JP5164300B2 - HER−2/neu融合タンパク質 - Google Patents
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Description
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照として本明細書に組入れられている、1999年1月29日に出願された米国仮特許出願第60/117,976号に対して優先権を主張するものである。
【0002】
政府支援の研究開発の下で行われた発明の権利に関する陳述
適用なし。
【0003】
発明の技術分野
本発明は概して、HER-2/neu融合タンパク質、HER-2/neu融合タンパク質をコードしている核酸分子、HER-2/neu融合タンパク質を発現しているウイルスベクター、ならびにHER-2/neu融合タンパク質及び/又はHER-2/neu融合タンパク質をコードしている核酸分子を含有している薬学的組成物(例えばワクチン)に関する。本発明は更に、HER-2/neu癌遺伝子に関連した悪性疾患の治療における使用を含む、HER-2/neuタンパク質に対する免疫応答を誘発又は増強することによる癌の治療又は予防の方法に関する。
【0004】
発明の背景
多大な経済的及び人的資源の投資にもかかわらず、癌は、依然主要死因のひとつである。例えば、癌は、年齢35〜74歳の女性において第一の死因である。乳癌が、女性における最も一般的な悪性疾患であり、かつ乳癌発症率は上昇している。女性9名中1名が本疾患と診断されると推定される。乳癌治療の標準的方法は、手術、放射線療法、及び化学療法の併用に集中している。これらの方法は、特定の悪性疾患においては一部劇的な成功を収めている。しかし、乳癌は、ある病期を過ぎて診断されると、多くの場合治癒できない。早期診断及び治療のための代替法が必要とされている。
【0005】
悪性疾患の一般的な特徴は、制御できない細胞増殖である。癌細胞は、正常な表現型から自律的増殖可能な悪性の表現型への形質転換の過程を受けるように見える。体細胞遺伝子の増幅及び過剰発現は、正常細胞から悪性細胞への形質転換を生じる共通の第一の事象であるとみなされる。腫瘍原性遺伝子によりコードされた悪性表現型の特徴は、細胞***時に形質転換された細胞の子孫へと継代される。
【0006】
悪性細胞において機能しかつ形質転換に寄与又は関連する少なくとも40種の癌遺伝子が、同定されている。これらの癌遺伝子は、該癌遺伝子により発現されたタンパク質のような、それらの遺伝子産物の推定機能又は局在位置を基に様々な群に分類されている。
【0007】
癌遺伝子は、正常細胞の生理の特定の局面に必須であると考えられている。これに関して、HER-2/neu癌遺伝子は、受容体様糖タンパク質のチロシンキナーゼファミリーの一員であり、上皮成長因子受容体(EGFR)と高度の同一性を共有しているように見える。HER-2/neuは恐らく、細胞増殖及び/又は分化において役割を果たしていると考えられる。HER-2/neuは、本質的に正常な遺伝子産物の増大した又は規制解除された発現によって生じた量的機構を通じて悪性疾患を誘導するように見える。
【0008】
p185糖タンパク質は、HER-2/neu癌遺伝子のタンパク質産物である。乳癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌、及び前立腺癌を含む様々な癌において、HER-2/neu遺伝子は増幅され、かつp185が過剰発現される。p185は、悪性の形質転換に関連しており、かつ浸潤性乳管癌腫(ductal in situ carcinomas)の50〜60%において、侵襲性乳癌の20〜40%において、並びに卵巣、前立腺、結腸、及び肺に生じる腺癌の実質的画分において認められる。HER-2/neuの発現は、悪性表現型にのみ密に関連するのではなく、悪性疾患の攻撃性にも関連している。HER-2/neuの過剰発現は、乳癌及び卵巣癌の予後不良に関連している。
【0009】
p185は、長さ約1255個のアミノ酸の推定相対分子量185kDの膜貫通タンパク質である。p185は、EGERと少なくとも40%の同一性があり、高度に疎水性の膜貫通ドメインである、約645個のアミノ酸の細胞外ドメイン(ECD)と、EGFRと少なくとも80%の同一性を有する、約580個のアミノ酸のカルボキシル末端細胞内ドメイン(ICD)とを有する。
【0010】
HER-2/neu癌遺伝子に関連した悪性疾患を標的とすることができる抗癌ワクチン、並びにHER-2/neu遺伝子に対する免疫応答を誘発及び増強することができるような組成物及び方法が必要とされている。
【0011】
発明の概要
本発明は、HER-2/neu癌遺伝子が関連した悪性疾患に対する恒温動物の免疫感作を含む用途のための、HER-2/neu p185融合タンパク質、HER-2/neu融合タンパク質をコードしている核酸分子、及びHER-2/neu融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列を含むウイルスベクターを提供する。本発明の融合タンパク質又は核酸分子は、薬学的に許容される担体又は希釈剤を含有する組成物、例えば水中油型乳液の中に存在することができ、かつ任意に1種またはそれ以上の追加の有効成分、例えばSBAS-2、3D-MPL、QS2l、又は3D-MPL及びQS21の組合せのような免疫賦活物質を含有する。本発明の組成物は、ワクチンとして有用であり、かつワクチンの形態であることができる。前述の融合タンパク質、核酸分子、ウイルスベクター、薬学的組成物及び/又はワクチンは、1回ベース(one-time basis)(例えば、悪性疾患を獲得又は再獲得するリスクが上昇しているか、または悪性疾患が疑われる個体について)、または定期的なベース(periodic basis)(例えば、悪性疾患を獲得又は再獲得するリスクが上昇しているか、または悪性疾患が疑われる個体について)で投与することができる。本発明の化合物又は組成物は、ヒトを含む恒温動物における、1種またはそれ以上の存在する腫瘍の治療、又は腫瘍発生もしくは再発の予防において有用である。
【0012】
本発明は更に、前述の薬学的組成物又はワクチンを患者に投与することを含む、HER-2/neuタンパク質に対する免疫応答を誘発又は増強することによる、患者における癌の発生を阻害又は予防する方法を提供する。この場合の患者は、例えば乳癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌、又は前立腺癌に罹患しており、これらの症例において本方法は、該疾患の治療を提供するか、又はこのような疾患のリスクがあるとみなされた患者が予防的に治療することができる。ある態様において、この薬学的組成物又はワクチンの投与は、本発明の核酸分子を用いてエクスビボにおける恒温動物の細胞にトランスフェクションするか、又は本発明の核酸分子を含むウイルスベクターを用いてエクスビボにおける恒温動物の細胞に感染させて、その後トランスフェクション又は感染した細胞を恒温動物に送達する段階を含む。
【0013】
本発明は更に、その他の局面内で、生物試料を、HER-2/neu融合タンパク質と特異的に反応するT細胞と接触する段階を含む、生物試料から腫瘍細胞を除去する方法を提供し、ここで該接触段階は、試料からタンパク質を発現している細胞の除去をもたらす条件下でそれに十分な時間をかけて行われる。関連した局面において、患者に前述のように処理した生物試料を投与する段階を含む、患者において癌の発生を阻害する方法が提供される。
【0014】
別の態様において、HER-2/neu融合タンパク質に特異的なT細胞を刺激及び/又は拡張する方法は、T細胞と下記の(i)〜(iii)の1種またはそれ以上との、T細胞の刺激及び/又は拡張をもたらす条件下でそれに十分な時間をかけて接触する段階を含む:(i)前述の融合タンパク質;(ii)このような融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチド;及び/又は(iii)このような融合タンパク質を発現している抗原提示細胞。前述のように調製されたT細胞を含む単離されたT細胞集団もまた、提供される。更なる局面において、本発明は、前述の有効量のT細胞群を患者に投与する段階を含む、患者において癌の発生を阻害する方法を提供する。
【0015】
更に別の態様において、本発明は更に、以下の段階を含む、患者において癌の発生を阻害する方法を提供する:(a)患者から単離されたCD4+及び/又はCD8+ T細胞を、下記の(i)〜(iii)の1種またはそれ以上と共にインキュベーションする段階:(i)HER-2/neu融合タンパク質;(ii)このような融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチド;及び(iii)このような融合タンパク質を発現している抗原提示細胞;並びに、(b)有効量の増殖されたT細胞を患者に投与することによって、患者における癌の発生を阻害する段階。増殖された細胞は、患者への投与前にクローン化することができるが、必ずしも必要ではない。
【0016】
最後に、本発明は、HER-2/neu融合タンパク質の作製法を提供し、本方法は、(a)細胞にHER-2/neu融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入する段階、(b)トランスフェクションされた細胞を培養する段階;及び(c)発現されたタンパク質を精製する段階を含む。好ましい態様において、この細胞はCHO細胞である。別の好ましい態様において、細胞は、無血清条件下で、懸濁液中で培養される。更に別の態様において、発現されたタンパク質は、2段階法により精製され、これはQセファロース高速カラム上での陰イオン交換クロマトグラフィー、及びフェニルセファロース6ファストフロー低置換上での疎水性クロマトグラフィーを含む。
【0017】
これら及びその他の本発明の局面は、下記の詳細な説明及び添付図面を参考にすると明らかとなると思われる。本明細書に明示された全ての参考文献は、各々が個別に組入れられているように、それらの全文が本明細書に参照として組入れられている。
【0018】
具体的な態様の説明
緒言
本発明は、HER-2/neu癌遺伝子発現のタンパク質産物に対する免疫を調節、好ましくは誘発又は増強することが可能な化合物及び組成物に関し、これは悪性疾患で増幅されたHER-2/neu遺伝子が、該遺伝子のタンパク質発現産物が腫瘍に存在することを必要としないような、恒温動物の悪性疾患に関するものを含んでいる。例えば、この遺伝子の過剰発現は、腫瘍形成の開始及び早期病期に関連し得るが、タンパク質発現は、その後低減されるか又は存在しない。本発明は、HER-2/neu陽性腫瘍をHER-2/neu陰性に転換するために有効な免疫応答を誘発又は増強するため、加えてHER-2/neu陽性腫瘍の確立を防止し、かつ存在するHER-2/neu陽性腫瘍の退縮を惹起するために使用することができる。
【0019】
下記の略号が、本明細書を通じて使用される:「ECD」は細胞外ドメインを意味し、「ICD」は細胞内ドメインを意味し、「PD」は細胞内ドメイン内のリン酸化ドメイン(すなわちリン酸化されたドメイン)を意味し、「ΔPD」はリン酸化ドメイン内のリン酸化ドメイン断片を意味し、かつ「KD」は細胞内ドメイン内のキナーゼドメインを意味する。HER-2/neu遺伝子の発現産物は、本明細書においては「HER-2/neuタンパク質」と称され、これは「p185」又は「c-erbB2」としても公知でありかつそのように称されることもある。
【0020】
定義
「HER-2/neu ECD-ICD融合タンパク質」は本明細書において、「ECD-ICD」又は「ECD-ICD融合タンパク質」とも称されるが、これはHER-2/neuタンパク質の細胞外ドメイン(又はその断片)及び細胞内ドメイン(又はその断片)を含む融合タンパク質(又はその断片)を意味する。本明細書において使用されるように、ECD-ICD融合タンパク質は、HER-2/neu膜貫通ドメインの実質的部分を含まず、好ましくはHER-2/neu膜貫通ドメインを全く含まない。
【0021】
「HER-2/neu ECD-PD融合タンパク質」は、「ECD-PD」又は「ECD-PD融合タンパク質」、又は「HER-2/neu ECD-ΔPD融合タンパク質」と称され、更に「ECD-ΔPD」もしくは「ECD-ΔPD融合タンパク質」とも称されるが、これはHER-2/neuタンパク質の細胞外ドメイン(又はその断片)及びリン酸化ドメイン(又はその断片、例えばΔPD)の融合タンパク質(又はその断片)を意味する。ECD-PD及びECD-ΔPD融合タンパク質は、HER-2/neu膜貫通ドメインの実質的部分を含まず、好ましくはHER-2/neu膜貫通ドメインを全く含まない。
【0022】
「HER-2/neu ECD-ICD融合タンパク質」及び「HER-2/neu ECD-PD融合タンパク質」という用語及びそれらの関連用語は、本発明の好ましい態様において、(i)HER-2/neuタンパク質と比べて免疫応答の誘発又は増強を増大するか、もしくは(ii)HER-2/neu タンパク質と比べて免疫応答の誘発又は増強に実質的に影響しないか(例えば、変異体は、ヘルパーT細胞又は細胞傷害性T細胞による反応を刺激するか、もしくは抗体産生を刺激する)のいずれかであるような、それらの断片、それらの相同体、及び1個以上のアミノ酸が挿入、欠失、又は他のアミノ酸(複数)又は非-アミノ酸(複数)で置換されたもののようなそれらの機能的同等物(集合的に「変異体」と称される)も意味することが理解される。HER-2/neu ECD-ICD融合タンパク質及びHER-2/neu ECD-PD融合タンパク質の代表的断片、相同体及び機能的同等物を含む変異体の具体的で限定的でない例は、本明細書により詳細に説明されている。変異体は、天然のポリペプチド成分を含む融合タンパク質と「実質的に同等」又は「実質的に類似」であることができ、かつ免疫応答を刺激する能力を保持している。
【0023】
「融合タンパク質」とは、一方のポリペプチドがあるタンパク質配列又はドメインに由来し、かつ他方のポリペプチドが別のタンパク質配列又はドメインに由来するものが共有結合で連結された少なくとも2個のポリペプチドを有するタンパク質を意味する。これらのポリペプチドは、直接的に、又は共有結合リンカー(例えばポリグリシンリンカーのようなアミノ酸リンカー、又は別の種類の化学リンカー、例えば糖リンカー、脂質リンカー、脂肪酸リンカー、ポリエーテルリンカー、例えばPEGなど)を介してのいずれかにより連結される(例えば、Hermanson、Bioconjugate techniques (1996)参照)。この融合タンパク質を形成するポリペプチドは、典型的には、C末端がN末端へ連結するが、これらは同じくC末端がC末端へ、N末端がN末端へ、又はN末端がC末端へ連結することもできる。この融合タンパク質のポリペプチドは、任意の順番であっても良い。「融合タンパク質」という用語は、更に融合タンパク質を形成するポリペプチドの保存的に修飾された変異体、多型変異体、対立遺伝子、突然変異体、サブ配列、及び種間相同体も意味する。融合タンパク質は、例えば融合タンパク質を連続してコードしている組換えポリヌクレオチドの調製によるもののような、あるタンパク質配列に由来するアミノ酸鎖の別のタンパク質配列に由来するアミノ酸鎖への共有結合的連結により作製され得る。融合タンパク質は、同種又は異種の、2、3、4又はそれ以上の異なるアミノ酸鎖を含むことができる。融合タンパク質中の様々なアミノ酸鎖は、互いに直接スプライシングされるか、又は化学連結基もしくはアミノ酸連結基を介して間接的にスプライシングされ得る。この融合タンパク質は、本明細書により詳細に説明されるように、任意に他の構成要素を含むことができる。
【0024】
本明細書において、「タンパク質」という用語は、「ポリペプチド」及び「ペプチド」と互換的に使用される。
【0025】
「核酸」とは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、及び1本鎖又は2本鎖のいずれかの形状のそれらのポリマーを意味する。この用語は、合成型、天然型、及び非天然型のような、参照核酸と類似の結合特性を有し、かつ参照ヌクレオチドと類似の方法で代謝されるような、公知のヌクレオチドアナログ又は修飾された主鎖残基又は結合を含む核酸を包含している。このようなアナログの例は、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラル-メチルホスホネート、2-O-メチルリボヌクレオチド、ペプチド-核酸(PNA)を含むが、これらに限定されるものではない。
【0026】
特に指定しない限り、特定の核酸配列は、保存的に修飾されたそれらの変異体(例えば、縮重コドン置換)及び相補配列、更には明示された配列をも包含することを暗示している。具体的には、縮重コドン置換は、1個以上の選択された(又は全ての)コドンの第三の位置が混合された塩基及び/又はデオキシイノシン残基で置換されているような配列の形成により達成される(Batzerら、Nucleic Acid Res.、19:5081(1991);Ohtsukaら、J. Biol. Chem.、260:2605〜2608(1985);Rossoliniら、Mol. Cell. Probes,、8:91〜98(1994))。核酸という用語は、遺伝子、cDNA、mRNA、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドと互換的に使用される。
【0027】
本発明の融合タンパク質を含むポリヌクレオチド配列は、該融合タンパク質の個別の各ポリペプチドをコードしている各ヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。従って融合ポリペプチドの個々のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列は、保存的に修飾された変異体、多型変異体、対立遺伝子、突然変異体、サブ配列、および種間相同体を含む。
【0028】
「配列同一性パーセンテージ」とは、2種の最適に並置された配列を比較ウインドウ全体で比較することにより決定され、ここで比較ウインドウ内のポリヌクレオチド配列の部分は、2種の配列の最適な並置において、参照配列(付加又は欠失を含まない)と比べて付加又は欠失(すなわちギャップ)を含み得る。このパーセンテージは、同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が両配列において生じる位置の数を決定し、合致した位置の数を得、合致した位置の数を比較のウインドウ内の位置の総数で除算し、かつその結果を100倍し、配列同一性パーセンテージを得ることにより、算出される。
【0029】
ポリヌクレオチド配列の「実質的同一性」という用語は、ポリヌクレオチドが、少なくとも25%の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。あるいは、同一性%は、25%〜100%の整数のいずれかであることができる。より好ましい態様は、好ましくは以下に説明する標準のパラメータを使用するBLASTであるような、本明細書に記したプログラムを用い、参照配列と比較して、少なくとも:25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、もしくは99%又はそれ以上を含む。当業者は、コドン縮重度、アミノ酸の類似性、リーディングフレームの位置などを考慮し、2種のヌクレオチド配列でコードされたタンパク質の対応する同一性を決定するために、これらの値を適切に調節することができることを認めると思われる。これらの目的に関してアミノ酸配列が「実質的に同一」とは、通常少なくとも40%の配列同一性を意味する。好ましいポリペプチドの同一性%は、40%〜100%の整数のいずれかであることができる。より好ましい態様は、少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、又は99%を含む。「実質的に類似の」ポリペプチドは、同一でない残基の位置が保存的アミノ酸変化により異なること以外は前述のような配列を共有している。保存的アミノ酸置換は、類似の側鎖を有する残基の互換性を意味する。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンであり;脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸群は、セリン及びトレオニンであり;アミド含有側鎖を有するアミノ酸群は、アスパラギン及びグルタミンであり;芳香族側鎖を有するアミノ酸群は、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンであり;塩基性側鎖を有するアミノ酸群は、リシン、アルギニン、及びヒスチジンであり;並びに、イオウを含有する側鎖を有するアミノ酸群は、システイン及びメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換群は以下のものである:バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、アスパラギン酸−グルタミン酸、及びアスパラギン−グルタミンである。
【0030】
比較のための配列の最適な並置は、Smith及びWaterman、Add. APL. Math.、2:482(1981)の局所的同一性アルゴリズムにより、Needleman及びWunsch、J. Mol. Biol.、48:443(1970)の同一性並置アルゴリズムにより、Pearson及びLipman、Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)、85: 2444(1988)の類似性検索法により、これらのアルゴリズムのコンピュータを使った実行により(Wisconsin Genetics Software Package、Genetics Computer Group (GCG)(575 Science Dr., Madison, WI)におけるGAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、及びTFASTA )、又は推測により実施することができる。
【0031】
配列同一性%及び配列類似性%を決定するのに適したアルゴリズムの好ましい例は、BLAST及びBLAST 2.0アルゴリズムであり、これらは各々、Altschulら、Nuc. Acids Res.、25:3389〜3402(1977)及びAltschulら、J. Mol. Biol.、215:403〜410(1990)に説明されている。BLAST及びBLAST 2.0を、本明細書に記したパラメータと共に用い、本発明の核酸及びタンパク質について配列同一性%を決定した。BLAST分析を行うためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)に公開されている。ヌクレオチド配列についての累積スコアは、パラメータM(合致した残基の対についての報酬スコア(reward score);常に>0)及びN(合致しない残基についてのペナルティスコア(penalty score);常に<0)を用いて算出される。アミノ酸配列について、スコア化のマトリックスを用いて、累積スコアを算出する。各方向におけるワードヒット(word hit)の拡大は、下記の場合に中止される:累積並置スコアが、その最高到達値から量Xだけ低下した場合;累積スコアが、1個以上の陰性-スコア化残基の並置の累積により、零以下になった場合;または、いずれかの配列の最後に達した場合。BLASTアルゴリズムパラメーターであるW、T及びXは、この並置の感度及び速度を決定する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列について)は、デフォルトとして、ワードレングス(W)11、期待値(E)10、M=5、N=-4及び両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列について、BLASTPプログラムは、デフォルトとして、ワードレングス3、及び期待値(E)10、及びBLOSUM62スコア化マトリックス(Henikoff及びHenikoff、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89:10915(1989))並置(B)50、期待値(E)10、M=5、N=-4、及び両鎖の比較を用いる。
【0032】
ヌクレオチド配列が実質的に同じであることの別の指標は、2種の分子が、中等度、及び好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、互いに、又は第三の核酸に、ハイブリダイズするかどうかである。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、かつ様々な環境において異なると思われる。比較的長い配列は、比較的高温で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範な指針は、Tijssen、「ハイブリダイゼーションの原理の検証及び核酸アッセイ法の戦略(Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes)」(1993)に見ることができる。一般に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度及びpHにおいて、特定の配列の融解温度(Tm)よりも約5〜10倍低いように選択される。Tmは、標的配列の50%が完全に合致したプローブにハイブリダイズするような温度である(所定のイオン強度及びpHで)。典型的には、ストリンジェントな条件は、pH7.0〜8.3で、塩濃度がナトリウムイオン約1.0M未満、典型的にはナトリウムイオン濃度約0.01〜1.0M(又は他の塩)であり、並びに温度が、短いプローブ(例えば、10〜50個のヌクレオチド)について低くとも約30℃及び長いプローブ(例えば、50個よりも多いヌクレオチド)について低くとも約60℃であるようなものであると思われる。ストリンジェントな条件は、同じく、ホルムアミドのような脱安定化剤(destabilizing agent)の添加により達成されるであろう。選択的又は特異的ハイブリダイゼーションについて、陽性シグナルは、バックグラウンドの少なくとも2倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの10倍である。
【0033】
例証的ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは以下のようなものであることができる:ホルムアミド50%、5x SSC、及び1% SDS、42℃でのインキュベーション、もしくは、5x SSC、1% SDS、65℃でのインキュベーション、並びに0.2x SSC、0.1% SDS、温度65℃での洗浄である。
【0034】
本発明の目的に適した「中等度のストリンジェントな条件」は、例えば、5x SSC、0.5% SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)の溶液中での前洗浄、50℃〜65℃、5x SSCで一晩のハイブリダイゼーション、それに続く各々2x、0.5x及び0.2x SSC (0.1% SDS含有)による65℃20分間の2回の洗浄である。このようなハイブリダイゼーションを行うDNA配列も、本発明の範囲内である。
【0035】
本明細書において説明される「T細胞の増殖」は、T細胞の増加に加えて、増加につながるT細胞の刺激、すなわち、有糸***につながる事象及び有糸***それ自身の開始を含む。
【0036】
本発明の融合タンパク質
A . HER-2/neu タンパク質の細胞内ドメイン及び細胞外ドメイン
HER-2/neuタンパク質は、前述のようなHER-2/neuの知見を基に、抗癌ワクチンの標的として選択された。この方法の大きな障害のひとつは、十分量のHER-2/neuタンパク質の単離が困難であることであった。この問題に対処するひとつの試みは、哺乳類細胞において、ECD及びICDを個別に発現することであった。ECDは、分泌タンパク質として高レベルで発現され、すなわちECDタンパク質約20mgが、1Lのマウス細胞培養物から精製された。しかし、ICDの発現レベルは低く、すなわち、わずかに約0.2mgのICDタンパク質が1LのHEK-293細胞から単離された。加えて、得られるICDタンパク質は、細胞溶解液において非常に不安定であり、有用な量の精製に関して多数の予想外の問題点を生じている。
【0037】
前述のように、HER-2/neuは、腫瘍原性の自己タンパク質であり、かつ自己タンパク質に対する免疫寛容は、免疫応答を減弱させる。いずれか特定のタンパク質の様々な部分に対する免疫寛容のレベルは、タンパク質の発現された部分が細胞膜内または細胞外のいずれかに存在するかによって決まる。ECDは、細胞表面に存在しかつ溢れている(shed)。対照的に、ICD及びその一部は、細胞内に存在し、かつ溢れていない。ECDは、生体の免疫系と容易に接触することができるのに対して、ICD及びその一部は、生体の免疫系から比較的隔離されている。結果的に、ECDに対する免疫寛容のレベルは、HER-2/neuタンパク質のICD部分のものよりも大きい。従って、本発明のワクチンは、ICDタンパク質及びICDペプチド、並びにその変異体であって、PDタンパク質及びPDペプチドを含むものが、ECDタンパク質及びECDペプチドよりもより大きいレベルの免疫応答を誘発する。
【0038】
ICD及びその変異体は、ECD及びその変異体よりもより免疫原性であるが、ECD及びその変異体に対する抗体は、有益でありかつ望ましい可能性がある。ECDは細胞表面に存在するが、ICD及びその一部は、分泌されずかつ細胞の内部に隔離されている。従ってECDに対する抗体反応は、非常に治療的恩典を有し、従って本発明にとって好ましい。ECDそれ自身は余り免疫原性ではない。ICD(PD及びΔPDを含む)は、ECDよりもより免疫原性であるので、ECD-ICD融合タンパク質及び/又はECD-PD融合タンパク質は、ECD単独よりもより免疫原性である。ECDに対する抗体誘起に関して、ECD-ICD融合タンパク質及び/又はECD-PD融合タンパク質は、ECD単独よりもより効果的であると予想され、本発明の好ましい態様である。
【0039】
本発明において、ECD又はその変異体は、ICD又はその変異体、好ましくはPD又はその変異体と、結合、連結、又は融合(直接又は間接のいずれか)される。ECDは、細胞表面でHER-2/neuタンパク質と反応する抗体の誘導に関する構造的コンホメーションを提供する一方で、ICD又はPDは、ECDの免疫原性を増大する。この組合せは、ECDに対する免疫応答の誘導に関してECD単独よりも驚くほど効果的である。
【0040】
