JP2013539074A - 3d局在顕微鏡法並びに4d局在顕微鏡法及び追跡方法並びに追跡システム - Google Patents
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Abstract
Description
前記方法は、対物レンズの一部分へ又は前記対物レンズの前記一部分から進む光と、前記対物レンズの別の部分へ又は前記対物レンズの前記別の部分から進む光との間の位相差を発生させて、2つの画像ローブを含む点放射体画像を生成することを含み、
それによって、
負の焦点外れを発生させる前記対物レンズに対する放射体の位置において、実質的に軸に沿った第1の互いに対向する方向に前記2つの画像ローブが互いから分離され、
負の焦点外れを発生させる前記対物レンズに対する放射体の位置において、実質的に前記軸に沿った第2の互いに対向する方向及び各前記画像ローブの各相対位置からの前記放射体のz軸位置において前記2つの画像ローブが互いから分離される、方法を含む。
前記システムは、対物レンズの一部分へ又は前記対物レンズの前記一部分から進む光と、前記対物レンズの別の部分へ又は前記対物レンズの前記別の部分から進む光との間の位相差を発生させて、2つの画像ローブを含む点放射体画像を生成するように構成され、
それによって、
負の焦点外れを発生させる前記対物レンズに対する放射体の位置において、実質的に軸に沿った第1の互いに対向する方向に前記2つの画像ローブが互いから分離され、
負の焦点外れを発生させる前記対物レンズに対する放射体の位置において、実質的に前記軸に沿った第2の互いに対向する方向に前記2つの画像ローブが互いから分離される、3D局在顕微鏡法システムを含む。
前記方法は、対物レンズの一部分へ又は前記対物レンズの前記一部分から進む光と、前記対物レンズの別の部分へ又は前記対物レンズの前記別の部分から進む光との間の位相差を発生させて、2つのローブを含む点放射体画像を生成することを含み、
前記2つのローブ間の分離は、撮像システムの前記対物レンズに対する前記放射体の位置に関連し、
前記画像の更なる特性、又は前記対物レンズへの若しくは前記対物レンズからの前記光の更なる特性は、前記放射体の別のロケーション非依存特性及び各前記画像ローブの各相対位置からの前記放射体のz軸位置に関連し、
前記方法は、前記別のロケーション非依存特性を評価することを含む、方法を含む。
負の焦点外れを発生させる前記対物レンズに対する放射体の位置において、実質的に軸に沿った第1の互いに対向する方向に前記2つの画像ローブが互いから分離され、
負の焦点外れを発生させる前記対物レンズに対する放射体の位置において、実質的に前記軸に沿った第2の互いに対向する方向に前記2つの画像ローブが互いから分離される。
前記システムは、対物レンズの一部分へ又は前記対物レンズの前記一部分から進む光と、前記対物レンズの別の部分へ又は前記対物レンズの前記別の部分から進む光との間の位相差を発生させて、2つのローブを含む点放射体画像を生成するように構成され、
前記2つのローブ間の分離は、撮像システムの前記対物レンズに対する前記放射体の位置に関連し、
前記画像の更なる特性、又は前記対物レンズへの若しくは前記対物レンズからの前記光の更なる特性は、前記放射体の別のロケーション非依存特性に関連する、システムを含む。
負の焦点外れを発生させる前記対物レンズに対する放射体の位置において、実質的に軸に沿った第1の互いに対向する方向に前記2つの画像ローブが互いから分離され、
正の焦点外れを発生させる前記対物レンズに対する放射体の位置において、実質的に前記軸に沿った第2の互いに対向する方向に前記2つの画像ローブが互いから分離される。
実験的な研究の以下の説明によって本発明を更に説明する。
材料及び方法
[細胞単離及び標識付け]
成体ラットから心室筋細胞を酵素によって単離し、2%のパラホルムアルデヒドで10分間にわたって固定した。次に、心室筋細胞は、標準的な免疫蛍光プロトコルに従って、マウス内で生じた一次抗体(T4026, Sigma-Aldrich, ニュージーランド)を用いてβチューブリンについて標識付けられ、Alexa680が二次的に標識付けた(A21058, Molecular Probes/Invitrogen, ニュージーランド)。標識付けられた細胞を、グリセリン及びPBSの80:20の混合物における0.5mg mL−1グルコースオキシダーゼ、40μg mL−1カタラーゼ、10%(w/v)グルコース、及び50mMのβメルカプトエチルアミンからなる「スイッチングバッファ(switching buffer)」(全てSigma-Aldrich, ニュージーランド、から得られる)にマウントした。
