JPH0466086A - ウロキナーゼ前駆体含有溶液の取得方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、純化ウロキナーゼ前駆体の取得方法に関する
ものであり、詳しくは高純度ウロキナーゼ前駆体溶液を
製造するための試料として適当な程度まで純化されたウ
ロキナーゼ前駆体含有溶液の取得方法に関するものであ
る。

（従来の技術） ウロキナーゼ前駆体は、プラスミノーゲンを活性化する
、いわゆるブラスミノーゲナクチベーターであり、血管
内に生じた血栓に対する治療薬として近年注目を集めて
いる。

従来、人の尿から精製されたウロキナーゼが血栓に対す
る治療薬と、して使用されて来たが、尿からの回収や精
製作業の繁雑さ、回収されるウロキナーゼは高活性を有
する高分子型と低活性しか有さない低分子型の混合され
たものであり、かつ、精製作業を行っているうちに高分
子型の低分子型への変換が生じるといった技術的課題が
ある。またこれに加え、治療薬として人体に大量投与す
ると副作用として出血作用を示す、という報告もある。

そのため、より活性の低い形態への変換が生じ難く、か
つ出血という副作用の少ないという性質を有するウロキ
ナーゼ前駆体が注目されるようになった。

ウロキナーゼ前駆体は天然には極めて微量にしか存在し
ないため、遺伝子操作の手法を適用して大量に取得する
試みがなされている（特開昭５９−５１３００号公報）
。

ところで、遺伝子操作の手法により大腸菌等の菌体でウ
ロキナーゼ前駆体を製造すると、いかなる理由であるか
は不明であるが、製造されたウロキナーゼ前駆体は活性
を発現し得ない不溶性の沈殿として菌体内に蓄積される
ことがある。従って、活性を発現し得る可溶性ウロキナ
ーゼ前駆体含有溶液を取得するため、例えば特開昭５９
−１６１３２１号又は特開昭６０−５００８９３号各公
報に記載されたような、菌体を適当な溶液中で超音波や
プレス機により破砕し、不溶性画分を回収し、後にグア
ニジン塩酸塩等の蛋白質変性剤やアルカリ処理を実施し
てウロキナーゼ前駆体の可溶化処理を行い、更にこの変
性剤の濃度を低下させたりｐＨを中性程度に戻してやる
ことで活性化処理を行う操作が実施される。

（従来技術の課題） 前記したように、ウロキナーゼ前駆体は血栓の治療薬と
して有望される蛋白質であるため、他の夾雑物を出来る
だけ除去した高純度のものが要求される。

一般に、ウロキナーゼ前駆体のような酵素（酵素前駆体
）を含有する溶液について、目的酵素を精製する手法と
して液体クロマトグラフィー法等を適用することが知ら
れている。しかしながら、液体クロマトグラフィー法は
、ある程度純化された酵素溶液についてさらに純度を高
める場合には有効な手段であるが、溶液中に夾雑物が多
量に存在する場合にはゲルの劣化が生じたり、性質の不
明な夾雑物がゲルに強力に吸着してしまう恐れがあると
いう不都合が生じる。更には、液体クロマトグラフィー
法を実施するためにはある程度時間が必要であり、特に
精製しようとする溶液が大量となるほど、多大な時間が
必要である。

従って、高純度のウロキナーゼ前駆体含有溶液を得よう
とする場合には、ある程度純化されたものを一旦取得し
、その後頁なる純化作業を実施することが効率のうえで
は最も良いのである。

ところが、例えば前記した特開昭５９−１［１１３２１
号公報には、内部にウロキナーゼ前駆体を有する菌体を
適当な溶液中で破砕した後、遠心分離等の操作で可溶性
の夾雑物を除去する方法が記載されているが、遠心分離
を行うには時間がかかるうえ、核酸、細胞壁多糖類、脂
質又は蛋白質等の夾雑物の大部分はウロキナーゼ前駆体
とともに不溶性画分に回収されてしまうという課題があ
る。また、大量のウロキナーゼ前駆体含有溶液について
遠心分離を実施しようとすれば大型の遠心分離機が必要
となり、大型の設備を設けなければならない。

他に、例えば硫安等の塩を添加する塩析法や、エタノー
ル等の有機溶媒を添加する溶媒分画法を適用した、ウロ
キナーゼ前駆体と夾雑物の溶解度の差に基づいた精製方
法も考えられる。この方法によれば、前記した更なる純
化作業に供するのに好適な、ある程度の純化されたウロ
キナーゼ前駆体含有溶液を取得することが可能である。

