CN110157691A - 5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体及其宿主细胞和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种5‑氨基乙酰丙酸合成酶(ALA合成酶)，所述ALA合成酶在对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第11位的氨基酸残基为Ile、Ser、Met、Cys、Val。本发明还提供了制备该酶的方法，含有该酶的表达载体、宿主细胞、该酶在ALA生产中的应用以及改造ALA合成酶以提高其活性的方法。

Description

5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体及其宿主细胞和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域。具体地说，本发明涉及5-氨基乙酰丙酸合成酶的突变体及其宿主细胞和应用。
背景技术
5-氨基乙酰丙酸(5-minolevulinic acid，ALA)是生物体合成血红素、叶绿素、VB12等四吡咯化合物的前体，广泛存在于动物、植物和微生物中。ALA在医药、农业、饲料和保健食品等领域应用广泛，是极具开发价值的高附加值生物基化学品。近年来，利用微生物经C4途径发酵生产ALA已经得到了产业化应用。
5-氨基乙酰丙酸合成酶(ALA合成酶)是C4途径合成ALA以及四吡咯化合物的关键酶和限速酶，其酶学性质的好坏直接影响ALA合成的效率。近年来，包括放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter，CN1322132C)、嗜酸柏拉红菌(Rhodoblastus acidophilus，CN1974758B)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides，CN103146694B)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris，CN103981203B)等大量不同来源的ALA合成酶被克隆鉴定并用于ALA高产菌株的构建。然而，上述ALA合成酶均为不同生物体内天然存在的酶源，这些酶本身的活性不高(Meng et al.Biotechnology Letters,2015,37(11):2247-2253；Menget al.Biotechnology Letters,2015,37(11):2247-2253)难以在工程菌中应用。
近年来，随着酶工程和蛋白质工程技术的快速发展，通过理性设计提高酶的催化活性等性质已被广泛应用。但是目前关于在ALA合成酶的理性设计和改造方面的研究并不多，现有的报道主要涉及真核生物来源的ALA合成酶，Turbeville等将两个小鼠来源的ALA合成酶融合表达后可提高其催化效率(Turbeville et al.Archives of Biochemistry&Biophysics,2011,511(1):107-117)，Lendrihas等通过构建小鼠红细胞中ALA合成酶II的突变体库，筛选得到了酶活提高的ALA合成酶突变体(Lendrihas et al.Journal ofBiological Chemistry,2010,285(18):13704)。上述研究虽然获得了酶活提高的ALA合成酶，但由于真核生物来源的ALA合成酶在细菌中表达活性较低，但并未用于ALA的生物合成。
此外，作为ALA合成过程中的关键酶，ALA合成酶活性的提高可以加快工程菌ALA合成的催化效率，减少自身蛋白合成和降解过程中能量的损耗，进而提升工程菌的稳定性和生产性能，降低ALA生产成本，对促进ALA在农牧等领域的应用有重要的价值。
因此，本领域急需开发活性高的ALA合成酶，实现ALA的低成本生物法生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种活性改善的ALA合成酶，提高ALA合成酶活性的方法、以及利用得到的ALA合成酶进行ALA生产的方法。
在第一方面，本发明提供一种ALA合成酶或其活性片段，其特征在于：
a)所述ALA合成酶的氨基酸序列在对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第11位的氨基酸残基替换为Ile、Ser、Met、Cys、Val；或
b)具有a)所限定的序列，但在上述位点之外通过一个或几个氨基酸残基，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有a)所限定的ALA合成酶功能的由a)衍生的ALA合成酶；或
c)具有a)所限定的序列，经过在a)所限定的序列的任一端的一个或几个氨基酸残基，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的缺失或添加，优选添加而形成的序列，且基本具有a)所限定的ALA合成酶功能的由a)衍生的ALA合成酶。
