CN110951808B - 一种以小球藻粉为原料制备高f值低聚肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种以小球藻粉为原料制备高F值低聚肽的方法：在pH 8‑10，温度27‑52℃条件下按70000‑90000U/mg蛋白在小球藻蛋白中添加胰蛋白酶进行第一步酶解；然后使用源于黑曲霉菌的重组羧肽酶进一步酶解，酶解条件为：pH 6.5‑7.5，酶添加量为蛋白量的3%‑7%；酶解温度为27℃‑40℃；然后将pH调至4.5，按固液比1:10的比例加入活性炭除杂，过滤得到高F值低聚肽溶液。本发明提供的制备高F值低聚肽的方法，以小球藻为原料，高蛋白含量，成本低，产量高。有利于提高产品F值，降低酶法生产成本，减少后期纯化过程中的能耗，降低环境污染，实现高效制备高F值低聚肽的工业化生产应用。

Description

一种以小球藻粉为原料制备高F值低聚肽的方法
技术领域
本发明属于蛋白制备领域，具体涉及一种制备高F值低聚肽的方法。
背景技术
作为世界微藻产业中产量之最的小球藻（Chlorella vulgaris），具有分布广，生物量大，易获得等特点，是高蛋白海洋生物，具备的多种高效益使用价值如今尚未被开发。我国常见普通小球藻（C.vulgaris）、蛋白核小球藻（Chlorella pyrenidosa）、椭圆小球藻（C.ellipsoidea）等。蛋白核小球藻粉末中蛋白含量高达63.36%-63.98%。包含了8种必需氨基酸（EAA），且含量达到23.35%，氨基酸评分（AAS）为64.3，优于一般植物性蛋白源；该微生物的平均食物摄取率已达到FAO/WHO的标准，完全可以满足人和动物生长所需“蛋白模式”，小球藻粉末是一种营养丰富且全面的优质单细胞蛋白源。根据《中华人民共和国食品安全法》和《新资源食品管理办法》（***公告2012年第19号）有关规定，2012年已经批准蛋白核小球藻为新资源食品。
基于蛋白核小球藻粉具有高蛋白含量，成本低，产量高等特点，可以考虑将其开发用于制备具有特定功能的生物活性肽。其中高F值低聚肽是一种具有高支链氨基酸含量和低芳香族氨基酸含量组成的小肽体系。由于它具有独特的氨基酸组成和生理功能，已经受到食品和医药界的高度关注。
高F值低聚肽主要是由2到10个氨基酸组成的混合小肽体系，其F值（支链氨基酸与芳香族氨基酸含量的摩尔数比值）一般大于20。由于其独特的氨基酸组成，使高F值低聚肽具有多种生理功效。它除了具有抗氧化、防衰老，良好保肝护肝，辅助治疗肝性脑病和治疗治疗苯丙酮尿症的生理功效外。对“慢性疲劳综合征”的亚健康状态也具有很好的调理功效。目前，国内外制取功能性多肽的方式有分离提取天然活性肽、化学合成法以及其他多种方法。分离提取天然活性肽法具有高效、低毒、无污染等特点，但是生物活性肽在生物体内的含量一般是微量的，且目前从天然生物体中分离纯化获得活性肽的成本较高、工艺也不是很完善。化学合成法作为一种新的生物活性肽制备方法，目前研究尚不成熟，仍有合成序列短、效率低、纯度低、成本高及毒性大等缺点。也有学者提出基因重组的方法制备活性肽，但该法还不完善，易出现翻译后难以修饰，易形成包涵体等不利情况。
发明内容
针对酶法制备高F值低聚肽时存在的问题，本发明提供一种以小球藻为原料制备高F值低聚肽的方法，生产条件温和、肽产品安全性高、功能特异性高。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种以小球藻为原料制备高F值低聚肽的方法，包括以下步骤：
（1）将小球藻蛋白以内肽酶水解，获得酶解液I；
（2）将酶解液I用羧肽酶酶解后，用活性炭吸附除杂后获得高F值低聚肽溶液，干燥后获得高F值低聚肽；
所述羧肽酶的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1或2所示。
步骤（1）中，小球藻蛋白提取步骤为：小球藻粉末加水制成悬液，加入NaOH，超声提取，提取液调至中性后固液分离，获得蛋白液，乙醇沉淀后获得小球藻蛋白。优选的，悬液中小球藻粉末质量与水的体积比例为1:30-50。NaOH加入质量为小球藻悬液体积的1%-7%；更优选为3%-6%。为了简便过程，也可以将NaOH与悬液中的水配制成NaOH溶液，直接加入小球藻配制成悬液。提取温度为20-70℃；更优选为20-40℃。提取时间为30-75min。更为优选的，小球藻悬液溶胀12-24h后提取。
步骤（1）中，所述内肽酶为胰蛋白酶。酶添加量为70000-90000U/mg蛋白。优选的，酶解条件为：pH 8-10；温度27-52℃，优选为42-52℃。
步骤（2）中，羧肽酶的酶解条件为：pH 6.5-7.5，酶添加量为小球藻蛋白量的3%-7%；酶解温度为27℃-40℃。
