JP5453116B2 - 発酵ブロス中のプロテアーゼ結晶の可溶化 - Google Patents
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Description
多くの方法が、この問題を解決するか、又は最小限におさえるために適用されている、例えば、培養ブロスのpHが9.5〜13.0のpHに調整されるUS 6,316、240を参照のこと。
発酵ブロス中のプロテアーゼ結晶、及び/又はプロテアーゼ沈殿物の可溶化方法であって、以下のステップ:
a)上記発酵ブロスを100〜2000%(w/w)希釈し;
b)二価塩を加え;そして
c)上記発酵ブロスのpH値をpH5.5より低いpH値に調整する、
を含んで成る前記方法を主張する。
プロテアーゼ
プロテアーゼ結晶、及び/又はプロテアーゼ沈殿物、及び/又は発酵ブロス中の細胞塊/不溶性物質に結合したプロテアーゼが、本発明によって可溶化できる。好ましい態様において、プロテアーゼはズブチリシン(subtilisin)である。
ペプチダーゼ分類法によると、ズブチリシンは、クランSB、ファミリーS8、MEROPS ID:S08.001と説明できる。
ズブチリシンは、例えば、Barrett et al. 1998. Handbook of proteolytic enzymes. Academic press, p. 289-294に記載されている。
本発明のプロテアーゼの起源、及び/又は本発明による使用に対する制限はない。これにより、プロテアーゼという用語には、天然又は野生型プロテアーゼだけでなく、プロテアーゼ活性を示すその突然変異体、変異体、フラグメントなどのすべて、並びにシャッフル・プロテアーゼ(shuffled proteases)及びコンセンサス・プロテアーゼなどの合成プロテアーゼも含まれる。このような遺伝子操作されたプロテアーゼは、当該技術分野で広く知られているように、例えば、部位特異的突然変異誘発法によって、(PCR反応におけるプライマーの1つとして所望の突然変異を含むPCR断片を使用する)PCR法によって、又はランダム変異導入法によって調製できる。コンセンサス・タンパク質の調製は、例えば、EP 897985に記載されている。
好ましい市販のズブチリシンには、ALCALASE(商標)、SAVINASE(商標)、ESPERASE(商標)、EVERLASE(商標)、OVOZYME(商標)、CORONASE(商標)、POLARZYME(商標)、及びKANNASE(商標)(Novozymes A/S);MAXATASE(商標)、MAXACAL(商標)、MAXAPEM(商標)、PROPERASE(商標)、PURAFECT(商標)、PURAFECT OXP(商標)、FN2(商標)、FN3(商標)、及びFN4(商標)(Genencor International Inc.);並びにBLAP X(商標)(Henkel)が含まれる。
本発明によるプロテアーゼは、微生物から得ることができる。
その微生物は、単細胞微生物、例えば、原核生物であるか、又は非単細胞微生物、例えば、真核生物であるかもしれない。有用な単細胞の細胞は、これだけに制限されることなく、バチルス属の細胞(Bacillus cell)、例えば、バチルス・アルカロフィルス(Bacillus alkalophilus)、バチルス・アミロリキファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バチルス・ブレビス(Bacillus brevis)、バチルス・サーキュランス(Bacillus circulans)、バチルス・クラウジイ(Bacillus clausii)、バチルス・コアグランス(Bacillus coagulans)、バチルス・ファーマス(Bacillus firmus)、バチルス・ラウタス(Bacillus lautus)、バチルス・レンタス(Bacillus lentus)、バチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バチルス・パミルス(Bacillus