在优选的实施方式中，所述ALA合成酶来源于沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)。
在进一步优选的实施方式中，所述ALA合成酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有80％以上，优选85％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，更优选96％、97％、98％、99％的同源性。
在优选的实施方式中，所述ALA合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，且
a)第11位的氨基酸残基为选自以下氨基酸的一种：Ile、Ser、Met、Cys、Val；或
b)具有a)所限定的序列，但在上述位点之外通过一个或几个氨基酸残基，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有a)所限定的ALA合成酶功能的由a)衍生的ALA合成酶；或
c)具有a)所限定的序列，经过在a)所限定的序列的任一端的一个或几个氨基酸残基，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的缺失或添加，优选添加而形成的序列，且基本具有a)所限定的ALA合成酶功能的由a)衍生的ALA合成酶。
在第二方面，本发明提供第一方面所述的ALA合成酶或其活性片段的编码核酸序列。
在第三方面，本发明提供包含第一方面所述的ALA合成酶或其活性片段的编码核酸序列的表达载体。
在第四方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有第一方面所述的ALA合成酶或其活性片段。
在优选的实施方式中，所述宿主细胞包含第三方面所述的表达载体或在其基因组中整合有第二方面所述的编码核酸序列。
在优选的实施方式中，所述宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)；更优选大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌。
在第五方面，本发明提供第一方面所述的ALA合成酶或其活性片段、或第二方面所述的编码核酸序列、或第三方面所述的表达载体、或第四方面所述的宿主细胞在生产ALA中的应用。
在第六方面，本发明提供一种制备ALA的方法，所述方法包括以下步骤：
a.培养第四方面所述的宿主细胞，使之产生ALA；和
b.任选从培养液中分离步骤a产生的ALA。
在第七方面，本发明提供一种制备ALA的方法，所述方法包括以下步骤：
a.利用权利要求1所述的ALA合成酶或其活性片段，催化从琥珀酰CoA和甘氨酸合成ALA；和
b.任选从以上反应体系中分离ALA。
在第八方面，本发明提供第一方面所述的ALA合成酶的制备方法，所述方法包括以下步骤：
a.得到第一方面所述的ALA合成酶的编码序列；
b.将a得到的编码序列直接转染合适的宿主细胞或经载体引入合适的宿主细胞；
c.培养b得到的宿主细胞；
d.从步骤c得到的培养体系中分离所述宿主细胞产生的ALA合成酶。
在优选的实施方式中，所述方法还包括测定得到的ALA合成酶的活性及菌株的ALA产量。
在第九方面，本发明提供改造ALA合成酶以便提高其活性的方法，所述方法包括以下步骤：
a.相对于改造前的ALA合成酶的氨基酸序列，将待改造的ALA合成酶的氨基酸序列的第11位的氨基酸残基替换为Ile、Ser、Met、Cys、Val；
或者
将待改造的ALA合成酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列作比对，并改造所述待改造ALA合成酶的编码序列，使得编码的氨基酸序列中对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第11位的氨基酸残基替换为Ile、Ser、Met、Cys、Val；
b.将a得到的编码序列直接转染合适的宿主细胞或经载体引入合适的宿主细胞；
c.培养b得到的宿主细胞；和
d.任选从步骤c得到的培养体系中分离所述宿主细胞产生的ALA合成酶。
在优选的实施方式中，所述方法还包括测定得到的ALA合成酶的活性以及包含所述ALA合成酶的工程菌株的ALA产量。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现对SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第11位的氨基酸残基突变为Ile、Ser、Met、Cys、Val，获得的ALA合成酶不仅提高了酶活性，并且提高条了ALA的产量，从而提升了所述ALA合成酶在生产ALA中的应用价值。在此基础上完成了本发明。
本文所用的术语“自然状态”指的是在微生物中多肽处于未修饰状态的活性，即自然状态下的活性。
