DE102010034122B4

DE102010034122B4 - Mikroskop und Objektiv, insbesondere für die TIRF-Mikroskopie

Info

Publication number: DE102010034122B4
Application number: DE102010034122.3A
Authority: DE
Inventors: Manfred Matthä; Ingo Fahlbusch; Werner Kleinschmidt; Dr. Kramer Matthias
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2010-08-12
Filing date: 2010-08-12
Publication date: 2020-03-26
Anticipated expiration: 2030-08-13
Also published as: DE102010034122A1

Abstract

Mikroskop, insbesondere für die TIRF-Mikroskopie,mit einem Objektiv (1) zum Leiten von Anregungslicht (7) in einen Oberflächenbereich einer zu untersuchenden Probe (10) und zum Leiten von aus dem Oberflächenbereich der Probe (10) emittiertem Licht, insbesondere Fluoreszenzlicht, zurück in Richtung einer Nachweiseinrichtung (16),mit Mitteln (15) zum Leiten des Anregungslichts (7) auf das Objektiv (1) in einem ersten Azimutalwinkel (38) bezüglich der Objektivachse (4) und mit mindestens einer Segmentblende (31, 32) zum Blockieren von von der Probe (10) zurücklaufendem, insbesondere reflektiertem, Anregungslicht (11), die mindestens einen Teil eines Kreissektors eines Querschnitts eines Beobachtungsstrahlengangs des Objektivs (1) abdeckt und in einem zweiten Azimutalwinkel (39) bezüglich der Objektivachse (4) ausgerichtet ist,wobei die Segmentblende (31, 32) im Objektiv (1) integriert ist undwobei eine Winkeldifferenz zwischen dem ersten und dem zweiten Azimutalwinkel (38, 39) einstellbar ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Segmentblende (31, 32) einen Ring mit einer nach innen gerichteten Nase (33, 34) aufweist.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich in einem ersten Aspekt auf ein Mikroskop, insbesondere für die TIRF-Mikroskopie, nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.
In einem zweiten Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Objektiv zur Verwendung in einem TIRF-Mikroskop nach dem Oberbegriff des Anspruchs 14.
In der TIRF-Mikroskopie, das heißt in der internen Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie, wird Anregungslicht auf eine zu untersuchende Probe geleitet und dort total reflektiert. Hierdurch wird die Probe in einem Oberflächenbereich angeregt und emittiert Licht, insbesondere Fluoreszenz- oder Phosphoreszenzlicht. Das emittierte Licht wird mit einer Nachweiseinrichtung gemessen.
Das Anregungslicht wird in der Regel von Lasern erzeugt und kann verschiedene Wellenlängen aufweisen, die zur Anregung der Probe geeignet sind. Das Anregungslicht wird unter einem flachen Winkel auf den Objektträger geleitet, so dass es an der Grenze des Objektträgers zur Probe zur internen Totalreflexion kommt. Bei der Totalreflexion tritt eine sogenannte evaneszente Welle in die Probe ein, wobei das elektrische Feld der evaneszenten Welle exponentiell mit der Tiefe innerhalb der Probe abklingt. Hierdurch wird die Probe nur in einem dünnen Oberflächenbereich, der eine Dicke von etwa 50 nm bis 400 nm hat, zur Fluoreszenz angeregt. Diese Eindringtiefe hängt von der Wellenlänge des Anregungslichts sowie vom Einfallswinkel auf die Grenzfläche Objektträger/Probe ab. Das Anregungslicht wird mit demselben Objektiv, das auch zur Beobachtung des von der Probe emittierten Lichts benutzt wird, auf die Probe geleitet. Nach der Totalreflexion tritt das Anregungslicht wieder in das Objektiv ein und muss von dem von der Probe emittierten Licht getrennt werden.
Ein gattungsgemäßes Mikroskop weist ein Objektiv zum Leiten von Anregungslicht in einen Oberflächenbereich einer zu untersuchenden Probe und zum Leiten von aus dem Oberflächenbereich der Probe emittiertem Licht, insbesondere Fluoreszenzlicht, zurück in Richtung einer Nachweiseinrichtung sowie Mittel zum Leiten des Anregungslichts auf das Objektiv in einem ersten Azimutalwinkel bezüglich der Objektivachse auf. Zudem ist mindestens eine Segmentblende zum Blockieren von von der Probe zurücklaufendem, insbesondere reflektiertem, Anregungslicht vorhanden, die mindestens einen Teil eines Kreissektors eines Querschnitts eines Beobachtungsstrahlengangs des Objektivs abdeckt und in einem definierten Azimutalwinkel bezüglich der Objektivachse ausgerichtet ist. Dieser definierte Azimutalwinkel wird auch als zweiter Azimutalwinkel bezeichnet.
Der erste und zweite Azimutalwinkel liegen also in einer Ebene, die senkrecht zur Objektivachse orientiert ist. Sie werden bezüglich einer grundsätzlich beliebigen, aber gemeinsamen Position in dieser Ebene gemessen. Die Lage der Ebene entlang der Objektivachse ist nicht bedeutsam, da sich der erste Azimutalwinkel des auf die Probe zulaufenden Anregungslichts entlang der Objektivachse nicht ändert. Der erste Azimutalwinkel kann beispielsweise bezogen auf einen Mittelpunkt des Querschnitts des Anregungslichts gemessen oder angegeben werden. Der zweite Azimutalwinkel kann zum Beispiel bis zu einer oder bezogen auf eine Mitte des abgedeckten Teils des oben definierten Kreissektors gemessen oder angegeben werden.
Ein gattungsgemäßes Objektiv zur Verwendung in einem TIRF-Mikroskop weist einen feststehenden Teil auf, der in einem in einem TIRF-Mikroskop eingebauten Zustand feststehend ist.
