CN102597254B - 从丙酮和乙酰辅酶a酶促产生3-羟基-3-甲基丁酸的方法 - Google Patents

从丙酮和乙酰辅酶a酶促产生3-羟基-3-甲基丁酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明描述了从丙酮和提供活化乙酰基的化合物产生3-羟基-3-甲基丁酸(又称作β-羟基异戊酸或HIV)的方法，所述方法包括将丙酮和提供活化乙酰基的化合物酶促转化为3-羟基-3-甲基丁酸。所述转化使用一种酶，其能够催化丙酮的氧(代)(即C＝O)基的碳原子和提供活化乙酰基的化合物的甲基之间形成共价键。优选地，在所述方法中使用的酶是具有HMG辅酶A合酶(EC？2.3.3.10)活性的酶和/或PksG蛋白，和/或具有C-C键切割/缩合裂合酶，例如HMG辅酶A裂合酶(EC？4.1.3.4)活性的酶。也描述了能够从丙酮和提供活化乙酰基的化合物产生3-羟基-3-甲基丁酸的生物，上述酶和生物在产生3-羟基-3-甲基丁酸中的用途，以及丙酮在产生3-羟基-3-甲基丁酸中的用途。

Description

从丙酮和乙酰辅酶A酶促产生3-羟基-3-甲基丁酸的方法
本发明涉及从丙酮和提供活化乙酰基的化合物产生3-羟基-3-甲基丁酸(又称作β-羟基异戊酸或HIV)的方法，所述方法包括将丙酮和提供活化乙酰基的化合物酶促转化为3-羟基-3-甲基丁酸。所述转化使用一种酶，其能够催化丙酮的氧(代)(oxo)(即C＝O)基的碳原子和提供活化乙酰基的化合物的甲基之间形成共价键。优选地，在所述方法中使用的酶是具有HMG辅酶A合酶(EC2.3.3.10)活性的酶和/或PksG蛋白，和/或具有C-C键切割/缩合裂合酶，例如HMG辅酶A裂合酶(EC4.1.3.4)活性的酶。本发明也涉及能够从丙酮和提供活化乙酰基的化合物产生3-羟基-3-甲基丁酸的生物，并涉及上述酶和生物用于产生3-羟基-3-甲基丁酸的用途。最后，本发明涉及丙酮在产生3-羟基-3-甲基丁酸中的用途。
3-羟基-3-甲基丁酸(又称作β-羟基异戊酸或HIV，见图1)是必需氨基酸亮氨酸的代谢物并在人体内合成。在葡萄柚、苜蓿和鲶鱼(catfish)中可发现小量的3-羟基-3-甲基丁酸。也知道其存在于一些亮氨酸分解代谢的代谢疾病，即低血容量酸血症(hypovalericacidemia)中。据显示，3-羟基-3-甲基丁酸可能对提高肌肉重量和强度有作用。(Nissen等人，J.Appl.Physiol.81(1996)，2095-2104)。Wilson等人(Nutrition&Metabolism5(2008))提出了以下作用机制：
——通过HMG辅酶A还原酶的转化提高肌纤维膜的完整性
——通过mTOR途径提高蛋白质合成
——通过抑制泛素途径抑制蛋白质降解。推测3-羟基-3-甲基丁酸帮助肌肉对抗蛋白质降解，辅助肌肉修复和提供增加的持久力。已有描述在医院的加护病房中用3-羟基-3-甲基丁酸帮助患有慢性阻塞性肺病的患者，与HIV有关的肌萎缩、癌症、具有严重伤害的创伤受害者。因此，3-羟基-3-甲基丁酸具有商业利益，因为其作为肌肉强化剂用于健美和作为药物用于避免肌萎缩的用途。美国专利7026507描述了制备3-羟基-3-甲基丁酸钠的固体制剂的方法，其中在第一个处理步骤中，4,4-dimethyloxetan-2-one与氢氧化钠水溶液反应，形成3-羟基-3-甲基丁酸钠溶液，然后，如果适当则在浓缩后在进一步处理步骤中对合成的二氧化硅应用溶液，如果适当则干燥得到的产物。
提供这样的生产3-羟基-3-甲基丁酸的方法将是理想的，其不依赖无机生产步骤且可在活的生物中生产，从而对环境有利且廉价。在这个背景下，Lee等人(Appl.Environ.Microbiol.63(1997),4191-4195)描述了通过使用微生物Galactomycesreessii将3-甲基丁酸转化为3-羟基-3-甲基丁酸产生3-羟基-3-甲基丁酸的方法。然而，尽管此方法允许产生3-羟基-3-甲基丁酸，仍然需要提供备选的有效和成本实用的产生3-羟基-3-甲基丁酸的方法，特别是通过生物学过程。
本发明满足了产生3-羟基-3-甲基丁酸的备选方法的此需求，并提供了基于生物资源和允许在体外或在微生物和其他物种体内产生3-羟基-3-甲基丁酸的方法。
特别地，本发明涉及从丙酮和提供活化乙酰基的化合物产生3-羟基-3-甲基丁酸(又称作β-羟基异戊酸或HIV)的方法，所述方法包括将丙酮和提供活化乙酰基的化合物酶促转化为3-羟基-3-甲基丁酸。
丙酮由以下通式代表：CH3-(C＝0)-CH3。在优选的实施方案中，提供活化乙酰基的化合物由以下通式(I)表征：
其中，X选自
S-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-CH(OH)-C(CH3)2-CH2-O-PO2H-O-PO2H-C10H13N5O7P(辅酶A),S-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-CH(OH)-C{CH3)2-CH2-O-PO2H-多肽(酰基载体蛋白)，S-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-CH(OH)-C(CH3)2-CH2-OH(泛酰巯基乙胺)，S-CH2-CH2-NH-CO-CH3(N-乙酰-半胱胺)，S-CH3(甲硫醇)，S-CH2-CH(NH2)-CO2H(半胱氨酸)，S-CH2-CH2-CH(NH2)-CO2H(同型半胱氨酸)，S-CH2-CH(NH-C5H8NO3)-CO-NH-CH2-CO2H(谷胱甘肽)，S-CH2-CH2-SO3H(辅酶M)和OH(醋酸)。
所述转化使用一种酶，其能够催化丙酮的氧(代)(即C＝O)基的碳原子和根据通式(I)的提供活化乙酰基的化合物的甲基的相应碳原子(C2)之间形成共价键。根据此反应历程，丙酮的氧(代)基作为亲电试剂起反应，而根据通式(I)的提供活化乙酰基的化合物的甲基作为亲核试剂起反应。丙酮和根据通式(I)的提供活化乙酰基的化合物的转化的一般反应显示在图5中。
反应可在一步中发生，即3-羟基-3-甲基丁酸可为上述酶催化的反应的直接产物。可选地，反应可包含两步，特别是在使用乙酰辅酶A作为提供活化乙酰基的化合物的情况下，在这个意义上，首先产生3-羟基-3-甲基丁酸和提供活化乙酰基的化合物的加合物，例如3-羟基-3-甲基丁酰辅酶A，其随后水解为例如3-羟基-3-甲基丁酸和辅酶A。因此，在第一种备选方案中，如图5中显示酶催化全部反应。在第二种备选方案中，酶催化丙酮的氧(代)(即C＝O)基的碳原子和提供活化乙酰基的化合物的甲基的相应碳原子(C2)之间形成共价键，但X保留在分子中。然后通过水解从所述分子中去除X。
本发明首次显示，有可能通过使用可将活化乙酰基转移至丙酮的酶产生3-羟基-3-甲基丁酸。在现有技术中，已报导了通过使用真菌Galactomycesreessii的生物转化从异戊酸产生3-羟基-3-甲基丁酸。然而，考虑到异戊酸是通过脱羧从亮氨酸得到的，而亮氨酸自身来源于两分子丙酮酸和一分子乙酰辅酶A的整体缩合代谢，此生产方法在能量上是不利的。本发明的方法避免了此缺点。
大体上，在本发明的背景下可使用接受如上定义的提供活化乙酰基的化合物作为一种底物和包含丙酮基作为成分的底物的任意酶。在一个优选的实施方案中，所述酶是接受乙酰辅酶A作为底物的酶。这样的酶的实例是HMG辅酶A合酶，HMG辅酶A裂合酶或其他C-C键切割/缩合裂合酶。然而，如下文将解释的，也包括通常用于在反应中天然催化不同于乙酰辅酶A的乙酰供体的酶，其也可以使用乙酰辅酶A或其类似物，例如PksG蛋白。
在另一个优选实施方案中，所述酶是接受根据通式(I)的提供活化乙酰基的化合物作为底物的酶，其中X是酰基载体蛋白，例如由用于在枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)中产生bacillaene的pksX基因簇编码的乙酰-S-AcpK蛋白。这样的酶的实例是PksG蛋白。PksG蛋白是来自枯草芽孢杆菌的pksX基因簇编码的蛋白质之一。PksG蛋白能够在类似HMG辅酶A合酶催化的反应中催化羧甲基-CH2-CO2H从乙酰-S-AcpK转移至与PksL的硫醇化结构域之一连接的β-酮硫酯聚酮化合物中间体。然而，在本发明的背景下已显示，PksG蛋白也可使用乙酰辅酶A代替乙酰-S-AcpK蛋白作为活化乙酰基的供体。
在一个优选的实施方案中，提供活化乙酰基的化合物是乙酰辅酶A。乙酰辅酶A(AcetylCoA)(又称作乙酰辅酶A(acetylCoenzymeA))的化学结构是在辅酶A(一种硫醇)和乙酸之间的硫酯。
在另一个优选的实施方案中，提供活化乙酰基的化合物具有通式(I)，其中X是酰基载体蛋白，例如由用于在枯草芽孢杆菌中产生bacillaene的pksX基因簇编码的乙酰-S-AcpK蛋白。
优选地，在所述方法中使用的酶是具有HMG辅酶A合酶(EC2.3.3.10)和/或PksG蛋白的活性的酶，和/或具有C-C键切割/缩合裂合酶活性的酶，例如HMG辅酶A裂合酶(EC4.1.3.4)。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的方法包括使用一种酶将丙酮和乙酰辅酶A酶促转化为3-羟基-3-甲基丁酸，所述酶能够催化丙酮的氧(代)(即C＝O)基的碳原子和根据通式(I)的乙酰辅酶A的碳原子C2之间形成共价键。
在优选的实施方案中，在根据本发明的方法中使用的酶是具有HMG辅酶A合酶(EC2.3.3.10)活性的酶，或具有PksG蛋白活性的酶，或具有C-C键切割/缩合裂合酶活性的酶，例如HMG辅酶A裂合酶(EC4.1.3.4)。
特别地，在本发明的背景下已显示，HMG辅酶A合酶可接受丙酮代替其通常的底物乙酰乙酰辅酶A，因此允许将乙酰辅酶A(或根据通式(I)的化合物)和丙酮转化为3-羟基-3-甲基丁酸。
另外，在本发明的背景下已显示，PksG蛋白可使用乙酰辅酶A作为底物代替Ac-S-AcpK蛋白，并可催化通常由HMG辅酶A合酶催化的反应。因此，设想催化与HMG辅酶A合酶的反应类似的反应的PksG蛋白也能够催化丙酮和通式(I)的化合物转化为3-羟基-3-甲基丁酸。另外，设想C-C键切割/缩合裂合酶，例如HMG辅酶A裂合酶可催化乙酰辅酶A和丙酮转化为3-羟基-3-甲基丁酰辅酶A，其可进而被水解为3-羟基-3-甲基丁酸和辅酶A。
在本申请的背景下，术语“HMG辅酶A合酶”或“具有HMG辅酶A合酶活性的蛋白质/酶”指被归类为EC号EC2.3.3.10(以前HMG辅酶A合酶曾被归类为EC4.1.3.5，但已被转移至EC2.3.3.10)中的任意酶，所述术语特别地指能够催化下述反应的任意酶，其中乙酰辅酶A与乙酰乙酰辅酶A缩合形成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG辅酶A)(见图2)，且所述术语也指衍生自这样的HMG辅酶A合酶且能够催化丙酮和如上定义的提供活化乙酰基的化合物(优选乙酰辅酶A)转化为3-羟基-3-甲基丁酸的任意酶。
