JP4500378B2 - 共焦点顕微鏡による検査方法およびそのシステム構成 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する分野】
本発明は、スペクトル域の異なるレーザ光を、少なくとも二つの座標で偏向する顕微鏡光路に送り込み、試料の観察位置に時間的間隔を置いて順次照準、照射していく共焦点顕微鏡による検査方法に関するものである。この方法では試料の少なくとも一つの面においてポイント、ポイント毎におよび走査線毎にレーザ光が照射され、その被照射位置から出る反射光および／または放射光から走査面の画像が形成されるようになっている。本発明の対象は、さらにこの方法実施のためのレーザ走査型顕微鏡にも及んでいる。
【０００２】
【従来の技術】
従来型の光顕微鏡では一画像面の光学記録しか提供できないが、光顕微鏡の特殊改良開発製品としての共焦点顕微鏡によれば、微小構造を立体空間のＺ座標においても結像させて測定することが可能である。
しかし光顕微鏡では、例えば起伏のある粗い試料表面を高倍率で拡大しても、試料が持つ立体構造の印象をつかみ取ることは不可能である。光顕微鏡では常に試料の狭い範囲だけしか鮮明には写し出せない。それは、光の分散成分が多くて、軸方向の分解能に欠けることから、表面窪み部分の仔細構造については画像が不鮮明になるからである。
【０００３】
それに反して、共焦点レーザ走査型顕微鏡の場合、光の分散は大幅に抑制され、対物レンズの焦点平面に位置する構造の画像だけが形成される。光線が異なった別々の平面に集束する場合は、Ｚ軸方向での段階的走査により試料の三次元画像が算定され、提供できるようになっている。
そのために第一の有孔遮光器からの光を被測定面に小さな点状として結像させるが、照射光源としてはレーザを使用する。点状レーザ光は、偏向鏡によって試料表面上をポイント毎におよび走査線毎に網目スクリーンを形成するように移動させる。試料からの反射光および／または放射光は顕微鏡対物レンズを通って、第一有孔遮光器と共役関係の位置に配置されている第二の有孔遮光器に集束される。これら両有孔遮光器の配置関係から、第二有孔遮光器に後続設置されている一つまたは複数の検出器には結果的に焦点平面からの情報だけが到達するようになっている。
【０００４】
焦点の上方および下方に発生する光の分散は、第二有孔遮光器によって排除される。二次元偏向によって得られる複数の重合結像面からの情報は保存されて、画像形成のために再加工される。
共焦点レーザ走査型顕微鏡のこの原理は例えば出版物に紹介されている :「材料試験に於ける新しい検査方法としての共焦点レーザ走査顕微鏡測定法」（雑誌「材料試験」第３９巻(１９９７年度刊)第６号、２６４ページ以降）。そのほか、「科学技術情報」第II巻、第1号、９〜１９ページ（１９９５年６月）の記載内容から知られているように、レーザ走査型顕微鏡の照射光源としては、それぞれ一波長を持つ複数のレーザを組み合わせるか、あるいは多数の利用可能波長を持つ「マルチライン」混合ガスレーザが使用される。それによって、輝面、位相コントラストおよび干渉コントラストという旧来のコントラスト法と並んで蛍光技術用に共焦点顕微鏡測定法を利用する可能性が生まれてくる。その場合では、励起波長と放射波長が様々なスペクトル帯にある色々な弗化クロムの利用下で、物質の構造を複数の蛍光色で同時に表現するということが基本になっている。それにより、様々な色素分子のスペクトル特性と関連づけて、形態学に関する情報のほか生理学的パラメータについても詳細を知ることができる。
【０００５】
蛍光技術に記載の測定法に共焦点顕微鏡を利用すれば、イオンおよび分子の濃度変化について解明の手掛かりが導き出せる。その場合、光強度依存性についてだけでなく、それに加えて励起スペクトルまたは放射スペクトルのずれに関するデータも表示し、ひいてはイオン濃度の定量化をも可能にする指示器を利用することも重要である。この関係ではさらに、定義付けされた不均質状態を生成し、それに続いて現れる平衡状態の動力学を通して流動性や拡散など被測定体に関する情報を得るフォトブリーチ法の適用が提案される。