Ein Mikroskop der oben genannten Art für die TIRF-Mikroskopie ist in DE 101 43 481 A1 beschrieben. Bei diesem Mikroskop ist die Segmentblende jedoch außerhalb des Objektivs angeordnet, nämlich in einem Modul, das auch ein Prisma zum Lenken von Anregungslicht in das Objektiv aufweist. Nachteilig an dieser Ausführung ist, dass das Objektiv vollständig vom zurücklaufenden Anregungslicht durchquert wird, ehe dieses an der Segmentblende blockiert wird. Auf dem Weg durch das Objektiv kann durch das zurücklaufende Anregungslicht Falschlicht erzeugt werden, was im Folgenden näher beschrieben wird. In DE 101 43 481 A1 ist zudem eine alternative Ausgestaltung eines TIRF-Mikroskops beschrieben. Statt einer Segmentblende ist bei dieser Ausgestaltung ein Prisma im Objektiv vorhanden, welches das von der Probe zurücklaufende Licht aus dem Beobachtungsstrahlengang des Objektivs herausleitet. Damit das Prisma von dem zurücklaufenden Licht nicht verfehlt wird, weist das Objektiv dem Prisma gegenüberliegend eine Einrichtung zum Einkoppeln des Anregungslichts auf. Dadurch ist zwischen der Einkoppel-Einrichtung und dem Prisma immer eine feste Azimutalwinkeldifferenz bezüglich der Objektivachse von 180° gegeben. Nachteilig hieran sind unter anderem die großen baulichen Veränderungen des Objektivs. Zudem wird durch ein Prisma kein vollständiges Blockieren des zurücklaufenden Anregungslichts erreicht. Das von der Probe zurücklaufende Licht muss entweder aus dem Objektiv ausgekoppelt werden oder an anderer Stelle gedämpft werden.
Weitere TIRF-Mikroskope sind aus DE 10 2005 009 832 A1 sowie aus DE 103 44 410 A1 bekannt. Hierbei ist jeweils eine Blende im Objektiv integriert. Diese ist jedoch rotationssymmetrisch und farbselektiv, wozu ein innerer Kreis und ein äußerer Ring für verschiedene Wellenlängenbereiche von Licht durchlässig sind. Somit kann auf die Probe zulaufendes Anregungslicht die Blende im Bereich des äußeren Rings durchdringen und wird beim Zurücklaufen, also nach einer Reflexion an der Oberfläche der Probe, auf den inneren Kreis der Blende geleitet, welcher das zurücklaufende Anregungslicht blockiert.
Ein Nachteil der farbselektiven Blenden ist, dass für das Anregungslicht nur ein eingeschränkter Spektralbereich blockiert werden kann. Für andere Spektralbereiche müsste die Blende gewechselt werden, was nur unter hohem Aufwand möglich ist. Als zusätzlicher Nachteil wird ein hoher Anteil des von der Probe emittierten Lichts, also des nachzuweisenden Lichts, an dem für das nachzuweisende Licht undurchlässigen Ringbereich der Blende blockiert.
US 2003/0058350 A1 beschreibt ein Mikroskop, welches insbesondere für die TIRF-Mikroskopie gestaltet ist. Ein Anregungslichtstrahl wird über ein Objektiv geleitet und an einer Oberfläche, an welcher eine Probe angeordnet wird, totalreflektiert. Das totalreflektierte Licht läuft im Objektiv zurück und wird in diesem blockiert. Hierzu umfasst das Objektiv eine drehbare Glasplatte mit absorbierender oder reflektierender Beschichtung. Wird die Glasplatte geeignet gedreht, gelangt das Anregungslicht auf dem Weg zur Probe durch die transparente Glasplatte und wird auf dem Rückweg von der Beschichtung gestoppt. Nachzuweisendes Fluoreszenzlicht gelangt durch die transparente Glasplatte zu einem Detektor.
Weitere Mikroskope, die auch für die TIRF-Mikroskopie eingesetzt werden können, sind aus DE 10 2008 059 328 A1 und W02006/127692 A2 bekannt.
Zudem sind TIRF-Schieber bekannt, über welche Anregungslicht in das Mikroskop eingekoppelt werden kann. Hierdurch kann ein gewöhnliches Mikroskop für die TIRF-Mikroskopie verwendet werden. Dabei durchläuft das von der Probe zurücklaufende Anregungslicht jedoch das komplette Objektiv bis zum TIRF-Schieber. Hierbei kann das zurücklaufende Anregungslicht auf dem gesamten Weg durch das Objektiv Falschlicht erzeugen.
Ein Objektiv, das zum Reduzieren von Fehlern der optischen Abbildung des Mikroskops in einem in das Mikroskop eingebauten Zustand drehbar ist, ist in DE 10 2005 023 972 A1 beschrieben. Dieses Objektiv kann jedoch zurücklaufendes Anregungslicht nicht blockieren und kann deshalb nicht ohne weiteres für die TIRF-Mikroskopie eingesetzt werden.
Für eine gute Bildqualität ist es ein grundlegendes Ziel, das Entstehen von Falschlicht durch das zurücklaufende Anregungslicht zu vermeiden. Unter Falschlicht soll hier dasjenige Licht verstanden werden, das zu einer Verfälschung des Bildeindrucks führt, indem es nicht aus dem Oberflächenbereich der Probe stammt, aber dennoch in das Okular des Mikroskops oder auf einen Kamerasensor des Mikroskops gelangt. Die Entstehung des Falschlichts kann in die folgenden drei Kategorien eingeteilt werden.
Bei vielen Mikroskopen werden mit einem Strahlteiler das von der Probe emittierte Licht und das zurücklaufende Anregungslicht getrennt. Hierbei kann allerdings ein geringer Anteil des zurücklaufenden Anregungslichts den Strahlteiler passieren und so zu Falschlicht führen. Selbst wenn durch den Strahlteiler das zurücklaufende Anregungslicht um den sehr großen Faktor 10¹⁰ unterdrückt wird, führt dies noch zu einer Beeinträchtigung der Bildqualität. Diese Art von Falschlicht wird auch bei dem Prisma aus DE 101 43 481 A1 sowie bei den farbselektiven Blenden aus DE 10 2005 009 832 A1 und DE 103 44 410 A1 erzeugt.
