CN108220280B - 利用酵母提取高纯核酸的方法及其产品和应用 - Google Patents

利用酵母提取高纯核酸的方法及其产品和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及核酸提取领域，具体涉及一种利用酵母提取高纯核酸的方法及其产品和应用。利用酵母提取高纯核酸的方法，包括如下步骤：(1)热提取：将含酵母的原料配制成溶液，进行热提取；(2)酶解：向步骤(1)热提取后的溶液中依次加入碱性蛋白酶和外切蛋白酶进行酶解。本发明还包括利用上述方法制备得到的核酸以及核酸在食品、饲料或制药领域中的应用。采用热提取和特殊的双酶解的方法提取酵母中的核酸，提取生产周期短，生产工艺简单。适合工业化大生产。制得核酸纯度高。解决了酵母核酸提取率低、产品纯度低的难题。

Description

利用酵母提取高纯核酸的方法及其产品和应用
技术领域
本发明涉及核酸提取领域，具体涉及一种利用酵母提取高纯核酸的方法及其产品和应用。
背景技术
目前从酵母中提取核酸的研究很多，但是应用于实际的并不多，而且尚没有工业应用的报道，不同的方法多多少少都存在一定的局限性：高压均质法机械强度大，破碎操作容易受剪切损伤，并且该法没有选择性，容易使细胞壁完全破损，从而增加了其它杂质渗出，给核酸的纯化带来麻烦；自溶法条件难于控制，耗时长，提取率也较低；酶溶法常常存在抑制的问题，产物抑制会导致胞内物质释放率降低，同时，酶法破壁相对成本较高，单一酶难以获得效果；碱法提取核酸虽然提取率相对较高，但容易混入较多的蛋白质使其纯度降低，增加了后处理工序，该方法有待于进一步完善；盐法具有提取条件温和成本较低等优点，但盐法用盐量过高，仍存在诸多弊端，且提取率偏低。
中国发明专利公开了一种申请号为94115437.8的文件，名称为从天然植物细胞中提取核酸的生产工艺，它以脱脂大豆粕为原料，经过溶胀、匀浆制备、细胞裂解、溶剂抽提、透析处理、浓度和纯度测定、灭菌分装、干燥等生产工艺制得核酸提取液和核酸纯化干品，其不足在于：利用化学试剂如酚或乙醇抽提，提取液需要进行透析处理，通常需要48-72小时，而且每隔6-8小时更换一次透析液，生产周期长、成本高，有害液体的排放还会污染环境，不适合工业化生产。
中国发明专利还公开一种申请号为931110416的文件，名称为人体胎盘核酸的制备方法及应用，该方法也是利用化学试剂如饱和酚抽提，提取液的透析处理通常需要5-7天，生产周期长、成本高，有害液体的排放还会污染环境，原料来源少，不适合工业上大规模化生产。
中国发明专利CN96115417，名称为从天然食品中制取核酸原料的方法，它以豆类、高粱、大麦、小麦及玉米水果等原料，包括原料研磨、匀质裂解、离心制取核酸等工艺步骤，特点是采用研磨、高温、高速匀质等物理方法，在以氯化钠溶液作为溶剂的碱性状态下进行细胞与核蛋白的裂解以及对核酸大分子进行物理和化学的切割。该发明仍然使用了硫酸铵这类非食用的原料，废液排放仍然不能用于食品使用。该发明使用的原料为农副产品，质量波动较大，工业化大生产质量不易保持稳定。
发明内容
本发明所解决的现有技术的问题是：目前从酵母中提取核酸的方法均有一定的局限性，不适用于工业生产。而现有的利用酶解的方法来提取核酸时，酶的提取效率不高，单一酶又难以获得好的提取效果，进而难以提取得到高的核酸。
因此，需要提供一种利用酵母提取高纯度的核酸的方法。
本发明的目的是在于提供一种从酵母中提取高纯度的核酸的方法。工艺简单、生产周期短，原料质量波动小，容易进行规模化工业生产。
具体而言，本发明提供了如下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种利用酵母提取高纯核酸的方法，包括如下步骤：
(1)热提取：将含酵母的原料配制成溶液，进行热提取；
(2)酶解：向步骤(1)热提取后的溶液中依次加入碱性蛋白酶和外切蛋白酶进行酶解。
优选的，步骤(1)中热提取的温度为90-100℃。
优选的，步骤(1)中热提取的温度为96-100℃。
优选的，步骤(1)中热提取时溶液的pH值为7.0-8.0，热提取时间为60-120分钟。
优选的，步骤(1)中含酵母的原料在溶液中的重量比例为10-30％。
优选的，步骤(1)中含酵母的原料在溶液中的重量比例为10-15％。
优选的，碱性蛋白酶包括：Novo蛋白酶和Carsberg蛋白酶。
优选的，碱性蛋白酶来自于枯草芽孢杆菌。
优选的，步骤(2)中碱性蛋白酶占含酵母的原料的重量比为1-5‰，优选为1-3‰。
优选的，步骤(2)中每1kg的含酵母的原料，碱性蛋白酶的量为20U-100U。
优选的，碱性蛋白酶酶解温度为60-70℃，pH值为7.0-8.0，酶解时间为3-6h。
优选的，所述外切蛋白酶包括氨肽酶和羧肽酶，优选为氨肽酶。
