所述的乙酰-CoA产生，其中如此产生的乙酰乙酰-CoA随后与乙酰-CoA缩合，从而形成3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA，其中3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA随后转化成3-甲基戊烯二酰-CoA，所述3-甲基戊烯二酰-CoA随后通过脱羧反应转化成3-甲基巴豆酰-CoA，后者随后如本文上述那样进一步酶促转化成3-甲基丁酸和异丁烯。

本发明的方法可以在体外或在体内实施。体外反应理解为其中不使用细胞的反应，即无细胞反应。因此，体外优选地意指在无细胞***中。在一个实施方案中，术语“在体外”意指在分离的酶(或酶***，任选地包含可能要求的辅因子)存在下。在一个实施方案中，该方法中所用的酶以纯化形式使用。

为了体外实施该方法，将反应的底物和酶在允许酶有活性并允许酶促转化发生的条件下(缓冲液、温度、协同底物、辅因子等)温育。允许该反应推进足以产生相应产物的时间。可以通过本领域已知的方法，如可能与质谱法检测连接的气相色谱，测量各自产物的产生。酶可以处于允许酶促反应发生的任何合适形式。它们可以是纯化或部分纯化的或处于细胞粗提物或部分纯化的提取物形式。酶还可能固定在合适的载体上。

在另一个实施方案中，本发明的方法在生物，优选微生物存在下以培养方式实施，所述生物产生对如上文所述的本发明转化方法所述的酶。利用微生物实施本发明方法的方法称作“体内”方法。可以使用天然产生上文对本发明转化方法所述的酶的微生物或已经过基因修饰从而它表达(包括过量表达)这类酶中一者或多者的微生物。因此，微生物可以是这样的工程化微生物，所述工程化微生物表达上述用于本发明方法转化的酶，即在其基因组中具有编码这类酶的核苷酸序列并且已经过修饰以过量表达它们。表达可以按组成型方式或按诱导或受调节的方式发生。

在另一个实施方案中，微生物可以是这样的微生物，所述微生物已经通过引入一个或多个核酸分子被基因修饰，所述核酸分子含有编码上述用于本发明方法转化的一种或多种酶的核苷酸序列。该核酸分子可以稳定地整合到该微生物的基因组中或可以按染色体外方式例如在质粒上存在。

这种基因修饰微生物可以是例如这样的微生物，所述微生物不天然地表达上述用于本发明方法转化的酶并且已经过基因修饰以表达这类酶，或所述微生物天然地表达这类酶并且已经过基因修饰，例如用核酸(例如编码相应酶的载体)转化和/或在编码该酶的内源核苷酸序列前方***启动子以增加所述微生物中的相应活性。

然而，本发明优选地排除如自然界中所存在那样的天然存在的微生物，所述微生物按照自然界中存在的水平表达如上文所述的酶。相反，本发明的和在本发明方法中使用的微生物优选地是非天然存在的微生物，无论它是否已经过基因修饰以表达(包括过量表达)正常情况下不存在于其基因组中的本发明外源酶或无论它是否已经过工程化以过量表达外源酶。

因此，本发明使用的酶和(微)生物优选地是非天然存在的酶或(微生物)，即它们是与天然存在的酶或微生物显著不同并且在自然界中不存在的酶或(微)生物。就这些酶而言，它们优选地是天然存在酶的变体，所述变体本身不存在于自然界中。这类变体例如包括突变体，尤其通过分子生物学方法制备的突变体，其显示改善的特性，如更高酶活性、更高底物专一性、更高耐温性等。就((微)生物而言，它们优选地是因基因修饰而不同于天然存在生物的如上文所述的基因修饰生物。基因修饰生物是不天然存在的，即，不能在自然界中存在并且因引入外来核酸分子而与天然存在生物明显不同的生物。

通过过量表达如上文所述的外源酶或内源酶，酶浓度大幅度高于自然界中存在的浓度，这随后可以出乎意料地迫使利用相应非天然酶的本发明反应进行。优选地，过量表达的酶的浓度是宿主细胞总蛋白的至少5％、10％、20％、30％或40％。

将“非天然”底物理解为这样的分子，所述分子在自然界中不受相应的酶作用，甚至它可以实际上与内源酶一起共存于微生物中。这种个“非天然”底物在自然界中不被微生物转化，因为其他底物是优选的(例如“天然底物”)。因此，本发明构思用上文描述的酶在自然界中不存在的环境下利用非天然底物。

因此，在本发明的上下文中，该微生物也可能是不天然具有相应酶活性，但经基因修饰从而包含允许相应酶表达的核苷酸序列的微生物。类似地，该微生物也可以是天然具有相应酶活性，但是经基因修饰从而增强这种酶活性(例如通过引入编码相应酶的外源核苷酸序列或通过引入针对编码该酶的内源性基因的启动子以增加内源产量至过量表达(非天然)水平)的微生物。

如果使用天然表达相应酶的微生物，可以如此修饰这种微生物，从而在微生物中过量表达相应的活性。可以例如通过以下方式实现这一点：在相应基因的启动子区中实施突变或引入高表达性启动子，从而导致确保基因的更高表达的启动子。备选地，还可能是基因如此突变，从而导致显示更高活性的酶。

通过使用表达上文对本发明转化方法所述的酶的微生物，可以在不需要分离或纯化酶的情况下，在培养基中直接实施本发明的方法。

在一个实施方案中，本发明方法中使用的生物是这样的微生物，所述微生物已经过基因修饰以含有编码上述用于本发明方法转化的至少一种酶的外来核酸分子。在这种语境下，术语“外来”或“外源”意指核酸分子不天然地存在于所述微生物中。这意味着它不出现在微生物中的相同结构内或在相同位置处。在一个优选的实施方案中，外来核酸分子是包含启动子和编码相应酶的编码序列的重组分子，其中驱动编码序列表达的启动子相对于编码序列是异源的。在这种语境下，“异源”意指该启动子不是天然驱动所述编码序列表达的启动子，而是天然驱动不同编码序列表达的启动子，即，它衍生自另一个基因，或是合成性启动子或嵌合启动子。优选地，启动子是微生物异源的启动子，即在相应的微生物中不天然存在的启动子。甚至更优选地，启动子是诱导型启动子。在不同类型的生物中、尤其在微生物中驱动表达的启动子是本领域技术人员熟知的。