Eine zweite Kategorie von Falschlicht kann dann auftreten, wenn das zurücklaufende Anregungslicht Optiken des Beobachtungssystems, wie zum Beispiel das Objektiv oder Adapterlinsen, durchläuft, bevor es durch beispielsweise einen Strahlteiler wegreflektiert wird. An diesen Optiken, insbesondere an Kittschichten an den Optiken, kann durch das zurücklaufende Anregungslicht parasitäres Fluoreszenzlicht angeregt werden. Dieses Fluoreszenzlicht kann zusammen mit dem von der Probe emittierten Licht einen farbselektiven Strahlteiler passieren und so als Falschlicht wahrgenommen werden. Diese Art von Falschlicht wird also durch die farbselektiven Blenden aus DE 10 2005 009 832 A1 und DE 103 44 410 A1 nicht blockiert. Bei der in DE 101 43 481 A1 beschriebenen Ausführung, bei welcher eine Segmentblende in einem Modul und nicht im Objektiv angeordnet ist, durchläuft das zurücklaufende Anregungslicht das gesamte Objektiv, so dass vergleichsweise viel parasitäres Fluoreszenzlicht verursacht werden kann.
Eine dritte Kategorie von Falschlicht entsteht dadurch, dass das zurücklaufende Anregungslicht an Grenzflächen im Objektiv reflektiert und auf die Probe zurückgeworfen werden kann. Dieses ungewollt zurückgeworfene Licht kann über die Oberflächenschicht hinaus tiefer in die Probe eindringen und dort Fluoreszenzlicht verursachen, welches als Falschlicht in den Beobachtungsstrahlengang gelangt. Das ist für TIRF-Mikroskopie, bei der durch Totalreflexion des Anregungslichts die Probe nur in einer Oberflächenschicht zur Fluoreszenz angeregt werden soll, unerwünscht. Das Risiko, das diese Art von Falschlicht entsteht, ist bei dem in DE 101 43 481 A1 beschriebenen Mikroskop mit einer außerhalb des Objektivs angeordneten Segmentblende hoch, da hier das zurücklaufende Anregungslicht das Objektiv vollständig durchläuft. Diese Art von Falschlicht tritt außerdem auch an den farbselektiven Blenden aus DE 10 2005 009 832 A1 und DE 103 44 410 A1 sowie dem Prisma aus DE 101 43 481 A1 auf.
Besondere Bedeutung kommt dem Falschlicht insbesondere wegen der hohen Intensität des zurücklaufenden Anregungslichts zu. Während bei normaler Fluoreszenz-Mikroskopie reflektiertes Anregungslicht nur eine sehr geringe Intensität aufweist, hat bei der TIRF-Mikroskopie das zurücklaufende Anregungslicht aufgrund der Totalreflexion nahezu dieselbe Intensität wie das auf die Probe zulaufende Anregungslicht.
Als eine Aufgabe der Erfindung kann angesehen werden, ein Mikroskop und ein Objektiv bereitzustellen, bei denen eine besonders gute Bildqualität erreichbar ist.
Diese Aufgabe wird in einem ersten Aspekt durch das Mikroskop mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst. In einem zweiten Aspekt wird die Aufgabe durch das Objektiv mit den Merkmalen des Anspruchs 14 gelöst.
Vorteilhafte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Mikroskops und des erfindungsgemäßen Objektivs sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche und werden außerdem in der folgenden Beschreibung, insbesondere im Zusammenhang mit den Figuren, beschrieben.
Bei dem erfindungsgemäßen Mikroskop ist die Segmentblende im Objektiv integriert und eine Winkeldifferenz zwischen dem ersten und dem zweiten Azimutalwinkel ist einstellbar.
Das Objektiv der oben genannten Art zur Verwendung in einem TIRF-Mikroskop ist erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Segmentblende zum Blockieren von von einer Probe zurücklaufendem, insbesondere reflektiertem, Anregungslicht vorhanden ist, dass die Segmentblende mindestens einen Teil eines Kreissektors einer Querschnittsfläche eines Beobachtungsstrahlengangs abdeckt, dass ein drehbarer Teil vorhanden ist, welcher in dem in ein TIRF-Mikroskop eingebauten Zustand drehbar ist, und dass die Segmentblende mit dem drehbaren Teil mechanisch gekoppelt, insbesondere verbunden, ist.
Als wesentliche Idee der Erfindung kann erachtet werden, die Segmentblende möglichst nah an der Probe anzuordnen, so dass nur wenige optische Elemente, wie zum Beispiel die Linsen eines Objektivs, vom zurücklaufenden Anregungslicht durchquert werden. Das zurücklaufende Licht durchquert also nicht alle Linsen des Objektivs. Dadurch wird vorteilhafterweise das Risiko reduziert, das parasitäres Fluoreszenzlicht an den optischen Elementen oder an Kittschichten der optischen Elemente erzeugt wird. Zudem trifft das zurücklaufende Anregungslicht so an weniger Grenzflächen, beispielsweise der optischen Elemente, an denen es zurück zur Probe geworfen werden kann und dort eine Fluoreszenzanregung bewirkt.
Als ein Kerngedanke der Erfindung kann angesehen werden, dass nur ein möglichst geringer Teil eines Querschnitts des Beobachtungsstrahlengangs abgedeckt wird. Somit kann das von der Probe emittierte Licht fast vollständig das Objektiv durchlaufen. Die Segmentblende braucht also nicht einen vergleichsweise großen Ring des Querschnitts des Beobachtungsstrahlengangs abzudecken, wie dies beispielsweise bei farbselektiven Ringblenden der Fall ist, sondern nur einen Teil eines Kreissektors.
