DE69004101T2

DE69004101T2 - Verfahren zur kristallisation von enzymen.

Info

Publication number: DE69004101T2
Application number: DE91902671T
Authority: DE
Inventors: Niels-Viktor Nielsen; Torben Kjaersgaard Nielsen
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1989-12-21
Filing date: 1990-12-21
Publication date: 1994-03-24
Anticipated expiration: 2010-12-22
Also published as: JP2975109B2; DE69004101D1; ATE96167T1; JPH05502791A; WO1991009943A1; DK0506866T3; EP0506866A1; EP0506866B1; ES2060360T3

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kristallisation von Enzymen.
Enzyme werden für industrielle Zwecke üblicherweise als Flüssigkeiten oder feste Materialien bereitgestellt. Wenn nicht als Flüssigkeiten bereitgestellt, werden sie üblicherweise als amorphe Materialien bereitgestellt, weil die bekannten Verfahren zur Kristallisation von Enzymen üblicherweise als zu kostspielig angesehen werden, um in einem industriellen Maßstab eingesetzt zu werden.
Somit ist der Zweck der Erfindung die Bereitstellung eines Verfahrens zur Kristallisation von Enzymen, das einfach und preiswert ist und das an industrielle Anforderungen kompatibel ist.
Das Verfahren gemäß der Erfindung ist gekennzeichnet durch die Tatsache, daß eine wäßrige, enzymhaltige Flüssigkeit mit einer Enzymreinheit über 20 % (d.h. das reine Enzym beläuft sich auf mehr als 20 % der Gesamttrockensubstanz in der enzymhaltigen Flüssigkeit) und mit einer Konzentration von reinem Enzymprotein von wenigstens 5 g/l enzymhaltige Flüssigkeit, als ein Ausgangsmaterial verwendet wird und daß ein Kristallisationsmittel, welches Na-, K-, Ca- oder Mg-Formiat, -Acetat oder -Nitrat ist, zum Ausgangsmaterial bis zu einer Endkonzentration zugegeben wird, die geringer ist als die Konzentration, die benötigt wird, um die Enzyme in einer amorphen Form auszufällen
Wenn durchgeführt in einem industriellen Maßstab, werden die Kristalle in einem Filter abgetrennt und die Kristalle werden anschließend zu Reinigungszwecken gespült. Bezug wird genommen auf Fig. 1.
Alle Kristallisationsmittel, die im Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden, sind leicht lösliche Salze, d.h. Salze, die in reinem Wasser bei 25ºC eine Löslichkeit über 5 g/l zeigen.
Die oben angegebenen Ausgangsmaterialien sind in der Technik bekannt und sie können zum Beispiel bereitgestellt werden, wie in Kapitel 9 ("Production of Microbial Enzymes") in Microbial Technology, 2nd edition, Vol. 1, Academic Press, Inc., 1979, beschrieben; und somit kann ein Überblick über Gewinnungs- und Reinigungsverfahren für Enzyme technischer Qualität in diesem Kapitel gefunden werden. Außerdem beschreibt US-Patent No. 3,795,583 Reinigungsverfahren für enzymhaltige Kulturbrühen.
Überraschenderweise ist festgestellt worden, daß das Verfahren gemäß der Erfindung, das einfach und preiswert ist, mit einer Ausbeute von bis zu 95 % durchgeführt werden kann und daß es leicht an industrielle Praxis angepaßt werden kann.
So ist das Ausgangsmaterial für das Verfahren gemäß der Erfindung zur Kristallisation von Enzymen eine wäßrige, enzymhaltige Flüssigkeit mit einer Enzymreinheit von über 20 % (d.h. das reine Enzym beläuft sich auf mehr als 20 % der Gesamttrockensubstanz in der enzymhaltigen Flüssigkeit) und mit einer Konzentration von Enzymprotein von wenigstens 5 g/l enzymhaltige Flüssigkeit. Die zur Kristallisation notwendige Zeit liegt üblicherweise zwischen 5 und 12 Stunden. Durch Zugabe von Kristallkeimen in einer Menge von z.B. 1 % kann die Kristallisationsgeschwindigkeit beschleunigt werden. Die Kristalle werden vorzugsweise aus dem Überstand durch Filtration abgetrennt.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung wird das Kristallisationsmittel zum Ausgangsmaterial bis zu einer Endkonzentration zugegeben, die einer zugesetzten Menge an Kristallisationsmittel von 0,02 bis 1,7M an Kristallisationsmittel entspricht, vorzugsweise von 0,05 bis 1,6M, bevorzugter von 0,10 bis 1,5M.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung ist das Enzym eine Protease, Lipase, Amylase, Cellulase, Hemicellulase, Pektinase, Anidase oder Oxidase. Diese Enzyme werden üblicherweise als Zusatzstoffe in Waschmitteln verwendet, und so ist diese Ausführungsform bevorzugt, wenn kristalline Enzyme in der Waschmittelindustrie wünschenswert sind. Auch proteintechnologische Varianten dieser Enzyme liegen innerhalb des Umfangs der Erfindung.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung ist das Enzym eine Protease und die Protease ist eine Protease vom Subtilisin-Typ, vorzugsweise Savinase oder eine proteintechnologische Variante von Savinase oder Alcalase . Andere Beispiele solcher Protease sind Alcalase , Subtilisin NOVO oder proteintechnologische Varianten derselben, die sehr häufig als Zusatzstoffe in Waschmitteln verwendet werden, und so ist diese Ausführungsform bevorzugt wenn kristalline Savinase , Esperase , Alcalase , Subtilisin NOVO oder proteintechnologische Varianten derselben in der Waschmittelindustrie wünschenswert sind.
DK-Patent Anmeldung No. 872/86 beschreibt ein Verfahren zur Kristallisation einer enzymhaltigen Lösung, bei dem eine übersättigte Lösung bei einem pH nahe dem isoelektrischen Punkt des Enzyms kristallisiert wird.
US 4,699,882 beschreibt ein Kristallisationsverfahren, das spezifisch auf Glucose-Isomerase gerichtet ist. Die verwendeten Kristallisationsmittel sind Magnesiumsulfat und Ammoniumsulfat.
WO89/08703 beschreibt ein Subtilisin-Kristallisationsverfahren, das als einen zwingenden Schritt ein Kristallisationsmittel verwendet, das ein Halogenidsalz ist, und das in befriedigender Weise nur unter etwa 10ºC durchgeführt werden kann.
Somit unterscheiden sich diese Verfahren nach dem Stand der Technik wesentlich von dem Verfahren gemäß der Erfindung.