在又一个实施方案中，核酸分子相对于微生物是外来的，在于编码的酶相对于微生物不是内源的，即当微生物未经基因修饰时不由该微生物天然表述。换句话说，编码的酶相对于微生物是异源的。外来核酸分子可以在微生物中以染色体外形式存在，例如作为质粒，或稳定整合在染色体中。优选稳定整合。因此，基因修饰可以例如在于整合编码酶的相应基因至染色体中，或在于从含有酶编码序列上游的启动子的质粒表达所述酶，所述启动子和编码序列优选地源自不同生物；或本领域技术人员已知的任何其他方法。

在本发明的上下文中，术语“微生物”指细菌，以及指真菌，如酵母，并且也指藻类和古细菌。在一个优选的实施方案中，微生物是细菌。原则上可以使用任何细菌。在本发明方法中待使用的优选细菌是芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、发酵单胞菌属(Zymomonas)或埃希氏菌属(Escherichia)的细菌。在一个特别优选的实施方案中，细菌属于埃希氏菌属并且甚至更优选地属于大肠杆菌种。在另一个优选实施方案中，细菌属于恶臭假单胞菌物种，或属于运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)物种，或属于谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)物种或属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)物种。

还可能使用极端嗜热性细菌如嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)或来自梭菌科(Clostridiae)的厌氧细菌。

在另一个优选实施方案中，微生物是真菌，更优选地是的酵母属、裂殖酵母属(Schizosaccharomyce)、曲霉属(Aspergillus)或木霉属(Trichoderma)、克鲁维酵母属或毕赤酵母属的真菌，并且甚至更优选地是以下物种：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、黑曲霉(Aspergillusniger)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、Pichia torula或Pichia utilis。

在另一个实施方案中，本发明的方法利用光合微生物，所述光合微生物表达至少一种用于如上文所述的本发明转化的酶。优选地，微生物是光合细菌或微藻。在又一个实施方案中，微生物是藻类，更优选地属于硅藻类的藻类。

还可构思在本发明方法中使用微生物的组合，其中不同微生物表达如上文所述的不同酶。下文还将进一步详细描述为表达目的酶对微生物的基因修饰。

在另一个实施方案中，本发明的方法包括步骤：提供生物，优选地携带相应酶活性或(细胞)培养物形式、优选液态细胞培养物形式的微生物，后续步骤是在发酵罐(经常也称作生物反应器)中允许相应酶表达的合适条件下培育所述生物，优选地微生物，并且还包括步骤：实现如本文上述的本发明方法的酶促转化。合适的发酵罐或生物反应器装置和发酵条件是本领域技术人员已知的。生物反应器或发酵罐指支持生物学活性环境的本领域已知的任何制造或工程化装置或***。因此，生物反应器或发酵罐可以是其中实施化学/生物化学过程(如本发明方法)的容器，所述化学/生物化学过程涉及生物、优选地微生物和/或生物化学活性物质，即，从携带上述酶的这类生物或生物衍生的上述酶。在生物反应器或发酵罐中，这种过程可以是需氧的或厌氧的。这些生物反应器常见是圆柱状，并且可以具有从数升至若干立方米的一系列尺寸，并经常由不锈钢制成。在这个方面，不受理论约束，发酵罐或生物反应器可以按照这样的方式设计，从而它适合以分批培养、补料分批培养、灌注培养或恒化培养培养生物，优选地微生物，全部培养方法通常均是本领域已知的。

培养基可以是适于培养相应生物或微生物的任何培养基。

在一个优选实施方案中，本发明的方法还包括步骤：回收通过该方法产生的异丁烯。例如，如果本发明的方法通过发酵表达必需酶的相应微生物在体内实施，则可以通过本领域技术人员已知的方法从发酵废气回收异丁烯。

本发明方法中使用的酶可以是天然存在的酶或是这样的酶，所述酶可以(例如通过引入例如改变或改善酶活性、稳定性等的突变或其他改变)从天然存在的酶衍生。

用于修饰和/或改善蛋白质的所需酶活性的方法是本领域技术人员熟知的并且包括，例如随机诱变或位点定向诱变并随后选择具有所需特性的酶，或所谓“定向进化”方案。

例如，对于原核细胞中的基因修饰，可以将编码相应酶的核酸分子引入质粒，所述质粒允许通过DNA序列重组诱变或序列修饰。标准方法(见Sambrook和Russell(2001),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,CSH Press,Cold Spring Harbor,NY,USA)允许进行碱基交换或添加天然或合成序列。可以通过使用与片段互补的衔接头和接头连接DNA片段。另外，可以使用提供合适限制性位点或除去多余DNA或限制性位点的工程化措施。在其中可能***，缺失或置换的那些些情况下，可以使用体外诱变、“引物修复”、限制作用或连接。通常而言，实施序列分析、限制分析和其他生物化学和分子生物学方法作为分析方法。随后用如上文所述的测定法，对所产生的酶变体测试所需的活性，例如，酶活性，并且特别是它们增加的酶活性。