Dabei muss sichergestellt sein, dass das zurücklaufende Anregungslicht die Segmentblende auch trifft. Als wesentliche Idee der Erfindung hierzu kann erachtet werden, dass die relative Orientierung zwischen dem Anregungslicht und der Segmentblende eingestellt werden kann. Entscheidend ist hierbei die Orientierung in einer Ebene senkrecht zur Objektivachse, also der Azimutwinkel bezüglich der Objektivachse zwischen dem Anregungslicht und der Segmentblende. Das zurücklaufende Anregungslicht trifft genau dann auf die Segmentblende, wenn das auf die Probe zulaufende Anregungslicht in einer Azimutalwinkeldifferenz von 180° zu der Segmentblende ausgerichtet ist.
Dieser Versatz zwischen dem auf die Probe zulaufenden Anregungslicht und der Segmentblende kann durch die Winkeldifferenz zwischen dem ersten und dem zweiten Azimutalwinkel angegeben werden. Der erste Azimutalwinkel gibt die Orientierung des Anregungslichts in einer Ebene senkrecht zur Objektivachse an. Da bei der TIRF-Mikroskopie das Anregungslicht nicht windschief zur Objektivachse auf das Objektiv geleitet wird, kann der erste Azimutalwinkel an einer beliebigen Stelle entlang der Objektivachse bestimmt werden. Indem die Winkeldifferenz zwischen dem ersten und zweiten Azimutalwinkel einstellbar ist, wird vorteilhafterweise sichergestellt, dass das zurücklaufende Anregungslicht immer von der Segmentblende blockiert werden kann.
Die Einstellbarkeit der Winkeldifferenz ist auch deshalb von Bedeutung, weil es nur unter hohem Aufwand möglich ist, Objektive und deren Aufnahmen in Objektivrevolvern so zu fertigen, dass ein Objektiv beim Einbau in den Objektivrevolver eine vordefinierte Drehstellung besitzt. Unter Einstellbarkeit soll deshalb ein Verändern während oder vor dem Betrieb des Mikroskops verstanden werden, insbesondere durch einen Benutzer. Hierzu sind mechanische Mittel vorhanden, die insbesondere von einem Benutzer manuell und/oder über eine motorisierte Steuereinrichtung bedient werden können.
Schließlich erlaubt es die Einstellbarkeit der Winkeldifferenz auch, dass das zurücklaufende Anregungslicht zu Justierzwecken hindurchgelassen werden kann und eine Nachweiseinrichtung erreicht. Dies ist hingegen nicht in einfacher Weise bei den bekannten TIRF-Mikroskopen möglich, bei denen beispielsweise in einem Modul eine Segmentblende feststehend zu einem Prisma zum Einkoppeln des Anregungslichts montiert ist, oder eine ringförmige farbselektive Blende vorhanden ist.
Insbesondere kann erfindungsgemäß die Segmentblende das zurücklaufende Anregungslicht durch Absorption blockieren. Gegenüber farbselektiven Blenden oder Prismen zum Abführen des zurücklaufenden Anregungslichts wird dann im Normalbetrieb vorteilhafterweise bewirkt, dass praktisch gar kein zurücklaufendes Anregungslicht die Nachweiseinrichtung trifft. Zudem wird wellenlängenunabhängig ein Blockieren des zurücklaufenden Anregungslichts erreicht.
Da gemäß der Erfindung die azimutale Winkeldifferenz, also die relative Drehposition, zwischen der Segmentblende und dem Anregungslicht frei eingestellt werden kann, können die Segmentblende und die Mittel zum Leiten des Anregungslichts auf das Objektiv unabhängig voneinander gebildet sein. Somit können die Mittel zum Leiten des Anregungslichts außerhalb des Objektivs angeordnet sein, wobei das auf die Probe zulaufende Anregungslicht alle Linsen des Objektivs durchläuft. Vorteilhafterweise wird so der Herstellungsaufwand des Objektivs vergleichsweise gering gehalten.
Ein wesentlicher Gedanke des erfindungsgemäßen Objektivs kann darin gesehen werden, dass die Segmentblende drehbar zu einem feststehenden Objektivteil und somit im eingebauten Zustand auch drehbar zu dem Anregungslicht ist. Dadurch kann bewerkstelligt werden, dass die Segmentblende immer von dem zurücklaufenden Anregungslicht getroffen wird. Vorteilhafterweise sind dazu keine aufwendigeren Einrichtungen am Mikroskop zum Lenken des Anregungslichts auf das Objektiv notwendig.
Bei einer bevorzugten Ausführung des erfindungsgemäßen Mikroskops ist zum Einstellen der Winkeldifferenz zwischen dem ersten und dem zweiten Azimutalwinkel die Segmentblende relativ zu einem feststehenden Teil des Objektivs drehbar. Hierbei wird also die Winkeldifferenz durch eine Veränderung des zweiten Azimutalwinkels eingestellt. Somit ist nicht erforderlich, dass auch der erste Azimutalwinkel einstellbar ist. Vorteilhafterweise können somit die Mittel zum Leiten des Anregungslichts vergleichsweise einfach, beispielsweise durch einen TIRF-Schieber, ausgeführt sein. Der feststehende Teil des Objektivs kann das Gewinde, mit dem das Objektiv im Mikroskop befestigt wird, umfassen. Bevorzugt ist der feststehende Teil des Objektivs eine Außenhülse. Vorzugsweise ist die Segmentblende mit einem drehbaren Teil des Objektivs, wie zum Beispiel einer Innenhülse, verbunden, der von einem Benutzer manuell oder über eine motorisierte Steuereinrichtung gedreht werden kann.
Alternativ oder zusätzlich kann bei einer weiteren Variante des erfindungsgemäßen Mikroskops aber auch vorgesehen sein, dass zum Einstellen der Winkeldifferenz zwischen dem ersten und dem zweiten Azimutalwinkel der erste Azimutalwinkel mit den Mitteln zum Leiten des Anregungslichts auf das Objektiv veränderbar ist. Hier ist also das Anregungslicht frei in der Objektivpupille einstellbar. Somit kann hier die Segmentblende feststehend zum Rest des Objektivs ausgeführt sein.