BEISPIELE 1 - 4

Das Ausgangsmaterial für die Kristallisation von Savinase -Kristallen wird in der folgenden Art und Weise hergestellt.
Zu 1 kg Savinase -Fermentationsbrühe (US-Patent No. 3,723,250) werden 7,5 g CaCl&sub2;.2H&sub2;O und 1 Liter Wasser zugegeben. Der pH wird mit einer wäßrigen Natriumhydroxidlösung auf 8,0 eingestellt. Die Suspension wird dann durch Zugabe von Flockungsmittel Superfloc C 521 (etwa 15 g/Liter Brühe) und Flockungsmittel Superfloc A 130 (etwa 0,2 g/Liter Brühe) zur Ausflockung gebracht. Die ausgeflockte Suspension wird zentrifugiert und der Überstand wird auf einem geeigneten Filterblatt filtriert, um eine klare Flüssigkeit zu erhalten. Das Filtrat wird durch Eindampfen auf einen RI(Brechungsindex)-Wert von 12 % konzentriert und dann auf etwa 38ºC erwärmt. Bei dieser Temperatur wird schrittweise Natriumsulfat (250 g/kg Enzymlösung) unter schnellem Mischen zur Lösung zugegeben.
Der Niederschlag wird abfiltriert und in kaltem (< 5ºC) Wasser (3-5 Liter Wasser/kg Filterkuchen) erneut aufgeschlämmt. Das nicht-gelöste Material wird durch Filtration entfernt und das klare Filtrat wird ultra- und diafiltriert bis zu einem Punkt, wo der RI(Refraktometerindex)-Wert Trockensubstanz im Permeat niedriger als 0,5 % ist und der RT-Wert der Trockensubstanz im Konzentrat zwischen 10-16 % ist. Die proteolytische Aktivität beträgt 8-22 KNPU/g.
Das resultierende Konzentrat zeigt einen Gehalt an reiner Savinase -Protease auf Trockensubstanzbasis über 25 Gew.-%.
Zum Ausgangsmaterial, d.h. dem oben angegebenen Konzentrat, werden 7 % Calciumformiat (0,54 M zugesetzt), das als ein Ausfällungsmittel dient, bei 20-25ºC und einem pH-Wert von etwa 5,0 zugegeben. Die Mischung wird mit Savinase -Kristallen (etwa 1 Gew.-%) beimpft und dann vorsichtigt bewegt, und nach 3-6 Stunden kann ein kräftiger Niederschlag von kristalliner Savinase beobachtet werden. Die Menge des Kristallschlamms beträgt etwa 20 % des Gesamtvolumens und zeigt eine Enzymaktivität von etwa 86 KNPU/g. Die Ausfällungsausbeute auf der Basis von KNPU beträgt etwa 81 %.
Die folgenden Beispiele 2-4 wurden mit demselben Savinase -Konzentrat, demselben Beimpfungsverfahren, derselben Temperatur (20-24ºC) und demselben pH (5,0) durchgeführt. Alle erzeugten Kristallschlämme hatten eine Aktivität von etwa 80 KNPU/g.
Die variablen Parameter in den Beispielen 2-4 sind aus der folgenden Tabelle zu erkennen. Tabelle 1 Beispiel Nr. Ausfällungsmittel Konzentration an zugegebenem Ausfällungsmittel % Schlamm % Ausbeute

