CN112921023A

CN112921023A - 一种重组天冬氨酸裂解酶及高重复利用率用于制备r-3-氨基丁酸的方法

Info

Publication number: CN112921023A
Application number: CN202110340692.4A
Authority: CN
Inventors: 杨卫华; 张利坤; 谈聪; 唐云平; 李业; 彭汶铎; 钱敏帆; 严燕兵; 倪建洲; 吴怀春
Original assignee: Changxing Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Changxing Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2021-03-30
Filing date: 2021-03-30
Publication date: 2021-06-08
Anticipated expiration: 2041-03-30
Also published as: CN112921023B

Abstract

本发明公开了一种重组天冬氨酸裂解酶及高重复利用率用于制备R‑3‑氨基丁酸的方法，通过基因工程，在原基因的两端分别增加一段带有多个氨基且为极性氨基酸残基的多肽链，基于该序列通过生物发酵获得酶液，与树脂固定获得固定化酶。该固定化酶减少了固定化载体与蛋白质共价结合对酶活性中心结合几率，从而降低固定化后对酶活损害，使酶活回收率最高能提高到50%以上，且由于增加极性氨基酸数量，提高可用于转化底物浓度，在工业化酶发酵工程中大大降低酶的成本并节约生产工序。

Description

一种重组天冬氨酸裂解酶及高重复利用率用于制备R-3-氨基丁酸的方法

技术领域

本发明涉及酶工程和生物催化领域，具体地说涉及一种重组天冬氨酸裂解酶及高重复利用率用于制备R-3-氨基丁酸的方法。

背景技术

中国专利ZL 201810198044.8（公开日：2018年08月07日）公开了一种R-3-氨基丁酸的制备方法，该方法以较高浓度的巴豆酸、铵盐为底物，加入含有镁离子的盐，在碱性条件下加入重组天冬氨酸酶进行生物催化，获得98%以上的转化率。其中的重组天冬氨酸酶是基于芽孢杆菌重组天冬氨酸酶的基因获得的。

该酶可用于树脂作为载体进行固定化，该方法主要是酶以共价键结合于载体上即将酶分子上非活性部位功能团与载体表面反应基团进行共价结合的方法。其优点在于：酶与载体结合牢固，稳定性好；但缺点在于：采用了比较强烈的反应条件，会引起酶蛋白的高级结构的变化，有机率破坏活性中心，所以往往不能得到比活高的固定化酶。

大部分酶与树脂固定后，酶的活性会受到很大影响。前述重组天冬氨酸酶利用树脂进行固定化后，酶活回收率只有10%，几乎无法制备固定化酶，可见载体与酶蛋白结合后会使其失活变性。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种用于树脂载体固定并具有高重复利用率的重组天冬氨酸裂解酶及其编码基因；本发明还提供了前述基因片段的重组表达载体和对应的宿主细胞；本发明还有一个目的是提供基于前述重组天冬氨酸裂解酶固定化酶的高重复利用率制备R-3-氨基丁酸上的方法。

技术方案：一种重组天冬氨酸裂解酶，具有由第一序列SEQ ID NO.1和第二序列依次串联形成的氨基酸序列，其中，所述第一序列和第二序列的长度分别为SEQ ID NO.1的2-5%，任意氨基酸选自C半胱氨酸、G甘氨酸、H组氨酸、K赖氨酸、N天冬氨酸、Q谷氨酰胺、R精氨酸、S丝氨酸、T苏氨酸、Y酪氨酸中的任意一个。

本发明所述SEQ ID NO.1序列与ZL 201810198044.8公开的序列相同，其能在高浓度底物下进行酶催化反应，获得手性纯度不低于99.95%，杂质纯度不低于99%，含量不低于99%，产品收率不低于85%的R-3-氨基丁酸。酶催化的反应原理和酶制备方法参见ZL201810198044.8的说明书记载。本发明在现有技术的基础上，进一步探讨了如何提高该酶的重复利用率，通过在3’端和5’端分别增加两条亲水序列，显著提高了重复利用率，并维持较高的酶催化转化率。

值得注意的是，所述两条亲水序列的长度分别为SEQ ID NO.1的2-5%，且两条序列的氨基酸选自半胱氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸中的任意一个，而其他亲水氨基酸构建的酶稳定性不足，或显著降低转化率。优选地，两条亲水序列中精氨酸、赖氨酸应保证较高的含量，不少于任一亲水序列的20%。具体地说，所述第一序列中的精氨酸比例不少于10%，赖氨酸比例不少于10%，组氨酸比例不少于9%。所述第二序列中的精氨酸比例不少于20%，赖氨酸比例不少于15%。