Bei einer vorteilhaften Alternative des erfindungsgemäßen Mikroskops oder des erfindungsgemäßen Objektivs ist die Segmentblende zwischen einer Objektivpupille und einer der Probe zugewandten Frontlinse angeordnet. Dadurch wird vom zurücklaufenden Anregungslicht nur eine geringe Anzahl optischer Elemente durchlaufen, an denen es durch parasitäre Fluoreszenzanregung zu Falschlicht kommen kann. Zudem wird das Risiko verringert, dass das zurücklaufende Licht an einem optischen Element teilweise zurückgeworfen wird und in der Probe erneut eine Fluoreszenzanregung bewirkt.
Besonders bevorzugt ist bei einer Ausführung des erfindungsgemäßen Mikroskops oder des erfindungsgemäßen Objektivs die Segmentblende in einem für das von der Probe emittierte Licht divergenten Teil des Beobachtungsstrahlengangs angeordnet. Das heißt, die Segmentblende ist nahe an der Frontlinse, oder zumindest näher an der Frontlinse als an der Objektivpupille, angeordnet. Hierbei kann auch vorgesehen sein, dass die Segmentblende benachbart zu einer der drei zur Probe nächsten Linsen des Objektivs angeordnet ist. Das zurücklaufende Anregungslicht wird also besonders früh blockiert, wodurch das Entstehen von parasitärem Falschlicht an Linsen oder an einem Kitt an einer Linse weitestgehend vermieden wird. Zudem wird das Risiko einer Rückreflexion des zurücklaufenden Anregungslichts hin zur Probe verringert.
Bei einer ebenfalls bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Mikroskops oder des erfindungsgemäßen Objektivs weist das Objektiv mehrere Linsen auf und die Segmentblende ist benachbart zu einer Linse angeordnet, die sich direkt benachbart zur Objektivpupille befindet. Dabei soll die Eigenschaft „benachbart“ verstanden werden als „in Richtung der Objektivachse“ benachbart. In der Ebene der Objektivpupille ist das Anregungslicht fokussiert, damit es als paralleles Strahlenbündel auf die Probe trifft. Daher ist in der Nähe der Objektivpupille die Querschnittsfläche des Anregungslichts relativ klein. Vorteilhafterweise kann die Segmentblende hier besonders klein ausgeführt sein, wodurch sie nur wenig von der Probe emittiertes Licht blockiert. Da der Probenort und die Objektivpupille zueinander Fourier-konjugiert sind, wird bei einer Positionierung der Segmentblende in der Nähe der Objektivpupille das Sichtfeld des Mikroskops vorteilhafterweise weniger verringert.
Erfindungsgemäß weist die Segmentblende einen Ring mit einer nach innen gerichteten Nase auf. Dabei wird das zurücklaufende Anregungslicht von der Nase blockiert, während der Ring bevorzugt außerhalb des Beobachtungsstrahlengangs liegt. Unter Beobachtungsstrahlengang soll der Strahlengang des von der Probe emittierten Lichts verstanden werden.
Bevorzugt ist eine Ausdehnung der Nase nach innen gerade so groß, dass das zurücklaufende Anregungslicht blockiert werden kann.
Zweckmäßigerweise ist bei einer vorteilhaften Variante des erfindungsgemäßen Mikroskops oder des erfindungsgemäßen Objektivs an einer Außenseite des Objektivs eine Markierung vorhanden, die den zweiten Azimutalwinkel anzeigt. Somit kann ein Benutzer in einfacher Weise die richtige Orientierung der Segmentblende, in der diese das zurücklaufende Anregungslicht blockiert, einstellen. Dabei ist die Markierung vorzugsweise an dem drehbaren Teil oder an einem Angriffsstück, mit dem der drehbare Teil gedreht werden kann, angebracht. Es ist außerdem bevorzugt, dass bei mehreren Segmentblenden für jede Segmentblende eine Markierung vorhanden ist.
Bei einer weiteren Ausführungsvariante des erfindungsgemäßen Mikroskops weist die Nachweiseinrichtung einen Kamerasensor mit einem rechteckigen Sehfeld zum Messen des von der Probe emittierten Lichts auf und die Segmentblende ist benachbart zu einer Seite des Sehfelds, insbesondere zu einer langen Seite des Sehfelds, angeordnet. Vorteilhafterweise kann sich somit die Segmentblende in einem Bereich befinden, der vom Kamerasensor nicht erfasst wird. In diesem Fall reduziert die Segmentblende nicht die Intensität des von der Probe emittierten und auf den Kamerasensor fallenden Lichts. Hier ist die Segmentblende also gerade nicht benachbart zu einer Ecke des Sehfelds des Kamerasensors angeordnet.
Bei einem vorteilhaften Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Mikroskops oder des erfindungsgemäßen Objektivs sind mehrere, insbesondere zwei, Segmentblenden vorhanden, die in verschiedenen Positionen entlang der Objektivachse und in verschiedenen zweiten Azimutalwinkeln bezüglich der Objektivachse angeordnet sind. Die Segmentblenden liegen also in einer Ebene senkrecht zur Objektivachse versetzt zueinander, so dass ausgewählt werden kann, welche Segmentblende das zurücklaufende Anregungslicht blockiert.
Sind mehrere Segmentblenden vorhanden, sind diese bevorzugt gemeinsam und relativ zu einem feststehenden Teil des Objektivs drehbar. Somit kann in besonders einfacher Weise die gewünschte Segmentblende ausgewählt werden. Dabei kann eine der Segmentblenden im Bereich der Objektivpupille und eine andere der Segmentblenden nahe zur Frontlinse des Objektivs angeordnet sein.
Ein besonders hoher Benutzerkomfort wird erreicht, wenn ein Motor zum Drehen der Segmentblenden vorhanden ist. Hierbei kann vorgesehen sein, dass der Motor die Segmentblende automatisch in eine Position bewegen kann, in der das zurücklaufende Licht blockiert wird.
In einer weiteren Ausführungsvariante des erfindungsgemäßen Mikroskops oder des erfindungsgemäßen Objektivs ist die Segmentblende als eine Beschichtung der Linse des Objektivs oder einer im Objektiv angeordneten Glasplatte ausgebildet.