可通过本领域熟知的方法测量将乙酰辅酶A与乙酰乙酰辅酶A缩合形成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG辅酶A)的酶活性。例如，在Clinkenbeard等人(J.Biol.Chem.250(1975)，3108-316)中描述了一个可能和优选使用的测定。在此测定中，通过监控伴随乙酰辅酶A依赖的乙酰乙酰辅酶A烯醇化物形式的消失而在303nm处的吸光度的减少测量HMG辅酶A合酶活性。优选地如在实施例3中描述的测定HMG辅酶A合酶活性。
HMG辅酶A合酶是甲羟戊酸途径的一部分。已鉴定出2种用于合成异戊烯焦磷酸(IPP)的途径，即甲羟戊酸途径和甘油醛3-磷酸-丙酮酸途径。HMG辅酶A合酶催化乙酰辅酶A与乙酰乙酰辅酶A的生物学克莱森(Claisen)缩合，并且是包括β-酮硫解酶、脂肪酸合酶(β-酮脂酰基载体蛋白合酶)和聚酮合酶的酰基缩合酶超家族的成员。
已描述了多种生物的HMG辅酶A合酶。编码来自多种来源的HMG辅酶A合酶的氨基酸和核酸序列也是现有的。大体上，序列仅共有低程度的总体(overall)序列同一性。例如，来自葡萄球菌(Staphylococcus)或链球菌(Streptococcus)的酶与人和鸟的HMG辅酶A合酶仅显示约20％的同一性。在一些数据来源中报导，细菌HMG辅酶A合酶与其在动物中的对应物仅显示约10％的总体序列同一性(Sutherlinetal.，J.Bacteriol.184(2002)，4065-4070)。然而，参与乙酰化和缩合反应的氨基酸残基在细菌和真核HMG辅酶A合酶中是保守的(Campobasso等人(J.Biol.Chem.279(2004)，44883-44888)。已测定了3种HMG辅酶A合酶的三维结构，并基本上良好表征了对酶促反应关键的氨基酸(Campobasso等人，loc.cit.；Chun等人，J.Bioi.Chem.275(2000)，17946-17953；Nagegowda等人，Biochem.J.383(2004)，517-527；Hegardt，Biochem.J.338(1999)，569-582)。在真核生物中存在2种HMG辅酶A合酶形式，即细胞质形式和线粒体形式。细胞质形式在产生胆固醇和其他类异戊二烯中起关键作用，而线粒体形式参与酮体的产生。
原则上可在本发明的背景下使用任意HMG辅酶A合酶，特别是来自原核或真核生物的。
下面描述原核HMG辅酶A合酶，例如来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(Campobasso等人，loc.cit.；Uniprot登记号Q9FD87)，表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)(Uniprot登记号Q9FD76)，溶血葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticus)(Uniprot登记号Q9FD82)，粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)(Sutherlin等人，loc.cit.；Unirprot登记号Q9FD7)，屎肠球菌(Enterococcusfaecium)(Uniprot登记号Q9FD66)，肺炎链球菌(Streptococcuspneumonia)(Uniprot登记号Q9FD56)，化脓链球菌(Streptococcuspyogenes)(Uniprot登记号Q9FD61)和嗜热自养甲烷杆菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum)(登记号AE000857)，伯氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)(NCBI登记号BB0683)。
另外，下表A列出了一些已知的来自原核生物的HMG辅酶A合酶：
表A：
下面描述真核HMG辅酶A合酶，例如来自真菌，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)(登记号U32187和P54874)，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(登记号P54839)，植物，例如拟南芥(Arabidopsisthaliana)(登记号X83882和P54873)，樟子松(Pinussylvestris)(登记号X96386)，和动物，例如秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)(登记号P54871)，小家鼠(Musmusculus)(线粒体的；登记号P54869和Hegardt，Biochem.J.338(1999)，569-582)，褐家鼠(Rattusnorvegicus)(线粒体的：登记号P22791和Hegardt，Biochem.J.338(1999)；细胞质的：登记号P17425)，569-582)，中国仓鼠(中国仓鼠(Cricetulusgriseus)：登记号P13704)，野猪(Susscrofa)(线粒体的；登记号U90884和Hegardt，Biochem.J.338(1999)，569-582)，智人(Homosapiens)(线粒体的：登记号P54868和Hegardt，Biochem.J.338(1999)，569-582；细胞质的：登记号Q01581)，德国小蠊(Blatteiiagermanica)(细胞质形式1；登记号P54961)，德国小蠊(细胞质形式2；登记号P54870)和原鸡(Gallusgallus)(细胞质的；登记号P23228)。
SEQIDNO：1-14提供来自不同生物的HMG辅酶A合酶的实例：
SEQIDNO：1显示了秀丽隐杆线虫的细胞质HMG辅酶A合酶的序列(P54871，基因库F25B4.6)，SEQIDNO：2显示了粟酒裂殖酵母的细胞质HMG辅酶A合酶的序列(裂殖酵母；P54874)，SEQIDNO：3显示了酿酒酵母的细胞质HMG辅酶A合酶的序列(面包酵母；P54839，基因库CAA65437.1)，SEQIDNO：4显示了拟南芥的细胞质HMG辅酶A合酶的序列(拟南芥；P54873)，SEQIDNO：5显示了盘基网柄菌(Dictyosteliumdiscoideum)的细胞质HMG辅酶A合酶的序列(粘液菌；P54872，基因库L2114)，SEQIDNO：6显示了德国小蠊的细胞质HMG辅酶A合酶的序列(德国小蠊；P54961，基因库X73679)，SEQIDNO：7显示了原鸡的细胞质HMG辅酶A合酶的序列(鸡；P23228，基因库CHKHMGCOAS)，SEQIDNO：8显示了智人的细胞质HMG辅酶A合酶的序列(人；Q0158，基因库X66435)，SEQIDNO：9显示了智人的线粒体HMG辅酶A合酶的序列(人；P54868，基因库X83618)，SEQIDNO：10显示了盘基网柄菌的线粒体HMG辅酶A合酶的序列(粘液菌；Q86HL5，基因库XM_638984)，SEQIDNO：11显示了表皮葡萄球菌的HMG辅酶A合酶的序列(Q9FD76)，SEQIDNO：12显示了发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)的HMG辅酶A合酶的序列(B2GBL1)，SEQIDNO：13显示了丁酸栖高温菌(Hyperthermusbutylicus)的HMG辅酶A合酶的序列(A2BMY8)，SEQIDNO：14显示了Chloroflexusaggregans的HMG辅酶A合酶的序列(B8G795)，SEQIDNO：24显示了德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)的HMG辅酶A合酶的序列(Q1GAH5)，SEQIDNO：25显示了溶血葡萄球菌的HMG辅酶A合酶的序列(相比野生型蛋白质，具有I98＞V差异)(Q4L958)。
在本发明的优选实施方案中，HMG辅酶A合酶是包含选自SEQIDNO：1-14的氨基酸序列、或与SEQIDNO：1-14的任一序列至少n％同一的序列并具有HMG辅酶A合酶活性的酶，其中n是在10和100之间的整数，优选10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，91，92，93，94，95，96，97，98或99。
优选地，通过比较相应的序列与上述SEQIDNO中的任一氨基酸序列测定同一性程度。当比较的序列不具有相同的长度时，同一性程度优选地指在较短序列中与较长序列中的氨基酸残基同一的氨基酸残基的百分比，或指在较长序列中与较短序列中的氨基酸残基同一的氨基酸残基的百分比。可根据本领域熟知的方法，优选地使用合适的计算机算法例如CLUSTAL测定序列同一性程度。
当使用Clustal分析法测定特定序列是否与参考序列例如80％同一时，可使用默认设置或优选地设置如下：矩阵：blosum30；开放缺口罚分：10.0；延伸缺口罚分：0.05；延迟发散：40；缺口分隔距离：8，用于氨基酸序列比较。用于核苷酸序列比较，延伸缺口罚分优选地设为5.0。
优选地，在序列的全长上计算同一性程度。
在根据本发明的方法中使用的HMG辅酶A合酶可为天然存在的HMG辅酶A合酶，或其可为来源于天然存在的HMG辅酶A合酶的HMG辅酶A合酶，例如通过引入例如改变或提高酶活性、稳定性等的突变或其他改变。
在本申请背景下的术语“HMG辅酶A合酶”或“具有HMG辅酶A合酶活性的蛋白质/酶”也包括来源于HMG辅酶A合酶的、能够通过丙酮和如上定义的提供活化乙酰基的化合物(优选乙酰辅酶A)的酶促转化产生3-羟基-3-甲基丁酸的酶，但其仅具有对作为底物的乙酰乙酰辅酶A的低亲和力，或不再接受乙酰乙酰辅酶A作为底物。HMG辅酶A合酶的偏好底物的这样的修饰允许提高丙酮至3-羟基-3-甲基丁酸的转化和减少副产物，例如HMG辅酶A的产生。修饰和/或提高蛋白质的期望酶活性的方法是本领域技术人员熟知的，并包括例如随机诱变或定点诱变和随后选择具有期望性能的酶或所谓的“定向进化”方法。例如，为了在原核细胞中的基因改造，可将编码HMG辅酶A合酶的核酸分子引入质粒，从而允许通过DNA序列重组进行诱变或序列修饰。标准方法(见Sambrook和Russell(2001)，MolecularCloning：ALaboratoryManual，CSHPress，ColdSpringHarbor，NY，USA)允许进行碱基交换或加入天然或合成的序列。可通过对片段应用衔接子和接头将DNA片段彼此连接。另外，可使用提供合适的限制位点或去除多余的DNA或限制位点的改造措施。在这些有可能进行***、缺失或取代的情况下，可使用体外诱变，“引物修复”，限制酶切或连接。大体上，可进行序列分析，限制酶切分析和其他生物化学和分子生物学方法作为分析方法。然后检测得到的HMG辅酶A合酶变体的酶活性，和特别是其偏好丙酮而不是乙酰乙酰辅酶A作为底物的能力。在实施例5中描述了测量HMG辅酶A合酶使用丙酮作为底物的能力的测定。可通过与标准化合物的比较检测3-羟基-3-甲基丁酸的形成，例如在通过薄层层析，LC/MS分离后和在其衍生化后的比色测定，或通过质谱。