优选的，步骤(2)中外切蛋白酶占含酵母的原料的重量比的浓度为1-5‰，优选为1-2‰，进一步优选每1kg的含酵母的原料，外切蛋白酶的量为20U-100U。
优选的，步骤(2)中每1kg的含酵母的原料，外切蛋白酶的量为0.2U-1U。
优选的，外切蛋白酶酶解温度为60-70℃，pH值为7.0-8.0，酶解时间为3-6h。
优选的，所述方法还包括：对步骤(2)酶解得到的溶液离心处理得到核酸提取液。
优选的，对核酸提取液进行过滤，优选膜过滤，得到提取的核酸液。
优选的，所述含酵母的原料为相对于面包酵母菌体的100重量％，含有20重量％以上的核酸，其中的RNA大于12重量％
第二方面，本发明提供了以上任一项所述的方法制备得到的核酸。
第三方面，本发明提供了以上所述的核酸在食品、饲料或制药领域中的应用。
本发明与现有技术相比具有以下优势。
(1)采用热提取和特殊的双酶解的方法提取酵母中的核酸，提取生产周期短，生产工艺简单。适合工业化大生产。
(2)在整个生产中，核酸产品和抽提核酸后的副产品均可用于食品。
(3)制得核酸纯度高。解决了酵母核酸提取率低、产品纯度低的难题。
具体实施方式
如上所述，本发明提供了一种利用含有酵母的原料提取高纯核酸的方法。所述高纯核酸是指核糖核酸的纯度为80％以上。
本发明基于现有的酶法提取核酸的基础，在热提取的基础上，采用两种不同性质的酶依次进行酶解，即分别通过碱性蛋白酶和外切蛋白酶进行酶解，可以显著提高核酸的纯度。
碱性蛋白酶指的是pH值碱性范围内水解蛋白质肽键的酶类，是作用pH值为7-11，而且由于其活性中心含Ser，因此又称为丝氨酸蛋白酶。不仅能够水解肽键，而且具有水解酯键、酰胺键和转酯及转肽的功能。能够将大分子的蛋白质分子肽链分解成多肽或氨基酸，具有较强的分解蛋白质的能力。碱性蛋白酶的分子量优选为26000～34000，优选pH为7-8。常见的碱性蛋白酶有两种，一种为Novo蛋白酶，另一种为Carsberg蛋白酶。碱性蛋白酶的主要来源为微生物提取，其中在一种优选实施方式中，碱性蛋白酶来自于枯草芽孢杆菌。主要有Subtilisin E、Subtilisin BPN、Subtilisin、Carsberg、Subtilisin、Armylosaccharticus等几类。
外切蛋白酶能够从肽链的任意一端切下单个的氨基酸，从而将蛋白质或者多肽分解成单个的氨基酸。包括氨肽酶和羧肽酶。本发明优选为氨肽酶。
其中，在一种实施方式中，通过如下步骤所实现：
1、原料酵母热提取
取含有酵母的原料，加水调节干物质浓度在10-15％，调节pH为7.0-8.0，升温至90-100℃，维持时间60-120分钟。
2、加入酶制剂降解核酸中的蛋白质
第一步热提取后的溶液中加入碱性蛋白酶1-3‰，设定温度在60-70℃，pH 7.0-8.0，酶解作用3-6小时，然后再加入外切蛋白酶1-2‰，设定温度在60-70℃，pH7.0-8.0，酶解作用3-6小时。分离取上清液得到核酸提取液。
3、核酸的膜过滤纯化
使用有机超滤膜，过滤核酸提取液，膜截留的部分即为提纯的核酸液。
4、核酸的提取
上清液中加入盐酸，调节pH至2.0-2.5，核酸沉淀下来，成为较高纯度的核酸。
其中，热处理没有特别的限制，其主要目的是灭活酵母中的核酸酶(特别是核酸酶)、蛋白酶、磷酸酯合成酶等，其作用温度为90-100℃，优选为96-100℃。温度过低，不足以灭活酶，以至于会产生较低含量和较低纯度的核酸。温度过高时，产物可能会出现烧焦臭味或者显色。
其中，在酶处理过程中，首先利用碱性蛋白酶破碎酵母的细胞壁，使得细胞内的核酸溢出，蛋白酶再将结合在核酸上的蛋白质移除降解。如果在处理过程中首先利用外切蛋白酶进行酶解，然后再利用碱性蛋白酶酶解的话，那么酵母细胞壁破碎效果差，不少核酸会残留在细胞内，不能收集到。从而会降低提取率。
其中，所述含有酵母的原料为任何含有酵母的物质。其中本发明的“酵母”没有特别限制，可以是例如啤酒酵母如酿酒酵母、面包酵母，也可以是其他酵母株酵母、假丝酵母、毕赤酵母、汉逊酵母等等。所述的酵母可以是新鲜酵母，或者也可以是活性干酵母。也可以是含有核酸的酵母提取物或者酵母发酵物或者酵母浸出膏等等，也可以是由糖蜜、淀粉水解糖为原料发酵的面包酵母。所述的面包酵母可以是市售的普通面用活性干酵母，超市或者便利店出售的任意的小包装面用活性干酵母或者块状压榨的鲜酵母均可。
其中，在本发明的一种优选实施方式中，所述面包酵母为高核酸的面包酵母，相对于面包相对于面包酵母菌体的100重量％，含有20重量％以上的核酸，其中的RNA大于12.0重量％。所述高核酸面包酵母的制备方法，包括面包酵母菌体的种子罐培养和面包酵母菌体的扩大培养，包括：
a)在扩大培养过程中，在面包酵母菌体湿重达到100g/L～120g/L之后，加入相对于扩大培养的发酵体系为1‰g/L以上的谷氨酰胺和1‰g/L以上的天冬氨酸；