Weitere Vorteile und Merkmale der Erfindung werden nachstehend mit Bezug auf die beigefügten schematischen Figuren beschrieben. Hierin zeigen:

1 eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Mikroskops;
2 eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Objektivs;
3 eine schematische Darstellung eines Sichtfelds eines erfindungsgemäßen Mikroskops;
4 eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels einer Segmentblende;
5 eine Schrägansicht des Ausführungsbeispiels der Segmentblende;
6 eine schematische Darstellung von zwei Segmentblenden; und
7 eine schematische Darstellung eines zweiten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Objektivs.

Äquivalente Komponenten sind in allen Figuren mit denselben Bezugszeichen gekennzeichnet.
1 zeigt ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Mikroskops 100 und eines erfindungsgemäßen Objektivs 1 zur Verwendung für die TIRF-Mikroskopie.
Hierbei wird Anregungslicht 7 auf eine Probe 10 geleitet und dort total reflektiert. Dabei wird die Probe 10 angeregt und emittiert Licht, welches von dem Objektiv 1 zu einer Nachweiseinrichtung 16 weitergeleitet wird.
Als Anregungslicht 7 wird in der Regel Laserlicht verwendet. Dabei können ein oder mehrere Lichtquellen zum Erzeugen von Anregungslicht 7 mit unterschiedlichen Wellenlängen vorhanden sein, wobei diese Lichtquellen im Mikroskop 100 einen gemeinsamen Strahlengang aufweisen.
Das Mikroskop 100 weist Mittel 15 zum Leiten des Anregungslichts 7 auf das Objektiv 1 auf. Dabei leiten die Mittel 15 das Anregungslicht 7 in einem ersten Azimutalwinkel 38 bezüglich der Objektivachse 4 in das Objektiv 1. Bei einer einfachen Ausführung können die Mittel 15 ein TIRF-Schieber sein, mit dem der Abstand zur Objektivachse 4 einstellbar ist, mit dem das Anregungslicht 7 auf die Eintrittspupille des Objektivs 1 trifft. Dadurch kann der Winkel eingestellt werden, unter dem das Anregungslicht 7 auf die Probe 10 trifft. Oberhalb des Grenzwinkels für die Totalreflexion kann die Eindringtiefe des Anregungslichts 7 in die Probe 10 variiert werden. Bei solch einem TIRF-Schieber ist also der erste Azimutalwinkel 38 des Anregungslichts 7 bezüglich der Objektivachse 4 nicht veränderbar. In dem dargestellten Beispiel kann aber mit den Mitteln 15 das Anregungslicht frei in der Objektivpupille eingestellt werden. Es kann also der erste Azimutalwinkel 38 eingestellt werden.
Das Anregungslicht 7 wird durch das Objektiv 1 auf die Probe 10 geleitet. Dabei durchläuft es ein Deckglas 14 und wird an der Grenzfläche 17 von der Probe 10 und dem Deckglas 14 total reflektiert. Der hierbei vorliegende Winkel zwischen dem Anregungslicht 7 und der Probe 10 wird durch den Polarwinkel zur Objektivachse 4 bestimmt, unter dem das auf die Probe zulaufende Anregungslicht 7 auf das Objektiv 1 trifft.
Das an der Grenzfläche 17 total reflektierte Anregungslicht 7 gelangt als zurücklaufendes Anregungslicht 11 wieder in das Objektiv 1. Gemäß der Erfindung wird dabei das zurücklaufende Anregungslicht 11 in dem Objektiv 1 absorbiert, so dass es dieses nicht vollständig durchläuft. Das von der Probe 10 emittierte Licht wird hingegen von dem Objektiv 1 in Richtung einer Nachweiseinrichtung 16 weitergeleitet. Die Nachweiseinrichtung 16 misst das emittierte Licht, so dass ein Bild der Probe erzeugt werden kann.
Der Verlauf des Anregungslichts 7 im Objektiv 1 ist in 2 dargestellt.
Hierbei durchläuft das Anregungslicht 7 die Linsen des Objektivs 1 in einem äußeren Bereich und wird auf eine Probe 10 geleitet. Nach der Totalreflexion an der Probe 10 tritt das zurücklaufende Anregungslicht 11 wieder in das Objektiv 1 ein und durchläuft die Linsen diesmal auf der gegenüberliegenden Seite. Das auf die Probe zulaufende Anregungslicht 7 und das zurücklaufende Anregungslicht 11 stehen also bezüglich der Objektivachse 4 in einem Azimutalwinkel von 180° zueinander.
Da durch das Anregungslicht 7, 11 Falschlicht erzeugt werden kann, ist es vorteilhaft, wenn das Anregungslicht 7, 11 so wenig Linsen wie nötig durchläuft. Deshalb ist bei dem hier dargestellten Ausführungsbeispiel eine Segmentblende 31 nah an der der Probe 10 zugewandten Frontlinse des Objektivs 1 angeordnet, nämlich benachbart zur dritten Linse von der Frontlinse aus gesehen.
Eine weitere Segmentblende 32 ist benachbart zu derjenigen Linse, die im Bereich der Objektivpupille 9 liegt, angeordnet. Damit das Anregungslicht 7 bei der Reflexion an der Probe 10 einen möglichst parallelen Strahl aufweist, muss das Anregungslicht 7 in der Objektivpupille 9 fokussiert sein. Der Strahldurchmesser des einlaufenden Anregungslichts 7 sowie des zurücklaufenden Anregungslichts 11 ist also nahe der Objektivpupille 9 klein. Vorteilhafterweise kann deshalb die Segmentblende 32 kleiner ausgeführt sein als die Segmentblende 31.
Im dargestellten Beispiel befindet sich die Segmentblende 31 in einer Drehposition, das heißt in einem zweiten Azimutalwinkel, in welchem sie das zurücklaufende Anregungslicht 11 durchlässt. Die Segmentblende 32 hingegen befindet sich in einer Drehposition, in der sie das zurücklaufende Anregungslicht 11 blockiert.