【０００６】
上記文献から知られているように、可視スペクトル域での蛍光励起には波長４８８ｎｍ、５６８ｎｍ、および６４７ｎｍのＡｒ（アルゴン）レーザ、Ｋｒ（クリンプトン）レーザが使用される。これらは一本のレーザ光に統合され、光導ファイバーを通じて走査装置に送り込まれる。ＵＶ域での励起には波長３５１ｎｍおよび３６４ｎｍのＡｒレーザが勧められる。その場合でも光導ファイバーを通して走査装置へ誘導する。
ここで述べている方法およびシステムは、例えば微小構成体内の立体的な細胞構造または組織構造の分類確定や、あるいは魚実験に於ける染色体内複数遺伝子の位置特定を可能にする三次元データの収集に利用できる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしこの場合では、各試料が、レーザ構成要素で生成されて走査装置に送り込まれるレーザ光により走査域全体に亘って照射されるという欠点がある。つまり、走査域全体に比較的高い光線負荷がかかるので、特に生物体の試験では予期せぬ現象が起きたり、不満足な結果になったりする。
そのほか、試料を例えば上記レーザ光のように異なった波長で励起した場合、個々のスペクトル光が互いに「滲出する」現象が起きるので、試料の特定場所からの放射光および／または反射光に対して明確な検出および判定ができないという欠点もある。
以上の状況を踏まえ、本発明では上記のようなレーザ走査型顕微鏡測定法において試料に対するこのような光線負荷を小さくし、しかも正確な画像判定ができるように改良することを課題としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、この課題はレーザ光の照射ポイントの切替毎にスペクトルの組成および／または光の強度を変えることによって解消される。
これは、顕微鏡光路の偏向操作を繰り返しながら、単一スペクトル成分または複数スペクトル成分の組込をあるいは光線照射全体を時々中断したり、単一スペクトル成分または複数スペクトル成分を時々顕微鏡光路に追加組込することによって行う。そうすることによって、試料内で隣接している少なくとも二つの位置がスペクトル特性の異なる光で、および／または強度の異なるレーザ光線で照射されることになる。顕微鏡光路を偏向させながらレーザ光の組込を時々中断することによって画像面の選択部分だけにレーザ光線を当てることが可能である。
この方法によれば、高強度のレーザ光で照射されるのは画像判定に関係する試料部位だけであることから、試料は保護される。
【０００９】
本発明に記載の方法の変法として、試料内で相互に隣接する複数の部位を対象として走査しながら、その間にスペクトル組成および／またはレーザ光強度を変化させるということがよく行われる。その場合、当走査列を越えて偏向させることが可能で、それは同一方向にも双方向にも複数回行うことができる。
本発明に記載の方法では、例えば走査が同一方向にまたは逆方向に行われようと、それには関係なしに、同列の隣接する走査位置については常にスペクトルの組成や強度を変更して走査するようになっている。そうすることによって、試料へのエネルギー投入を抑制したままで画像判定の品質を高めることができる。それにより同時に、個々のスペクトル域の相互「滲出」現象を起こすことなく試料内の各隣接部位の観察ができるようになる。
【００１０】
顕微鏡光路に組入れるレーザ光を様々なスペクトル組成にするためには、例えば波長６３３ｎｍ、５６８ｎｍ、５４３ｎｍ、５１４ｎｍ、４８８ｎｍおよび４５８ｎｍ等の複数のレーザ線を準備し、必要に応じて、あるいは判定対象である試料の特性に依存して、準備した単一波長のうちの唯一つだけを、または選択した複数のものを、あるいはすべてを組込むというようにする。このような可視領域の光線のほか、例えば３５１ｎｍおよび３６４ｎｍ等のＵＶ領域の波長も組込に利用することができる。
【００１１】