具体地说，所述第一序列为SEQ ID NO.2，氨基酸序列为TCRKSYHKQGNRYQTYSRCKH；第二序列为SEQ ID NO.3，氨基酸序列为CHTSYGRYRKQRK。

本发明提供的酶不仅适用于传统酶催化体系，同样也适用于高底物浓度的酶催化反应。由于高底物浓度引起高盐浓度，进而会干扰酶氨基酸残基之间的静电相互作用，使蛋白质表面必需水分子层减少，导致疏水相互作用增加，加速酶变性、聚集、沉降。本发明提供得到第一序列和第二序列位于活性催化片段的两端，可以有效屏蔽高盐，增加和稳定蛋白质表面的水化层，防止高盐条件下蛋白质的展开。基于天冬氨酸裂解酶的结构模型，我们通过引入定点突变在酶表面增加了极性氨基酸的数量，获得了稳定性提高的酶突变体，该突变体在本高盐浓度（即高底物浓度）的酶催化体系下，仍然保证极高的稳定性。

本发明还提供表达前述天冬氨酸裂解酶的分离的基因片段，包括如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，其表达SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3依次串联形成的氨基酸序列。

本发明还提供了一种重组表达载体，其包含前述SEQ ID NO.4的基因片段，选用包括但不限于pET、pGEX、pMAL的任意一种作为载体，优选pET-28质粒。

对应地，本发明还提供了利用前述重组表达载体制备获得的宿主细胞。所述宿主细胞选自包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母的任意一种，优选大肠杆菌作为宿主细胞。

基于上述氨基酸序列和基因片段，本发明提供的一种高重复利用率制备R-3-氨基丁酸上的方法，包括如下步骤：

（1）将表达权利要求1所述重组天冬氨酸裂解酶的菌种破壁制备粗酶液，离心获得酶清液，按每1000U酶清液与1~10g载体混合，获得固定化酶；

（2）以浓度为100~400g/L的巴豆酸、铵盐为底物，加入所述固定化酶，在pH为8.5-9.5的条件下进行生物酶催化，具有不低于98%的转化率；

（3）回收固定化酶，重复用于步骤（2）所述的生物酶催化反应。

对于上述步骤（1），在专利ZL 201810198044.8报道酶蛋白序列基础上，N端添加第二序列CHTSYGRYRKQRK，C端添加第一序列TCRKSYHKQGNRYQTYSRCKH，通过密码子优化后合成基因。将合成基因和载体进行双酶切并纯化，随后按适量的比例将目的片段和载体进行连接构成重组质粒，加入感受态细胞进行转化构成重组菌株，将重组菌株涂布在相应抗性的平板中进行培养，然后依次经发酵培养、细胞破碎处理获得粗酶液，离心获得酶清液，按每1000U酶清液与1~10g载体混合，获得固定化酶。

对于上述步骤（2），所述生物酶催化反应中，铵盐中的铵根离子与巴豆酸的摩尔比为0.2~0.4:1，优选为0.3:1。所述铵盐选用包括但不限于硫酸铵、氯化铵、乙酸铵、甲酸铵的任意一种或多种的组合，优选为乙酸铵。

本发明在生物酶催化反应前，先通过加入氨水调节pH至6.5~7.5，其目的在于使该反应液处于中性条件，为了使酶能够多次重复利用。加入固定化酶后，维持催化反应在中性条件下，优选的pH为5.5~8.5，更优选的为6.5~7.5。

优选地，所述载体为环氧树脂和/或氨基树脂。更优选地，所述固定化酶与载体固定后可重复利用20次，仍保留不低于50%的相对酶活，或固定化酶的酶活回收率不低于30%。

更优选地，所述载体选用氨基树脂，所述固定化酶与载体固定后可重复利用20次，能保留不低于65%的相对酶活，或固定化酶的酶活回收率不低于40%。

上述重组天冬氨酸裂解酶进行生物催化反应具有不低于98%的转化率，即使在高底物浓度的反应条件下，依然能保持较好的稳定性，通过树脂制备固定化酶重复利用20次依然能维持转化率在98%以上。

