JP2002062261A - 光学装置および顕微鏡 - Google Patents

光学装置および顕微鏡

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JP2002062261A JP2000249320A JP2000249320A JP2002062261A JP 2002062261 A JP2002062261 A JP 2002062261A JP 2000249320 A JP2000249320 A JP 2000249320A JP 2000249320 A JP2000249320 A JP 2000249320A JP 2002062261 A JP2002062261 A JP 2002062261A
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慶記 池滝
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 簡単な構成で、結像性能の良好な超解像性を
容易に発現できる光学装置および顕微鏡を提供する。 【解決手段】 波長の異なる複数の光を発生する光源手
段（２，３，４，６，８）と、上記複数の光を対象１に
集光する集光手段１３と、上記対象１から発せられる光
を検出する発光検出手段１７とを有し、上記光源手段か
ら発生する波長の異なる複数の光のうち、少なくとも１
つの光はマルチ空間モードの集光パターンが形成される
光として、これら複数の光を上記集光手段１３により上
記マルチ空間モードの集光パターンの一部領域のみが他
の光の集光パターンと空間的に重ね合わされるように上
記対象１に集光させるよう構成する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、光学装置および顕
微鏡に関するもので、より詳しくは、異なる２波長の光
を用いる超解像の蛍光顕微鏡のような顕微分光装置にお
いて、２波長の光の波面を操作して試料面に集光させる
ことにより、検出感度および空間分解能の向上を図った
顕微分光装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】光学顕微鏡の技術は古く、種々のタイプ
の顕微鏡が開発されてきた。また、近年では、レーザー
技術および電子画像技術をはじめとする周辺技術の進歩
により、更に高機能の顕微鏡システムが開発されてい
る。
【０００３】このような背景の中、例えば特開平８−１
８４５５２号公報において、複数波長の光で試料を照明
することにより発する二重共鳴吸収過程を用いて、得ら
れる画像のコントラストの制御のみならず化学分析も可
能にした高機能な顕微鏡が提案されている。
【０００４】この顕微鏡は、二重共鳴吸収を用いて特定
の分子を選択し、特定の光学遷移に起因する吸収および
蛍光を観測するもので、その原理を図９〜図１７を参照
して説明する。図９は、試料を構成する分子の価電子軌
道の電子構造を示すもので、先ず、図９に示す基底（Ｓ
０）の分子がもつ価電子軌道の電子を光により励起して
図１０に示す第１励起状態（Ｓ１状態）とする。次に、
別な波長の光により同様に励起して図１１に示す第２励
起状態（Ｓ２状態）とする。この励起状態により、分子
は蛍光あるいは燐光を発光したりして、図１２に示すよ
うに基底状態に戻る。
【０００５】二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、
図１０の吸収過程や図１１の蛍光や燐光の発光を用い
て、吸収像や発光像を観察する。この顕微鏡法では、ま
ず最初にレーザー光等により共鳴波長λ１の光で図１０
のように試料を構成する分子をＳ１状態に励起させる
が、この際、単位体積内でのＳ１状態の分子数は、照射
する光の強度が増加するに従って増加する。
【０００６】ここで、線吸収係数は、分子一個当りの吸
収断面積と単位体積当たりの分子数との積で与えられる
ので、図１１のような励起過程においては、続いて照射
する共鳴波長λ２に対する線吸収係数は、最初に照射し
た波長λ１の光の強度に依存することになる。すなわ
ち、波長λ２に対する線吸収係数は、波長λ１の光の強