特别地，在包含40mMTris-HClpH8，5至50mM乙酰辅酶A，100至500mM丙酮，1mMMgCl2(除了用于线粒体HMG辅酶A合酶以外)，0.5mMDTT和在0.2至8mg/ml范围内变化的酶的反应混合物中进行反应。在缺乏酶和一种底物的情况下进行对照反应。
通过分析在30或37℃下孵育渐增时间后取出的等分试样跟踪合成的进展。一般在孵育48小时后移取50μl等分试样，在100℃加热1分钟以消除蛋白质，离心并将上清转移至干净的小瓶用于通过质谱检测HIV。在40mMTris-HClpH8，1mMMgCl2，0.5mMDTT中制备3-羟基-3-甲基丁酸溶液，如上述加热并用作参考。
在PESCIEXAPI2000三重四极杆质谱仪上以阴离子模式用H2O/乙腈＝60/40(含0.1％三乙胺)作为流动相分析样品，流速为40μl/分钟。10μl每种上清与等量的流动相混合并直接注入质谱。监控[3-羟基-3-甲基丁酸-H]-离子的存在。也可在放射性标记的[2-4C]丙酮的存在下进行3-羟基-3-甲基丁酸的合成。通过TLC或HPLC在分离反应混合物后分析产物的形成。
在优选的实施方案中，在本发明中使用的HMG辅酶A合酶是对丙酮具有300mM或更低，优选地250mM或更低，甚至更优选地200mM或更低，特别优选地150mM或更低的KM值的酶。优选地，在实施例7中描述的条件下测定KM值。在另一个优选的实施方案中，在本发明中使用的HMG辅酶A合酶对描述的反应具有至少0.1x10-4秒-1，优选地至少0.2x10-4秒-1，甚至更优选地至少0.5x10-4秒-1，和特别优选地至少1x10-4秒-1，至少2x10-4秒-1，至少3x10-4秒-1，或至少5x10-4秒-1的Kcat值。优选地，在实施例7中描述的条件下测定Kcat值。
在本领域中已知鸟类HMG辅酶A合酶的His264在酶与乙酰乙酰辅酶A的相互作用中起作用，且Ala264变体缺乏与乙酰乙酰辅酶A的硫酯部分的氧的相互作用(Misraaetal.，Biochem.35(1996)，9610-9616)。因此，为了开发显示较弱的接受乙酰乙酰辅酶A作为底物的能力但接受丙酮作为底物的HMG辅酶A合酶变体，设想***地突变HMG辅酶A合酶中对应Misraa等人(见上述引文)中描述的鸟类HMG辅酶A合酶的His264的组氨酸残基，从而减弱或失效接受乙酰乙酰辅酶A作为底物的能力。
另外，可提供显示提高活性的HMG辅酶A合酶变体。例如Steussy等人(Biochemistry45(2006)，14407-14414)描述了粪肠球菌HMG辅酶A合酶的突变体，其中Ala110被改变为Gly110且其显示了140倍的总反应速度的提高。
也可在辅因子的存在下实施鉴定在产生3-羟基-3-甲基丁酸方面具有提高的酶性能的变体的方法，由于底物丙酮比HMG辅酶A合酶的天然底物乙酰乙酰辅酶A短，所述辅因子允许在酶的催化位点中的空间和/或电子互补。这样的辅因子的一个实例是辅酶A或结构紧密相关的分子例如S-亚硝基辅酶A。
接受丙酮作为底物、但对乙酰乙酰辅酶A作为底物具有低亲和力、或不再接受乙酰乙酰辅酶A作为底物的HMG辅酶A合酶的修饰形式可来源于天然存在的HMG辅酶A合酶，或来源于已经修饰的、优化的或综合合成的HMG辅酶A合酶。
可在根据本发明的方法中使用的蛋白质的另一个实例是PksG蛋白。在本申请的背景下，术语“PksG蛋白”或“具有PksG蛋白活性的蛋白质/酶”指能够催化由PksG蛋白天然催化的反应，即，将-CH2COO-从乙酰-S-AcpK(Ac-S-AcpK)转移至与PksL的硫醇化结构域之一连接的β-酮硫酯聚酮化合物中间体的任意酶。此反应与由HMG辅酶A合酶催化的反应类似，区别在于磷酸泛酰巯基乙胺基部分的乙酰硫酯与载体蛋白而不是辅酶A的一部分连接。尽管PksG蛋白在其天然催化的反应中催化乙酰基从乙酰-S-AcpK转移至接受体，在本发明的背景下已显示，PksG蛋白也可作用于通常由HMG辅酶A合酶催化的反应，即从乙酰乙酰辅酶A和乙酰辅酶A开始的HMG辅酶A的合成(见实施例3，其中在表1中显示，来自海水分枝杆菌(Mycobacteriummarinum)(B2HGT6)的酶可作用于乙酰乙酰辅酶A和乙酰辅酶A)。
可通过本领域已知的方法测量PksG蛋白的酶活性。例如在Calderone等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA103(2006)，8977-8982)中描述了一种可能和优选使用的测定。在此测定中使用乙酰乙酰(Acac)-S-PksL-T2作为模式底物并与Ac-S-AcpK和PksG蛋白一起孵育。HMG-S-PksL-T2的形成指示PksG蛋白能够将羧甲基-CH2-CO2H从Ac-S-AcpK转移至(Acac)-S-PksL-T2。可通过电喷射离子化(ESI)-FTMS或在放射自显影中测定HMG-S-PksL-T2的形成。在优选的实施方案中，如Calderone等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA103(2006)，8977-8982)的第8982页中描述的实施相应的测定。
PksG蛋白是枯草芽孢杆菌中的pksX途径的一部分，其编码负责bacillaene生物合成的酶(Butcher等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA104(2007)，1506-1509)。编码的蛋白质是AcpK，PksC，PksL，PksF，PksG，PksH和Pksl。根据Calderone等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA103(2006)，8977-8982)，这些酶的作用是在乙酰乙酰-S-载体蛋白上加入来源于醋酸的β-甲基支链。
在本发明的优选实施方案中，PksG蛋白是包含如在SEQIDNO：15或16中显示的氨基酸序列、或与SEQIDNO：15或16至少n％同一的序列、并具有PksG蛋白活性的酶，其中n是10和100之间的整数，优选10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，91，92，93，94，95，96，97，98或99。SEQIDNO：15显示了枯草芽孢杆菌(P40830)的PksG蛋白的氨基酸序列，和SEQIDNO：16显示了海水分枝杆菌(B2HGT6)的PksG蛋白的氨基酸序列。
有关序列同一性程度的测定，上面已陈述的关于HMG辅酶A合酶的测定同样适用。
在根据本发明的方法中使用的PksG蛋白可为天然存在的PksG蛋白，或其可为来源于天然存在的PksG蛋白的PksG蛋白，例如通过引入例如改变或提高酶活性、稳定性等的突变或其他改变。
在本申请背景下的术语“PksG蛋白”或“具有PksG蛋白活性的蛋白质/酶”也包括来源于PksG蛋白的、能够如上定义的通过丙酮和提供活化乙酰基的化合物(优选乙酰辅酶A)的酶促转化产生3-羟基-3-甲基丁酸的酶，但其仅具有对其天然底物的低亲和力，或不再接受其天然底物作为底物。PksG蛋白的偏好底物的这样的修饰允许提高丙酮至3-羟基-3-甲基丁酸的转化和减少不想要的副产物的产生。修饰和/或提高蛋白质的期望酶活性的方法是本领域技术人员熟知的并已在上文描述。然后检测得到的PksG蛋白变体的酶活性，和特别是其偏好丙酮作为底物的能力。测量PksG蛋白使用丙酮作为底物的能力的测定是在有关HMG辅酶A合酶的实施例5中描述的测定。可如上文描述的检测3-羟基-3-甲基丁酸的形成。
也可在辅因子的存在下实施鉴定在产生3-羟基-3-甲基丁酸方面具有提高的酶性能的变体的这样的方法，由于底物丙酮比PksG蛋白的天然底物短，所述辅因子允许在酶的催化位点中的空间和/或电子互补。
接受丙酮作为底物、但对其天然底物具有低亲和力、或不再接受其天然底物的PksG蛋白的修饰形式可来源于天然存在的PksG蛋白，或来源于已经修饰的、优化的或综合合成的PksG蛋白。
在本发明的背景下，术语“C-C键切割/缩合裂合酶”或“具有C-C键切割/缩合裂合酶活性的蛋白质/酶”指能够切割C-C键或通过缩合形成C-C键的并包含所谓的TIM(丙糖磷酸异构酶)桶结构域的酶。在若干丙酮酸结合酶和乙酰辅酶A依赖酶中存在此TIM桶结构域(Forouhar等人J.Biol.Chem.281(2006)，7533-7545)。TIM桶结构域在CATH蛋白质分类数据库中具有分类谱系3.20.20.150(www.cathdb.info/cathnode/3.20.20.150)。
术语“C-C键切割/缩合裂合酶”特别包括被归类为异丙基苹果酸合酶(EC2.3.3.13)、高柠檬酸合酶(EC2.3.3.14)或4-羟基-2-酮基戊酸醛缩酶(EC4.1.3.39)的酶。异丙基苹果酸合酶催化以下反应：乙酰辅酶A+3-甲基-2-氧代丁酸+H2O(2S)-2-异丙基苹果酸+辅酶A。这样的酶的实例是来自流产布鲁氏菌(Brucellaabortus)(菌株2308；Q2YRT1)的相应酶和来自Hahellachejuensis(菌株KCTC2396；Q2SFA7)的相应酶。
高柠檬酸合酶(EC2.3.3.14)是催化化学反应乙酰辅酶A+H2O+2-氧化戊二酸(R)-2-羟基丁烷-1，2，4-三羧酸盐+CoA的酶。4-羟基-2-酮基戊酸醛缩酶催化化学反应4-羟基-2-氧代戊酸乙醛+丙酮酸。
在本发明的背景下，术语“HMG辅酶A裂合酶”或“具有HMG辅酶A裂合酶活性的蛋白质/酶”指被归类为EC号EC4.1.3.4的任意酶，所述术语特别指能够催化HMG辅酶A切割为乙酰辅酶A和乙酰乙酸(见图3)或逆转此反应，即通过乙酰辅酶A和乙酰乙酸的缩合产生HMG辅酶A的任意酶，且所述术语也指来源于这样的HMG辅酶A裂合酶且能够催化丙酮和如上定义的提供活化乙酰基的化合物(优选乙酰辅酶A)转化为3-羟基-3-甲基丁酰辅酶A的任意酶。在本发明的背景下，产生的3-羟基-3-甲基丁酰辅酶A可然后被水解从而产生3-羟基-3-甲基丁酸。这可通过本领域技术人员已知的措施实现，例如使用酰基辅酶A水解酶(EC3.1.2.20)或酰基辅酶A转移酶(EC2.8.3.8)。