本发明提供的固定化酶可降低高浓度底物、产物对酶催化体系效率产生的抑制作用。大致分为两种情况：1. 如果是别构抑制，抑制剂会结合到酶表面的特定位点，进而引起酶整体结构的变化，导致活性中心的催化效率降低。通过酶的固定化，可能阻止了底物或产物与酶表面特定位置的结合，解除别构抑制；2. 如果底物或产物直接与活性中心结合产生抑制效果，酶固定化则会可能引起活性口袋的轻微变形，这种变形会影响抑制剂与酶的相互作用，但不会影响底物与酶的结合。这种情况比较常见于底物分子比抑制剂分子大的情形。

本发明通过基因工程，在原基因两端分别增加一段带有多个氨基且为极性氨基酸残基的多肽链，减少固定化载体与蛋白质共价结合对酶活性中心结合几率，从而降低固定化后对酶活损害，使酶活回收率最高能提高到50%以上，且由于增加极性氨基酸数量，提高可用于转化底物浓度，在工业化酶发酵工程中大大降低酶的成本并节约生产工序。

附图说明

图1为实施例1中第一序列的氨基酸亲水性分布曲线；

图2为实施例1中第二序列的氨基酸亲水性分布曲线；

图3为试验例中固定化酶A和对照组随着反应时间产物生成量对比图；

图4为试验例中固定化酶A和对照组重复使用20次相对酶活对比图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1

1. 构建重组天冬氨酸裂解酶表达菌株

一种重组天冬氨酸裂解酶，具有由SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3依次串联形成的氨基酸序列，SEQ ID NO.2的氨基酸序列为TCRKSYHKQGNRYQTYSRCKH；SEQ IDNO.3的氨基酸序列为CHTSYGRYRKQRK。整个氨基酸序列的核苷酸编码序列如SEQ ID NO.4所示。

序列SEQ ID NO.2的亲水性分布如图1所示，纵坐标表示疏水性大小（正值表示疏水，负值表示亲水）；图2展示了SEQ ID NO.3的亲水性分布，可见极性氨基酸残基占比较大，具有更高耐盐性。

委托上海捷瑞生物工程有限公司合成基因，将合成基因和载体进行双酶切并纯化，随后按适量的比例将目的片段和pET-28载体进行连接构成重组质粒，加入BL21(DE3)感受态细胞进行转化构成重组菌株，将重组菌株涂布在相应抗性的平板中进行培养，获得重组天冬氨酸裂解酶表达菌株BL21(DE3)/pET-28a(+)-Asp。

2. 酶液制备

将重组菌接种至浓度为50 μg/mL卡那霉素LB斜面集培养，37℃培养12 h，获得斜面菌体；用无菌水洗下培养好的斜面菌体接入装有100 mL终浓度为50 μg/mL的卡那霉素LB发酵培养基的500 mL三角瓶中，37℃、150 r/min培养6~8 h后，25℃、150 r/min诱导培养10~12 h。将发酵液离心(5000 r/min，10 min)收集沉淀菌体。用100 mmol/L、pH 7.0磷酸缓冲液悬浮菌体，使菌体终浓度为20%(m/V)，超声破碎20 min，4℃下9000 r/min离心10 min，保留上清得到粗酶液。

将上述粗酶液加入0.1-0.3g/L的壳聚糖絮凝，再通过高速离心，得到酶清液。

3. 载体树脂活化

取25g 氨基树脂LX-1000HAA（西安蓝晓科技新材料股份有限公司）载体水洗两遍后，加入100mL水，及0.2%(v/v)戊二醛，150 r/min，25℃活化1h后，水洗两遍备用抽滤干备用。

4. 固定化酶的制备

称好所需已活化树脂，每1000U上述絮凝后酶液加入8g固定化树脂（按照经验一般8g树脂对应处理后酶液量约15-25g），树脂质量与酶液总质量比为1:5左右，不够补加PBS溶液，在25℃下固定（摇床摇或者100-200rpm搅拌都可以）24h后抽滤洗涤干净，冷藏保存在0.1M pH7.4的PBS溶液中（PBS浸湿树脂保证存放不干即可，可加34mg/L用量的氯霉素防止杂菌滋生），获得固定化酶A。

如采用ZL 201810198044.8公开的酶液与LX-1000HAA进行固定，酶活回收率为10.5%。固定化酶A重复利用20次，能保留不低于65%的相对酶活，固定化酶的酶活回收率为50.5%，转化率在98%以上。