如上文所述，本发明方法中所用或本发明组合物中所含的微生物可以是已经通过引入编码相应酶的核酸分子进行基因修饰的微生物。因此，在优选的实施方案中，微生物是这样的重组微生物，所述重组微生物已经过基因修饰以具有上述用于本发明方法转化的至少一种酶的增加的活性。这可以例如通过用编码相应酶的核酸转化该微生物来实现。下文将进一步详细描述对微生物的基因修饰。优选地，引入微生物中的核酸分子是相对于微生物是异源的核酸分子，即，它不天然地存在于所述微生物中。

在本发明的上下文中，“增加的活性”意指基因修饰的微生物中酶的表达和/或活性比相应未修饰的微生物中高至少10％、优选地至少20％、更优选地至少30％或50％、甚至更优选地至少70％或80％并且特别优选至少90％或100％。在甚至更优选的实施方案中，表达和/或活性的增加可以是至少150％、至少200％或至少500％。在特别优选的实施方案中，表达比相应未修饰的微生物中高至少10倍、更优选地至少100倍和甚至更优选至少1000倍。

术语“增加的”表达/活性也涵盖如下情况，其中相应未修饰的微生物不表达相应的酶，从而未修饰的微生物中的相应表达/活性是零。优选地，过量表达的酶的浓度是总宿主细胞蛋白的至少5％、10％、20％、30％或40％。

用于测量细胞中给定蛋白质的表达水平的方法是本领域技术人员熟知的。在一个实施方案中，通过测量相应蛋白质的量进行表达水平的测量。相应方法是本领域技术人员熟知的并且包括蛋白质印迹法、ELISA等。在另一个实施方案中，通过测量相应RNA的量进行表达水平的测量。相应方法是本领域技术人员熟知的并且包括例如RNA印迹。

在本发明的上下文中，术语“重组”意指微生物经基因修饰，从而与野生型或未修饰的微生物相比，含有编码如上文定义的酶的核酸分子。编码如上文定义的酶的核酸分子可以单独使用或作为载体的部分使用。

所述核酸分子还可以包含与包含于该核酸分子中的多核苷酸有效连接的表达控制序列。如本说明书自始至终使用，术语“有效连接的”或“有效连接”指在一个或多个表达控制序列和待表达的多核苷酸中编码区之间以如此方式连接，从而在与表达控制序列相容的条件下实现表达。

表达包括异源DNA序列的转录，优选地，转录成可翻译的mRNA。确保在真菌中以及在细菌中表达的调节元件是本领域技术人员熟知的。它们涵盖启动子、增强子、终止信号、靶向信号等。在下文与相关载体相联系解释时进一步给出实例。

相对于其来源和/或相对于待表达的基因，关于核酸分子使用的启动子可以是同源或异源的。合适的启动子是例如自身导致组成型表达的启动子。然而，也可以使用仅在由外部影响所决定的时间点激活的启动子。在这种情况下，可以使用人工和/或化学诱导型启动子。

所述载体还可以包含与包含于该载体中的所述多核苷酸有效连接的表达控制序列。这些表达控制序列可以适用于确保可翻译性RNA在细菌或真菌中的转录和合成。

此外，可以通过分子生物学中常规的方法将不同突变***多核苷酸(见例如Sambrook和Russell(2001),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,CSH Press,ColdSpring Harbor,NY,USA)，导致合成可能具有修饰的生物学特性的多肽。可构思在氨基酸序列修饰例如影响多肽生物学活性或其调节作用的位置引入点突变。

另外，可以制备拥有修饰的底物或产物特异性的突变体。优选地，这类突变体显示增加的活性。备选地，可以制备在不丧失底物结合活性的情况下消除其催化活性的突变体。

另外，将突变引入编码如上文定义的酶的多核苷酸中允许增加或减少所述多核苷酸编码的酶的基因表达速率和/或活性。

为了遗传地修饰细菌或真菌，可以将编码如上文定义的酶的多核苷酸或这些分子的部分引入质粒中，所述质粒允许通过DNA序列重组诱变或序列修饰。标准方法(见Sambrook和Russell(2001),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,CSH Press,ColdSpring Harbor,NY,USA)允许进行碱基交换或添加天然或合成序列。可以通过使用针对片段的衔接头和接头连接DNA片段。另外，可以使用提供合适限制性位点或除去多余DNA或限制性位点的工程化措施。在其中可能***，缺失或置换的那些情况下，可以使用体外诱变、“引物修复”、限制作用或连接。通常而言，实施序列分析、限制分析和其他生物化学和分子生物学方法作为分析方法。

因而，根据本发明，重组微生物可以通过遗传修饰真菌或细菌来产生，包括将上述多核苷酸、核酸分子或载体引入真菌或细菌中。

表达编码相应酶的多核苷酸，从而以导致具有上文描述的任一种活性的多肽产生。不同表达***的综述例如含于Methods in Enzymology 153(1987),385-516中，Bitter等人(Methods in Enzymology153(1987)，516-544)并含于Sawers等人,(AppliedMicrobiology and Biotechnology 46(1996),1-9)、Billman-Jacobe(Current Opinionin Biotechnology 7(1996),500-4)、Hockney(Trends in Biotechnology 12(1994),456-463)、Griffiths等人,(Methods in Molecular Biology 75(1997),427-440)中。酵母表达***的综述例如由Hensing等人(Antonie van Leuwenhoek 67(1995),261-279),Bussineau等人(Developments in Biological Standardization 83(1994),13-19)、Gellissen等人(Antonie van Leuwenhoek 62(1992),79-93)、Fleer(Current Opinion inBiotechnology 3(1992),486-496)、Vedvick(Current Opinion in Biotechnology 2(1991),742-745)和Buckholz(Bio/Technology 9(1991),1067-1072)给出。