表述“保持初始功能”是指基因或者蛋白质的突变体具备对应于初始基因或者蛋白质的功能(如活性或者性质)的功能。用于基因的表述“保持初始功能”是指基因的突变体编码保持初始功能的蛋白质。也就是说，ALA合成酶突变体基因的“保持初始功能”是指该基因的突变体编码具有ALA合成酶活性的蛋白质，而ALA合成酶突变体“保持初始功能”的表述是指该突变蛋白具有ALA合成酶的活性。ALA合成酶的活性指该蛋白具有催化从琥珀酰CoA和甘氨酸合成ALA合成的活性。
“ALA合成酶”
本文中的术语“ALA合成酶”和“本发明的多肽”可互换使用，并具有本领域普通技术人员通常理解的含义，均是指具有催化从琥珀酰CoA和甘氨酸合成ALA合成的活性。
关于本发明，ALA合成酶可以是如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列对应的蛋白(MNYEAYFRRQLDGLHREGRYRVFADLERHAGSFPRATHHRPEGAGDVTVWCSNDYLGMGQHPAVLTAMHEALDSCGAGAGGTRNIAGTNHYHVLLEQELAALHGKESALLFTSGYVSNWASLSTLASRMPGCVILSDELNHASMIEGIRHSRSETRIFAHNDPRDLERKLADLDPHAPKLVAFESVYSMDGDIAPIAEICDVADAHNAMTYLDEVHGVGLYGPNGGGIADREGISHRLTIIEGTLAKAFGVVGGYIAGSSAVCDFVRSFASGFIFSTSPPPAVAAGALASIRHLRASSAERERHQDRVARLRARLDQAGVAHMPNPSHIVPVMVGDAALCKQISDELISRYGIYVQPINYPTVPRGTERLRITPSPQHTDADIEHLVQALSEIWTRVGLAKAA)，也可以不是SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列对应的蛋白；换言之，本发明的ALA合成酶可以与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有较高的同源性，也可以具有较低的同源性。本发明的ALA合成酶可以来源于各种物种，包括但不限于放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)、嗜酸柏拉红菌(Rhodoblastus acidophilus)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)，只要其具有ALA合成酶的活性，且其相应的第11位氨基酸残基突变为Ile、Ser、Met、Cys、Val，相比自然状态活性有所提高的，也包括在本发明的范围内。
具体地说，本发明的ALA合成酶的氨基酸序列的第11位的氨基酸残基为Ile、Ser、Met、Cys、Val；或者所述ALA合成酶的氨基酸序列在对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第11位的氨基酸残基为Ile、Ser、Met、Cys、Val。在优选的实施方式中，所述ALA合成酶的氨基酸序列在对应于SEQ ID NO:1所示序列的第11位的氨基酸残基替换为Ile。
本领域技术人员知晓，为提升活性而对野生型多肽进行突变，找到能实现所需目的的位点更为重要。因此，基于本发明的教导，本领域技术人员会对待改造的ALA合成酶的相应第11位的氨基酸残基进行突变，并检测突变体的相关活性。
此外，本领域普通技术人员也不难知晓，在多肽的某些区域，改变少数氨基酸残基基本上不会改变生物活性，例如，适当替换某些氨基酸得到的序列并不会影响其活性(可参见Watson等，Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，The Benjamin/CummingsPub.Co.P224)。因此，本领域普通技术人员能够实施这种替换(包括残基的取代、缺失、***、添加)并且确保所得多肽仍保持其初始功能。
因此，对本发明的ALA合成酶作进一步突变而得到仍具备ALA合成酶的功能和活性的进一步突变体是显而易见的。例如，本领域技术人员公知在多肽的任一端增加或减少数个氨基酸残基，例如优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基不会影响得到的突变体的功能。例如，为便于纯化，技术人员往往在得到的蛋白的任一端带上6×His标签，而这种蛋白与不具备6×His标签的蛋白具有相同的功能。
本发明还提供了编码本发明多肽的多核苷酸。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
