-
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur wellenlängenselektiven und örtlich hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie, wobei in einer Probe wiederholt Fluoreszenzemitter zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung angeregt und von der Probe mit einem Mikroskop, das einen Abbildungsstrahlengang mit einer optischen Auflösung aufweist, Einzelbilder erzeugt werden, wobei die Fluoreszenzemitter derart zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung angeregt werden, daß zumindest eine Teilmenge der Fluoreszenzemitter in jedem Einzelbild isoliert ist, in den erzeugten Einzelbildern die Lagen der isoliert fluoreszierenden Fluoreszenzemitter mit einer über eine optische Auflösung hinaus gehenden Ortsgenauigkeit lokalisiert werden und daraus ein hochaufgelöstes Gesamtbild erzeugt wird.
-
Die Erfindung bezieht sich weiter auf ein Fluoreszenzmikroskop zum wellenlängenselektiven Abbilden einer Probe mit einer über eine optische Auflösung gesteigerten Ortsauflösung, das aufweist eine Beleuchtungseinrichtung, die dazu ausgebildet ist, in der Probe wiederholt Fluoreszenzemitter zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung anzuregen, eine einen Abbildungsstrahlengang mit der optischen Auflösung umfassende Abbildungseinrichtung, die dazu ausgebildet ist, von der Probe mit der optischen Auflösung Einzelbilder zu erzeugen, einer Steuereinrichtung, die dazu ausgebildet ist, die Beleuchtungseinrichtung und die Abbildungseinrichtung so anzusteuern, daß von der Probe mehrere Einzelbilder erzeugt werden, wobei die Fluoreszenzemitter derart zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung angeregt sind, daß zumindest eine Teilmenge der Fluoreszenzemitter in jedem Einzelbild isoliert ist, die Steuereinrichtung dazu ausgebildet ist, in den erzeugten Einzelbildern die Lagen der isoliert fluoreszierenden Fluoreszenzemitter mit einer über eine optische Auflösung hinaus gehenden Ortsgenauigkeit zu lokalisieren und daraus ein hochaufgelöstes Gesamtbild zu erzeugen.
-
Im Stand der Technik sind verschiedene Verfahren zur Überwindung der Beugungsgrenze in der Mikroskopie entwickelt worden. Aus der
WO 2006/127692 oder der
DE 10 2006 021 317 A1 ist ein mit PALM abgekürztes Verfahren (photo activated light microscopy) bekannt, das eine Markierungssubstanz zur Abbildung einer Probe verwendet, welche z.B. mittels optischer Strahlung aktiviert werden kann. Nur im aktivierten Zustand kann die Markierungssubstanz bestimmte Fluoreszenzstrahlung abgeben. Nicht aktivierte Moleküle der Markierungssubstanz senden auch nach Einstrahlung von Anregungsstrahlung keine oder zumindest keine merkliche Fluoreszenzstrahlung ab. Man bezeichnet deshalb die Aktivierungsstrahlung allgemein als Umschaltsignal. Im PALM-Verfahren wird nun das Umschaltsignal so aufgebracht, daß zumindest ein gewisser Anteil der aktivierten Markierungsmoleküle von benachbarten aktivierten Molekülen so beabstandet ist, daß diese Markierungsmoleküle gemessen an der optischen Auflösung der Mikroskopie getrennt oder nachträglich durch Bildverarbeitungsverfahren trennbar sind. Man spricht davon, daß eine Teilmenge der Fluoreszenzemitter isoliert wird. Nach Aufnahme der Fluoreszenzstrahlung wird für diese isolierten Emitter dann das Zentrum deren auflösungsbegrenzt bedingter Strahlungsverteilung ermittelt. Daraus kann man rechnerisch die Lage der Moleküle mit höherer Genauigkeit bestimmen, als es die optische Auflösung eigentlich zuläßt. Dieser Vorgang wird als Lokalisierung bezeichnet. Die gesteigerte Auflösung durch rechnerische Schwerpunktbestimmung der Beugungsverteilung wird in der englischen Fachliteratur auch als „super resolution“ bezeichnet. Sie erfordert, daß in der Probe zumindest eine Teilmenge der aktivierten Markierungsmoleküle mit der optischen Auflösung unterscheidbar, also isoliert sind. Dann kann ihre Ortslage mit höherer Genauigkeit bestimmt werden, sie können lokalisiert werden.