度で制御できることになる。このことは、波長λおよび
波長λ２の２波長の光で試料を照射し、波長λ２による
透過像を撮影すれば、透過像のコントラストは波長λ１
の光で完全に制御できることを示している。
【０００７】また、図１１の励起状態での蛍光または燐
光による脱励起過程が可能である場合には、その発光強
度はＳ１状態にある分子数に比例する。したがって、蛍
光顕微鏡として利用する場合にも画像コントラストの制
御が可能となる。
【０００８】さらに、二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡
法では、上記の画像コントラストの制御のみならず、化
学分析も可能にする。すなわち、図９に示される最外殻
価電子軌道は、各々の分子に固有なエネルギー準位を持
つので、波長λ１は分子によって異なることになり、同
時に、波長λ２も分子固有のものとなる。
【０００９】ここで、従来の単一波長で照明する場合で
も、ある程度特定の分子の吸収像あるいは蛍光像を観察
することが可能であるが、一般にはいくつかの分子の吸
収帯の波長領域は重複するので、試料の化学組成の正確
な同定までは不可能である。
【００１０】これに対し、二重共鳴吸収過程を用いた顕
微鏡法では、波長λ１および波長λ２の２波長により吸
収あるいは発光する分子を限定するので、従来法よりも
正確な試料の化学組成の同定が可能となる。また、価電
子を励起する場合、分子軸に対して特定の電場ベクトル
をもつ光のみが強く吸収されるので、波長λ１および波
長λ２の偏光方向を決めて吸収または蛍光像を撮影すれ
ば、同じ分子でも配向方向の同定まで可能となる。
【００１１】また、最近では、例えば特開平１０−１４
２１５１号公報に開示されているように、二重共鳴吸収
過程を用いて回折限界を越える高い空間分解能をもつ蛍
光顕微鏡も提案されている。図１３は、やはり分子にお
ける二重共鳴吸収過程の概念図で、基底状態Ｓ０の分子
が、波長λ１の光で第１励起状態であるＳ１に励起さ
れ、更に波長λ２の光で第２励起状態であるＳ２に励起
されている様子を示していると共に、Ｓ２からの蛍光が
極めて弱い場合を示している。
【００１２】図１３に示すような光学的性質を持つ分子
の場合には、極めて興味深い現象が起きる。図１４は、
図１３と同じく二重共鳴吸収過程の概念図で、横軸のＸ
軸は空間的距離の広がりを表わし、波長λ２の光を照射
した空間領域Ａ１と波長λ２の光が照射されない空間領
域Ａ０とを示している。
【００１３】図１４において、空間領域Ａ０では波長λ
１の光の励起によりＳ１状態の分子が多数生成され、そ
の際に空間領域Ａ０からは波長λ３で発光する蛍光が見
られる。しかし、空間領域Ａ１では、波長λ２の光を照
射したため、Ｓ１状態の分子のほとんどが即座に高位の
Ｓ２状態に励起されて、Ｓ１状態の分子は存在しなくな
る。このような現象は、幾つかの分子により確認されて
いる。これにより、波長λ３の蛍光は完全になくなり、
しかも、Ｓ２状態からの蛍光はもともとないので、Ａ１
領域では蛍光自体が完全に抑制されることになる。した
がって、空間領域で蛍光があるのは、Ａ０領域のみとな
る。
【００１４】この結果は、顕微鏡の応用分野から考察す
ると、極めて重要な意味をもつものである。すなわち、
従来の走査型レーザー顕微鏡等では、レーザー光を集光
レンズによりマイクロビームに集光して観察試料上を走
査するが、その際のマイクロビームのサイズは、集光レ
ンズの開口数と波長とで決まる回折限界となり、原理的
にそれ以上の空間分解能は期待できない。
【００１５】ところが、図１４の場合には、波長λ１と
λ２との２種類の光を空間的に上手く重ね合わせて、波
長λ２の光の照射により蛍光領域を抑制することで、例
えば波長λ１の光の照射領域に着目すると、蛍光領域が
集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界よりも狭
くでき、実質的に空間分解能を向上させることが可能と
なる。したがって、この原理を利用することで、回折限
界を越える二重共鳴吸収過程を用いた超解像顕微鏡、例
えば蛍光顕微鏡が可能となる。
【００１６】さらに、本発明者は、顕微鏡の超解像性を