レーザ光線の顕微鏡光路への組込は、本発明では極く一般的な実施態様として、分極状態維持のまま単一モードファイバーを通じてなされる。照射組込用のレーザ線の輝度をそれぞれ所期の通り調整するには、音響光学変調器（ＡＯＭ）を後に接続させることのできる音響光学同調化の可能なフィルタ（ＡＯＴＦ）を利用するのが効率的である。各レーザ波長を、顕微鏡光路に設置された対物レンズに適合させるのは、ＵＶ領域でも可視領域でも調整用可動光線視準器によって行う。
【００１２】
そのほか本発明に記載の方法では、よく見られる実施態様として、試料の各照射箇所からの反射光および／または放射光について、そのスペクトル特性および強度の判定が行われる。その場合、この判定は当該位置の照射と同時に、照射レーザ光のスペクトル組成および／または強度の考慮のもとでなされる。それにより、試料の走査領域を対象として個々のポイントについて判定することが可能になる。その結果、画像判定の際には非常に高い分解能および最高レベルの精度が実現される。
【００１３】
さらには、個々の照射位置から反射したレーザ光および／または放射したレーザ光を複数の検出管路で検出することも本発明の範囲に含まれる。それぞれの検出管路は受光器としてスペクトル成分別に指定されている。従って、複合蛍光プレパラートの検査にとって非常に良好な条件が与えられる。つまり、複合蛍光プレパラートが同時に検査できて、その場合それぞれの検出管路で同一の光学観察条件が設定できる。
【００１４】
これに関連して言えば、本発明の場合顕微鏡光路に組込まれるレーザ光のスペクトル組成および／または強度は試料中に含まれる、または試料に塗布された蛍光染料の励起光線に相応しており、その場合それぞれの検出管路は蛍光染料から発する放射光線の受容に用いられる。そのようにして、各種蛍光染料の励起用にレーザ光を生成することが、また、得られた検出結果より当該蛍光染料の試料上または試料内の分布状態を推察することが可能になる。
【００１５】
以上のほか、本発明では極めて一般的な実施態様として、組込まれたレーザ光のスペクトル組成および／またはその強度が継続的に判定され、しかも特定位置に照準、照射されたレーザ光線の判定結果とその位置からの反射光および／または放射光の判定結果について数学的関連づけがなされている。その関連づけの結果から、例えば隣接する二つの位置からの反射光および／または放射光のスペクトル特性に所定の閾値を越えた差異が確認できれば、当該位置について顕微鏡光路の偏向状態が座標ｘ、ｙ、ｚにより特定できる。それより、これら両位置間に光学的境界層の存在が推測できる。本発明ではこれらの偏向状態に関するデータは保存され、試料内の光学的境界層によって区切られた面積および／または体積の計算用基礎データとして利用される。
【００１６】
そのようにして得られた偏向状態に関する保存データにより、後続の周期的走査における当該位置照射用のレーザ光について、そのスペクトル組成および／または強度の調整シグナルを確認してプリセットすることも可能である。そうした上に、試料および蛍光染料の光学特性を考慮に入れれば、画像判定過程が自動的に最適化される。
【００１７】
本発明に記載の方法はいわゆるフォトブリーチングへの適用には特に有利である。その場合、走査過程では選択された試料部位がまず比較的高い光線強度で照射され、それによってブリーチング過程が惹起される。直後に続く周期的走査により始まった反応が光学的に捕らえられ判定される。それにより、ブリーチング過程の直後に現れる試料物質内の拡散や伝達過程など動力学的プロセスに関する情報を得ることができる。
【００１８】
そのためには走査は単位時間当たりの分解能を非常に高くして行わねばならないが、これは本発明に基づけば、試料の各位置に当たるそれぞれの光の強度およびスペクトル組成を光線の偏向と同時に十分な速さで切替えることによって達成される。
レーザ光線の強度およびスペクトル組成の迅速な変更および切替は、音響光学的に調整可能なフィルタ（ＡＯＴＦ）によって行う。当フィルタは光路中で互いに交換可能な各種フィルタの機能を本質的には受け継いでいるが、その切替スピードはそれらよりはるかに速い。その上、個々のレーザ線および任意に組合わされたレーザ線の強度を単位時間当たり高い作用力で変調することができる。
【００１９】
ＡＯＴＦの機能および応用については、例えば下記文献に記載されている :