-
Zum Isolieren einzelner Markierungsmoleküle nutzt das PALM-Prinzip statistische Effekte aus. Bei einem Markierungsmolekül, das nach Empfang des Umschaltsignals gegebener Intensität zur Fluoreszenzstrahlung anregbar ist, kann durch Einstellen der Intensität des Umschaltsignals dafür gesorgt werden, daß die Wahrscheinlichkeit in einem gegebenen Flächenbereich der Probe vorhandene Markierungsmoleküle zu aktivieren, so gering ist, daß es ausreichend Teilbereiche gibt, in denen innerhalb der optischen Auflösung nur unterscheidbare Markierungsmoleküle Fluoreszenzstrahlung emittieren.
-
Das PALM-Prinzip wurde hinsichtlich der Aktivierung der zu erfassenden Moleküle weitergebildet. So ist beispielsweise bei Molekülen, die einen langlebigen nicht fluoreszierenden und einen kurzlebigen fluoreszierenden Zustand aufweisen, ein separates Aktivieren mit spektral von der Anregungsstrahlung sich unterscheidender Aktivierungsstrahlung gar nicht erforderlich. Vielmehr wird die Probe zuerst mit Beleuchtungsstrahlung hoher Intensität so aktiviert, daß der weit überwiegende Anteil der Moleküle in den nicht fluoreszenzfähigen langlebigem Zustand (z.B. einen Triplet-Zustand) gebracht werden. Die verbleibenden, dann noch fluoreszierenden Moleküle sind dadurch hinsichtlich der optischen Auflösung isoliert.
-
Es sei auch noch angemerkt, daß das PALM-Prinzip in der Fachliteratur mittlerweile auch andere Abkürzungen erhalten hat, wie beispielsweise STORM. In dieser Beschreibung wird die Abkürzung PALM für alle Mikroskopieaufnahmen verwendet, die eine Ortsauflösung über die optische Auflösung der verwendeten Apparatur hinaus erreichen, indem Fluoreszenzmoleküle zuerst isoliert und dann lokalisiert werden. Das PALM-Verfahren hat den Vorteil, daß für die Beleuchtung keine hohe Ortsauflösung benötigt wird. Eine einfache Weitfeldbeleuchtung ist möglich.
-
Das PALM-Prinzip erfordert es, daß viele Einzelbilder der Probe aufgenommen werden, die jeweils Teilmengen aus isolierten Molekülen enthalten. Um die Probe zur Gänze abzubilden, muß die Menge aller Einzelbilder sicherstellen, daß möglichst alle Moleküle mindest einmal in einer Teilmenge enthalten waren. Das PALM-Verfahren benötigt deshalb regelmäßig eine Vielzahl von Einzelbildern, was eine gewisse Dauer für die Aufnahme eines Gesamtbildes bedingt. Damit ist ein erheblicher Rechenaufwand verbunden, da in jedem Einzelbild rechnerisch eine Vielzahl von Molekülen lokalisiert werden muß. Es fallen große Datenmengen an.
-
Es besteht nun das Bedürfnis, hochauflösende Bilder nicht nur in einem Farbkanal zu erfassen, sondern eine Farbinformation, d.h. eine Wellenlängenangabe über die fluoreszierenden Emitter zu gewinnen. Der Stand der Technik kennt in der Fluoreszenzmikroskopie ein Mikroskop gemäß 8. Das dort dargestellte Fluoreszenzmikroskop 100 umfaßt einen Beleuchtungsstrahlengang 3 sowie einen Abbildungsstrahlengang 4, die über ein gemeinsames Objektiv 5 eine Probe 2 mit Anregungsstrahlung beleuchten und die fluoreszierende Probe 2 abbilden. Der Beleuchtungsstrahlengang 3 ist mit dem Abbildungsstrahlengang 4 über einen in der Regel dichroitisch ausgestalteten Strahlteiler 6 zusammengefaßt, so daß sowohl Beleuchtungsstrahlung aus dem Beleuchtungsstrahlengang 3 durch das Objektiv 5 zur Probe 2 fällt, als auch die Abbildung der Probe durch das Objektiv 5 und über den Abbildungsstrahlengang 4 erfolgt. Der Beleuchtungsstrahlengang 3 weist üblicherweise mehrere Spektralkanäle auf; in der Darstellung der 8 sind exemplarisch zwei Laserquellen L1 und L2 dargestellt, deren Strahlung über einen Strahlteiler 5 zusammengeführt wird. Der