高めるための新たな工夫も既に提案している。すなわ
ち、超解像顕微鏡の機能を十分に活かすための蛍光ラベ
ラー分子や、利用する波長λ１およびλ２の２つの光の
試料への照射タイミング等の提案である。この提案で
は、少なくとも基底状態を含め３つの量子状態を有して
いて、第１励起状態をのぞく高位のエネルギー状態から
基底状態へ脱励起するときの遷移が蛍光による緩和過程
よりも熱緩和過程が支配的である各種分子が染色する蛍
光プローブ分子と、生化学的な染色技術を施した生体分
子とを化学結合させた試料を、染色する分子を波長λ１
の光でＳ１状態に励起し、続いて波長λ２の光により即
座に高位の量子準位に励起することで、Ｓ１状態からの
蛍光を抑制するものである。このように、分子の光学的
性質を利用し、空間的な蛍光領域を人為的に抑制するこ
とで、空間分解能の向上をはかるものである。
【００１７】このような分子の光学的性質は、量子化学
的な立場から説明することができる。すなわち、一般
に、分子はそれを構成する各原子がσまたはπ結合によ
って結ばれている。言い換えると、分子の分子軌道は、
σ分子軌道またはπ分子軌道を有していて、これらの分
子軌道に存在する電子が各原子を結合する重要な役割を
担っている。そのうちでも、σ分子軌道の電子は各原子
を強く結合し、分子の骨格である分子内の原子間距離を
決めている。それに対して、π分子軌道の電子は各原子
の結合にほとんど寄与しないで、むしろ分子全体に極め
て弱い力で束縛されている。
【００１８】多くの場合、σ分子軌道にいる電子を光で
励起すると、分子の原子間隔が大きく変化し、分子の解
離を含む大きな構造変化が起こる。その結果として、原
子の運動エネルギーや、構造変化のために光が分子に与
えたエネルギーのほとんどが熱エネルギーに変化する。
したがって、励起エネルギーは蛍光という光の形態では
消費されない。また、分子の構造変化は極めて高速（ps
ecより短い）に起こるので、その過程で仮に蛍光が起き
てもその寿命が極めて短い。
【００１９】それに対し、π分子軌道の電子は、励起し
ても分子の構造自体はほとんど変化せず、高位の量子的
な離散順位に長時間とどまり、nsecのオーダで蛍光を放
出して脱励起する性質を有している。
【００２０】量子化学によれば、分子がπ分子軌道をも
つことと、二重結合をもつこととは同等であり、用いる
蛍光ラベラー分子には、二重結合を豊富にもつ分子を選
定することが必要条件となる。このことは、二重結合を
もつ分子でもベンゼンやピラジン等の６員環分子におい
ては、Ｓ２励起状態からの蛍光が極めて弱いことが確か
められている（例えば、M.Fujii et.al.Chem.Phys.Let
t.171(1990)341）。
【００２１】したがって、ベンゼンやピラジン等の6員
環分子を含む分子を蛍光ラベラー分子として選定すれ
ば、Ｓ１状態からの蛍光寿命が長く、しかも光励起によ
りＳ１状態からＳ２状態に励起することで、分子からの
蛍光を容易に抑制できるので、超解像性を効果的に利用
することができる。すなわち、これら蛍光ラベラー分子
により染色して観察を行えば、高空間分解能で試料の蛍
光像を観察することができるのみならず、その分子の側
鎖の化学基を調整することにより、生体試料の特定の化
学組織のみ選択的に染色できるので、試料の詳細な化学
組成までも分析可能となる。
【００２２】また、一般に、２重共鳴吸収過程は２つ光
の波長や偏光状態等が特定の条件を満たすときにのみ起
こるので、これを用いることで分子の構造を非常に詳細
に知ることができる。すなわち、光の偏光方向と分子の
配向方向とは強い相関関係があり、２つ波長の光のそれ
それの偏光方向と分子の配向方向とが特定の角度をなす
とき、２重共鳴吸収過程が強く起こる。したがって、２
つ波長の光を試料に同時に照射して、それそれの光りの
偏光方向を回転することにより、蛍光の消失の程度が変
化するので、その様子から観測しようとする組織の空間
配向の情報も得ることができる。このことは、２つ波長
の光を調整することでも可能である。
【００２３】以上のように、本発明者による先の提案に
よると、超解像性以外にも、高い分析能力を有している
ことがわかる。さらに、波長λ１とλ２との２つの光の