しかし、これらの方法は実験室レベルでの作業には適当
であるものの、工業規模では種々の課題を有している。

例えばこれらの方法では、塩や有機溶媒等の試薬をウロ
キナーゼ前駆体含有溶液重量の２０−１’２０％程度使
用しなければならず、試薬コストか高くなることは勿論
、試薬の貯蔵施設や試薬管理者を設けることが必要とな
るのである。また例えば、大量の塩をウロキナーゼ前駆
体含有溶液に添加する場合には塩が溶液に空気を持ち込
むために発泡といった課題が生じ、有機溶媒を添加する
場合には有機溶媒と水の反応により発熱するという課題
が生じるのである。発泡が生じると、溶液中の不溶物（
沈殿等）が泡に吸着してしまい、遠心分離等の操作によ
って分離することが難しくなる。

（課題を解決するための手段） 以上のような課題に鑑みて、本発明者らは特別な設備を
必要とすることなく、簡便な操作により、可溶化・活性
化操作を終了した後の大量のウロキナーゼ前駆体含有溶
液について適用可能であり、例えば液体クロマトグラフ
ィー法等の高純度化のため操作に供するのに好適な、あ
る程度に純化されたウロキナーゼ前駆体含有溶液を取得
する方法を提供することを目的として鋭意研究を行った
結果、本発明を完成するに至った。即ち本発明は、ウロ
キナーゼ前駆体をコードする遺伝子を含むプラスミドで
形質転換された菌体宿主を培養して当該蛋白質を内部に
有する菌体を取得し、該菌体を適当な溶液中で破砕して
不溶性のウロキナゼ前駆体を含む溶液を取得し、当該溶
液について可溶化・活性化処理を施して活性を発現し得
る可溶性ウロキナーゼを含む溶液を取得し、次いで可溶
性ウロキナーゼを含む溶液に有機酸及び／又は鉱酸を添
加してそのｐＨを低下させ、生じた沈殿を溶液から除去
することからなる純化されたウロキナーゼ前駆体含有溶
液の取得方法である。以下、本発明の詳細な説明する。

本発明により取得される純化されたウロキナーゼ前駆体
含有溶液は、大腸菌等の菌体に由来する核酸、細胞壁多
糖類、脂質又は蛋白質等の夾雑物の大部分が除去された
ものであり、例えば液体クロマトグラフィー等の更なる
高純度化のための作業に供するのに好適なものである。

なお、本発明でいうウロキナーゼ前駆体とは、プラスミ
ン等の蛋白質分解酵素の作用を受けて活性化された後に
ブラスミノーゲンアクチベーターとしての活性を発揮す
る蛋白質であり、例えば特開昭５９−５１３００号公報
に記載されたような、人腎臓細胞等の細胞培養液中に天
然に遊離されるアミノ酸−次構造を有するものの他、例
えば特開昭８２−１４３８８６号公報に記載されたよう
なアミノ酸−次構造に人工的な変異を有するものの両者
を意味する。

まず、ウロキナーゼ前駆体をコードする遺伝子を含むプ
ラスミドで形質転換された菌体宿主を培養してウロキナ
ーゼ前駆体を内部に有する菌体を取得する。ウロキナー
ゼ前駆体をコードする遺伝子や当該遺伝子を含むプラス
ミド等は前記したような公報の記載を参照して行えばよ
く、特別の条件等はない。宿主は、ウロキナーゼ前駆体
を菌体内部に不溶性の活性を発現し得ない（例えプラス
ミン等の蛋白質分解酵素で処理しても、プラスミノーゲ
ン活性化能を有するウロキナーゼに変換されない）高次
構造に折り畳まれた凝集塊として蓄積するものである。

この菌体の培養条件等についても本発明では特別の制限
はない。

取得された菌体を破砕する操作やその際に使用する溶液
（破砕溶液）についても特別の制限はないが、破砕操作
は例えばホモジナイズ、超音波処理等の物理的手法によ
り行うことが好ましい。

薬品の添加により破砕を行うと、後にこの薬品を除去す
る必要が生じるためである。ここで使用する適当な溶液
は、ウロキナーゼ前駆体の一次構造等を変化させない程
度にｐＨ等を調整された緩衝液等を使用すれば良い。例
えばＴｒＩｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ７−９）やリン酸緩
衝液（ｐＨ７−９）が例示出来る。