Die Segmentblenden 31, 32 sind mit einem drehbaren Teil 2 des Objektivs 1 verbunden. Bei dem drehbaren Teil 2 handelt es sich hier um eine Innenhülse 2. Über ein Angriffsstück 6 ist der drehbare Teil 2 gegen einen feststehenden Teil 3 drehbar, so dass der zweite Azimutalwinkel der Segmentblenden 31, 32 eingestellt werden kann. Der feststehende Teil 3 ist hier eine Außenhülse 3. Um eine stabile Bauform zu erreichen, sind hier sämtliche Linsen des Objektivs 1 mit dem drehbaren Teil 2 verbunden.
Die Größe der Segmentblende 31, 32 sollte zum sicheren Blockieren des zurücklaufenden Anregungslichts 11 größer als der Strahldurchmesser des zurücklaufenden Anregungslichts 11 sein. Gleichzeitig sollten die Segmentblenden 31, 32 möglichst klein sein, so dass sie möglichst wenig von der Probe emittiertes Licht blockieren.
In 3 ist schematisch das Sichtfeld 21 eines erfindungsgemäßen Mikroskops 1 dargestellt. Hier wird durch die Segmentblende 31 ein Teil 23 des Sichtfelds 21 verdeckt oder abgeschattet. Dargestellt ist außerdem das Sichtfeld 22 eines Kamerasensors der Nachweiseinrichtung, welcher in der hochauflösenden PAL-Mikroskopie, Photo-Activated Localisation Microscopy, verwendet wird. Dieses Sichtfeld 22 des Kamerasensors ist rechteckig und kleiner als das Sichtfeld 21. Vorteilhafterweise befindet sich die Segmentblende beim Blockieren des zurücklaufenden Anregungslichts in einer Position, in der sie keine Auswirkungen auf das Sichtfeld 22 des Kamerasensors hat. Hierzu ist der durch die Segmentblende verdeckte Bereich 23 benachbart zu einer langen Seite des rechteckigen Bereichs 22 ausgerichtet.
Ein erstes Ausführungsbeispiel einer Segmentblende 31, 32 eines erfindungsgemä-ßen Mikroskops oder eines erfindungsgemäßen Objektivs ist in den 4 und 5 dargestellt.
Dabei umfasst die Segmentblende 31, 32 einen Ring sowie einen nach innen weisende Nase 33, 34. Während der Innenradius 37 des Rings derart dimensioniert ist, dass der Ring außerhalb des Beobachtungsstrahlengangs des Mikroskops liegt, soll mit der Nase 33, 34 das zurücklaufende Anregungslicht blockiert werden. Die Nase 33, 34 misst eine Höhe 35, das heißt eine Ausdehnung zur Richtung des Ringmittelpunkts, eine Breite 36 senkrecht hierzu, sowie einen Winkel 40, der einen Kreissektor definiert. Prinzipiell kann die Nase 33, 34 aber eine beliebige Form innerhalb des Kreissektors, zum Beispiel ein N-Eck oder eine halbkreisartige Form, aufweisen.
Eine Segmentblende 31 in der Nähe der Frontlinse kann kleiner ausgeführt sein als eine Segmentblende 32 in der Nähe der Objektivpupille. Bei einem hochaperturigen TIRF-Objektiv beträgt die Höhe 35 typischerweise etwa 3 mm bei einer Anordnung in der Nähe der Frontlinse und etwa 2 mm im Bereich der Objektivpupille. Damit sind die Höhen 35 nur geringfügig größer als die Ausdehnung des zurücklaufenden Anregungslichts. Der Winkel 40 der Segmentblenden 31, 32 beträgt typischerweise ca. 20°. Dieser Winkel ist groß genug, so dass die Segmentblenden 31, 32 leicht in die richtige Position zum Blockieren des zurücklaufenden Anregungslichts gebracht werden können.
In 6 sind zwei Segmentblenden 31, 32 eines Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Mikroskops oder eines erfindungsgemäßen Objektivs dargestellt. Der Aufbau der Segmentblenden 31, 32 gleicht jeweils dem mit Bezug auf die 4 und 5 beschriebenen Aufbau der Segmentblende 31, 32.
In 6 zeigt auch die Querschnittsfläche des auf die Probe zulaufenden Anregungslichts 7. Das zurücklaufende Anregungslicht 11 durchläuft das Objektiv 1 gegenüberliegend zu dem auf die Probe 10 zulaufenden Anregungslicht 7. Das heißt, das auf die Probe zulaufende Anregungslicht 7 und das zurücklaufende Anregungslicht 11 verlaufen relativ zueinander in einem Azimutalwinkel von 180° bezüglich der Objektivachse 4. Damit eine Segmentblende 31, 32 das zurücklaufende Anregungslicht 11 blockiert, muss diese ebenfalls derart ausgerichtet sein, nämlich relativ zu dem auf die Probe zulaufenden Anregungslicht 7 in einem Azimutwinkel von 180° bezüglich der Objektivachse 4. Mit anderen Worten soll die Winkeldifferenz zwischen dem ersten Azimutalwinkel 38 und dem zweiten Azimutalwinkel 39 gerade 180° betragen. Dabei werden der erste und zweite Azimutalwinkel 38, 39 ab einer beliebigen, aber gemeinsamen Stelle gemessen. Der zweite Azimutalwinkel 39 wird bis zu demjenigen Bereich der Segmentblenden 31, 32 gemessen, der das zurücklaufende Anregungslicht 11 blockiert, im dargestellten Fall also bis zum Mittelpunkt der Nasen 33, 34.
Die Segmentblenden 31, 32 sind in verschiedenen zweiten Azimutalwinkeln 39 ausgerichtet, so dass eingestellt werden kann, welche der beiden Segmentblenden 31, 32 das zurücklaufende Anregungslicht blockieren soll. Zur einfacheren Bedienung sind dabei die Segmentblenden 31 und 32 in einem unveränderbaren Azimutalwinkel zueinander angeordnet.