Beleuchtungsstrahlengang 3 beleuchtet damit die Probe 2 mit Strahlung mindestens zweier Wellenlängen, so daß eine mehrfarbige Anregung der Probe 2 zur Fluoreszenzstrahlung erfolgt. Die Probe 2 gibt auch mehrfarbig Fluoreszenzstrahlung ab (dies könnte natürlich auch bei einer einfarbigen Fluoreszenzanregung und unterschiedlichen Fluoreszenzmolekülen der Fall sein). Im Abbildungsstrahlengang 4 wird das Bild der Probe 2 deshalb über zwei Strahlteiler 7 und 8 sowie geeignete, nicht näher bezeichnete Optiken auf drei Farbkanäle aufgeteilt, d.h. auf drei Kameras K1, K2 und K3 geleitet. Die Aufteilung über die Strahlteiler 8 und 9 bewirkt dabei eine spektral selektive Aufteilung auf die Kameras K1 bis K3. Alternativ oder zusätzlich können auch geeignete Farbfilter eingesetzt werden. Man erhält so mehrere Farbkanäle, für jede Kamera einen. Nachteilig an diesem Aufbau ist es jedoch, daß die verwendeten Kamerasysteme aufgrund der erforderlichen hohen Auflösung sehr teuer sind. Weiter wird der Bauraum für das Mikroskop 100 wegen der nötigen Strahlwege und Farbteiler groß. Auch sind die Kameras üblicherweise gekühlt und benötigen ebenfalls viel Bauraum. Weiter problematisch ist es, daß die Kameras K1, K2 und K3 präzise zueinander justiert werden müssen, damit die Bilder der einzelnen Farbkanäle nachher zueinander die richtige Lage haben. Ein etwaiger Justierfehler zwischen den Teilstrahlengängen der einzelnen Farbkanäle würde dazu führen, daß im Gesamtbild ein Farbfehler im Sinne einer chromatischen Abberation vorliegt.
-
Es wäre denkbar das Mikroskop 100 der 8 für das PALM-Prinzip zu verwenden, allerdings multiplizierte sich dann die anfallende Datenmenge sowie der Rechenaufwand mit der Zahl der Farbkanäle.
-
Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, ein Mikroskop sowie ein Verfahren zur wellenlängenselektiven, hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie anzugeben, das die geschilderten Nachteile des Standes der Technik vermeidet. Insbesondere sollen Größe und Teilevielfalt, Justieraufwand und Datenmenge reduziert werden.
-
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst mit einem Verfahren zur wellenlängenselektiven und örtlich hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie, wobei in einer Probe wiederholt Fluoreszenzemitter zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung angeregt und von der Probe mit einem Mikroskop, das einen Abbildungsstrahlengang mit einer optischen Auflösung aufweist, Einzelbilder erzeugt werden, wobei die Fluoreszenzemitter derart zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung angeregt werden, daß zumindest eine Teilmenge der Fluoreszenzemitter in jedem Einzelbild isoliert ist, in den erzeugten Einzelbildern die Lagen der isoliert fluoreszierenden Fluoreszenzemitter mit einer über eine optische Auflösung hinaus gehenden Ortsgenauigkeit lokalisiert werden und daraus ein hochaufgelöstes Gesamtbild erzeugt wird, der Abbildungsstrahlengang des Mikroskops einen spektral selektives Element aufweist, das bei der Erzeugung der Einzelbilder einer Punktbildverwaschungsfunktion eine spektral abhängige Rotationsasymmetrie verleiht, so daß die Bilder isoliert fluoreszierender Fluoreszenzemitter eine Rotationsasymmetrie aufweisen, die von einer Wellenlänge, bei der die isoliert fluoreszierenden Fluoreszenzemitter fluoreszieren, abhängt, und in den Einzelbildern die Bilder der isolierten Fluoreszenzemitter hinsichtlich ihrer Rotationsasymmetrie analysiert werden und daraus eine Angabe über die Wellenlänge der isoliert fluoreszierenden Fluoreszenzemitter abgeleitet wird.
