CN101094864A

CN101094864A - Her－2变体的纯化

Info

Publication number: CN101094864A
Application number: CNA2004800244693A
Authority: CN
Inventors: M·埃斯克林; K·G·尼尔森
Original assignee: PHAMACSA AS
Current assignee: PHAMACSA AS; Affitech AS
Priority date: 2003-06-25
Filing date: 2004-06-24
Publication date: 2007-12-26
Also published as: US20060240511A1; ZA200509951B; KR20060033870A; EA008827B1; EA200600102A1; US8022039B2; US7763452B2; US20100285071A1; IL171903A0; IL171903A

Abstract

本发明提供一种纯化获自昆虫细胞的培养物的EGFR家族蛋白质的新方法。所述方法包括下列连续步骤：a)用缓冲液渗滤和交换培养基，b)固定化金属亲和层析(IMAC)，c)大小排阻层析(SEC)，和d)阴离子交换层析(AIE)。该方法还提供HER－2蛋白质的免疫原性变体，以及制备所述变体的方式，针对所述变体，所述纯化方法特别适合。

Description

HER-2变体的纯化

发明领域

本发明涉及蛋白质的亲和纯化领域。更具体地，本发明涉及金属亲和蛋白质纯化中的改进，尤其是在昆虫细胞中重组生产的带组氨酸标签的或富含组氨酸的蛋白质的纯化。本发明还涉及适于源自蛋白质EGFR(表皮生长因子受体)家族的带组氨酸标签的蛋白质变体，尤其是癌症相关抗原HER-2的具体纯化方案。

另外，本发明涉及能够引起人免疫应答的人HER-2的免疫原性变体，所述免疫应答还靶向天然的人HER-2分子。

发明背景

癌症相关的膜蛋白HER-2是蛋白质EGFR家族的一员。这种特定的蛋白质已经显示可能在某些癌症，特别是乳腺癌和结肠直肠癌的自动特异性免疫治疗中作为免疫原。

本专利申请的受让人先前曾经提交过涉及针对HER-2抗原的主动疫苗接种的专利申请，参见WO 00/20027，特此将其并入本文作为参考。本领域的其它研究现在已经鉴定出对于这些疫苗优选的HER-2变体，但是在蛋白质化学中的一个普遍问题是设计改进的方式来以高纯度获得令人满意的产率的重组蛋白。

固定化金属离子亲和层析(IMAC)首次由Porath(Porath，J.，J.Carlsson，I.Olsson，G Belfrage[1975]Nature 258：598-599)以术语金属螯合层析进行介绍，并且先前已经在几篇文章中得以综述(Porath，J.[1992] ProteinPurification and Expression 3：263：281；以及其中所引用的文章)。IMAC纯化方法是基于加载以软金属离子诸如Cu²⁺和Ni²⁺的螯合性基质的使用。蛋白质表面上的供电子基团，特别是组氨酸的咪唑侧链，能够结合加载金属的非配位位点。通过降低pH或通过用咪唑替代可以使得电子供体基团与金属之间的相互作用可逆。因而，通过可逆的金属复合物/蛋白质相互作用可以纯化具有给电子基团的蛋白质。

1991年，Ford等(Ford，C.，I.Suominen，C.Glatz[1991] ProteinExpression and Purification 2：95-107)描述了将使用IMAC技术(Ni-NTA配体)的蛋白质纯化应用于具有组氨酸残基尾部的重组蛋白质(多组氨酸重组蛋白，“带His标签的蛋白质”)。这种方法利用了这样的事实，即两个或更多组氨酸残基能够协作以形成非常牢固的金属离子复合物。

当组氨酸残基作为“标签(tag)”以各种组合被附着于相关重组蛋白上时，例如包括特异性蛋白酶的识别位点，从而使得his标签随后能够以酶学方法去除，该技术存在许多变化。