已经在文献中广泛描述表达载体。通常，它们不仅含有选择标记基因和确保在选择的宿主中复制的复制起点，还含有细菌启动子或病毒启动子，和在大多数情况下转录终止信号。在启动子和终止信号之间通常存至少一个使得***编码性DNA序列成为可能的限制性位点或多接头。如果在选择的宿主生物中有活性，则天然控制相应基因的转录的DNA序列可以用作启动子序列。然而，这种序列也可以交换为其他启动子序列。可以使用确保基因组成型表达的启动子和允许人为控制基因表达的诱导型启动子。文献中详述了拥有这些特性的细菌启动子和病毒启动子序列。文献中充分描述了用于微生物(例如大肠杆菌、酿酒酵母)中表达的调节序列。允许特别高地表达下游序列的启动子例如是T7启动子(Studier等人,Methods in Enzymology 185(1990),60-89)、lacUV5、trp、trp-lacUV5(DeBoer等人,引自Rodriguez和Chamberlin(编著),Promoters,Structure and Function；Praeger,NewYork,(1982),462-481；DeBoer等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983),21-25)、lp1、rac(Boros等人,Gene 42(1986),97-100)。诱导型启动子优选地用于多肽的合成。这些启动子经常导致比组成型启动子更高的多肽产量。为了获得最佳多肽量，经常使用一种两阶段方法。首先，将宿主细胞在最佳条件下培养直至相对高的细胞密度。在第二步骤中，根据使用的启动子的类型诱导转录。在这个方面，tac启动子是特别合适的，所述tac启动子可以由乳糖或IPTG(＝异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)诱导(deBoer等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80(1983),21-25)。文献中也描述了转录的终止信号。

可以通过例如Sambrook和Russell(2001),Molecular Cloning:A LaboratoryManual,CSH Press,Cold Spring Harbor,NY,USA；Methods in Yeast Genetics,ALaboratory Course Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1990中描述的标准方法，用如上所述的多核苷酸或载体实施宿主细胞的转化。宿主细胞在满足所用具体宿主细胞要求(尤其在pH值、温度、盐浓度、通气、抗生素、维生素、微量元素等方面)的营养培养基中培养。

本发明另外涉及

-磷酸丁酰转移酶(EC 2.3.1.19)或表达磷酸丁酰转移酶(EC 2.3.1.19)的生物；或

-磷酸乙酰转移酶(EC 2.3.1.8)或表达磷酸乙酰转移酶(EC 2.3.1.8)的生物

用于3-甲基巴豆酰-CoA酶促转化成磷酸3-甲基巴豆酰酯的用途。

本发明另外涉及磷酸转移酶(EC 2.7.2)例如丁酸激酶(EC 2.7.2.7)、分枝链脂肪酸激酶(EC 2.7.2.14)、丙酸激酶(EC 2.7.2.15)和/或乙酸激酶(EC2.7.2.1)，或表达这类酶的微生物用于3-甲基巴豆酰-CoA酶促转化成磷酸3-甲基巴豆酰酯的用途。

本发明还涉及包含以下的组合：

-磷酸丁酰转移酶(EC 2.3.1.19)和/或磷酸乙酰转移酶(EC 2.3.1.8)；和

-磷酸转移酶(EC 2.7.2)，例如丁酸激酶(EC 2.7.2.7)，分枝链脂肪酸激酶(EC2.7.2.14)、丙酸激酶(EC 2.7.2.15)和/或乙酸激酶(EC 2.7.2.1)，

或表达这种酶组合的微生物用于3-甲基巴豆酰-CoA转化成3-甲基巴豆酸的用途。

另外，本发明涉及包含以下的组合：

-磷酸转移酶(EC 2.7.2)，例如丁酸激酶(EC 2.7.2.7)，分枝链脂肪酸激酶(EC2.7.2.14)、丙酸激酶(EC 2.7.2.15)和/或乙酸激酶(EC 2.7.2.1)；和

-2-烯酸还原酶(EC 1.3.1.31)

或表达这种酶组合的微生物，用于3-甲基巴豆酰-CoA转化成3-甲基丁酸的用途。

另外，本发明涉及包含以下的组合：

-2-烯酸还原酶(EC 1.3.1.31)；和

-细胞色素P450或非血红素铁加氧酶

或表达这种酶组合的微生物，用于3-甲基巴豆酰-CoA转化成异丁烯的用途。

本发明还涉及硫酯酶(EC 3.1.2)和/或CoA-转移酶(EC 2.8.3)或表达这种酶的微生物用于3-甲基巴豆酰-CoA转化成3-甲基巴豆酸的用途。

本发明还涉及包含以下的组合：

-硫酯酶(EC 3.1.2)和/或CoA-转移酶(EC 2.8.3)；和

-2-烯酸还原酶(EC 1.3.1.31)

另外，本发明涉及包含以下的组合：

-硫酯酶(EC 3.1.2)和/或CoA-转移酶(EC 2.8.3)；和

-2-烯酸还原酶(EC 1.3.1.31)；和

-细胞色素P450或非血红素铁加氧酶

本发明还涉及包含以下的组合：

(i)分类为EC 1.3._._的酶；和

(ii1)磷酸丁酰转移酶(EC 2.3.1.19)和/或磷酸乙酰转移酶(EC 2.3.1.8)；和

磷酸转移酶(EC 2.7.2)，例如丁酸激酶(EC 2.7.2.7)、分枝链脂肪酸激酶(EC2.7.2.14)、丙酸激酶(EC 2.7.2.15)和/或乙酸激酶(EC 2.7.2.1)；或

(ii2)硫酯酶(EC 3.1.2)；或

(ii3)CoA-转移酶(EC 2.8.3)

本发明还涉及包含以下的组合：

(i)分类为EC 1.3._._的酶；和

(ii2)硫酯酶(EC 3.1.2)；或

(ii3)CoA-转移酶(EC 2.8.3)