以上の操作により取得される溶液は、不溶性のウロキナ
ーゼ前駆体と菌体に由来する、核酸、細胞壁多糖類、脂
質又は蛋白質等の大量の夾雑物を含む溶液である。この
溶液について、ウロキナーゼ前駆体の可溶化・活性化処
理を実施する。可溶化・活性化処理は、例えば特開昭５
９−１６１３２１号公報や特開昭６０−５００８９３号
公報等に詳細に記載されているが、本発明においても同
様に実施すれば良い。即ち、グアニジン塩酸塩等の強力
な蛋白質変性剤を使用して活性を発現し得ない高次構造
に折り畳まれているウロキナーゼ前駆体を変性させ、可
溶化し、後に変性剤濃度を低下させて活性を発現し得る
高次構造に折り畳むことで活性化させたり、溶液のｐＨ
をアルカリ性にしてウロキナーゼ前駆体を変性させ、可
溶化し、後にｐＨを中性付近に戻して活性化させても良
い。この操作により、可溶化・活性化されたウロキナー
ゼ前駆体と夾雑物を含む溶液が取得される。

これらの操作の後、本発明においては前記溶液に有機酸
及び／又は鉱酸を添加してそのｐＨを低下させる。鉱酸
としては例えば塩酸や硫酸等が例示でき、有機酸として
は例えば酢酸や蟻酸等が例示出来る。これらは単独で使
用しても良いし、二以上を混合して使用しても良い。そ
の添加量は、可溶化・活性化されたウロキナーゼ前駆体
と夾雑物を含む溶液のｐ）ｌがｐＨ２−５の範囲となる
量である。なお、このｐＨの範囲ではウロキナーゼ前駆
体は安定に存在する。ｐＨを低下させればさせるほど、
変性され、沈殿を生じる夾雑物の量が多くなるため、可
能な限りｐ）Ｉ　２付近まで溶液のｐＨを低下させると
良い。

有機酸及び／又は鉱酸の添加を、少量の塩類が溶液中に
存在した条件下で実施すると、夾雑物の変性・沈殿が更
に良好となる。塩類としてはＮａＣ１、硫安、リュウ酸
ナトリウム等を使用すれば良く、その添加量は予備的実
験を行って決定すと良い。本発明者らの経験では、ウロ
キナーゼ前駆体量が７００１Ｕ／ｍｌであり、比活性が
１００ＯＯＩＵ／ｍｌ程度の溶液に対し、そのｐＨをｐ
ｔ＋　４に低下させた場合には重量／体積（Ｖ／Ｖ）で
５％程度の硫安の添加が効果的であった。なお、この塩
類の添加は、ｐ）ｌの低下に先立って行っても、それと
同時に行っても、又はｐＨを低下させた後に行っても良
い。

以上の操作により、可溶化・活性化処理を終了した段階
で取得された、可溶化・活性化されたウロキナーゼ前駆
体と夾雑物を含む溶液中の夾雑物の大部分は沈殿を生し
る。従って、この沈殿を溶液から除去することで、更な
る純化作業に供するのに好適なウロキナーゼ前駆体溶液
を取得することが出来る。沈殿の除去作業は、例えば限
外濾過膜を使用して行っても良いし、上清を選択的に回
収することで行っても良い。

この様な回収された溶液について、更にゲル濾過クロマ
トグラフィーやイオン交換クロマトグラフィー等の操作
を行うことに本発明では制限がないが、なかでも、本発
明の操作を実施した後の溶液はｐＨが低く、好ましく塩
類を添加した場合には塩濃度も高いから、疎水クロマト
グラフィーを実施することが好ましい。

（発明の効果） 本発明により取得された純化されたウロキナーゼ前駆体
含有溶液は、−菌体に由来する夾雑物の大部分が除去さ
れているから、例えば液体クロマトグラフィー法等によ
る更なる高純度化のための作業に直接供することが可能
である。しがちその場合には、ゲルの劣化等や、性質の
不明な夾雑物がゲルに吸着して精製の度合いが変化する
といった現象を防止することが可能となる。

本発明は、可溶化・活性化処理の後に当該処理により取
得された溶液について有機酸及び／又は鉱酸を添加して
そのｐＨを低下させ、生じた沈殿を除去するという簡便
な操作により実施することが可能であり、しかも、従来
の塩析法や有機溶媒を使用する方法において課題であっ
た発泡、発熱等を生じることはない。このため、本発明
の方法によれば、高純度のウロキナーゼ前駆体を遺伝子
操作の手法により菌体を宿主として製造する場合の一連
の操作を円滑に完了することが可能となるのである。