蛍光検出のために、60倍の1.47NA TIRF対物レンズを有する変更されたNikon TE2000顕微鏡、及びAndor IXon DV887DCS-BV EMCCDカメラを用いて撮像を実行した。急傾斜の平面照明を、671nmのレーザー光源とともに用い、約109W/m2の焦点面輝度を得た。フレームあたり40msの積分時間を用いて再構成ごとに約20000個のフレームを撮影した。圧電焦点合わせ装置(piezo focusser)(Physik Intrumente、ドイツ)を用いて焦点合わせを実行し、200nmの軸ステップサイズを有するzスタックを取得した。zスタックは、1.2μmの範囲にわたる7個の軸位置を含んでいた。試料退色が異なる平面内で観察される信号量に影響を及ぼさないことを確実にするために、焦点が前後に(zレベルあたり100フレームの、退色レートと比較して)迅速に動かされるzサンプリング戦略を用い、各軸位置に対応する面を画像捕捉の完了後に照合した。試料内のPSFローブ分離sを達成するのに必要な角度を、光線光学から、□=sM/(fT(n−1))として推定した。ここで、Mは対物レンズの倍率であり、fTは対物レンズ設計チューブ長(objective design tube length)(ここではNikon CFI60対物レンズの場合200mm)であり、nはスライドガラス(glass slide)の屈折率(1.51)である。このため、小さいが60倍の対物レンズで良好に分解可能な約400nmのスポット分離を、スライド面間の約50秒角の角度で達成することができる。顕微鏡スライドガラスの2つの表面が非常に平坦であるが完全に平行ではないことを利用することによって位相マスクが作成される。小さいが60倍の対物レンズで良好に分解可能な約400nmのスポット分離を達成するには、2分角〜3分角の通常のスライド平行度公差内に十分入る50秒角の角度で十分である。スライドのボックスを検査することによって、スライドがフィルター交換器の下に挿入されて対物レンズの後方開口の半分を占め、それによって瞳面の半分を占め、分岐したPSFが生じるときに適切な位相勾配を引き起こす幾つかのスライドを得た。位相傾斜が厳密に瞳面内にはなく、現代の無限補正対物レンズ(modern infinity-corrected objective)の裏の「無限空間」(試料内の点光源からの光が本質的にコリメートされる)内のいずれかの場所にあるとき、依然として効果が観察された。これによって、瞳面を再撮像する必要がなくなり、使用されていないDIC解析器スロット内のフィルター交換器の後の好都合なロケーションに位相傾斜を位置決めすることが可能になった。
単一分子の位置を、補間された測定されたPSFの、撮像データへのレーベンバーグ−マルカート重み付き最小二乗あてはめを実行することによって抽出した。3つの異なる補間戦略(すなわち、フーリエ領域シフト、三次スプライン補間、及び単純線形補間)を調査した。フーリエ領域シフトを用いて得られた結果と三次スプライン補間法を用いて得られた結果との間で大きな差は観察されなかった。線形補間がはるかに最も高速であった。あてはめアルゴリズムにおいて用いられる重み付けは、任意の所与のピクセルにおける計算された雑音(ポアソン過程、電子倍増過程、及び読出し雑音過程を考慮に入れる)に対応し、収束時の共分散行列の解析から、あてはめ誤差の推定値が得られることを可能にする。
各局在事象をガウス分布としてレンダリングすることによって、図10bに示すような深度が符号化された射影画像を得た。ここで、色はそのあてはめられたz位置に対応し、標準偏差は平均横方向局在精度に等しい。次に、結果としての画像を、GIMP画像編集プログラムを用いて穏やかに輝度飽和させ、弱い構造の視認性を向上させた。3Dガウス分布として各事象をレンダリングすることによって、3Dボリュームデータを得た。ここで、横方向及び軸方向の標準偏差は、横方向及び軸方向の事象の推定局在誤差に対応する。定位置の位相プレートを用いて得られた広視野画像は劣化し、ゴーストを発生させるアーチファクトを示す。通常の広視野PSFの横方向及び軸方向の標準偏差に対応する横方向及び軸方向の標準偏差を用いて、同じ励起波長で各事象をレンダリングすることによって、局在事象から、従来の回折制限された解像度のボリュームデータを再構成した。OpenDX(www.opendx.org)を用いてボリュームデータの等値面レンダリングを実行した。