实施例2

本实施例在实施例1的基础上进行适当的变化，将氨基树脂LX-1000HAA替换为环氧树脂LX-1000EP（西安蓝晓科技新材料股份有限公司），获得固定化酶B。

如采用ZL 201810198044.8公开的酶液与LX-1000EP进行固定，酶活回收率为4.8%。本实施例的固定化酶B与载体固定后重复利用20次，转化率在98%以上。

实施例3

本实施例在实施例1的基础上进行适当的变化，将氨基树脂LX-1000HAA替换为环氧树脂LX-103B（西安蓝晓科技新材料股份有限公司），获得固定化酶C。

如采用ZL 201810198044.8公开的酶液与LX-103B进行固定，酶活回收率为5.3%。本实施例的固定化酶C与载体固定后重复利用20次，转化率在98%以上。

实施例4 1000L体系生物催化反应

在1000L催化体系中，加入250kg巴豆酸，2.4kg硫酸镁，58kg乙酸铵，再用氨水将pH调至7.0，40℃搅拌，加入上述实施例1获得的天冬氨酸固定化酶菌10kg，开始反应。反应12h结束后，经检测溶液中的R-3-氨基丁酸浓度可达294g/L，转化率达到98%以上。

反应结束后，反应液经过滤截留固定化酶，清液经纳滤膜去除盐以及大部分色素。微滤选用截留相对分子质量大于3000-5000道尔顿物质的微滤膜进行分离，纳滤截留相对分子质量大于120~200道尔顿物质的钠滤膜进行分离。得到的纳滤清液经浓缩结晶、离心以及干燥得到255kg成品。

经检测该成品R-3-氨基丁酸手性纯度为99.98%，杂质纯度为99.54%，含量为99.7%，产品收率为88%。

该反应重复50次，反应时间控制在12h内，转化率达到98%以上，得到的产品符合质量标准。

实施例5 15000L体系生物催化反应

在15000L催化体系中，加入3900kg巴豆酸，36kg硫酸镁，870kg乙酸铵，用氨水将pH调至6.8，42℃搅拌，加入天冬氨酸固定化酶170kg，开始反应。反应12h结束后，经检测溶液中的R-3-氨基丁酸浓度可达307g/L，转化率达到98%以上。

反应结束后，反应液经过滤截留固定化酶，清液经纳滤膜去除盐以及大部分色素。微滤选用截留相对分子质量大于3000-5000道尔顿物质的微滤膜进行分离，纳滤截留相对分子质量大于120~200道尔顿物质的钠滤膜进行分离。得到的纳滤清液经浓缩结晶、离心以及干燥得到4154kg成品。

经检测该成品R-3-氨基丁酸手性纯度为99.99%，杂质纯度为99.60%，含量为99.6%，产品收率为90.2%。

试验例

本实施例选用本发明改造过基因菌株（实验组）与ZL 201810198044.8公开的菌株（对照组）按照实施例1的方法制备固定化酶，然后在100mL催化体系中，加入25g巴豆酸，024g硫酸镁，5.8g乙酸铵，再用氨水将pH调至7.0，40℃搅拌，分别加入实施例1~3获得的固定化酶A~C和对照组获得的固定化酶1g，开始反应。反应16h结束后，检测两组溶液中的R-3-氨基丁酸浓度。

随着时间产物生成量如图3所示，可知固定化酶A反应16h产物浓度达285g/L，而对照组只有实验组的五分之一，且后续反应速率较慢，几乎无法正常反应，表明原基因酶的固定化效果不尽人意。由图4可知，以第一次使用固定酶酶活为100%，按照上述工艺使用基因改造后固定化酶重复进行20批反应后，反应前10批仍保留88%相对酶活，反应15批仍保留72%以上相对酶活，反应20批仍保留65%以上相对酶活。

序列表

<110> 长兴制药股份有限公司

<120> 一种重组天冬氨酸裂解酶及高重复利用率用于制备R-3-氨基丁酸的方法

<130> P2020110330745

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 467

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asn Thr Asp Val Arg Ile Glu Lys Asp Phe Leu Gly Glu Lys Glu Ile