本发明具有以下优点：
本发明提供的制备高F值低聚肽的方法，以小球藻为原料，高蛋白含量，成本低，产量高。采用胰蛋白酶和原核重组表达的羧肽酶粗酶液依次水解提取的小球藻蛋白，具有生产条件温和、安全性高，良好的溶解性、稳定性及功能特异性等优点。本发明的方法有利于提高产品F值，降低酶法生产成本，减少后期纯化过程中的能耗，降低环境污染，实现高效制备高F值低聚肽的工业化生产应用。
生物保藏信息
黑曲霉（Aspergillus niger），于2019年11月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址为中国北京，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No. 18828。
附图说明
图1为CPA基因PCR产物凝胶电泳图片；
图2为构建Y206S和S135G突变体过程的琼脂糖凝胶电泳图；
图3为重组酶粗酶液SDS-PAGE电泳图；
图4为不同料液比下的蛋白提取率；
图5为不同氢氧化钠添加量下蛋白的提取率；
图6为不同温度下蛋白的提取率；
图7为不同提取温度下蛋白的提取率；
图8为胰蛋白酶和碱性蛋白水解小球藻蛋白的水解度；
图9为不同pH下小球藻蛋白的水解度；
图10为不同温度下小球藻蛋白的水解度；
图11为不同时间下小球藻蛋白的水解度；
图12为不同酶添加量下小球藻蛋白的水解度；
图13为不同酶处理后生成的低聚肽产物的F值。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 重组羧肽酶（CPA）的获得
1. 黑曲霉M00988 CPA的克隆与表达载体的构建
根据NCBI黑曲霉源的羧肽酶基因序列，设计了两对引物CPA-F/CPA-R，序列见表1。
表1 羧肽酶基因克隆引物序列
Figure RE-398693DEST_PATH_IMAGE002
提取黑曲霉M00988（CGMCC No. 18828）的DNA为模板，序列如SEQ ID NO: 6所示。以CPA-F/CPA-R引物进行PCR扩增获得目的基因片段CPA。PCR扩增条件为：94℃预变性5min，然后94℃变性30s，68℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min，得到一段大小约为1500bp的片段，琼脂糖电泳检测如图1所示。
以所得目的基因片段CPA为模板，以加酶切位点的引物CPA-Nde I-F/CPA-Eco I-R（见表2）进行PCR扩增，获得加酶切位点目的基因片段CPA，将其与克隆载体PMD18-T连接，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，经过氨苄青霉素抗性平板筛选，挑取阳性转化子。将重组质粒命名为T-CPA，送至华大基因公司进行测序，将测序结果在NCBI上比对。经测序验证正确的重组质粒T- CPA，用Nde I和EcoI双酶切后连接到经相同酶切的Pcold TF上，构建表达载体Pcold TF- CPA。
表2 带酶切位点羧肽酶基因克隆引物序列
Figure RE-315834DEST_PATH_IMAGE004
2. M00988CPA突变体的构建
选择M00988 CPA底物结合口袋上的几个位点进行定点突变，分别是206位的酪氨酸和135位的丝氨酸。利用重叠延伸PCR方法构建定点突变的突变体，分别设计了引物，见表3。
表3 重叠延伸PCR引物序列
Figure RE-564412DEST_PATH_IMAGE006
以构建成功的Pcold TF-CPA质粒为突变的原材料，通过重叠延伸PCR经过两轮PCR进行定点突变。第一轮PCR以构建成功的Pcold TF-CPA质粒为模板，以CPA-Nde I-F，Y206S-R和Y206S-F，CPA-Eco I-R或CPA-Nde I-F，S135G-R和S135G-F，CPA-Eco I-R为引物分别进行PCR得到包含突变位点的前段和后段序列。第二轮PCR以第一轮PCR得到的前段和后段产物为模板，以CPA-Nde I-F，CPA-Eco I-R为引物进行PCR得到突变体的全序列。
将206位的酪氨酸突变为丝氨酸或135位的丝氨酸突变为甘氨酸，构建Pcold TF-CPA-Y206S或Pcold TF-CPA-S135G突变体的表达载体。得到成功将206位的酪氨酸突变为丝氨酸或135位的丝氨酸突变为甘氨酸后的突变序列。图2为构建Y206S和S135G突变体过程的琼脂糖凝胶电泳图。图2（A）为Y206S突变体电泳图，其中1、2道为前段，3、4道为后段，5、6道为第二轮PCR产物；图2（B）为S135G突变体电泳图，其中1、2道为后段，3、4道为前段，5、6道为第二轮PCR产物。