図13は、本方法(PRI)の軸方向局在精度と、2つの既存の3D局在法、すなわち非点収差検出及び二方向検出の軸方向局在精度との理論的比較を示している。精度を比較するために、3つの方法の点拡がり関数をシミュレートし、クラメル−ラオ下限を計算するのに用いた。これは、点拡がり関数形状に含まれる情報に基づき、所与の雑音条件下の可能な限り最小の局在誤差(完全な解析アルゴリズムを用いて得られるもの)を表す。雑音計算のために、雑音がポワソン統計に従い、各蛍光分子から合計2000個の光子が検出されると仮定した。本発明の方法は、他の方法と比較して、より優れた軸方向精度および全体にわたる3D精度を有するものとして示されることを見てとることができ、横方向精度がより広い軸範囲にわたって維持されることを見てとることができる。
図14は、2つのローブの相対振幅に対する波長依存を、光学フィルターを用いて生成することができることを示している。実験的な撮像システム(これ以外では実施例1において概略が示されたようなもの)において、位相傾斜が瞳面の半分に挿入され、ロングパス干渉フィルターが残る半分に挿入された。この構成は、3つの異なる色において蛍光ビーズを撮像するのに用いられ、これらのビーズタイプのそれぞれに対応する点拡がり関数を通じた焦点の合った部分が図14a〜図14cに示されている。各PSFの中心を通る線プロファイルが図14dとしてプロットされ、異なるビーズタイプがそれらの相対的なローブ高さによって明確に区別可能であることを示している。
Claims (51)
- 3D局在顕微鏡法システムであって、
前記3D局在顕微鏡法システムは、対物レンズの一部分へ又は前記対物レンズの前記一部分から進む光と、前記対物レンズの別の部分へ又は前記対物レンズの前記別の部分から進む光との間の位相差を発生させて、2つの画像ローブを含む点放射体画像を生成するように構成され、
それによって、
負の焦点外れを発生させる前記対物レンズに対する放射体の位置において、前記2つの画像ローブが、実質的に軸に沿った第1の互いに対向する方向に互いから分離され、
正の焦点外れを発生させる前記対物レンズに対する放射体の位置において、前記2つの画像ローブが、実質的に前記軸に沿った第2の互いに対向する方向に互いから分離される、3D局在顕微鏡法システム。 - 4D局在顕微鏡法システムまたは放射体追跡システムであって、
前記4D局在顕微鏡法システムまたは前記放射体追跡システムは、対物レンズの一部分へ又は前記対物レンズの前記一部分から進む光と、前記対物レンズの別の部分へ又は前記対物レンズの前記別の部分から進む光との間の位相差を発生させて、2つのローブを含む点放射体画像を生成するように構成され、
前記2つのローブ間の分離は、撮像システムの前記対物レンズに対する放射体の位置に関連し、
前記画像の更なる特性、又は前記対物レンズへの若しくは前記対物レンズからの前記光の更なる特性は、前記放射体の別のロケーション非依存特性に関連する、
4D局在顕微鏡法システムまたは放射体追跡システム。 - 前記対物レンズの一部分へ又は前記対物レンズの前記一部分から進む光と、前記対物レンズの別の部分へ又は前記対物レンズの前記別の部分から進む光との間の前記位相差を発生させて、2つの画像ローブを含む点放射体画像を生成するように構成され、
負の焦点外れを発生させる前記対物レンズに対する放射体の位置において、前記2つの画像ローブが、実質的に軸に沿った第1の互いに対向する方向に互いから分離され、
正の焦点外れを発生させる前記対物レンズに対する放射体の位置において、前記2つの画像ローブが、実質的に前記軸に沿った第2の互いに対向する方向に互いから分離される、請求項2に記載のシステム。 - 前記更なる特性は前記画像ローブ間の分離である、請求項2又は3に記載のシステム。
- 前記更なる特性は、前記放射体の前記位置に関連する前記画像ローブ間の前記分離の前記軸に対し或る角度を成す軸における前記画像ローブ間の分離である、請求項4に記載のシステム。
- 前記画像の前記更なる特性は、前記放射体の前記位置に関連する前記画像ローブ間の前記分離の前記軸に対し実質的に直交する軸における前記画像ローブ間の分離である、請求項4に記載のシステム。
- 前記更なる特性は、前記放射体からの光の輝度、スペクトル成分、寿命、又は偏光状態である、請求項2又は3に記載のシステム。