Indem die beiden Segmentblenden 31, 32 direkt benachbarte Bereiche des Beobachtungsstrahlengangs verdecken, kann auch bei mehreren Segmentblenden erreicht werden, dass das Sichtfeld 22 eines Kamerasensors nicht verdeckt wird.
Um die Drehposition der Segmentblenden 31, 32 einzustellen, kann ein Motor vorhanden sein. Ein derartiges erfindungsgemäßes Objektiv 1 mit einem Motor 41 ist in 7 dargestellt. Dabei ist der Motor 41 an einem feststehenden Teil 3 des Objektivs 1 angebracht. Der Motor 41 ist über eine Koppelvorrichtung 42 mit dem Angriffsstück 6 verbunden, welches wiederum mit einem drehbaren Teil 2 des Objektivs verbunden ist. Indem die Segmentblenden 31, 32 ebenfalls mit dem drehbaren Teil 2 gekoppelt oder verbunden sind, können diese durch den Motor 41 gedreht werden. Die Koppelvorrichtung 42 kann ein Zahnrad oder einen Riemen aufweisen.
Mit dem vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Mikroskop und dem erfindungsgemäßen Objektiv wird das bei der TIRF-Mikroskopie zurücklaufende Anregungslicht derart blockiert, dass durch das zurücklaufende Anregungslicht besonders wenig Falschlicht entsteht und dass möglichst wenig von der Probe emittiertes Licht blockiert wird. So wird eine besonders hohe Bildqualität ermöglicht.

Claims

Mikroskop, insbesondere für die TIRF-Mikroskopie, mit einem Objektiv (1) zum Leiten von Anregungslicht (7) in einen Oberflächenbereich einer zu untersuchenden Probe (10) und zum Leiten von aus dem Oberflächenbereich der Probe (10) emittiertem Licht, insbesondere Fluoreszenzlicht, zurück in Richtung einer Nachweiseinrichtung (16), mit Mitteln (15) zum Leiten des Anregungslichts (7) auf das Objektiv (1) in einem ersten Azimutalwinkel (38) bezüglich der Objektivachse (4) und mit mindestens einer Segmentblende (31, 32) zum Blockieren von von der Probe (10) zurücklaufendem, insbesondere reflektiertem, Anregungslicht (11), die mindestens einen Teil eines Kreissektors eines Querschnitts eines Beobachtungsstrahlengangs des Objektivs (1) abdeckt und in einem zweiten Azimutalwinkel (39) bezüglich der Objektivachse (4) ausgerichtet ist, wobei die Segmentblende (31, 32) im Objektiv (1) integriert ist und wobei eine Winkeldifferenz zwischen dem ersten und dem zweiten Azimutalwinkel (38, 39) einstellbar ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Segmentblende (31, 32) einen Ring mit einer nach innen gerichteten Nase (33, 34) aufweist.
Mikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zum Einstellen der Winkeldifferenz zwischen dem ersten und dem zweiten Azimutalwinkel (38, 39) die Segmentblende (31, 32) relativ zu einem feststehenden Teil (3) des Objektivs (1) drehbar ist.
Mikroskop nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass zum Einstellen der Winkeldifferenz zwischen dem ersten und dem zweiten Azimutalwinkel (38, 39) der erste Azimutalwinkel (38) mit den Mitteln (15) zum Leiten des Anregungslichts (7) auf das Objektiv (1) veränderbar ist.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Segmentblende (31, 32) zwischen einer Objektivpupille (9) und einer der Probe (10) zugewandten Frontlinse angeordnet ist.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Segmentblende (31, 32) in einem Teil des Beobachtungsstrahlengangs angeordnet ist, in dem das von der Probe (10) emittierte Licht divergent ist.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Objektiv (1) mehrere Linsen aufweist und dass die Segmentblende (31, 32) benachbart zu einer Linse angeordnet ist, die sich direkt benachbart zur Objektivpupille (9) befindet.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass eine Ausdehnung (35) der Nase (33, 34) nach innen gerade so groß ist, dass das zurücklaufende Anregungslicht (11) blockiert werden kann.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass an einer Außenseite des Objektivs (1) eine Markierung vorhanden ist, die den zweiten Azimutalwinkel (39) anzeigt.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Nachweiseinrichtung (16) einen Kamerasensor mit einem rechteckigen Sehfeld (22) zum Messen des von der Probe emittierten Lichts aufweist und dass die Segmentblende (31, 32) benachbart zu einer Seite des Sehfelds (22), insbesondere zu einer langen Seite des Sehfelds (22), angeordnet ist.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere, insbesondere zwei, Segmentblenden (31, 32) vorhanden sind, die in verschiedenen Positionen entlang der Objektivachse (4) und in verschiedenen zweiten Azimutalwinkeln bezüglich der Objektivachse (4) angeordnet sind.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Segmentblenden (31, 32) gemeinsam und relativ zu einem feststehenden Teil (3) des Objektivs (1) drehbar sind.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass ein Motor (41) zum Drehen der Segmentblende (31, 32) vorhanden ist.
Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Segmentblende (31, 32) als Beschichtung einer Linse des Objektivs (1) oder einer im Objektiv (1) angeordneten Glasplatte ausgebildet ist.
Objektiv zur Verwendung in einem TIRF-Mikroskop (100) mit einem feststehenden Teil (3), welcher in einem in ein TIRF-Mikroskop eingebauten Zustand feststehend ist, mit mindestens einer Segmentblende (31, 32) zum Blockieren von von einer Probe (10) zurücklaufendem, insbesondere reflektiertem, Anregungslicht (11), wobei die Segmentblende (31, 32) mindestens einen Teil eines Kreissektors einer Querschnittsfläche eines Beobachtungsstrahlengangs abdeckt, mit einem drehbaren Teil (2), welcher in dem in ein TIRF-Mikroskop (100) eingebauten Zustand drehbar ist, wobei die Segmentblende (31, 32) mit dem drehbaren Teil (2) mechanisch gekoppelt, insbesondere verbunden, ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Segmentblende (31, 32) einen Ring mit einer nach innen gerichteten Nase (33, 34) aufweist.