可通过本领域熟知的方法测量HMG辅酶A裂合酶的酶活性。例如在Melianby等人(MethodsofEnzymaticAnalysis；BergmeyerEd.(1963)，454-458)中描述了一个可用的测定。特别地，通过分光光度测定测量酶活性，通过3-羟基丁酸脱氢酶使用NADH依赖的乙酰乙酸的还原进行。
优选地如实施例4中描述的测定HMG辅酶A裂合酶活性。在这样的测定中，在加入0.005mg/mlHMG辅酶A裂合酶之前孵育5分钟含有40mMTris-HClpH8，1mMMgCl2，0.5mMDTT，0.4mMHMG辅酶A，0.2mMNADH，5单位3-羟基丁酸脱氢酶的反应混合物(1ml)，然后通过在340nm处的吸光度的减少监控反应的进展。
在一些情况下描述了通过HMG辅酶A裂合酶催化的反应需要二价阳离子，例如Mg2+或Mn2+的存在。因此，优选地，用于测定HMG辅酶A裂合酶活性的测定包括这样的二价阳离子，且根据本发明的用于产生3-羟基-3-甲基丁酸的方法如果使用HMG辅酶A裂合酶，优选在这些阳离子的存在下进行。
HMG辅酶A裂合酶是肝生酮作用的一部分。其催化肝生酮作用的末端反应，这是此途径的关键步骤。所述反应也是亮氨酸分解代谢中的重要步骤。
已描述了多种生物的HMG辅酶A裂合酶。编码HMG辅酶A裂合酶的氨基酸和核酸序列可从众多来源获得。大体上，序列间仅共有中等程度的总体序列同一性。例如，来自枯草芽孢杆菌或马尔他布鲁氏杆菌(Brucellamelitensis)的酶仅显示与人HMG辅酶A裂合酶的约45％的同一性(Forouhar等人，J.Biol.Chem.281(2006)，7533-7545)。已测定了多种HMG辅酶A裂合酶的三维结构并基本上良好表征了对酶促反应有决定性的氨基酸(Forouhar等人，loc.ci；Fu等人，J.Biol.Chem.281(2006)，7526-7532)。在真核生物中，HMG辅酶A裂合酶位于线粒体基质中。
大体上在本发明的背景下可使用任意HMG辅酶A裂合酶，特别是来自原核或真核生物的。
下面描述原核HMG辅酶A裂合酶，例如来自流产布鲁氏菌(UniProt登记号Q2YPL0和B2S7S2)，枯草芽孢杆菌(UniProt登记号034873)，地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)(Fu等人，见上面引文)，丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)(UniProt登记号Q4ZTL2和Q4ZRW6)，假单胞菌(Pseudomonasmevalonii)(UniProt登记号P13703)，耐压希瓦氏菌(Shewanellapiezotolerans)(UniProt登记号B8CRY9)，纤维弧菌(Cellvibriojaponicus)(UniProt登记号B3PCQ7)，棕色固氮菌(Azotobactervinelandii)(UniProt登记号C1DJK8和C1DL53)，Herminiimonasarsenicoxydans(UniProt登记号A4G1F2)和Burkhoideriacenocepacia(UniProt登记号A2VUW7)。
另外，下表B列出了一些已知的来自原核生物的HMG辅酶A裂合酶：
表B：
下面描述真核HMG辅酶A裂合酶，例如来自植物，例如萝卜(Raphanussativus)和玉蜀黍(登记号B6U7B9，基因库ACG45252)和动物，例如人(智人；UniProt登记号P35914)，食蟹猴(Cynomolgusmonkey)(UniProt登记号Q8XZ6)，苏门达腊猩猩(Sumatranorangutan)(Pongoabelii；UniProt登记号Q5R9E1)，大鼠(Rattusnorvegicus；UniProt登记号P97519；Fu等人，见上面引文)，小家鼠(UniProt登记号P38060)，鸭子(Anasspec)，牛(Bostaurus；UniProt登记号Q29448)，山羊(Caprahircus)，鸽子(Columbalivia)，鸡(Gallusgallus；UniProt登记号P35915)，绵羊(Ovisaries)，猪(Susscrofa)，斑马鱼(Brachydaniorerio；A8WG57，基因库BC154587)和来自原生动物梨形四膜虫(Tetrahymenapyriformis)。
在SEQIDNO：17-23中提供了来自不同生物的HMG辅酶A裂合酶的实例。SEQIDNO：17显示了玉蜀黍的HMG辅酶A裂合酶的序列(登记号B6U7B9，基因库ACG45252)，SEQIDNO：18显示了斑马鱼的HMG辅酶A裂合酶的序列(Brachydaniorerio；A8WG57，基因库BC154587)，SEQIDNO：19显示了牛的HMG辅酶A裂合酶的序列(Uniprot登记号Q29448)和SEQIDNO：20显示了智人的HMG辅酶A裂合酶的序列(线粒体，Uniprot登记号P35914，基因库HUMHYMEGLA)，SEQIDNO：21显示了恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)的HMG辅酶A裂合酶的序列(Q88H25)，SEQIDNO：22显示了鲍氏不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)的HMG辅酶A裂合酶的序列(B7H4C6)和SEQIDNO：23显示了嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)的HMG辅酶A裂合酶的序列(Q72IH0)。
在本发明的优选实施方案中，HMG辅酶A裂合酶是包含选自SEQIDNO：7-23的氨基酸序列或与SEQIDNO：7-23中任一序列至少n％同一的序列的并具有HMG辅酶A裂合酶活性的酶，其中n是10和100之间的整数，优选10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，91，92，93，94，95，96，97，98或99。
有关序列同一性程度的测定，上面已陈述的关于HMG辅酶A合酶的测定同样适用。
在根据本发明的方法中使用的HMG辅酶A裂合酶可为天然存在的HMG辅酶A裂合酶，或其可为来源于天然存在的HMG辅酶A裂合酶的HMG辅酶A裂合酶，例如通过引入例如改变或提高酶活性、稳定性等的突变或其他改变。
在本申请背景下的术语“HMG辅酶A裂合酶”或“具有HMG辅酶A裂合酶活性的蛋白质/酶”也包括来源于HMG辅酶A裂合酶、能够通过丙酮和如上定义的提供活化乙酰基的化合物(优选乙酰辅酶A)的缩合产生3-羟基-3-甲基丁酰辅酶A的酶，但其仅具有对作为底物的乙酰乙酸的低亲和力，或不再接受乙酰乙酸作为底物。HMG辅酶A裂合酶的偏好底物的这样的修饰允许提高丙酮至3-羟基-3-甲基丁酰辅酶A的转化和减少副产物HMG辅酶A的产生。修饰和/或提高蛋白质的期望酶活性的方法是本领域技术人员熟知的并已在上文描述。
可在如实施例6中描述的测定中测定给定的酶催化3-羟基-3-甲基丁酰辅酶A产生的能力。
接受丙酮作为底物但仅具有对作为底物的乙酰乙酸的低亲和力、或不再接受乙酰乙酸作为底物的HMG辅酶A裂合酶的修饰形式可来源于天然存在的HMG辅酶A裂合酶，或来源于已经修饰的、优化的或综合合成的HMG辅酶A裂合酶。
在根据本发明的方法中，可以仅应用如上定义的一种酶，例如仅HMG辅酶A合酶或仅HMG辅酶A裂合酶或仅PksG蛋白。然而，当然也可以使用超过一种活性，即不同的酶，特别是HMG辅酶A合酶、HMG辅酶A裂合酶和PksG蛋白的任意组合。例如，在体外方法的情况下，可对反应混合物加入超过一种酶的活性，同时或以任何可能的顺序相继加入。在使用生物，特别是微生物的体内方法中，有可能例如使用生物，特别是微生物表达如上定义的酶。然而，也设想使用生物/微生物表达上述酶的任意可能的组合。另外，也可能使用2种或多种类型的生物/微生物的混合物，其中一种表达一种酶，另一种表达另一种酶。然后可共同培养这些不同的种类。
在根据本发明的方法中使用的酶，例如HMG辅酶A合酶和/或PksG蛋白和/或C-C键切割/缩合裂合酶，例如HMG辅酶A裂合酶可为蛋白质的天然形式或合成的蛋白质、以及化学合成的或在生物***中产生的或通过重组方法产生的蛋白质。所述酶，例如HMG辅酶A合酶和/或PksG蛋白和/或C-C键切割/缩合裂合酶，例如HMG辅酶A裂合酶，也可为化学修饰的，例如以提高其稳定性、抗性(例如对温度的抗性)，以便于其纯化或其在支持物上的固定。所述酶可以分离的形式、纯化的形式、固定的形式、作为从合成所述酶的细胞得到的粗制或部分纯化的提取物、作为化学合成的酶、作为重组产生的酶、以产生其的微生物的形式等使用。
可在体外或体内实施根据本发明的方法。体外反应被理解为其中不使用细胞的反应，即无细胞反应。
为了体外实施所述方法，在允许酶有活性和发生酶促转化的条件下(缓冲液、温度、辅因子等)孵育用于反应的底物和酶。允许反应进行足够的时间以产生3-羟基-3-甲基丁酸。可通过在薄层层析，LC/MS分离后与标准化合物的比较和在其衍生化后的比色测定检测3-羟基-3-甲基丁酸和/或3-羟基-3-甲基丁酰辅酶A的产生。
酶可为允许酶促反应发生的任意合适形式。其可为纯化的或部分纯化的，或为粗制细胞提取物或部分纯化的提取物的形式。酶也可以固定在合适的载体上。
由于底物丙酮一般比酶使用的天然底物(例如HMG辅酶A合酶和HMG辅酶A裂合酶分别使用的乙酰乙酰辅酶A/乙酰乙酸)短，可有利地向反应混合物加入允许在酶的催化位点中的空间和/或电子互补的辅因子。在HMG辅酶A合酶的情况下，这样的辅因子的一个实例为辅酶A或结构紧密相关的分子，例如S-亚硝基辅酶A。
为了体内实施所述方法，使用合适的生物/微生物，其能够提供底物，即丙酮和如上定义的提供活化乙酰基的化合物，和能够催化丙酮的氧(代)(即C＝O)基的碳原子和提供活化乙酰基的化合物的甲基的相应碳原子(C2)之间形成共价键的酶，在优选的实施方案中，所述酶是HMG辅酶A合酶和/或PksG蛋白和/或C-C键切割/缩合裂合酶，例如HMG辅酶A裂合酶。
因此，在此实施方案的情况下，根据本发明的方法的特征在于，在能够产生丙酮和表达能够在丙酮的氧(代)(即C＝O)基的碳原子和提供活化乙酰基的化合物的甲基的相应碳原子(C2)之间形成共价键的酶，优选表达具有HMG辅酶A合酶(EC2.3.3.10)活性的酶和/或表达PksG蛋白和/或表达具有C-C键切割/缩合裂合酶，例如HMG辅酶A裂合酶(EC4.1.3.4)活性的酶的生物，优选微生物的存在下实现丙酮和提供活化乙酰基的化合物的转化。