pumilus)、バチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)、及びバチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis);又はストレプトマイセス属の細胞(Streptomyces cell)、例えば、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)若しくはストレプトマイセス・ムリヌス(Streptomyces murinus)を含めたグラム陽性細菌、あるいは、E.コリ(E. coli)及びシュードモナス属(Pseudomonas sp.)などのグラム陰性細菌などの細菌細胞である。
宿主細胞はまた、哺乳動物細胞、昆虫細胞、又は植物細胞などの真核生物であってもよい。
本発明は、工業規模のあらゆる発酵、例えば、少なくとも50リットル、好ましくは少なくとも500リットル、より好ましくは少なくとも5,000リットル、よりいっそう好ましくは少なくとも50,000リットルの培地を有するあらゆる発酵にも有用である。
フェドバッチ法では、発酵開始前に、1又は複数の構造成分、及び/又は触媒成分を含んで成る化合物を全く加えないか又はその一部しか培地に加えず、そして、1又は複数の構造成分、及び/又は触媒成分を含んで成る化合物の、それぞれ、全部又は残りの部分を、発酵過程中に供給する。供給用に選ばれた化合物は、発酵過程へと一緒に供給されても、互いに別個に供給されてもよい。
本発明の好ましい態様において、フェドバッチ発酵法が好まれる。
本発明の方法は、未処理の発酵ブロスに対して、又は細胞及び他の固形物の除去以前を除いて、最初に、これだけに制限されることなく、例えば、温度調節、に晒された発酵ブロスに対して適用できる。従って、我々はまた、以下の:
発酵ブロス中のプロテアーゼ結晶、及び/又はプロテアーゼ沈殿物の可溶化方法であって、以下のステップ:
a)上記発酵ブロスを100〜2000%(w/w)希釈し;
b)二価塩を加え;
c)上記発酵ブロスのpH値をpH5.5より低いpH値に調整し;そして
d)着目のプロテアーゼを産生する微生物を取り出す、
を含んで成る前記方法も主張する。
希釈媒質は、典型的には、水、問題のプロテアーゼ過程からの限外濾液、問題のプロテアーゼ過程からの水の再利用、加熱器からの復水、又は前述のもののいずれかの組み合わせ、例えば、水と限外濾液の混合物であるだろう。
二価塩、特に、カルシウム塩、及び/又はマグネシウム塩が、驚くほど優れた可溶化剤であることがわかった。好ましい二価塩は、リン酸塩、硫酸塩、硝酸塩、酢酸塩、塩化物、例えば、塩化カルシウム又は塩化マグネシウムである。好ましい態様は、カルシウム塩である。
二価塩の投入は、典型的には、インラインで、又は混合タンクにおいて行われるか、あるいは、当該技術分野で知られているその他の方法のいずれかによっても行われる。
二価塩に加えて、アルミン酸塩、例えば、NaAlO2、及び/又はカチオン性重合体、及び/又はアニオン性重合体などの1種類以上の凝集剤を加えることは有利である。
発酵ブロスのpHは、pH5.5より低いpH値、特に5.0より低いpH値に調整される。pH調整は、二価塩の添加前に、それと同時に、又は添加後に行われ得る。pHは、2.0〜5.5のpH値に;好ましくは2.0〜5.0のpH値に;より好ましくは3.0〜5.0のpH値に、そして、特に4.0〜5.0のpH値に調整され得る。
a)発酵ブロスを100〜2000%(w/w)希釈し、
b)二価塩を加え、そして、
c)上記発酵ブロスのpH値をpH5.5より低いpH値に調整する、
は、順不同でも行うことができること、例えば、ステップa)とステップb)を同時に実施できること;ステップb)とステップc)を同時に実施できること;及びステップb)をステップc)の前に実施できることに留意すべきである。
希釈した発酵ブロスは、典型的には、5℃〜50℃の温度であるだろう。希釈の前、それと同時、又は希釈の後に発酵ブロスを加熱すること、又は二価塩の添加/pH調節の前、それと同時、又はその後に発酵ブロスを加熱することは有利である。