- 前記放射体の前記ロケーション非依存特性は、前記放射体からの光のスペクトル成分、寿命、又は偏光状態のうちの任意の1つ又は複数である、請求項2〜7のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記システムは、前記対物レンズに対する放射体の、焦点の合った位置において、前記2つの画像ローブが、前記放射体の前記位置に関連する前記画像ローブ間の分離の前記軸に沿って互いから実質的に分離されないように構成される、請求項1〜8のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記システムは、前記対物レンズに対する放射体の、焦点の合った前記位置において、前記2つの画像ローブが、前記放射体の前記位置に関連する前記画像ローブ間の分離の前記軸に実質的に直交して互いから分離されるように構成される、請求項1〜9のいずれか1項に記載のシステム。
- 屈折位相変更装置を備え、
前記屈折位相変更装置は、前記対物レンズの一部分へ又は前記対物レンズの前記一部分から進む光と、前記対物レンズの別の部分へ又は前記対物レンズの前記別の部分から進む光との間の前記位相差を発生させるように構成される、請求項1〜10のいずれか1項に記載のシステム。 - 前記屈折位相変更装置は位相傾斜を備える、請求項11に記載のシステム。
- 前記位相傾斜は線形位相傾斜である、請求項12に記載のシステム。
- 前記位相変更装置は、単一の位相傾斜を備え、
前記単一の位相傾斜は、前記対物レンズの一部分へ又は前記対物レンズの前記一部分から進む光と、前記対物レンズの別の部分へ又は前記対物レンズの前記別の部分から進む光との間の前記位相差を発生させるように構成される、請求項12又は13に記載のシステム。 - 前記位相変更装置は、少なくとも2つの位相傾斜を備え、
少なくとも1つの位相傾斜は、前記対物レンズの一部分へ又は前記対物レンズの前記一部分から進む光に対し位相変化を発生させるように構成され、
少なくとも1つの別の位相傾斜は、前記対物レンズの別の部分へ又は前記対物レンズの前記別の部分から進む光に対し位相変化を発生させるように構成される、請求項11に記載のシステム。 - 前記2つの位相傾斜は、互いに異なる位相変化勾配を有する、請求項15に記載のシステム。
- 前記2つの位相傾斜は、互いに反対向きの位相変化勾配を有する、請求項15又は16に記載のシステム。
- 前記2つの位相傾斜は、互いに等しいが反対向きの位相変化勾配を有する、請求項15に記載のシステム。
- 前記位相変更装置は、鋸歯構成の複数の線形傾斜を備える、請求項11に記載のシステム。
- 前記システムは反射性位相変更装置を備え、
前記反射性位相変更装置は、前記対物レンズの一部分へ又は前記対物レンズの前記一部分から進む光と、前記対物レンズの別の部分へ又は前記対物レンズの前記別の部分から進む光との間の前記位相差を発生させるように構成される、請求項1〜10のいずれか1項に記載のシステム。 - 前記反射性位相変更装置は、少なくとも2つの反射性位相傾斜を備え、
少なくとも1つの反射性位相傾斜は、前記対物レンズの一部分へ又は前記対物レンズの前記一部分から進む光に対し位相変化を発生させるように構成され、
少なくとも1つの別の反射性位相傾斜は、前記対物レンズの別の部分へ又は前記対物レンズの前記別の部分から進む光に対し位相変化を発生させるように構成される、請求項20に記載のシステム。 - 前記反射性位相変更装置は、固定の相対角度での反射面を備える、請求項21に記載のシステム。
- 前記反射性位相変更装置は、調整可能な相対角度での反射面を備える、請求項21に記載のシステム。
- 前記反射性位相変更装置は、線形に変動する位相差を発生させるように構成される、請求項21〜23のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記反射性位相変更装置は、鋸歯構成の複数の線形反射性位相傾斜を備える、請求項21に記載のシステム。
- 前記反射性位相変更装置は変形可能なミラーを備える、請求項19に記載のシステム。
- 前記システムは分散性位相変更装置を備え、
前記分散性位相変更装置は、前記対物レンズの一部分へ又は前記対物レンズの前記一部分から進む光と、前記対物レンズの別の部分へ又は前記対物レンズの前記別の部分から進む光との間の前記位相差を発生させるように構成される、請求項1〜10のいずれか1項に記載のシステム。 - 前記分散性位相変更装置は、2つの分散性位相変更装置を備え、