ECD又はECDの一部は、ICDもしくはICDの一部を含むその変異体、又はPDもしくはPDの一部を含むその変異体(例えばΔPD)と結合することができる。本発明のECDは、好ましくはヒト、ラット、又はマウスのECDである。ヒトECDは、図9に配列番号:3として記されている。ラットECDは、図14に配列番号:8として記されている。
【0041】
本発明のICDは、好ましくはヒト、ラット、又はマウスのICDである。ヒトICDは、図7にLys 676 からVal 1255の領域を含んで広がる配列番号:1として記されている。ラットICDは、図8にLys 677からVal 1256の領域を含んで広がる配列番号:2として記されている。
【0042】
本発明のPDは、好ましくはヒト、ラット、又はマウスのPDである。ヒトPDは、図10に配列番号:4として記されている。ヒトPDは、ヒトΔPDであることができ、これは図11に配列番号:5として記されている。ラットPDは、図8にGln 991からVal 1256の領域を含むように広がる配列番号:2として記されている。ラットPDは、ラットΔPDであることができ、これは図8にGln 991からArg 1049の領域を含んで広がる配列番号:2として記されている。
【0043】
ある態様において、ヒトECDは、(i)ヒトICDもしくはラットICD、又は(ii)ヒトPDもしくはΔPD、又はラットPDもしくはΔPDのいずれかに融合することができる。別の態様において、ラットECDは、(i)ヒトICDもしくはラットICD、又は(ii)ヒトPDもしくはΔPD、又はラットPDもしくはΔPDのいずれかに融合することができる。
【0044】
HER-2/neu PDは、長さが268個のアミノ酸であり、細胞内にあり、かつタンパク質チロシンキナーゼによりリン酸化することができる。この領域は、他のチロシンキナーゼ受容体の対応する部分と同一性を共有していない。従って、このドメインの特異性及び独自性は、腫瘍ワクチンとしての用途にとって特に好ましい。しかし、細菌及び哺乳類細胞におけるこのドメイン単独の発現は、問題が多い。例えば、得られるPDタンパク質は、非常に不安定であり、かつ大量生産に適していない。ある態様において、本発明は、このような問題点を、細胞内ドメイン又はリン酸化ドメインの全て又は一部を、HER-2/neu細胞外ドメインの全部又は一部と融合することにより解決している。本発明のECD-ICD融合タンパク質及びECD-PD融合タンパク質は、可溶性であり、分泌され、かつ培養培地において安定している。このシステムは、大量の細胞内ドメイン又はリン酸化ドメインタンパク質を、癌ワクチンの開発、好ましくは乳癌ワクチンの開発のために提供することができるが、HER-2/neu発現により特徴付けられるあらゆる癌に対するワクチンについて有用であると考えられる。ECD-ICD及びECD-PD融合タンパク質は、細胞内ドメイン又はリン酸化ドメイン、もしくはそれらの変異体の、細胞外ドメイン又はその変異体との融合タンパク質としての発現を増加することに加え、改善されたワクチン製剤を提供する。
【0045】
このPDは、PDのN末端に先行し分泌シグナル配列を導入することにより分泌され、可溶性の、分泌された組換えタンパク質を生じる。この分泌法は、該組換えタンパク質が培養培地中に蓄積するので好ましい。このタンパク質は細胞内タンパク質に会合していないので、タンパク質分解は制限される。このタンパク質は、より簡便かつ経済的に精製されるはずである。
【0046】
実施例3に示されたように、pFLAGCMV-l発現プラスミド(Kodak社)を用いて、HER-2/neu細胞内ドメインのどの領域が分泌され得るかを決定した。このタンパク質は、そのN末端にプレプロトリプシン分泌シグナル及びFLAG-タグを伴う融合タンパク質として発現された。HEK-293細胞を、このような構築物によりトランスフェクションし、かつ細胞及び培養培地は、FLAG-タグ融合タンパク質について、プローブとしてFLAG-タグM2抗体を使用するウェスタンブロットによりアッセイされた。図4の結果は、完全長ICDもKDも分泌されないが、PDが可溶性でありかつ培養培地に分泌されかつ検出されることを示している。これらの結果は、ICD又はKDタンパク質の完全長構造は分泌を生じないこと、つまり細胞膜を通るタンパク質の経路にあることを示している。
【0047】
実施例4に示されたように、ECDは分泌シグナル配列を有し、かつ分泌されたタンパク質として良好に発現されるので、ECDがPDの融合のパートナーとして使用された。ECD-PD融合タンパク質は、HEK-293細胞において発現された。可溶性ECD-PD融合タンパク質の分泌は、HER-2/neu ECD-特異的抗体を用いるELISAアッセイ法、その後のHER-2/neu PD特異的抗体を用いるウェスタンブロットにより決定した。図6に示されたように、可溶性ECD-PDはHEK-293において発現され、かつ培養培地へと分泌された。
【0048】
B. 本発明の融合タンパク質の免疫原性
好ましい態様において、本発明は、HER-2/neu遺伝子のタンパク質発現産物の特定の部分を基にした融合タンパク質(例えば、HER-2/neu ECD-ICD融合タンパク質又はHER-2/neu ECD-PD融合タンパク質)に関し、これは抗体反応を誘発することが可能であり、かつ胸腺依存性リンパ球(「T細胞」)により認識され得る。従って、自己発生の免疫T細胞応答を、予防のために用いるか、またはHER-2/neuが過剰発現されるかもしくはされた悪性疾患を治療するために用いることができる。別の局面において、本発明は免疫感作のための、このようなECD-ICD融合タンパク質又はECD-PD融合タンパク質の発現を指示する核酸分子、又はそれらの変異体の、単独又はウイルスベクター内での使用に関する。
【0049】
概してCD4+ T細胞群は、特異的抗原で刺激された場合のリンホカインの放出を通じてのヘルパー又はインデューサーとして機能すると考えられる;しかし、CD4+細胞のサブセットは、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)として作用することができる。同様に、CD8+ T細胞は、直接抗原性標的を溶解することによって機能すると考えられる;しかし、様々な環境下で、これらはリンホカインを分泌し、ヘルパー又はDTH機能を提供することができる。機能の重複の可能性があるにも関らず、表現型CD4及びCD8マーカーは、MHCクラスI又はクラスII抗原に結合したペプチドの認識部位に連結している。MHCクラスI又はクラスIIの状況における抗原認識は、CD4+及びCD8+ T細胞が、異なる環境下で提示された異なる抗原又は同一抗原に対し応答することを指示している。免疫原性ペプチドのMHCクラスII抗原への結合は、抗原提示細胞によって示された(ingest)抗原について最も一般的に生じる。
【0050】
本発明において示されるように、HER-2/neu癌遺伝子のタンパク質発現産物のECD-ICD融合タンパク質又はECD-PD融合タンパク質は、T細胞によって認識される。循環血中HER-2/neu ECD-ICD融合タンパク質又は、HER-2/neu ECD-PD融合タンパク質は、ペプチド断片に分解される。ECD-ICD融合タンパク質又はECD-PD融合タンパク質に由来するペプチド断片は、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)の抗原に結合する。細胞表面上のMHC抗原に結合したペプチドの提示及びペプチド+自己MHC抗原の組合せの宿主T細胞による認識により、HER-2/neu ECD-ICD又はHER-2/neu ECD-PD融合タンパク質(悪性細胞上で発現されたものを含む)は、T細胞に対して免疫原性であると思われる。T細胞受容体の強烈な特異性は、個々のT細胞が、1個のアミノ酸残基が異なるタンパク質断片間の識別を可能にする。
【0051】
ECD-ICD融合タンパク質又はECD-PD融合タンパク質由来のペプチド断片に対する免疫応答時に、ペプチド-MHC複合体の高い結合親和性を伴うT細胞受容体を発現しているT細胞は、ペプチド-MHC複合体に結合することによって、活性化されかつ増殖が誘発される。ペプチドとの最初の遭遇において、少数の免疫T細胞がリンホカインを分泌し、増殖し、かつエフェクター細胞及び記憶T細胞に分化する。一次免疫応答は、インビボにおいて生じるが、インビトロにおいて検出することは困難である。記憶T細胞による同じ抗原との次回の遭遇は、より迅速かつより強度な免疫応答に繋がる。二次応答は、インビボ又はインビトロのいずれかにおいて生じる。このインビトロ応答は、増殖の程度、サイトカイン産生の程度、又は抗原に再曝露されたT細胞集団の細胞溶解活性の発生を測定することにより、容易に評価される。特定の抗原に反応したT細胞群の実質的増殖は、抗原に曝露されるか、又は抗原により感作されるかする前の指標とみなされる。
【0052】
C. 本発明の融合タンパク質
ある態様において、本発明の化合物は、HER-2/neu ECD-ICD融合タンパク質もしくは変異体、又はこのようなECD-ICD融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを含む。好ましくは、この核酸分子はDNA分子である。本発明のHER-2/neu ECD-ICD融合タンパク質において、ECD及びICDポリペプチド構成要素は、直接融合されるか、またはリンカー、例えばアミノ酸リンカー又は他の種類の化学リンカーを介して融合される。好ましい態様において、本発明のECD-ICD融合タンパク質は、HER-2/neu ICDの全部又は一部に直接融合されたHER-2/neu ECD全部又は一部を含む。
【0053】
追加の態様において、ECD-ICD融合タンパク質中のECDサイズは、ECDのカルボキシル末端から1〜約100個のアミノ酸のどこか、好ましくは約100個のアミノ酸を順次取り除くことにより、変更することができる。同様に、ECD-ICD融合タンパク質中のICDサイズは、ICDのN末端及び/又はC末端から1〜約100個のアミノ酸のどこかを順次取り除くことにより、変更することができる。得られる変異体の形状は、本発明に係る用途のために、文献及び本明細書において説明されたような適当なスクリーニング法を用いて、それらの抗原性及び/又は免疫原性を基に選択することができる。
【0054】
別の態様において、本発明の化合物は、HER-2/neu ECD-PD融合タンパク質、もしくは変異体、又はこのようなECD-PD融合タンパク質をコードしている核酸分子を含む。ある態様において、HER-2/neu ECDは、HER-2/neu ΔPDに融合される。好ましくは、この核酸分子はDNA分子である。本発明のHER-2/neu ECD-PD融合タンパク質において、ECD及びPD又はΔPDポリペプチド構成要素は、直接融合されるか又はリンカー、例えばペプチドリンカーを介して融合されることができる。好ましい態様において、本発明のECD-PD融合タンパク質は、HER-2/neu PD又はHER-2/neuΔPDに直接融合されたHER-2/neu ECDを含む。ここで及び本明細書を通じて、本発明の融合タンパク質の好ましい態様は、HER-2/neu PD融合タンパク質である。
【0055】
別の態様において、ECD-PD融合タンパク質におけるECDのサイズは、ECDのカルボキシル末端からの1〜約100個のアミノ酸のどこか、好ましくは約100個のアミノ酸を順次取り除くことにより変更することができる。同様に、ECD-PD融合タンパク質中のPDサイズは、PDのN末端からアミノ酸を順次取り除くことにより、変更することができる。同じく、好ましい態様はPDである。別の変異体の形状は、本発明における用途のために、文献及び本明細書において説明されたような適当なスクリーニング法を用いて、それらの抗原性及び/又は免疫原性を基に選択することができる。
【0056】
表1は、ECDのカルボキシル末端から100個のアミノ酸を除去することが、ECD-PD融合タンパク質の発現レベル及び安定性に影響を及ぼさないことを示している。
【0057】
【表1】
ECD切断型−PD要約
【0058】
ECD-ICD融合タンパク質及びECD-PD融合タンパク質の変異体は、同じく、各々、天然のECD-ICD融合タンパク質及びECD-PD融合タンパク質の様々な構造形態を含む。イオン化可能なアミノ基及びカルボキシル基の存在のために、例えば、HER-2/neu ECD-ICD又はECD-PD融合タンパク質は、酸性又は塩基性塩の形状であることができるか、または中性の形状であってもよい。個々のアミノ酸残基も、酸化又は還元により修飾することができる。
【0059】
本発明の範囲のその他の変異体は、各々天然のHER-2/neu ECD-ICDタンパク質又は天然のHER-2/neu ECD-PDタンパク質の一次アミノ酸構造が、各々、他のペプチド又はポリペプチド、又はグリコシル基、脂質、リン酸、アセチル基などのような化学部分と、共有結合又は凝集的抱合体の形成により修飾されるようなECD-ICD融合タンパク質又はECD-PD融合タンパク質である。共有結合誘導体は、例えばアミノ酸側鎖への又はN末端もしくはC末端での特定の官能基の連結により、調製することができる。
【0060】
本発明は更に、グリコシル化を伴う又は伴わない、HER-2/neu ECD-ICD融合タンパク質及びHER-2/neu ECD-PD融合タンパク質も含む。酵母又は哺乳類発現システムにおいて発現されたECD-ICD融合タンパク質及びECD-PD融合タンパク質は、分子量及びグリコシルパターンが、発現システムによって、天然の分子と類似であるか、又はわずかに異なることができる。大腸菌(E. coli)のような細菌のポリペプチドをコードしているDNAの発現は、典型的には非グリコシル化分子を提供する。真核生物タンパク質のN-グリコシル化部位は、アミノ酸三つ組Asn-A1-Z(ここでA1はPro以外の任意のアミノ酸であり、かつZはSer又はThrである)により特徴付けられる。失活されたN-グリコシル化部位を有するHER-2/neu ECD-ICD又はECD-PD融合タンパク質の変異体は、オリゴヌクレオチドの合成及び連結又は位置指定突然変異技術のような当業者に公知の技術により作製することができ、これも本発明の範囲内である。代わりに、N-連結したグリコシル化部位は、HER-2/neu ECD-ICD又はECD-PD融合タンパク質に添加することができる。
【0061】
本発明のECD-ICD融合タンパク質は、変異体を含むと理解され、これはヒト及び非ヒトのポリペプチド間のあらゆる可能な組合せを含む。非ヒトポリペプチドは、例えばラット、マウス、モルモット、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌなどのようないずれかの哺乳類類のポリペプチドを含む。ある態様において、ECD-ICD融合タンパク質は、以下を含む:
(i)図9のヒトECD (配列番号:3)と、図7に示されたLys 676からVal 1255を含むように広がるアミノ酸配列(配列番号:1)であるヒトICDとの、化学及び/又はアミノ酸連結基を伴う又は伴わない連結により作製されたもののような、ヒトECD -ヒトICDの融合タンパク質、及びそれらの変異体;
(ii)図14のラットECD(配列番号:8)と、図8に示されたLys 677からVal 1256を含むように広がるアミノ酸配列(配列番号:2)であるラットICDとの、化学及び/又はアミノ酸連結基を伴う又は伴わない連結により作製されたもののような、ラットECD -ラットICDの融合タンパク質、及びそれらの変異体;
(iii)図9のヒトECD (配列番号:3)と、図8に示されたLys 677からVal 1256を含むように広がるアミノ酸配列(配列番号:2)であるラットICDとの、化学及び/又はアミノ酸連結基を伴う又は伴わない連結により作製されたもののような、ヒトECD -ラットICDの融合タンパク質、及びそれらの変異体;並びに
(iv)図14のラットECD (配列番号:8)と、図7に示されたLys 676からVal 1255を含むように広がるアミノ酸配列(配列番号:1)であるヒトICDとの、化学及び/又はアミノ酸連結基を伴う又は伴わない連結により作製されたもののような、ラットECD -ヒトICDの融合タンパク質、及びそれらの変異体。
【0062】
本発明のECD-ICD融合タンパク質のあらゆる変異体が、本発明の態様として含まれている。ある態様において、このような変異体は、天然のHER-2/neu ECD-ICDタンパク質と実質的に同一であるか又は実質的に類似しており、かつ免疫応答刺激能を保持している。ECDタンパク質をコードしているヒトDNA配列は、例えば、図15(配列番号:9)にヌクレオチド1からヌクレオチド1959まで含むように広がることが示されている。ICDタンパク質をコードしているヒトDNA配列は、例えば、図15(配列番号:9)にヌクレオチド2026からヌクレオチド3765を含むように広がることが示されている。HER-2/neu ECD-ICDタンパク質の免疫応答産生能に関するいずれかの配列の修飾の作用は、例えば、変異されたHER-2/neu ECD-ICDタンパク質のT細胞反応を誘発する能力を、例えば本明細書に記された方法を用いて分析することによるか、又は変異されたHER-2/neu ECD-ICDタンパク質の抗体産生能を分析することにより、容易に決定することができる。
【0063】
本発明のECD-PD融合タンパク質は、変異体を含むと理解され、これはヒト及び非ヒトのポリペプチドの間のあらゆる可能な組合せを含む。非ヒトポリペプチドは、例えばラット、マウス、モルモット、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌなどを含む。ある態様において、ECD-PD融合タンパク質は、以下を含む:
(i)図9のヒトECD (配列番号:3)と、図10に示されたヒトPD(配列番号:4)との、化学及び/又はアミノ酸連結基を伴う又は伴わない連結により作製された融合タンパク質及びそれらの変異体を含むような、図12に示されたようなヒトECD -ヒトPDの融合タンパク質(配列番号:6)及びそれらの変異体;
(ii)図14のラットECD(配列番号:8)と、図8に示されたGln 991からVal 1256を含むように広がるアミノ酸配列(配列番号:2)であるラットPDとの、化学及び/又はアミノ酸連結基を伴う又は伴わない連結により作製されたもののような、ラットECD -ラットPDの融合タンパク質、及びそれらの変異体;
(iii)図9のヒトECD (配列番号:3)と、図8に示されたGln 991からVal 1256を含むように広がるアミノ酸配列(配列番号:2)であるラットPDとの、化学及び/又はアミノ酸連結基を伴う又は伴わない連結により作製されたもののような、ヒトECD -ラットPDの融合タンパク質、及びそれらの変異体;並びに
(iv)図14のラットECD (配列番号:8)と、図10に示されたヒトPD(配列番号:4)との、化学及び/又はアミノ酸連結基を伴う又は伴わない連結により作製されたもののような、ラットECD -ヒトPDの融合タンパク質、及びそれらの変異体。
【0064】
本発明のECD-PD融合タンパク質のあらゆる変異体が、本発明の態様として含まれている。ある態様において、このような変異体は、天然のHER-2/neu ECD-PDタンパク質と実質的に同一であるか又は実質的に類似しており、かつ免疫応答刺激能を保持している。ECDタンパク質をコードしているヒトDNA配列は、例えば、図15(配列番号:9)にヌクレオチド1からヌクレオチド1959まで含むように広がることが示されている。PDタンパク質をコードしているヒトDNA配列は、例えば、図15(配列番号:9)にヌクレオチド2968からヌクレオチド3765を含むように広がることが示されている。HER-2/neu ECD-PDタンパク質の免疫応答産生能に関するいずれかの配列の修飾の作用は、例えば、変異されたHER-2/neu ECD-PDタンパク質のT細胞反応を誘発する能力を、例えば本明細書に記された方法を用いて分析することによるか、又は変異されたHER-2/neu ECD-PDタンパク質の抗体産生能を分析することにより、容易に決定することができる。
【0065】
別の態様において、ECD-PD融合タンパク質は、本発明のECD-ΔPD融合タンパク質であり、これは変異体を含むと理解され、ヒトと非ヒトポリペプチドの間のあらゆる可能性のある組合せを含む。非ヒトポリペプチドは、例えばラット、マウス、モルモット、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌなどを含む。ある態様において、ECD-ΔPD融合タンパク質は、以下を含む:
(i)図9のヒトECD (配列番号:3)と、図11に示されたヒトΔPD(配列番号:5)との、化学及び/又はアミノ酸連結基を伴う又は伴わない連結により作製された融合タンパク質及びそれらの変異体を含むような、図13に示されたようなヒトECD -ヒトΔPDの融合タンパク質(配列番号:7)及びそれらの変異体;
(ii)図14のラットECD(配列番号:8)と、図8に示されたGln 991からArg 1049を含むように広がるアミノ酸配列(配列番号:2)であるラットΔPDとの、化学及び/又はアミノ酸連結基を伴う又は伴わない連結により作製されたもののような、ラットECD -ラットΔPDの融合タンパク質、及びそれらの変異体;
(iii)図9のヒトECD (配列番号:3)と、図8に示されたGln 991からArg 1049を含むように広がるアミノ酸配列(配列番号:2)であるラットΔPDとの、化学及び/又はアミノ酸連結基を伴う又は伴わない連結により作製されたもののような、ヒトECD -ラットΔPDの融合タンパク質、及びそれらの変異体;並びに
(iv)図14のラットECD (配列番号:8)と、図11に示されたヒトΔPD(配列番号:5)との、化学及び/又はアミノ酸連結基を伴う又は伴わない連結により作製されたもののような、ラットECD -ヒトΔPDの融合タンパク質、及びそれらの変異体。
【0066】
本発明のECD-ΔPD融合タンパク質のあらゆる変異体が、本発明の態様として含まれている。ある態様において、このような変異体は、天然のHER-2/neu ECD-ΔPDタンパク質と実質的に同一であるか又は実質的に類似しており、かつ免疫応答刺激能を保持している。ECDタンパク質をコードしているヒトDNA配列は、例えば、図15(配列番号:9)にヌクレオチド1からヌクレオチド1959まで含むように広がることが示されている。ΔPDタンパク質をコードしているヒトDNA配列は、例えば、図15(配列番号:9)にヌクレオチド2968からヌクレオチド3144を含むように広がることが示されている。HER-2/neu ECD-ΔPDタンパク質の免疫応答産生能に関するいずれかの配列の修飾の作用は、例えば、変異されたHER-2/neu ECD-ΔPDタンパク質のT細胞反応を誘発する能力を、例えば本明細書に記された方法を用いて分析することによるか、又は変異されたHER-2/neu ECD-ΔPDタンパク質の抗体産生能を分析することにより、容易に決定することができる。
【0067】
好ましい態様において、本発明のHER-2/neu ECD-PD融合タンパク質は、ECD-PD融合タンパク質である。
【0068】
ある具体的な態様において、本発明の融合タンパク質は、例えば免疫学的融合パートナー又は発現エンハンサーのような融合パートナーを含むことができる。融合パートナーは、例えば、Tヘルパーエピトープ(免疫学的融合パートナー)、好ましくはヒトにより認識されたTヘルパーエピトープの提供を補助することができるか、もしくは、組換え融合タンパク質よりもより高い収率で、融合タンパク質(発現エンハンサー)の発現を補助することができる。ある好ましい融合パートナーは、免疫学的及び発現増強の両方の融合パートナーである。その他の融合パートナーは、融合タンパク質の溶解度を増大するため、又は融合タンパク質が所望の細胞内コンパートメントに標的化されることを可能にするために選択することができる。更に別の融合パートナーは、融合タンパク質の精製を促進する親和性タグを含む。
【0069】
更に無関係の免疫原性タンパク質と一緒に、本明細書に記された融合ポリペプチドを含む融合タンパク質も提供される。好ましくは、この免疫原性タンパク質は、リコール反応を誘発することが可能である。このようなタンパク質の例は、破傷風、結核及び肝炎のタンパク質を含む(例えば、Stouteら、New Engl. J. Med.、336:86〜91(1997))。
【0070】
その他の態様において、免疫学的融合パートナーは、グラム陰性菌であるインフルエンザ菌(Haemophilus influenza)Bの表面タンパク質であるプロテインDに由来する(国際公開公報第91/18926号)。好ましくは、プロテインD誘導体は、該タンパク質のほぼ1/3を含み(例えば、最初のN末端の100〜110個のアミノ酸)、かつプロテインD誘導体は、リピド化され得る。ある好ましい態様において、リポプロテインDの融合パートナーの最初の109個の残基は、そのN末端に含まれ、別の外因性T細胞エピトープとの融合タンパク質を提供し、かつ大腸菌における発現レベルを増大する(従って発現エンハンサーとして機能する)。リピド尾は、該融合タンパク質の抗原提示細胞への最適な提示を確実にする。その他の融合パートナーは、インフルエンザウイルスNS 1(赤血球凝集素)に由来する非構造タンパク質を含む。典型的には、N末端の81個のアミノ酸を使用するが、Tヘルパーエピトープを含む様々な断片を使用することができる。
【0071】
別の態様において、免疫学的融合パートナーは、LYTAとして公知のタンパク質、又はその一部(好ましくはC末端部分)である。LYTAは、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)に由来するが、アミダーゼLYTAとして公知のN-アセチル-L-アラニンアミダーゼを合成する(LytA遺伝子によりコードされる;Gene、43:265〜292(1986))。LYTAは、ペプチドグリカン主鎖において特定の結合を特異的に分解する自己溶菌酵素である。LYTAタンパク質のC末端ドメインは、コリン又はDEAEのようないくつかのコリンアナログに対する親和性に寄与することができる。この特性は、融合タンパク質の発現に有用な大腸菌C-LYTA発現プラスミドの開発において利用されている。アミノ末端にC-LYTA断片を含むハイブリッドタンパク質の精製は明らかにされている(Biotechnology、10:795〜798(1992)を参照)。好ましい態様において、LYTAの反復部分は、融合タンパク質に組込まれ得る。反復部分は、残基178から始まるC末端領域に認めることができる。特に好ましい反復部分は、残基188〜305を組入れている。
【0072】
好ましい態様において、本発明の融合タンパク質は、更に融合パートナーを含む。好ましい融合パートナーは、例えばRa12又はLeIFを含むが、これらに限定されるものではない。特に本発明は、組換え融合ポリペプチドの発現の安定かつ高い収量を促進するか又は寛容を破壊するための融合パートナーとして、Ra12又はLeIF配列を用いる材料及び方法を提供する。
【0073】
Ra12は、ヒト型結核菌(M. tuberculosis)MTB32Aコード配列の14kD C末端断片であり、これはそれ自身で高レベルで発現され、かつ精製過程を通じて可溶性であり続ける。LeIFは、真核生物のリボソームタンパク質eIFと相同であり、かつTh1及び/又はCTL免疫応答を刺激することが可能であるような、リーシュマニア抗原である(例えば米国特許第5,876,966号、第5,876,735号及び第5,879,687号を参照)。本発明は、Ra12及びLeIFポリペプチドのこれらの特性を利用し、かつHER-2/neu融合ポリペプチドに加え、Ra12及びLeIFポリペプチドを含む融合ポリペプチドの安定かつ高収率の発現のための組換え核酸分子、発現ベクター、宿主細胞、及び方法を提供する。Ra12又はLeIFポリペプチド及び問題の融合タンパク質を含む融合ポリペプチドをコードしている組換え核酸は、従来の遺伝子工学技術により容易に構築することができる。組換え核酸は、好ましくは該融合パートナーポリヌクレオチド配列が、選択された融合タンパク質配列の5'側に位置するように、構築される。融合パートナーポリヌクレオチド配列が、対象となる融合タンパク質のポリヌクレオチド配列の3'側に位置するか、又は、融合タンパク質のポリヌクレオチド配列が、融合パートナーポリヌクレオチド配列内の位置に挿入されることも適している。加えて、本明細書に記されたような融合パートナー又はそれらの一部もしくは他の変異体をコードしているいずれか適当なポリヌクレオチドを、本発明の組換え融合核酸の構築に使用することができる。
【0074】
本発明の融合パートナーポリペプチドをコードしている核酸は、当技術分野において公知のいずれか適当な方法で調製することができる。例証的方法は、適当な配列のクローニング及び制限、又はNarangらのホスホトリエステル法、Meth. Enzymol.、68:90〜99(1979);Brownらのホスホジエステル法、Meth. Enzymol.、68:109〜151(1979);Beaucageらのジエステルホスホロアミダイト法、Tetra. Lett.、22:1859〜1862(1981);及び米国特許第4,458,066号に開示された固体支持体法のような方法による直接の化学合成を含む。
【0075】
融合パートナーポリペプチド及び選択された融合タンパク質を含む融合ポリペプチドをコードしている組換え核酸は、当技術分野において公知のいずれかの方法を用いて調製することができる。前述のように、組換え核酸は、好ましくは、融合パートナーポリヌクレオチド配列が、対象となる融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列の5'側に位置するように構築される。この融合パートナー及び融合タンパク質のポリヌクレオチド配列は、それらの融合及びその後の発現を促進するように修飾することもできる。
【0076】
前記組換え核酸は更に、タンパク質精製プロトコールを促進するアフィニティタグをコードしている配列のような、他のヌクレオチド配列を含むこともできる。
【0077】
D. 本発明の融合タンパク質の変異体
CD4+ T細胞は、一般に腫瘍細胞の外側にある抗原を認識する。対照的に、正常な環境においては、ペプチドのMHCクラスIへの結合は、細胞質ゾルに存在しかつ標的それ自身により合成されるタンパク質についてのみ生じ、外部環境のタンパク質は除かれる。このことの例外は、外因性ペプチドの高濃度で細胞外に存在する正確なクラスI結合モチーフとの結合である。従って、CD4+及びCD8+ T細胞は、広く異なる機能を有し、かつその抗原が正常に存在する場所を反映して異なる抗原を認識する傾向がある。
【0078】