BEISPIELE 5 - 69

Es ist festgestellt worden, daß der Kristallisationsprozeß abhängig ist von den folgenden Parametern:
pH: mit ansteigendem pH nimmt die Kristallgröße ab und die Kristallisationsgeschwindigkeit nimmt zu.
Salzkonzentration: mit ansteigender Salzkonzentration steigt die Kristallisationsausbeute, die Kristallisationsgeschwindigkeit nimmt zu und die Kristallgröße nimmt ab.
Salzart: das Kristallisationsverhalten variiert von Salz zu Salz.
Temperatur: mit ansteigender Temperatur nimmt die Kristallisationsgeschwindigkeit zu und die Kristallgröße nimmt ab.
Enzymkonzentration: mit steigender Enzymkonzentration nimmt die Kristallisationsgeschwindigkeit zu, die Kristallisationsausbeute steigt und die Kristallgröße nimmt ab.
Enzymreinheit: mit zunehmender Enzymreinheit nimmt die Kristallisationsgeschwindigkeit zu und die Kristallisationsausbeute steigt.
Die folgenden Beispiele 5-18, die die oben angegebene pH-Abhängigkeit und die Salzkonzentrations-Abhängigkeit veranschaulichen, wurden mit einem Savinase -Konzentrat durchgeführt, das nach dem in den Beispielen 1-4 erwähnten Verfahren hergestellt ist. Die Temperatur wurde bei 20-25ºC gehalten und die Enzymkonzentration betrug etwa 55 g/l. Das Kristallisationsmittel war Kaliumacetat. Die Enzymreinheit betrug etwa 35 %. Beispiel Nr. Zugegebene Mol Kaliumacetat/l Kristallisationsbeginn, Kommentar keine Kristallisation Kristalle Beispiel Nr. Zugegebene Mol Kaliumacetat/l Kristallisationsbeginn, Kommentar keine Kristallisation Kristalle amorphe Fragmente
Bezug wird genommen auf Fig. 2, die das Kristallisationsverhalten (Savinase ) als eine Funktion der Enzymreinheit zeigt. Fig. 2 zeigt, daß die Kristallisationsgeschwindigkeit und die Kristallisationsausbeute mit zunehmender Enzymreinheit steigen.
Die folgenden Beispiele 19-25, die das Kristallisationsverhalten als eine Funktion der Enzymkonzentration zeigen, wurden bei 20-25ºC, mit 0,8 Mol zugegebenem Kaliumacetat/l und bei pH 4,9 durchgeführt. Die Enzymreinheit betragt etwa 38 % (TS-Basis). Die Savinase -Proben werden aus verschiedenen Stufen in der abschließenden Ultrafiltration im in den Beispielen 1-4 erwähnten Aufbereitungsverfahren genommen, entsprechend den Werten in der Spalte "g Enzym/l". Beispiel Nr. g Enzym/l Kristallisationsbeginn Ausbeute
Die folgenden Beispiele 26-29, die das Kristallisationsverhalten als eine Funktion der Enzymtemperatur zeigen, werden mit 0,51 Mol zugegebenem Kaliumacetat/l, pH 5,5 und eine Enzymkonzentration bei etwa 55 g/l durchgeführt. Die Enzymreinheit beträgt etwa 36 % (TS-Basis). Maximale Kristallisationszeit: 12 Stunden. Beispiel Nr. Temperatur Kristallisationsbeginn Ausbeute Stunden
Die folgenden Beispiele 30-69 zeigen, daß das Kristallisationsverfahren ohne weiteres mit anderen Subtilisinen, wie etwa Alcalase oder Durazym , verwendet werden kann.
Das Ausgangsmaterial für die Kristallisation wird mit einem Aufbereitungsverfahren hergestellt, das zu den in den Beispielen 1 - 4 angegebenen sehr ähnlich ist.
Im Falle von Alcalase werden während des Ausflockungsschrittes neben CaCl&sub2; etwa 4 g NaAlO&sub2; pro 1 Fermentationsbrühe zugegeben. Das Produkt wird auf eine proteolytische Aktivität bei etwa 3,5 AU/g hinauslaufen.
Durazym , das eine proteintechnologische Version von Savinase ist, wird analog zur Kristallisation von Savinase in den Beispielen 1 - 4 hergestellt. Das Produkt wird auf eine proteolytische Aktivität bei etwa 19 DPU/g hinauslaufen.