分别对Pcold TF以及突变序列进行双酶切，之后采用T4 DNA连接酶将经过双酶切的突变序列和Pcold TF进行连接，并得到重组质粒Pcold TF-CPA-Y206S、Pcold TF-CPA-S135G，其目的基因核酸序列分别如SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 5所示。
3. M00988 CPA及其突变体的原核表达
将构建好的Pcold TF-CPA及突变体的表达载体分别转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中。在氨苄霉素抗性平板上筛选阳性重组子，并经菌落PCR验证后再测序验证。将经验证正确的Pcold TF-CPA/BL21及突变体重组菌接种至5mL含氨苄抗性的液体LB培养基，37℃过夜培养，然后以1%的接种量转接至100mL含氨苄抗性的液体LB培养基中，37℃培养至OD600在0.6-0.8之间，再加入IPTG至终浓度为0.5mM，15℃培养18h。将发酵液于8000r/min4℃离心10min，收集菌体。用0.2M的磷酸缓冲液（pH7.5）重悬菌体，采用超声波细胞破碎法破碎细胞，8000r/min4℃离心10min，所得上清液即为粗酶液。粗酶液经SDS-PAGE电泳（图3）发现，在100kDa左右有蛋白条带，与预测的CPA蛋白量98kDa接近，说明构建的原核表达体系能够正确表达羧肽酶。M00988 CPA蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示，两突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示。
实施例2 高F值低聚肽的制备
1. 小球藻蛋白提取
准确称量一定量的小球藻粉末，置于250mL锥形瓶中，按适量料液比g/mL，加入去离子水，搅拌后放于摇床中，200rpm室温下溶胀12小时。向溶胀的小球藻悬液中加入适量氢氧化钠固体，添加过程中注意缓慢添加，并不断搅拌。完成后，在一定温度和时间下超声处理。接着，用0.1mol/L氢氧化钠溶液和盐酸溶液调节pH=7，在5000rpm 25℃下离心10min，取上清液，用量筒测量体积并记录后，从中取10mL于锥形瓶中，以1:4（V/V）料液比加入95%的4℃乙醇溶液，搅拌1min，充分混合。再以5000rpm在25℃下离心10分钟，倒掉上清液。将所得沉淀用少量去离子水清洗，去表面酒精后，再用0.1mol/L pH=6的PBS溶液30mL复溶沉淀，振荡至其完全溶解。
所得样品用Bradford蛋白浓度测定试剂盒，按照说明书指示进行蛋白浓度的测定，根据所得蛋白质浓度计算蛋白质提取率。蛋白质提取率计算公式如下：
Figure RE-287518DEST_PATH_IMAGE007
式中：
R——小球藻蛋白提取率，%；
C——提取液中蛋白质的浓度，mg/mL；
V——溶液体积，mL；
M——小球藻粉末质量，g；
X——小球藻蛋白含量，%。
（1）不同料液比选择
料液比（m/V）的梯度设为1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80等八个梯度。分别取1g小球藻粉末，分别配置上述8种浓度悬液，25℃下200r/min溶胀12小时。加入1%的固体氢氧化钠，25℃、40W超声30min。提取完调pH=7,5000rpm、25℃离心10min，取上清，测量记录体积。取10mL上清液，以1:4（V/V）加入4℃、95%乙醇溶液，搅拌1min充分混合。25℃、于5000rpm下离心10min，去上清液，沉淀用去离子水轻轻冲掉沉淀中残留酒精，用30mL、pH=6的PBS溶液充分溶解沉淀。测定提取液蛋白含量，计算蛋白提取率，结果如图4所示，料液比自1:10-1:40均与蛋白提取率呈现正相关的趋势，蛋白提取率随料液比的增加而增大。但是再次增加料液比，蛋白提取率反而会降低，在1:40时，蛋白提取率达到最高为9.17%。
（2）不同氢氧化钠添加量的选择
取1g小球藻粉末，以料液比（m/V）1:40配置悬液，25℃下200r/min溶胀12小时。分别加入不同质量的氢氧化钠固体，至样品溶液中氢氧化钠浓度为1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%，25℃、40W超声30min。提取完调pH=7，5000rpm、25℃离心10min，取上清，测量记录体积。取10mL上清液，以1:4（V/V）加入4℃、95%乙醇溶液，搅拌1min充分混合。25℃、于5000rpm下离心10min，去上清液，沉淀用去离子水轻轻冲掉沉淀中残留酒精，用30mL、pH=6的PBS溶液充分溶解沉淀。测定提取液蛋白含量，计算蛋白提取率结果如图5所示：当氢氧化钠添加量在1%-5%时，蛋白提取率呈增加趋势，峰值处于5%，且在4%-5%之间的提取率有明显提升。当氢氧化钠添加量继续增加时，蛋白提取率呈现下降趋势。