本発明の変異体を作製するためのアミノ酸置換を作製する別の方法は、MHCクラスII分子(例えばCD4+ T細胞応答)又はMHCクラスI分子(例えばCD8+ T細胞応答)と結合する可能性のあるT細胞モチーフ内のアミノ酸の同定及び置換である。理論的にMHCクラスII分子と結合する可能性のあるモチーフを伴うペプチドセグメント(HER-2/neu ECD-ICD又はECD-PD融合タンパク質の)は、コンピュータ解析により確定することができる。例えば、T細胞認識の可能性のある位置を識別するように設計されたいくつかのコンピュータアルゴリズムを組込んだタンパク質配列解析パッケージ「T Sites」を利用することができる(Fellerら、Nature、349:720〜721(1991))。2種の検索アルゴリズムが使用される:(1)Margalitにより説明されるAMPHIアルゴリズム(Fellerら、Nature, 349:720〜721(1991);Margalitら、J. Immunol.、138:2213〜2229 (1987))は、α−ヘリックスの周期性及び両親媒性に従いエピトープモチーフを同定する;(2)Rothbard及びTaylorアルゴリズムは、電荷及び極性パターンに従いエピトープモチーフを同定する(Rothbardら、EMBO、7:93〜100 (1988))。両モチーフを伴うセグメントは、MHCクラスII分子への結合に最も適している。CD8+ T細胞は、MHCクラスI分子に結合したペプチドを認識する。Parkerら(J. Immunol.、152:163(1994))は、特定のMHC分子に結合するペプチドが識別可能な配列モチーフを共有していることを明らかにした。HLA-A2.1のグローブにおける結合のためのペプチドモチーフは、培養細胞株のHLA-A2.l分子からストリップされたペプチドのエドマン分解法により定義されている(表2、Falkら、Nature、35 1:290〜296(1991))。この方法は、長さが9個のアミノ酸で、2位(L)及び9位(V)に生じるドミナントアンカー残基を伴う、典型的又は平均的HLA-A2.1結合ペプチドを同定している。通常生じる強力な結合残基は、2位(M)、4位(E,K)、6位(V)、及び8位(K)で同定されている。この同定されたモチーフは、多くの結合ペプチドの平均を示している。
【0079】
【表2】
HLA-A2.1制限モチーフ
【0080】
ここで定義されたように誘導されたペプチドモチーフは、特にストリンジェントではない。一部のHLA-A2.1結合ペプチドは、両ドミナントアンカー残基を有さず、かつこのドミナントアンカー残基に隣接するアミノ酸は、結合を許す又は許さないかにおいて大きな役割を果たしている。ここで説明された結合モチーフを伴うペプチドの全てが結合するわけではなく、モチーフを伴わないいくつかのペプチドが結合することがある。しかし、本モチーフは、結合が可能ないくつかのペプチドの同定をもたらすのに十分に妥当である。注意点としては、全てのMHC分子及び各モチーフが、残基2位及び9位のドミナントアンカーアミノ酸の間に6個のアミノ酸が配置されていることである。
【0081】
HER-2/neu ECD-ICD又はECD-PD融合タンパク質内のペプチドモチーフの同定の後、アミノ酸置換を、保存的又は非保存的に行うことができる。後者の種類の置換は、より強力及び/又はより広範な交差反応性を有する改善されたECD-ICD又はECD-PD融合タンパク質又はポリペプチドを作製することが意図されている。より強力なタンパク質又はペプチドの例は、天然のタンパク質又はポリペプチドに特異的なT細胞による認識に影響を及ぼすことなく、天然のタンパク質又はポリペプチドと同じMHC分子により高い親和性で結合するものである。広い交差反応性を伴うポリペプチドの例は、天然のポリペプチドよりも、より広範な交差反応性免疫応答を誘発する(すなわち、より広い範囲のMHC分子に結合する)ものである。同様に、ペプチドモチーフ間に存在しかつスペーサー機能を有する(例えば、MHC分子又はT細胞受容体と相互作用しない)ような1種以上のアミノ酸を、保存的又は非保存的に置換することができる。当業者には、1種以上のアミノ酸置換を含むポリペプチドは、T細胞認識を刺激する能力に関して本明細書に記されたものを含む、様々なアッセイ法により、有益又は有害な免疫学的相互作用に関して試験することができることは明らかである。
【0082】
本発明の範囲内の変異体は更に、もしくは代わりに、前述のような、該ポリペプチドの所望の免疫学的特性の及ぼす影響が最小であるようなアミノ酸の欠失又は付加を含む他の修飾を含むことができる。当業者には、所望の免疫学的特性が、完全長、天然のHER-2/neu ECD-ICD又はECD-PD融合タンパク質の特性と少なくともおおまかに同等であるならば、HER-2/neu ECD-ICD 又はECD-PD融合タンパク質の切断型又は非天然の伸長型を用いることができることは理解されると思われる。システイン残基は、変性時の不正確な分子間ジスルフィド橋の形成を防止するために、欠失するか、又は他のアミノ酸と置換することができる。KEX2プロテアーゼ活性が存在する酵母システムにおける発現を増強するための他の突然変異法は、隣接二塩基性アミノ酸残基の修飾に関する。
【0083】
本発明の融合タンパク質の調製
A. 融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチド
本発明は、HER-2/neu融合タンパク質をコードしている単離又は精製されたポリヌクレオチドに関する。本発明において、該融合タンパク質のアミノ酸配列をコードしているいずれかのヌクレオチド配列は、該融合タンパク質の発現を指示する組換え分子の作製に使用することができる。
【0084】
HER-2/neu融合ポリヌクレオチドの作製のための完全長コード配列又は相同変異体をクローニングするために、HER-2/neuヌクレオチド配列又はそれらの相補体のいずれかの部分から設計された標識されたDNAプローブを用いて、ゲノム又はcDNAライブラリーをスクリーニングし、該融合タンパク質の個別の成分の各々のコード配列を確定することができる。Her-2/neuヌクレオチド配列は、適当な哺乳類、例えばラット、マウス、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌなどに由来することができる。
【0085】
ある態様において、Her-2/neu配列は、ヒト、ラット又はマウスに由来する。マウスのHer-2/Neu配列は、図19(配列番号:11)に示されている。マウスのHer-2/neuは、下記のプライマーを用いて、マウス脳RNAから増幅することもできる:5'-プライマー:CCATGGAGCTGGCGGCCTGGTGCCGTTG (配列番号:12)及び3'-プライマー:GGCCTTCTGGTTCATACTGGCACATCCAGGC (配列番号:13)。マウスのHer-2/neuアミノ酸配列は、図20(配列番号:14)に示した。マウスHer-2/neuの変異体アミノ酸配列は、Nagataら、J. Immunol.、159:1336〜1343(1997)に記されている。
【0086】
このようなクローンは、完全長HER-2/neuタンパク質を発現しているクローンの適当な発現ライブラリーのスクリーニングにより単離することができる。このライブラリーの調製及びスクリーニングは、一般に、当業者に公知の方法を用いて行われ、このような方法は、Sambrookらの「分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning : A Laboratory Manual)」、Cold Spring Harbor Laboratories、コールドスプリングハーバー、NY(1989)に記されており、これは本明細書に参照として組入れられている。簡単に述べると、バクテリオファージ発現ライブラリーを、フィルターに配置しかつ写し取る。その後このフィルターを、検出試薬と共にインキュベーションする。本発明の状況において、「検出試薬」は、HER-2/neuタンパク質に結合することが可能ないずれかの化合物であり、これはその後当業者に公知の様々な手段のいずれかにより検出することができる。典型的検出試薬は、レポーター基に結合された、プロテインA、プロテインG、IgG又はレクチンのような「結合物質」を含む。好ましいレポーター基は、酵素、基質、補因子、インヒビター、色素、放射性核種、ルミネセンス基、蛍光基及びビオチンを含む。より好ましいレポーター基は、テトラメチルベンジジン又は2,2'-アジノ-ジ-3-エチルベンズ-チアゾリンスルホン酸のような基質とのインキュベーションにより検出されるホースラディッシュペルオキシダーゼである。HER-2/neuタンパク質を発現するゲノム又はcDNA配列を含むプラークは、当業者に公知の技術により単離及び精製される。適当な方法は、例えば、Sambrookらの「分子クローニング:実験マニュアル」、Cold Spring Harbor Laboratories、コールドスプリングハーバー、NY(1989)に記されている。
【0087】
コード配列の単離は、本明細書に記されたコード配列を基にデザインされた2種の縮重オリゴヌクレオチドプライマープールを用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により行うことができる。所望の核酸も、他の周知の増幅技術を用いてクローン化され得る。PCR、リガーゼ連鎖反応(LCR)、Qβ-レプリカーゼ増幅、及び他のRNAポリメラーゼ技術を含むインビトロ増幅法を通じて、当業者に示すのに十分なプロトコールの例は、Sambrook、及びAusubel、更には米国特許第4,683,202号;「PCRプロトコール、方法および適用の指針(PCR Protocols A Guide to Methods and Applications)」(Innisら編集、1990);Arnheim 及びLevinson C&EN、p.p.36〜47(1990年10月1日);The Journal of NIH Research、3:81〜94 (1991);Kwohら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、86:1173(1989);Guatelliら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、87:1874(1990);Lomellら、J. Clin. Chem.、35:1826(1989);Landegrenら、Science、241:1077〜1080(1988);Van Brunt、Biotechnology、8:291〜294(1990);Wuら、Gene、4:560(1989);及びBarringerら、Gene 89:117(1990)に記されている。改善されたインビトロ増幅された核酸のクローニング法は、Wallaceらの、米国特許第5,426,039号に開示されている。本発明の核酸の増幅における使用に適したプライマーは、本明細書に提供された配列を基に設計することができる。
【0088】
本発明において、融合タンパク質、その断片、又はその機能性同等物をコードしている本発明のポリヌクレオチドを用い、適当な宿主細胞において融合タンパク質、その断片、又はその機能性同等物の発現を指示する組換え核酸分子を作製することができる。このようなポリヌクレオチドによってコードされた融合ポリペプチドは、該コード配列の分子操作により変更することができる。
【0089】
遺伝暗号の固有の縮重度のために、実質的に同じ又は機能的に同等のアミノ酸配列をコードしている別のDNA配列を、該融合ポリペプチドの発現のための、本発明の実践において使用することができる。このようなDNA配列は、本明細書において説明されるコード配列又はそれらの相補体に、本明細書において説明される低、中又は高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能なものを含む。
【0090】
本発明において使用することができる変更されたヌクレオチド配列は、同じ又は機能的に同等の遺伝子産物をコードしている配列を生じるような様々なヌクレオチド残基の欠失、付加又は置換を含む。遺伝子産物それ自身は、アミノ酸残基の欠失、付加又は置換を含むことができ、このことがサイレント変化を生じ、その結果機能的に同等の抗原性エピトープを産生する。このような保存的アミノ酸置換は、関連した残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び/又は両親媒性の類似性を基に作製することができる。例えば負荷電したアミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含み;正荷電したアミノ酸は、リシン、ヒスチジン及びアルギニンを含み;類似した親水値を有する荷電していない極性ヘッド基を有するアミノ酸は、以下のものである:グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン及びチロシン;並びに、非極性ヘッド基を有するアミノ酸は、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、プロリン、メチオニン、及びトリプトファンである。
【0091】
本発明のヌクレオチド配列は、遺伝子産物のプロセッシング及び発現を修飾するような変更を含むが、これに限定されるものではない様々な目的のために、該融合タンパク質コード配列を変更するために操作することができる。例えば、突然変異は、当技術分野において周知の技術を用いて導入することができ、例えば、制限酵素部位の挿入又は欠失、グリコシル化パターンの変更、リン酸化、翻訳、開始及び/もしくは終結配列の作製及び/もしくは破壊、又はコード領域における変異の作製、更にインビトロ修飾の促進などである。当業者は、所定の核酸構築物において変更を作製する多くの方法を認めると思われる。このような周知の方法は、例えば位置指定突然変異、縮重オリゴヌクレオチドを使用するPCR増幅、核酸を有する細胞の化学変異原性物質又は放射線照射への曝露、所望のオリゴヌクレオチドの化学合成(例えば、巨大核酸を作製するためのライゲーション及び/又はクローニングによる結合)又は他の周知の技術(例えば、Gilimanら、Gene 8:81〜97(1979);Hutchinsonら、J. Biol. Chem.、253:6551(1978);Robertsら、Nature、328:731〜734(1987)を参照のこと)を含む。これらの操作は、該融合ポリペプチドの免疫原性を破壊しないことが好ましい。
【0092】
ある本発明の態様において、融合タンパク質のコード配列は、当技術分野において周知の化学的方法を用いて、全体又は一部を合成することができる(例えば、Caruthersら、Nuc. Acids Res. Symp. Ser.、7:215〜233(1980);Creaら、Nuc. Acids Res. 9(1 0):2331(1980);Matteucciら、Tetrahedron Letter、21:719(1980);及び、Chowら、Nuc. Acids Res.、9(12):2807〜2817(1981)を参照のこと)。
【0093】
B. ポリペプチド合成
あるいは、前記融合ポリペプチドそれ自身を、アミノ酸配列の全部又は一部を合成する化学的方法を用いて作製することができる。例えば、ペプチドは固相法で合成することができ、例としてアミノ酸を連続的に付加しアミノ酸鎖を伸長させる、メリフィールド固相合成法がある(Merrifield、J. Am. Chem. Soc.、85:2149〜2146 (1963))。ポリペプチドの自動合成装置は、Perkin Elmer Biosystems社(フォスターシティ、CA)などの供給業者から市販されており、かつ一般に製造業者の指示に従い操作することができる。その後合成されたペプチドは、樹脂から切断され、かつ例えば分取高速液体クロマトグラフィーなどで精製することができる(Creighton、タンパク質構造および分子の原理(Proteins Structures and Molecular Principles)」、50〜60 (1983)参照)。この合成融合ポリペプチドの組成は、アミノ酸分析又は配列決定により確定することができる(例えば、エドマン分解法;Creighton、「タンパク質、構造と分子の原理(Proteins, Structures and Molecular Principles)」、pp. 34〜49 (1983)参照)。
【0094】
加えて、非古典的アミノ酸又は化学的アミノ酸アナログを、該配列に置換又は付加として導入することができる。非古典的アミノ酸は、概して、通常のアミノ酸のD-アイソマー、α-アミノイソ酪酸、4-アミノ酪酸、Abu、2-アミノ酪酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-アミノヘキサン酸、Aib、2-アミノイソ酪酸、3-アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β-アラニン、フルオロ-アミノ酸、デザイナー(designer)アミノ酸、例えばβ-メチルアミノ酸、Cα-メチルアミノ酸、Nα-メチルアミノ酸、及びアミノ酸アナログを含むが、これらに限定されるものではない。更に、アミノ酸は、D(右旋性)又はL(左旋性)であることができる。
【0095】
C. 連結基
別の態様において、融合タンパク質のポリペプチド、例えばECD及びICD又はECD及びPDは、連結基を介して連結される。この連結基は、例えばスクシンイミジル-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(SMCC)などを含む化学架橋剤であることができる。この連結基は、例えばポリグリシン連結基を含む付加アミノ酸配列であることもできる。
【0096】
具体的な態様において、該融合タンパク質内の各ポリペプチドのコード配列は、それらのアミノ末端又はカルボキシル末端に、いずれかの順で結合されたペプチドを介して、直接結合している。
【0097】
あるいは、アミノ酸リンカー配列を用い、第一及び第二のポリペプチド構成要素を、各ポリペプチドの二次及び三次構造への折畳みを確実にするのに十分な距離で隔てることができる。このようなアミノ酸リンカー配列は、当技術分野において周知の常法を用いて該融合タンパク質に組込まれる。適当なペプチドリンカー配列は、下記の要因を基に選択することができる:(1)それらが、柔軟性のある延長されたコンホメーションを採用する能力があること;(2)それらが第一及び第二のポリペプチド上の機能性エピトープと相互作用することができる二次構造を採用することができないこと;並びに、(3)ポリペプチドの機能性エピトープと反応することがあるような疎水性又は荷電した残基が存在しないこと。好ましいペプチドリンカー配列は、Gly、Asn及びSer残基を含む。他のほぼ中性のアミノ酸、例えばThr及びAlaも、リンカー配列において使用することができる。リンカーとして有用に利用できるアミノ酸配列は、Marateaら、Gene、40:39〜46(1985);Murphyら、Proc. Natl. Acad, Sci. USA、83:8258〜8262(1986);米国特許第4,935,233号及び第4,751,180号に記されている。このリンカー配列は、一般に長さが1〜約50個のアミノ酸である。リンカー配列は、第一及び第二のポリペプチドが、機能性ドメインを分離しかつ立体障害を防ぐような非必須N末端アミノ酸領域を有する場合は不要である。
【0098】
他の化学リンカーは、炭水化物リンカー、脂質リンカー、脂肪酸リンカー、PEGのようなポリエーテルリンカーなどがある(例えば、Hermanson、Bioconjugate Techniques、(1996)参照)。
【0099】
D. 追加のポリペプチド
前述のように、融合タンパク質は、1個以上の追加のポリペプチドに連結することができる。例えば、この融合ポリペプチドは、該融合タンパク質の2種のポリペプチドの一方のコピーの1個以上に連結することができる。あるいは、この融合タンパク質は、追加の異種ポリペプチド、例えば前述のようにRa12又はLeIFに連結することができる。この融合ポリペプチドは、発現時の精製を容易にするために、アフィニティタグにも融合することができる。例えば、タグでコードされた複数のヒスチジン残基は、融合ポリペプチドの精製のために金属キレートアフィニティクロマトグラフィー法を使用することを可能にする。別のアフィニティタグ分子の例は、例えばStrep-タグ、PinPoint、マルトース結合タンパク質、グルタチオンS-トランスフェラーゼなどがある(例えば、Glick及びPasternak、「組換えDNAの分子生物学の原理及び用途(Molecular Biotechnology Principles and Applications of Recombinant DNA)」(第2版、1999)を参照)。
【0100】
ある態様において、該融合ポリペプチドは、任意にミコール酸、リポアリブドマニン(「LAMs」)、又はトレハロース誘導体のような脂質部分に連結される。
【0101】
前述のように、ある態様において、このような融合タンパク質は、該融合タンパク質をコードしている核酸の組換え発現により作製される。このような融合産物は、適切なコード枠において、当技術分野において公知の方法により互いに所望のアミノ酸配列をコードしている適当な核酸配列をライゲーションし、かつこの産物を当技術分野において公知の方法で発現することにより作製することができる。あるいは、このような産物は、例えばペプチド合成装置を使用するタンパク質合成法により作製することもできる。サイトカイン又はアジュバントのような他の分子のコード配列を更に、該融合ポリヌクレオチドに追加することができる。
【0102】
E. 配列修飾
免疫応答刺激能を保持している本発明の融合タンパク質の変異体は、一般に、前述の1種以上の局面で配列を修飾し、かつ得られた融合タンパク質を例えばT細胞応答又は抗体応答のような免疫応答刺激能についてアッセイすることにより同定することができる。例えば、このようなアッセイ法は一般に、T細胞を修飾された融合タンパク質と接触し、かつ応答をアッセイすることにより行うことができる。該融合タンパク質の個々のポリペプチド成分の自然に生じる変異体は、同じく例えば個別のポリペプチド又はそれらの変異体の各々をコードしているDNA配列による適当なcDNA又はゲノムライブラリーのスクリーニングにより、単離することができる。
【0103】
前述の配列修飾は、標準組換え技術又は修飾された融合タンパク質の自動合成を用いて、導入することができる。例えば、突然変異を、突然変異体配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することにより、特定の座位に導入することができ、天然の配列の断片にライゲーションすることができる制限酵素部位に隣接することができる。ライゲーション後、得られる再構築された配列は、所望のアミノ酸の挿入、置換、又は欠失を有するアナログをコードしている。
【0104】
あるいは、オリゴヌクレオチドが指定した位置特異的突然変異法を用いて、特定のコドンが必要な置換、欠失、又は挿入に従い変更された遺伝子を提供することができる。前述の別のセットを作製する方法の例は、Walderら、Gene、42:133(1986);Bauerら、Gene、37:73(1985);Craik、BioTechniques、1月:12〜19 (1985);Smithら、「遺伝子工学:原理及び方法(Genetic Engineering : Principles and Methods)」、Plenum Press (1981);及び米国特許第4,518,584号及び第4,737,462号に記されている。
【0105】
このようなHER-2/neu融合タンパク質の発現のために構築されたヌクレオチド配列における突然変異は、当然コード配列の読み枠を保存しなければならず、かつ、ハイブリダイズし、mRNAの翻訳に有害に作用するループ又はヘアピンのようなmRNA二次構造を形成することがあるような相補的領域を形成しないことが好ましい。突然変異部位は予め定められるが、突然変異の性質それ自身を予め定める必要ない。例えば、所定の部位での突然変異体の最適な特性を選択するために、ランダム突然変異を、標的コドンで行い、かつ発現されたHER-2/neu融合タンパク質突然変異体を所望の活性についてスクリーニングすることができる。HER-2/neu融合タンパク質をコードしているヌクレオチド配列の全ての突然変異がが、最終産物において発現されるわけではない。例えば、ヌクレオチド置換は、発現を増強すること、主として転写されたmRNAにおいてループ二次構造を避けること(例えば欧州特許出願第75,444A号参照)、又は例えば大腸菌発現のための周知の大腸菌優先(preference)コドンのような選択された宿主においてより容易に翻訳されるコドンを提供することが行われる。
【0106】
F. 発現ベクター
本発明のHer-2/neu融合タンパク質、及びそれらの変異体は、好ましくは組換えDNA法により作製される。このような方法は、HER-2/neu融合タンパク質をコードしているDNA配列の組換え発現ベクターへの挿入、並びに該融合タンパク質の発現及び好ましくは分泌を促進する条件下での、組換え微生物、哺乳類、真菌又は昆虫細胞発現システムにおける該DNA配列の発現を含む。本発明により提供されるHer-2/neu融合タンパク質をコードしているDNA配列は、cDNA断片及び短いオリゴヌクレオチドリンカーから、もしくは一連のオリゴヌクレオチドから構成され、組換え発現ベクターに挿入されかつ組換え転写ユニットにおいて発現されることが可能である合成遺伝子を提供することができる。
【0107】
組換え発現ベクターは、哺乳類、真菌、微生物、ウイルス、又は昆虫遺伝子に由来した適当な転写又は翻訳調節エレメントに機能的に連結されたHER-2/neu融合タンパク質をコードしているDNA配列を含む。このような調節エレメントは、転写プロモーター、転写を制御するための任意のオペレーター配列、適当なmRNAリボソーム結合部位をコードしている配列、並びに転写及び翻訳の終結を制御する配列を含む。複製起点及び形質転換体の認識を促進する選択マーカーを更に組込むことができる。
【0108】
DNA領域は、これらが互いに機能するように関連付けられる場合に、機能的に連結される。例えば、シグナルペプチドのためのDNA(分泌リーダー)は、それが該ポリペプチドの分泌に参加する前駆体として発現される場合、ポリペプチドのDNAに機能的に連結され;プロモーターは、それが該配列の転写を制御する場合は、コード配列に機能的に連結され;または、リボソーム結合部位は、それが翻訳を可能にするように位置される場合には、コード配列に機能的に連結される。一般に、「機能的に連結された」とは、連続した、且つ分泌リーダーの場合は読み枠内にあることを意味する。微生物において発現されるHER-2/neu融合タンパク質をコードしているDNA配列は、好ましくはmRNAへのDNAの転写を早期に終結することがあるイントロンを含まない。
【0109】
細菌のための発現ベクターは、周知のクローニングベクターpBR322(ATCC 3701 7)の遺伝的エレメントを含む市販のプラスミドに由来する選択マーカー及び細菌の複製起点を含むことができる。このような市販のベクターは、例えばpKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals社、ウプスラ、スウェーデン)、pGEMI(Promega Biotec社、マジソン、WI)、pET28b(Novagen社)及びpPDM(修飾されたpET28b、Corixa社)を含む。これらのpBR322「主鎖」セクションは、適当なプロモーター及び発現される構造配列に組みあわせられれいる。大腸菌は、典型的には大腸菌種由来のプラスミドであるpBR322誘導体を用いて形質転換される(Bolivarら、Gene、2:95(1977))。pBR322は、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性の遺伝子を含み、その結果、形質転換された細胞を同定するための簡単な手段を提供する。通常組換え微生物発現ベクターにおいて使用されるプロモーターは、β-ラクタマーゼ(ペニシリナーゼ)及びラクトースプロモーターシステム(Changら、Nature、275:615(1978);及びGoeddelら、Nature、281:544(1979))、トリプトファン(trp)プロモーターシステム(Goeddelら、Nucl. Acids Res.、8:4057(1980);及び欧州特許出願第36,776号)、並びにtacプロモーター(Maniatis、「分子クローニング:実験マニュアル」、Cold Spring Harbor Laboratory、p.412 (1982))を含む。特に有用な細菌発現システムは、ファージλPLプロモーター及びcI857ts熱不安定リプレッサーを使用する。アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手でき、λPLプロモーターの誘導体を組入れるプラスミドベクターは、大腸菌株JMB9(ATCC 37092)のレジデントであるプラスミドpHUB2、及び大腸菌RR1(ATCC 53082)のレジデントであるpPLc28を含む。
【0110】
酵母ベクター内の適当なプロモーター配列は、アルコールオキシダーゼ、メタロチオネイン、3-ホスホグリセレートキナーゼ(Hitzemanら、J. Biol. Chem.、255:2073(1980))、又はエノラーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、3-ホスホグリセラートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼのような他の解糖酵素(Hessら、J. Adv. Enzyme Reg.、7:149(1968);及びHollandら、Biochem.、17:4900(1978))のプロモーターを含む。酵母発現において使用するのに適当なベクター及びプロモーターは、更に欧州特許出願第73,657号に開示されている。
【0111】
好ましい酵母ベクターは、大腸菌における選択及び複製のためのpBR322由来のDNA配列(Ampr遺伝子及び複製起点)並びにグルコース-抑制ADH2プロモーター及びα-因子分泌リーダーを含む酵母DNA配列を用いて構成することができる。ADH2プロモーターは、Russellら、J. Biol. Chem.、258:2674(1982)及びBeierら、Nature、300:724(1982)に説明されている。異種タンパク質の分泌を指示する酵母α-因子リーダーは、プロモーターと発現されるべき構造遺伝子の間に挿入することができる(例えば、Kurjanら、Cell、30:933(1982);及び、Bitterら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、81:5330(1984)を参照)。リーダー配列は、その3'末端の近傍に、リーダー配列の外因性遺伝子への融合を促進するために、1個以上の有用な制限酵素部位を含むように修飾することができる。