本発明により、プロテアーゼ結晶、及び/又はプロテアーゼ沈殿物、及び/又は細胞塊/不溶性物質に結合したプロテアーゼの80%超が可溶化され得る;好ましくはプロテアーゼ結晶、及び/又はプロテアーゼ沈殿物、及び/又は細胞塊/不溶性物質に結合したプロテアーゼの85%超が可溶化され得る;より好ましくはプロテアーゼ結晶、及び/又はプロテアーゼ沈殿物、及び/又は細胞塊/不溶性物質に結合したプロテアーゼの90%超が可溶化され得る;特にプロテアーゼ結晶、及び/又はプロテアーゼ沈殿物、及び/又は細胞塊/不溶性物質に結合したプロテアーゼの95%超が可溶化され得る。
一部が結晶性形態又は沈殿形態の着目のプロテアーゼを含む培養ブロスからのプロテアーゼ生成物の回収における重要なパラメーターの1つは、もちろん総合的な抽出収率であることに留意すべきである。
特定の条件下で、回収は、プロテアーゼが完全に可溶性の形態でもたらされる第1ステップ、そして、プロテアーゼが、スラッジとして一般的に知られている細胞塊や他の不溶性物質から分離される第2ステップのツーステップの過程と考えられる。第2ステップでは、スラッジへのプロテアーゼの結合は、総合的な抽出収率に対してマイナスの影響があるだろう。残念ながら、結晶性酵素又は沈殿している酵素の速い溶解に有利に働く条件は、スラッジへの酵素の結合を増加させる場合がある。
プロテアーゼ結晶及びプロテアーゼ沈殿物の可溶化の後に、スラッジへのプロテアーゼの結合を低減するために、二価塩が加えられる。そのとき、電導度は、1mS/cm〜100mS/cmの範囲内に;より好ましくは1mS/cm〜40mS/cmの範囲内に;そして、特に3mS/cm〜20mS/cmの範囲内にあるだろう。そのとき、プロテアーゼは溶液の状態にあるので、プロテアーゼは、遠心分離、濾過、又はその他の知られている分離過程によってスラッジ物質から分離され得る。
発酵ブロス中のプロテアーゼ結晶、及び/又はプロテアーゼ沈殿物、及び/又は細胞塊/不溶性物質に結合したプロテアーゼの可溶化方法であって、以下のステップ:
a)上記発酵ブロスを100〜2000%(w/w)希釈し;
b)上記発酵ブロスのpH値をpH5.5より低いpH値に調整し;そして
c)二価塩を加える、
を含んで成り、ここで、ステップb)とステップc)の間には、20秒〜60分の猶予がある前記方法も主張する。
ステップb)とステップc)の間に猶予があるツーステップの過程は、回収プロセスに使用されるpHにおいて、プロテアーゼが強い正味の正電荷を持ち、そして、スラッジが正味の陰性表面荷電を持つときに、有利に適用できる。
得られたプロテアーゼは、当該技術分野で知られている方法によってさらに単離できる。例えば、プロテアーゼは、これだけに制限されることなく、さらなる濾過、例えば、限外濾過や精密濾過、抽出、スプレードライ、留去、沈殿、又は結晶化を含めた従来の手順によって回収できる。
ズブチリシン:ズブチリシンは、EP 0396 608 B1に記載のズブチリシン309であった。
バチルス属(Bacillus species):バチルス属は、WO 02/00907に記載のとおり挿入したズブチリシンのコピーを伴ったバチルス・リケニホルミスであった。
発酵ブロスは、6.8のpHであった。
発酵ブロスを、300%(w/w)の水で希釈した。それは、1kgの発酵ブロス(培養ブロス=CB)を3kgの水で希釈することを意味する。
8つのサンプルを取り出した。4つのサンプルでは、カルシウムを加えなかった。その他の4つのサンプルでは、未希釈の発酵ブロスに対して3%(w/w)のCaCl2(36%(w/w))を加えた。それは、希釈した発酵ブロスに対する二価塩の濃度が:
[(3×0.36)/4]%=0.27%
であることを意味する。
pH7のサンプルを除いて、すべてのサンプルを室温にて1時間混合した。
次に、サンプルを遠心分離し、そして、遠心分離物中のプロテアーゼ活性を測定した。
結果を以下の表1に示す。
カルシウム塩を添加した場合、遠心分離物中のプロテアーゼ活性は、低いpHほど顕著に増強されるであろう:pH10.5にてプロテアーゼ活性は65%であり;pH7.5にて活性は79%であり;そして、pH4.5にて活性は100%である。