在昆虫细胞中蛋白质的表达需要使用各种专门的培养基并且还必然伴有各种源自昆虫细胞的组分对重组蛋白的污染，所述组分未在细菌、真菌和哺乳动物细胞中发现。所以当需要对在昆虫细胞中产生的蛋白质进行纯化时，对于在细菌、真菌和哺乳动物细胞中产生的重组蛋白设计的纯化方案不一定是最佳选择。

因此对于蛋白质纯化的改进有持续性的需要，以便获得源自昆虫细胞中重组生产的药物级别的蛋白质。

发明目的

本发明的目的是提供一种纯化在昆虫细胞中表达的重组EGFR家族蛋白质的改进方法。本发明的另一个目的是提供HER-2蛋白的免疫原性变体，其通过特异性主动(active)免疫治疗的方式可有效用于例如癌症治疗。

发明概述

本发明人设计了一种将EGFR家族蛋白纯化到一定纯度的新方法，该纯度对于药用、特别是用作疫苗试剂是可接受的。

因此，在一个方面，本发明涉及一种纯化EGFR家族衍生蛋白质的方法，所述蛋白质重组生产于昆虫细胞培养物中并且所述蛋白质是适于通过固定化金属亲和层析的手段进行纯化的蛋白质，所述方法包括从所述昆虫细胞培养物中获得含有所述EGFR家族衍生(derived)蛋白质的、基本上不含细胞的样品，并且其后通过下列连续步骤对所述EGFR家族衍生蛋白质进行富集：

-用缓冲液渗滤和交换培养基，

-固定化金属亲和层析(IMAC)，

-大小排阻层析(SEC)，和

-阴离子交换层析(AIE)。

本发明的另一方面涉及HER-2蛋白的一种免疫原性变体，其包含SEQID NO：2，残基17-677所示的氨基酸序列。

附图说明

图1：IMAC的层析图谱。

箭头指示104.1峰。

图2：SEC的层析图谱。

箭头指示单体峰。

图3：AIE的层析图谱。

箭头指示104.1峰。

图4：pMT/hHER2MA5-5DUniHis载体p992，质粒图谱。

hHER2MA5-5D：编码hHER2MA5-5DUH蛋白的基因(核苷酸3604-5592)。

P2表位：编码hHER2MA5-5DUH蛋白中P2表位的序列(核苷酸4357-4401)。

P30表位：编码hHER2MA5-5DUH蛋白中P30表位的序列(核苷酸5500-5562)。

SV40晚期多聚腺苷酸化位点：Poly A信号(核苷酸263-268)。

ColEl：大肠杆菌(E.coli)复制的复制起点(核苷酸701-1434)。氨苄青霉素抗性基因：赋予细菌中氨苄青霉素抗性的基因(核苷酸1579-2439)。

金属硫蛋白启动子：能够用多种化合物(例如，镉)诱导的启动子(核苷酸3050-3415)。

Kozak样序列：核糖体结合位点(核苷酸3493-3501)。

BiP信号序列：指引HER2变体蛋白质分泌入细胞外区室的信号序列(核苷酸3502-3555)。

UniHis序列：编码用来纯化HER2 AutoVac蛋白的UniHis标签的序列(核苷酸3556-3597)。

二肽酶终止序列：如果要将UniHis标签从HER2 AutoVac蛋白质上剪切下来时使用(核苷酸3598-3603)。

发明详述

下面将在本发明的上下文中定义多种术语和措辞。

“EGFR家族衍生蛋白质”表示与人EGFR(或ErbB-1)；人HER-2/neu(ErbB-2)；HER-3(ErbB-3)；或HER-4(ErbB-4)同源或相同的蛋白质。

在本说明书和权利要求书中“自体的”EGFR家族蛋白质意指将要进行疫苗接种以对抗其自身所有的EGFR家族蛋白的动物的EGFR家族多肽。换句话说，只有当考虑到与将要进行疫苗接种的动物的关系时该术语才是相关的。

对于胸腺来源的淋巴细胞来说术语“T淋巴细胞”和“T细胞”是可以交换使用的，其负责各种细胞介导的免疫应答以及效应器功能诸如体液免疫应答中的辅助物活性。同样地，对于产生抗体的淋巴细胞来说术语“B淋巴细胞”和“B细胞”将是可以交换使用的。