【0112】
脊椎動物細胞の形質転換において使用するための発現ベクターにおける転写及び翻訳の制御配列は、ウイルス給源により提供される。例えば、通常使用されるプロモーター及びエンハンサーは、例えばポリオーマ、アデノウイルス2、シアミンウイルス(SV40)、及びヒトサイトメガロウイルスに由来する。SV40ウイルスゲノム由来のDNA配列、例えばSV40の起点、初期及び後期プロモーター、エンハンサー、スプライス部位、及びポリアデニル化部位を用いて、異種DNA配列の発現に必要な他の遺伝的エレメントを提供することができる。初期及び後期プロモーターは、SV40ウイルス複製起点も含む断片としてウイルスから容易に得られるので、両者とも特に有用である(Fiersら、Nature、273:113(1978))。ウイルス複製起点に位置されたHind III部位からBgl II部位に向かって伸びているおよそ250bpの配列が含まれるならば、比較的小さい又は大きいSV40断片も使用することができる。更に、このような制御配列が選択された宿主細胞と共存可能であるならば、ウイルスゲノムプロモーター配列、制御配列、及び/又はシグナル配列を使用することができる。構築することができるベクターの例は、Okayamaら、Mol. Cell Biol.、3:280(1983)に記されている。
【0113】
マウスの乳腺上皮細胞C127における哺乳類受容体cDNAの安定した高レベル発現のための有用なシステムは、Cosmanら、Mol. Immunol.、23:935(1986)により説明されたように、実質的に構築することができる。本発明の融合タンパク質の発現に適した真核細胞ベクターは、pDC406である(McMahanら、EMBO J.、10:2821(1991)、これは、SV40、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、及びエプスタイン-バールウイルス(EBV)に由来する調節配列を含む。他のベクターはpDC406に由来している、pDC409及びpDC410を含む。pDC410は、EBV複製起点のSV40ラージT抗原コード配列による置換により、pDC406に由来する。pDC409は、多クローニング部位の外側のBgl II 制限酵素部位が欠失され、多クローニング部位内に独自のBgl II部位を形成している点で、pDC406と異なる。CMVプロモーター、SV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウスの乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、又は哺乳類細胞における発現に有効であることが示された他のプロモーターの指示でタンパク質の発現を可能にするいずれか他のベクターも適している。
【0114】
一部の発現システムは、転写及び翻訳制御配列に加え、ネオマイシン、チミジンキナーゼ、ヒグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ、及びジヒドロ葉酸レダクターゼの遺伝子増幅を提供するマーカーを有する。
【0115】
EBV複製起点を含むpDC406及びpDC409のような発現のベクターのエピソーム複製を可能にする有用な細胞株は、CV-1/EBNA(ATCC CRL 10478)である。CV-l/EBNA細胞株は、CV-l細胞株のエプスタイン-バールウイルス核抗原-I(EBNA-l)をコードしている遺伝子によるトランスフェクションにより誘導され、かつヒトCMV前初期エンハンサー/プロモーターで起動されるEBNA-lを構成的に発現する。
【0116】
哺乳類培養細胞における発現に好ましいベクターは、pFLAGCMV-1(Kodak社)、pcDNA3.1/hyg(Invitrogen社)及びpEE14-GS (CellTech社)を含む。
【0117】
G. 宿主細胞
形質転換された宿主細胞は、組換えDNA技術を用いて構築された発現ベクターで形質転換又はトランスフェクションされ、かつ本発明のHER-2/neu融合タンパク質コードしている配列を含む細胞である。形質転換された宿主細胞は、所望のHER-2/neu融合タンパク質を発現することができるが、HER-2/neu DNAのクローニング又は増幅目的で形質転換された宿主細胞は、HER-2/neu融合タンパク質を発現する必要はない。好ましくは発現されたHer-2/neu融合タンパク質は、選択されたDNAに応じて、培養培地又は上清に分泌される。当業者は、Her-2/neu融合タンパク質が培養上清に分泌された場合は、これらは培養上清中に溶解することを理解するであろう。
【0118】
外因性ヌクレオチド配列の宿主細胞への導入のための周知の手段のいずれかを用いて、発現ベクターを導入することができる。これらは、Superfect(Qiagen社)などの試薬、リポソーム法、リン酸カルシウムトランスフェクション法、ポリブレン(polybrene)、プロトプラスト融合法、電気穿孔法、微量注入法, プラスミドベクター、ウイルスベクター、微粒子銃アクセレーション(遺伝子銃)、又はクローン化されたゲノムDNA、cDNA、合成DNA又は外因性遺伝物質を宿主細胞に導入するいずれか他の周知の方法の使用を含む(例えば前記Sambrookらの論文を参照のこと)。
【0119】
組換えタンパク質発現に適した宿主細胞は、適当なプロモーターの制御下での、原核細胞、酵母、又はより高等な真核細胞を含む。原核細胞は、グラム陰性菌又はグラム陽性菌、例えば大腸菌又はバチルス属(Bacilli)を含む。より高等な真核細胞は、以下に説明するような、昆虫又は哺乳類給源の確立された細胞株を含む。細胞-非含有翻訳システムも、DNA構築物に由来するRNAを用いるHER-2/neu融合タンパク質の作製に使用することができる。細菌、真菌、酵母、及び哺乳類細胞宿主における使用に適したクローニング及び発現ベクターは、例えば、Pouwelsら、「クローニングベクター:実験マニュアル(Cloning Vectors : A Laboratory Manual)」、Elsevier、ニューヨーク(1985)に説明されている。
【0120】
原核細胞発現宿主を、徹底的なタンパク質分解及びジスルフィドプロセッシングを必要としない、HER-2/neu融合タンパク質の発現に使用することができる。原核細胞発現ベクターは一般に、1種以上の表現型の選択マーカー、例えば抗生物質耐性を付与するか又は独立栄養要件を提供するタンパク質をコードしている遺伝子、宿主における増幅を確実にするために宿主により認識される複製起点を含む。形質転換に適した原核細胞宿主は、大腸菌(例えばBL21(DE3) CodonPlus E.coli)、枯草菌(Bacillus subtilis)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、並びにシュードモナス属(Pseudomonas)、ストレプトミセス属(Streptomyces)、及びブドウ球菌属(Staphylococcus)の様々な種を含むが、他の宿主も使用することができる。
【0121】
組換えHER-2/neu融合タンパク質は、P.パストリス(pastoris)のような酵母宿主において発現することもできる。他の属の酵母、例えばサッカロミセス(Saccharomyces)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)又はクルイベロミセス(Kluyveromyces)も使用することができる。ピチア(Pichia)における発現は、細菌シャトルベクター(例えば、pPICZシリーズ、Invitrogen社)への発現されるべき遺伝子のライゲーション、このベクターによる酵母の形質転換、及びこの酵母ゲノムのアルコールオキシダーゼ(AOX)座への染色体組込みにより行われる。その後組換え酵母の選択は、例えばZeocin (Invitrogen社)を用いて行われ、かつタンパク質発現は、増殖培地へのメタノールの添加により誘導される(Higginら、「ピチア(Pichia)プロトコール」、Methods in Molecular Biology、Vol. 103、Humana Press (1998))。タンパク質発現に適したピチア(Pichia)株は、例えばSMDl168ピチア(Pichia)株を含む。ESPシステム(Stratagene社)のような他の方法を基にした発現システムも使用することができる。
【0122】
適当な酵母の形質転換プロトコールは、当業者に公知である。 Hindらの論文(Proc. Natl. Acad. Sci. USA、75:1929 (1978))に記された技術の例は、0.67%酵母窒素ベース、0.5%カザアミノ酸、2%グルコース、10mg/mlアデニン、及び20mg/mlウラシルからなる選択培地におけるTrp+形質転換体の選択に関係している。ADH2プロモーターを含むベクターにより形質転換された宿主株は、80mg/mlアデニン及び80mg/mlウラシルを補充した1%酵母エキス、2%ペプトン、及び1%グルコースからなる濃縮培地(rich medium)において、発現のために増殖することができる。ADH2プロモーターの抑制解除は、培地グルコースが使い果たされた時点で生じる。粗酵母上清を、濾過により収集し、かつ更なる精製まで4℃で保存する。
【0123】
様々な哺乳類又は昆虫(例えば、Spodoptera又はTrichoplusra)細胞培養システムも、同じく組換えポリペプチドの発現に使用することができる。昆虫細胞における異種ポリペプチドの産生のためのバキュロウイルスシステムは、例えばLuckowら、BioTechnology、6:47(1988)において検証されている。適当な哺乳類宿主細胞株の例は、Gluzman、Cell、23:175(1981)に記されたサル腎細胞のCOS-7株、及び例えばCV-1/EBNA (ATCC CRL 10478)、L細胞、C127、3T3、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)、COS、NS-1、HeLa、ヒト胚腎細胞(HEK 293)及びBHK細胞株などを含む、適当なベクターの発現が可能であるような他の細胞株を含む。哺乳類発現ベクターは、非転写エレメント(例えば、複製起点、発現されるべき遺伝子に連結された適当なプロモーター及び/又はエンハンサー、及び5'又は3'フランキング非転写配列)並びに5'又は3'非翻訳配列(例えば、必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位、並びに転写終結配列)を含むことができる。好ましい哺乳類発現システムは、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株である。
【0124】
H. 本発明の融合タンパク質の精製
精製されたHER-2/neu融合タンパク質は、本発明のDNAの組換え翻訳産物の発現に適当な宿主/ベクターシステムの培養、その後の培養培地又は細胞抽出物からの精製により調製することができる。例えば、組換えポリペプチドを培養培地に分泌するシステムの上清は、最初に例えばAmicon又はMillipore Pellicon限外濾過ユニットのような市販のタンパク質濃縮フィルターを用いて濃縮することができる。濃縮段階の後、この濃縮物を適当な精製マトリックスに適用することができる。例えば、適当なアフィニティマトリックスは、適当な支持体に結合されたカウンター構造(counter structure)タンパク質(すなわち、HER-2/neu融合タンパク質が構造を基に特異的相互作用で結合しているようなタンパク質)又はレシチンもしくは抗体分子を含むことができる。
【0125】
あるいは、陰イオン交換樹脂、例えば、マトリックス又はペンダントジエチルアミノエチル(DEAE)基を有する基質を使用することができる。これらのマトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、ポリスチレン、セファロース又は他の種類のタンパク質精製において通常使用されるものであることができる。あるいは、陽イオン交換工程を使用することができる。適当な陽イオン交換体は、スルホプロピル基又はカルボキシメチル基、好ましくはスルホプロピル基を含む様々な不溶性マトリックスを含む。ゲル濾過クロマトグラフィーも、HER-2/neu融合タンパク質の精製の手段を提供する。本発明の融合タンパク質は、好ましくは例えばmonoQカラム又はQセファロース高速クロマトグラフィーを用いる、陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製される。
【0126】
アフィニティクロマトグラフィーは、HER-2/neu融合タンパク質を精製する別の好ましい方法である。例えば、HER-2/neu融合タンパク質に対するモノクローナル抗体は、当技術分野において周知の方法を使用することによる、アフィニティクロマトグラフィー精製において有用である。
【0127】
最後に、疎水性RP-HPLC培地(例えば、ペンダントメチル又は他の脂肪族基を有するシリカゲル)を使用する1種以上の逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)工程を用いて、更にHER-2/neu融合タンパク質組成物を精製することができる。前述の精製工程の一部又は全部は、様々な組合せにおいて、均質な組換えタンパク質又はポリペプチドを提供するために使用することもできる。
【0128】
細菌培養において産生される組換えHER-2/neu融合タンパク質は、細胞ペレットからの最初の抽出、その後濃縮、塩析、水性イオン交換又はサイズ排除クロマトグラフィーの工程の1種以上により得られる。高速液体クロマトグラフィー(HPLC)は、最終精製工程のために使用することができる。組換えHER-2/neu融合タンパク質の発現において使用される微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、音波処理、機械的破壊又は細胞溶解剤の使用を含む、いずれか常法により破壊することができる。
【0129】
分泌タンパク質としてHER-2/neu融合タンパク質を発現する酵母の発酵は、精製を非常に簡素化する。大規模発酵において得られる分泌された組換えタンパク質は、Urdalら、J. Chromatog.、296:171(1984)に記されたものに類似の方法で精製することができる。この参考文献は、分取HPLCカラム上での組換えヒトGM-CSFの精製のための、2段階の逐次逆相HPLC工程を説明している。
【0130】
組換え培養において合成されたHER-2/neu融合タンパク質の調製は、培養物からHER-2/neu融合タンパク質を回収するために行われた精製工程によって量及び特徴が左右されるタンパク質を含む、非HER-2/neu細胞成分を含むことができる。これらの成分は、通常酵母、原核生物又は非ヒト真核生物給源であることができる。このような調製物は、典型的にはその給源種において天然に認められるHER-2/neuタンパク質に通常会合し得る他のタンパク質を含まない。
【0131】
自動合成は、本発明のタンパク質及びポリペプチド調製の別法を提供する。例えば、市販の固相技術、例えばアミノ酸が成長しているアミノ酸鎖に逐次追加されるメリフィールド固相合成法のようなもののいずれかを用いることができる(Merrifield、J. Am. Chem. Soc.、85:2149〜2146(1963)参照)。ポリペプチドの自動合成のための装置は、Applied Biosystems社(フォスターシティ、CA)などの供給業者から市販されており、かつ一般に製造業者の指示に従い操作することができる。
【0132】
一般に、本明細書に記されたようなポリペプチド(融合タンパク質を含む)及びポリヌクレオチドは単離されている。「単離された」ポリペプチド又はポリヌクレオチドは、その当初の環境から取り出されたものである。例えば、天然のタンパク質は、天然のシステムにおいて共存する物質の一部又は全部から分離される場合に、単離される。好ましくは、このようなポリペプチドは、少なくとも約90%の純度、より好ましくは少なくとも約95%の純度、及び最も好ましくは少なくとも約99%の純度である。ポリヌクレオチドは、例えば、天然の環境の一部ではないようなベクターにクローニングされる場合に、単離されているとみなされる。
【0133】
結合物質
本発明は更に、本発明のHER-2/neu融合タンパク質に特異的に結合する、抗体及びそれらの抗原結合断片のような物質を提供する。本明細書で使用される抗体、又はそれらの抗原結合断片は、これが検出可能なレベル、すなわちバックグラウンドシグナル(例えばELISA内で)の少なくとも2倍以上で、HER-2/neu融合タンパク質と反応し、かつ類似の条件下で無関係のタンパク質とは検出可能なように反応しない場合に、HER-2/neu融合タンパク質に「特異的に結合」すると称される。本明細書で使用される「結合」とは、複合体が形成されるような、2個の個別の分子間の非共有結合的会合を意味する。結合能は、例えば複合体形成のための結合定数を決定することにより評価することができる。この結合定数は、複合体の濃度を、成分濃度の積で除算し、得られる。一般に、本発明の状況では、複合体形成の結合定数が約103 L/molを越える場合に、2種の化合物が「結合」すると称される。この結合定数は当技術分野において周知の方法を用いて決定される。
【0134】
結合物質は、更に本明細書に記された代表的アッセイ法を用いて、患者を、乳癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌又は前立腺癌などの癌の有無で識別することが可能である。別の表現をすると、HER-2/neu融合タンパク質に結合する抗体又は他の結合物質は、該疾患を有する患者の少なくとも約20%において癌の存在を示すシグナルを発生し、かつ癌を有さない個体の少なくとも約90%において疾患の非存在を示す陰性シグナルを発生するであろう。結合物質がこの要件を満足するかどうかを決定するために、癌を有する又は有さない患者(標準の臨床検査により決定された)由来の生物試料(例えば血液、血清、血漿、尿及び/又は腫瘍生検標本)は、該結合物質に結合するポリペプチドの存在について、本明細書に記されたようにアッセイすることができる。該疾患を伴う又は伴わない試料の十分に有意な数をアッセイしなければならないことは明らかである。各結合物質は、前述の基準を満たさなければならないが;しかし、当業者は、結合物質を感度を向上するために組合せて使用することができることを認めると思われる。
【0135】
前記要件を満たすいずれかの物質は、結合物質であることができる。例えば結合物質は、ペプチド成分を伴う又は伴わないリボソーム、RNA分子又はポリペプチドであることができる。好ましい態様において、結合物質は、抗体又はその抗原結合断片である。抗体は、当業者に公知の様々な技法のいずれかにより調製することができる。例えばHarlow及びLane、「抗体:実験マニュアル(Antibodies : A Laboratory Manual)」、Cold Spring Harbor Laboratory、1988年を参照のこと。一般に、抗体は、本明細書に記したモノクローナル抗体の作製、又は組換え抗体の作製をもたらすための、抗体遺伝子の適当な細菌又は哺乳類細胞宿主へのトランスフェクションによる方法を含む、細胞培養技術により作製することができる。ある技法おいて、例えば融合ポリペプチド又は対象となる融合タンパク質の個々のポリペプチドの間の接合点に相当する配列(「接合領域」と称される)を含む免疫原が、最初に、広範な種類の哺乳類のいずれか(例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ又はヤギ)に注射される。この工程において、対象となる融合タンパク質又は本発明の融合タンパク質の接合領域は、修飾を伴わない免疫原として利用することができる。あるいは、特に比較的短い配列について、該配列がウシ血清アルブミン又はキーホールリムペットヘモシアニンのような担体タンパク質に連結されている場合に、優れた免疫応答が誘発される。この免疫原は、動物宿主に、好ましくは1回以上の追加免疫を含む予め定められた投与スケジュールに従い注射され、かつ動物は、定期的に採血される。次に該融合ポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体は、このような抗血清から、例えば適当な固体支持体に結合した融合ポリペプチドを用いるアフィニティクロマトグラフィーにより、精製される。
【0136】
本発明の融合タンパク質に対して生じるポリクローナル抗体は、対象となる融合タンパク質とは特異的に免疫反応性であるが、該融合タンパク質の個々のポリペプチド成分とは反応性でないようなポリクローナル抗体のみを得るように選択することができる。この選択は、対象となる融合タンパク質の個々のポリペプチド成分と交差反応する抗体の消去(subtracting)により行うことができる。
【0137】
あるいは、融合タンパク質の個々のポリペプチド成分の各々又は全てを認識する抗体は、本発明において有用である。
【0138】
対象となる免疫原性融合ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体は、例えば、Kohler及びMilstein(Eur. J. Immunol.、6:511〜519(1976))の技術、及びその改良法を用いて調製することができる。簡単に述べると、これらの方法は、所望の特性を有する抗体を産生することが可能である(すなわち、対象となる融合ポリペプチドと反応性がある)不死化された細胞株の調製に関する。このような細胞株は、例えば前述のように免疫処置した動物から得られた脾細胞から作製することができる。その後脾細胞は、例えば骨髄腫細胞融合パートナー、好ましくは免疫処置した動物と同系のものとの融合により、不死化される。様々な融合技法を用いることができる。例えば脾細胞及び骨髄腫細胞を、非イオン性界面活性剤と数分間一緒にし、かつその後ハイブリッド細胞の増殖を維持するが骨髄腫細胞はそうではないような選択培地に低密度で播種する。好ましい選択技法は、HAT(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン)選択を使用する。十分な時間経過後、通常約1〜2週間の後、ハイブリッドのコロニーが認められる。単独のコロニーを選択し、かつそれらの培養上清を、融合ポリペプチドに対する結合活性について試験する。高い反応性及び特異性を有するハイブリドーマが好ましい。
【0139】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマコロニーを増殖する上清から単離することができる。加えて、ハイブリドーマ細胞株の、マウスなどの適当な脊椎動物の腹腔への注射のような様々な技術を、収量を増大するために使用することができる。その後モノクローナル抗体を、腹水又は血液から収集する。夾雑物は、クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈殿及び抽出のような常法により抗体から除去することができる。本発明の融合ポリペプチドは、例えばアフィニティクロマトグラフィー工程のような精製法において使用することができる。
【0140】
ある態様において、抗体の抗原結合断片の使用が好ましいことがある。このような断片は、通常の技術により調製することができるようなFab断片を含む。簡単に述べると、免疫グロブリンは、ウサギ血清からプロテインAビーズカラム上のアフィニティクロマトグラフィー(Harlow及びLane、「抗体:実験マニュアル(Antibodies : A Laboratory Manual)」、Cold Spring Harbor Laboratory、1988年)により精製し、かつパパイン消化し、Fab及びFc断片を得ることができる。Fab及びFc断片は、プロテインAビーズカラム上のアフィニティクロマトグラフィーにより分離することができる。
【0141】
本発明のモノクローナル抗体は、1種以上の治療的物質と併用することができる。これに関して適当な物質は、放射性核種、分化誘発剤、医薬品、毒物及びそれらの誘導体を含む。好ましい放射性核種は、90Y、123I、125I、131I、186Re、188Re、211At及び212Biである。好ましい医薬品は、メトトレキセート、並びにピリミジン及びプリンアナログを含む。好ましい分化誘発剤は、フォルボールエステル及び酪酸を含む。好ましい毒物は、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン、シュードモナスエンドトキシン、赤痢菌毒素、及びアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質を含む。
【0142】
治療的物質は、適当なモノクローナル抗体に直接又は間接(例えば連結基を介して)のいずれかで組み合わせ(例えば共有結合)することができる。物質と抗体の間の直接反応は、各々が他方と反応することが可能であるような置換基を有する場合に可能である。例えば、一方のアミノ基又はスルフヒドリル基のような求核基は、他方の、無水物又は酸ハロゲン化物のようなカルボニル含有基と、もしくは良い脱離基(例えばハロゲン化物)を有するアルキル基と反応することができる。
【0143】
あるいは、連結基を介して治療的物質及び抗体と結合することが望ましい。連結基は、結合能による相互作用を避けるために、物質から抗体を隔てるためのスペーサーとして機能することができる。連結基は、物質又は抗体上の置換基の化学反応性を増大し、その結果結合効率を増大するためにも利用することができる。化学反応性の増加も、さもなければ可能でないような、物質、又は物質上の官能基の利用を促進する。
【0144】
当業者には、ホモ-及びヘテロ-官能性の両方である様々な二官能性又は多官能性試薬(例えばPierce Chemical社(ロックフォード、IL)のカタログに記載されたもの)を連結基として利用できることは明らかである。結合は、例えばアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基又は酸化された炭水化物残基を介して作用することができる。例えば米国特許第4,671,958号を含む、このような方法を記した多くの参照文献がある。
【0145】
治療的物質は本発明の免疫複合体の抗体部分を含まないとより強力であるので、細胞への内在化の途中又はその時点で切断されるような連結基を使用することがより望ましい。多くの様々な切断可能な連結基が説明されている。これらの連結基からの物質の細胞内放出の機序は、ジスルフィド結合の還元による(例えば米国特許第4,489,710号)、光不安定性の結合への照射(例えば米国特許第4,625,014号)による、誘導されたアミノ酸側鎖の加水分解による(例えば米国特許第4,638,045号)、血清補体が媒介した加水分解による(例えば米国特許第4,671,958号)、及び酸で触媒された加水分解による(例えば米国特許第4,569,789号)ような切断を含む。
【0146】
1種以上の物質が抗体に結合することが望ましい可能性がある。ある態様において、物質の複数の分子が、1抗体分子に結合される。別の態様において、1よりも多い種類の物質が、1抗体に結合される。この特定の態様に関らず、1よりも多い物質との免疫複合体は、様々な方法で調製することができる。例えば、1種よりも多い物質を、抗体分子に直接結合するか、又は複数の結合部位を提供するリンカーを使用することができる。あるいは担体を使用することができる。
【0147】
担体は、直接又は連結基を介した共有結合を含む、様々な方法で物質を運搬することができる。適当な担体は、タンパク質、例えばアルブミン(例えば米国特許第4,507,234号)、ペプチド及び多糖、例えばアミノデキストラン(例えば米国特許第4,699,784号)などを含む。担体は、非共有結合又はリポソーム小胞(例えば米国特許第4,429,008号及び第4,873,088号)内などへの封入によっても物質を運搬することができる。放射性核種に特異的な担体は、放射性ハロゲン化された小分子及びキレート化合物を含む。例えば、米国特許第4,735,792号は、代表的放射性ハロゲン化された小分子及びそれらの合成を開示している。放射性核種キレート剤は、窒素及びイオウ原子を金属に結合するためのドナー原子として有するものを含む化合物、又は金属酸化物、放射性核種のキレートにより形成することができる。例えば、米国特許第4,673,562号は、代表的キレート化合物及びその合成を開示している。
【0148】
抗体及び免疫複合体の投与のためには、様々な経路を使用することができる。典型的には、投与は、静脈内、筋肉内、皮下又は切開された腫瘍の床(in the bed of a resected tumor)である。抗体/免疫複合体の正確な用量は、使用した抗体、腫瘍上の抗原密度、及び抗体のクリアランス速度によって決まることは明らかであろう。
【0149】
利用できる本発明の融合タンパク質に適当な抗体の例は、8029Kウサギポリクローナル抗体、マウスモノクローナルc-neu-3抗体(Calbiochem社)、及びマウスモノクローナルハーセプチン(Herceptin)抗体(米国特許第5,677,171号)を含むが、これらに限定されるものではない。モノクローナルc-neu-3抗体は、ECD-ΔPD 構築物において欠失された(1242〜1255 aa)PDドメインの逐次エピトープを認識する。ハーセプチン抗体は、ECDドメインのコンホメーション性エピトープに結合する。
【0150】
T 細胞
免疫療法用組成物は、同じく又はあるいは、本発明の融合タンパク質に特異的な T細胞を含む。このような細胞は、インビトロ又はエクスビボにおいて調製することができる。例えば、T細胞は、患者の骨髄、末梢血、又は骨髄もしくは末梢血の画分から、市販の細胞分離システムを用いて単離される(同じく米国特許第5,240,856号及び第5,215,926号;国際公開公報第89/06280号;第91/16116号及び第92/07243号を参照のこと)。あるいは、T細胞は、関連のある又はないヒト、非ヒト哺乳類、細胞株又は培養物に由来することができる。
【0151】
T細胞は、HER-2/neu融合ポリペプチド、HER-2/neu融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチド及び/又はこのような融合ポリペプチドを発現している抗原提示細胞(APC)により刺激されることがある。このような刺激は、該融合ポリペプチドに特異的なT細胞を生じる条件下及びそれに十分な時間で行われる。好ましくは、HER-2/neu融合ポリペプチド又はポリヌクレオチドは、特異的T細胞の形成を促進するためにミクロスフェアのような送達ビヒクル内に存在する。
【0152】