-
Diese Aufgabe wird weiter gelöst mit einem Fluoreszenzmikroskop zum wellenlängenselektiven Abbilden einer Probe mit einer über eine optische Auflösung gesteigerten Ortsauflösung, das aufweist eine Beleuchtungseinrichtung, die dazu ausgebildet ist, in der Probe wiederholt Fluoreszenzemitter zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung anzuregen, eine einen Abbildungsstrahlengang mit der optischen Auflösung umfassende Abbildungseinrichtung die dazu ausgebildet ist, von der Probe mit der optischen Auflösung Einzelbilder zu erzeugen, einer Steuereinrichtung, die dazu ausgebildet ist, die Beleuchtungseinrichtung und die Abbildungseinrichtung so anzusteuern, daß von der Probe mehrere Einzelbilder erzeugt werden, wobei die Fluoreszenzemitter derart zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung angeregt sind, daß zumindest eine Teilmenge der Fluoreszenzemitter in jedem Einzelbild isoliert ist, die Steuereinrichtung dazu ausgebildet ist, in den erzeugten Einzelbildern die Lagen der isoliert fluoreszierenden Fluoreszenzemitter mit einer über eine optische Auflösung hinaus gehenden Ortsgenauigkeit zu lokalisieren und daraus ein hochaufgelöstes Gesamtbild zu erzeugen, der Abbildungsstrahlengang des Mikroskops einen spektral selektives Element aufweist, das bei der Erzeugung der Einzelbilder einer Punktbildverwaschungsfunktion eine spektral abhängige Rotationsasymmetrie verleiht, so daß die Bilder isoliert fluoreszierender Fluoreszenzemitter eine Rotationsasymmetrie aufweisen, die von einer Wellenlänge, bei der die isoliert fluoreszierenden Fluoreszenzemitter fluoreszieren, abhängt, und die Steuereinrichtung dazu ausgebildet ist, in den Einzelbildern die Bilder der isolierten Fluoreszenzemitter hinsichtlich ihrer Rotationsasymmetrie zu analysieren und daraus eine Angabe über die Wellenlänge der isoliert fluoreszierenden Fluoreszenzemitter zu abzuleiten.
-
Erfindungsgemäß wird die im Stand der Technik vorhandene Limitierung der mehrfarbigen Weitfeld-Detektion für die Hochauflösung überwunden, indem die spektrale Information der Emitter in einer Rotationsasymmetrie der Punktbildverwaschungsfunktion und damit letztlich in ihrem Erscheinungsbild auf der Kamera kodiert wird. Dies erfolgt dadurch, daß im Abbildungsstrahlengang das spektral selektive Element eingesetzt wird, das die Pumpbildverwaschungsfunktion spektral abhängig rotationsasymmetrisch gestaltet. Dies ist für die lokalisierungsbasierte Hochauflösung gemäß PALM-Prinzip im Gegensatz zur klassischen Fluoreszenzmikroskopie möglich, da man es beim PALM-Prinzip aufgrund der Isolierung und Lokalisierung per se mit einzelnen Molekülen zu tun hat. Die in der normalen Mikroskopie also ansonsten strikt zu vermeidende Störung der Punktbildverwaschungsfunktion führt also überraschend für das PALM-Prinzip zum Vorteil einer einfachen Wellenlängenselektion.
-
In den Einzelbildern werden die Bilder der isolierten Fluoreszenzemitter hinsichtlich ihrer Rotationsasymmetrie analysiert. Aus der aufgefundenen Rotationsasymmetrie kann einfach auf die Wellenlänge der detektierten Strahlung geschlossen werden, da man die durch das spektral selektive Element eingebrachte spektral abhängige Rotationssymmetriestörung kennt. Unter den Bild eines Fluoreszenzemitters ist dessen in der Regel beugungsbegrenztes Punktbild gemeint.
-
Besonders einfach kann die Rotationsasymmetrie dahingehend analysiert werden, daß für jedes Bild eines der isolierten Fluoreszenzemitter eine Winkelangabe des Bildes ermittelt wird. Die Winkelangabe liefert dann die Angabe über die Wellenlänge der isoliert fluoreszierenden Fluoreszenzemitter, da das spektral selektive Element einzelne Wellenlängen zu unterschiedlichen Winkellagen der Rotationsasymmetrie umsetzt.
-
Besonders einfach ist das Verfahren auszuführen, wenn das spektral selektive Element der Punktbildverwaschungsfunktion eine punktsymmetrische Rotationsasymmetrie verleiht. Die rotationsasymmetrischen Bilder der einzelnen Fluoreszenzemitter unterscheiden sich dann lediglich durch die Drehlage, welche von der Farbe, d.h. der Wellenlänge des einzelnen Fluoreszenzemitters abhängt. Es ist dann relativ einfach möglich, die Angabe über die Wellenlänge der isoliert fluoreszierenden Fluoreszenzemitter abzuleiten, in dem für jedes Bild eines der isolierten Fluoreszenzemitter seine Drehlage ermittelt wird.