在本发明的背景下，术语“其能够产生丙酮”表示，生物/微生物具有在细胞内部产生丙酮的能力，这是由于提供允许从代谢前体产生丙酮的酶活性的酶的存在。
某些微生物产生丙酮，例如丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)，拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)，解纤维梭菌(Clostridiumcellulolyticum)，多粘芽孢杆菌(Bacilluspolymyxa)和恶臭假单胞菌。在丙酮丁醇梭菌中最好的表征了丙酮的合成。其开始于2分子乙酰辅酶A缩合成乙酰乙酰辅酶A的反应(反应步骤1)。此反应由乙酰辅酶A乙酰基转移酶(EC2.3.1.9)催化。然后通过与醋酸或丁酸的反应将乙酰乙酰辅酶A转化为乙酰乙酸，也导致乙酰辅酶A或丁酰辅酶A的产生(反应步骤2)。此反应由例如乙酰乙酰辅酶A转移酶催化(EC2.8.3.8)。已知乙酰乙酰辅酶A转移酶来自多种生物，例如来自大肠杆菌，其中其由atoAD基因编码，或来自丙酮丁醇梭菌，其中其由ctfAB基因编码。
然而，其他酶也可以催化此反应，例如3-含氧酸辅酶A转移酶(EC2.8.3.5)或琥珀酸辅酶A连接酶(EC6.2.1.5)。
最后，通过由乙酰乙酸脱羧酶(EC4.1.1.4)催化的脱羧步骤(反应步骤3)将乙酰乙酸转化为丙酮。
上述反应步骤1和2和催化它们的酶不是丙酮合成特有的，并可在多种生物中找到。相反地，由乙酰乙酸脱羧酶(EC4.1.1.4)催化的反应步骤3仅在能够产生丙酮的生物中发现。
在一个优选的实施方案中，在根据本发明的方法中使用的生物是天然具有产生丙酮的能力的生物，优选微生物。因此，优选地所述微生物属于梭菌属、芽孢杆菌属或假单胞菌属，更优选地属于丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、解纤维梭菌、多粘芽孢杆菌或恶臭假单胞菌物种。
在更优选的实施方案中，在根据本发明的方法中使用的生物是天然具有产生丙酮的能力的且在已进一步被基因改造以表达如上定义的酶的意义上是重组的生物，优选微生物。术语“重组”在一个实施方案中表示生物经基因改造以包含编码如上定义的酶的外源核酸分子。在优选的实施方案中，生物已经基因改造以包含编码如上定义的酶，例如HMG辅酶A合酶、C-C键切割/缩合裂合酶，例如HMG辅酶A裂合酶或PksG蛋白的外源核酸分子或编码这些蛋白质的任意可能组合的外源核酸序列。在此背景下术语“外源”指核酸分子不天然存在于所述生物/微生物中。这表示其不存在于生物/微生物的相同结构中或相同位置上。在一个优选的实施方案中，外源核酸分子是包含启动子和编码相应的酶，例如HMG辅酶A合酶、和/或C-C键切割/缩合裂合酶，例如HMG辅酶A裂合酶和/或PksG蛋白的编码序列的重组分子，其中驱动编码序列表达的启动子对编码序列而言是异源的。异源在此背景下表示启动子不是天然驱动所述编码序列表达的启动子，而是天然驱动不同的编码序列表达的启动子，即其来源于另一个基因，或是合成的启动子或嵌合启动子。优选地，启动子是相对生物/微生物异源的启动子，即启动子不天然存在于相应的生物/微生物中。甚至更优选地，启动子是诱导型启动子。用于驱动不同生物，特别是微生物种类中的表达的启动子是本领域技术人员熟知的。
在另一个优选的实施方案中，核酸分子相对生物/微生物是外源的，因为编码的酶，例如HMG辅酶A合酶，和/或编码的C-C键切割/缩合裂合酶，例如HMG辅酶A裂合酶，和/或PksG蛋白相对生物/微生物不是内源的，即当生物/微生物没有被基因改造时不天然表达。换句话说，编码的HMG辅酶A合酶和/或编码的C-C键切割/缩合裂合酶，例如HMG辅酶A裂合酶和/或PksG蛋白对生物/微生物而言是异源的。
术语“重组”在另一个实施方案中表示，生物在控制如上定义的酶的表达的、天然存在于生物中的调控区中被基因改造，从而导致与对应的未基因改造的生物相比，相应的酶表达的提高。下面进一步描述术语“更高表达”的意思。
可通过本领域技术人员已知的方法实现调控区的这样的改造。一个实例是用允许更高表达的启动子替换天然存在的启动子，或改造天然存在的启动子以显示更高的表达。因此，在此实施方案中，生物在编码如上定义的酶的基因的调控区中包含不天然存在于生物中的外源核酸分子，且与相应的未基因改造的生物相比，其导致酶的更高的表达。
外源核酸分子可以染色体外的形式，例如作为质粒存在于生物/微生物中，或稳定整合在染色体中。优选稳定整合。
在更优选的实施方案中，生物/微生物的特征在于，与相应的未基因改造的生物/微生物相比，在具有外源核酸分子的基因改造的生物/微生物中，如上定义的酶，例如HMG辅酶A合酶和/或C-C键切割/缩合裂合酶，例如HMG辅酶A裂合酶，和/或PksG蛋白的表达/活性更高。“更高的”表达/活性表示，所述酶，特别是HMG辅酶A合酶和/或C-C键切割/缩合裂合酶，例如HMG辅酶A裂合酶，和/或PksG蛋白的表达/活性在基因改造的生物中比在相应的未基因改造的生物/微生物中的高至少10％，优选至少20％，更优选地至少30％或50％，甚至更优选地至少70％或80％和特别优选至少90％或100％。在甚至更优选的实施方案中，表达/活性的提高可为至少150％，至少200％或至少500％。在特别优选的实施方案中，所述表达比在相应的未基因改造的生物/微生物中的高至少10倍，更优选地至少100倍和甚至更优选地至少1000倍。
术语“更高的”表达/活性也包括下述情况，其中相应的未基因改造的生物/微生物不表达相应的酶，例如HMG辅酶A合酶和/或C-C键切割/缩合裂合酶，例如HMG辅酶A裂合酶，和/或PksG蛋白，从而相应的表达/活性在未基因改造的生物/微生物中为0。
测量给定蛋白质在细胞中的表达水平的方法是本领域技术人员熟知的。在一个实施方案中，通过测量相应的蛋白质的量进行表达水平的测量。相应的方法是本领域技术人员熟知的并包括蛋白质印迹、ELISA等。在另一个实施方案中，通过测量相应的RNA的量进行表达水平的测量。相应的方法是本领域技术人员熟知的并包括Northern印迹。
分别测量上述酶，特别是HMG辅酶A合酶和/或C-C键切割/缩合裂合酶，例如HMG辅酶A裂合酶，和/或PksG蛋白的酶活性的方法是本领域已知的并已在上面描述。
在另一个优选的实施方案中，在根据本发明的方法中使用的生物是基因改造的生物，优选微生物，其来源于天然不产生丙酮但已被基因改造以产生丙酮的生物/微生物，即通过在生物/微生物中引入允许产生丙酮所必需的基因。原则上任意微生物可以此方式被基因改造。负责丙酮合成的酶已经在上面描述。编码相应酶的基因是本领域已知的并可用于基因改造给定的微生物以产生丙酮。如上所述，丙酮合成的反应步骤1和2在大多数生物中天然存在。然而，反应步骤3是丙酮合成特有的和关键的。因此，在优选的实施方案中，来源于天然不产生丙酮的生物/微生物的基因改造的生物/微生物被改造，以包含编码催化乙酰乙酸通过脱羧转化成丙酮的酶，例如乙酰乙酸脱羧酶(EC4.1.1.4)的核苷酸序列。编码此酶的来自若干生物的核苷酸序列是本领域已知的，例如来自丙酮丁醇梭菌(Uniprot登记号P23670和P23673)，拜氏梭菌(梭菌MP；Q9RPK1)，巴氏梭菌(Clostridiumpasteurianum)(Uniprot登记号P81336)，根瘤菌属物种(Bradyrhizobiumsp.)(菌株BTAM/ATCCBAA-1182；Uniprot登记号A5EBU7)，鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderiamallei)(ATCC10399A9LBS0)，鼻疽伯克霍尔德氏菌(Uniprot登记号A3MAE3)，鼻疽伯克霍尔德氏菌FMHA5XJB2，Burkholderiacenocepacia(Uniprot登记号A0B471)，Burkholderiaambifaria(Uniprot登记号Q0b5P1)，Burkholderiaphytofirmans(Uniprot登记号B2T319)，伯克霍尔德氏菌物种(Uniprot登记号Q38ZU0)，肉毒杆菌(Clostridiumbotutinum)(Uniprot登记号B2TLN8)，皮氏罗尔斯顿菌(Ralstoniapickettii)(Uniprot登记号B2UIG7)，黑胡桃链霉菌(Streptomycesnogalater)(Uniprot登记号Q9EYI7)，阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)(Uniprot登记号Q82NF4)，嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)(Uniprot登记号Q5ZXQ9)，唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)(Uniprot登记号Q1WVG5)，红球菌属物种(Rhodococcusspec.)(Uniprot登记号Q0S7W4)，植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)(Uniprot登记号Q890G0)，豌豆根瘤菌(Rhizobiumleguminosarum)(Uniprot登记号Q1911)，干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)(Uniprot登记号Q03B66)，土拉热弗朗西斯氏菌(Francisellatularensis)(Uniprot登记号Q0BLC9)，红色糖多孢菌(Saccharopolysporaerythreae)(Uniprot登记号A4FKR9)，Korarchaeumcryptoftlum(Uniprot登记号B1L3N6)，解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)(Uniprot登记号A7Z8K8)，异旋孢腔菌(Cochliobolusheterostrophus)(Uniprot登记号Q8NJQ3)，冰岛硫化叶菌(Sulfolobusislandicus)(Uniprot登记号C3ML22)和土拉热弗朗西斯氏菌全北区亚种(Francisellatularensissubsp.Holarctica)(菌株OSU18)的adc基因。
更优选地，生物，优选微生物被基因改造以便于用编码能够催化上述丙酮合成的反应步骤2，即乙酰乙酰辅酶A至乙酰乙酸的转化的酶的核酸分子转化。
甚至更优选地，生物，优选微生物被基因改造以便于用编码能够催化上述丙酮合成的反应步骤1，即2分子乙酰辅酶A至乙酰乙酰辅酶A的缩合的酶的核酸分子转化。