“抗原呈递细胞”(APC)是将表位呈递给T细胞的细胞。典型的抗原呈递细胞是巨噬细胞、树突状细胞和其它呑噬性和胞饮性细胞。应当注意B细胞通过将结合到MCH II类分子上的T_H抗原表位呈递给T_H细胞也作为APCs起作用，但是当在本说明书和权利要求书中一般性地使用术语APC时，它意在指上述的呑噬性和胞饮性细胞。

“辅助T淋巴细胞”或“T_H细胞”表示CD4阳性的T细胞，其通过识别结合抗原呈递细胞上MHC II类分子的T_H抗原表位来向B细胞和细胞毒性T细胞提供帮助。

术语“细胞毒性T细胞”(CTL)将对于CD8阳性的T细胞使用，其需要T_H细胞的协助以便被激活。

在本说明书上下文中“特异性”免疫应答意指主要针对一种分子或一组准相同(quasi-identical)分子或，选择性地，针对呈递所述分子或准相同分子组的CTL表位的细胞的多克隆免疫应答。

在本说明书上下文中术语“多肽”意指从2到10个氨基酸残基的短肽，从11到100个氨基酸残基的寡肽，和超过100个氨基酸残基的多肽。而且，所述术语还指在包括蛋白质，即包含至少一个多肽的功能性生物分子；当包含至少两个多肽时，这些可以形成共价连接或可以是非共价连接的复合物。蛋白质中的多肽可以是糖基化的和/或脂质化的和/或包含辅基。

术语“亚序列”意为分别直接来自天然存在的氨基酸序列或核酸序列的任何至少3个氨基酸的连续序列或当有关时，至少3个核苷酸的连续序列。

至于术语“下调自体的EGFR家族蛋白”，本文指在活体中减少相关EGFR家族蛋白的量和/或活性。可以通过一些机制来获得所述下调，所述机制包括通过清除细胞(诸如巨噬细胞和其它吞噬细胞)来去除CEA，并且甚至更重要的是携带或具有抗原的细胞在动物中被CTLs杀死。

术语“免疫原”倾向于指能够在特定的动物中诱导免疫应答的物质。因此，将理解的是自体EGFR家族蛋白不是在自体宿主中的免疫原-必需使用强佐剂和/或共呈递T辅助表位和自体蛋白质从而针对自体蛋白质的免疫应答能够产生，并且在这样情形中，所述“免疫原”是能够打破自身耐性的物质的组合物。

术语“免疫原性有效量”具有它在本领域中的通常含义，即能够诱导免疫应答的免疫原的量，该免疫应答显著地使与免疫原共有免疫特征的病原体参与。

术语“药用盐”在本领域具有一般意义，即，其用于物质，当治疗目的疾病时，所述物质可以被接受作为人用的药剂的部分，并且因此所述术语有效地将高毒性物质的应用排除在外，所述毒性物质将恶化而不是改善被治疗的受试者的疾病。

“外源T-细胞表位”是一种肽，其能够结合MHC分子并且在动物物种中刺激T-细胞。优选的外源表位是“泛主的(promiscuous)”表位，即与动物物种或种群中MHC II类分子的基本部分结合的表位。对于这类表位，经常在本领域交替使用的术语是术语“通用T-细胞表位”。仅有非常有限数量的这些泛主的T-细胞表位是已知的，并且它们将在下面详细进行讨论。应当注意为了使按照本发明使用的免疫原在动物种群的尽可能大的部分中有效，可能需要1)将数个外源T-细胞表位***相同的类似物中或2)制备数个类似物，其中每个类似物***不同的泛主表位。应当注意外源T-细胞表位的概念还包括隐藏T-细胞表位的使用，即这样的表位，其来源于自身蛋白并且仅当以分离形式存在而不是所考虑的自身蛋白的一部分时发挥免疫原性性能。