String、Kenneth、R.:「蛍光鏡検における照射用波長選択」、NIH、LKEM、ビルディングＮｏ.１０／６Ｎ３０９、Bethexda、MD 20892（１９９３年４月）。
そのほか、ＡＯＴＦの具体的な適用例はアメリカ特許公報 US 5,444,528、US 5,377,003 および US 5,216,484 に紹介されている。
【００２０】
レーザ光線変調のためのＡＯＴＦ調整と光線偏向のための走査装置調整との時間的同期性は、調整装置から走査装置へ発せられた制御シグナルにＡＯＴＦの制御シグナルをその都度適合させることによって達成される。走査装置およびＡＯＴＦの制御は常に同期的に行われる。即ち、走査装置用制御インパルスが発信されれば、それに対応して常にＡＯＴＦ用制御インパルスが発せられる。
これはまた一方では、それぞれの偏向ポジションに、即ち試料の各位置に然るべき強度および／またはスペクトル組成の光を振り向けることが可能であることを意味している。
【００２１】
そのために、本方法実施のための切替システムは、アウトプットから光線変調器の切替に到るまでの制御インパルス作動時間が極く短い時間になるように、ＡＯＴＦによって最適化されている。この時間は＜１０msの範囲にある。変法の一つでは、所定の位置に、それも所定の光線強度およびスペクトル組成の光を正確に照射するため、ＡＯＴＦおよび走査装置の調整において、強度およびスペクトル組成の切替および／または偏向に要する予備調整時間または予備作業時間が予め計算される。
【００２２】
本発明はさらに、レーザ光生成のためのレーザ構成要素、選択可能な様々なスペクトル成分、レーザ光を顕微鏡光路に組込むための単一モードファイバー、少なくとも二次元で偏向できる走査装置、レーザ光を試料上に集束させる顕微鏡対物レンズ、試料からの反射光および／または放射光の様々な成分を受容するための複数の検出器および検出器の出力側に後置されている判定機器を有する、上記作業過程実施のためのレーザ走査型顕微鏡をも対象にしている。
【００２３】
本発明に記載のようなレーザ走査型顕微鏡のレーザ構成要素には、個々に調整可能な複数の単一型および／または複合型波長レーザが設置されており、レーザ構成要素の後には光線集束器、音響光学的に調整可能なフィルタ（ＡＯＴＦ）および／または音響光学変調器（ＡＯＭ）が配置され、単一モードファイバーの後には、それぞれのファイバー末端までの距離が変更可能な視準レンズが配置されており、それらは制御可能な調整装置と連結している。
【００２４】
検出器としては光電子増倍器（ＰＭＴ）が装備されていて、各反射帯か放射帯に、つまり各検出管路にそれぞれ一つづつ配置されている。試料から出て各検出管路に入る光線の分岐には、リング状分離器上に配置されていて、そのリング状分離器の回転によって互いに交換し得るようになっているフィルタおよび／または色分離器が使用される。各リング状分離器も制御可能な調整装置と連結している。さらに、レーザ構成要素、ＡＯＴＦ、ＡＯＭ、走査装置およびリング状分離器用調整装置、視準レンズ用調整装置の各制御入力部は判定機器の出力部と結合している。
レーザ走査型顕微鏡の変形として試料に照準される顕微鏡光路が分岐している場合がある。分岐の一つは、その出力部が制御ユニットとも結合している光電子受容器に向けられている。
【００２５】
そのほか、本発明の変法の中で極く一般的な実施態様として、判定機器においては光電子受容器の出力信号とＰＭＴの出力信号および／または走査装置用偏向信号とが数学的に結びつけられているものがある。その場合、判定機器の出力部において最適化された調整信号がレーザ構成要素、ＡＯＴＦ、ＡＯＭ、走査装置および調整装置用に提供されることになる。
【００２６】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を実施例に基づき詳しく説明する。
図１に描かれたレーザ構成要素１には、レーザ２、３および４が装備されていて、それぞれ可視領域、即ち波長６３３ｎｍ、５４３ｎｍおよび４５８ｎｍのレーザ光を生成する。これらのレーザから出た光線は複数の光結合器５、ＡＯＴＦ６およびファイバー７を経由して、座標ｘおよびｙに光線偏向ユニット９の装備された走査装置８に進入する。