Vor der Kristallisation haben beide Enzyme eine Enzymreinheit von über 25 %, gemessen auf Trockensubstanzbasis.
In den folgenden Beispielen 30-34 ist das Enzym Alcalase und der pH während der Kristallisation ist 4,5-8,5, die Temperatur liegt zwischen 20 und 25ºC, das Kristallisationsmittel ist Natriumformiat, das in einer Konzentration von 1,5 M/l zugegeben wird, die Enzymkonzentration beträgt etwa 66 g/l und die Enzymreinheit beträgt 50 %. Beispiel Nr. Kristallisationsbeginn Ausbeute Stunde
In den folgenden Beispielen, in denen Alcalase und verschiedene Kristallisationsmittel verwendet werden, liegt der pH während der Kristallisation zwischen 4,5 und 5,0, die Temperatur liegt zwischen 20 und 25ºC, die Kristallisationszeit liegt zwischen 6 und 24 Stunden, die Enzymkonzentration beträgt etwa 66 g/l und die Enzymreinheit beträgt 50%. Enzym: Alcalase Beispiel Nr. Salz M zugegebenes Salz/l Ausbeute
In den folgenden Beispielen, die mit Alcalase und mit Kristallisation mit Natriumformiat bei verschiedenen Enzymkonzentrationen durchgeführt werden, liegt der pH während der Kristallisation zwischen 4,5 und 5,0, die Temperatur liegt zwischen 20 und 25ºC, die Kristallisationszeit beträgt 12 Stunden (bei 20 bis 25ºC) plus 12 Stunden bei 10ºC. Die Enzymkonzentration beträgt etwa 66 g/l, die Enzymreinheit beträgt 50 % und das Salz wird in einer Dosierung von 1,5 Mol/l zugegeben. Beispiel Nr. g Enzym/l Kristallisationsbeginn Ausbeute Stunden Stunde
Die folgenden Beispiele mit Alcalase , die das Kristallisationsverhalten als eine Funktion von Temperaturen veranschaulichen, werden durchgeführt bei pH 4,5 und einer Temperatur zwischen 5 und 30ºC. Das Natriumformiat wird in einer Menge von 1,5 Mol/l zugegeben. Die Enzymkonzentration beträgt etwa 66 g/l und die Enzymreinheit beträgt 50 %. Die Kristallisationszeit beträgt 12 Stunden bei der spezifizierten Temperatur plus 12 Stunden bei 10ºC. Beispiel Nr. Temperatur Kristallisationsbeginn Ausbeute Stunden Stunde
Die folgenden Beispiele, die das Kristallisationsverhalten von Alcalase als eine Funktion der Enzymtemperatur veranschaulichen, werden durchgeführt bei pH 5,0 und bei einer Temperatur zwischen 15 und 30ºC. Die Dosierung von Calciumformiat beträgt zugegebene 0,8 Mol/l. Die Enzymkonzentration beträgt etwa 63 g/l und die Reinheit beträgt 50 %.
Die Kristallisationszeit beträgt 12 Stunden (bei der spezifizierten Temperatur) plus 12 Stunden bei 10ºC. Beispiel Nr. Temperatur Kristallisationsbeginn Ausbeute/Kristallgröße Stunden Stunde
In den folgenden Beispielen, die die Kristallisation von Alcalase bei verschiedenen pH-Werten veranschaulichen, wird der pH von 4,5 bis 8,5 variiert, die Temperatur liegt zwischen 20 und 25ºC, die Salzdosierung beträgt zugegebene 0,8 Mol/l, die Enzymkonzentration beträgt etwa 66 g/l und die Enzymreinheit beträgt 50 %. Salz: Kaliumacetat. Beispiel Nr. Kristallisationsbeginn Ausbeute/Kristallgröße Stunden Stunde *)Die Kristalle sind sehr klein und daher schwer von der Mutterlauge abzutrennen
Die folgenden Beispiele mit Durazym , die Kristallisation mit verschiedenen Kristallisationsmittel zeigen, werden durchgeführt bei pH 4,9 und einer Temperatur zwischen 20 und 25ºC. Die Enzymkonzentration beträgt etwa 48 g/l und die Enzymreinheit beträgt etwa 30 %. Enzym: Durazym Beispiel Nr. Salz zugegebene M Salz/l Ausbeute