在特别优选的实施方案中，生物/微生物被基因改造以便于用编码能够催化上述丙酮合成的反应步骤1的酶的核酸分子、和用编码能够催化上述丙酮合成的反应步骤2的酶的核酸分子转化，或用编码能够催化上述丙酮合成的反应步骤1的酶的核酸分子、和用编码能够催化上述丙酮合成的反应步骤3的酶的核酸分子转化，或用编码能够催化上述丙酮合成的反应步骤2的酶的核酸分子、和用编码能够催化上述丙酮合成的反应步骤3的酶的核酸分子转化，或用编码能够催化上述丙酮合成的反应步骤1的酶的核酸分子和用编码能够催化上述丙酮合成的反应步骤2的酶的核酸分子和用编码能够催化上述丙酮合成的反应步骤3的酶的核酸分子转化。
制备上述基因改造的生物，优选微生物的方法是本领域熟知的。因此，一般地，用允许各个酶在微生物中表达的DNA构建体转化生物/微生物。这样的构建体通常包含所讨论的编码序列，所述编码序列与允许在相应的宿主细胞中转录和翻译的调控序列，例如启动子和/或增强子和/或转录终止子和/或核糖体结合位点等连接。现有技术已经描述了已被基因改造从而能够产生丙酮的微生物。特别地，来自例如丙酮丁醇梭菌的基因已被引入大肠杆菌，从而允许在天然不产生丙酮的细菌大肠杆菌中合成丙酮(Bermejo等人，Appl.Environ.Microbiol.64(1998)；1079-1085；Hanai等人，Appl.Environ.Microbiol.73(2007)，7814-7818)。特别地，Hanai等人(见上面的引文)显示，为了在大肠杆菌中实现丙酮的产生，引入编码乙酰乙酸脱羧酶(例如来自丙酮丁醇梭菌)的核酸序列就足够了，这表明在大肠杆菌中催化上述反应步骤1和2的内源酶(即大肠杆菌atoB和atoAD基因的表达产物)足以提供用于产生丙酮的底物。
在特别优选的实施方案中，在根据本发明的方法中使用的生物，优选微生物是重组生物/微生物，其来源于天然不产生丙酮但已如上所述被基因改造从而产生丙酮、且表达能够催化丙酮的氧(代)(即C＝O)基的碳原子和如上定义的提供活化乙酰基的化合物的甲基的相应碳原子(C2)之间形成共价键的酶的生物/微生物。术语“重组”在此背景下优选地表示，生物在已被进一步基因改造从而表达如上定义的酶的意义上是重组的。术语“重组”在一个实施方案中表示，生物被基因改造从而包含编码如上定义的酶(例如HMG辅酶A合酶或C-C键切割/缩合裂合酶，例如HMG辅酶A裂合酶，或PksG蛋白)的外源核酸分子，或编码上面定义的酶的任意可能组合的外源核酸分子。
有关术语“外源核酸分子”的定义，上文已陈述的定义同样适用。
术语“重组”在另一个实施方案中表示，生物在控制如上定义的酶的表达的、天然存在于生物中的调控区中被基因改造，从而导致与对应的未基因改造的生物相比，相应的酶表达的提高。下面进一步描述术语“更高表达”的意思。
可通过本领域技术人员已知的方法实现调控区的这样的改造。一个实例是用允许更高表达的启动子替换天然存在的启动子，或改造天然存在的启动子以显示更高的表达。因此，在此实施方案中，生物在编码如上定义的酶的基因的调控区中包含不天然存在于生物中的外源核酸分子，且与相应的未基因改造的生物相比，其导致酶的更高的表达。
优选地，这样的生物/微生物的特征在于，与相应的未基因改造的生物/微生物相比，在重组的生物/微生物中，所述酶，例如HMG辅酶A合酶和/或C-C键切割/缩合裂合酶，例如HMG辅酶A裂合酶，和/或PksG蛋白的表达/活性更高。“更高的”表达/活性表示，所述酶，例如HMG辅酶A合酶和/或C-C键切割/缩合裂合酶，例如HMG辅酶A裂合酶，和/或PksG蛋白的表达/活性在基因改造的生物/微生物中比在相应的未基因改造的生物/微生物中的高至少10％，优选至少20％，更优选地至少30％或50％，甚至更优选地至少70％或80％和特别优选至少90％或100％。在甚至更优选的实施方案中，表达/活性的提高可为至少150％，至少200％或至少500％。在特别优选的实施方案中，所述表达比在相应的未基因改造的生物/微生物中的高至少10倍，更优选地至少100倍和甚至更优选地至少1000倍。
术语“更高的”表达/活性也包括下述情况，其中相应的未基因改造的生物/微生物不表达所述酶，例如HMG辅酶A合酶和/或C-C键切割/缩合裂合酶，例如HMG辅酶A裂合酶，和/或PksG蛋白，从而相应的表达/活性在未基因改造的生物/微生物中为0。有关测量表达或活性水平的方法，上文已描述的方法同样适用。
如在本发明的背景下使用的术语“生物”一般指任意可能的生物种类，特别是真核生物、原核生物和古细菌。所述术语包括动物、植物、真菌、细菌和古细菌。所述术语也包括分离的细胞或这样生物的细胞团块，如组织或愈伤组织。
在一个优选的实施方案中，所述生物是微生物。术语“微生物”在本发明的背景下指原核细胞，特别是细菌，以及真菌，例如酵母，也指藻类和古细菌。在一个优选的实施方案中，所述微生物是细菌。原则上可使用任意细菌。在根据本发明的方法中使用的优选的细菌是芽孢杆菌属、梭菌属、假单胞菌属或埃希氏菌属的细菌。在特别优选的实施方案中，细菌属于埃希氏菌属和甚至更优选地属于大肠杆菌种。
在另一个优选的实施方案中，所述微生物是真菌，更优选地酵母属、裂殖酵母属、曲霉属或木霉属和甚至更优选地酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、黑曲霉(Aspergillusniger)种的或里氏木霉(Trichodermareesei)种的真菌。
在另一个优选的实施方案中，微生物是具有光合作用活性的微生物，例如能够进行光合作用的细菌或微藻类。
在特别优选的实施方案中，微生物是藻类，更优选地属于硅藻类的藻类。
如果在本发明的方法的背景下使用微生物，也设想以下述方式实施根据本发明的方法，其中使用2种微生物，即一种产生丙酮，另一种使用第一种微生物产生的丙酮在如本文上面定义的酶的帮助下将其转化。
当使用提供相应的酶活性的微生物体内实施根据本发明的方法时，在允许发生酶促反应的合适的培养条件下培养所述微生物。具体的培养条件取决于使用的具体微生物，但这是本领域技术人员熟知的。一般以这样的方式选择培养条件，即其允许编码用于相应反应的酶的基因表达。用于提高和微调特定基因在特定培养阶段的表达，例如通过化学诱导物或通过温度改变诱导基因表达的多种方法是本领域技术人员已知的。
在另一个优选的实施方案中，在根据本发明的方法中使用的生物是能够进行光合作用的生物，例如植物或微藻类。原则上可使用任意可能的植物，即单子叶植物或双子叶植物。优选地使用可以对农业有意义的规模培养的并允许生产大量生物量的植物。实例是草如黑麦草，谷物如黑麦、大麦、燕麦、粟、玉米、其他储存淀粉的植物如马铃薯或储存糖的植物如甘蔗或甜菜。也设想使用烟草或蔬菜植物如番茄、胡椒、黄瓜、茄子等。另一种可能性是使用储存油的植物，例如油菜、橄榄等。也设想使用树，特别是快速生长的树，例如桉树、白杨或橡胶树(Heveabrasiliensis)。
本发明也涉及生物，优选微生物，其由以下特征表征：
(a)其能够产生丙酮；和
(b)其表达能够催化丙酮的氧(代)(即C＝O)基的碳原子和如上定义的提供活化乙酰基的化合物的甲基的相应碳原子(C2)之间形成共价键的酶，优选地具有HMG辅酶A合酶(EC2.3.3.10)活性的酶，和/或具有C-C键切割/缩合裂合酶，例如HMG辅酶A裂合酶(EC4.1.3.4)，和/或PksG蛋白活性的酶。
关于在根据本发明的生物中表达的酶，特别是HMG辅酶A合酶，C-C键切割/缩合裂合酶，例如HMG辅酶A裂合酶，和/或PksG蛋白的来源、性质、性能、序列等，上面陈述的与根据本发明的方法有关的内容同样适用。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的生物是天然具有产生丙酮的能力的生物，优选微生物，即上述特征(a)是生物，优选微生物天然显示的特征。因此，优选地，生物是属于梭菌属、芽孢杆菌属或假单胞菌属，更优选地属于丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、解纤维梭菌、多粘芽孢杆菌或恶臭假单胞菌种的微生物。
在另一个优选的实施方案中，根据本发明的生物，优选微生物是基因改造的生物/微生物，其来源于天然不产生丙酮但已被基因改造以产生丙酮的生物/微生物，即通过在生物/微生物中引入允许产生丙酮所必需的基因。原则上任意生物/微生物可以此方式被基因改造。负责丙酮合成的酶已经在上面描述。编码相应酶的基因是本领域已知的并可用于基因改造给定的生物，优选微生物以产生丙酮。
在优选的实施方案中，来源于天然不产生丙酮的生物/微生物的基因改造的生物/微生物被改造，以包含编码催化乙酰乙酸通过脱羧转化成丙酮的酶，例如乙酰乙酸脱羧酶(EC4.1.1.4)的核苷酸序列。编码此酶的来自若干生物的核苷酸序列是本领域已知的，例如来自丙酮丁醇梭菌的adc基因。
更优选地，生物/微生物被基因改造以用编码能够催化上述丙酮合成的反应步骤2，即乙酰乙酰辅酶A至乙酰乙酸的转化的酶的核酸分子转化。
甚至更优选地，生物/微生物被基因改造以用编码能够催化上述丙酮合成的反应步骤1，即2分子乙酰辅酶A至乙酰乙酰辅酶A的缩合的酶的核酸分子转化。
在特别优选的实施方案中，生物/微生物被基因改造以便于用编码能够催化上述丙酮合成的反应步骤1的酶的核酸分子、和用编码能够催化上述丙酮合成的反应步骤2的酶的核酸分子转化，或用编码能够催化上述丙酮合成的反应步骤1的酶的核酸分子、和用编码能够催化上述丙酮合成的反应步骤3的酶的核酸分子转化，或用编码能够催化上述丙酮合成的反应步骤2的酶的核酸分子、和用编码能够催化上述丙酮合成的反应步骤3的酶的核酸分子转化，或用编码能够催化上述丙酮合成的反应步骤1的酶的核酸分子和用编码能够催化上述丙酮合成的反应步骤2的酶的核酸分子和用编码能够催化上述丙酮合成的反应步骤3的酶的核酸分子转化。
制备上述基因改造的生物/微生物的方法是本领域熟知的。因此，一般地，用允许各个酶在生物/微生物中表达的DNA构建体转化生物/微生物。这样的构建体通常包含讨论中的编码序列，所述编码序列与允许在相应的宿主细胞中转录和翻译的调控序列，例如启动子和/或增强子和/或转录终止子和/或核糖体结合位点等连接。现有技术已经描述了已被基因改造从而能够产生丙酮的生物，特别是微生物。特别地，来自例如丙酮丁醇梭菌的基因已被引入大肠杆菌，从而允许在天然不产生丙酮的细菌大肠杆菌中合成丙酮(Bermejo等人，Appl.Environ.Microbiol.64(1998)；1079-1085；Hanai等人，Appl.Environ.Microbiol.73(2007)，7814-7818)。特别地，Hanai等人(见上面的引文)显示，为了在大肠杆菌中实现丙酮的产生，引入编码乙酰乙酸脱羧酶(例如来自丙酮丁醇梭菌)的核酸序列就足够了，这表明在大肠杆菌中催化上述反应步骤1和2的内源酶(即大肠杆菌atoB和atoAD基因的表达产物)足以提供用于产生丙酮的底物。