照射タイミングを工夫することで、Ｓ／Ｎを改善し、か
つ蛍光抑制を効果的に起こすことができ、超解像性をよ
り効果的に発現することが可能となる。
【００２４】図１５は、上述した本発明者の先の提案に
係る超解像顕微鏡の一例の構成を示すものである。この
超解像顕微鏡では、Ｎｄ：ＹＡＧレーザー５１からのレ
ーザー光をハーフミラー５２で２分し、その一方を３倍
波発生器５３を経てダイクロイックミラー５４に入射さ
せ、他方をミラー５５、ラマンシフタ５６、ミラー５７
および位相板５８を経てダイクロイックミラー５４に入
射させて、３倍波発生器５３からのレーザー光と、位相
板５８を透過したレーザー光とをダイクロイックミラー
５４で空間的に重ね合わせ、その重ね合わせたレーザー
光を、コンデンサレンズ５９、ピンホール６０、ダイク
ロイックミラー６１および対物レンズ６２を経て、移動
ステージ６３上でカバーガラス６４により保持された試
料６５に集光させている。なお、位相板５８は、図１６
に示すように、光軸に対して点対称な位置で位相差πを
与えるように形成されており、試料６５は、予め蛍光ラ
ベラー分子で染色されている。
【００２５】また、試料６５から発する蛍光は、対物レ
ンズ６２を経てダイクロイックミラー６１により往路と
分離し、ピンホール６６、シャープカットフィルタ６
７、バンドパスフィルタ６８およびノッチフィルタ６９
を経てフォトマル７０で受光している。なお、シャープ
カットフィルタ６７、バンドパスフィルタ６８、ノッチ
フィルタ６９およびフォトマル７０は、遮光ボックス７
１に収容し、この遮光ボックス７１にピンホール６６を
形成している。
【００２６】図１５に示す超解像顕微鏡は、３倍波発生
器５３からのレーザー光を、蛍光ラベラー分子をＳ０状
態からＳ１状態へ励起するポンプ光とし、ラマンシフタ
５６からのレーザー光をＳ１状態からＳ２状態へ励起す
るイレース光として、このイレース光を位相板５８で中
空ビーム化してダイクロイックミラー５４でポンプ光と
空間的に重ね合わせ、これにより試料６５上でイレース
光の強度がゼロとなる光軸近傍以外の蛍光を抑制して、
結果的にポンプ光の広がりより狭い領域に存在する蛍光
ラベラー分子のみを超解像で観察するものである。
【００２７】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、本発明
者による種々の実験検討によると、上述した各種の超解
像顕微鏡には、結像性能の点で更に改良すべき点がある
ことが判明した。例えば、図１５に示した超解像顕微鏡
では、イレース光を図１６に示した位相板５８を通すこ
とにより中空ビーム化してポンプ光と空間的に重ね合わ
せ、これにより試料６５上でイレース光の強度がゼロと
なる光軸近傍以外の蛍光を抑制するので、理論上は非常
にエレガントな方法であるが、実際には、イレース光の
中央部の強度を完全にゼロにするのは困難である。
【００２８】その理由は、位相板５８を設計値通りに理
想的に加工することができないために、ビーム光軸に対
して点対称な位置で位相差πを与えることができず、電
場強度を完全には相殺できないためである。このため、
ビーム光軸に対して点対称な位置にある光波のうち、相
殺されない分が光軸上に残留し、しかもビーム光軸を中
心とする全方位角２πの成分の光波に対して相殺されな
い残留分が光軸上に堆積し、結果として図１７に示すよ
うに、ビーム光軸中央でも無視できない電場強度が発生
することになる。
【００２９】したがって、このような状態で、ポンプ光
とイレース光とを試料面で重複させ、蛍光抑制現象を利
用して超解像性を発現させようとしても、ポンプ光中心
部での蛍光強度が低下し、結果として超解像性が弱くな
り、むしろ蛍光信号の全体量の低下による弊害が目立つ
ようなる。
【００３０】本発明は、かかる点に鑑みてなされたもの
で、簡単な構成で、結像性能の良好な超解像性を容易に
発現できる光学装置および顕微鏡を提供することを目的
とするものである。
【００３１】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成する請求
項１に係る光学装置の発明は、波長の異なる複数の光を
発生する光源手段と、上記複数の光を対象に集光する集