“外源T辅助淋巴细胞表位”(外源T_H表位)是外源T细胞表位，其与MHC II类分子结合并且可以呈递在与MHC II类分子结合的抗原呈递细胞(APC)的表面。也是重要的是，加入“外源性”特点因此具有两个方面：外源T_H表位是1)由考虑到的动物呈递在MHC II类分子中和2)外源表位不是来自与进行免疫的靶抗原相同的多肽-所述表位因此也是与靶抗原异质的。

“CTL表位”是能够结合于MHC I类分子的肽。

术语“佐剂”具有它在疫苗技术领域中的通常含义，即物质或物质的组合物，其1)自身不能产生针对疫苗免疫原的特异性免疫应答，但2)然而能够增强针对免疫原的免疫应答。或者，换言之，仅用佐剂接种不提供针对免疫原的免疫应答，用免疫原的接种可能或可能不产生针对免疫原的免疫应答，但用免疫原和佐剂的组合接种诱导针对免疫原的免疫应答，其要强于由免疫原单独诱导的免疫应答。

“渗滤”是使用超滤膜来去除盐或溶剂，交换缓冲液，或在大分子溶液中分级不同大小的生物分子的技术。将通过超滤膜保留下来的大分子进行浓缩，同时去除溶剂和低分子量的种类。然而，大分子样品的简单浓缩将不彻底地去除更小的种类。因此，必需使用多个洗涤量(渗滤)将更小的种类从样品中“洗涤”除去。在超滤方法后，可以对样品进行浓缩从而进行进一步的分析或纯化。与凝胶过滤和透析比较，其具有优势，当进行凝胶过滤和透析时，在分离过程中样品会被稀释，需要另外的浓缩步骤。使用渗滤，不存在如两种方法中会发生的损失或污染情况。

“固定化金属亲和层析”(IMAC)是一种层析技术，其中将蛋白质纯化，其为它们对于某些二价金属离子的亲和性的结果，参看，在“发明背景”中的描述。

“大小排阻层析”(SEC)是一种层析技术，其中按照它们的物理大小来对蛋白质和其它的大分子进行分级。小分子仍旧保留在基质的孔中并且因此缓慢洗脱，而大分子被排出因此从基质中较早洗脱。

“阴离子交换层析”(AIE)是一种层析技术，其中具有净负电荷的分子被保留在柱基质上并随后通过用来自洗脱缓冲液的阴离子取代或通过改变所述蛋白质的净电荷来进行洗脱。

优选实施方案的描述

本发明涉及纯化方法，其特别适合于纯化EGFR家族衍生蛋白质，所述蛋白质重组地在昆虫细胞中产生。结合已经导致与人癌症相关的抗原HER-2的免疫原性变体的制备的尝试来考虑本发明，-这些变体在DES表达***，GlaxoSmithKline所有并且由Invitrogen上市的表达***中进行制备。所述***利用S2果蝇细胞和专门的载体。然而，将S2细胞作为宿主细胞进行重组生产的应用要解决考虑的HER-2变体具有其本身的一些问题，而这些问题已经通过使用本发明的方法进行解决(即，关于来自S2细胞的共迁移蛋白质的问题)。

用在本实施例中的具体蛋白质是人HER-2的变体，其在人中具有免疫原性-所述变体包括在SEQ ID NO：2，残基17-677中所示的氨基酸序列。然而，由于该氨基酸序列本身不适合于IMAC，其包含N-端组氨酸标签(在SEQ ID NO：1中的氨基酸残基1-14)，可以通过氨基二肽酶将其进行裂解(二肽基肽酶I，DPPI，参见Pedersen J等，1999，Protein Expression andPurification 15，389-400)。二氨基肽酶的终止序列由SEQ ID NO：2中的残基15和16组成。

因此，通常本发明的纯化方法特别适合于EGFR家族衍生蛋白质，所述蛋白质包括异源的氨基酸序列，所述氨基酸序列促进通过IMAC方式进行的纯化。该序列可以对于EGFR家族来源的蛋白质是天然的，但是更经常地，它是异源的氨基酸序列(即，不是与EGFR家族来源蛋白质天然相关的)。出于这种目的的优选的氨基酸序列富含组氨酸残基(例如，His₆标签和具有一些连续的组氨酸残基的其它氨基酸序列)。促进IMAC纯化的最优选的异源氨基酸序列是包括SEQ ID NO：2的残基1-14的那个。