1 5 10 15

Pro Lys Asp Ala Tyr Tyr Gly Val Gln Thr Ile Arg Ala Thr Glu Asn

20 25 30

Phe Pro Ile Thr Gly Tyr Arg Ile His Pro Glu Leu Ile Lys Ser Leu

35 40 45

Gly Ile Val Lys Lys Ser Ala Ala Leu Ala Asn Met Glu Val Gly Leu

50 55 60

Leu Asp Lys Glu Val Gly Gln Tyr Ile Val Lys Ala Ala Asp Glu Val

65 70 75 80

Ile Glu Gly Lys Trp Asn Asp Gln Phe Ile Val Asp Pro Ile Gln Gly

85 90 95

Gly Ala Gly Thr Ser Ile Asn Met Asn Ala Asn Glu Val Ile Ala Asn

100 105 110

Arg Ala Leu Glu Leu Met Gly Glu Glu Lys Gly Asn Tyr Ser Lys Ile

115 120 125

Ser Pro Asn Ser His Val Asn Met Ser Gln Ser Thr Asn Asp Ala Phe

130 135 140

Pro Thr Ala Thr His Ile Ala Val Leu Ser Leu Leu Asn Gln Leu Ile

145 150 155 160

Glu Thr Thr Lys Tyr Met Gln Gln Glu Phe Met Lys Lys Ala Asp Glu

165 170 175

Phe Ala Gly Val Ile Lys Met Gly Arg Cys His Leu Gln Asp Ala Val

180 185 190

Pro Ile Leu Leu Gly Gln Glu Phe Glu Ala Tyr Ala Arg Val Ile Ala

195 200 205

Arg Asp Ile Glu Arg Ile Ala Asn Thr Arg Asn Asn Leu Tyr Asp Ile

210 215 220

Asn Met Gly Ala Thr Ala Val Gly Thr Gly Leu Asn Ala Asp Pro Glu

225 230 235 240

Tyr Ile Ser Ile Val Thr Glu His Leu Ala Lys Phe Ser Gly His Pro

245 250 255

Leu Arg Ser Ala Gln His Leu Val Asp Ala Thr Gln Asn Thr Asp Cys

260 265 270

Tyr Thr Glu Val Ser Ser Ala Leu Lys Val Cys Met Ile Asn Met Ser

275 280 285

Lys Ile Ala Asn Asp Leu Arg Leu Met Ala Ser Gly Pro Arg Ala Gly

290 295 300

Leu Ser Glu Ile Val Leu Pro Ala Arg Gln Pro Gly Ser Ser Ile Ile

305 310 315 320

Pro Gly Met Val Cys Pro Val Met Pro Glu Val Met Asn Gln Val Ala

325 330 335

Phe Gln Val Phe Gly Asn Asp Leu Thr Ile Thr Ser Ala Ser Glu Ala

340 345 350

Gly Gln Phe Glu Leu Asn Val Met Glu Pro Val Leu Phe Phe Asn Leu

355 360 365

Ile Gln Ser Ile Ser Ile Met Thr Asn Val Phe Lys Ser Phe Thr Glu

370 375 380

Asn Cys Leu Lys Gly Ile Lys Ala Asn Glu Glu Arg Met Lys Glu Tyr

385 390 395 400

Val Glu Lys Ser Ile Gly Ile Ile Thr Ala Ile Asn Pro His Val Gly

405 410 415

Tyr Glu Thr Ala Ala Lys Leu Ala Arg Glu Ala Tyr Leu Thr Gly Glu

420 425 430

Ser Ile Arg Glu Leu Cys Ile Lys Tyr Gly Val Leu Thr Glu Glu Gln

435 440 445

Leu Asn Glu Ile Leu Asn Pro Tyr Glu Met Thr His Pro Gly Ile Ala

450 455 460

Gly Arg Lys

465

<210> 2

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Thr Cys Arg Lys Ser Tyr His Lys Gln Gly Asn Arg Tyr Gln Thr Tyr

1 5 10 15

Ser Arg Cys Lys His

20

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Cys His Thr Ser Tyr Gly Arg Tyr Arg Lys Gln Arg Lys