以上のように本発明の方法は、遺伝子操作の手法により
ウロキナーゼ前駆体を製造するにおいて、より高純度の
製造物を取得するために好適な標品を提供するものであ
る。

（実施例） 以下、本発明を更に詳細に説明するために実施例を記載
するが、これら実施例は本発明の一例であり、本発明を
限定するものではない。

なお、本実施例においては、ウロキナーゼ前駆体の量等
をその活性（ＩＵ）により示しているが、ウロキナーゼ
前駆体自体は活性を有していないため、−旦蛋白質分解
酵素であるプラスミンによりこれをウロキナーゼに変換
した後、ウロキナーゼの特異的基質であるＰｙｒＧＩｙ
Ａｒｇ−ｐＮＡ　　（Ｓ−２４４４゜第−化学薬品（株
）製、Ｐｙｒはピログルタミル基を表す）を用いてその
活性を測定し、市販のウロキナーゼ（ミドリ十字（株）
製）と比較して決定した。また、蛋白質濃度は２８０ｎ
ｍでの吸光度を測定して決定し、ウロキナーゼ前駆体の
純度は単位蛋白質量当たりのウロキナーゼ活性で示した
。

実施例　１゜ １３５位及び１５７位のアミノ酸残基がそれぞれリジン
、フェニルアラニンに変換されたウロキナーゼ前駆体を
コードする遺伝子を含むプラスミド（特開昭６２−１４
ＨＩｉ８号）で大腸菌（ＫＹ１４３Ｂ株）を形質転換し
、３０’Ｃ条件下、グリセリンとカゼインの分解物を含
むＭ９培地で培養してウロキナーゼ前駆体を発現させた
結果、ウロキナーゼ前駆体は菌体内部に蓄積された。

湿重ｆｆ１１ｇの菌体を、Ｔｒｌｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８
）溶液中でホモジナイズして破砕し、続いて２Ｍ尿素水
溶液で可溶化処理を行った。可溶化処理後の溶液につい
て、５％トリエチレンテトラミンを添加してそのｐ）ｌ
をｐＨＩＩとし、更に濃塩酸加してｐＨをｐＨ９として
活性化処理を行った。この溶液は、大腸菌に由来する夾
雑物を多量に含有しているため、乳白色を呈していた。

このウロキナーゼ前駆体を含有する溶液について活性を
測定したところ、７００１Ｌｌ／■１であり、比活性（
溶液中の蛋白質当たりの活性）は９５０！Ｌｌ／ｓｇで
あった。

以上の操作で得られた、ウロキナーゼ前駆体及び夾雑物
を含む可溶化・活性化処理後溶液に対し、濃塩酸を滴下
してそのｐＨをｐＨ２に調整した。

溶液を室温にて１時間放置した後、生じた沈殿を除去す
るため濾過を行い、溶液画分を取得した。

取得された溶液は、無職透明の溶液であった。

得られた溶液中のつａキナーゼ活性は５７５＋１１１１
であり、もとの溶液中の活性の約８２％が回収された。

比活性を測定したところ、５２０ＯＩＵ／ｍｇであり、
もとの溶液の値に対して約４倍となっていた。比活性は
溶液中の全蛋白質量で溶液のウロキナーゼ活性を割った
値であり、その値が高いほどウロキナーゼ前駆体の純度
が高いことを意味している。従って、得られた溶液のウ
ロキナーゼ前駆体純度はもとの溶液に比較して約４倍に
上昇したことになる。

実施例　２゜ 実施例１で取得した菌体について、活性化処理の後に濃
塩酸を添加して溶液のｐＨをｐＨ４に調整した以外は実
施例１と同様の操作を行った。なお、活性化処理後の溶
液中のウロキナーゼ活性及び比活性は実施例１と同様で
あった。

得られた溶液中のウロキナーゼ活性は８３０１０／■１
であり、もとの溶液中の活性の９０％が回収された。比
活性を測定したところ、３８０ＯＩＵ／ｍｇであり、も
との溶液の値に対して約３倍に上昇していた。

実施例　３゜ 実施例１で取得した菌体について、活性化処理の後にｍ
塩酸を添加して溶液のｐＨをｐＨ５に調整した以外は実
施例１と同様の操作を行った。なお、活性化処理後の溶
液中のウロキナーゼ活性及び比活性は実施例１と同様で
あった。