在另一优选的实施方案中，在根据本发明的方法中使用的生物，优选地微生物被基因改造从而表达能够催化丙酮的氧(代)(即C＝O)基的碳原子和提供活化乙酰基的化合物的甲基的相应碳原子(C2)之间形成共价键的酶。在此背景下，术语“重组”表示，在第一方面，所述生物包含编码能够催化丙酮的氧(代)(即C＝O)基的碳原子和提供活化乙酰基的化合物的甲基的相应碳原子(C2)之间形成共价键的酶的外源核酸分子，优选编码HMG辅酶A合酶的外源核酸分子，或编码C-C键切割/缩合裂合酶，例如HMG辅酶A裂合酶的外源核酸分子，或编码PksG蛋白的外源核酸分子，或编码具有上述性质的酶的任意可能组合的外源核酸分子。术语“外源”在此背景下表示所述核酸分子不天然存在于所述生物/微生物中。这表示，其不存在于生物/微生物的相同结构中或相同位置上。在一个优选的实施方案中，外源核酸分子是包含启动子和编码所述酶，例如HMG辅酶A合酶，和/或C-C键切割/缩合裂合酶，例如HMG辅酶A裂合酶，和/或PksG蛋白的编码序列的重组分子，其中驱动编码序列表达的启动子对编码序列而言是异源的。异源在此背景下表示启动子不是天然驱动所述编码序列表达的启动子，而是天然驱动不同的编码序列表达的启动子，即其来源于另一个基因，或是合成的启动子或嵌合启动子。优选地，启动子是相对生物/微生物异源的启动子，即启动子不天然存在于相应的生物/微生物中。甚至更优选地，启动子是诱导型启动子。用于驱动不同生物，特别是微生物种类中的表达的启动子是本领域技术人员熟知的。
在另一个优选的实施方案中，核酸分子相对生物/微生物是外源的，因为编码的酶，例如HMG辅酶A合酶，和/或编码的C-C键切割/缩合裂合酶，例如HMG辅酶A裂合酶，和/或编码的PksG蛋白相对生物/微生物不是内源的，即当生物/微生物没有被基因改造时不被生物/微生物天然地表达。换句话说，编码的酶，例如HMG辅酶A合酶和/或编码的C-C键切割/缩合裂合酶，例如HMG辅酶A裂合酶和/或编码的PksG蛋白对生物/微生物而言是异源的。
术语“重组”在另一个方面表示，生物在控制天然存在于生物中的、如上定义的酶的表达的调控区中被基因改造，从而导致与对应的未基因改造的生物相比，相应的酶表达的提高。下面进一步描述术语“更高表达”的意思。
可通过本领域技术人员已知的方法实现调控区的这样的改造。一个实例是用允许更高表达的启动子替换天然存在的启动子，或改造天然存在的启动子以显示更高的表达。因此，在此实施方案中，生物在编码如上定义的酶的基因的调控区中包含不天然存在于生物中的外源核酸分子，且与相应的未基因改造的生物相比，其导致酶的更高的表达。
在更优选的实施方案中，生物/微生物的特征在于，与相应的未基因改造的生物/微生物相比，在具有外源核酸分子的基因改造的生物/微生物中，所述酶，例如HMG辅酶A合酶和/或C-C键切割/缩合裂合酶，例如HMG辅酶A裂合酶，和/或PksG蛋白的表达/活性更高。“更高的”表达/活性表示，所述酶，例如HMG辅酶A合酶和/或C-C键切割/缩合裂合酶，例如HMG辅酶A裂合酶，和/或PksG蛋白的表达/活性在基因改造的生物/微生物中比在相应的未基因改造的生物/微生物中的高至少10％，优选至少20％，更优选地至少30％或50％，甚至更优选地至少70％或80％和特别优选至少90％或100％。在甚至更优选的实施方案中，表达/活性的提高可为至少150％，至少200％或至少500％。在特别优选的实施方案中，所述表达比在相应的未基因改造的生物/微生物中的高至少10倍，更优选地至少100倍和甚至更优选地至少1000倍。
术语“更高的”表达/活性也包括下述情况，其中相应的未基因改造的生物/微生物不表达相应的酶，例如HMG辅酶A合酶和/或C-C键切割/缩合裂合酶，例如HMG辅酶A裂合酶，和/或PksG蛋白，从而相应的表达/活性在未基因改造的生物/微生物中为0。
测量给定蛋白质在细胞中的表达水平的方法是本领域技术人员熟知的。在一个实施方案中，通过测量相应的蛋白质的量进行表达水平的测量。相应的方法是本领域技术人员熟知的并包括蛋白质印迹、ELISA等。在另一个实施方案中，通过测量相应的RNA的量进行表达水平的测量。相应的方法是本领域技术人员熟知的并包括Northern印迹。
分别测量上述酶，特别是HMG辅酶A合酶和/或C-C键切割/缩合裂合酶，例如HMG辅酶A裂合酶，和/或PksG蛋白的酶活性的方法是本领域已知的并已在上面描述。
如在本发明的背景下使用的术语“生物”一般指任意可能的生物种类，特别是真核生物、原核生物和古细菌。所述术语包括动物、植物、真菌、细菌和古细菌。所述术语也包括分离的细胞或这样生物的细胞团块，如组织或愈伤组织。
在一个优选的实施方案中，所述生物是微生物。术语“微生物”在本发明的背景下指原核细胞，特别是细菌，以及真菌，例如酵母，也指藻类和古细菌。在一个优选的实施方案中，所述微生物是细菌。原则上可使用任意细菌。在根据本发明的方法中使用的优选的细菌是芽孢杆菌属、梭菌属、假单胞菌属或埃希氏菌属的细菌。在特别优选的实施方案中，细菌属于埃希氏菌属和甚至更优选地属于大肠杆菌种。
在另一个优选的实施方案中，所述微生物是真菌，更优选地酵母属、裂殖酵母属、曲霉属或木霉属和甚至更优选地酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、黑曲霉种的或里氏木霉种的真菌。
在另一个优选的实施方案中，微生物是具有光合作用活性的微生物，例如能够进行光合作用的细菌或微藻类。
在特别优选的实施方案中，微生物是藻类，更优选地属于硅藻类的藻类。
在另一个优选的实施方案中，在根据本发明的方法中使用的生物是能够进行光合作用的生物，例如植物或微藻类。原则上可使用任意可能的植物，即单子叶植物或双子叶植物。优选地使用可在农业有意义的范围上培养的并允许生产大量生物量的植物。实例是草如黑麦草，谷物如黑麦、大麦、燕麦、粟、玉米、其他储存淀粉的植物如马铃薯或储存糖的植物如甘蔗或甜菜。也设想使用烟草或蔬菜植物如番茄、胡椒、黄瓜、茄子等。另一优选的实施方案是使用储存油的植物，例如油菜、橄榄等。也设想使用树，特别是快速生长的树，例如桉树、白杨或橡胶树(Heveabrasiliensis)。
本发明也涉及使用生物，优选微生物，其由以下特征表征：
(a)其能够产生丙酮；和
(b)其表达能够催化丙酮的氧(代)(即C＝O)基的碳原子和如上定义的提供活化乙酰基的化合物的甲基的相应碳原子(C2)之间形成共价键的酶，优选地具有HMG辅酶A合酶(EC2.3.3.10)活性的酶，和/或具有C-C键切割/缩合裂合酶，例如HMG辅酶A裂合酶(EC4.1.3.4)活性的酶，和/或PksG蛋白，用于产生3-羟基-3-甲基丁酸。
即，本发明也涉及根据本发明的生物/微生物在产生3-羟基-3-甲基丁酸中的用途。
本发明也涉及包含根据本发明的生物的组合物。
另外，本发明也涉及下述组合物，其包含(i)丙酮；和(ii)如上定义的提供活化乙酰基的化合物；和(iii)能够催化丙酮的氧(代)(即C＝O)基的碳原子和如上定义的提供活化乙酰基的化合物的甲基的相应碳原子(C2)之间形成共价键的酶。
有关所述酶的优选实施方案，上面已陈述的有关根据本发明的方法和生物的部分同样适用。
另外，本发明也涉及能够催化丙酮的氧(代)(即C＝0)基的碳原子和如上定义的提供活化乙酰基的化合物的甲基的相应碳原子(C2)之间形成共价键的酶在产生3-羟基-3-甲基丁酸中的用途。
有关所述酶的优选实施方案，上面已陈述的有关根据本发明的方法和生物的部分同样适用。
最后，本发明也涉及丙酮在产生3-羟基-3-甲基丁酸中的用途，其包含丙酮和如上定义的提供活化乙酰基的化合物的酶促转化。在优选的实施方案中，通过与根据本发明的方法有关的上述酶，更优选地使用具有HMG辅酶A合酶活性的酶和/或使用具有C-C键切割/缩合裂合酶，例如HMG辅酶A裂合酶，和/或PksG蛋白活性的酶实现酶促转化，和最优选地通过使用根据本发明的生物实现转化。
图1：3-羟基-3-甲基丁酸(又称作β-羟基异戊酸)的化学结构
图2：由HMG辅酶A合酶催化的反应的反应历程
图3：由HMG辅酶A裂合酶催化的反应的反应历程
图4：包括由PksG蛋白催化的反应的pksX途径的反应的反应历程
图5：丙酮和包含活化乙酰基的化合物转化为3-羟基-3-甲基丁酸的反应的反应历程
X代表S-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-CH(OH)-C(CH3)2-CH2-O-PO2H-O-PO2H-C10H13N5O7P(辅酶A),S-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-CH(OH)-C{CH3)2-CH2-0-P02H-polypeptide(酰基载体蛋白),S-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-CH(OH)-C(CH3)2-CH2-OH(泛酰巯基乙胺)，S-CH2-CH2-NH-CO-CH3(N-乙酰-半胱胺)，S-CH3(甲硫醇)，S-CH2-CH(NH2)-CO2H(半胱氨酸)，S-CH2-CH2-CH(NH2)-CO2H(同型半胱氨酸)，S-CH2-CH(NH-C5H8NO3)-CO-NH-CH2-CO2H(谷胱甘肽)，S-CH2-CH2-SO3H(辅酶M)和OH(醋酸)。
图6：市售的3-羟基-3-甲基丁酸的质谱
图7：在来自原鸡的Hmg辅酶A合酶(P23228)的存在下从乙酰辅酶A和丙酮形成的3-羟基-3-甲基丁酸的质谱
图8：没有酶的对照测定的质谱
图9：用在实施例7中描述的使用表皮葡萄球菌的HMG辅酶A合酶的反应的Michaelis-Menten图
以下实施例用于说明本发明。
实施例1
用于创建HMG辅酶A合酶和HMG辅酶A裂合酶数据库的生物信息学方法
选择12种HMG辅酶A合酶和8种HMG辅酶A裂合酶的组以创建用于代表在真核生物中发现的这些酶种类的多样性的蛋白质的非冗余集合。通过在通用蛋白质资源数据库(UniversalProteinResourceDatabase)Uniprot(http://www.uniprot.org/)上进行基于多重序列和基于文本的检索鉴定这些蛋白质。它们都包含独特的特征，例如目的酶种类特有的保守蛋白质结构域和基序。为了有效覆盖序列多样性但不必筛选大量蛋白质，通过用超过85％的同源性将它们分组为序列簇和然后选择每个簇的代表性单个候选序列缩小酶的初始库。来自HMG辅酶A合酶组和裂合酶组的任意两种蛋白质之间的蛋白质序列同一性的范围分别为30％-80％和50％-80％。
应用相同的方法从原核生物中选择HMG辅酶A合酶和HMG辅酶A裂合酶。创建的集合包含50种与HMG辅酶A合酶同源的蛋白质(包括pksG蛋白)，和59种与HMG辅酶A裂合酶同源的蛋白质。
实施例2