b)继续扩大培养，直至相对于面包酵母菌体的100重量％，RNA大于12.0重量％。所述高核酸的面包酵母的制备方法记录在中国专利ZL201010613463.7中。
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。但是这些实施例仅为本发明的代表举例而已，不应理解为本发明实施的限定范围。此外，凡是对本发明配方、生产工艺步骤的简单替换或变化，均属于本发明的保护范围。本发明组合物中所用的原料均为本领域技术人员常用的原料。
其中，本发明实施例和对比例中所用到原料信息及厂家如表1：
表1实施例和对比例中所用到原料信息及厂家
原料 纯度和/或型号 厂家
面包酵母 -- 安琪酵母股份公司
Alcalase酶 20万U/g 丹麦诺维信公司
Flavourzyme酶 2000U/g 丹麦诺维信公司
核酸酶 50万U/g 南京庞博生物工程有限公司
木瓜蛋白酶 60万U/g 南京庞博生物工程有限公司
有机超滤膜 UFX5，5KD Alfa Lava公司(阿法拉伐)
实施例一
取面包干酵母100kg，加入1000kg水，制成酵母乳状液。用氢氧化钠调节pH值至7.5，升温到96℃，保温90分钟，然后降温到65℃，加入Alcalase酶0.2kg，调节pH7.0，温度保持65℃，酶解作用4小时后，灭活；再加入flavourzyme酶0.15kg，温度保持在60℃，pH值为7.0，作用4小时后，灭活。然后进入离心机，以5000转/分离心30分钟获得上清液。上清液使用有机超滤膜(分子量5KD)过滤，膜截留的液体即核酸提取液。核酸提取液中加入盐酸，调节pH至2-2.5，所得沉淀即核酸。所得核酸沉淀加清水洗净，得到高纯度核酸。然后进行冷冻干燥，得到核酸粉末。
然后参照如下方法分别对提取后核酸的含量、提取之前酵母中核酸的含量进行测定。
具体测定方法如下：
核酸含量参照安琪酵母股份有限公司企业标准Q/AQJM 2144S-2014中附录A中RNA含量的测定方法，包括：
1.试剂
0.5mol/L的高氯酸(HClO4)溶液：在400mL蒸馏水加入21.5mL70％(或22.1mL68％)的高氯酸，再用蒸馏水定容至500mL。
0.25mol/L高氯酸(HClO4)溶液：取250mL0.5mol/L高氯酸(HClO4)用蒸馏水稀释定容至500mL。
2.设备
电子天平：精确至1mg；
离心机：4000转/分钟，能分离酵母；
离心试管，容量至少10mL；
分光光度计：波长可调至260nm；
热水浴：70℃；
冷水浴：4℃；
10mL和1mL吸管；
100mL容量瓶。
3.操作步骤
3.1样品处理
吸取20-50mg样品到离心管并称其重量。
加入5mL的0.5mol/L HClO4，振荡混匀。将该离心管放入70℃水浴锅中，保温15分钟，每3-4分钟振荡一次。
在4000rpm离心10分钟，吸取1mL上清液，用蒸馏水定溶至100mL，混匀。
3.2测定
用待测样品冲洗比色皿，装满比色皿后放入分光光度计。擦净表面。在260nm测光吸收值，用蒸馏水作为空白。记录吸光度，重复测量一次，取两次测量的平均值。
计算
RNA含量(％)＝(A×稀释度×0.03365×5×100)÷(m×Ds)
式中A——样品溶液的吸光度；
稀释度——按本方法操作时，稀释度为100；
m——称取样品的质量，mg；
Ds——样品的干物质；
5——在加入0.5mol/LHClO4后溶液的体积；
0.03365——对应于吸光度为1.00时，待测溶液中RNA的含量，mg/100mL。
4.精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的3％。
分别记录测定的提取后核酸的含量、提取之前酵母中核酸的含量值，然后计算核酸的提取率以及核酸的纯度。
其中核酸的提取率为提取后测得的核酸的含量占酵母中核酸含量的百分比。
核酸的纯度为提取后测得的核酸的含量占冷冻干燥后核酸的重量的百分比。
实验测得，实施例一计算得到的核酸的提取率为72％，核酸的纯度为85％。
同时，参照安琪酵母股份有限公司企业标准Q/AQJM 2144S-2014对制得的核酸的感官和理化指标以及微生物限量进行了测定，其各项指标均符合要求。
其中水分：按GB 5009.3规定的方法测定。
总砷：按GB/T 5009.11规定的方法测定。
铅：按GB 5009.12规定的方法测定。
菌落总数：按GB 4789.2规定的方法测定。
大肠菌群：按GB 4789.3规定的方法测定。
霉菌：按GB 4789.15规定的方法测定。
沙门氏菌：按GB 4789.4规定的方法测定。
表2感官特征
项目 特征
色泽 淡黄色。
气味 核酸特有气味。