（3）不同提取温度的选择
取1g小球藻粉末，以料液比（m/V）1:40配置悬液，25℃下200r/min溶胀12小时。加入5%的固体氢氧化钠，分别在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃下40W超声30min。提取完调pH=7，25℃下5000rpm离心10min，取上清，测量记录体积。取10mL上清液，以1:4（V/V）加入4℃、95%乙醇溶液，搅拌1min充分混合。25℃、于5000rpm下离心10min，去上清液，沉淀用去离子水轻轻冲掉沉淀中残留酒精，用30mL、pH=6的PBS溶液充分溶解沉淀。测定提取液蛋白含量，计算蛋白提取率。结果如图6所示：当提取温度在20℃-70℃时，呈现先增后减的趋势，且在40℃时出现了峰值。
（4）不同提取时间的选择
取1g小球藻粉末，以料液比（m/V）1:40配置悬液，25℃下200r/min溶胀12小时。加入5%的固体氢氧化钠，在40℃、40W下分别超声15min、30min、45min、60min、75min。提取完调pH=7，25℃下5000rpm离心10min，取上清，测量记录体积。取10mL上清液，以1:4（V/V）加入4℃、95%乙醇溶液，搅拌1min充分混合。25℃、于5000rpm下离心10min，去上清液，沉淀用去离子水轻轻冲掉沉淀中残留酒精，用30mL、pH=6的PBS溶液充分溶解沉淀。测定提取液蛋白含量，计算蛋白提取率。结果如图7所示：提取时间为30-75min，蛋白提取率在60min时出现最大值。
2. 内肽酶酶解条件优化
将小球藻蛋白提取条件进行响应面优化，根据获得的结果提取小球藻蛋白：准确称量一定量的小球藻粉末，按1:48（m/V）的料液比加入去离子水，搅拌后于室温下振荡12小时溶胀。向小球藻悬液中加入5.37%的氢氧化钠固体，添加过程中注意缓慢添加，并不断搅拌。完成后，在43℃下超声处理60min。接着，用0.1mol/L氢氧化钠溶液和盐酸溶液调节pH=7，在5000rpm 25℃下离心10min，取上清液，以1:4（V/V）的比例加入4℃的95%酒精溶液，搅拌1min，充分混合。再以5000rpm在25℃下离心10分钟，倒掉上清液。将所得沉淀用少量去离子水清洗，去表面酒精后，再用0.1mol/L pH=6的PBS溶液将沉淀溶解，获得小球藻蛋白提取液。
取1mL上述提取液，加pH=6的PBS缓冲液4mL混合，在酶最适反应pH、温度下于水浴锅中恒温处理20min。取适量酶加入提取液中开始水解，每隔1h，用0.1mol/L的标准氢氧化钠溶液滴定测水解度，水解度计算公式如下：
本水解度采用pH-stat法：
DH= VNaOH×NNaOH /（α×Mp×Htot）×100%
式中：
VNaOH——滴定消耗的碱体积，mL；
NNaOH——滴定消耗的碱当量浓度，mol/L；
Mp——参加蛋白水解的蛋白总量，g；
Htot——每克蛋白中肽键的当量常数，9.2mmol/g；
α——氨基酸的平均解离度；
α=10pH-pk/（1+10pH-pk）
pK=7.8+2400×（298-T）/298T
T=273.15+t
t——反应环境的温度，℃；
pH——反应起pH值。
（1）不同种类酶的水解度
取1mL小球藻蛋白提取液，加pH=6的PBS缓冲液4mL混合，分别在pH=8、37℃和pH=10.5、40℃下于水浴锅中恒温处理20min。加入胰蛋白酶和碱性蛋白酶各2500U酶液开始水解，胰蛋白酶于37℃，pH为8的条件下；碱性蛋白酶是于40℃，pH为10.5的条件下，每隔1h，用0.1mol/L的标准氢氧化钠溶液滴定测水解度并记录数据，共水解4小时，计算总水解度，确定最适酶种类，结果如图8所示：胰蛋白酶的水解度优于碱性蛋白水解度。
（2）不同pH下的水解度
取1mL小球藻蛋白提取液，加pH=6的PBS缓冲液4mL混合，调pH分别为6、7、8、9、10在37℃下于水浴锅中恒温处理20min。加入7500U的胰蛋白酶酶液开始水解，每隔1h，用0.1mol/L的标准氢氧化钠溶液滴定测水解度并记录数据，共水解4小时，计算总水解度，结果如图9所示：整体上pH从6-8阶段的水解度是呈上升降趋势的，在pH8时出现峰值，自pH8-pH9的阶段水解度一直呈下降趋势的。
（3）不同温度下的水解度