HMG辅酶A裂合酶和HMG辅酶A合酶集合的克隆、表达和纯化
基因克隆：
对编码来自真核生物的HMG辅酶A合酶和裂合酶的核酸序列进行针对大肠杆菌密码子偏好的优化，并通过化学合成(GeneArt)得到基因。
从不同来源的基因组DNA中通过常规重组技术克隆编码来自原核生物的HMG辅酶A合酶和裂合酶的基因。然后将这些基因分别***包含His标签的用于真核和原核生物的pET25b和pET22b载体(Novagen)。
在大肠杆菌中的过表达：
将质粒经电穿孔引入大肠杆菌BL21细菌(Novagen)，然后在包含氨苄青霉素的LB琼脂培养皿上铺开。在30℃下在包含0.5M山梨醇，5mM甜菜碱，100μg/ml氨苄青霉素的TB培养基中在适度摇晃下培养培养物。当OD(600nm)达到0.8时，加入IPTG至1mM的终浓度，并在20℃下在适度摇晃下进行表达，持续16小时。然后通过在4℃，10,000rpm离心20分钟收获细菌细胞并冷冻于-80℃。
细胞提取物的制备：
通过在5ml包含300mMNaCI，5mMMgCl2，1mMDTTpH8的50mMNa2HPO4缓冲液中重悬1.6克细胞沉淀制备细胞提取物。然后对制备物加入20μllysonase(Novagen)，将其在室温孵育10分钟和在冰上孵育20分钟。通过在冰上的超声波水浴中的3次5分钟的超声处理和在每次脉冲之间均化提取物得到细胞裂解物。然后通过在4℃，10,000rpm离心20分钟澄清粗提取物。
蛋白质纯化：
将澄清的上清加载至能够特异性固定携带6个组氨酸尾部的蛋白质的PROTINO-1000Ni-IDA柱(Macherey-Nagel)。洗涤柱，并用4ml包含300mMNaCI，5mMMgCl2，1mMDTT，250mM咪唑pH8的50mMNa2HPO4缓冲液洗脱酶。然后浓缩包含酶的组分并在AmiconUltra-410kDa过滤装置(Millipore)上脱盐，并重悬于250μl包含0.5mMDTT的40mMTris-HClpH8中。通过Bradford法测定蛋白质浓度。
纯化的酶的同质性从20％到75％不等。
实施例3
使用天然底物乙酰乙酰辅酶A和乙酰辅酶A测量HMG辅酶A合酶的活性
根据Clinkenbeard等人(J.Biol.Chem.250(1975)，3108-3116)测量HMG辅酶A合酶的活性。用于HMG辅酶A合酶的标准测定介质混合物在1ml的总体积中包含40mMTris-HClpH8，1mMMgCl2，100μM乙酰乙酰辅酶A，200μM乙酰辅酶A，0.5mMDTT。在缺乏MgCl2的情况下测定线粒体HMG辅酶A合酶，以避免观察到的对此酶的抑制(Reed等人，J.Biol.Chem.250(1975)，3117-3123)。通过加入0.02mg/mL酶起始反应。
在缺乏酶的情况下进行对照测定。通过监控伴随乙酰辅酶A依赖的乙酰乙酰辅酶A烯醇化物形式的消失的在303nm处的吸光度的减少测量HMG辅酶A合酶活性。考虑到乙酰乙酰辅酶A的非特异性消除，从试验样品得到的结果中扣除在缺乏酶的对照测定中得到的结果。在测定条件下对乙酰乙酰辅酶A的表观吸收系数为5600M-1。
表1：一些纯化的HMG辅酶A合酶或与HMG辅酶A合酶同源的酶的生理活性
实施例4
使用天然底物HMG辅酶A测量HMG辅酶A裂合酶的活性
根据MellanbyJ等人(MethodsofEnzymaticAnalysis；BergmeyerEd.(1963)，454-458)测量HMG辅酶A裂合酶的活性。在加入0.005mg/mlHMG辅酶A裂合酶之前，孵育5分钟包含40mMTris-HClpH8，1mMMgCl2，0.5mMDTT，0.4mMHMG辅酶A，0.2mMNADH，5单位3-羟基丁酸脱氢酶的完全反应混合物(1ml)，然后通过在340nm处的吸光度的减少监控反应进展。在缺乏酶的情况下进行对照测定。
考虑到NADH的非特异性消除，从试验样品得到的结果中扣除在缺乏酶的对照测定中得到的结果。以Δμmol/分钟·mg蛋白质为单位计算比活。
表2：一些纯化的HMG辅酶A裂合酶的生理活性
实施例5
3-羟基-3-甲基丁酸的产生
用于3-羟基-3-甲基丁酸合成的完全反应包含40mMTris-HClpH8，5至50mM乙酰辅酶A，100至500mM丙酮，1MgCl2(除了用于HMG辅酶A合酶以外)，0.5mMDTT和范围从0.2至8mg/ml变化的酶。在缺乏酶和一种底物的情况下进行对照反应。
通过分析在30或37℃下孵育渐增时间后取出的等分试样跟踪合成的进展。一般在孵育48小时后移取50μl等分试样，在100℃加热1分钟以消除蛋白质，离心并将上清转移至干净的小瓶用于通过质谱检测HIV。在40mMTris-HClpH8，1mMMgCl2，0.5mMDTT中制备3-羟基-3-甲基丁酸溶液，如上述加热并用作参考。
在PESCIEXAPI2000三重四极杆质谱仪上以阴离子模式用H2O/乙腈＝60/40(含0.1％三乙胺)作为流动相分析样品，流速为40μl/分钟。10μl每种上清与等量的流动相混合并直接注入质谱。监控[3-羟基-3-甲基丁酸-H]-离子的存在。观察以下酶的对应3-羟基-3-甲基丁酸的峰：德国小蠊(德国蟑螂)P54961(SEQIDNO：6)
原鸡(鸡)P23228(SEQIDNO：7)
智人(人)Q01581(SEQIDNO：8)
拟南芥P54873(CAA58763)(SEQIDNO：4)
秀丽隐杆线虫P54871(SEQIDNO：1)
粟酒裂殖酵母(裂殖酵母)P54874(SEQIDNO：2)
酿酒酵母(面包酵母)P54839(SEQIDNO：3)
盘基网柄菌(粘液菌)Q86HL5(SEQIDNO：10)
肠膜状明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)Q03WZ0(SEQIDNO：)
表皮葡萄球菌Q8CN06(SEQIDNO：11)
德氏乳杆菌Q1GAH5(SEQIDNO：24)
溶血葡萄球菌Q4L958(相比野生型蛋白质，具有I98＞V差异)(SEQIDNO：25)
图6-8显示了市售的3-羟基-3-甲基丁酸，使用来自原鸡的HMG辅酶A合酶(P23228)的反应和不含酶的对照测定的代表性结果。
实施例6
使用裂合酶产生3-羟基-3-甲基丁酰辅酶A
在放射性标记的[2-14C]丙酮的存在下进行3-羟基-3-甲基丁酰辅酶A的合成。用于3-羟基-3-甲基丁酰辅酶A合成的完全反应包含40mMTris-HClpH8，5至50mM乙酰辅酶A，100至500mM丙酮，1至10mMMgCl2，0.5mMDTT和范围从0.5至7mg/ml变化的酶。在通过TLC或HPLC分离反应混合物后分析产物的形成。
也通过TLC法分析3-羟基-3-甲基丁酰辅酶A(StadtmanE.R.，J.Biol.Chem.196(1952)，535-546)。将等分试样的反应物置于纤维素板上并在以下溶剂***中层析：乙醇/0.1M醋酸钠pH4.5(1/1)。使用辅酶A和乙酰辅酶A作为内标。报导的3-羟基-3-甲基丁酰辅酶A的Rf为0.88。
实施例7
在HMG合酶的情况下，乙酰辅酶A和丙酮之间的酶促反应的动力学参数
使用可变浓度的丙酮和恒定浓度的乙酰辅酶A(10mM)在以下条件下测量动力学参数：
40mMTris-HClpH8
2mMMgCl2
0-1M丙酮
最终pH被调节为8。
通过对1ml反应混合物加入3mg纯化的酶起始反应。然后在37℃下孵育混合物40小时，不加摇晃。
3-羟基-3-甲基丁酸产生的分析
应用导致3-羟基-3-甲基丁酸分解为异丁烯的热化学条件(Pressman等人，JACS，1940，2069-2080)：首先使用6NHCl将反应混合物的pH调节为pH4，然后将样品转移至气相层析瓶(Interchim)。密封瓶并在110℃孵育4小时，从而导致3-羟基-3-甲基丁酸分解为异丁烯。
使用市售的3-羟基-3-甲基丁酸在相同的条件下制备校准曲线。
收集1ml顶部空气并注入装备有FID检测器和CPSilicaPlot柱(Varian)的HP5890气相层析仪(HP)。使用市售的异丁烯作为参考。从异丁烯信号中计算样品中最初存在的3-羟基-3-甲基丁酸的量。
若干被研究的HMG辅酶A合酶的动力学参数显示在下表中。
对来自表皮葡萄球菌的酶，图9显示了相应的Michaelis-Menten图。

Claims (5)

1.一种产生3-羟基-3-甲基丁酸的方法，其包括丙酮和由以下通式(I)表征的提供活化乙酰基的化合物的酶促转化：
其中，X是
S-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-CH(OH)-C(CH3)2-CH2-O-PO2H-O-PO2H-C10H13N5O7P(辅酶A)，
所述转化使用一种酶，其能够催化丙酮的氧代(即C＝O)基的碳原子和所述根据通式(I)的提供活化乙酰基的化合物的甲基的相应碳原子(C2)之间形成共价键，且其中所述酶是具有HMG辅酶A合酶(EC2.3.3.10)活性的酶。
2.权利要求1的方法，其特征在于在能够产生丙酮和表达如权利要求1定义的酶的生物的存在下实现所述转化。
3.一种组合物，其包含
(i)丙酮；和
(ii)由以下通式(I)表征的提供活化乙酰基的化合物：
其中，X是
S-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-CH(OH)-C(CH3)2-CH2-O-PO2H-O-PO2H-C10H13N5O7P(辅酶A)；和
(iii)能够催化丙酮的氧代(即C＝O)基的碳原子和(ii)中定义的所述化合物的甲基的相应碳原子(C2)之间形成共价键的酶，其中所述酶是具有HMG辅酶A合酶(EC2.3.3.10)酶促活性的酶。
4.如权利要求1中定义的酶在产生3-羟基-3-甲基丁酸中的用途，其中包括丙酮和由以下通式(I)表征的提供活化乙酰基的化合物的酶促转化：
其中，X是
S-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-CH(OH)-C(CH3)2-CH2-O-PO2H-O-PO2H-C10H13N5O7P(辅酶A)，其中所述酶促转化通过具有HMG辅酶A合酶(EC2.3.3.10)酶促活性的酶实现。
5.丙酮在产生3-羟基-3-甲基丁酸中的用途，其中包括丙酮和由以下通式(I)表征的提供活化乙酰基的化合物的酶促转化：
其中，X是
S-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-CH(OH)-C(CH3)2-CH2-O-PO2H-O-PO2H-C10H13N5O7P(辅酶A)，其中所述酶促转化通过具有HMG辅酶A合酶(EC2.3.3.10)酶促活性的酶实现。
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