pH10.5にて、カルシウム添加の効果がないことに留意すべきである。
ズブチリシン:ズブチリシンは、WO 00/37599に記載のズブチリシン309の変異体であった。
バチルス属(Bacillus species):バチルス属は、WO 02/00907に記載のとおり挿入したズブチリシンのコピーを伴ったバチルス・リケニホルミスであった。
発酵ブロスは、7.4のpHであった。
発酵ブロスを、300%(w/w)の水で希釈した。それは、1kgの発酵ブロス(培養ブロス=CB)を3kgの水で希釈することを意味する。
8つのサンプルを取り出した。4つのサンプルでは、カルシウムを加えなかった。その他の4つのサンプルでは、未希釈の発酵ブロスに対して3%(w/w)のCaCl2(36%(w/w))を加えた。それは、希釈した発酵ブロスに対する二価塩の濃度が:
[(3×0.36)/4]%=0.27%
であることを意味する。
pH7のサンプルを除いて、すべてのサンプルを室温にて1時間混合した。
8つのサンプルの電導度を計測した。それらは、すべて10.5〜14.3mS/cmの範囲内にあった。
次に、サンプルを遠心分離し、そして、遠心分離物中のプロテアーゼ活性を測定した。
結果を以下の表2に示す。
pH10.5にて、カルシウム添加の負の効果があることに留意すべきである。
Claims (20)
- 発酵ブロス中のズブチリシン結晶、及び/又はズブチリシン沈殿物の可溶化方法であって、以下のステップ:
a)上記発酵ブロスを100〜2000%(w/w)希釈し;
b)二価塩を加え;そして
c)上記発酵ブロスのpH値をpH5.5より低いpH値に調整する、
を含んで成る前記方法。 - 前記ズブチリシン結晶、及び/又はズブチリシン沈殿物を、微生物から得る、請求項1に記載の方法。
- 前記微生物が、原核生物又は真核生物である、請求項2に記載の方法。
- 前記原核生物が、バチルス属の細胞である、請求項2に記載の方法。
- 前記発酵ブロスを、水で希釈する、請求項1に記載の方法。
- 前記発酵ブロスを、限外濾液で希釈する、請求項5に記載の方法。
- 前記希釈を、水と限外濾液の混合物で実施する、請求項1に記載の方法。
- 前記二価塩が、カルシウム塩、及び/又はマグネシウム塩である、請求項1に記載の方法。
- 前記二価塩を、希釈した発酵ブロスに対して0.01〜5%の濃度で添加する、請求項1に記載の方法。
- 前記pHを、2.0〜5.0のpHに調整する、請求項1に記載の方法。
- 前記発酵ブロスを、3.0〜5.0のpHに調整する、請求項10に記載の方法。
- 前記発酵ブロスを、4.0〜5.0のpHに調整する、請求項11に記載の方法。
- 前記発酵ブロスが、5℃〜50℃の温度である、請求項1に記載の方法。
- 追加的に1又は複数の他の凝集剤を、発酵ブロスに加える、請求項1に記載の方法。
- 前記ステップa)とステップb)を同時に実施する、請求項1に記載の方法。
- 前記ステップb)とステップc)を同時に実施する、請求項1に記載の方法。
- 前記ステップc)を、ステップb)の前に実施する、請求項1に記載の方法。
- 発酵ブロス中のズブチリシン結晶、及び/又はズブチリシン沈殿物、及び/又は細胞塊/不溶性物質に結合したズブチリシンの可溶化方法であって、以下のステップ:
a)上記発酵ブロスを100〜2000%(w/w)希釈し;
b)上記発酵ブロスのpH値をpH5.5より低いpH値に調整し;そして
c)二価塩を加える、
を含んで成り、ここで、ステップb)とステップc)の間に20秒〜60分の猶予がある前記方法。 - 前記ステップa)、b)、及びc)の後に、電導度が1mS/cm〜100mS/cmの範囲内にある、請求項1又は請求項18に記載の方法。
- 前記ズブチリシン結晶、及び/又はズブチリシン沈殿物、及び/又は細胞塊/不溶性物質に結合したズブチリシンの80%超が可溶化される、請求項1又は請求項18に記載の方法。
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