和

(iii)细胞色素P450或非血红素铁加氧酶

本发明还涉及与本发明用途相关的表达如本文上述的酶组合的微生物。

就上文用途中提到的酶和微生物而言，上面关于根据本发明的方法所阐述的同样适用。

图1示意性显示通过利用分类为EC 1.3.1._的使用NADPH作为辅因子的酶将3-甲基巴豆酰-CoA转化成3-甲基丁酰-CoA的反应。

图2示意性显示通过利用分类为EC 1.3.1._的使用NADH作为辅因子的酶将3-甲基巴豆酰-CoA转化成3-甲基丁酰-CoA的反应。

图3示意性显示通过利用分类为EC 1.3.8._的使用FADH作为辅因子的酶将3-甲基巴豆酰-CoA转化成3-甲基丁酰-CoA的反应。

图4示意性显示由硫酯酶(EC 3.1.2)催化3-甲基丁酰-CoA转化成3-甲基丁酸。

图5示意性显示由CoA-转移酶(EC 2.8.3)催化3-甲基丁酰-CoA转化成3-甲基丁酸。

图6示意性显示3-甲基丁酰-CoA转化成磷酸3-甲基丁酰酯及磷酸3-甲基丁酰酯随后转化成3-甲基丁酸。

图7示意性显示由硫酯酶(EC 3.1.2)催化3-甲基巴豆酰-CoA转化成3-甲基巴豆酸。

图8示意性显示由CoA-转移酶(EC 2.8.3)催化3-甲基巴豆酰-CoA转化成3-甲基巴豆酸。

图9示意性显示3-甲基巴豆酰-CoA转化成磷酸3-甲基巴豆酰酯和磷酸3-甲基巴豆酰酯随后转化成3-甲基巴豆酸。

图10示意性显示通过利用分类为2-烯酸还原酶(EC 1.3.1.31)的酶，使3-甲基巴豆酸转化成3-甲基丁酸。

图11a示意性显示3-甲基丁酸转化成异丁烯。

图11b示意性显示利用NADPH作为还原剂和利用黄素氧还蛋白/黄素氧还蛋白还原酶作为氧化还原介体蛋白，将3-甲基丁酸转化成异丁烯。

图12显示借助脱羧反应使3-甲基戊烯二酰-CoA转化成3-甲基巴豆酰-CoA。

图13显示3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA转化成3-甲基戊烯二酰-CoA。

图14显示乙酰-CoA和乙酰乙酰-CoA缩合成3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA。

图15显示从乙酰-CoA产生乙酰乙酰-CoA的可能途径。

图16显示如实施例2中所概述，采用Jeotgalicoccus sp.(Uniprot登录号：E9NSU2)的细胞色素P450，对酶催化的异戊酸氧化脱羧获得的GC色谱图。

图17显示如实施例3中所概述，由表达Jeotgalicoccus sp.的细胞色素P450的大肠杆菌菌株和大肠杆菌对照菌株产生的异丁烯的色谱图。

图18显示如实施例4中所概述，采用溶酪巨球菌(Uniprot登录号：B9EBA0)的细胞色素P450时，对酶催化的异戊酸氧化脱羧过程获得的GC色谱图。

图19显示对采用恶臭假单胞菌的酰基-CoA硫酯酶II的酶测定法获得的典型HPLC-色谱图的例子。

图20a显示对a)酶促测定法(测定法A，实施例7)b)无酶促测定法(测定法H，实施例7)获得的典型HPLC-色谱图(分析3-甲基巴豆酰-CoA，3-甲基巴豆酸和CoA-SH)的叠加。

在磷酸丁酰转移酶与丁酸激酶组合的酶促测定法中观察到3-甲基巴豆酰-CoA的消耗，同时CoA-SH和3-甲基巴豆酸的产生。

图20b显示对a)酶促测定法(测定法A，实施例7)b)无酶促测定法(测定法H，实施例7)获得的典型HPLC-色谱图(分析ADP和ATP))的叠加。

在磷酸丁酰转移酶与丁酸激酶组合的酶促测定法中观察到ADP消耗，同时ATP产生。

图21显示酶促测定法中以及不同的对照测定法中产生3-甲基巴豆酸和ATP的结果，所述酶促测定法包含与不同丁酸激酶组合的来自枯草芽孢杆菌的磷酸丁酰转移酶。

图22显示酶促测定法中以及不同的对照测定法中产生3-甲基巴豆酸和ATP的结果，所述酶促测定法包含与不同丁酸激酶组合的来自粪肠球菌的磷酸丁酰转移酶。

在本说明书中，引用了包含专利申请的众多文件。这些文献的公开内容(尽管不认为与本发明可专利性相关)通过引用的方式完整并入本文。更具体地，参考的全部文献通过引用的方式以相同的程度并入，如同专门且个别地指出通过引用的方式并入每份单独的文献。

现在将参考以下实施例描述本发明，所述实施例仅是示意性的并且不得解释为限制本发明的范围。

实施例

一般方法和材料

除非另外说明，否则实验中所用的全部试剂和材料均从Sigma-Aldrich Company(St.Luis,MO)获得。适于培育细菌培养物及蛋白质表达的材料和方法是本领域熟知的。含有编码大肠杆菌黄素氧还蛋白还原酶的基因的载体pCAN(UniprotP0A6L0)购自NAIST(NaraInstitute of Science and Technology，日本，ASKA集团)。提供的载体在甲硫氨酸起始密码子后含有一段6组氨酸密码子。将如此克隆的黄素氧还蛋白还原酶在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中过量表达并且在允许吸附6-His标记的蛋白质的PROTINO-2000Ni-TED柱(Macherey-Nagel)上纯化。将含有目的酶的级分合并并且在Amicon Ultra-4 10kD过滤装置(Millipore)上浓缩。随后将黄素氧还蛋白还原酶重悬于含有100mM NaCl的100mM磷酸盐缓冲液pH7.0中，待用于后续酶促测定法中。在NanoDrop 1000分光光度计(ThermoScientific的)上依据UV 280nm直接测量，测定蛋白质浓度。