取1m小球藻蛋白提取液，加pH=6的PBS缓冲液4mL混合，调pH为8分别在27℃、32℃、37℃、42℃、47℃、52℃下于水浴锅中恒温处理20min。加入7500U的胰蛋白酶酶液开始水解，每隔1h，用0.1mol/L的标准氢氧化钠溶液滴定测水解度并记录数据，共水解4小时，计算总水解度，结果如图10所示：整体上从27℃到42℃的水解度都是与温度呈正相关的，温度越高水解度越高，到42℃时出现水解度最大峰值。之后，温度与水解度呈负相关变化，水解度随着温度升高而降低。
（4）不同时间下的水解度
取1mL小球藻蛋白提取液，加pH=6的PBS缓冲液4mL混合，调pH为8在42℃下于水浴锅中恒温处理20min。加入7500U的胰蛋白酶酶液开始水解，分别在0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、5h时，用0.1mol/L的标准氢氧化钠溶液滴定测水解度并记录数据，计算总水解度，结果如图11所示：整体上水解度和酶解时间呈现正相关趋势。在0-3.5h，水解度随时间增加而升高，在3.5h时达到稳定，水解度不再随时间而改变，酶解反应完全。
（5）不同酶添加量下的水解度
取1mL小球藻蛋白提取液，加pH=6的PBS缓冲液4mL混合，调pH为8分别在42℃下于水浴锅中恒温处理20min。分别加入10000U/mg蛋白、30000U/mg蛋白、50000U/mg蛋白、70000U/mg蛋白、90000U/mg蛋白的胰蛋白酶酶液开始水解，每隔1h，用0.1mol/L的标准氢氧化钠溶液滴定测水解度并记录数据，共水解4小时，计算总水解度，结果如图12所示：整体上水解度与酶添加量呈正相关趋势，随酶的添加量增加，水解度的增加逐渐趋于平缓。可观察到从酶添加量70000U/mg蛋白到之后，水解度的增加就几乎趋于水平。
3. 羧肽酶酶解
准确称量一定量的小球藻粉末，按1:48（m/V）的料液比加入去离子水，搅拌后于室温下振荡12小时溶胀。向小球藻悬液中加入5.37%的氢氧化钠固体，添加过程中注意缓慢添加，并不断搅拌。完成后，在43℃下超声处理60min。接着，用0.1mol/L氢氧化钠溶液和盐酸溶液调节pH=7，在5000rpm 25℃下离心10min，取上清液，以1:4（V/V）的比例加入4℃的95%酒精溶液，搅拌1min，充分混合。再以5000rpm在25℃下离心10分钟，倒掉上清液。将所得沉淀用少量去离子水清洗，去表面酒精后，再用0.1mol/L pH=6的PBS溶液将沉淀溶解，获得小球藻蛋白提取液。
将内肽酶酶解条件进行响应面优化，根据获得的结果对小球藻蛋白进行内肽酶酶解：将提取的小球藻蛋白液的pH调至8，按80361.64U/mg小球藻蛋白的加酶量加入胰蛋白酶，在37℃水浴条件下酶解3.5h，煮沸5min灭酶活，获得内肽酶酶解液。
取1mL上述内肽酶酶解液调节pH至7.5，按5%的加酶量分别加入原核表达的CPA、CPA-Y124G及CPA-S135G突变体的粗酶液，分别记为CPA、Y124G、S135G。在40℃水浴条件下酶解4小时，然后煮沸5min灭酶活。
另取上述内肽酶酶解液调节pH至7.0，按1U/mg蛋白添加风味蛋白酶（相当于4%添加量），记为Fla。在45℃水浴条件下酶解4小时，然后煮沸5min灭酶活；
再取上述内肽酶酶解液调节调节pH至6.5，按30U/mg蛋白添加木瓜蛋白酶（相当于4%添加量），记为Pap。在60℃水浴条件下酶解4小时，然后煮沸5min灭酶活。
4. 活性炭吸附芳香族氨基酸
将经外肽酶酶解后的样品pH调至4.5，按固液比1:10的比例加入活性炭素，在25℃下吸附12小时。过滤除去活性炭素，得到高F值低聚肽溶液。用酸水解法将其水解为游离的氨基酸，用高效液相测定低聚肽溶液中其氨基酸组成及含量，表4低聚肽产物溶液中中芳香族氨基酸和支链氨基酸的含量。
表4 支链氨基酸与芳香族氨基酸含量
Figure RE-446098DEST_PATH_IMAGE009
图13为不同酶处理后生成的低聚肽产物溶液中的F值的柱形图。由试验结果可以看出，用CPA原酶制得的样品其F值为13.11，未能达到高F值水平（F值>20）；用突变体Y206S和S135G制得的低聚肽的F值分别为34.33和33.42，相较于原酶来说，用突变体Y206S和S135G制得的低聚肽的F值分别显著提高了约2.62和2.55倍，达到的高F值的水平。同时采用特异性改造的酶突变体Y206S和S135G所制得的低聚肽产品的F值也明显优于目前市面上制备低聚肽普遍采用的风味蛋白酶和木瓜蛋白酶。
序列表
<110> 北京工商大学
<120> 一种以小球藻粉为原料制备高F值低聚肽的方法
<130> 20191106
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 480
<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 1
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1 5 10 15