BEISPIEL 69

Kristallisation von Candida-Lipase B

Candida-Lipase B ist beschrieben in WO88/02775, aus der deutlich wird, daß diese Lipase mit Hilfe von Candida antarctica DM5 3855 hergestellt werden kann.
Nach Fermentation wird die Kulturbrühe durch Zugabe von 0,25 l Wasser pro Liter Kulturbrühe vorbehandelt. Der pH wird mit Hilfe einer wäßrigen NaOH-Lösung auf 8,0 eingestellt. Die Suspension wird auf einem Trommelfilter filtriert, der mit Kieselgur Dicalite 4208 vorbeschichtet ist. Das Filtrat wird an schließend auf geeigneten Filterplatten filtriert, um eine vollständig klare Flüssigkeit zu erhalten. Schließlich wird eine Ultrafiltration und eine Diafiltration durchgeführt, bis zu einem RI(Refraktormeterindex)-Wert Trockensubstanz im Konzentrat von ungefähr 12 % und bis der RT-Wert Trockensubstanz in Permeat weniger als 2 % ist. Schließlich wird eine sterile Filtration durchgeführt. Dieses Filtrat, das eine Lipaseaktivität von etwa 25 KLU/g und einen pH von 7,0 zeigt, ist das Ausgangsmaterial für die Kristallisation. Zum Ausgangsmaterial werden 4-6 % Salz zugegeben, welches CH&sub3;COOK(KAc) oder HCOONa ist. Nach ein paar Minuten wird ein kräftiger Niederschlag von kristalliner Candida-Lipase B gebildet und 2-5 Stunden später beläuft sich der kristalline Niederschlag auf etwa 20 % des Gesamtvolumens. Die Kristalle zeigen eine Aktivität von 65-70 KLU/g und die Ausbeute übersteigt 80 %. Die Kristalle sind klein und nadelförmig.

Claims

1. Verfahren zur Kristallisation von Enzymen, gekennzeichnet durch die Tatsache, daß eine wäßrige, enzymhaltige Flüssigkeit mit einer Enzymreinheit über 20 % (d.h. das reine Enzym beläuft sich auf mehr als 20 % der Gesamttrockensubstanz in der enzymhaltigen Flüssigkeit) und mit einer Konzentration von reinem Enzymprotein von wenigstens 5 g/l enzymhaltige Flüssigkeit als ein Ausgangsmaterial verwendet wird und daß ein Kristallisationsmittel, welches Na-, K-, Ca- oder Mg- Formiat, -Acetat oder -Nitrat ist, zum Ausgangsmaterial bis zu einer Endkonzentration zugegeben wird, die geringer ist als die Konzentration, die benötigt wird, um die Enzyme in einer amorphen Form auszufällen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Kristallisationsmittel zum Ausgangsmaterial bis zu einer Endkonzentration zugegeben wird, die einer zugegebenen Menge an Kristallisationsmittel von 0,02 bis 1,7M Kristallisationsmittel entspricht, vorzugsweise von 0,05 bis 1,6M, bevorzugter von 0,10 bis 1,5M.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch die Tatsache, daß das Enzym eine Protease, Lipase, Amylase, Cellulase, Hemicellulase, Pektinase, Amidase oder Oxidase ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, gekennzeichnet durch die Tatsache, daß das Enzym eine Protease ist und daß die Protease eine Protease vom Subtilisin-Typ ist, vorzugsweise Savinase oder eine proteintechnologische Variante von Savinase , oder Alcalase .