ALA合成酶基因可以是在严格的条件下与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列制备的探针，例如与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的部分或者整个序列互补的序列杂交的DMA，只要保持其初始功能即可。所述“严格的条件”是指可形成所谓的特异性杂交且未形成非特异性杂交的条件。例如，同源性较高的DNA，例如具有80％以上同源性的DNA彼此杂交，同源性低于80％的DNA彼此不杂交的条件，或者通常的Southern杂交的清洗条件，即在相当于60℃、1*SSC、0.1％SDS、优选60℃、0.1*SSC、0.1％SDS，更优选68℃、0.1*SSC、0.1％SDS的盐浓度及温度下清洗1次、优选2-3次的条件。
此外，由于密码子的简并性因宿主而异，ALA合成酶基因中的任意密码子可以用相应的等价密码子替换，也就是说，ALA合成酶基因可以是由于遗传密码的简并性而在上面例如的任何ALA合成酶基因的突变。例如，ALA合成酶基因可以是经修饰的基因，使得其具有根据要使用的宿主中密码子频率的最佳密码子。
因此，本文所用的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
本文所用的术语“活性片段”与本领域技术人员常规理解的含义相同或相似，均是指该片段的氨基酸序列是完整蛋白或多肽的氨基酸序列的一部分，但该片段具备与完整蛋白或多肽相同或相似的功能或活性。具体地说，在本发明中，“活性片段”表示具有ALA合成酶活性的任意氨基酸序列。
基于本发明的教导和本发明具体得到的ALA合成酶，本领域技术人员不难得到具有相同或相似活性或功能的活性片段，这样的活性片段当然应该落在本发明的保护范围内。
“对应于”
本文所用的术语“对应于”具有本领域普通技术人员通常理解的意义。具体地说，“对应于”表示两条序列经同源性或序列相同性比对后，一条序列与另一条序列中的指定位置相对应的位置。因此，例如，就“对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第11位的氨基酸残基”而言，如果在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的一端加上6×His标签，那么所得突变体中对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第11位就可能是第17位。
在具体的实施方式中，所述同源性或序列相同性可以是90％以上，优选95％以上，更优选96％、97％、98％、99％的同源性。因此，与本发明的具体ALA合成酶具有90％以上，优选95％以上，更优选96％、97％、98％、99％的序列相同性或同源性，并且在上述位点具有所述氨基酸残基突变的ALA合成酶也包括在本发明的保护范围内。
任意氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的对应于位置可以通过氨基酸序列之间的比对确定。本领域普通技术人员公知的测定序列同源性或相同性的方法包括但不限于：计算机分子生物学(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.M.编，牛津大学出版社，纽约，1988；生物计算：信息学和基因组项目(Biocomputing:Informatics andGenome Projects)，Smith，D.W.编，学术出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析(Computer Analysis of Sequence Data)，第一部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，Humana Press，新泽西，1994；分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis inMolecular Biology)，von Heinje，G.，学术出版社，1987和序列分析引物(SequenceAnalysis Primer)，Gribskov，M.与Devereux，J.编M Stockton Press，纽约，1991和Carillo，H.与Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48:1073(1988)。测定相同性的优选方法要在测试的序列之间得到最大的匹配。测定相同性的方法编译在公众可获得的计算机程序中。优选的测定两条序列之间相同性的计算机程序方法包括但不限于：GCG程序包(Devereux，J.等，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S，F.等，1990)。公众可从NCBI和其它来源得到BLASTX程序(BLAST手册，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等，1990)。熟知的Smith Waterman算法也可用于测定相同性。
宿主细胞