得られた溶液中のウロキナーゼ活性は６８０１Ｌｌ／■
１であり、もとの溶液中の活性の９４％が回収された。

比活性を測定したところ、２４００１Ｕ／■ｇであり、
もとの溶液の値に対して約２．５倍に上昇していた。

実施例　４゜ 実施例１で取得した菌体のうち、乾燥重量で２ｇの菌体
をＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨｇ）溶液中でホモジナイズ
して破砕した後、４００　ｍｌの４Ｍグアニジン塩酸塩
溶液を添加してウロキナーゼ前駆体を可溶化処理し、還
元剤としてグルタチオンを０．２ｉｏ１／ｌ　となるよ
うに添加した。続いて溶液のｐＨをｐｌ＋８に保ったま
ま、同緩衝液（ｐ）１ｇ）を添加してグアニジン塩酸塩
濃度を４倍に希釈して活性化処理を行った。

この溶液は、大腸菌に由来する夾雑物を多量に含有して
いるため、乳白色を呈していた。このウロキナーゼ前駆
体を含有する溶液について活性を測定したところ、７２
０１Ｕ／ｓｌであり、比活性（溶液中の蛋白質当たりの
活性）は１００ＯＩＵ／−ｇであった。

以上の操作で得られた、ウロキナーゼ前駆体及び夾雑物
を含む可溶化・活性化処理後溶液に対し、１５ｇの硫安
を添加した後に濃塩酸を添加し、そのｐ）ＩをｐＨ４に
調整した。溶液を室温にて１時間放置した後、上清を取
得した。取得された溶液は、無職透明の溶液であった。

得られた溶液中のウロキナーゼ活性は５９０１Ｌｌ／−
１であり、もとの溶液中の活性の約８２％が回収された
。比活性を測定したところ、４０００１１１／ｍｇであ
り、もとの溶液の値に対して約４倍となっていた。なお
、沈殿を乾燥させてその重量を測定したところ、約１ｇ
であった。

比較例　１゜ 実施例１で取得した菌体について、活性化処理の後の溶
液３００１に対し１５ｇの硫安を添加し、室温で１時間
放置した以外は実施例４と同様の操作を行った。なお、
活性化処理後の溶液中のウロキナーゼ活性及び比活性は
実施例４と同様であった。

得られた溶液中のウロキナーゼ活性はもとの溶液と同様
であり、この溶液は見た目にも乳白色を呈していた。除
去された沈殿を乾燥させてその重量を測定したところ約
０．２ｇであり、実施例４の結果と比較すると２０％で
しかなかった。

即ち、同量の塩類（硫安）を添加したとしても、酸処理
を実施しない場合には純度の高いウロキナーゼ前駆体含
有溶液が取得されないことが分かる。

比較例　２゜ 実施例１で取得した菌体について、活性化処理の後の溶
液３００１に対し５０ｇの硫安を添加し、室温で１時間
放置した以外は比較例１と同様の操作を行った。なお、
活性化処理後の溶液中のウロキナーゼ活性及び比活性は
実施例４と同様であった。

得られた溶液の比活性は４０００１Ｕ／Ｉ１ｇてあり、
もとの溶液の約３．３倍であった。この溶液は透明であ
った。

本比較例の結果は、従来から公知である塩析法により本
発明と同等の結果（実施例４参照）を得ようとする場合
には、およそ３倍の塩類（硫安）を使用する必要がある
ことを示している。

特許出願人　　　東ソー株式会社

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ウロキナーゼ前駆体をコードする遺伝子を含むプ
   ラスミドで形質転換された菌体宿主を培養して当該蛋白
   質を内部に有する菌体を取得し、該菌体を適当な溶液中
   で破砕して不溶性のウロキナーゼ前駆体を含む溶液を取
   得し、当該溶液について可溶化・活性化処理を施して活
   性を発現し得る可溶性ウロキナーゼを含む溶液を取得し
   、次いで可溶性ウロキナーゼを含む溶液に有機酸及び／
   又は鉱酸を添加してそのｐＨを低下させ、生じた沈殿を
   溶液から除去することからなる純化されたウロキナーゼ
   前駆体含有溶液の取得方法。
2. （２）活性を発現し得る可溶性ウロキナーゼを含む溶液
   中に塩類を共存させた条件下でｐＨを低下させる操作行
   うことを特徴とする請求項第１項に記載の方法。