外观 粉状。
杂质 无肉眼可见外来杂质。
表3理化指标
项目 参数
RNA含量(以干基计)，％ ≥75.0
水分，％ ≤8.0
总砷(以As计)，mg/kg ≤2.0
铅(以Pb计)，mg/kg ≤2.0
表4微生物限量
项目 参数
菌落总数，CFU/g ≤10000
大肠菌群，MPN/g ≤0.3
霉菌，CFU/g ≤25
酵母，CFU/g ≤25
沙门氏菌，/25g 未检出
实施例二
取面包干酵母100kg，加入900kg水，制成酵母乳状液。用氢氧化钠调节pH值至8，升温到95℃，保温120分钟，然后降温到70℃，加入Alcalase酶0.1kg，调节pH7.5，温度保持70℃，酶解作用3小时后，灭活；再加入flavourzyme酶0.1kg，温度保持在70℃，pH值为7.5，作用3小时后，灭活。然后进入离心机，以5000转/分离心30分钟获得上清液。上清液使用有机超滤膜(分子量5KD)过滤，膜截留的液体即核酸提取液。核酸提取液中加入盐酸，调节pH至2-2.5，所得沉淀即核酸。所得核酸沉淀加清水洗净，得到高纯度核酸。然后进行冷却干燥，得到核酸粉末。
然后分别按照实施例一的方法计算核酸的提取率以及核酸的纯度。
实验测得，核酸的提取率为71％，核酸的纯度为80％。制得的核酸的感官和理化指标以及微生物限量的各项指标均符合要求。
实施例三
取面包干酵母100kg，加入600kg水，制成酵母乳状液。用氢氧化钠调节pH值至7.0，升温到100℃，保温60分钟，然后降温到65℃，加入Alcalase酶0.3kg，调节pH8.0，温度保持60℃，酶解作用6小时后，灭活；再加入flavourzyme酶0.2kg，温度保持在60℃，pH值为8.0，作用6小时后，灭活。然后进入离心机，以5000转/分离心30分钟获得上清液。上清液使用有机超滤膜(分子量5KD)过滤，膜截留的液体即核酸提取液。核酸提取液中加入盐酸，调节pH至2-2.5，所得沉淀即核酸。所得核酸沉淀加清水洗净，得到高纯度核酸。然后进行冷却干燥，得到核酸粉末。
然后分别按照实施例一的方法计算核酸的提取率以及核酸的纯度。实验测得，核酸的提取率为74％，核酸的纯度为90％。制得的核酸的感官和理化指标以及微生物限量的各项指标均符合要求。
对比例一
取面包干酵母100kg，加入900kg水，制成酵母乳状液。用氢氧化钠调节pH值至8.0，升温到85℃，保温150分钟，然后降温到70℃，加入Alcalase酶0.1kg，调节pH7.5，温度保持70℃，酶解作用3小时后，灭活；再加入flavourzyme酶0.1kg，温度保持在70℃，pH值为7.5，作用3小时后，灭活。然后进入离心机，以5000转/分离心30分钟获得上清液。上清液使用有机超滤膜(分子量5KD)过滤，膜截留的液体即核酸提取液。核酸提取液中加入盐酸，调节pH至2-2.5，所得沉淀即核酸。所得核酸沉淀加清水洗净，得到核酸溶液。然后进行冷却干燥，得到核酸粉末。
然后分别按照实施例一的方法计算核酸的提取率以及核酸的纯度。
实验测得核酸的提取率为60％，核酸的纯度为80％。制得的核酸的感官和理化指标以及微生物限量的各项指标均符合要求。
对比例二
取面包干酵母100kg，加入900kg水，制成酵母乳状液。用氢氧化钠调节pH值至8.0，升温到95℃，保温120分钟，然后降温到70℃，加入Amano核酸酶0.1kg，调节pH7.5，温度保持70℃，酶解作用3小时后，灭活；再加入木瓜蛋白酶0.1kg，温度保持在70℃，pH值为7.5，作用3小时后，灭活。然后进入离心机，以5000转/分离心30分钟获得上清液。上清液使用有机超滤膜(分子量5KD)过滤，膜截留的液体即核酸提取液。核酸提取液中加入盐酸，调节pH至2-2.5，所得沉淀即核酸。所得核酸沉淀加清水洗净，得到核酸溶液。然后进行冷却干燥，得到核酸粉末。
然后分别按照实施例一的方法对核酸的提取率以及核酸的纯度进行测定。
实验测得核酸的提取率仅为20％，核酸的纯度为57％。因为使用了Amano核酸酶进行酶解，所以使得提取的核酸分解为核苷酸，所以核酸的提取率仅为20％。而且由于核酸大多数被降解，也就失去了提取的意义。
对比例三
取面包干酵母100kg，加入900kg水，制成酵母乳状液。用氢氧化钠调节pH值至8.0，升温到95℃，保温120分钟，然后降温到65℃，加入flavourzyme酶0.1kg，调节pH7.0，温度保持65℃，酶解作用3小时后，灭活；再加入Alcalase酶0.1kg，温度保持在70℃，pH值为7.0，作用3小时后，灭活。然后进入离心机，以5000转/分离心30分钟获得上清液。上清液使用有机超滤膜(分子量5KD)过滤，膜截留的液体即核酸提取液。核酸提取液中加入盐酸，调节pH至2-2.5，所得沉淀即核酸。所得核酸沉淀加清水洗净，得到核酸溶液。然后进行冷却干燥，得到核酸粉末。