光手段と、上記対象から発せられる光を検出する発光検
出手段とを有し、上記光源手段から発生する波長の異な
る複数の光のうち、少なくとも１つの光はマルチ空間モ
ードの集光パターンが形成される光として、これら複数
の光を上記集光手段により上記マルチ空間モードの集光
パターンの一部領域のみが他の光の集光パターンと空間
的に重ね合わされるように上記対象に集光させるよう構
成したことを特徴とするものである。
【００３２】請求項２に係る顕微鏡の発明は、少なくと
も基底状態を含め３つの電子状態を有する分子で染色し
た試料を観察する顕微鏡であって、上記分子を基底状態
から第１の励起状態へ遷移させる波長λ１の第１の光を
発生する第１の光源と、上記分子を上記第１の励起状態
から、よりエネルギー準位の高い第２の励起状態へ遷移
させる波長λ２の第２の光を発生させる第２の光源と、
上記第１の光および第２の光を上記試料に集光させる集
光光学系と、上記分子からの発光を検出する発光検出器
とを有し、上記第１の光源から上記第１の光としてマル
チ空間モードの集光パターンが形成される光を発生さ
せ、上記集光光学系により上記第１の光の集光パターン
の一部領域のみが上記第２の光の集光パターンと空間的
に重ね合わされるように上記試料に集光させるよう構成
したことを特徴とするものである。
【００３３】請求項３に係る発明は、請求項２に記載の
顕微鏡において、上記第１の光源および第２の光源がコ
ヒーレント光源であることを特徴とするものである。
【００３４】請求項４に係る発明は、請求項３に記載の
顕微鏡において、上記波長λ１の第１の光の波面に位相
分布をもたせる位相分布発生素子を有することを特徴と
するものである。
【００３５】請求項５に係る発明は、請求項４に記載の
顕微鏡において、上記位相分布発生素子は、波面がゼロ
またはπの位相差をもつ複数の分割された領域を有する
ことを特徴とするものである。
【００３６】請求項６に係る発明は、請求項５に記載の
顕微鏡において、上記分割された領域は、隣接する領域
とπの位相差をもつことを特徴とするものである。
【００３７】請求項７に係る発明は、請求項２から６の
いずれか一つに記載の顕微鏡において、上記第２の光
も、マルチ空間モードの集光パターンを有することを特
徴とするものである。
【００３８】すなわち、本発明では、ポンプ光および／
またはイレース光の集光ビームパターンをマルチモード
化して空間的に複数の区域に分割し、これらのビームを
試料集光面上で空間的に一部重複させて、ポンプ光の１
部の分割区域からの蛍光を抑制し、これによりポンプ光
の回折限界のサイズよりも微小な空間領域からの蛍光信
号の検出を可能にするものである。
【００３９】一般に、レーザー光源のように波面が揃っ
た光ビームを、２次元的な位相分布をもつ位相フィルタ
に通すと、任意の空間モードを持った集光ビームが形成
される。これは、光情報技術の分野では既に実用化され
ている技術である（例えば、T.M.Turpin et.al.Rroc.SP
IE,3073(1997)178-184)。
【００４０】例えば、図１に示すように、ポンプ光を集
光ビーム内をマルチモード化して２つに分割する。同様
に、イレース光も２つに分割する。この二つのビーム
を、１分割領域のみを重ね合わせると、その部分からの
蛍光は完全に抑制され、分解能を倍に向上したことにな
る。
【００４１】また、この他にも図２に示すように３分割
する方法もあり、高次のモードを生成するに従い空間分
解能も向上する。さらに、図３に示すように２次元的な
高次の空間モードもつポンプ光を形成し、イレース光の
空間パターンは輪帯状にして、空間分割されたポンプ光
の１分割領域を残し、それ以外の領域をイレース光の照
射領域と重複させて蛍光を消去する方法も可能である。
【００４２】このように、ポンプ光またはイレース光の
集光ビームパターンをマルチモード化して空間的に複数
の区域に分割することは、既存技術を用いることで複数
の方法が可能であり、基本的には、波面の揃ったコヒー
レント光を用いて、波面走査することにより行なうこと
ができる。
【００４３】その一つは、位相板を用いる方法で、図１
〜図３に示したように、レーザー光の波面を光軸と直交