进行本发明方法的EGFR衍生蛋白质优选地是包括人EGFR或人HER-2的氨基酸序列的基本部分的蛋白质，特别优选的是该基本部分主要来自人EGFR或人HER-2的细胞外部分。最优选的是人HER-2的变体，并且在最优选的实施方案中，人HER-2的变体包括至少一个外源T辅助细胞表位。

如上提及，已经考虑本发明的方法与在人HER-2抗原的某些变体的重组生产上进行的研究相结合。这些变体的特征在于包括泛主的外源T-辅助表位，所述表位被引入人HER-2细胞外结构域的氨基酸序列中。人HER-2的优选变体包括破伤风类毒素P2(SEQ ID NO：2的残基269-282)和P30(在SEQ ID NO：2中的残基649-669)并且最优选的变体具有由SEQID NO：2的残基1-677组成的氨基酸序列。

渗滤/缓冲液交换

在约2约25℃的温度下进行渗滤/缓冲液交换的步骤。然而，优选地使用在更低部分范围的温度，例如低于20℃的温度，诸如低于15℃或低于10℃的温度。最优选的温度在介于2和9℃之间的范围，诸如在介于约3℃和约9℃之间的范围，其中最优选的温度在约3到约8℃的范围并且尤其优选从4到约6℃。在更高的温度(例如，超过10℃)，存在蛋白质聚集的倾向，并且这可以通过加入去污剂，诸如吐温类型的去污剂来抵消。

正常情况下，以两轮来进行渗滤从而在培养基样品中首先浓缩大分子化合物，其后用缓冲液交换培养基。按照本领域标准方法进行这些程序，也参见实施例。优选地的是，浓缩步骤导致大分子化合物的介于2和25倍之间，诸如介于2和20倍之间，3和15倍之间，3和10倍之间的浓缩。大分子化合物的优选的浓度在介于4和8倍之间的范围内，并且最优选的浓度是约5倍，或对于介质的总蛋白质浓度，不超过3mg/ml，或优选地不超过2mg/ml。

缓冲液交换以两个连续步骤进行，其第一个步骤发生在至少6.5和至多7.2的pH下，并且第二个发生在至少7.0和最多8.0的pH下。然而，在两个范围的重叠部分在相同的pH下进行两个步骤是可能的。典型地，使用磷酸盐缓冲液进行缓冲液的交换。

缓冲液交换完成后，通过添加试剂到样品中来优选地增加连续步骤的严格性，所述试剂将竞争性结合IMAC步骤中的层析基质从而减少污染成分的无意义结合的量。例如，可以添加咪唑，组氨酸或高盐浓度的缓冲液到渗滤的和缓冲液中以增加严紧性。优选地，当使用咪唑时，其被添加到浓度达到介于约0.05-约20mM的范围中，优选地在从约0.5-约15mM范围中，诸如从约1到约10mM范围中。尤其优选的是咪唑的浓度在约2-约9mM的范围内，诸如从约3到约8mM的的浓度，最优选的咪唑的浓度是约4约6mM，诸如约5mM的浓度。当使用高盐浓度缓冲液(经常地是NaCl)，所述浓度在从100mM到多至约1M的范围中。

在IMAC步骤前，将去污剂加到渗滤和缓冲液交换的样品中也是优选的。所述去污剂将通常选自聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯诸如吐温20，吐温40，吐温60，吐温80，和吐温85，和烷基芳基聚醚醇诸如TritonX100，非离子去污剂，和基于碳水化合物的去污剂诸如辛基糖苷。将所述去污剂优选地加入达到介于约0.05％(v/v)和10％(v/v)之间，诸如约0.1％(v/v)的浓度。