T細胞が該融合ポリペプチドで被覆されるか又は融合ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを発現している標的細胞を殺傷する場合に、T細胞は、HER-2/neu融合ポリペプチドに特異的であると考えられる。T細胞特異性は、様々な常法のいずれかで評価することができる。例えば、クロム放出アッセイ法又は増殖アッセイ法における、陰性対照と比較して溶解及び/又は増殖における刺激指数の2倍以上の増加は、T細胞の特異性を示している。このようなアッセイ法は、例えばChenら、Cancer Res.、54:1065〜1070(1994)に記されている。あるいは、T細胞増殖の検出は、様々な公知の技法により達成される。例えばT細胞増殖は、DNA合成の増大した速度を測定することにより検出することができる(例えば、T細胞のトリチウム化されたチミジンとのパルス標識培養、及びDNAに組入れられたトリチウム化されたチミジン量の測定)。HER-2/neu融合ポリペプチド(100ng/ml〜100μg/ml、好ましくは200ng/ml〜25μg/ml)との、3〜7日間の接触は、結果的にT細胞の増殖を少なくとも2倍増大する。前述のような2〜3時間の接触は、サイトカイン(例えば TNVF又はIFN-γ)放出レベルの2倍の増加がT細胞活性化の指標となるような標準のサイトカインアッセイ法を用いて測定される、T細胞の活性化を生じるはずである(Coliganら、「現在の免疫学プロトコール(Current Protocols in immunology)」、第1巻、Wiley Intersejence (Greene 1998)参照)。HER-2/neu融合ポリペプチド、ポリヌクレオチド又は融合ポリペプチド-発現APCに反応して活性化されたT細胞は、CD4+及び/又はCD8+である。HER-2/neu融合タンパク質に特異的なT細胞は、常法を用いて拡張することができる。好ましい態様において、T細胞は、患者に由来するか、又は関連のある又はないドナーに由来し、かつ刺激及び発現後該患者に投与される。
【0153】
治療目的で、HER-2/neu融合ポリペプチド、ポリヌクレオチド又はAPCに反応して増殖するCD4+又はCD8+ T細胞を、インビトロ又はインビボのいずれかで数を増やすことができる。このようなT細胞のインビトロにおける増殖は、様々な方法で行うことができる。例えば、T細胞は、インターロイキン-2のようなT細胞増殖因子及び/又はHER-2/neu融合ポリペプチドを合成する刺激細胞の添加を伴う又は伴わずに、HER-2/neu融合ポリペプチドに再度晒すことができる。あるいは、HER-2/neu融合タンパク質の存在下で増殖するような1種以上のT細胞は、クローニングにより数を増大することができる。細胞クローニングの方法は当技術分野において周知であり、かつ限定希釈を含む。拡張後、これらの細胞は、例えばChangら、Crit. Rev. Oncol. Haematol.、22:213(1996)に記されているように、患者に戻される。
【0154】
本発明の融合タンパク質を含有する薬学的組成物及びワクチン組成物
別の好ましい態様において、本発明は、HER-2/neu融合タンパク質、又はその変異体、及びHER-2/neu ICDタンパク質、又はその変異体を含有する組成物に関する。この融合タンパク質は、好ましくは本明細書に詳述されたような、本発明のECD-ICD融合タンパク質、ECD-PD融合タンパク質、又はそれらの変異体である。ICDタンパク質は、好ましくは図7に示したLys 676からVal 1255を含む領域に広がる(配列番号:1)ヒトICDタンパク質であるか、又は図8に示されたLys 677 からVal 1256を含むように広がるアミノ酸配列である(配列番号:2)ラットICDタンパク質である。あるいは、HER-2/neu ICDタンパク質は、免疫原性であるか又は増強された免疫原性を組成物に提供するような、ICDタンパク質の変異体又は一部である。例えば、ICDタンパク質の一部は、本明細書に記されたHER-2/neu PDタンパク質、本明細書に記されたHER-2/neu ΔPDタンパク質、本明細書に記されたHER-2/neu KDタンパク質、又はICDタンパク質のN末端又はC末端から1〜100個のアミノ酸のいずれかが順次除去されるようなHER-2/neu ICDタンパク質であることができる。加えて、本発明の変異体の他の態様を提供するためのアミノ酸置換は一般に、様々な方法で行うことができる。好ましい態様において、保存的アミノ酸置換が前述のように行われる。
【0155】
ある局面において、本明細書に記されたポリペプチド、ポリヌクレオチド、T細胞及び/又は結合物質は、薬学的組成物又は免疫原性組成物(すなわちワクチン)中に混入され得る。薬学的組成物は、1種以上のこのような化合物及び生理的に許容できる担体を含む。ワクチンは、1種以上のこのような化合物及び非特異的免疫応答エンハンサーを含む。非特異的免疫応答エンハンサーは、外因性抗原に対する免疫応答を増強するいずれかの物質であることができる。非特異的免疫応答エンハンサーの例は、アジュバント、生分解性ミクロスフェア(例えばポリラクティックガラクチド)及びリポソーム(その中に化合物が組入れられる、例えば米国特許第4,235,877号を参照)を含む。ワクチン調製物は、一般に例えばPowell及びNewman編集の「ワクチンデザイン(Vaccines Design)」(サブユニット及びアジュバント法)、Plenum Press (NY, 1995)に記されている。ワクチンは、CTL又はCD4+ T細胞から生じるような抗体免疫及び/又は細胞免疫を生じるように設計される。
【0156】
本発明の範囲内の薬学的組成物及びワクチンは、更に他の化合物も含み、これは生物学的に活性又は不活性であることができる。例えば、他の腫瘍抗原の1種以上の免疫原性部分が、該組成物又はワクチン内に、融合ポリペプチドに組込まれるか又は個別の化合物のいずれかで存在することができる。ポリペプチドは、例えば米国特許第4,372,945号及び第4,474,757号に開示されているように、他の巨大分子に複合化することができるが、必ずしも必要ではない。薬学的組成物及びワクチンは、一般に予防及び治療目的で使用される。
【0157】
薬学的組成物又はワクチンは、1種以上のHer-2/neu融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチド、例えば前述のHER-2/neu ECD-ICD及び/又はHER-2/neu ECD-PDを含み、その結果、該融合タンパク質がインサイチューで生成される。このようなポリヌクレオチドは、DNA、RNA、修飾された核酸又はDNA/RNAハイブリッドを含む。前述のようにポリヌクレオチドは、核酸発現システム、細菌及びウイルス発現システムを含む、当業者に公知の様々な送達システムのいずれかの中に存在してもよい。多くの遺伝子送達技術が当技術分野において周知であり、例えばこれは本明細書に引用されている参考文献Rolland、Crit. Rev. Therap. Drug Carrier System、15:143〜198(1998)に記されている。適当な核酸発現システムは、患者における発現に必要なDNA配列を含む(例えば、適当なプロモーター及び終結シグナル)。細菌送達システムは、その細胞表面上に融合タンパク質の免疫原性部分を発現するか又はこのようなエピトープを分泌するような細菌(例えばカルメット‐ゲラン杆菌)の投与に関連している。好ましい態様において、DNAは、ウイルス発現システム(例えばワクシニア、ポックスウイルス、レトロウイルス又はアデノウイルス)を用いて導入され、これは非病原性(欠損)、複製コンピテントウイルスの使用に関連している。適当なシステムは、例えばFisher-Hochら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、86:317〜321(1989);Flexnerら、Ann. N.Y Acad. Sci.、569:86〜103(1989);Flexnerら、Vaccine、8:17〜21(1990);米国特許第4,603,112号、第4,769,330号、第4,777,127号及び第5,017,487号;国際公開公報第89/01973号;英国特許第2,200,651号;欧州特許第0,345,242号;国際公開公報第91/02805号;Berkner、Biotechniques、6:616〜627(1988);Rosenfeldら、Science、252:431〜434(1991);Kollsら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、91:215〜219(1994);Kass-Eislerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90:11498〜11502(1993);Guzmanら、Circulation、88:2838〜2848(1993);及びGuzmanら、Cir. Res.、73:1202〜1207(1993)に記されている。このような発現システムにDNAを組込む技術は、当業者に周知である。DNAは、例えばUlmerら、Science、259:1745〜1749(1993)に記され、かつCohen、Science、259:1691〜1692(1993)において検証されたように、「剥き出し」であっても良い。剥き出しのDNAの取り込みは、細胞に効率的に輸送される、生分解性ビーズ上のDNAのコーティングにより増大され得る。ワクチンは、ポリヌクレオチド及びポリペプチド成分の両方を含むことができることは明らかである。このようなワクチンは、増強された免疫応答を提供することができる。
【0158】
ワクチンは、本明細書に提供されたポリヌクレオチド及び融合ポリペプチドの薬学的に許容される塩を含むことは明らかである。このような塩は、有機塩基(例えば、一級、二級及び三級アミン及び塩基性アミノ酸の塩)及び無機塩基(例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム及びマグネシウム塩)を含む、薬学的に許容される無毒の塩基から調製することができる。
【0159】
当業者に公知のいずれか適当な担体を、本発明の薬学的組成物において使用することができ、担体の種類は、投与の形態に応じて決まる。本発明の組成物は、例えば局所、経口、鼻腔内、静脈内、頭蓋内、腹腔内、皮下又は筋肉内投与を含む、投与に適当な方法で製剤することができる。皮下注射のような非経口投与については、、担体は、好ましくは水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックス又は緩衝液を含む。経口投与のためには、前述の担体又は固形担体、例えばマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、及び炭酸マグネシウムなどのいずれかを使用することができる。生分解性ミクロスフェア(例えばポリラクテートポリグリコレート)も、本発明の薬学的組成物のための担体として使用することができる。適当な生分解性ミクロスフェアは、例えば米国特許第4,897,268号;第5,075,109号;第5,928,647号;第5,811,128号;第5,820,883号;第5,8-に開示され、2/neu(5,8-2/neu)融合タンパク質は、生分解性ミクロスフェア内に封入されるか又はミクロスフェアの表面に会合されることができる。ある態様において、本明細書に記されたECD-ICD融合タンパク質は、生分解性ミクロスフェア内に封入されている。代わりにもしくは加えて、本明細書に記されたECD-PD融合タンパク質は、生分解性ミクロスフェア中に封入されている。ミクロスフェアは、例えば、ECD-ICD融合タンパク質及びECD-PD融合タンパク質の両方を含むことができる。好ましくは、ミクロスフェアは、約25μm未満、好ましくは約1μm〜約10μmである。リポソーム内への封入は、例えば米国特許第4,235,877号に開示されている。
【0160】
このような組成物は、更に緩衝液(例えば、中性に緩衝された生理食塩水又はリン酸緩衝された生理食塩水)、炭水化物(例えば、グルコース、マンノース、スクロース又はデキストラン)、マンニトール、タンパク質、ポリペプチド、又はグリシンのようなアミノ酸、酸化防止剤、静菌剤、EDTAもしくはグルタチオンのようなキレート剤、アジュバント(例えば水酸化アルミニウム)、レシピエント血液に対し製剤を等張、低張又はやや高張とする溶質、懸濁剤、増粘剤及び/又は保存剤も含む。あるいは、本発明の組成物は、凍結乾燥品として製剤することができる。化合物は、周知の技術を用いてリポソームに封入することもできる。
【0161】
様々な免疫応答エンハンサー又は免疫賦活物質のいずれかを、本発明のワクチンにおいて使用することができる。例えば、アジュバントを含むことができる。ほとんどのアジュバントは、抗原を急激な代謝から保護するように設計された物質、例えば水酸化アルミニウム又は鉱油など、及び免疫応答の刺激剤、例えばリピドA、百日咳菌(Bortadella pertussis)又はヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)由来のタンパク質のような物質を含む。適当なアジュバントは市販されており、例えばフロイントの不完全アジュバント及び完全アジュバント(Difco Laboratories社、デトロイト、MI);Merckアジュバント65(Merck 社、ラーウェイ、NJ);AS-2(SmithKline Beecham社);アルミニウム塩、例えば水酸化アルミニウムゲル(アルム)又はリン酸アルミニウム;カルシウム、鉄又は亜鉛の塩;アシル化されたチロシンの不溶性懸濁液;アシル化された糖;陽イオン性又は陰イオン性に誘導された多糖;ポリホスファザン;生分解性ミクロスフェア;モノホスホリルリピドA及びQuil Aがある。GM-CSF又はインターロイキン-2、-7、もしくは-12のようなサイトカイン類も、アジュバントとして使用することができる。
【0162】
本明細書に記されたワクチンにおいて、アジュバント組成物は、好ましくは主にTh1型の免疫応答を誘発するように設計されている。高レベルのTh1-型サイトカイン(例えばIFN-γ、TNF-α、IL-2及びIL-12)は、投与された抗原に対して細胞媒介した免疫応答を好んで誘発する傾向がある。対照的に、高レベルのTh2-型サイトカイン(例えば、IL-4、IL-5,、IL-6及びIL-IC)は、体液性免疫応答を好んで誘発する傾向がある。本明細書に記されたようなワクチンの適用後、患者は、Th1-及びTh2-型応答を含む免疫応答を維持すると思われる。応答が主にTh1型であるような好ましい態様において、Th1型サイトカインのレベルは、Th2-型サイトカインのレベルよりもより大きい程度に増大するであろう。これらのサイトカイン類のレベルは、標準のアッセイ法を用いて、容易にアッセイすることができるであろう。サイトカインファミリーの検証については、Mosmann及びCoffman、Ann. Rev. Imniunol.、7:145〜173(1989)を参照のこと。
【0163】
主にTh1型応答の誘発における使用が好ましいアジュバントは、例えばモノホスホリルリピドA、好ましくは3-デ-O-アシル化されたモノホスホリルリピドA(3D-MPL)の、アルミニウム塩との組合せを含む。MPLアジュバントは、Corixa社(ハミルトン、MT;米国特許第4,436,727号;第4,877,611号;第4,866,034号及び第4,912,094号を参照のこと)から入手できる。CpG-含有オリゴヌクレオチド(ここではCpGジヌクレオチドがメチル化されていない)も、主にTh1型応答を誘発する。このようなオリゴヌクレオチドは周知であり、かつ例えば国際公開公報第96/02555号及び第WP99/33488号に開示されている。免疫賦活性DNA配列も説明されており、例えばSatoら、Science、273:352(1996)に記されている。別の好ましいアジュバントは、サポニン、好ましくはQS21(Aquila社、米国)であり、これは恐らく単独で又は他のアジュバントと組合せて使用することができる。例えば、増強されたシステムは、モノホスホリルリピドA及びサポニン誘導体の組合せ、例えば国際公開公報第94/00153号に記されたようなQS21及び3D-MPLの組合わせに関連しており、国際公開公報第96/33739号に記されたようにQS21がコレステロールで失活されるより反応性の少ない組成物である。他の好ましい製剤は、水中油型乳剤及びトコフェロールを含む。水中油型乳剤中のQS21、3D-MPL及びトコフェロールに関連している特に強力なアジュバント製剤は、国際公開公報第95/17210号に開示されている。QS-21及び3D-MPLも、欧州特許第671 948 B1号に開示されている。
【0164】
他の好ましいアジュバントは、Montanide ISA 720(Seppic社、仏国)、SAF(Chiron社、カリフォルニア、米国)、ISCOMS(CSL社)、MF-59(Chiron社)、SBASアジュバントシリーズ(例えば、SBAS-2又はSBAS-4、SmithKline Beecham社から入手、リキセンサルト、ベルギー)、Detox(Corixa Corporation社、ハミルトン、MT)、RC-529 (Corixa社、USA)及びアミノアルキルグルコサミニド-4-リン酸(AGPs)がある。
【0165】
好ましい態様において、アジュバントはSBAS-2である(例えば欧州特許第73589B1号を参照)。
【0166】
本明細書に提供されたワクチンはいずれも、抗原、免疫応答エンハンサー及び適当な担体又は賦形剤の組合せを生じる周知の方法を用いて調製することができる。本明細書に記された組成物は、徐放性製剤の一部として投与することができる(すなわち、投与後に化合物の緩徐な放出をもたらすカプセル剤又はスポンジ(sponge)のような製剤)。このような製剤は、一般に周知の技術を用いて調製され(例えば、Coombesら、Vaccine、14:1429〜1438(1996)参照)、かつ例えば、経口、経直腸、又は皮下移植、もしくは所望の標的部位への移植により投与される。徐放性製剤は、担体マトリックス中に分散された及び/又は速度制御膜で囲まれた貯蔵器内に含まれた、ポリペプチド、ポリヌクレオチド又は抗体を含むことができる。
【0167】
このような製剤において使用するための担体は、生体適合性であり、かつ生分解性でもあり;好ましくは、この製剤は、比較的一定のレベルの活性成分放出を提供する。このような担体は、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)の微粒子に加え、ポリアクリレート、ラテックス、デンプン、セルロース、及びデキストランを含む。他の遅効型放出担体は、非液体親水性コア(例えば架橋した多糖又はオリゴ糖)を含み、任意にリン脂質のような両親媒性化合物を含有する外層を含むような、超分子バイオベクター(supramolecular biovector)を含む(例えば米国特許第5,151,254号及びPCT出願国際公開公報第94/20078号、第94/23701号及び第96/06638号を参照のこと)。徐放性製剤に含まれる活性化合物の量は、移植部位、放出の速度及び予定期間、並びに治療又は予防される病態の性質によって決まる。
【0168】
様々な送達ビヒクルのいずれかを、腫瘍細胞を標的とする抗原特異的免疫応答の形成を促進するために、薬学的組成物及びワクチンにおいて使用することができる。送達ビヒクルは、抗原提示細胞(APC)、例えば樹状細胞、マクロファージ、B細胞、単球及びAPCが有効であるように操作された他の細胞などがある。このような細胞は、抗原提示能を増大し、T細胞応答の活性化及び/又は維持を改善し、それ自身抗腫瘍作用を有し、及び/又は受取り手と免疫学的に共存性があるように(すなわち合致したHLAハロタイプ)遺伝的に修飾することができるが、これは必須ではない。APCは、一般に腫瘍及び腫瘍周辺(peritumoral)組織を含む様々な体液又は器官のいずれかから単離され、かつ自家、同種、同系又は異種の細胞であることができる。
【0169】
本発明のある好ましい態様は、樹状細胞又はその前駆体を抗原提示細胞として使用する。樹状細胞は、高度に強力なAPCであり(Banchereauら、Nature、392:245〜251 (1998))、かつ予防的又は治療的抗腫瘍免疫を誘起する生理的アジュバントとして有効であることが示されている(Timmermanら、Ann. Rev. Med.、50:507〜529(1999)参照)。一般に樹状細胞は、それらの典型的形状(インサイチューで星型、インビトロにおいて目視できる著しい細胞質の***(樹状突起))、それらの***を縮め(take up)かつ高い効率で抗原を提示する能力並びにそれらの天然のT細胞応答を活性化する能力を基に同定することができる。樹状細胞は、当然、通常インビボ又はエクスビボの樹状細胞においては認められない特異的細胞-表面受容体又はリガンドを発現するように操作することができ、かつこのような修飾された樹状細胞が、本発明により考察されている。樹状細胞の代わりに、分泌された小胞抗原を負荷した樹状細胞(エキソソームと称される)は、ワクチンにおいて使用することができる(Zitvogelら、Nature Med.、4:594〜600(1998)参照)。
【0170】
樹状細胞及び前駆体は、末梢血、骨髄、腫瘍浸潤細胞、腫瘍周辺組織浸潤細胞、リンパ節、脾臓、皮膚、臍帯血又はいずれか他の適当な組織もしくは液体から得ることができる。例えば末梢血から収集された単球を培養液に、GM-CSF、IL-4、IL-13及び/又はTNFαなどのサイトカインの組合せを添加することにより、エクスビボにおいて樹状細胞に分化することができる。あるいは、末梢血、臍帯血又は骨髄から収集されたCD34陽性細胞は、GM-CSF、IL-3、TNFα、CD40リガンド、LPS、flt3リガンド及び/又は樹状細胞の成熟及び増殖を誘導する他の化合物(複数)の組合せを培養培地に添加することにより、樹状細胞に分化することができる。
【0171】
樹状細胞は、通常「未成熟」及び「成熟」細胞に分類され、これは2種の良く特徴付けられた表現型の間で簡単に識別することができる。しかし、この命名法は、全ての可能性のある分化の中間段階を排除するように構築されるものではない。未成熟の樹状細胞は、抗原取り込み及びプロセッシングの高い能力を伴うAPCとして特徴付けられ、これはFcγ受容体及びマンノース受容体の高い発現と相関している。成熟表現型は、典型的にはこれらのマーカーの低い発現、しかしMHCクラスI 及びクラスII、接着分子(例えばCD54及びCD11)及び同時刺激分子(例えば、CD40、CD80、CD86及び4-1BB)のような、T細胞活性化に寄与し得る細胞表面分子の高い発現で特徴付けられる。
【0172】
APCは一般に、本発明の融合タンパク質(又はその変異体)をコードしているポリヌクレオチドでトランスフェクションされ、その結果融合タンパク質、又はその変異体が細胞表面に発現される。このようなトランスフェクションは、エクスビボで行われ、かつこのようなトランスフェクションされた細胞を含む組成物又はワクチンは、その後本明細書に記したように治療目的で使用することができる。あるいは、樹状又は他の抗原提示細胞を標的とする遺伝子送達ビヒクルを、患者に投与し、インビボで生じるトランスフェクションを得ることができる。樹状細胞のインビボ及びエクスビボのトランスフェクションは、例えば、一般に国際公開公報第97/24447号に開示されたもの、又はMahviら、Immunology and Cell Biology、75:456〜460(1997)に説明された遺伝子銃法のような当技術分野において公知の方法のいずれかを用いて行うことができる。樹状細胞の抗原負荷は、樹状細胞又は前駆細胞の、対象となる融合タンパク質、DNA(剥き出し又はプラスミドベクター内)又はRNAとの;または、融合タンパク質を発現している組換え細菌又はウイルス(例えば、ワクシニア、トリポックス、アデノウイルス又はレンチウイルスベクター)との、インキュベーションにより達成される。負荷する前に、対象となる融合タンパク質を、T細胞ヘルプ(help)(例えば担体分子)を提供する免疫学的パートナーに共有結合により複合化することができる。あるいは、樹状細胞を、複合化していない免疫学的パートナーで、個別に又は融合タンパク質存在下でパルスすることができる。
【0173】
ワクチン及び薬学的組成物は、シールされたアンプル又はバイアルのような、単回用量又は反復用量用の容器中で提供することができる。このような容器は、使用時まで製剤の無菌性を保つために、密閉式にシールされることが好ましい。一般に製剤は、油性又は水性のビヒクル中の懸濁剤、液剤または乳剤として貯蔵される。あるいは、ワクチン又は薬学的組成物は、使用直前に滅菌液体担体の添加のみを必要とする凍結乾燥状態で貯蔵することもできる。
【0174】
当業者には、ワクチンのためのHER-2/neu融合タンパク質又は核酸は、合成により調製するか、又は天然に由来することができることは明らかであると思われる。
【0175】
本発明の融合タンパク質に対する免疫応答
A. 本発明の融合タンパク質に対する免疫応答の検出
本発明のひとつの局面において、HER-2/neu融合タンパク質(又はHer-2/neu融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチド)は、HER-2/neu癌遺伝子が結合されている悪性腫瘍上に発現されていることを含むHER-2/neuタンパク質に対する免疫応答を形成するために使用される。このような悪性疾患の例は、乳癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌及び前立腺癌である。HER-2/neu融合タンパク質により一旦形成された、HER-2/neuタンパク質に対する免疫応答は長期に渡って存在し(long-lived)、かつ該タンパク質が試験の時点で体内に存在するか否かに拘らず、免疫処置後しばらくして検出することができる。HER-2/neu融合タンパク質に対する反応により形成されるHER-2/neuタンパク質に対する免疫応答は、CD4+又はCD8+ T細胞の特異的活性化もしくは抗体の有無、又は増強を試験することにより検出することができる。例えば、通常の技術(例えば、末梢血リンパ球のFicoll/Hypaque密度勾配遠心分離)により免疫処置された個体から単離されたT細胞は、HER-2/neu融合タンパク質と共にインキュベーションする。例えば、T細胞は、インビトロにおいて2〜9日間(典型的には4日間)37℃でHER-2/neu融合タンパク質と共に(典型的には全タンパク質5μg/ml又はHER-2/neuタンパク質を合成する細胞の等級化された数)インキュベーションされる。別のT細胞試料アリコートを対照として利用するために、HER-2/neu融合タンパク質の非存在下でインキュベーションすることが望ましい。
【0176】
CD4+又はCD8+ T細胞の特異的活性化は、様々な方法で検出することができる。特異的T細胞活性化の検出法は、T細胞の増殖、サイトカイン(例えばリンホカイン)の産生、又は細胞溶解活性の発生(すなわちHER-2/neu融合タンパク質に特異的な細胞傷害性 T細胞の形成)の検出を含む。CD4+ T細胞について、好ましい 特異的T細胞活性化の検出法は、T細胞の増殖の検出である。CD8+ T細胞について、好ましい特異的T細胞活性化の検出法は、細胞溶解活性の発生の検出である。
【0177】
T細胞増殖の検出は、様々な公知の技術により行うことができる。例えば、T細胞増殖は、DNA合成速度を測定することにより検出することができる。増殖するように刺激されているT細胞は、DNA合成の上昇した速度を示す。典型的DNA合成速度の測定法は、例えば、T細胞のトリチウム化されたチミジン、新たに合成されたDNAに組入れられるヌクレオシド前駆体とのパルス-標識培養である。組込まれるトリチウム化されたチミジンの量は、液体シンチレーション分光光度計を用いて決定することができる。T細胞増殖を検出する別法は、インターロイキン-2(IL2)産生、Ca2+灌流、又は3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムのような色素取り込みの増分の測定を含む。あるいは、リンホカイン(例えばインターフェロン-γ)の合成を測定することができ、もしくは完全なp185HER-2/neuタンパク質に応答することができるT細胞の相対数を定量化してもよい。
【0178】
B. 本発明の融合タンパク質に応答した抗体産生の検出
本発明は更に、T細胞が免疫原性であることに加え、B細胞を刺激し、HER-2/neu融合タンパク質を認識することが可能な抗体を産生することを明らかにするHER-2/neu融合タンパク質にも関する。このような抗体の検出は、HER-2/neu癌遺伝子が悪性腫瘍に結合されている悪性疾患を診断する別の方法を提供する。HER-2/neu融合タンパク質に対する抗体特異的(すなわち、約107L/mole以上の結合親和性を示す)は、血清及び腹水を含む様々な体液中に見ることができる。簡単に述べると、体液試料を、該融合タンパク質に対する抗体特異性が存在するかどうかを決定することが望ましい、ヒトのような恒温動物から単離することができる。体液は、免疫複合体がHer-2/neu融合タンパク質及びこの融合タンパク質に特異的な抗体の間に形成される条件下でそれに十分な時間、HER-2/neu融合タンパク質と共にインキュベーションされる。例えば、体液及びHER-2/neu融合タンパク質は、46℃で24〜48時間インキュベーションされる。インキュベーション後、反応混合液を、免疫複合体の存在について試験する。HER-2/neu融合タンパク質とHER-2/neu融合タンパク質に特異的な抗体の間に形成された1種以上の免疫複合体の検出は、例えばラジオイムノアッセイ法(RIA)及び酵素結合イムノソルベントアッセイ法(ELISA)のような様々な公知の技術により達成することができる。
【0179】
適当なイムノアッセイ法は、Davidら(米国特許第4,376,110号)の二重モノクローナル抗体サンドイッチイムノアッセイ法;モノクローナルポリクローナル抗体サンドイッチアッセイ法(Wideら、Kirkham及びHunter編集、「ラジオイムノアッセイ法(Radioimmunoassay)」、E. and S. Livingstone、エジンバラ、(1970));Gordonらの「ウェスタンブロット」法(米国特許第4,452,901号);標識リガンドの免疫沈降(Brownら、J. Biol. Chem.、255:4980〜4983 (1980));例えばRainesらの論文、J. Biol. Chem.、257:5154〜5160(1982)に記されたような酵素結合イムノソルベントアッセイ法;フルオロクロムの使用を含む免疫細胞化学的技術(Brooksら、Clin. Exp. Immunol.、39:477(1980));及び、活性の中和(Bowen-Popeら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、81:2396〜2400(1984))を含み、これらは全て本明細書に参照として組入れられている。前述のイムノアッセイ法に加え、多くの他のイムノアッセイ法を利用でき、これは米国特許第3,817,827号;第3,850,752号;第3,901,654号;第3,935,074号;第3,984,533号;第3,996,345号;第4,034,074号;及び第4,098,876号に開示されており、これらは全て本明細書に参照として組入れられている。