する平面内で位相差が０かπ異なる領域を適当に配置し
てやればよい。また、ポンプ光を２分割する場合には、
瞳面を左右半分の２領域に分けて、ポンプ光またはイレ
ース光の位相差が互いにπ異なるようにすればよい。こ
のようにしてビームを集光すれば、２領域の境界面で電
場強度の符号が反転して、結果として電場がゼロとな
り、集光ビームは２つのピークをもつ形状になる。同様
に、瞳面を３領域に分け、隣接する領域の位相差が互い
にπ異なるようにすれば、図２に示したように、集光ビ
ームは３つのピークをもつ形状になる。
【００４４】なお、上記の位相差を与えるには、光学研
磨されたガラス基板の上に、例えばフッ化マグネシウム
のような高屈折率の光学薄膜を蒸著したり、直接、ガラ
ス基板をケミカルエッチングする等の方法により可能で
ある。その他、光源であるレーサ自体が、空間的にマル
チモード化したビームを発生するものを用いることでも
可能である。すなわち、レーザー共振器の境界条件を選
ぶことにより、ビーム断面で縦がｎ、横がｍのｎ×ｍの
複数のピークを持つモードパターンの光を発振させるこ
とができる。これは、いわゆるＴＥＭモードと呼ばれる
もので、図４（ａ），（ｂ）および（ｃ）に代表的な低
次のＴＥＭモードの三つのパターンを示す（オーム社：
新世代工学シリーズ「レーザー工学」１999年、中井貞
雄著）。このように、レーザー自身が空間的にマルチモ
ード化したビームを発振する場合には、位相板を用いる
ことなく超解像を実現することができるので、簡潔な顕
微鏡システムの構成が可能となる。
【００４５】
【発明の実施の形態】以下、本発明の一実施の形態につ
いて、図５〜図８を参照して説明する。図５は顕微鏡の
一例の構成を示す図である。本実施の形態では、蛍光色
素ローダミン６Ｇで染色した生物試料１を観察する。ロ
ーダミン６Ｇは、図６および表１に示す光学特性を有す
るので、光源２としては、レーザー媒体がＮｄ：ＹＡＧ
からなり、３０ｐｓｅｃ程度のパルス幅のレーザー光
（基本波長：１０６４ｎｍ）を出射するＮｄ：ＹＡＧピ
コ秒レーザーを用い、このレーザー光を倍波した波長５
３２ｎｍの光をポンプ光として用い、ラマン結晶で波長
変換した２次のストークス光に対応する波長５９９ｎｍ
の光をイレース光として用いる。本実施の形態では、ポ
ンプ光およびイレース光をそれぞれ２分割した１×２の
空間モードとして、図１に示したように、試料１上でポ
ンプ光とイレース光とを一部空間的にオーバーラップさ
せて集光させる。
【００４６】
【表１】
【００４７】図５において、Ｎｄ：ＹＡＧピコ秒レーザ
ー２からの出射光は、ビームスプリッタ３で２本のビー
ムに分岐し、その一方のビームをＫＤＰ結晶４により２
倍の波長５３２ｎｍのビームに変換してポンプ光とし、
他方のビームはミラー５で反射させた後、酸化バリウム
結晶Ｂａ（ＮＯ３）２からなるラマンシフタ６により波
長５９９ｎｍのビームに変換してイレース光とする。
【００４８】ＫＤＰ結晶４から出射されるポンプ光は、
位相板７を通過させることにより、１×２で空間的にマ
ルチモード化してダイクロイックミラー８に入射させ
る。位相板７は、図７に示すように、光学研磨した石英
ガラス基板をケミカルエッチングし、そのエッチング深
さにより波長５３２ｎｍのポンプ光に対して隣接する２
領域でπだけの位相差を与えるように構成して、ポンプ
光を空間的にマルチモード化したビームに変形する。
【００４９】同様に、ラマンシフタ６から出射されるイ
レース光も、位相板９を通過させることにより１×２で
空間的にマルチモード化し、そのイレース光をミラー１
０を経てダイクロイックミラー８に入射させる。位相板
９は、図８に示すように、位相板７と同様、光学研磨し
た石英ガラス基板をケミカルエッチングし、そのエッチ
ング深さを波長５９９ｎｍのイレース光に調整すること
により、イレース光を空間的にマルチモード化したビー
ムに変形する。
【００５０】ダイクロイックミラー８では、ポンプ光と
イレース光とをコンバインし、そのコンバインしたビー
ムをリレーレンズ１１およびハーフミラー１２を経て対
物レンズ１３により、サンプルステージ１４に載置され
た試料１上に集光させる。
【００５１】ここで、試料１上に集光されるポンプ光お