本文所用的术语“宿主细胞”是具有本领域普通技术人员通常理解的含义，即，能够产生本发明ALA合成酶的宿主细胞。换言之，本发明可以利用任何宿主细胞，只要本发明的ALA合成酶能在该宿主细胞中表达。
例如，适用于本发明的宿主细胞来自(但不限于)大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)；更优选大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌。
固定化酶
本文所用的术语“固定化酶”具有本领域普通技术人员常规理解的含义。具体地说，该术语表示水溶性酶经物理或化学方法处理后，使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在其中，使得酶在水中形成溶性凝胶或半透膜的微囊体从而导致流动性降低。
固定化的酶仍具有酶活性，在催化反应中以固相状态作用于底物。酶经固定化后一般稳定性增加，易从反应***中分离，且易于控制，能反复多次使用。便于运输和贮存，有利于自动化生产。固定化酶是近十余年发展起来的酶应用技术，在工业生产、化学分析和医药等方面有诱人的应用前景。
本领域普通技术人员鉴于本文的教导，不难将本发明的ALA合成酶处理成固定化酶或以全细胞催化的形式，用于催化从甘氨酸和琥珀酰CoA产生ALA。
本发明的应用与优点
1.本发明的ALA合成酶能提高ALA的产量，降低生产成本，在工业上的应用前景广阔；
2.本发明提供了改造ALA合成酶的点突变位点，这些位点的突变可以有效提高待改造的ALA合成酶的酶活。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料与方法
本发明实施例所用的DNA聚合酶购自大连宝生物公司的Pyrobest；限制性内切酶及DNA连接酶等均购自Fermentas公司；
酵母粉和蛋白胨购自英国Oxoid公司产品；甘氨酸和IPTG购自Promega公司；ALA和对二甲氨基苯甲醛等购自Sigma公司；高氯血红素、琼脂粉和抗生素购自北京索来宝；葡萄糖、冰醋酸、高氯酸、三氯乙酸、乙酰丙酮氯仿以及其他常用化学试剂均购自国药。
质粒提取试剂盒和琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒均购自上海生工，相关操作均严格按照说明书执行；
质粒构建测序验证由金唯智完成；
E.coil DH5α感受态细胞购自北京全式金公司。
LB培养基成分：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，固体培养基中添加2％的琼脂粉。
M9培养基成分：Na2HPO4·12H2O 17.1g/L，KH2PO4 3.0g/L，NaCl 0.5g/L，NH4Cl1.0g/L，MgSO4 2mM，CaCl2 0.1mM，葡萄糖20g/L，酵母粉2g/L。
抗生素浓度为：氨苄青霉素100μg/mL、卡那霉素50μg/mL。
ALA的检测方法：200μL稀释的发酵液或酶活力测定反应终止后样品加入100μL pH4.6乙酸钠缓冲液，然后加入5μL乙酰丙酮，100℃水浴温育15min，冷却至室温后加入等体积的Ehrlish’s试剂(42mL冰醋酸，8mL 70％高氯酸，1g二甲氨基苯甲醛)混匀，显色10min后测553nm波长下的吸光度。
粗酶活性测定步骤如下：
(1)将已经离心收集，-80℃保存菌体(OD600＝25)用1mL Tris-HCl buffer(pH7.5，含100mM NaCl)重悬；
(2)MP破碎细胞：6M/S，30s，破碎7次；
(3)将上一步得到的细胞破碎液离心，收集上清。
(4)蛋白浓度测定参照说明书使用Thermo Scientific公司的BCA蛋白定量试剂盒完成。
酶活力测定：测定反应在总体积为200μL的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5，含100mM NaCl)体系中进行，酶反应体系中各组分如表1所示。加入10μL细胞破碎上清液，金属浴中37℃震荡反应6min后向体系中加入100μL的10％三氯乙酸溶液终止反应。
表1 ALA合成酶活性测定反应体系中各组分浓度
组分 加入体积
甘氨酸(1M) 40μL
琥珀酰辅酶A(10mM) 5μL
磷酸吡哆醛(10mM) 2μL
ALA合成酶(150μg/mL) 10μL
Tris-HCl(50mM,pH 7.5，含100mM NaCl) 143μL
实施例1.ALA合成酶突变载体的构建