-
Eine punktsymmetrische Rotationsasymmetrie hat weiter den Vorteil, daß wellenlängenunabhängig bei der Lokalisierung die Ortsangabe einfach dadurch ermittelt werden kann, daß man auf den Schwerpunkt des punktsymmetrischen und rotationsasymmetrischen Beugungsbildes jedes isolierten Fluoreszenzemitters Bezug nimmt. Die Lage des Schwerpunktes liefert die Lokalisierung der Ortsangabe.
-
Das spektral selektive Element kann vielfältig ausgebildet werden. Eine einfache Möglichkeit ist eine Platte aus einem dispersiven Material, deren Dicke längs eines Radius um eine optische Achse variiert. Natürlich kann statt die Dispersion des Materials auszunutzen und damit die Dicke zu variieren, auch allgemein die Transmissionseigenschaft variieren.
-
Eine besonders vorteilhafte Ausgestaltung realisiert das spektral selektive Element als Platte aus mehreren keilförmigen Sektoren, die sich hinsichtlich ihrer spektralen Transmissionseigenschaften unterscheiden. Verleiht man dann punktsymmetrisch zueinander liegenden Sektoren gleiche spektrale Transmissionseigenschaften, erhält man das bereits erwähnte, vorteilhafte rotationssymmetrische Bild für jedes einzelne isolierte Fluoreszenzmolekül. Das Symmetriezentrum ist zugleich der Durchstoßpunkt der optischen Achse.
-
Die Lokalisierung kann erleichtert werden, wenn das spektral selektive Element einen auf einer optischen Achse liegenden Zentralbereich aufweist, der breitbandige spektrale Transmissionseigenschaften aufweist und von Sektoren umgeben ist, die sich hinsichtlich ihrer spektralen Transmissionseigenschaften voneinander und bevorzugt auch vom Zentralbereich unterscheiden. Im Zentralbereich ist dann das beugungsbegrenzte Punktbild jedes Fluoreszenzemitters spektral unabhängig, was eine einfache Lokalisierung ermöglicht. Durch die Sektoren hat jedes beugungsbegrenzte Punktbild mindestens ein Ohr, bevorzugt zwei symmetrisch zueinander liegende Ohren dessen bzw. deren Lage die Farbabgabe kodiert.
-
Der optische Aufbau des Mikroskops ist besonders einfach, wenn das spektral selektive Element in einer Pupille oder nahe einer Pupille des Abbildungsstrahlengangs angeordnet ist.
-
Bei einem spektral selektiven Element, das eine punktsymmetrische Variation der Transmissionseigenschaften hat, ergeben sich beugungsbegrenzte Punktbilder für die Fluoreszenzemitter, die die Form einer Fliege haben. Die Drehlage der Fliege kodiert die Farbe, bei der ein isolierter Emitter leuchtete.
-
Es versteht sich, daß die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung einsetzbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen. Soweit in dieser Beschreibung Verfahrensmerkmale erwähnt sind, werden sie im Betrieb des Mikroskopes durch ein entsprechend ausgebildetes Steuergerät realisiert. Analog gilt eine Offenbarung von funktionellen Merkmalen des Steuergerätes auch als Beschreibung entsprechender Verfahrensmerkmale, z.B. Schritte.
-
Nachfolgend wird die Erfindung beispielsweise anhand der beigefügten Zeichnungen, die auch erfindungswesentliche Merkmale offenbaren, noch näher erläutert. Es zeigen:
-
1 eine Schemadarstellung eines Mikroskops zur wellenlängenselektiven, hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie,
-
2 eine schematische Draufsicht auf ein spektralselektives Element im Mikroskop der 1,
-
3 einen Ausschnitt aus einem Einzelbild, das mit dem Mikroskop der 1 erzeugt wurde, wobei der Ausschnitt exemplarische beugungsbegrenzte Bilder eines isolierten Fluoreszenzemitters zeigt,
-
4 ein Einzelbild 16 mit mehreren Bildern gemäß der 3,
-
5 eine Darstellung ähnlich der 2 mit einem abgewandelten spektralselektiven Element,
-
6 ein Diagramm zur Veranschaulichung der spektralen Eigenschaften verschiedener Bereiche des spektralselektiven Elementes der 5,
-
7 eine Darstellung ähnlich der 3 für das Element der 5 und
-
8 ein Fluoreszenzmikroskop nach dem Stand der Technik mit mehreren Farbkanälen.