实施例1：重组细胞色素P450脂肪酸脱羧酶的克隆和表达

重组蛋白的基因合成、克隆和表达

通过寡核苷酸串联法产生了从原核生物基因组推断的所研究酶的序列，以符合大肠杆菌的密码子选择(基因由

商业合成)。将一段6组氨酸密码子在甲硫氨酸起始密码子后***以提供用于纯化的亲和标签。在pET-25b(+)表达载体(载体由

构建)中克隆如此合成的基因。

将BL21(DE3)感受态细胞(Novagen)根据标准热休克法用这些载体转化并且铺展到补充有适宜抗生素的LB琼脂平板上。单个转化体用来接种补充有0.5mM氨基酮戊酸的200ml ZYM-5052自诱导培养基(Studier FW,Prot.Exp.Pur.41,(2005),207-234)，以表达细胞色素P450。将培养物在振荡培养箱中于30℃温育6小时并且蛋白质表达在18℃持续过夜(大约16小时)。

通过在4℃，10,000转/分钟离心20分钟收集细胞并且在-80℃贮存沉淀物。

实施例2：来自Jeotgalicoccus sp.的细胞色素P450脂肪酸脱羧酶催化异戊酸在体外氧化脱羧成异丁烯

来自200ml培养细胞的沉淀物重悬于补充有20μl lysonase(Merck-Novagen)的50ml裂解缓冲液(100mM磷酸钾pH 7，100mM KCl)中。随后，将细胞悬液在室温温育10分钟，接着在冰上温育20分钟。在SDS-PAGE上使用凝胶光密度测定法估计总细胞裂解物中细胞色素P450脂肪酸脱羧酶的量。

在水中配制3-甲基丁酸(异戊酸)的0.5M母液并用10M NaOH溶液调节至pH 7.0。

在2ml玻璃小瓶(Interchim)中按以下条件建立酶促测定法：

100mM磷酸钾缓冲液pH 7.0

100mM NaCl

1mM NADPH

50mM异戊酸

0.2mg/ml来自大肠杆菌的纯化的黄素氧还蛋白还原酶

通过添加30μl含有来自Jeotgalicoccus sp.的重组P450脂肪酸脱羧酶(Uniprot登录号：E9NSU2；SEQ ID NO:1)的细胞裂解物(总体积300μl)，启动测定法。

平行地进行一系列对照测定法(表1)。

将小瓶密封并在30℃温育30分钟。通过在80℃温育1分钟，终止酶促反应，并且通过配备火焰离子化检测器(FID)的气相色谱(GC)分析反应顶空中存在的异丁烯。

对于GC顶空分析，使用在130℃的等温模式，将1m顶空气体隔离于配备GS-氧化铝柱(30m x 0.53mm)(Agilent)的Bruker GC-450***中。使用氮气作为载气，流速6ml/分钟。

通过与异丁烯标准品比较，鉴定酶促反应产物。在这些GC条件下，异丁烯的保留时间是2.23分钟。

在含有细胞色素P450脂肪酸脱羧酶和氧化还原配偶体的测定中观察到从异戊酸明显产生异丁烯(表1，图16)。

表1

实施例3：通过来自Jeotgalicoccus sp.的细胞色素P450脂肪酸脱羧酶催化的异戊酸在体内氧化脱羧成异丁烯

将BL21(DE3)感受态细胞(Novagen)用编码来自Jeotgalicoccus sp.ATCC8456的细胞色素P450脂肪酸脱羧酶的pET-25b(+)表达载体转化并且铺展到补充有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板上。

用空pET-25b(+)载体转化的BL21(DE3)菌株作为阴性对照用于后续测定法中(对照菌株)。将平板在30℃温育过夜。单个转化体用来接种补充有氨苄青霉素的LB培养基，随后在30℃温育过夜。1ml这种过夜培养物用来接种300ml补充有0.5mM氨基酮戊酸的ZYM-5052自诱导培养基(Studier FW(2005)，当地应用)。将培养物在30℃和160转/分钟振摇下培育20小时。

取出和离心一定体积的与30的OD₆₀₀相对应的培养物。将沉淀物重悬于30ml含有葡萄糖(45g/L)和MgSO₄(1mM)并补充有50mM异戊酸的MS培养基(Richaud C.,Mengin-Leucreulx D.,Pochet S.,Johnson EJ.,Cohen GN.and Marlière P,The Journal ofBiological Chemistry,268,(1993),26827-26835)中。随后将这些培养物在螺旋帽密封的160ml瓶中在30℃振摇下温育22小时。在8小时温育后，通过使用30％NH₄OH调节培养物的pH值至8.5。

在温育时间后，通过配备火焰离子化检测器(FID)的气相色谱(GC)分析反应顶空中产生的异丁烯。根据实施例2中描述的方法分离和分析1ml顶空气相。

图17显示某些量的异丁烯随对照菌株产生，这可能归因于异戊酸自发分解。从异丁烯峰面积判断，由表达P450脂肪酸脱羧酶的大肠杆菌菌株产生的异丁烯相对于对照菌株产生的异丁烯的比率是约2.2倍(图17)。这些结果清晰地显示，可以通过表达来自Jeotgalicoccus sp.ATCC8456的细胞色素P450脂肪酸脱羧酶的大肠杆菌菌株在体内实现从异戊酸产生异丁烯。