【0180】
検出目的のためのHER-2/neu融合タンパク質(すなわち抗原)は、標識又は非標識かのいずれであってもよい。非標識の場合、融合タンパク質は、凝集反応アッセイ法において使用されることがわかっている。加えて、非標識の融合タンパク質は、免疫複合体と反応性である標識分子と組合せるか、又は免疫グロブリンに特異的な抗体のような、HER-2/neu融合タンパク質に対する抗体と反応性である標識された抗体(二次抗体)と組合せて使用することができる。あるいは融合タンパク質は、直接標識することができる。標識された場合、例えば放射性同位元素、発蛍光団、酵素、発光物質、色素粒子などのレポーター基を含む。これら及び他の標識物は、当技術分野において周知であり、かつ例えば米国特許第3,766,162号;第3,791,932号;第3,817,837号;第3,996,345号;及び第4,233,402号に開示されており、これらは本明細書に参照として組入れられている。
【0181】
典型的にはELISAアッセイ法において、対象となる融合タンパク質が、マイクロタイターウェルの表面に吸着される。その後表面上の残余のタンパク質-結合部位が、ウシ血清アルブミン(BSA)、熱失活した正常ヤギ血清(NGS)、又はBLOTTO(保存剤、塩及び消泡剤を含む脂肪非含有乾燥ミルクの緩衝液)などの適当な物質でブロッキングされる。その後ウェルを、特異的抗体を含むことが疑わしい試料と共にインキュベーションする。試料は、希釈せずに適用するか、もしくはより頻繁には通常BSA、NGS、又はBLOTTOのようなタンパク質を少量(0.1〜5.0質量%)含有する緩衝液中に希釈することができる。特異的結合が生じるのに十分な時間インキュベーションした後、ウェルを洗浄し、非結合のタンパク質を除去し、かつ次にレポーター基で標識した抗-種(anti-species)特異的免疫グロブリン抗体と共にインキュベーションする。このレポーター基は様々な酵素から選択することができ、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及びグルコースオキシダーゼがある。特異的結合が生じるのに十分な時間経過後、次にウェルを再度洗浄し、非結合の複合体を除去し、かつ該酵素の基質を添加する。色を発色させ、ウェルの内容物の光学密度を、肉眼で又は装置により決定する。
【0182】
本発明のこの局面の好ましい態様において、レポーター基は対象となるHER-2/neu融合タンパク質に結合される。免疫複合体の検出工程は、実質的にあらゆる非結合のHER-2/neu融合タンパク質の除去、及びその後のレポーター基の存在又は非存在の検出に関連している。
【0183】
別の好ましい態様において、レポーター基は、HER-2/neu融合タンパク質に特異的な抗体への結合が可能な二次抗体に結合される。免疫複合体の検出工程は、(a)実質的にあらゆる非結合の抗体の除去、(b)二次抗体の添加、(c)実質的にあらゆる非結合の二次抗体の除去、及びその後の(d)レポーター基の存在又は非存在の検出が関連している。HER-2/neu融合タンパク質に特異的な抗体は、ヒトに由来し、二次抗体は、抗ヒト抗体である。
【0184】
免疫複合体検出の第三の好ましい態様において、レポーター基は、免疫複合体への結合が可能な分子に結合される。検出工程は、(a)該分子の添加、(b)実質的にあらゆる非結合の分子の除去、及びその後の(c)レポーター基の存在又は非存在の検出が関連している。免疫複合体への結合が可能な分子の例は、プロテインAである。
【0185】
免疫複合体を検出する様々な方法を本発明において使用することができることは、当業者には明らかである。これらの方法のいずれかにおける使用に適したレポーター基は、放射性同位元素、発蛍光団、酵素、発光物質、色素粒子などを含む。
【0186】
本発明の関連する局面において、HER-2/neu融合タンパク質と体液中のHER-2/neu融合タンパク質に特異的な抗体の間で形成される免疫複合体の検出は、HER-2/neu癌遺伝子が関連した悪性腫瘍に関してHER-2/neu融合タンパク質に関与している癌療法の効果をモニタリングするために使用することができる。治療開始前及びそれ以降に個体から採取された体液試料は、前述の方法論により免疫複合体について分析することができる。簡単に述べると、両方の試料中に検出された免疫複合体の数を比較する。第一の試料(治療前)に対する第二の試料(治療開始時以降)中の免疫複合体数の実質的変化は、治療がうまくいったことを反映している。
【0187】
癌療法
本発明の更なる局面において、本明細書に記された組成物は、乳癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌及び前立腺癌などの癌の免疫療法に使用することができる。このような方法において、典型的には薬学的組成物及びワクチンを患者に投与する。本明細書で使用される「患者」とは、恒温動物、好ましくはヒトを意味する。患者は、癌に罹患していてもしていなくとも良い。従って、前述の薬学的組成物及びワクチンを用いて、癌の発生を防止するか、又は癌に罹患した患者を治療することができる。悪性腫瘍の存在を含む癌は、当技術分野において一般に採用される診断基準を用いて診断することができる。薬学的組成物及びワクチンは、原発性腫瘍の外科的摘出及び/又は放射線療法又は従来の化学療法薬の投与などの治療の前又はそれ以降のいずれかに投与することができる。投与は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、皮内、経直腸、経膣、局所、舌下及び経口の経路を含む、いずれか適当な方法で行うことができる。
【0188】
特定の態様において、免疫療法は能動免疫療法であり、これは治療が、免疫応答を修飾する物質(例えば本明細書に提供されたような融合ポリペプチド及びポリヌクレオチド)の投与により腫瘍に対して反応するように、内在性宿主免疫系をインビボ刺激することに頼っている。
【0189】
他の態様において、免疫療法は、受動免疫療法であり、これは治療が、抗腫瘍作用を直接又は間接に変調することができかつ完全な宿主免疫系には不要であるような、確立された腫瘍-免疫反応性を伴う物質(エフェクター細胞又は抗体)の送達に関連している。エフェクター細胞の例は、前述のT細胞、Tリンパ球(例えばCD8+細胞傷害性Tリンパ球及びCD4+ Tヘルパー腫瘍浸潤リンパ球)、キラー細胞(ナチュラルキラー細胞及びリンホカインで活性化されたキラー細胞)、B細胞及び本明細書に記された融合タンパク質を発現している抗原提示細胞(樹状細胞及びマクロファージなど)を含む。本明細書において列挙された融合ポリペプチドに特異的なT細胞受容体及び抗体受容体は、クローン化され、発現され、及び養子免疫療法のために他のベクター又はエフェクター細胞に転移される。本明細書において提供された融合ポリペプチドは、受動免疫療法のための抗体又は抗イディオタイプ抗体(前述及び米国特許第4,918,164号)の産生のために使用することができる。
【0190】
エフェクター細胞は、一般に本明細書に記したようにインビトロにおける増殖による養子免疫療法のために十分量得ることができる。1個の抗原-特異性エフェクター細胞数の数十億個へのインビボにおける抗原認識を保持しながら増殖するための培養条件は、当技術分野において周知である。このようなインビトロ培養条件は、典型的には、多くはサイトカイン(IL-2など)及び未分化の支持細胞の存在中、抗原による間欠刺激を使用する。前述のように、免疫療法に十分な数の細胞を生成するために、本明細書において提供された免疫反応性融合ポリペプチドを用いて、急速に抗原特異性T細胞培養物を拡張することができる。特に樹状細胞、マクロファージ又はB細胞のような抗原提示細胞は、当技術分野において周知の技術を用いて、免疫反応性融合ポリペプチドでパルスされるか、又は1種以上のポリヌクレオチドでトランスフェクションされ得る。例えば、抗原提示細胞は、組換えウイルス又は他の発現システムにおける発現を増大するのに適したプロモーターを有するポリヌクレオチドでトランスフェクションすることができる。治療において使用するために培養されたエフェクター細胞は、増殖しかつ広範に分布し、かつインビボにおいて長期生存することができなければならない。培養されたエフェクター細胞を、IL-2が補充された抗原による反復刺激により、インビボで増殖しかつかなりの数で長期生存するように誘導することができることが研究で示されている(例えば、Cheeverら、Immunological Reviews、157:177(1997)参照)。
【0191】
あるいは、本明細書において列挙された融合ポリペプチドを発現しているベクターは、患者から採取された抗原提示細胞に導入され、かつ同じ患者への戻し移植のためにエクスビボにおいてクローン性に繁殖することができる。トランスフェクションされた細胞は、当技術分野において公知のいずれかの手段を用い、好ましくは滅菌型の静脈内、腔内、腹腔内又は腫瘍内への投与で、患者に再導入することができる。
【0192】
本明細書に記された治療的組成物の投与の経路及び頻度、更に用量は、個体毎に変動し、かつ常法を用いて容易に確立することができる。一般に、薬学的組成物及びワクチンは、注射(例えば、皮内、筋肉内、静脈内又は皮下)、鼻腔内(例えば吸引により)又は経口により投与される。好ましくは、1〜10回用量で、52週間にわたり投与される。好ましくは、1ヶ月間隔で6回用量が投与され、且つその後は追加免疫が定期的に施される。別のプロトコールが、個々の患者に適していることがある。適当な用量は、前述のように投与した場合に、抗腫瘍免疫応答を促進することが可能であり、かつ基本(すなわち未治療)レベルよりも少なくとも10〜50%高いような化合物の量である。このような反応は、患者における抗腫瘍抗体の測定によるか、又はインビトロにおいて患者の腫瘍細胞を殺傷することが可能な細胞溶解性エフェクター細胞のワクチン-依存型の形成により、モニタリングすることができる。このようなワクチンは、ワクチン投与した患者においてワクチン投与しない患者と比べて改善された臨床の転帰(例えば、より頻繁な寛解、完全又は部分的又は長期の疾患を伴わない生存)に繋がるような免疫応答の惹起も可能であるはずである。一般に、1種以上の融合ポリペプチドを含む薬学的組成物及びワクチンについて、各融合タンパク質の量は、宿主1kgにつき、約1μg〜5mg、好ましくは100μg〜5mg、及び最も好ましくは5μg〜250μgの範囲の用量で存在する。適当な投与サイズは、患者のサイズによって変動するが、典型的には約0.1ml〜約5 mlである。
【0193】
好ましくは、初回又は一次免疫は、例えば少なくとも1種のECD及び/又はICD又はPDを有するHER-2/neu融合タンパク質によって、並びに次回又は追加免疫は、例えば少なくとも1種のECD及び/又はICD又はPDを有するHer-2/neu融合タンパク質によって行われるであろう。免疫処置に好ましいECD-ICD及び/又はECD-PD融合タンパク質は、本明細書に記されたものを含む。当業者には、本発明が、完全なHER-2/neu融合タンパク質の使用に加え、Her-2/neu融合タンパク質の複数のペプチドへの***を意図していることは理解されるであろう。完全なp185HER-2/neuタンパク質もHER-2/neu ECDドメイン全体(又はHER-2/neu ECDドメインの一部)のアミノ酸配列を有するペプチドも、単独では免疫処置に使用されない。
【0194】
一般に、適当な用量及び治療様式は、治療及び/又は予防の利益を提供するのに十分な量の活性化合物(複数)を提供する。このような反応は、治療した患者において未治療の患者と比べて改善された臨床の転帰(例えば、より頻繁な寛解、完全又は部分的又は長期の疾患を伴わない生存)を確立することにより、モニタリングすることができる。予め存在するHER-2/neuタンパク質又は融合タンパク質に対する免疫応答の増加は、一般に改善された臨床の転帰に相関している。このような免疫応答は、一般に、治療の前後に患者から得られた試料を用いて行うことができる、通常の増殖アッセイ法、細胞傷害性アッセイ法、又はサイトカインアッセイ法を用いて評価することができる。
【0195】
癌の検出
A. 癌の検出法
一般に、癌は、患者から得た生物試料(血液、血清、血漿、尿及び/又は腫瘍生検標本など)中のHER-2/neuタンパク質及び/又はこのようなタンパク質をコードしているポリヌクレオチドの存在を基に患者において検出することができる。別の言い方をすると、このようなタンパク質は、例えば乳癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌などの癌の有無を示すためのマーカーとして使用することができる。本明細書に提供された結合物質は、一般に生物試料中の該物質に結合しているHER-2/neuタンパク質レベルの検出をもたらす。ポリヌクレオチドのプライマー及びプローブを使用し、HER-2/neu腫瘍タンパク質をコードしているmRNAレベルを検出することができ、このことは更に癌の有無の指標でもある。一般に、HER-2/neu腫瘍配列は、腫瘍組織において正常組織よりも少なくとも3倍高いレベルで存在しなければならない。
【0196】
試料中のポリペプチドマーカーの検出のための結合物質の使用については、当業者に公知の様々なアッセイ形式がある。例えばHarlow及びLane、「抗体:実験マニュアル(Antibodies : A Laboratory Manual)」、Cold Spring Harbor Laboratory, 1988年参照。一般に、患者における癌の有無は、(a)患者から得られた生物試料と結合物質との接触段階;(b)試料中の結合物質と結合するポリペプチドレベルの検出段階;及び(c)ポリペプチドの予め定められたカットオフ値との比較段階により決定することができる。
【0197】
好ましい態様において、本アッセイ法は、試料の残余からポリペプチドに結合しかつこれを除去するための固体支持体上に固定された結合物質の使用に関する。その後結合したポリペプチドは、レポーター基を含みかつ結合物質/ポリペプチド複合体に特異的に結合する検出試薬を用いて検出することができる。このような検出試薬は、例えば、ポリペプチド又は抗体に特異的に結合するような結合物質、もしくは結合物質に特異的に結合するような他の物質、例えば抗免疫グロブリン、プロテインG、プロテインA又はレクチンなどを含むことができる。あるいは、競合アッセイ法を利用することができ、ここにおいてポリペプチドは、レポーター基で標識され、かつ試料と結合物質のインキュベーション後に固定された結合物質に結合することが可能である。試料の成分が標識されたポリペプチドの結合物質への結合を阻害する程度は、試料の固定された結合物質との反応性の指標である。このようなアッセイ法における使用に適したポリペプチドは、前述のような、該結合物質が結合するような完全長HER-2/neu腫瘍タンパク質及びその一部、並びに該結合物質が結合するようなHER-2/neu融合タンパク質及びその一部である。
【0198】
固体支持体は、腫瘍タンパク質が付着することができるような当技術分野において公知のいずれかの物質であることができる。固体支持体は、例えばマイクロタイタープレート中の試験ウェル又はニトロセルロースもしくは他の適当な膜である。あるいは、支持体は、例えばガラス、ガラスファイバー、ラテックス又はポリスチレンもしくはポリ塩化ビニルのようなプラスチック材料のようなビーズ又はディスクである。支持体は更に、例えば米国特許第5,359,681号に開示されたもののような、磁気ビーズ又は光ファイバーセンサーであることもできる。この結合物質は、当業者に公知の様々な技術を用いて、固体支持体上に固定することができ、これらは、特許及び科学文献に十分に説明されている。本発明の文脈において、「固定」という用語は、吸着のような非共有結合的会合、及び共有結合的付着(物質と支持体上の官能基の間の直接の連結、又は架橋剤による連結)の両方を意味する。マイクロタイタープレートのウェル又は膜への吸着による固定が好ましい。このような場合、吸着は、結合物質の適当な緩衝液中での固体支持体との適当な時間接触することにより達成される。この接触時間は温度により変動するが、典型的には約1時間〜約1日の間である。一般に、プラスチック(ポリスチレン又はポリ塩化ビニル)製マイクロタイタープレートのウェルの、結合物質約10ng〜約10μg、好ましくは約100ng〜約1μgの範囲との接触が、適量の結合物質の固定に十分である。
【0199】
結合物質の固体支持体への共有結合的付着は、一般に支持体と結合物質上のヒドロキシル又はアミノ基のような官能基の両方と反応するであろう二官能性試薬と、支持体の第一の反応により達成される。例えばこの結合物質は、ベンゾキノンを用いるか、又は支持体上のアルデヒド基の、結合パートナーのアミン及び活性水素との縮合により、被覆された適当な高分子を有する支持体に共有結合的に付着することができる(例えば、Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, 1991、A12〜A13参照)。
【0200】
ある態様において、アッセイ法は、2-抗体サンドイッチアッセイ法である。このアッセイ法は、一般にはマイクロタイタープレート上のウェルである固体支持体上に固定されている抗体と、試料の最初の接触により行うことができ、その結果試料中のポリペプチドは、固定された抗体に結合することができる。次に非結合の試料が、固定されたポリペプチド-抗体複合体から除去され、かつレポーター基を含む検出試薬(好ましくは該ポリペプチドの異なる位置に結合することが可能な二次抗体)が添加される。その後固体支持体に結合された残留する検出試薬の量は、具体的なレポーター基に適した方法で決定される。
【0201】
より詳細には、前述のように一旦抗体が、支持体上に固定されると、支持体上の残りのタンパク質結合部位は、典型的にはブロッキングされる。例えばウシ血清アルブミン又はTween 20(登録商標)(Sigma Chemical社、セントルイス、MO)のようなブロッキング剤が当業者に公知である。その後固定された抗体は、試料とインキュベーションされ、かつポリペプチドは、該抗体と結合することが可能になる。試料は、インキュベーション前に、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)のような適当な希釈剤で希釈することができる。一般に適当な接触時間(すなわちインキュベーション時間)は、乳癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌又は前立腺癌を伴う個体から得られた試料中のポリペプチドの存在を検出するのに十分な期間である。好ましくは、接触時間は、結合及び非結合のポリペプチド間の平衡を達成するような少なくとも約95%の結合レベルに達するのに十分なものである。当業者は、平衡に到達するのに必要な時間が、ある期間をかけて生じる結合レベルのアッセイ法により容易に決定されることを認めるであろう。室温でのインキュベーション時間は、概して約30分で十分である。
【0202】
その後、非結合試料を、0.1%Tween20(登録商標)を含有するPBSのような適当な緩衝液により固体支持体を洗浄す、除去する。その後レポーター基を含む二次抗体が固体支持体に添加される。好ましいレポーター基は、先に列記された基を含む。
【0203】
その後検出試薬を、固定化した抗体-ポリペプチド複合体と共に、結合したポリペプチド検出するのに十分な時間インキュベーションする。適当な時間は通常ある期間に生じる結合レベルのアッセイ法により決定される。その後、非結合の検出試薬は除去され、かつ結合した検出試薬が、レポーター基を用いて検出される。レポーター基の検出に用いられる方法は、レポーター基の性質によって決まる。放射性基については、シンチレーション計数又はオートラジオグラフ法が一般に適している。分光学的方法は、色素、発色基及び蛍光基を検出するために使用される。ビオチンは、様々なレポーター基(市販の放射性もしくは蛍光基又は酵素)に結合されたアビジンを用いて検出される。酵素レポーター基は一般に、基質の添加(一般に特定の時間)、その後の反応生成物の分光学的又はその他の分析により検出される。
【0204】
乳癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌又は前立腺癌のような癌の有無を決定するために、固体支持体に結合し続けているレポーター基で検出されたシグナルは、一般に予め定められたカットオフ値に相当するシグナルと比較される。ある好ましい態様において、癌の検出のためのカットオフ値は、固定された抗体が癌を有さない患者の試料と共にインキュベーションされた場合に得られたシグナル中位値の平均である。一般に、予め定められたカットオフ値よりも標準偏差の3倍高いシグナルを発生する試料は、癌について陽性とみなされる。別の好ましい態様において、カットオフ値は、Sackettら、「臨床疫学:臨床用医薬品の基本的科学(Clinical Epideminology : Basic Science for Clinical Medicine)」、Little Brown and Co., 1985, p. 106〜7に記された方法に従いReceiver Operator Curveを用いて決定される。簡単に述べると、この態様において、カットオフ値は、診断試験結果の各々の可能性のあるカットオフ値に相当している真の陽性率(すなわち感度)及び偽陽性率(100%特異性)のプロット対により決定される。左上隅(すなわち最大面を囲う値)に最も近いプロット上のカットオフ値は、最も正確なカットオフ値であり、かつこの方法で決定されたカットオフ値よりも高いシグナルを発生する試料は、陽性であるとみなし得る。あるいは、カットオフ値は、偽陽性率を最小化するために、プロットに沿って左側にシフトされるか、又は偽陰性率を最小化するために、右側にシフトされる。一般に、この方法で決定されたカットオフ値よりも高いシグナルを発生する試料は、癌について陽性とみなされる。
【0205】
関連した態様において、アッセイ法は、フロースルー又はストリップ試験形式において行うことができ、ここで該結合物質は、ニトロセルロースのような膜上に固定される。フロースルー試験において、試料中のポリペプチドは、試料が膜を通過する際に、固定された結合物質に結合する。その後第二の標識された結合物質は、第二の結合物質を含有する溶液が膜を通って流れる際に、結合物質-ポリペプチド複合体に結合する。次に結合された第二の結合物質の検出が前述のように行われる。ストリップ試験形式においては、結合物質が結合した膜の一方の端が、試料を含有する溶液中に浸漬される。試料は膜に沿って、第二結合物質を含む領域を通りかつ固定された結合物質の領域へと移動する。固定された抗体の領域の第二結合物質の濃度は、癌の存在を示す。典型的には、その部位の第二結合物質の濃度は、線状のようなパターンを形成し、これは容易に目視できる。このようなパターンが存在しない場合は、結果は陰性である。一般に、膜に固定された結合物質の量は、生物試料が前述の形式の2-抗体サンドイッチアッセイ法において陽性シグナルを発生するのに十分なポリペプチドのレベルを含む場合に、肉眼により識別できるパターンを形成するように選択される。このようなアッセイ法で使用するのに好ましい結合物質は、抗体及びその抗原-結合断片である。好ましくは、膜上に固定された抗体量は、約25 ng〜約lμg、及びより好ましくは約50ng〜約500ngの範囲である。このような試験は、典型的には極少量の生物試料で行うことができる。
【0206】
当然、腫瘍タンパク質、又は本発明の結合物質の使用に適している多くの他のアッセイプロトコールが存在する。先の説明は、単に例証するためのものである。例えば、前記プロトコールは、HER-2/neuポリペプチドを用い、生物試料中のこのようなポリペプチドに結合する抗体を検出するように容易に修飾することができることは、当業者には明らかであろう。このようなHER-2/neuタンパク質に特異的な抗体の検出は、癌の存在と相関している。
【0207】
癌は、同じく又はあるいは、生物試料中のHER-2/neu融合タンパク質と特異的に反応するT細胞の存在を基にしても検出される。ある方法において、患者から単離されたCD4+及び/又はCD8+ T細胞を含む生物試料は、HER-2/neu融合ポリペプチド、このような融合ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド及び/又は少なくともこのような融合ポリペプチドを発現しているAPCと共にインキュベーションされ、かつT細胞の特異的活性化の有無が検出される。適当な生物試料は、単離されたT細胞を含むが、これに限定されるものではない。例えばT細胞は、常法(例えば末梢血リンパ球のFicoll/Hypaque密度勾配遠心分離による)により、患者から単離することができる。T細胞は、インビトロにおいて2〜9日間(典型的には4日間)、37℃で、HER-2/neu融合ポリペプチド(例えば5〜25μg/ml)と共にインキュベーションすることができる。対照として利用するために、HER-2/neu融合ポリペプチドが存在しないT細胞試料の別のアリコートをインキュベーションすることが望ましい。CD4+ T細胞について、活性化は、T細胞の増殖を評価することで検出されることが好ましい。CD8+ T細胞について、活性化は、細胞溶解活性の評価により検出されることが好ましい。罹患していない患者よりも少なくとも2倍大きい増殖レベル及び/又は少なくとも20%大きい細胞溶解活性レベルは、患者における癌の存在を示している。
【0208】
前述のように、癌は、同じく又はあるいは、生物試料中のHER-2/neuタンパク質をコードしているmRNAのレベルを基に検出してもよい。例えば、少なくとも2個のオリゴヌクレオチドプライマーを、生物試料由来のHER-2/neu cDNAの一部を増幅するアッセイ法を基にしたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)において使用することができ、ここで少なくとも1個のオリゴヌクレオチドプライマーは、HER-2/neuタンパク質をコードしているポリヌクレオチドに特異的である(すなわちこれにハイブリダイズする)。その後増幅されたcDNAは、ゲル電気泳動のような当技術分野において周知の技術を用いて分離・検出される。同様に、HER-2/neuタンパク質又は融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブは、生物試料中のHER-2/neuタンパク質をコードしているポリヌクレオチドの存在を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ法において使用することができる。
【0209】
アッセイ条件下のハイブリダイゼーションを可能にするために、オリゴヌクレオチドプライマー及びプローブは、長さが少なくとも10個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも20個のヌクレオチドであるHER-2/neuタンパク質又は融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチドの部分との同一性か、少なくとも約60%、好ましくは少なくとも約75%、及びより好ましくは少なくとも約90%であるオリゴヌクレオチド配列を含まなければならない。オリゴヌクレオチドプライマー及び/又はプローブは、前述のように中等度にストリンジェントな条件下で、本明細書に記されたHER-2/neuタンパク質又は融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチドにハイブリダイズすることが好ましい。診断法において有用に使用することができるオリゴヌクレオチドプライマー及び/又はプローブは、好ましくは、長さが少なくとも10〜40個のヌクレオチドである。好ましい態様において、オリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号:6又は7に記された配列を有するDNA分子の少なくとも10個の連続するヌクレオチド、より好ましくは少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む。PCRベースのアッセイ法及びハイブリダイゼーションアッセイ法の両技術共、当技術分野において周知である(例えばMullisら、 Cold Spring Harbor Symp, Qunant. Biol.、51:263(1987);Erlich編集、「PCR技術(PCR Technology)」、Stockton Press, NY. 1989参照)。
【0210】
ある好ましいアッセイ法は、PCRが逆転写と組合せて適用されるRT-PCRを使用する。典型的には、RNAが生検組織のような生物試料から抽出され、かつ逆転写され、cDNA分子を作製する。少なくとも1種の特異的プライマーを用いるPCR増幅は、cDNA分子を生じ、これは、例えばゲル電気泳動を用いて、分離・可視化される。増幅は、被験患者から及び癌に罹患していない個体から得られた生物試料上について行われる。増幅反応は、2桁にわたるcDNAの数種の希釈物で行うことができる。被験患者試料の数種の希釈物における発現の、非癌性試料の同じ希釈物と比較した場合の2倍又はそれ以上の増加は、典型的には陽性と認められる。
【0211】
別の態様において、HER-2/neuタンパク質又は融合タンパク質及びこのようなタンパク質又は融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを、癌の進行のモニタリングのためのマーカーとして用いることができる。この態様において、癌の診断のための前述のアッセイ法は、経時的に行うことができ、かつ反応性ポリペプチド(複数)レベルの変化が評価される。例えば、このアッセイ法は、6ヶ月から1年の間24〜72時間毎に行われ、その後は必要に応じて行われる。一般に、結合物質により検出されるポリペプチドのレベルが経時的に増加する患者においては、癌が進行している。対照的に、反応性ポリペプチドのレベルが、一定であるか又は時間と共に減少する場合は、癌は進行していない。
【0212】
あるインビボ診断アッセイ法は、腫瘍について直接行うことができる。このようなアッセイ法のひとつは、腫瘍細胞を、結合物質と接触することを含む。その後結合された結合物質は、レポーター基により直接又は間接に検出することができる。このような結合物質は、同じく組織学的用途においても使用することができる。あるいは、ポリヌクレオチドプローブを、このような用途において用いることができる。