1 5 10

<210> 4

<211> 1509

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgacctgtc gtaaaagtta tcacaagcag ggcaaccgct accagaccta cagccgctgc 60

aagcacaata ccgatgttcg tattgagaaa gactttttag gtgaaaagga gattccgaaa 120

gacgcttatt atggcgtaca aacaattcgt gcaacggaaa attttccaat tacaggttat 180

cgtattcatc cagaattaat taaatcactg ggcattgtaa aaaaatcagc cgcattagca 240

aacatggaag ttggcttact ggataaagaa gttggccaat atatcgtaaa agctgctgac 300

gaagtgattg aaggtaaatg gaatgatcaa tttattgttg acccaattca aggcggcgca 360

ggtacttcca ttaatatgaa tgcaaatgaa gtgattgcta accgcgcatt agaattaatg 420

ggtgaggaaa aaggtaacta ttcaaaaatt agtccaaact cccatgtaaa tatgtctcaa 480

tcaacaaacg atgctttccc tactgcaacg catattgctg tgttaagttt attaaatcaa 540

ttaattgaaa ctacaaaata catgcaacaa gaattcatga aaaaagcaga tgaattcgct 600

ggcgttatta aaatgggtcg ttgccacttg caagacgctg ttcctatttt attaggtcaa 660

gagtttgaag catatgctcg tgtaattgcc cgcgatattg aacgtattgc caatacgcgt 720

aacaatttat acgacatcaa catgggtgca acagcagtcg gcactggctt aaatgcagat 780

cctgaatata ttagcatcgt aacagaacat ttagcaaaat tcagcggtca tccattacgt 840

agtgcacaac atttagtgga cgcaactcaa aatacagact gctatacaga agtttcttct 900

gcattaaaag tttgcatgat caacatgtct aaaattgcca atgatttacg cttaatggca 960

tctggtccac gcgcaggctt atcagaaatc gttcttcctg ctcgtcaacc tggttcttct 1020

atcattcctg gtatggtgtg ccctgttatg ccagaagtga tgaaccaagt ggcattccaa 1080

gtgttcggta atgatttaac aattacatct gcttctgaag caggccaatt tgaattaaat 1140

gtgatggaac ctgtgttatt cttcaattta attcaatcga tttcgattat gactaatgtc 1200

tttaaatcct ttacagaaaa ctgcttaaaa ggtattaagg caaatgaaga acgcatgaaa 1260

gaatatgttg agaaaagcat tggtatcatt actgcaatta acccacatgt aggctatgaa 1320

acagctgcaa aattagcacg tgaagcatat cttacaggcg aatccatccg tgaactttgc 1380

attaagtatg gcgtattaac agaagaacag ttaaatgaaa tcttaaatcc atatgaaatg 1440

acacatccgg gtattgctgg tcgtaaatgc cataccagct atggtcgtta tcgtaaacag 1500

agaaaataa 1509

Claims

1.一种重组天冬氨酸裂解酶，其特征在于：该裂解酶具有由第一序列SEQ ID NO.1和第二序列依次串联形成的氨基酸序列，其中，所述第一序列和第二序列的长度分别为SEQ IDNO.1的2-5%，任意氨基酸选自C半胱氨酸、G甘氨酸、H组氨酸、K赖氨酸、N天冬氨酸、Q谷氨酰胺、R精氨酸、S丝氨酸、T苏氨酸、Y酪氨酸中的任意一个。

2.根据权利要求1所述的一种重组天冬氨酸裂解酶，其特征在于：所述第一序列中的R精氨酸比例不少于10%，K赖氨酸比例不少于10%，H组氨酸比例不少于9%。

3.根据权利要求2所述的一种重组天冬氨酸裂解酶，其特征在于：所述第二序列中的R精氨酸比例不少于20%，K赖氨酸比例不少于15%。

4.根据权利要求1~3任意一项所述的一种重组天冬氨酸裂解酶，其特征在于：所述第一序列为SEQ ID NO.2，第二序列为SEQ ID NO.3。

5.分离的基因片段，包括如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，其表达SEQ ID NO.2、SEQID NO.1、SEQ ID NO.3依次串联形成的氨基酸序列。

6.一种重组表达载体，其包含权利要求5所述的基因片段。

利用如权利要求6所述的重组表达载体制备获得的宿主细胞。

7.一种高重复利用率制备R-3-氨基丁酸的方法，其特征在于：

8.根据权利要求7所述的一种高重复利用率制备R-3-氨基丁酸的方法，其特征在于：所述载体为环氧树脂和/或氨基树脂。

9.根据权利要求7所述的一种高重复利用率制备R-3-氨基丁酸的方法，其特征在于：所述固定化酶与载体固定后可重复利用20次，仍保留不低于50%的相对酶活。

10.根据权利要求9所述的一种高重复利用率制备R-3-氨基丁酸的方法，其特征在于：所述固定化酶与氨基树脂固定后可重复利用20次，仍保留不低于65%的相对酶活，或所述固定化酶的酶活回收率不低于40%。