利用Stratagene系列XL-II定点突变试剂盒，设计19对引物(见表2)，以pEC-XK99E-hemA野生型质粒为模板(构建过程参考谷氨酸棒状杆菌合成5-氨基乙酰丙酸的途径构建与发酵优化[J].生物技术通报,2017,33(01):148-156.)，利用上述引物进行PCR扩增，分别将HemA的第11位氨基酸残基突变为丙氨酸(A)、精氨酸(R)、半胱氨酸(C)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)。PCR反应条件为：95℃5min，10个循环(95℃30s,74℃-65℃30s,72℃4.5min)，13个循环(95℃30s,65℃30s,72℃4.5min)，72℃10min。PCR扩增体系(50μL)：模板1μL，上下游引物各1μL，dNTP mix 4μL，5×Fast Pfu Fly Buffer 10μL，灭菌的双蒸水32μL，FastPfu FlyDNA Polymerase 1μL。采用胶回收试剂盒对上述PCR产物进行纯化和回收，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含有卡那霉素的LB平板，37℃过夜培养，转化子测序验证，正确的表达载体分别命为：p11A，p11R，p11N，p11C，p11I，p11M，p11S，p11T，p11V。
表2.引物序列
引物名称 引物序列(5’-3’) SEQ ID NO:
11R-F CCGTCAACGCGACGGCCTCCATCGTGAAGGCCGG 2
11R-R GGCCGTCGCGTTGACGGCGGAAATAGGCTTCG 3
11C-F CCGTCAATGCGACGGCCTCCATCGTGAAGGCCGG 4
11C-R GGCCGTCGCATTGACGGCGGAAATAGGCTTCG 5
11I-F CCGTCAAATCGACGGCCTCCATCGTGAAGGCCGG 6
11I-R GGCCGTCGATTTGACGGCGGAAATAGGCTTCG 7
11M-F CCGTCAAATGGACGGCCTCCATCGTGAAGGCCGG 8
11M-R GGCCGTCCATTTGACGGCGGAAATAGGCTTCG 9
11S-F CCGTCAAAGCGACGGCCTCCATCGTGAAGGCCGG 10
11S-R GGCCGTCGCTTTGACGGCGGAAATAGGCTTCG 11
11T-F CCGTCAAACTGACGGCCTCCATCGTGAAGGCCGG 12
11T-R GGCCGTCAGTTTGACGGCGGAAATAGGCTTCG 13
11V-F CCGTCAAGTTGACGGCCTCCATCGTGAAGGCCGG 14
11V-R GGCCGTCAACTTGACGGCGGAAATAGGCTTCG 15
实施例2.重组菌株构建及发酵验证
将构建正确的ALA合成酶突变的表达载体转化C.glutamicum ATCC13032菌株，获得工程菌株，对ALA合成酶突变体工程菌株进行24孔板ALA发酵，突变体工程菌株在含有酵母粉的M9培养基的24孔板中培养16h作为种子液，按照初始OD600为0.5转接至含有M9培养基的24孔板中进行发酵验证，培养3h，添加诱导剂IPTG终浓度100uM，24h发酵结束，测ALA合成酶粗酶酶活以及ALA产量。粗酶酶活的检测方法、ALA的检测和葡萄糖分析方法如“材料与方法”部分所述。经检测，与野生型菌株相比，各突变体的粗酶活均有提高，各个重组菌株的ALA产量存在一定的差异，如表3所示，设野生型菌株的ALA产量为1。
结果显示，与野生型相比，ALA合成酶11位点突变体为Ile、Ser、Met、Cys、Val后，其ALA产量高于对照菌株，提升幅度为2％-40％，突变为其他氨基酸则无明显效果或产量大幅下降。
表3. 24孔板发酵验证ALA合成酶突变体对ALA合成的影响
实施例3.5L发酵罐验证
选择上述效果最好的突变体(p11I)表达菌株进行5L发酵罐验证，发酵培养基成分为：(NH4)2SO4 5g/L，KH2PO4 5g/L，玉米浆干粉2g/L，MgSO4 7H2O 2g/L，盐酸硫胺素1mg/L，发酵过程控制温度30℃，pH 6.5，溶氧不低于30％。结果显示上述菌株ALA产量分别达到20g/L，比对照菌株(17.2g/L)提高了16.2％，说明表达突变体的工程菌株在发酵罐水平也可以有效提高产物ALA的产量。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体及其宿主细胞和应用
<130> P2019-0814
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 403
<212> PRT
<213> 沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)
<400> 1
Met Asn Tyr Glu Ala Tyr Phe Arg Arg Gln Leu Asp Gly Leu His Arg
1 5 10 15
Glu Gly Arg Tyr Arg Val Phe Ala Asp Leu Glu Arg His Ala Gly Ser
20 25 30
Phe Pro Arg Ala Thr His His Arg Pro Glu Gly Ala Gly Asp Val Thr
35 40 45
Val Trp Cys Ser Asn Asp Tyr Leu Gly Met Gly Gln His Pro Ala Val