-
1 zeigt schematisch ein Fluoreszenzmikroskop 1, dessen Betrieb von einem Steuergerät C gesteuert wird. Es ist über nicht gezeigte Verbindungen mit den Elementen des Mikroskopes 1 verbunden, insbesondere mit den Laserquellen / der Laserquelle und der Kamera. Elemente bzw. Bauteile die funktionell und/oder strukturell Elementen oder Bauteilen entsprechen, die bereits anhand des Mikroskops 100 der 8 erläutert wurden, also hinsichtlich ihrer Funktion bzw. Struktur dem Stand der Technik entsprechen, sind in der Darstellung der 1 mit den selben Bezugszeichen versehen. Ihre Beschreibung muß deshalb nicht wiederholt werden.
-
Das Mikroskop 1 der 1 umfaßt neben dem Beleuchtungsstrahlengang 3 einen Abbildungsstrahlengang 10, der nun, wie noch erläutert werden wird, ohne spektrale Aufgliederung in mehrere Farbkanäle auskommt. Es ist deshalb nur eine einzige Kamera K1 nötig. Die Abbildung der Probe wird durch ein spektral selektives Element 11 geleitet, das die Punktbildverwaschungsfunktion des Mikroskops 1 rotationsasymmetrisch modifiziert. Da das Mikroskop 1 ansonsten beugungsbegrenzte Bilder der isolierten Fluoreszenzmoleküle aufnimmt, sind diese Bilder nun durch das spektral selektive Element 1 hinsichtlich ihrer Punktbildverwaschungsfunktion asymmetrisch modifiziert.
-
2 zeigt schematisch eine vereinfachte Draufsicht auf das spektral selektive Element 11 längs der optischen Achse, die also in der Darstellung der 2 senkrecht zur Zeichnungsebene steht. Das spektral selektive Element 11 umfaßt exemplarisch vier Sektoren 12, 13, 14 und 15, die unterschiedliche spektrale Transmissionscharakteristik haben. Die Sektoren unterscheiden sich hinsichtlich ihrer spektralen Filtereigenschaften, wobei im dargestellten Beispiel gegenüberliegende Sektoren gleiche spektrale Filtereigenschaften haben, benachbarte Sektoren sich jedoch in ihren Filtereigenschaften unterscheiden. Exemplarisch und ohne Einschränkung für das Prinzip der Erfindung sind gegenüberliegende Sektoren mit gleichen Transmissionseigenschaften ausgestattet. Die Sektoren 12 und 13 haben gleiche spektrale Transmissionseigenschaften. Analoges gilt für die Sektoren 14 und 15.
-
Den Effekt des spektralselektiven Elementes 11 auf ein Punkt-Bild eines isolierten Emitters zeigt 3, die einen Ausschnitt eines Einzelbildes 16 darstellt, das mit dem Mikroskop 1 erzeugt wird. Das spektral selektive Element 11 verformt die Punktbildverwaschungsfunktion eines einzelnen leuchteten Fluorophors rotationsasymmetrisch, nämlich in Form der in 3 dargestellten Fliege. 3 zeigt einen Ausschnitt eines Einzelbildes 16, das mit dem Mikroskop 1 an der Steuerung durch das Steuergerät C bei der Ausführung des PALM-Verfahrens entsteht, wenn ein Fluorophor isoliert leuchtet. Je nach Wellenlänge, bei der ein Fluorophor vornehmlich leuchtet, wird die Strahlung dieses Fluorophors entweder von den Sektoren 12 und 13 oder den Sektoren 14 und 15 transmittiert. Entsprechend bildet sich eine Fliege 17a oder 17b. Die Drehlage der Fliege 17 um ein Zentrum 18 kodiert die Farbe des leuchtenden Fluorophors. In 3 sind schematisch zwei Fliegen 17a und 17b für unterschiedliche Leuchtfarben eingetragen. Natürlich sind die Transmissionseigenschaften der Sektoren des spektral selektiven Elementes 11 so gewählt, daß für eine gegebene Anwendung nur eine der beiden Fliegen 17a oder 17b vorliegt. Die Richtung der Hauptachse der Fliege wird vom Steuergerät C ausgewertet, was eine Angabe über die Wellenlänge, bei der das Fluorophor leuchtet, liefert. Das Zentrum 18 ist der Ausgangspunkt für die Lokalisierung des Fluorophors, die den bekannten PALM-Ansätzen folgt, die oben bereits anhand des Begriffes „super resolution“ erläutert wurden.