レーザ構成要素１０には、ＵＶレーザが備えられてあり、その光はＡＯＴＦ１１および光誘導ファイバー１２を経由して走査装置８に進入する。
【００２７】
これら両光路内には光誘導ファイバー７および１２の後方にそれぞれ視準レンズ１３が設置されている。それぞれのレンズはファイバー末端との距離が変更できるようになっており、そのために制御可能な調整装置（図には描かれていない）と連結されている。
光線偏向装置９に到達したレーザ光線は、走査対物レンズ１４を通り、簡略図示された顕微鏡１５の光路に入り、そこで試料１６のほうに向けられる。その後、レーザ光線は鏡胴レンズ１７、光線分離器１８および顕微鏡対物レンズ１９を通過する。
【００２８】
試料１６の被照射位置からの反射光および／または放射光は、顕微鏡対物レンズ１９を通って光線偏向装置９に戻り、その後、光線分離器２０を通って結像レンズ２１に到達する。そこでいくつかの検出管路２２へと分岐され、その各検出管路２２に一つずつ配置された光電子増倍器２３の方に向けられる。個々の検出管路２２への光線分岐のため、光は偏向プリズム２４からダイクロイック光線分離器２５の方へ向けられる。各検出管路２２には光線方向にも光線と垂直方向にも位置調整ができて、直径も変更できるピンホール２６および放射フィルタ２７が備え付けられている。
【００２９】
光電子増倍器２３の出力部は、制御装置２９と結合している判定機器２８の信号入力部に通じている。制御装置２９の出力部はレーザ構成要素１および１０の信号入力部と、さらには例えば視準レンズ１３、ピンホール２６などの光学素子や光学構成ユニットの位置変更のための調整装置の信号入力部とも結合している（詳細は図示してない）。
【００３０】
例えば、走査装置８に送り込まれたレーザ光線は、光線分離器３０によって分岐される。その場合、分岐の一つは光電子受容器３１に向けられている。当受容器の前には複数の線状フィルタ３２および中性フィルタ３３がリング状フィルタ架台の上に設置され、いずれもリング状フィルタ架台の回転によって入れ替え可能になっている。受光器３１の出力部も同様に判定機器２８の信号入力部に繋がっている。線状フィルタ３２と中性フィルタ３３の配置されているリング状フィルタ架台は、その制御導入部が制御装置２９の信号出力部と結合している調整機器と繋がっている（図示してない）。
【００３１】
レーザ走査型顕微鏡の操作では、顕微鏡光路の光学軸３８を走査装置８を通じて図２に図解されているように、試料の判定対象である仔細部分３５を含む走査対象面３４において、Ｘ座標の方向にポイント毎におよびＹ座標の方向に列毎に網目状に移動させる。
従来の技術レベルでは、レーザ光は走査のあいだスペクトル組成およびスペクトル強度に変化がないまま顕微鏡光路に入り込むため、例えば個々の細胞、細胞内小器官、生物体または寄生生物など特に極端にコントラストの乏しい対象物の構造を高分解能で観察する場合では、十分な輝面または位相コントラストを持った画像を得るには一貫して高い光線負荷を要していた。
【００３２】
光線負荷を小さくして、しかも画像判定の品質を高くするためには、本発明の方法では列および／またはその他対象物表面３４の走査中に単一または複数のスペクトル成分、場合によっては全スペクトルの組込を時々中断したり、あるいは単一または複数のスペクトル成分を時々追加組込したりするようになっている。
【００３３】
レーザ光のスペクトル組成および強度を変更するあいだ、光線偏向装置９は繰り返し作動したままである。その結果、例えば走査列内または走査対象試料内の位置３６と３７とでは照射状態が異なってくる。それにより、判定対象部分３５、例えばその中の列に含まれる位置３７では受ける照射光線が弱くなるということが起こり得る。あるいはまた、位置３７の走査ではそれが望ましい限り、逆にレーザ光強度の引き上げおよび／またはレーザ光スペクトルの変更が行われる。例えばフォトブリーチングの目的のために本発明の方法を適用する場合である。その場合では、その直後に展開される動力学的過程を追跡できるように、選択された試料位置を極めて高い光線強度で照射することが肝要である。