よびイレース光は、図１に示した位置関係となり、１×
２で空間的にマルチモード化されたポンプ光の半分が、
イレース光と空間的に重複し、その重複部分は蛍光が抑
制される。このポンプ光とイレース光との空間的な重ね
合わせは、ダイクロイックミラー８、ミラー１０および
ハーフミラー１２により調整することができる。
【００５２】一方、試料１から発する蛍光は、対物レン
ズ１３、ハーフミラー１２およびハーフミラー１５を透
過させて、結像レンズ１６によりＣＣＤカメラ１７の撮
像面上に結像させ、これにより蛍光像を目視できるよう
にする。
【００５３】また、ハーフミラー１５で一部反射される
蛍光は、レンズ１８により空間フィルタであるピンホー
ル１９に結像させ、このピンホール１９を通過した蛍光
をレンズ２０および透過型回折格子２１を経てＩＣＣＤ
カメラ２２の撮像面上に結像させる。
【００５４】ここで、ＩＣＣＤカメラ２２は、光−電子
変換膜と２次元光電子増倍管からなり、蛍光は透過型回
折格子２１を経て蛍光スペクトルの形としてＩＣＣＤカ
メラ２２で撮影される。したがって、試料１をサンプル
ステージ１４により２次元走査しながら蛍光信号を計測
し、各点におけるデータをパーソナルコンピュータ等の
メモリに格納してＣＲＴ等のモニタ上に表示させれば、
目的とする試料１の構造を画像化することができる。
【００５５】本実施の形態の顕微鏡によれば、試料１に
集光したレーザー光よりも遥かに微小な領域の蛍光信号
をセレクトすることができるので、計測法としてのポテ
ンシャルを極めて高くすることができる。また、サンプ
ルステージ１４として、ピエゾ素子で駆動するものを用
いれば、位置分解能を１０ｎｍ程度と極めて高くできる
ので、超解像顕微鏡の空間分解能に十分見合った性能を
持たせることができる。
【００５６】さらに、本実施の形態の顕微鏡では、ピン
ホール１９を顕微鏡光学系の共焦点に配置しているの
で、試料１の３次元観察も可能である。すなわち、ピン
ホール１９は、レーザー光の焦点位置から発する蛍光の
みを通過させることができるので、サンプルステージ１
４を光軸方向に移動させて、レーザー光に対して２次元
走査すれば、光学深さ方向における試料１の断層像を得
ることができる。
【００５７】また、上記実施の形態では、一つのＮｄ：
ＹＡＧピコ秒レーザー２の出射光からポンプ光およびイ
レース光を得るようにしたが、ポンプ光およびイレース
光を別々の光源から得るように構成することもできる。
【００５８】
【発明の効果】以上のように、本発明によれば、波長の
異なる複数の光のうち、少なくとも１つの光はマルチ空
間モードの集光パターンが形成される光として、これら
複数の光をマルチ空間モードの集光パターンの一部領域
のみが他の光の集光パターンと空間的に重ね合わされる
ように対象に集光させるようにしたので、簡単な構成
で、結像性能の良好な超解像性を容易に発現できる光学
装置および顕微鏡を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の原理を説明するための図である。
【図２】 同じく、本発明の原理を説明するための図で
ある。
【図３】 同じく、本発明の原理を説明するための図で
ある。
【図４】 代表的な低次のＴＥＭモードの三つのパター
ンを示す図である。
【図５】 本発明の一実施の形態による顕微鏡の構成を
示す図である。
【図６】 図５に示す試料の光学特性を示す図である。
【図７】 図５において、ポンプ光をマルチモード化す
る位相板の構成および作用を説明するための図である。
【図８】 同じく、図５において、イレース光をマルチ
モード化する位相板の構成および作用を説明するための
図である。
【図９】 試料を構成する分子の価電子軌道の電子構造
を示す概念図である。
【図１０】 図９の分子の第１励起状態を示す概念図で
ある。
【図１１】 同じく、第２励起状態を示す概念図であ
る。
【図１２】 同じく、第２励起状態から基底状態に戻る
状態を示す概念図である。
【図１３】 分子における二重共鳴吸収過程を説明する
ための概念図である。
【図１４】 同じく、二重共鳴吸収過程を説明するため
の概念図である。
【図１５】 本発明者が先の提案した超解像顕微鏡の一