【0213】
前述のように、感度を向上するために、複数のHER-2/neu融合タンパク質マーカーを、所定の試料内でアッセイすることができる。本明細書に提供された様々なタンパク質に特異的な複数の結合物質が、単独のアッセイ法で組合せることができることは明らかであろう。更に、複数のプライマー又はプローブを同時に使用することができる。腫瘍タンパク質マーカーの選択は、最適な感度を生じる組合せを決定する通常の実験を基にすることができる。加えて、又はあるいは、本明細書に提供された腫瘍タンパク質のアッセイ法は、他の公知の腫瘍抗原についてのアッセイ法と組合わせることができる。
【0214】
B. 診断キット
更に本発明は、前述の診断方法のいずれかで使用するためのキットを提供する。このようなキットは、典型的には、診断アッセイ法を行うのに必要な2種以上の成分を含む。成分は、化合物、試薬、容器及び/又は装置であることができる。例えばキット内のひとつの容器は、HER-2/neu融合タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体又はその断片を含む。このような抗体又は断片は、前述のように、支持体材料に付着して提供することができる。1個以上の別の容器には、該アッセイ法において使用される試薬又は緩衝液のような要素が収まっている。このようなキットは、更に又はあるいは、前述のような抗体結合の直接又は間接の検出に適したレポーター基を含む検出試薬も含むことができる。
【0215】
あるいは、キットは、生物試料中のHER-2/neuタンパク質をコードしているmRNAレベルを検出するために設計することができる。このようなキットは、前述のような、HER-2/neuタンパク質又は融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチドとハイブリダイズする、少なくとも1種のオリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーを含む。このようなオリゴヌクレオチドを、例えばPCR又はハイブリダイゼーションアッセイ法において使用することができる。このようなキットに存在する追加成分は、第二のオリゴヌクレオチド及び/又は診断試薬又はHER-2/neuタンパク質をコードしているポリヌクレオチドの検出を促進するための容器を含む。
【0216】
本明細書に引用された全ての出版物及び特許明細書は、個々の出版物及び特許明細書が具体的かつ個別に参照として組入れられることが指示されるのと同じように、本明細書に参照として組入れられている。
【0217】
前述の発明は、理解を明確化する目的で例証及び実施例によりある程度詳細に説明されているが、当業者には、本発明の内容は、添付の特許請求の範囲の精神又は範囲から逸脱しない限りは、それに変更及び修飾を行うことができることは明らかであると思われる。
【0218】
実施例
以下の実施例では例示的な方法が示されているが、本発明または添付の特許請求の範囲を限定するためのものではない。
【0219】
実施例において、オリゴヌクレオチドプライマー、リポフェクトアミン、および制限エンドヌクレアーゼのように、一般的な分子生物学の試薬は、主にGibco/BRL(Grand Island, NY)から入手した。制限エンドヌクレアーゼであるAat IIおよびpflM-1は、New England Biology Labs(Beverly, MA)から入手した。HER2/neu ELISAアッセイキットおよびHER2/neu特異的モノクローナル抗体Ab-3、はOncogene Science(Manhasset, NY)から購入した。pFLAGCMV-1発現ベクターおよびFLAGタグM2抗体はKodak(Rochester,NY)から購入した。PfuポリメラーゼはStarategene(La Jolla, CA)から入手した。pcDNA 3.1/hyg発現ベクターはInvitrogen(Carlsbad, CA)から購入した。
【0220】
実施例 1
pFLAGCMV-1 発現ベクターにおける HER2/NEU の ICD 、 KD および PD 断片のクローニング
細胞内ドメイン(ICD)、キナーゼドメイン(KD)、およびリン酸化ドメイン(PD)をコードするHER2/neuのDNA断片が、ポリメラーゼ連鎖反応によって別々に得られた。制限切断部位であるHind IIIおよびXho Iが、これらの5'末端および3'末端に導入された。この設計により、N末端にプレプロトリプシン(preprotrypsin)のリーダー配列およびFLAGタグ配列のあるフレームを持つpFLAGCMV-1発現ベクター(Kodak)でDNA断片がクローニングされた。PCR産物がゲルから精製され、pFLAGCMV-1のHind III部位およびSal I部位でクローニングされた。その結果、pFLAGCMV-1/ICD(図1)、pFLAGCMV-1/KD(図2)、およびpFLAGCMV-1/PD(図3)が発現プラスミドとして設計された。
【0221】
実施例 2
pcDNA3.1/hyg 発現ベクターにおける ECD-PD 融合タンパク質のクローニング
HER-2/neu PDをコードするDNA断片が、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅された。ゲルから精製された後、pT7-HER-2/neuプラスミドのAat II部位およびXho I部位でクローニングされた。この方法により、ECDおよびPDを一緒に結合させた新規のクローニングベクターであるpT7/ECD-PD(膜貫通ドメインのセリンを含む)が作製された。pT7/ECD-PDプラスミドは、Hind IIIおよびXho Iで37℃、1時間処理することにより切断された。ECD-PD融合タンパク質をコードする2.7kbのDNA断片がゲルから精製され、pcDNA3.1/hyg(Invitrogen)のHind III部位およびXho I部位でサブクローニングされた。得られた発現ベクターは、pcDNA3.1/hygECD-PDとして設計された(図5)。
【0222】
実施例 3
HEK-293 細胞における HER-2/NEU の ICD 、 KD 、および PD 断片の発現
pFLAGCMV-1発現プラスミド(Kodak)は、HER2/neu細胞内ドメインのどの部分が培地中に分泌されるのかを特定するために使用された。このタンパク質は、実施例1で記載したように、N末端にプレプロトリプシンの分泌シグナルおよびFLAGタグを持つ融合タンパク質として発現された。
【0223】
ICD、KDおよびPDを発現している細胞系のトランスフェクションおよび培養は以下のように行われた:ヒト胚腎細胞(HEK-293細胞)が10%胎児ウシ血清を含むダルベッコ変法イーグル培地で培養された。トランスフェクション前日に、6穴培養プレートの各ウェルに1.5 x 105個の細胞が播種された。トランスフェクションには1μgのプラスミドDNAを使い、無血清培地中でリポフェクトアミン(Gibco/BRL)によって行われた。培地および細胞は、72時間後に回収された。安定な形質転換株を選別するために、トランスフェクトされた細胞は200μg/mlハイグロマイシン添加培地で培養された。
【0224】
以下のように、細胞および培地中のFLAGタグ融合タンパク質に対するアッセイをウェスタンブロット解析によって行った。トランスフェクトされたHEK-293細胞の培地および細胞溶解液が、7.5% SDSポリアクリルアミドゲルで分離された。タンパク質は電気泳動によって、ポリビニリデンジフルオライド(PVDF)膜に転写された。PVDF膜は、最初に5%ウシ血清アルブミンを含むTBST(20mMトリス、pH7.5、150mM塩化ナトリウム、0.01% Tween 20)でインキュベートし、一次抗体と共に1時間インキュベートした後、最後にペルオキシダーゼ結合抗マウスヤギ抗体で、さらに1時間インキュベートした。免疫ブロットは、ECLシステム(Amersham Corp.)を使用して行った。マウスのモノクローナル抗体であるc-neu AB-3(「Ab-3」)(Oncogene science)がHER-2/neuタンパク質を検出するために使用された。AB-3は、ヒトHER-2/neuタンパク質のカルボキシル末端を認識する。FLAG-タグ融合タンパク質を検出するために、解析にはM2モノクローナル抗体(Kodak)を一次抗体として使用した。
【0225】
図4に示された結果から、全長のICDおよびKDはいずれも分泌されないが、PDは培地中に検出されたことが示された。この結果は、KDの構造によってタンパク質が細胞膜を通過できないことを示す。
【0226】
実施例 4
pcDNA3.1/hyg 発現ベクターを使った HEK-293 細胞および CHO 細胞における ECD-PD 融合タンパク質の発現
実施例2で示したように、N末端にプレプロトリプシン分泌シグナルおよびFLAGタグを持つECD-PD融合タンパク質が構築された。
【0227】
ECD-PDを発現している細胞系のトランスフェクションおよび増殖は以下のように行われた:HEK-293細胞およびチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)を、10%ウシ胎児血清を添加したダルベッコ変法イーグル培地で培養した。トランスフェクション前日に、6穴培養プレートの各ウェルに1.5 x 105個の細胞を播種した。トランスフェクションは1μgのプラスミドDNAを使い、無血清培地中でリポフェクトアミン(Gibco/BRL)で行った。培地および細胞は72時間後に収穫された。安定な形質転換株を選別するために、トランスフェクトした細胞は、200μg/mlのハイグロマイシン添加培地で培養した。
【0228】
可溶性ECD-PD融合タンパク質は、HER-2/neu ECDに特異的な抗体を用い、ELISAアッセイ法によって以下のように測定した。試料中のHER-2/neuタンパク質を結合するために、マイクロプレートが特異的なマウス抗体(Oncogene Science)でプレコーティングした。試料の入ったマイクロプレートを室温で一晩インキュベートした後、検出用抗体と共に1時間インキュベートした。それから、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスヤギ抗体を加えて、さらに1時間インキュベートした。ペルオキシダーゼの基質であるo-フェニレンジアミンを添加すると、着色産物が形成された。この着色産物を分光光度計で定量した。490nmにおける吸光度は試料中のneuタンパク質量を反映している。
【0229】
その後、可溶性ECD-PD融合タンパクが、以下のようにHER-2/neu PD特異的抗体を用いたウェスタンブロット解析で特定された:トランスフェクトされたHEK-293細胞の培地および細胞溶解液が、7.5% SDSポリアクリルアミドゲルで分離された。タンパク質は電気泳動によって、PVDF膜に転写された。PVDF膜を5%ウシ血清アルブミンを含むTBSTでインキュベートし、次に一次抗体と共に1時間インキュベートしてから、最後にペルオキシダーゼ結合抗マウスヤギ抗体で、さらに1時間インキュベートした。免疫ブロットは、ECLシステム(Amersham Corp.)を用いて行った。本実験では、マウスAb-3モノクローナル抗体(「Ab-3」)(Oncogene Science)が、本実験においてHER-2/neuタンパク質を検出するために使用された。AB-3はヒトHER-2/neuタンパク質のカルボキシル末端を認識する。FLAG-タグ融合タンパク質を検出するために、解析にはM2モノクローナル抗体(Kodak)を一次抗体として使用した。図6に結果を示す。
【0230】
実施例 5
pcDNA3.1/hyg 発現ベクターにおけるヒト ECD- Δ PD 融合タンパク質のクローニング
図13(配列番号:7)に示したように、ヒトECD-ΔPD融合タンパク質は、以下のプライマーを用い、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって作製された。
PDM-251 5'-cctgaatcgcgaacccaagtgtgcaccggcac-3' (配列番号:15) Tm 69℃
PDM-279 5'-ctggactcgagtcattagcggtgcctgtggtgg-3' (配列番号:16) Tm 69℃
【0231】
ポリメラーゼ連鎖反応の条件は、以下のように行った:10μl 10 x Pfu緩衝液 (Stratagene)、1μl 10mM dNTPs 、2μl 10μM各オリゴ、83μl 滅菌水、1.5μl Pfu DNAポリメラーゼ、および50ng鋳型で、96℃ 2分 x 1回; (96℃ 20秒、69℃ 15秒、72℃ 5分) x 40 回; 72℃ 5分 x 1回。PCR産物はNru IおよびXho Iで切断し、pPDM Hisベクター(平滑制限酵素カッターEco 72Iを持つHisタグ-イン-フレームの改変pET28ベクター)でクローニングを行い、Eco 72IおよびXho Iで切断した。配列を確認し、組換えプラスミドを大腸菌発現用のBL21 pLys Sに形質転換した。プラスミド構築物は、BamHIおよびXho Iで切断され、同じ制限酵素で切断されたpcDNA3.1/hygECD-PDにクローニングされた。
【0232】
実施例 6
大腸菌におけるヒト ECD-PD-C T -HIS タグ融合タンパク質の発現
ヒトECD-PD融合タンパク質は、実施例2で示されたようにpcDNA3.1/hygベクターでクローニングされ、C末端に6 x ヒスチジンタグを持つフレームでhECD-PDを構築するためめの鋳型として使用した。hECD-PDは以下のプライマーを使用し、PCRによって増幅した。
【0233】
AWO28 Nco I部位を持つ hECD-PDセンスプライマー
5'-GGGccatggggAGCACCCAAGTGTGCACCGGC-3 (配列番号:17)
【0234】
AWO29 Xho I部位を持ち、終止(stop)のないhECD-PDアンチセンスプライマー 5'-GGGctcgagCACTGGCACGTCCAGACCCAGG-3' (配列番号:18)
【0235】
その後、PCR産物はNco IおよびXho I制限酵素で切断、精製され、2つの同じ制限酵素で直鎖状にしたpET28b発現ベクターにライゲーションされた。ライゲーション産物をNovaBlue細胞に形質転換し、いくつかのコロニーがスクリーニングのために選別された。これらのうち、hECD-PD.CThisクローンがDNA配列によって確認され、その後タンパク質発現に使用された。
【0236】
タンパク質発現のために、hECD-PD.CThisクローンをBL21(DE3)CodonPlus-RIU大腸菌コンピテントセルに形質転換した。標準少量発現スクリーニングは、誘導産物を決定するために形質転換されたクローンを使って行われた。最も良い結果はTB培地で37℃、2時間培養したときに得られた。
【0237】
大腸菌が産生したhECD-PD.CThisは、その後、モノQカラムで精製され、20mM Tris-HCl(pH 8.0)緩衝液でリフォールディングされた。リフォールディングされたタンパク質が分析され、ウェスタンブロットおよびELISA(図17)によってハーセプチン結合陽性であることが示された。しかし、おそらくタンパク質が変性したために、ハーセプチン結合活性は後に消失した。
【0238】
実施例 7
大腸菌におけるヒト N T -HIS タグ -ECD-PD 融合タンパク質の発現
ヒトECD-PD融合タンパク質が、5'側Nde Iおよび3'側Xho Iの制限酵素部位を持つpPDM発現ベクターでクローニングされた。ECD-PDインサートはN末端に6 x ヒスチジンタグを持つフレームに融合された。
【0239】
タンパク質発現のために、NThis-hECD-PD融合タンパク質を含む pPDMベクターをBL21(DE3)CodonPlus-RIU大腸菌コンピテントセルに形質転換した。標準少量発現スクリーニングは、誘導産物を決定するために形質転換されたクローンを使用して行われた。TB培地で30℃、2時間細胞を増殖させた場合には、最も良い結果が得られた。
【0240】
大腸菌に由来する未精製のNThis-hECD-PD融合タンパク質は、マウスbc-neu-3抗体およびウサギ抗ECD抗体によって認識された。次に行う精製で、大腸菌由来のNThis-hECD-PDは、ウェスタンブロットおよびELISAアッセイ法の両方(図17)において、ハーセプチンで認識された。
【0241】
実施例 8
大腸菌におけるマウス ECD-PD-C T -HIS タグ融合タンパク質の発現
以下のように、実施例2で示されたヒトECD-PD融合タンパク質のクローニングと同様の方法で、マウスECD-PD融合タンパク質が、pcDNA3.1ベクターでクローニングされた。この構築物はさらに、C末端の6 x ヒスチジンタグに続いて終止コドンを持つフレームにmECD-PDを構築するための鋳型として使用された。mECD-PD/pcDNA3.1構築物(1932塩基対のORF)のNco I内部部位は、以下のプライマーを用いた部位指定突然変異誘発法により発現しないように突然変異を起こさせた。
AWO38 プライマー:
5'-GGCCCCTCCAGCCCGATGGACAGCACCTTCTACCG-3' (配列番号:19)
AWO39プライマー:
5'-CGGTAGAAGGTGCTGTCCATCGGGCTGGAGGGGCC-3' (配列番号:20)
【0242】
配列が確認された後、mECD-PD融合構築物は、以下のプライマーを用いたPCRによって増幅された。
Nco I制限酵素部位を持つAWO36センスプライマー
5'-GGGccatggGTACCCAAGTGTGTACCGG-3' (配列番号:21)
Xho I制限酵素部位を持つAWO37アンチセンスプライマー
5'-GGGctcgagTCAATGGTGATGGTGATGGTGTCATGGCACATCCAGGCCTAGGTACTCAGGG-3' (配列番号:22)
【0243】
その後、PCR産物は、Nco IおよびXho I制限酵素で切断、精製され、同じ2つの制限酵素で直鎖状にしたpET28b発現ベクターにライゲーションされた。
【0244】
ライゲーション産物をNovaBlue細胞に形質転換し、多数のコロニーが生じた。配列解析によって、4つのコロニーが選別された。これらのうち、正しい配列を持つmECD-PD.CThisクローンを、BL21(DE3) CodonPlus-RIU大腸菌コンピテントセルに形質転換した。標準少量発現スクリーニングは、誘導産物を決定するために形質転換されたクローンを使って行われた。2倍濃度のYT培地で30℃、3時間培養した場合に、最も良い結果が得られた。
【0245】
実施例9
大腸菌におけるRa12-mECD-PD-C T HISタグ融合タンパク質の発現
実施例8に述べられたように、マウスECD-PD融合タンパク質がpET28b発現ベクターにクローンニングされた。Ra12配列は、以下のように5'末端および3'末端にNco I部位を加えたPCR断片を使って増幅された。
Ra12.JC05: 5'-CCGccatggGCACGGCCGCGTCCGATAACTTCC-3'(配列番号:23)
Ra12.JC06: 5'-GCGccatggCGGCCGGGGGTCCCTCGGCC-3'(配列番号:24)
【0246】
mPCD-EDとRa12のアジュバント融合(adjuvant fusion)を得るために、Ra12PCR産物がNco I制限酵素で切断され、Nco Iで切断されCIAP処理されたpET28b-mECD-PDベクターにライゲーションされた。ライゲーション産物をNovaBlue細胞に形質転換し、多数のコロニーが生じた。方向性の非特異的なライゲーション反応のために、2倍のコロニーがプラスミドミニプレップのために採取された。正方向のインサートをスクリーニングするために、これらのコロニーは、Afi III制限酵素で切断でされた。正方向性を示す少数のクローンの配列が解析された。発現のために、正方向の1クローンをBL21(DE3)CodonPlus-RIU大腸菌コンピテントセルに形質転換した。誘導産物を決定するために、形質転換されたクローンを使い、標準少量発現スクリーニングを行った。最も良い結果は、細胞をLB培地で37℃、3時間培養した場合に得られた。
【0247】
実施例 10
大腸菌における LeIf.mECD-PD-C T HIS タグ融合タンパク質の発現
実施例8で述べられたように、マウスmECD-PD融合タンパク質は、pET28b発現ベクターでクローニングされた。LeIF配列は5'末端および3'末端にNco I部位を付け加えた、以下のPCR断片を使って増幅された。
LeIf.JC03: 5'-CGCccatggCGCAGAATGATAAGATCGCCC-3'(配列番号:25)
LeIf.JC04: 5'-GCCccatggCGTCGCGCATGAACTTCTTCGTC-3'(配列番号:26)
【0248】
mPCD-EDとLeIFのアジュバント融合を得るために、LeIF PCR産物がNco I制限酵素で切断され、Nco Iで切断されCIAP処理されたpET28b-mECD-PDベクターにライゲーションされた。ライゲーション産物をNovaBlue細胞に形質転換し、多数のコロニーが生じた。方向性の非特異的なライゲーション反応のために、2倍のコロニーがプラスミドミニプレップのために採取された。正方向のインサートをスクリーニングするために、これらのコロニーは、Kpi I制限酵素で切断でされた。正方向性を示す少数のクローンの配列が解析された。発現のために、正方向の1クローンをBL21(DE3)CodonPlus-RIU大腸菌コンピテントセルに形質転換した。誘導産物を決定するために、形質転換されたクローンを使い、標準少量発現スクリーニングを行った。もっとも良い結果は、細胞を2倍濃度のYT培地で30℃、3時間培養した場合に得られた。
【0249】
実施例 11
ピチアにおける ECD-PD 融合タンパク質の発現
ピチアで発現するために使用されたECD-PD組換えタンパク質は、2つの改良点を持つCHOでの発現用と同様にデザインされた:(i)HER-2/neu遺伝子の天然の分泌シグナル配列はサッカロミセス-セレビシエ(Sacchromyces cerevisiae)のアルファプレ-プロシグナル配列によって置換され;且つ(ii)組換えタンパク質のC末部分は、1個のグリシンおよび6個のヒスチジンによって延長された。
【0250】
ECD-PD融合タンパク質の発現カセットは、スフェロプラスト法によってピチアSMD1168株に組み込まれた。複数コピーが組み込まれた6株のクローンは、定量的ドットブロット解析により250株のクローンから選別された。選別されたクローンは、緩衝されたメタノール混合培地(BMMY-1%)中で72時間のフラスコ振盪培養によって誘導された。6株の候補クローンは、細胞を含まない上清および全細胞抽出液中で、同様の発現特性を示した。
【0251】
細胞を含まない上清中には、全長のECD-PD組換えタンパク質の分泌は非常に少なく、c-neu-3マウス抗体(Calbiochem)を用いたウェスタンブロットでのみ検出された。±70kDaタンパク質の分泌および蓄積(72時間後に最大)は、SDS-PAGEの銀染色で可視化された。また、ハーセプチンマウス抗体を用いた非還元条件下でのウェスタンブロットによって検出された。このタンパク質は、マウスc-neu-3抗体またはマウス抗ヒスチジン抗体(QIAGEN)を用いても検出されなかった。
【0252】
全細胞抽出液では、銀染色試薬第一キットを用いたSDS-PAGEにより、特異的なバンドは検出されなかった。マウスc-neu-3抗体または抗ヒスチジン抗体を使ったウェスタンブロットによって、2本のバンドが検出された。1本は、以下に示すCHO細胞の発現産物である分泌型ECD-PDとして観察されたものと、同じ分子サイズを持つ。もう1本は100〜120kDaの大きさで、「スメア(smear)」のように見える。これらの2本のシグナルは、E.R.に保持されているにECD-PD組換えタンパク質で、様々な形態に糖化されたものに相当する可能性がある。
【0253】
実施例 12
ECD-PD および ECD- Δ PD 融合タンパク質の CHOK1 細胞における発現
pcDNA3.1/hyg/ECD-PDおよびpcDNA3.1/hyg/ECD-ΔPDプラスミドが、Xba I制限酵素によって切断され、ECD-PDおよび ECD-ΔPD融合タンパク質を含むDNA断片が、各々2783塩基対および2166塩基対のXba I断片としてゲルから精製された。各断片は、Xba I(CMV極初期プロモーターの下流にあるクローニングサイト)で直鎖状にしたpEE14-GSベクター(Cell Tech)に移された。ライゲーション後に、DH5αコンピテント大腸菌細胞に形質転換された。制限酵素の切断によって解析された16個のコロニーのうち、ECD-PDに対しては2のコロニーが陽性で、そしてECD-ΔPDに対しては1個のコロニーが陽性であることが示された。得られたプラスミドは大量培養され、CsCl-EtBrの二重勾配遠心法によって精製された。プラスミドは、制限酵素切断による解析、およびインサートとプラスミド間の5'および3'連結部位の配列決定による解析で異常のないことが示された。
【0254】
マスターセルバンク(Master Cell Bank)CHO-K1 028W 1996/2 SHF p31由来のCHO-K1細胞が、無血清条件下で懸濁培養され、pEE14-ECD-PDおよびpEE14-ECD-ΔPDの両プラスミドに古典的なDNAリン酸カルシウム共沈殿法でトランスフェクトされた。トランスフェクション後48時間で細胞数が計測され、96穴プレートに5000個/ウェルの密度で培養された。トランスフェクトされた細胞は、Crockettら、((1990) Biotech., 8:662)によって述べられたグルタミン合成酵素(GS)発現システムに従って選別され、グルタミン無添加のGMEM培地に、30μMメチオニンスルフォキサミン(MSX)、 添加物(グルタミン酸/アスパラギン/ヌクレオシド)、および5%の透析済みウシ胎児血清(FBS)を加えて増殖させた。細胞は第1週目に3回洗浄され、トランスフェクションを行う第2週目には2回洗浄された。3回目の洗浄で20%の馴化培地が添加された。5回目の洗浄で、選別のレベルを上げるためにMSXの濃度が50μMまで増加された。
【0255】
MSX形質転換コロニーは、トランスフェクション後3〜5週間で24穴プレートに移され、培養上清が回収された。ECD-PDおよびECD-ΔPD融合タンパク質の発現はハーセプチン抗体を使った非還元条件下で、ウェスタンブロット解析により検査され、一方、ECD-PD融合タンパク質の発現は、検査された52株のクローンのうち18株で検出された。ECD-ΔPDでの発現では、検査された47株のクローンのうち13株が陽性だった。融合タンパク質を発現している選別されたクローンは、無血清培地条件下での懸濁液に再度馴化された。発現レベルに基づいて、ECD-PD構築物を保持する5株のクローンおよびECD-ΔPD構築物を保持する3株のクローンの生育と生存可能性が評価され、特徴が示された。ECD-PD構築物としては、クローンF560 F3の発現レベルが最も高かった。
【0256】
発現は、33℃で酪酸ナトリウム(2 mM)およびDMSO(2%)の有無によって評価された。いくつかのクローンはNaBまたはDMSOによって誘導された。CHO-K1細胞におけるECD-PDおよびECD-ΔPDの発現は、ウェスタンブロットおよびSDS-PAGEに続く、銀染色またはクーマシー染色のいずれかによって解析された。8092Kウサギポリクローナル抗体に加えて、ハーセプチン およびc-nu-3マウスモノクローナル抗体がウェスタンブロット解析に使用された。ECD-PDおよびECD-ΔPDクローンの培養上清の解析では、クーマシー/銀染色されたゲルにおいて、それぞれ150kDaおよび98kDaのバンドが検出された。同様のバンドは、ECD-PDだけに対するc-neu-3抗体(図18)に加えて、 ハーセプチンおよび8029K ポリクローナル抗血清によって示された。CHOで発現されたHER-2/neu融合タンパク質は、ハーセプチン抗体によって認識される(図18)。
【0257】
融合タンパク質の発現レベルは、次の細胞へ継代する間の安定性についても継続して検討された。5株のECD-PDクローンと2株の ECD-ΔPDクローンが継代期間中追跡調査され、発現の安定性が、ウェスタンブロット解析により評価された。解析された7株のクローンのうち4株は32代以上の継代でも安定していた。しかし、そのうちの1株は死亡率が高く、その他のクローンでは細胞の大型化が見られた。
【0258】
ECD-PDおよびECD-ΔPDクローンの中で、最も良いクローン2株を使って少量スケールでの産生が行われた。細胞は2 mM酪酸ナトリウムを添加した無血清培地で33℃、120時間懸濁培養した。融合タンパク質の発現は両方とも、ハーセプチン抗体を使ったウェスタンブロットおよび銀染色試薬、第一キットを用いたSDS-PAGEによって評価した。いずれの融合タンパク質も+/- 100μg/mlの発現がみられた。
【0259】
実施例 13
CHO 細胞で発現した ECD-PD および ECD- Δ PD 融合タンパク質の精製
CHO細胞での発現と分泌に続き、ECD-PDおよびECD-ΔPD融合タンパク質は、Qセファロース高性能カラムを用いた陰イオン交換クロマトグラフィによって精製された。カラムに上清を添加する前に、1N塩酸を加えてpH6.5に調整した。クロマトグラフィのために、1 mlのQセファロース高性能樹脂(Pharmacia)がC10/10カラムとして使用された(Pharmacia)。
【0260】
カラムは、最初に4 ml/分でカラムの10倍容積の水で平衡化され、次に4 ml/分で1倍容積の0.5M水酸化ナトリウム、それから4 ml/分で10倍容積の緩衝液A(20 mMBis-TrisプロパンpH6.5-50 mM 塩化ナトリウム)で平衡化された。カラムに試料を添加し、1 ml/分の流速で送液した。その後、280nmでのO.D.が0.1に達するまで、カラムを1 ml/分の緩衝液Aで洗浄し、20倍容積の緩衝液でもう一度洗浄した。溶出の前に流動を逆転させて、3倍容積の緩衝液でもう一度洗浄した。
【0261】
溶出は最初に、流速1 ml/分の緩衝液B(20 mM Bis-TrisプロパンpH6.5-250 mM塩化ナトリウム)を用いて行われ、それから緩衝液C(20 mM Bis-TrisプロパンpH6.5-1 mM塩化ナトリウム)を用いた。対象となる融合タンパク質は緩衝液Bで溶出した。
【0262】
融合タンパク質はフェニルセファロース6ファーストフロー低置換(Fast Flow low substitution)の疎水性クロマトグラフィによってさらに精製された。ECD-PDおよびECD-ΔPD融合タンパク質を含む溶出液(緩衝液B 溶出液)は、固体の硫酸アンモニウム(AMS)を添加することで1M濃度のAMS (140g/literの溶液)になるように調整された。溶液のpHは7.0になるように調整