-
Die Fliege 17a liegt vor, wenn die Strahlung des Emitters derart ist, das sie durch die Sektoren 12 und 13 transmittiert wurde (und von den Sektoren 14 und 15 blockiert). Die Fliege 17b stellt sich ein, wenn die Wellenlänge des Fluoreszenzemitters lediglich durch die Sektoren 14 und 15 transmittiert werden konnte. Die Fliegen 17a bzw. 17b haben das Zentrum 18, das der wirklichen Lage des Fluoreszenzemitters entspricht. Durch die Ermittlung des Schwerpunktes 18 der Fliege 17a bzw. 17b kann somit die Lage des Fluoreszenzemitters mit über die Ortsauflösung gesteigerter Genauigkeit angegeben werden. Die Winkellage der Fliege 17a bzw. 17b ergibt die Farbangabe.
-
Die Verwendung des spektralselektiven Elementes mit nur einem Farbkanal im Abbildungsstrahlengang hat den Vorteil, daß nur eine der vergleichsweise kostenaufwendigen Kameras erforderlich ist. Auch ist der mit mehreren Kameras verbundene Bauaufwand und Raumbedarf nicht mehr nötig. Schließlich sind die Einzelbilder 16 auch automatisch hinsichtlich der Farbkanäle justiert, da alle Emitter in einem einzigen Bild aufgenommen werden, unabhängig von ihrem Farbkanal. Eine chromatische Abberation bedingt durch eine mangelhafte Justierung der einzelnen Farbkanäle ist damit durch den Aufbau bereits grundsätzlich vermieden. Die erhaltenen Bilder sind prinzipbedingt in dieser Hinsicht chromatisch fehlerfrei.
-
Der Betrieb des Mikroskops 1 wird durch ein Steuergerät C gesteuert. Soweit vorstehend oder nachfolgend Verfahrensmerkmale beschrieben werden, stellt das Steuergerät C sicher, daß das Mikroskop 1 in einen entsprechenden Betrieb versetzt wird, der diese Verfahrensmerkmale realisiert.
-
Natürlich ist die Ausbildung des spektral selektiven Elementes 11, wie es in 2 dargestellt ist, rein exemplarisch. Das spektral selektive Element 11 muß nicht zwingend aus Sektoren ausgebildet sein. Ausschlaggebend ist lediglich, daß seine Transmissionseigenschaften so sind, daß die Punktbildverwaschungsfunktion eines einzelnen leuchteten Fluorophors abhängig vom Spektralbereich und/oder der Hauptwellenlänge etc., bei der der Fluorophor leuchtet, asymmetrisch verzerrt wird. Aus der Asymmetrie kann das Steuergerät C dann einfach eine Farbabgabe für das Fluorophor ableiten.
-
Eine punktsymmetrische Gestaltung der spektralen Transmissionseigenschaften des spektral selektiven Elementes 11, wie in 2, hat den Vorteil, daß das Zentrum jedes Punktverwaschungsbildes eines einzelnen leuchteten Fluorophors einfach zur Lokalisierung des Fluorophors herangezogen werden kann.
-
Die Verwendung hinsichtlich ihrer Transmissionseigenschaften weitgehend konstanter, gegeneinander abgegrenzter Sektoren hat weiter den Vorteil, daß das Steuergerät C bei der Ausführung des Verfahrens lediglich zwischen einer diskreten Anzahl von rotationsasymmetrischen Verzeichnungen unterscheiden muß. Der Preis für diese Vereinfachung ist, daß nur bestimmte Farben oder Spektralbereiche unterschieden werden können.
-
Es ist gleichermaßen möglich, die Transmissionseigenschaften des spektral selektiven Elementes so zu gestalten, daß die rotationsasymmetrische Spektralverzeichnung sich in einer Vielzahl feiner Stufen oder sogar kontinuierlich mit der Wellenlänge ändert. Um den Preis einer dadurch nötigeren präziseren Bestimmung der Rotationsasymmetrie der Punktverwaschungsbilder in jedem Einzelbild erhält man dann eine höhere spektrale Auflösung bezüglich der Farbangabe der Fluorophore.
-
4 zeigt exemplarisch ein Einzelbild 16, das mit dem Mikroskop 1 unter der Steuerung des Steuergerätes C erhalten wird, das mit einem spektral selektiven Element 11 erzeugt wurde, welches vier verschiedene diskrete Rotationsasymmetrien für vier verschiedene Farben leuchtender Fluoreszenzemitter erzeugt. Gegenüber dem in 2 dargestellten Element hat das spektral selektive Element 11, mit dem das Einzelbild 16 der 4 erzeugt wurde, nicht zwei, jeweils paarweise gegenüberliegende Sektoren, sondern vier Paare – insgesamt also acht Sektoren. Die punktsymmetrische Ausbildung des spektral selektiven Elementes 11 sorgt dafür, daß das Punktverwaschungsbild eines einzelnen Fluorophors wieder eine Fliege 17 ist. Im Einzelbild 16 gibt es vier verschiedene Drehlagen kodierend die vier verschiedenen Transmissionsbänder des spektral selektiven Elementes. Die Zentren 18 dienen wiederum zur Lokalisierung der Fluorophore.