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Asn Leu Gln Arg Arg Pro Leu Val Ile Ala Ser Thr Asp Glu Ala Lys
35 40 45
Val Thr Ile Ile Tyr Ala Gly Leu Leu Ile Pro Gly Asp Gly Glu Pro
50 55 60
Leu Arg Asn Ala Ala Leu Val Ile Ser Asp Lys Ile Ile Ala Phe Val
65 70 75 80
Gly Ser Glu Ala Asp Ile Pro Lys Lys Tyr Leu Arg Ser Thr Gln Ser
85 90 95
Thr His Arg Val Pro Val Leu Met Pro Gly Leu Trp Asp Cys His Met
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115 120 125
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195 200 205
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245 250 255
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275 280 285
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Leu Glu His Val Ser Tyr Ala Asp Glu Glu Val Trp Glu Leu Met Lys
305 310 315 320
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355 360 365
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<400> 14
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Claims (9)

1.一种以小球藻为原料制备高F值低聚肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将小球藻蛋白以内肽酶水解，获得酶解液I；
（2）将酶解液I用羧肽酶酶解后，用活性炭吸附除杂后获得高F值低聚肽溶液，干燥后获得高F值低聚肽；
所述羧肽酶的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1或2所示；
步骤（1）中，所述内肽酶为胰蛋白酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，小球藻蛋白提取步骤为：小球藻粉末加水制成悬液，加入NaOH，超声提取，提取液调至中性后固液分离，获得蛋白液，乙醇沉淀后获得小球藻蛋白。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，悬液中小球藻粉末质量与水的体积比例为1:30-50；NaOH加入质量为小球藻悬液体积的1%-7%；提取温度为20-70℃；提取时间为30-75min。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，NaOH加入质量为小球藻悬液体积的3%-6%；提取温度为20-40℃。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，超声提取前，还包括将小球藻悬液溶胀12-24h的步骤。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，内肽酶添加量为70000-90000 U/mg蛋白。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，内肽酶解条件为：pH 8-10；温度27-52℃。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，酶添加量为蛋白量的3%-7%。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，羧肽酶的酶解条件为：pH 6.5-7.5，温度为27℃-40℃。
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