然后分别按照实施例一的方法对核酸的提取率以及核酸的纯度进行测定。
实验测得，核酸的提取率为50％，核酸的纯度为60％。对比例三先利用外切蛋白酶flavourzyme酶进行酶解，然后再利用碱性蛋白酶Alcalase酶进行酶解处理，其处理后的效果同实施例一到实施例三相比，无论是核酸的提取率还是核酸的纯度均比较低。将两种蛋白酶蛋白酶交换顺序，即不先利用碱性蛋白酶酶解，对于酵母细胞壁的破碎效果差，导致不少核酸残留在细胞内，随着离心过程而浪费掉，不能被收集，使得核酸的提取率降低。而且由于酶解效果不佳，导致核酸的纯度也较低。
对比例四
取面包干酵母100kg，加入900kg水，制成酵母乳状液。用氢氧化钠调节pH值至8.0，升温到95℃，保温120分钟，然后降温到70℃，加入木瓜蛋白酶0.1kg，温度保持在70℃，pH值为7.5，作用6小时后，灭活。然后进入离心机，以5000转/分离心30分钟获得上清液。上清液使用有机超滤膜(分子量5KD)过滤，膜截留的液体即核酸提取液。核酸提取液中加入盐酸，调节pH至2-2.5，所得沉淀即核酸。所得核酸沉淀加清水洗净，得到核酸溶液。然后进行冷却干燥，得到核酸粉末。
然后分别按照实施例一的方法对核酸的提取率以及核酸的纯度进行测定。
实验测得核酸的提取率为40％，核酸的纯度为55％。仅采用单一酶(木瓜蛋白酶)进行酶解，酶解效果不佳，测得的核酸的提取率和核酸的纯度均较低，达不到应用的目的。
以上所述仅为本发明较佳实施例，并不用于局限本发明，凡在本发明的精神和原则之内所做的修改、等同替换和改进等，均需要包含在发明的保护范围之内。

Claims (60)

1.一种利用酵母提取高纯核酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）热提取：将含酵母的原料配制成溶液，进行热提取；
（2）酶解：向步骤（1）热提取后的溶液中依次加入碱性蛋白酶和外切蛋白酶进行酶解；
步骤（1）中热提取的温度为96-100℃。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中热提取时溶液的pH值为7.0-8.0，热提取时间为60-120分钟。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中含酵母的原料在溶液中的重量比例为10-30%。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中含酵母的原料在溶液中的重量比例为10-30%。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中含酵母的原料在溶液中的重量比例为10-15%。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中含酵母的原料在溶液中的重量比例为10-15%。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，碱性蛋白酶包括： Novo蛋白酶和Carsberg蛋白酶。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，碱性蛋白酶包括：Novo蛋白酶和Carsberg蛋白酶。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，碱性蛋白酶包括：Novo蛋白酶和Carsberg蛋白酶。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，碱性蛋白酶包括：Novo蛋白酶和Carsberg蛋白酶。
11.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，碱性蛋白酶包括： Novo蛋白酶和Carsberg蛋白酶。
12.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，碱性蛋白酶包括： Novo蛋白酶和Carsberg蛋白酶。
13.根据权利要求7-12中任一项所述的方法，其特征在于，所述碱性蛋白酶来自于枯草芽孢杆菌。
14.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其特征在于，步骤（2）中碱性蛋白酶占含酵母的原料的重量比为1-5‰。
15.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其特征在于，步骤（2）中碱性蛋白酶占含酵母的原料的重量比为1-3‰。