【００３４】
【発明の効果】
本発明に記載の方法およびシステムによれば、被照射位置３６および３７それぞれからの反射光および／または放射光を個々の検出管路２２に受け入れることが可能である。それぞれの検出管路２２は各位置から出た光の様々なスペクトル成分が受容できるように、各々がそれに対応した構成に調整されている。
本発明に記載の方法の特異性は、各照射位置から出た光の検出および評価が当該位置の照射と同時に行われるところにある。このような特徴から、試料のそれぞれの位置３６および３７に於ける励起波長および放射波長の判定が可能である。それにより、正確に特定された観察位置での試料特性を把握することができる。
【００３５】
その上、本発明に記載のシステムによれば、光電子受容器３１から発した信号を基にして、試料に向けられたレーザ光の組成および強度を継続的に検査することも、さらに制御装置２９を通じて極めて微小な強度変動の補整にさえその信号を利用することが可能である。
【００３６】
同一位置における励起光線および放射光線の判定は、判定機器２９に組み込まれている計算機器によりその都度行われる。そのようにして、ある場所から他の場所への、例えばすぐ隣同士の位置３６、３７間でのレーザ光線偏向の場合に放射光線の放射波長または強度に所定の閾値を超えた変化が現れたかどうかを正確に確認することができる。そのような変化がある限り、隣接位置３６および３７間に光学的境界層が存在するものと推定できる。
【００３７】
これらの位置３６および３７についても試料の他の走査位置と同様、偏向ポジションに関するデータも制御装置２９および／または判定機器２８に用意されているので、本発明に記載の方法によれば関連する偏向ポジションを基にそのような光学的境界層を求めることができ、その偏向ポジションを基礎として、最終的には光学境界層に囲まれた部分の面積および体積を計算することもできる。
念のために付け加えておくが、図２に描いた測定面３４は試料の一走査面を表しているに過ぎない。当然のことながら、レーザ光線をＺ方向、即ち描かれた面に垂直方向に集束させることにより複数の試料面を走査することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 レーザ走査型顕微鏡の構造原理図
【図２】 個々の試料位置を通るレーザ光の偏向原理
【符号の説明】
１ レーザ構成要素
２,３,４ レーザ
５ 光結合器
６,１１ ＡＯＴＦ
７ ファイバー
８ 走査装置
９ 光線偏向装置
１１,１２ 光ファイバー
１３ 視準レンズ
１４ 走査対物レンズ
１５ 顕微鏡
１６ 試料
１７ 鏡胴レンズ
１８,２０ 光線分離器
１９ 対物レンズ
２１ 結像レンズ
２２ 検出管路
２３ 光電子増倍器
２４ 偏向プリズム
２５ ダイクロイック光線分離器
２６ ピンホール
２７ 放射フィルタ
２８ 判定機器
２９ 制御装置
３０ 光線分離器
３１ 光電子受容器
３２ フィルタ
３３ 中性フィルタ

Claims (12)

1. 異なるスペクトル領域のレーザ光が、顕微鏡光路に組み込まれており、
   試料は、少なくとも二次元方向に走査線毎にスキャンされ、そしてその試料光は、被照射位置から反射およびまたは放射する光から励起された試料の少なくとも一つの画像として、スペクトルで検出される共焦点レーザ走査顕微鏡法において、
   画像の励起中に、レーザ光がスペクトル成分に変えられ、そして走査線に沿って隣接する試料位置が異なるスペクトル成分のレーザ光で照射され、
   そして試料がレーザ光で照射された結果、特有のレーザ光のスペクトル成分が各スペクトル位置に割り当てられ、
   そのため試料成分の特定位置が走査される時に、レーザ光のスペクトル成分の選択的変更がなされることを特徴とする共焦点レーザ走査顕微鏡法。
2. イメージの励起中に、レーザ光はスペクトル成分が変えられ、そして走査線に沿って隣接する試料位置が異なる強度のレーザ光で照射され、
   そしてレーザ光が試料上を走査する結果、特定位置の強度が各試料の位置に割り当てられることを特徴とする請求項１に記載の共焦点レーザ走査顕微鏡法。