例の構成を示す図である。
【図１６】 図１５に示す位相板の構成を示す平面図で
ある。
【図１７】 図１５に示す超解像顕微鏡の改良点を説明
するための図である。
【符号の説明】
１ 試料 ２ Ｎｄ：ＹＡＧピコ秒レーザー ３ ビームスプリッタ ４ ＫＤＰ結晶 ５，１０ ミラー ６ ラマンシフタ ７，９ 位相板 ８ ダイクロイックミラー １１ リレーレンズ １２，１５ ハーフミラー １３ 対物レンズ １４ サンプルステージ １６ 結像レンズ １７ ＣＣＤカメラ １８，２０ レンズ １９ ピンホール ２１ 透過型回折格子 ２２ ＩＣＣＤカメラ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｇ０１Ｎ 21/17 Ｇ０１Ｎ 21/17 Ａ ６２０ ６２０ Ｆターム(参考） 2G020 CA01 CB23 CB43 CC02 CD04 CD24 CD52 2G043 AA03 CA09 EA01 FA01 FA02 GA02 GA04 GA06 GA08 GB01 HA01 HA09 HA15 JA04 KA02 KA05 KA08 KA09 LA03 LA07 MA11 2G059 AA05 DD03 DD13 EE07 FF02 FF03 FF13 GG01 GG08 GG09 HH02 HH06 JJ05 JJ07 JJ11 JJ22 JJ30 KK04 LL10 2H052 AA07 AA08 AA09 AC04 AC10 AC11 AC14 AC34 AF02

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 波長の異なる複数の光を発生する光源手
    段と、 上記複数の光を対象に集光する集光手段と、 上記対象から発せられる光を検出する発光検出手段とを
    有し、 上記光源手段から発生する波長の異なる複数の光のう
    ち、少なくとも１つの光はマルチ空間モードの集光パタ
    ーンが形成される光として、これら複数の光を上記集光
    手段により上記マルチ空間モードの集光パターンの一部
    領域のみが他の光の集光パターンと空間的に重ね合わさ
    れるように上記対象に集光させるよう構成したことを特
    徴とする光学装置。
  2. 【請求項２】 少なくとも基底状態を含め３つの電子状
    態を有する分子で染色した試料を観察する顕微鏡であっ
    て、 上記分子を基底状態から第１の励起状態へ遷移させる波
    長λ１の第１の光を発生する第１の光源と、 上記分子を上記第１の励起状態から、よりエネルギー準
    位の高い第２の励起状態へ遷移させる波長λ２の第２の
    光を発生させる第２の光源と、 上記第１の光および第２の光を上記試料に集光させる集
    光光学系と、 上記分子からの発光を検出する発光検出器とを有し、 上記第１の光源から上記第１の光としてマルチ空間モー
    ドの集光パターンが形成される光を発生させ、上記集光
    光学系により上記第１の光の集光パターンの一部領域の
    みが上記第２の光の集光パターンと空間的に重ね合わさ
    れるように上記試料に集光させるよう構成したことを特
    徴とする顕微鏡。
  3. 【請求項３】 上記第１の光源および第２の光源がコヒ
    ーレント光源であることを特徴とする請求項２に記載の
    顕微鏡。
  4. 【請求項４】 上記波長λ１の第１の光の波面に位相分
    布をもたせる位相分布発生素子を有することを特徴とす
    る請求項３に記載の顕微鏡。
  5. 【請求項５】 上記位相分布発生素子は、波面がゼロま
    たはπの位相差をもつ複数の分割された領域を有するこ
    とを特徴とする請求項４に記載の顕微鏡。
  6. 【請求項６】 上記分割された領域は、隣接する領域と
    πの位相差をもつことを特徴とする請求項５に記載の顕
    微鏡。
  7. 【請求項７】 上記第２の光も、マルチ空間モードの集
    光パターンを有することを特徴とする請求項２から６の
    いずれか一つに記載の顕微鏡。
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