前記2つの分散性位相変更装置は、高分散位相変更装置と、低分散位相変更装置とを含む、請求項27に記載のシステム。 - 前記システムは位相変更装置を備え、
前記位相変更装置は、前記対物レンズの一部分へ又は前記対物レンズの前記一部分から進む光と、前記対物レンズの別の部分へ又は前記対物レンズの前記別の部分から進む光との間の前記位相差を発生させるように構成され、
前記位相変更装置は回折格子を備える、請求項1〜10のいずれか1項に記載のシステム。 - 前記位相変更装置は回折格子と及び平面鏡とを備える、請求項29に記載のシステム。
- 各前記画像ローブの各相対位置から前記放射体のz軸位置を評価するように構成された画像処理システムを備える、請求項1〜30のいずれか1項に記載のシステム。
- 画像処理システムを備え、
前記画像処理システムは、各前記画像ローブの各相対位置を、数学的モデル若しくは数値モデル又はルックアップデータベースに合致させることによって前記放射体のz軸位置を評価するように構成される、請求項1〜30のいずれか1項に記載のシステム。 - 画像処理システムを備え、
前記画像処理システムは、
未加工画像を捕捉するステップと、
前記未加工画像の背景が減算された推定値及び前記未加工画像の信号対雑音比(SNR)推定値を得るステップと、
前記未加工画像の前記背景が減算された推定値及び前記SNR推定値における対象物コントラストを最大にするステップと、
しきい値処理された画像及び前記しきい値処理された画像上の開始位置のリストを得るステップと、
前記リスト内の誤検出された開始位置を破棄するステップと、
前記撮像システムの点拡がり関数、前記未加工画像のSNR推定値及び背景推定値を用いて、前記開始位置のリストに対し最適化あてはめプロセスを実行するステップと、
あてはめられた開始位置を前記未加工画像の3D画像に組み立てるステップと、
を含む複数のステップによって、少なくとも未加工放射体画像の3D放射体画像を生成する、請求項1〜32のいずれか1項に記載のシステム。 - 画像処理システムを備え、
前記画像処理システムは、
前記未加工画像のオフセットを補正し、
光電子数の観点から前記画像を較正し、
現在の未加工画像に系列内で先行する複数の画像の平均を減算する
ことによって、前記背景が減算された推定値を捕捉するように構成される、請求項33に記載のシステム。 - 前記画像処理システムは、前記未加工画像の各ピクセル内の光電子数の平方根を計算することによって前記SNR推定値を得るように構成される、請求項33又は34に記載のシステム。
- 前記画像処理システムは、
ウィナーフィルタリング、
前記撮像システムの点拡がり関数を用いた相関、又は
最尤デコンボリューション
のうちの任意の1つ又は複数によって、前記背景が減算された推定値における対象物コントラストを最大にするように構成される、請求項33〜35のいずれか1項に記載のシステム。 - 前記しきい値処理された画像は、前記背景が減算されコントラストが強化された推定値が、前記SNR推定値に一定の係数を乗算したものよりも明るいエリアを示すマスクである、請求項33〜36のいずれか1項に記載のシステム。
- 開始位置のリストは、
前記画像内の連続エリアを取り出すために二値標識付けを実行するステップと、
前記二値標識付けがなされた画像内の各標識付けられた領域の輝度中心を計算するとともに、これを前記標識付けられた領域の前記開始位置として用いるステップと、
によって、前記しきい値処理された画像から計算される、請求項33〜37のいずれか1項に記載のシステム。 - 前記画像処理システムは、
開始位置の選択された範囲内の近傍点の情報を抽出するステップと、
前記開始位置及び前記選択された近傍点の輝度を計算するステップと、
前記開始位置及び前記近傍点の前記輝度を比較するステップと、
前記開始位置の輝度が近傍点の輝度よりも大きくない場合、前記開始位置を破棄するステップと、
を含む複数のステップによって、誤検出された開始位置を破棄するように構成される、請求項33〜38のいずれか1項に記載のシステム。 - 前記画像処理システムは、
「データROI」及び「SNR ROI」を得るために、背景補正された画像内の各開始位置の周りの関心領域(ROI)及びSNR推定値から情報を抽出するステップと、
これらの領域からの前記データを用いて開始パラメータを計算するステップと、
前記撮像システムの前記点拡がり関数から導出された補間モデルと、