した。
【0263】
クロマトグラフィのために、0.5 mlのフェニルセファロース6ファーストフロー低置換(Fast Flow low substitution)(Pharmacia)が、C10/10カラムとして使用された(Pharmacia)。カラムは最初に4 ml/分でカラムの10倍容積の水で平衡化され、次に4 ml/分で1倍容積の0.5M水酸化ナトリウム、その後、4ml/分で10倍容積の緩衝液D(1mM PO4 pH 7.0-1M AMS) で平衡化された。平衡化に続いて試料を添加し、0.5ml/分の流速でカラムを通過させた。280nmでのO.D.がベースラインに達するまで、カラムは0.5 ml/分の緩衝液Dで洗浄され、それから1 ml/分の10倍容積で洗浄された。溶出前に流動を逆転させて、3倍容積の緩衝液でもう一度洗浄した。溶出は1 ml/分のE緩衝液(1mM PO4 pH 7.0)で行った。
【0264】
精製された融合タンパク質は、SDS-PAGEの後、第一キットを使用した銀染色、および8092Kウサギポリクローナル抗体またはマウスハーセプチン抗体を使ったウェスタンブロットによって解析された。これらの解析から、2段階の精製ステップによる純度はデンシトメトリー(バイオラド、GS-700イメージングデンシトメーター)によって+/- 90%と判定された。ウェスタンブロット解析から、モノマーは精製の間、主要バンドに保持され、酸化レベルがあがっていないこと、そしてハーセプチン抗体を使って示されたように、対象となるエピトープの検出は、精製条件によって変化しないことが示された。各々の融合タンパク質の総量は、タンパク質比色法(DOC TCA BCA)を使って測定された。このアッセイ法では、75mlの培養物から純度+/- 90%のレベルで、それぞれ2mgのECD-PDおよび4 mgのECD-ΔPD融合タンパク質が精製されたことになる。
【図面の簡単な説明】
【図1】 サイズが6.7kbである、pFLAGCMV-1/ICD発現プラスミドの地図を示す。
【図2】 サイズが5.7kbである、pFLAGCMV-1/KD発現プラスミドの地図を示す。
【図3】 サイズが5.7kbである、pFLAGCMV-1/PD発現プラスミドの地図を示す。
【図4】 実施例3に説明されたように、HER-2/neuリン酸化ドメインが、培養培地に分泌され、かつHER-2/neu細胞内ドメイン及びHER-2/neuキナーゼドメインが培養培地に分泌されなかったことを示す。
【図5】 サイズが8.3kbである、pcDNA3.l/hygro/ECD-PD発現ベクターの地図を示す。
【図6】 実施例4に説明されたように、HEK-293及びCHO細胞におけるECD-PD融合タンパク質の発現の結果、並びに該融合タンパク質が培養培地に分泌されたことを例示している。
【図7】 ヒトHER-2/neuタンパク質の完全長アミノ酸配列(配列番号:1)を示す。
【図8】 ラットHER-2/neuタンパク質の完全長アミノ酸配列(配列番号:2)を示す。このキナーゼドメインは、アミノ酸721位からアミノ酸998位を含むように広がっている。
【図9】 細胞外HER-2/neuタンパク質のアミノ酸配列(配列番号:3)を示す。
【図10】 ヒトHER-2/neuタンパク質のリン酸化ドメイン(PD)のアミノ酸配列(配列番号:4)を示す。
【図11】 ヒトHER-2/neuタンパク質のリン酸化ドメインの好ましい部分(ΔPD)のアミノ酸配列(配列番号:5)を示す。
【図12】 ヒトHER-2/neuタンパク質の細胞外ドメイン(ECD)及びリン酸化ドメイン(PD)を含む融合タンパク質のアミノ酸配列(配列番号:6)を示す。
【図13】 ヒトHER-2/neuタンパク質の細胞外ドメイン(ECD)及びリン酸化ドメインの好ましい部分(ΔPD)を含む融合タンパク質のアミノ酸配列(配列番号:7)を示す。
【図14】 ラットHER-2/neuタンパク質の細胞外ドメイン(ECD)のアミノ酸配列(配列番号:8)を示す。
【図15】 ヒトHER-2/neuタンパク質をコードしているDNA分子の完全長ヌクレオチド配列(配列番号:9)を示す。この完全長ヌクレオチド配列は、国際公開公報第96/30514号に開示されており、その開示はその全体が本明細書に参照として組入れられている。
【図16】 ラットHER-2/neuタンパク質をコードしているDNA分子の完全長ヌクレオチド配列(配列番号:10)を示す。この完全長ヌクレオチド配列は、Bargmannら、Nature、319:226〜30(1986)、及びGENBANK/X03362に開示されており、この開示はその全体が本明細書に参照として組入れられている。
【図17】 哺乳類細胞又は大腸菌のいずれかにおいて産生された様々なECD-PD融合タンパク質へのハーセプチン(Herceptin)結合に関するELISAアッセイ法の結果を示す。大腸菌において産生された融合タンパク質は、C末端又はN末端 6x ヒスチジンタグ(各々、C-Hisタグ及びN-Hisタグと記す)を伴うフレーム内にある。
【図18】 無血清条件下、懸濁液中で増殖したCHO-K1における、及びピチア(Pichia)細胞における、HER-2/neu ECD-PD融合タンパク質発現の比較を示している。
【図19】 マウスのHer-2/neuのヌクレオチド配列を示す。
【図20】 マウスのHer-2/neuのアミノ酸配列を示す。
Claims (13)
- (b)配列番号:5 を含む、または配列番号:2のGln 991からArg 1049を含むアミノ酸配列を含む、HER-2/neuリン酸化ドメイン又は該HER-2/neuリン酸化ドメインの断片に融合された、(a)HER-2/neu細胞外ドメイン又はそのカルボキシ末端の1から100個のアミノ酸が取り除かれている細胞外ドメインの断片を含む単離タンパク質であって、恒温動物における免疫応答を形成することが可能である、前記単離タンパク質。
- (b)配列番号:5 からなる、または配列番号:2のGln 991からArg 1049を含むアミノ酸配列からなる、HER-2/neuリン酸化ドメイン又は該HER-2/neuリン酸化ドメインの断片に融合された、(a)HER-2/neu細胞外ドメイン又はそのカルボキシ末端の1から100個のアミノ酸が取り除かれている細胞外ドメインの断片を含む、請求項1に記載の単離タンパク質。
- 配列番号:6の配列と少なくとも90%の同一性を有する配列を有するか、又は配列番号:4の配列と少なくとも90%の同一性を有する配列に直接または間接的に融合された配列番号:3の配列と少なくとも90%の同一性を有する配列を含む、単離タンパク質であって、
配列番号:6の配列、又は、配列番号:4の配列に直接または間接的に融合された配列番号:3の配列、からなるタンパク質と同等の免疫学的特性を有する、前記単離タンパク質。 - 配列番号:7の配列と少なくとも90%の同一性を有する配列を有するか、又は配列番号:5の配列と少なくとも90%の同一性を有する配列に直接または間接的に融合された配列番号:3の配列と少なくとも90%の同一性を有する配列を含む、単離タンパク質であって、
配列番号:7の配列、又は、配列番号:5の配列に直接または間接的に融合された配列番号:3の配列、からなるタンパク質と同等の免疫学的特性を有する、前記単離タンパク質。 - HER-2/neu細胞外ドメインが、化学リンカーを介して、HER-2/neuリン酸化ドメインまたは該リン酸化ドメインの断片に融合されている、請求項1又は2に記載のタンパク質。
- 化学リンカーがアミノ酸リンカーである、請求項5記載のタンパク質。
- 請求項1〜4、6のいずれかに記載のタンパク質をコードしている核酸分子。
- 請求項1〜4、6のいずれかに記載のタンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列を含む、ウイルスベクター。
- HER-2/neu融合タンパク質に特異的なT細胞をインビトロまたはエクスビボで刺激及び/又は拡張する方法であって、
請求項1〜6のいずれかに記載の融合タンパク質、該融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチド、又は、該融合タンパク質を発現する抗原提示細胞を、T細胞に接触させる段階を含む方法。 - 以下の段階を含む、請求項1〜6のいずれかに記載のHer-2/neu融合タンパク質を作製する方法:
(a)請求項7記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを細胞に導入する段階;
(b)トランスフェクションされた細胞を培養する段階;及び
(c)発現されたタンパク質を精製する段階。 - 細胞が、CV-1/EBNA、L細胞、C127、3T3、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)、COS、NS-1、HeLa、ヒト胚腎細胞(HEK 293)、及びBHK細胞株のいずれかの細胞または細胞株である、請求項10記載の方法。
- 細胞が、無血清条件下で懸濁液中で培養される、請求項11記載の方法。
- 発現されたタンパク質が、下記を含む2段階法により精製される、請求項10記載の方法:
(a)Qセファロース(商標)高速カラム上での陰イオン交換クロマトグラフィー;及び
(b)フェニルセファロース6ファストフロー(ローサブスティテューション)(商標)による疎水性クロマトグラフィー。
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US7638270B2 (en) * | 2003-01-24 | 2009-12-29 | Agensys, Inc. | Nucleic acids and corresponding proteins entitled 254P1D6B useful in treatment and detection of cancer |
WO2005046571A2 (en) | 2003-06-06 | 2005-05-26 | Agennix Incorporated | Lactoferrin as an adjuvant in cancer vaccines |
WO2004113377A1 (en) * | 2003-06-25 | 2004-12-29 | Pharmexa A/S | Purification of her-2 variants |
CN101094864A (zh) | 2003-06-25 | 2007-12-26 | 法麦克萨有限公司 | Her-2变体的纯化 |
CA2532460C (en) * | 2003-07-21 | 2012-04-24 | Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. Angeletti S.P.A. | Synthetic gene encoding human epidermal growth factor 2/neu antigen and uses thereof |
GB0321615D0 (en) | 2003-09-15 | 2003-10-15 | Glaxo Group Ltd | Improvements in vaccination |
KR101438983B1 (ko) | 2003-11-06 | 2014-09-05 | 시애틀 지네틱스, 인크. | 리간드에 접합될 수 있는 모노메틸발린 화합물 |
AU2005249490B2 (en) | 2004-06-01 | 2010-07-29 | Genentech, Inc. | Antibody drug conjugates and methods |
US20100111856A1 (en) | 2004-09-23 | 2010-05-06 | Herman Gill | Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates |
PL1791565T3 (pl) | 2004-09-23 | 2016-10-31 | Modyfikowane cysteiną przeciwciała i koniugaty | |
ITMI20041965A1 (it) | 2004-10-15 | 2005-01-15 | Augusto Amici | "dna codificante forme tronche e chimeriche della proteina p185neu e suoi usi terapeutici" |
GB0427131D0 (en) * | 2004-12-10 | 2005-01-12 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Novel combination |
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EP2390363A1 (en) | 2006-06-02 | 2011-11-30 | GlaxoSmithKline Biologicals s.a. | Method for identifying whether a patient will be responder or not to immunotherapy based on the differential expression of the PRF1 gene |
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MX336540B (es) | 2010-06-08 | 2016-01-22 | Genentech Inc | Conjugados y anticuerpos manipulados geneticamente con cisteina. |
CA2816426A1 (en) | 2010-11-17 | 2012-06-07 | Genentech, Inc. | Alaninyl maytansinol antibody conjugates |
CA2833212C (en) | 2011-05-12 | 2020-06-09 | Genentech, Inc. | Multiple reaction monitoring lc-ms/ms method to detect therapeutic antibodies in animal samples using framework signature peptides |
US11135303B2 (en) | 2011-10-14 | 2021-10-05 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof |
WO2013130093A1 (en) | 2012-03-02 | 2013-09-06 | Genentech, Inc. | Biomarkers for treatment with anti-tubulin chemotherapeutic compounds |
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EP2906297B1 (en) | 2012-10-12 | 2017-12-06 | ADC Therapeutics SA | Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates |
MX364328B (es) | 2012-10-12 | 2019-04-23 | Medimmune Ltd | Conjugados del anticuerpo pirrolobenzodiazepina. |
CN105102003B (zh) | 2012-10-12 | 2019-03-05 | Adc疗法责任有限公司 | 吡咯并苯并二氮杂卓-抗psma抗体结合物 |
AU2013366493B2 (en) | 2012-12-21 | 2017-08-24 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof |
WO2014096365A1 (en) | 2012-12-21 | 2014-06-26 | Spirogen Sàrl | Unsymmetrical pyrrolobenzodiazepines-dimers for use in the treatment of proliferative and autoimmune diseases |
BR112015021965B1 (pt) | 2013-03-13 | 2022-05-03 | Medimmune Limited | Conjugados e compostos de pirrolobenzodiazepinas, composição farmacêutica, uso dos mesmos para o tratamento de uma doença proliferativa e método de síntese dos ditos compostos |
JP6444902B2 (ja) | 2013-03-13 | 2018-12-26 | メドイミューン・リミテッドMedImmune Limited | ピロロベンゾジアゼピン及びその結合体 |
KR102057755B1 (ko) | 2013-03-13 | 2019-12-19 | 메디뮨 리미티드 | 피롤로벤조디아제핀 및 그의 컨쥬게이트 |
EA201690195A1 (ru) | 2013-08-12 | 2016-05-31 | Дженентек, Инк. | Конъюгатные соединения антитело-лекарство на основе димера 1-(хлорметил)-2,3-дигидро-1h-бензо[e]индола и способы применения и лечения |
EP3054983B1 (en) | 2013-10-11 | 2019-03-20 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates |
GB201317982D0 (en) | 2013-10-11 | 2013-11-27 | Spirogen Sarl | Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof |
EP3054985B1 (en) | 2013-10-11 | 2018-12-26 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates |
US9956299B2 (en) | 2013-10-11 | 2018-05-01 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepine—antibody conjugates |
JP6425327B2 (ja) * | 2013-12-12 | 2018-11-21 | 国立大学法人東京農工大学 | タンパク質−磁性粒子複合体及びその製造方法 |
CN105828840B (zh) | 2013-12-16 | 2020-08-04 | 基因泰克公司 | 1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚二聚体抗体-药物缀合物化合物及使用和治疗方法 |
RU2689388C1 (ru) | 2013-12-16 | 2019-05-28 | Дженентек, Инк. | Пептидомиметические соединения и их конъюгаты антител с лекарственными средствами |
CA2933557A1 (en) | 2013-12-16 | 2015-06-25 | Genentech, Inc. | Peptidomimetic compounds and antibody-drug conjugates thereof |
US10188746B2 (en) | 2014-09-10 | 2019-01-29 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof |
EP3191521A2 (en) | 2014-09-12 | 2017-07-19 | F. Hoffmann-La Roche AG | Cysteine engineered antibodies and conjugates |
CN106714844B (zh) | 2014-09-12 | 2022-08-05 | 基因泰克公司 | 蒽环类二硫化物中间体、抗体-药物缀合物和方法 |
GB201416112D0 (en) | 2014-09-12 | 2014-10-29 | Medimmune Ltd | Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof |
PE20170905A1 (es) | 2014-09-17 | 2017-07-12 | Genentech Inc | Pirrolobenzodiazepinas y conjugados de anticuerpo-disulfuro de las mismas |
CA2968447A1 (en) | 2014-11-25 | 2016-06-02 | Adc Therapeutics Sa | Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates and their use to treat neoplasms |
CN107206101B (zh) | 2014-12-03 | 2021-06-25 | 基因泰克公司 | 季铵化合物及其抗体-药物缀合物 |
GB201506402D0 (en) | 2015-04-15 | 2015-05-27 | Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W | Site-specific antibody-drug conjugates |
GB201506411D0 (en) | 2015-04-15 | 2015-05-27 | Bergenbio As | Humanized anti-axl antibodies |
MA43345A (fr) | 2015-10-02 | 2018-08-08 | Hoffmann La Roche | Conjugués anticorps-médicaments de pyrrolobenzodiazépine et méthodes d'utilisation |
MA43354A (fr) | 2015-10-16 | 2018-08-22 | Genentech Inc | Conjugués médicamenteux à pont disulfure encombré |
MA45326A (fr) | 2015-10-20 | 2018-08-29 | Genentech Inc | Conjugués calichéamicine-anticorps-médicament et procédés d'utilisation |
GB201601431D0 (en) | 2016-01-26 | 2016-03-09 | Medimmune Ltd | Pyrrolobenzodiazepines |
GB201602356D0 (en) | 2016-02-10 | 2016-03-23 | Medimmune Ltd | Pyrrolobenzodiazepine Conjugates |
GB201602359D0 (en) | 2016-02-10 | 2016-03-23 | Medimmune Ltd | Pyrrolobenzodiazepine Conjugates |
JP6943872B2 (ja) | 2016-03-25 | 2021-10-06 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | 多重全抗体及び抗体複合体化薬物定量化アッセイ |
GB201607478D0 (en) | 2016-04-29 | 2016-06-15 | Medimmune Ltd | Pyrrolobenzodiazepine Conjugates |
PL3458101T3 (pl) | 2016-05-20 | 2021-05-31 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Koniugaty PROTAC-przeciwciało i sposoby ich stosowania |
CN109313200B (zh) | 2016-05-27 | 2022-10-04 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于表征位点特异性抗体-药物缀合物的生物分析性方法 |
JP7043425B2 (ja) | 2016-06-06 | 2022-03-29 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | シルベストロール抗体-薬物コンジュゲート及び使用方法 |
JP7093767B2 (ja) | 2016-08-11 | 2022-06-30 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | ピロロベンゾジアゼピンプロドラッグ及びその抗体コンジュゲート |
CN110139674B (zh) | 2016-10-05 | 2023-05-16 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 制备抗体药物缀合物的方法 |
GB201617466D0 (en) | 2016-10-14 | 2016-11-30 | Medimmune Ltd | Pyrrolobenzodiazepine conjugates |
GB201702031D0 (en) | 2017-02-08 | 2017-03-22 | Medlmmune Ltd | Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates |
JP6671555B2 (ja) | 2017-02-08 | 2020-03-25 | アーデーセー セラピューティクス ソシエテ アノニム | ピロロベンゾジアゼピン抗体複合体 |
JP2020517609A (ja) | 2017-04-18 | 2020-06-18 | メディミューン リミテッド | ピロロベンゾジアゼピン複合体 |
CA3057748A1 (en) | 2017-04-20 | 2018-10-25 | Adc Therapeutics Sa | Combination therapy with an anti-axl antibody-drug conjugate |
WO2018229222A1 (en) | 2017-06-14 | 2018-12-20 | Adc Therapeutics Sa | Dosage regimes for the administration of an anti-cd19 adc |
WO2019034764A1 (en) | 2017-08-18 | 2019-02-21 | Medimmune Limited | CONJUGATES OF PYRROLOBENZODIAZEPINE |
JP2020534300A (ja) | 2017-09-20 | 2020-11-26 | ピーエイチ・ファーマ・カンパニー・リミテッドPh Pharma Co., Ltd. | タイランスタチン類似体 |
GB201803342D0 (en) | 2018-03-01 | 2018-04-18 | Medimmune Ltd | Methods |
GB201806022D0 (en) | 2018-04-12 | 2018-05-30 | Medimmune Ltd | Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof |
GB201814281D0 (en) | 2018-09-03 | 2018-10-17 | Femtogenix Ltd | Cytotoxic agents |
WO2020086858A1 (en) | 2018-10-24 | 2020-04-30 | Genentech, Inc. | Conjugated chemical inducers of degradation and methods of use |
WO2020123275A1 (en) | 2018-12-10 | 2020-06-18 | Genentech, Inc. | Photocrosslinking peptides for site specific conjugation to fc-containing proteins |
GB201901197D0 (en) | 2019-01-29 | 2019-03-20 | Femtogenix Ltd | G-A Crosslinking cytotoxic agents |
KR20230037560A (ko) * | 2020-07-14 | 2023-03-16 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 고정 용량 조합에 대한 분석 |
GB2597532A (en) | 2020-07-28 | 2022-02-02 | Femtogenix Ltd | Cytotoxic compounds |
KR102584276B1 (ko) * | 2023-03-30 | 2023-10-10 | 주식회사 애스톤사이언스 | Her2 백신, 및 면역관문 억제제의 조합 요법 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK0474727T3 (da) * | 1989-05-19 | 1998-01-12 | Genentech Inc | HER2 ekstracellulært domæne |
US5801005A (en) * | 1993-03-17 | 1998-09-01 | University Of Washington | Immune reactivity to HER-2/neu protein for diagnosis of malignancies in which the HER-2/neu oncogene is associated |
JPH0914357A (ja) * | 1995-06-27 | 1997-01-14 | Honda Motor Co Ltd | 伝動ベルト用ブロック |
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