-
Wie das Einzelbild der 4 deutlich zeigt, sind alle Farbkanäle in einem einzigen Einzelbild 16 enthalten. Die Problematik einer chromatischen Abberation aufgrund einer unvollkommenen Justierung mehrerer unabhängig aufgenommener Farbkanäle stellt sich damit nicht. Auch steigt die Zahl der Einzelbilder nicht linear mit der Zahl der Farbkanäle.
-
5 zeigt eine Draufsicht ähnlich der 2. Allerdings ist das spektral selektive Element 11 hier nicht nur durch vier Sektorenpaare 19, 20, 21 und 22 gebildet (wie sie für das Einzelbild 16 der 4 verwendet wurden), das spektral selektive Element 11 umfaßt auch einen breitbandig transmittierenden Zentralbereich 23. Die spektralen Filtereigenschaften sind exemplarisch in 6 aufgetragen, die die Transmission durch den jeweiligen Bereich als Funktion der Wellenlänge λ zeigt. Die Transmissionskurve 24 ist dabei dem Sektorenpaar 19, die Transmissionskurve 25 dem Sektorenpaar 20, die Transmissionskurve 26 dem Sektorenpaar 21 und die Transmissionskurve 27 dem Sektorenpaar 22 zugeordnet. Der Zentralbereich 23 transmittiert breitbandig im Spektralbereich 28. Ein Einzelbild eines Fluorophors ist dann, wie in 4 als Ausschnitt eines Einzelbildes 16 dargestellt, als kreisförmiger Spot 29 mit Ohren 30 ausgebildet. Die Drehlage der Ohren 30 kodiert die Farbinformation. Der zentrale Spot 29 erleichtert die Lokalisierung des Fluorophors im Einzelbild 16, d.h. die Erzeugung der sogenannten super resolution. Die Ausgestaltung des spektral selektiven Elementes 11 ist also gegenüber dem Konstruktionsprinzip des spektral selektiven Elementes 11 der 2 dahingehend modifiziert, daß die Lokalisierung der Fluorophore erleichtert ist.
-
Wie aus obiger Beschreibung deutlich wird, bewirkt das spektral selektive Element eine Rotationsasymmetrie der Punktbildverwaschungsfunktion eines einzelnen leuchteten Fluorophors abhängig von der spektralen Zusammensetzung der Fluoreszenzstrahlung. Es ist deshalb vorteilhaft, einen Wechselmechanismus für das spektral selektive Element 11 vorzusehen, um die spektralen Transmissionscharakteristiken, beispielsweise die Transmissionscharakteristiken einzelner Sektoren, an eine Mikroskopieaufgabe, insbesondere verwendete Fluorophore anzupassen.
-
Die vorstehend beschriebenen punktsymmetrischen rotationsasymmetrischen Punktbildverwaschungsfunktionen erleichtern die Lokalisierung des Moleküls. Dies ist jedoch nicht zwingend erforderlich. So ist es jederzeit möglich, die Punktsymmetrie der Transmissionseigenschaften des spektral selektiven Elementes 11 aufzugeben, da die Lokalisierung einfach anhand des Spots 29 ausgeführt werden kann. Bei der Verwendung eines Zentralbereichs 23 hätte das Punktverwaschungsbild eines Fluorophors dann nicht zwei Ohren 29, sondern nur ein Ohr. Ein derartiger Ansatz erhöht die spektrale Auflösung um den Faktor 2. Eine nicht punktsymmetrische Ausgestaltung der Transmissionseigenschaften des spektral selektiven Elementes 11 kann auch ohne einen Zentralbereich 23 realisiert werden. Wesentlich ist, daß bei der Auswertung der Einzelbilder 16 die Grundstruktur der spektral abhängigen Rotationsasymmetrie bekannt ist, so daß durch die Erkennung des rotationsasymmetrischen Einzelbildes des Fluorophor einfach lokalisiert werden kann. Dazu muß man lediglich wissen, wie das rotationsasymmetrische Punktverwaschungsbild zum jeweiligen Zentrum, an dem das Fluorophor zu erwarten ist, liegt.
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
-
Zitierte Patentliteratur
-
- WO 2006/127692 [0003]
- DE 102006021317 A1 [0003]