实施例4：来自溶酪巨球菌的细胞色素P450脂肪酸脱羧酶催化的异戊酸在体外氧化脱羧成异丁烯

在2ml玻璃小瓶(Interchim)中按以下条件建立酶促测定法：

100mM磷酸钾缓冲液pH 7.0

100mM NaCl

2mM NADPH

50mM异戊酸

0.2mg/ml来自大肠杆菌的纯化的黄素氧还蛋白还原酶

通过添加100μl含有来自溶酪巨球菌的重组P450脂肪酸脱羧酶的细胞裂解物(总体积300μl)，启动测定法。

平行地进行一系列对照测定法(表2)。

将小瓶密封并在30℃温育60分钟。通过在80℃温育1分钟，终止测定法，并且通过配备火焰离子化检测器(FID)的气相色谱(GC)分析反应顶空中存在的异丁烯。

对于GC顶空分析，使用在130℃的等温模式，将1ml顶空气体隔离于配备GS-氧化铝柱(30m x 0.53mm)(Agilent)的Bruker GC-450***中。使用氮气作为载气，流速6ml/分钟。

通过与异丁烯标准品比较，鉴定酶促反应产物。在这些GC条件下，异丁烯的保留时间是2.45分钟。

在含有细胞色素P450脂肪酸脱羧酶和氧化还原配偶体的测定法中观察到从异戊酸明显产生异丁烯(表2，图18)。

表2

实施例5：重组磷酸丁酰转移酶和丁酸激酶的克隆和过量表达

重组蛋白的基因合成、克隆和表达

通过寡核苷酸串联法产生了来自枯草芽孢杆菌(菌株168)和粪肠球菌MTUP9(Uniprot登录号分别是P54530和A0A038BNC2)的磷酸丁酰转移酶基因和来自干酪乳杆菌W56和地芽孢杆菌属物种GHH01(Uniprot登录号分别是K0N529和L8A0E1)的丁酸激酶基因的序列，以符合大肠杆菌的密码子选择(基因由

商业合成)。遵循实施例1中描述的方法实施相应蛋白质的表达。通过在4℃，10,000转/分钟离心20分钟收集细胞并且在-80℃贮存沉淀物。

蛋白质纯化和浓缩

在冰上解冻来自200ml培养细胞的沉淀物并且令其重悬于5ml含有100mM NaCl、10mM MgCl₂、10mM咪唑和1mM DTT的50mM磷酸钾缓冲液pH 7.5中。添加20微升lysonase(Novagen)。将细胞在室温孵育10分钟并且随后返回冰上20分钟。通过超声波处理2x 30秒完成细胞裂解。随后通过在4℃，4000转/分钟离心40分钟，澄清细菌提取物。将澄清的细菌裂解物加载于允许吸附6-His标记的蛋白质的PROTINO-2000Ni-TED柱(Macherey-Nagel)上。将柱洗涤并且将目的酶用6ml含有100mM NaCl和250mM咪唑的50mM磷酸钾缓冲液pH 7.5洗脱。将洗脱物随后在Amicon Ultra-4 10kDa滤器装置(Millipore)上浓缩，脱盐，并且将酶重悬于含有100mM NaCl的50mM磷酸钾缓冲液pH 7.5中。如此纯化的蛋白质的纯度从70％至90％变动，如通过SDS-PAGE分析所估计。在NanoDrop 1000分光光度计(ThermoScientific的)上依据UV 280nm直接测量或通过Bradford测定法(BioRad)，测定蛋白质浓度。

实施例6：酶催化的3-甲基巴豆酰-CoA水解成3-甲基巴豆酸和游离辅酶-A

根据如实施例1中所述的程序合成编码恶臭假单胞菌酰基-CoA硫酯酶II的基因。

含有编码大肠杆菌酰基-CoA硫酯酶2(TesB)的基因的载体pCA24N购自NAIST(NaraInstitute of Science and Technology，日本，ASKA集团)。提供的载体在甲硫氨酸起始密码子后含有一段6组氨酸密码子。

根据实施例1中描述的程序产生相应的酶。

酶促测定在0.2ml总反应体积中实施。

标准反应混合物含有：

50mM HEPES pH 7.0

10mM3-甲基巴豆酰-CoA(Sigma-Aldrich)

20mM MgCl₂

20mM NaCl

1mg/ml纯化的重组硫酯酶。

在不添加酶或不添加底物的情况下进行对照测定法。

将测定法在30℃摇动下温育30分钟，通过添加0.1ml乙腈终止反应，并且随后通过基于HPLC的程序分析样品。

对3-甲基巴豆酰-CoA消耗和3-甲基巴豆酸和游离辅酶A(CoA-SH)形成的基于HPLC的分析

使用配备柱加热模块和UV检测器(210nm)的1260Inifinity LC***(Agilent)，进行HPLC分析。在Zorbax SB-Aq柱(250x 4.6mm，5μm粒度，柱温30℃)上以1.5ml/分钟的流动相流速分离5μl样品。使用混合的A(含有8.4mM硫酸的H₂O)和B(乙睛)溶液以线性梯度(在初始时间0分钟0％B→在8分钟70％B)进行分离。使用商业3-甲基巴豆酰-CoA、3-甲基巴豆酸(Sigma-Aldrich)和CoA-SH(Sigma-Aldrich)作为参考。在这些条件下，游离辅酶A(CoA-SH)、3-甲基巴豆酰-CoA和3-甲基巴豆酸的保留时间分别是4.05、5.38和5.83分钟。

在对照测定法中未观察到3-甲基巴豆酸信号。

两种研究的硫酯酶催化3-甲基巴豆酰-CoA的水解，同时形成3-甲基巴豆酸。图19中显示用恶臭假单胞菌酰基-CoA硫酯酶II酶获得的色谱图的例子。

表3中显示如酶促测定法中观察到3-甲基巴豆酸的产生程度。

表3

实施例7：通过来自枯草芽孢杆菌的磷酸丁酰转移酶和来自干酪乳杆菌或地芽孢杆菌属物种的丁酸激酶的联合作用催化的3-甲基巴豆酰-CoA和ADP转化成3-甲基巴豆酸和ATP