開始パラメータと、
前記SNR ROIと
を用いて前記データROIをあてはめることによって、最適化プロセスを実行するステップと、
を含む複数のステップによって、背景補正された画像における関心領域に対する最適化あてはめプロセスを、各開始位置について実行するように構成される、請求項33〜39のいずれか1項に記載のシステム。 - 近傍点の前記選択された範囲は、前記撮像システムの前記点拡がり関数よりも大きなサイズである、請求項39に記載のシステム。
- 3D局在顕微鏡法の一方法であって、
前記方法は、対物レンズの一部分へ又は前記対物レンズの前記一部分から進む光と、前記対物レンズの別の部分へ又は前記対物レンズの前記別の部分から進む光との間の位相差を発生させて、2つの画像ローブを含む点放射体画像を生成することを含み、
それによって、
負の焦点外れを発生させる前記対物レンズに対する放射体の位置において、前記2つの画像ローブが、実質的に軸に沿った第1の互いに対向する方向に互いから分離され、
正の焦点外れを発生させる前記対物レンズに対する放射体の位置において、前記2つの画像ローブが、実質的に前記軸に沿った第2の互いに対向する方向及び各前記画像ローブの各相対位置からの前記放射体のz軸位置において、互いから分離される、3D局在顕微鏡法の一方法。 - 4D局在顕微鏡法の一方法または放射体追跡方法であって、
前記方法は、対物レンズの一部分へ又は前記対物レンズの前記一部分から進む光と、前記対物レンズの別の部分へ又は前記対物レンズの前記別の部分から進む光との間の位相差を発生させて、2つのローブを含む点放射体画像を生成することを含み、
前記2つのローブ間の分離は、撮像システムの前記対物レンズに対する前記放射体の位置に関連し、
前記画像の更なる特性、又は前記対物レンズへの若しくは前記対物レンズからの前記光の更なる特性は、前記放射体の別のロケーション非依存特性及び各前記画像ローブの各相対位置からの前記放射体のz軸位置に関連し、
前記方法は、前記別のロケーション非依存特性を評価することを含む、
4D局在顕微鏡法の一方法または放射体追跡方法。 - 前記方法は、前記対物レンズの一部分へ又は前記対物レンズの前記一部分から進む光と、前記対物レンズの別の部分へ又は前記対物レンズの前記別の部分から進む光との間の前記位相差を発生させて、2つの画像ローブを含む点放射体画像を生成することを含み、
負の焦点外れを発生させる前記対物レンズに対する放射体の位置において、前記2つの画像ローブが、実質的に軸に沿った第1の互いに対向する方向に互いから分離され、
正の焦点外れを発生させる前記対物レンズに対する放射体の位置において、前記2つの画像ローブが、実質的に前記軸に沿った第2の互いに対向する方向に互いから分離される、請求項43に記載の方法。 - 前記画像の更なる特性は、前記画像ローブ間の分離である、請求項43又は44に記載の方法。
- 前記画像の前記更なる特性は、前記放射体の前記位置に関連する前記画像ローブ間の前記分離の前記軸に対し或る角度を成す軸における前記画像ローブ間の分離である、請求項45に記載の方法。
- 前記画像の前記更なる特性は、前記放射体の前記位置に関連する前記画像ローブ間の前記分離の前記軸に対し実質的に直交する軸における前記画像ローブ間の分離である、
請求項45に記載の方法。 - 前記画像の前記更なる特性は、前記放射体からの光の輝度、スペクトル成分、寿命、又は偏光状態である、請求項43又は44に記載の方法。
- 前記放射体の前記ロケーション非依存特性は、前記放射体からの光のスペクトル成分、寿命、又は偏光状態のうちの任意の1つ又は複数である、請求項43〜48のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対物レンズに対する放射体の、焦点の合った位置において、前記2つの画像ローブが、前記放射体の前記位置に関連する前記画像ローブ間の分離の前記軸に沿って互いから実質的に分離されない、請求項43〜49のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対物レンズに対する放射体の、前記焦点の合った前記位置において、前記2つの画像ローブが、前記放射体の前記位置に関連する前記画像ローブ間の分離の前記軸に実質的に直交して互いから分離される、請求項43〜49のいずれか1項に記載の方法。
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