16.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其特征在于,每1kg的含酵母的原料，碱性蛋白酶的量为20U-100U。
17.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其特征在于，碱性蛋白酶酶解温度为60-70℃，pH值为7.0-8.0，酶解时间为3-6h。
18.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，碱性蛋白酶酶解温度为60-70℃，pH值为7.0-8.0，酶解时间为3-6h。
19.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，碱性蛋白酶酶解温度为60-70℃，pH值为7.0-8.0，酶解时间为3-6h。
20.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其特征在于，所述外切蛋白酶包括氨肽酶和/或羧肽酶。
21.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述外切蛋白酶包括氨肽酶和/或羧肽酶。
22.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述外切蛋白酶包括氨肽酶和/或羧肽酶。
23.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述外切蛋白酶包括氨肽酶和/或羧肽酶。
24.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其特征在于,所述外切蛋白酶为氨肽酶。
25.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其特征在于，步骤（2）中外切蛋白酶占含酵母的原料的重量比的浓度为1-5‰。
26.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，步骤（2）中外切蛋白酶占含酵母的原料的重量比的浓度为1-5‰。
27.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，步骤（2）中外切蛋白酶占含酵母的原料的重量比的浓度为1-5‰。
28.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，步骤（2）中外切蛋白酶占含酵母的原料的重量比的浓度为1-5‰。
29.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，步骤（2）中外切蛋白酶占含酵母的原料的重量比的浓度为1-5‰。
30.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其特征在于，步骤（2）中外切蛋白酶占含酵母的原料的重量比的浓度为1-2‰。
31.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其特征在于，每1kg的含酵母的原料，外切蛋白酶的量为0.2-1U。
32.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，每1kg的含酵母的原料，外切蛋白酶的量为0.2-1U。
33.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，每1kg的含酵母的原料，外切蛋白酶的量为0.2-1U。
34.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，每1kg的含酵母的原料，外切蛋白酶的量为0.2-1U。
35.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，每1kg的含酵母的原料，外切蛋白酶的量为0.2-1U。
36.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其特征在于，外切蛋白酶酶解温度为60-70℃，pH值为7.0-8.0，酶解时间为3-6h。
37.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，外切蛋白酶酶解温度为60-70℃，pH值为7.0-8.0，酶解时间为3-6h。
38.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，外切蛋白酶酶解温度为60-70℃，pH值为7.0-8.0，酶解时间为3-6h。