在下文中描述的测定法中，使用以下酶：

表4

酶促测定在0.2ml总反应体积中实施。

标准反应混合物含有：

50mM磷酸钾缓冲液pH 7.5

4mM 3-甲基巴豆酰-CoA

4mM ADP

10mM MgCl₂

10mM NaCl

0.2mg/ml来自枯草芽孢杆菌的纯化的磷酸丁酰转移酶

0.2mg/ml来自干酪乳杆菌或地芽孢杆菌属物种的纯化的丁酸激酶

平行地进行一系列对照(如表5中所示的测定法C-H)。

表5

测定随后在30℃摇动下温育20分钟。

在温育期后，通过在90℃加热反应介质4分钟，终止反应。将样品离心，经0.22μm滤器过滤并且将澄清的上清液转移入一只清洁小瓶供进一步分析。使用基于HPLC的方法追踪ADP及3-甲基巴豆酰-CoA的消耗和ATP及3-甲基巴豆酸和游离辅酶A(CoA-SH)的形成。

对ADP和ATP的基于HPLC的分析

使用配备柱加热模块和RI检测器的1260Inifinity LC***(Agilent)，进行HPLC分析。在Polaris C18-A柱(150x 4.6mm，5μm粒度，柱温30℃)上以1.5ml/分钟的流动相流速分离2μl样品。通过HPLC追踪ADP的消耗和ATP的形成。

对ADP和ATP的基于HPLC的分析

使用配备柱加热模块和RI检测器的1260Inifinity LC***(Agilent)，进行HPLC分析。在Polaris C18-A柱(150x 4.6mm，5μm粒度，柱温30℃)上以1.5ml/分钟的流动相流速分离2μl样品。在H₂O/MeOH混合溶液(99/1)(V/V)中使用8.4mM硫酸进行分离。在这些条件下，ADP和ATP的保留时间分别是2.13分钟和2.33分钟(参见图20b)。

对3-甲基巴豆酰-CoA、3-甲基巴豆酸和游离辅酶A(CoA-SH)的基于HPLC的分析

使用配备柱加热模块和UV检测器(260nm)的1260Inifinity LC***(Agilent)，进行HPLC分析。在Zorbax SB-Aq柱(250x 4.6mm，5μm粒度，柱温30℃)上以1.5ml/分钟的流动相流速分离1μl样品。

根据实施例6中描述的程序追踪3-甲基巴豆酰-CoA的消耗和3-甲基巴豆酸和游离辅酶A(CoA-SH)的形成。在这些条件下，3-甲基巴豆酰-CoA、3-甲基巴豆酸和游离辅酶A(CoA-SH)的保留时间分别是5.38分钟、5.73分钟和4.07分钟。

图20a和图20b中显示对酶促测定法A和无酶测定法H获得的典型色谱图。图21中总结HPLC分析的结果。

获得的数据显示在两种酶分别催化的一个两步骤反应中，3-甲基巴豆酰-CoA转化成3-甲基巴豆酸，同时从ADP产生ATP(测定法A和B)。因此，这种转化通过以下方式发生：形成中间体3-甲基巴豆酰磷酸，接着来自这个中间体的磷酸根基团转移至ADP，因而释放ATP。

当单独使用磷酸丁酰转移酶时，观察到明显产生3-甲基巴豆酸，同时无ATP产生(测定法E)。这种产生归因于由磷酸丁酰转移酶的作用产生的磷酸3-甲基巴豆酰酯的自发水解。

对于无ADP的对照测定法(测定法C和D)，以相同方式观察到3-甲基巴豆酸的产生。这种产生也归因于由磷酸丁酰转移酶的作用产生的磷酸3-甲基巴豆酰酯水解。

实施例8：通过来自粪肠球菌的磷酸丁酰转移酶和来自干酪乳杆菌或地芽孢杆菌属物种的丁酸激酶的联合作用催化的3-甲基巴豆酰-CoA和ADP转化成3-甲基巴豆酸和ATP

在下文中描述的测定法中，使用以下酶：

表6

酶促测定在0.2ml总反应体积中实施。

标准反应混合物含有：

50mM磷酸钾缓冲液pH 7.5

4mM 3-甲基巴豆酰-CoA

4mM ADP

10mM MgCl₂

10mM NaCl

0.2mg/ml来自粪肠球菌的纯化的磷酸丁酰转移酶

平行地进行一系列对照(测定法C-H表7)。

表7

测定法随后在30℃摇动下温育20分钟。

在温育期后，通过在90℃加热反应介质4分钟，终止反应。将样品离心，经0.22μm滤器过滤并且将澄清的上清液转移入一只清洁小瓶供进一步分析。根据实施例7和实施例6中描述的方法，通过HPLC分析追踪ADP及3-甲基巴豆酰-CoA的消耗和ATP及3-甲基巴豆酸和游离辅酶A(CoA-SH)的形成。

图22中总结HPLC分析的结果。

获得的数据显示在两种酶分别催化的一个两步骤反应中，3-甲基巴豆酰-CoA转化成3-甲基巴豆酸，同时从ADP产生ATP(测定法A和B)。因此，这种转化通过以下方式发生：形成中间体磷酸3-甲基巴豆酰酯，接着来自这个中间体的磷酸根基团转移到ADP上，因而释放ATP。

当单独使用磷酸丁酰转移酶时，观察到明显产生3-甲基巴豆酸，同时无ATP产生(测定法E)。这种产生归因于由磷酸丁酰转移酶的作用产生的磷酸3-甲基巴豆酰酯的水解。

对于无ADP的对照测定法(测定法C和D)，以类似方式观察到3-甲基巴豆酸的产生。这种产生也归因于由磷酸丁酰转移酶的作用产生的磷酸3-甲基巴豆酰酯的水解。