50 55 60
Leu Thr Ala Met His Glu Ala Leu Asp Ser Cys Gly Ala Gly Ala Gly
65 70 75 80
Gly Thr Arg Asn Ile Ala Gly Thr Asn His Tyr His Val Leu Leu Glu
85 90 95
Gln Glu Leu Ala Ala Leu His Gly Lys Glu Ser Ala Leu Leu Phe Thr
100 105 110
Ser Gly Tyr Val Ser Asn Trp Ala Ser Leu Ser Thr Leu Ala Ser Arg
115 120 125
Met Pro Gly Cys Val Ile Leu Ser Asp Glu Leu Asn His Ala Ser Met
130 135 140
Ile Glu Gly Ile Arg His Ser Arg Ser Glu Thr Arg Ile Phe Ala His
145 150 155 160
Asn Asp Pro Arg Asp Leu Glu Arg Lys Leu Ala Asp Leu Asp Pro His
165 170 175
Ala Pro Lys Leu Val Ala Phe Glu Ser Val Tyr Ser Met Asp Gly Asp
180 185 190
Ile Ala Pro Ile Ala Glu Ile Cys Asp Val Ala Asp Ala His Asn Ala
195 200 205
Met Thr Tyr Leu Asp Glu Val His Gly Val Gly Leu Tyr Gly Pro Asn
210 215 220
Gly Gly Gly Ile Ala Asp Arg Glu Gly Ile Ser His Arg Leu Thr Ile
225 230 235 240
Ile Glu Gly Thr Leu Ala Lys Ala Phe Gly Val Val Gly Gly Tyr Ile
245 250 255
Ala Gly Ser Ser Ala Val Cys Asp Phe Val Arg Ser Phe Ala Ser Gly
260 265 270
Phe Ile Phe Ser Thr Ser Pro Pro Pro Ala Val Ala Ala Gly Ala Leu
275 280 285
Ala Ser Ile Arg His Leu Arg Ala Ser Ser Ala Glu Arg Glu Arg His
290 295 300
Gln Asp Arg Val Ala Arg Leu Arg Ala Arg Leu Asp Gln Ala Gly Val
305 310 315 320
Ala His Met Pro Asn Pro Ser His Ile Val Pro Val Met Val Gly Asp
325 330 335
Ala Ala Leu Cys Lys Gln Ile Ser Asp Glu Leu Ile Ser Arg Tyr Gly
340 345 350
Ile Tyr Val Gln Pro Ile Asn Tyr Pro Thr Val Pro Arg Gly Thr Glu
355 360 365
Arg Leu Arg Ile Thr Pro Ser Pro Gln His Thr Asp Ala Asp Ile Glu
370 375 380
His Leu Val Gln Ala Leu Ser Glu Ile Trp Thr Arg Val Gly Leu Ala
385 390 395 400
Lys Ala Ala
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccgtcaacgc gacggcctcc atcgtgaagg ccgg 34
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggccgtcgcg ttgacggcgg aaataggctt cg 32
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccgtcaatgc gacggcctcc atcgtgaagg ccgg 34
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggccgtcgca ttgacggcgg aaataggctt cg 32
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccgtcaaatc gacggcctcc atcgtgaagg ccgg 34