39.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，外切蛋白酶酶解温度为60-70℃，pH值为7.0-8.0，酶解时间为3-6h。
40.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，外切蛋白酶酶解温度为60-70℃，pH值为7.0-8.0，酶解时间为3-6h。
41.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，外切蛋白酶酶解温度为60-70℃，pH值为7.0-8.0，酶解时间为3-6h。
42.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：对步骤（2）酶解得到的溶液离心处理得到核酸提取液。
43.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：对步骤（2）酶解得到的溶液离心处理得到核酸提取液。
44.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：对步骤（2）酶解得到的溶液离心处理得到核酸提取液。
45.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：对步骤（2）酶解得到的溶液离心处理得到核酸提取液。
46.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：对步骤（2）酶解得到的溶液离心处理得到核酸提取液。
47.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：对步骤（2）酶解得到的溶液离心处理得到核酸提取液。
48.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：对步骤（2）酶解得到的溶液离心处理得到核酸提取液。
49.根据权利要求36所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：对步骤（2）酶解得到的溶液离心处理得到核酸提取液。
50.根据权利要求42所述的方法，其特征在于，对核酸提取液进行过滤，得到提取的核酸液。
51.根据权利要求43-49中任一项所述的方法，其特征在于，对核酸提取液进行膜过滤，得到提取的核酸液。
52.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其特征在于，所述含酵母的原料为相对于面包酵母菌体的100重量%，含有20重量%以上的核酸，其中的RNA大于12重量%。
53.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述含酵母的原料为相对于面包酵母菌体的100重量%，含有20重量%以上的核酸，其中的RNA大于12重量%。
54.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述含酵母的原料为相对于面包酵母菌体的100重量%，含有20重量%以上的核酸，其中的RNA大于12重量%。
55.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述含酵母的原料为相对于面包酵母菌体的100重量%，含有20重量%以上的核酸，其中的RNA大于12重量%。
56.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述含酵母的原料为相对于面包酵母菌体的100重量%，含有20重量%以上的核酸，其中的RNA大于12重量%。
57.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，所述含酵母的原料为相对于面包酵母菌体的100重量%，含有20重量%以上的核酸，其中的RNA大于12重量%。
58.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，所述含酵母的原料为相对于面包酵母菌体的100重量%，含有20重量%以上的核酸，其中的RNA大于12重量%。
59.根据权利要求36所述的方法，其特征在于，所述含酵母的原料为相对于面包酵母菌体的100重量%，含有20重量%以上的核酸，其中的RNA大于12重量%。
60.根据权利要求49所述的方法，其特征在于，所述含酵母的原料为相对于面包酵母菌体的100重量%，含有20重量%以上的核酸，其中的RNA大于12重量%。
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