IMAC

IMAC步骤包括在将缓冲液交换的样品应用到其上以前，用二价金属离子使层析介质带上电荷。典型地，二价金属离子选自由Ni²⁺，Cu²⁺，Zn²⁺，Co²⁺，和Fe²⁺组成的组中。优选地，二价金属离子是Zn²⁺。

IMAC中的层析介质的洗脱是通过将咪唑、组氨酸、高盐浓度缓冲液，或pH的变化应用到层析介质上(典型地在层析柱上)来完成的。例如，当使用咪唑进行洗脱时，通过以介于约50mM和约500mM之间(诸如介于100和400mM之间)，优选地在约200mM的浓度以一个单一步骤应用咪唑到来有利地进行此。或者，当使用组氨酸时，通过以介于20mM和400mM之间(诸如介于50和200mM之间)，优选地约100mM的浓度来以一个单一步骤应用组氨酸来进行此。所述高盐浓度的缓冲液通常以多至约1或甚至2M的浓度包含NaCl。

SEC

SEC基质的平均孔径优选地是分离介于10kDa和600kDa之间的球蛋白的那个。

在已经将所述样品应用到基质上后，用磷酸盐或TRIS缓冲液，或替代地用生物学缓冲液诸如HEPES来进行洗脱。优选的缓冲液是TRIS缓冲液。

在SEC的过程中，将pH维持在约7到约8的范围内并优选地将所述pH保持在约7.5。

如果有关且必要(即，当磷酸盐缓冲液用在SEC步骤中时)，对包含获自SEC的EGFR家族衍生蛋白质的样品在AIE步骤前进行洗脱从而将磷酸盐浓度调整到少于15mM，诸如介于10和12.5mM之间的范围中。然而，令人惊奇的是使用这样的磷酸盐缓冲液浓度完全可以进行AIE。

AIE

在本发明的纯化步骤中的最终步骤是至少一个AIE步骤，其中使用强阴离子交换基质进行一个AIE步骤-在优选的实施方案中，还存在在前的步骤，所述步骤包括应用弱阴离子交换基质。此优选地包括将样品上载到强或弱离子交换基质上，所述样品包含在SEC后获得的EGFR家族衍生蛋白质。典型地，用在介于7和8之间的pH，优选地约pH 7.5的缓冲(磷酸盐，TRIS或生物学缓冲液诸如HEPES)的NaCl溶液进行洗脱。

在这些步骤后，在洗脱物中获得的蛋白质具有临床级别的纯度并且基本不含来源于昆虫细胞培养物的污染物。

预期使用弱阴离子交换基质的AIE步骤将可以应用作为IMAC和SEC步骤之间的步骤，而不是将其包括作为结束的AIE步骤的部分。

另外任选的步骤

渗滤后，有利的是包括病毒清除步骤(例如，用2％吐温20和0.3％TnBP)并且更有利的是在AIE后包括病毒过滤步骤(例如，使用Planova 15N滤器或相似的滤器)，其中两个步骤都被包括从而确保得到的产物没有临床上不可接受的污染物。然而，在使用无病毒***的情形中，这两个步骤不是必须的。

本发明的HER-2变体

如上提及，当纯化人HER-2肿瘤抗原的变体时，已经考虑了本发明的方法。已经证明该具体的变体特别适合于作为疫苗试剂来诱导针对自体HER-2的免疫原性反应，因此该具体变体也是本发明的一部分。

通常，具体应用、制剂、重组产物、合适的载体和宿主细胞以及其他涉及该具体HER-2变体的细节可以见于WO 00/20027的公开内容中。因此，在仅简单讨论后，将提供具体涉及所述变体的内容。因此，将WO00/20027的公开内容包括在本文中作为参考，并提供涉及用HER-2变体进行免疫的必须教导和产生这些以及它们的制剂通用方法。还将涉及针对自体HER-2的核酸疫苗的WO 00/20027的公开内容并入本文作为参考。