3. 個々またはいくつかのスペクトル成分の一時的追加組込みによるあるいは個々またはいくつかのスペクトル成分の一時的中断による検出中に、スペクトル成分およびまたはレーザ光の強度が変化することを特徴とする請求項１または２に記載の共焦点レーザ走査顕微鏡法。
4. レーザ光の組込みが検出中に一時的に中断されることを特徴とする請求項１、２または３に記載の共焦点レーザ走査顕微鏡法。
5. 可視域の波長λ_Ａ１＝６３３ｎｍ、 λ_Ａ２＝５６８ｎｍ、 λ_Ａ３＝５４３ｎｍ、 λ_Ａ４＝５１４ｎｍ、 λ_Ａ５＝４８８ｎｍおよび／またはλ_Ａ６＝４５８ｎｍのスペクトル成分、およびまたはＵＶ域の波長λ_Ａ７＝３５１ｎｍおよび／またはλ_Ａ８＝３６４ｎｍのスペクトル成分が、一時的に追加的に組み込みされるか、あるいはその組み込が一時的に中断されることを特徴とする請求項１から４のいずれか１に記載の共焦点レーザ走査顕微鏡法。
6. 各単一試料位置に当てられる反射光およびまたは放射光が、スペクトル特性およびその強度について、しかも同位置への照射と同時に同期して評価され、そして一方、その位置に当たるレーザ光のスペクトル成分およびまたはその強度が考慮されることを特徴とする請求項１から５のいずれか１に記載の共焦点レーザ走査顕微鏡法。
7. 個々の照射位置ごとに反射およびまたは放射されたレーザ光が、それぞれが複数の検出路で検出され、その個々の検出路が異なるスペクトル成分の受容用として設置されていることを特徴とする請求項６に記載の共焦点レーザ走査顕微鏡法。
8. 顕微鏡光路に組み込まれたレーザ光のスペクトル成分およびまたはその強度が、試料に含まれた、または試料に塗布された蛍光染料の励起光線に対応していること、および蛍光染料から出る放射光線を受け入れるために個々の検出路が割り当てられていることを特徴とする請求項１から７のいずれか１に記載の共焦点レーザ走査顕微鏡法。
9. 光学的境界層の位置を決定するために、顕微鏡光路の偏向位置が決定されそして隣接する位置が記憶され、そのためこれらの位置で反射およびまたは放射される光線のスペクトル特性の差が、予め決定された閾値を超えることを特徴とする請求項１から８のいずれか１に記載の共焦点レーザ走査顕微鏡法。
10. 記憶された偏向位置で、レーザ光のスペクトル成分およびまたはその強度の調整信号が決定され、後続する走査サイクルでこれらの位置に有効に働くようにプリセットされることを特徴とする請求項１から９のいずれか１に記載の共焦点レーザ走査顕微鏡法。
11. − 選択可能な様々なスペクトル成分を有するレーザ光の励起用レーザモジュール、
    − レーザ光の顕微鏡光路への組み込みのための単一モードファイバー、
    − 少なくとも二次元で偏向する走査装置、
    − レーザ光を試料上に集束させる顕微鏡対物レンズ、
    − 試料の反射光およびまたは放射光の異なるスペクトル成分の受容のための複数の検出器
    − 検出器の出力部の後に接続された評価回路
    とから構成され、
    − レーザモジュールに、複数の個別制御式単一波長型およびまたは複合波長型レーザ、および音響光学作用型フィルタ（ＡＯＴＦ）が装備されていて、そしてＡＯＴＦが同期方式で制御可能であり、
    − 検出器として光電子増倍器（ＰＭＴ）が配備され、そして試料から個々の検出チャンネルに進む反射光線およびまたは放射光線を分岐させるために、制御可能な切替装置に配置されそして互いに取り換え可能な色分離器が配備されており、
    − レーザモジュール、走査装置および切替装置の制御入力部が評価回路の出力部に接続している、
    ことを特徴とする請求項１から１０のいずれか１に記載の共焦点レーザ走査顕微鏡法を実行するためのレーザ走査型顕微鏡。
12. 顕微鏡光路に組み込まれたレーザ光の放射成分を、その出力部が評価回路と接続している光電子受容器に向けられていることを特徴とする請求項１１に記載のレーザ走査型顕微鏡

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