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggccgtcgat ttgacggcgg aaataggctt cg 32
<210> 8
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccgtcaaatg gacggcctcc atcgtgaagg ccgg 34
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggccgtccat ttgacggcgg aaataggctt cg 32
<210> 10
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ccgtcaaagc gacggcctcc atcgtgaagg ccgg 34
<210> 11
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggccgtcgct ttgacggcgg aaataggctt cg 32
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ccgtcaaact gacggcctcc atcgtgaagg ccgg 34
<210> 13
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggccgtcagt ttgacggcgg aaataggctt cg 32
<210> 14
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ccgtcaagtt gacggcctcc atcgtgaagg ccgg 34
<210> 15
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggccgtcaac ttgacggcgg aaataggctt cg 32

Claims (9)

1.一种5-氨基乙酰丙酸合成酶(ALA合成酶)或其活性片段，其特征在于：
a)所述ALA合成酶的氨基酸序列在对应于SEQ ID NO:1所示序列的第11位的氨基酸残基替换为Ile、Ser、Met、Cys、Val；或
b)具有a)所限定的序列，但在上述位点之外通过一个或几个氨基酸残基，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有a)所限定的ALA合成酶功能的由a)衍生的ALA合成酶；或
c)具有a)所限定的序列，经过在a)所限定的序列的任一端的一个或几个氨基酸残基，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的缺失或添加，优选添加而形成的序列，且基本具有a)所限定的ALA合成酶功能的由a)衍生的ALA合成酶。
2.权利要求1所述的ALA合成酶或其活性片段的编码核酸序列。
3.包含权利要求1所述的ALA合成酶或其活性片段的编码核酸序列的表达载体。
4.一种宿主细胞，所述宿主细胞含有权利要求1所述的ALA合成酶或其活性片段。
5.如权利要求1所述的ALA合成酶或其活性片段、或权利要求2所述的编码核酸序列、或权利要求3所述的表达载体、或权利要求4所述的宿主细胞在生产ALA中的应用。
6.一种制备ALA的方法，所述方法包括以下步骤：
a.培养权利要求4所述的宿主细胞，使之产生ALA；和
b.任选从培养液中分离步骤a产生的ALA。
7.一种制备ALA的方法，所述方法包括以下步骤：
a.利用权利要求1所述的ALA合成酶或其活性片段，催化从琥珀酰CoA和甘氨酸合成ALA；和
b.任选从以上反应体系中分离ALA。
8.权利要求1所述的ALA合成酶的制备方法，所述方法包括以下步骤：
a.得到权利要求1所述的ALA合成酶的编码序列；
b.将a得到的编码序列直接转染合适的宿主细胞或经载体引入合适的宿主细胞；
c.培养b得到的宿主细胞；
d.从步骤c得到的培养体系中分离所述宿主细胞产生的ALA合成酶。
9.一种改造ALA合成酶以便提高其活性的方法，所述方法包括以下步骤：
a.相对于改造前的ALA合成酶的氨基酸序列，将待改造的ALA合成酶的第11位的氨基酸残基替换为Ile、Ser、Met、Cys、Val；
或者
将待改造的ALA合成酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列作比对，并改造所述待改造ALA合成酶的编码序列，使得编码的氨基酸序列中对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第11位的氨基酸残基替换为Ile、Ser、Met、Cys、Val；
b.将a得到的编码序列直接转染合适的宿主细胞或经载体引入合适的宿主细胞；
c.培养b得到的宿主细胞；和
d.任选从步骤c得到的培养体系中分离所述宿主细胞产生的ALA合成酶。
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