如上提及，本发明的另一个方面涉及HER-2蛋白质的免疫原性变体，其包括SEQ ID NO：2，残基17-677所示的氨基酸序列。优选的是，该变体是多肽，其由SEQ ID NO：2，残基1-677所示的氨基酸序列组成，即还包括由SEQ ID NO：2的残基1-14组成的富含组氨基的纯化标签、以及由在SEQ ID NO：2中的残基15和16组成的氨基肽酶终止序列的变体。

本发明还包括编码该HER-2蛋白质的免疫原性变体的核酸片段，诸如DNA片段。特别优选的DNA片段具有编码在SEQ ID NO：1提出的HER-2变体编码序列。

在HER-2变体的重组产生中的有效工具是携带本发明的核酸片段的载体。特别优选的是能够自主复制的载体。典型地，所述载体选自由质粒、噬菌体、粘粒、微型染色体和病毒组成的组。

尤其优选表达载体。本发明的典型表达载体在5′-3′方向中并且在可操作的连接中，包括驱动本发明的核酸片段表达的启动子，任选地编码多肽片段的前导肽的核酸序列，本发明的核酸片段以及任选地编码终止子的核酸序列，所述前导肽使多肽片段能够分泌或整合到膜中。

对于重组生产而言，尤其优选用本发明的载体转化的宿主细胞。特别感兴趣的宿主细胞是昆虫细胞，并且最优选的是果蝇来源的宿主细胞诸如S2细胞。

一种稳定的细胞系也是本发明的部分，其携带本发明的载体并且表达本发明的核酸片段，并且其任选地在其表面上分泌或携带本发明的HER-2蛋白质的免疫原性变体。

另外，本发明还提供在人中针对HER-2蛋白质免疫的免疫原性组合物，其包括混合以药用载体或赋形剂并任选地佐剂的上述HER-2蛋白质的免疫原性变体。合适的制剂的细节可以见于WO 00/20027中。

或者，所述疫苗可以以核酸疫苗的形式存在(关于涉及该技术的细节，参看WO 00/20027)。因此，一种免疫原性组合物也是本发明的部分，所述免疫原性组合物用于在人中针对HER-2蛋白质进行免疫，其包括混合以药用载体或赋形剂并任选地佐剂的上述载体。

本发明的范围还包括针对自体HER-2的方法，所述方法包括向人施用免疫原性有效量的

-上述HER-2蛋白质的免疫原性变体或包括本文描述的变体的免疫原性组合物，或

-本文所述的载体或包含所述载体的免疫原性组合物。

特别优选的是该免疫方法(以及对于本文描述的免疫的不同方式)用于治疗或改善癌症。

实施例导言

随后的范例使用″104.1分子″(参见SEQ ID NO：2)，其是与癌症相关的HER-2蛋白质的免疫原性类似物。然而，本领域技术人员将理解本发明的一般教导可应用于其它带His标签的蛋白质，尤其是在昆虫细胞***中重组生产的那些。

所述纯化方法由随后的4个一般纯化步骤组成：

1.用发酵上清液的缓冲液交换进行渗滤。

2.固定化金属亲和层析法(IMAC)

3.凝胶过滤/大小排阻层析(SEC)

4.阴离子交换层析法(AIE)

另外存在被包括在目前优选的方法中的2个病毒清除步骤，一个病毒失活步骤和一个病毒过滤步骤。

渗滤/缓冲液交换

所述渗滤满足三个目的1)浓缩物质″104.1″2)从发酵培养基中去除可干扰随后的捕获步骤的低分子量物质，诸如金属离子和3)将缓冲液改变为更适合于金属鳌合层析(IMAC)的缓冲液。缓冲液交换发生在一个或两个步骤中。第一个步骤在50mM磷酸盐缓冲液pH 7.0中；第二个步骤在50mM磷酸盐缓冲液pH 7.5中是任选的。如果渗滤进行到pH 7.5，该pH次序似乎是关键的，因为直接达到pH 7.5导致了非鉴定的组分从昆虫细胞发酵培养基中的沉淀。进行浓缩主要是为了减少在后来的IMAC中的加样时间并且减少在缓冲液交换步骤中的缓冲液的消耗并且对于所述方法不是关键的，因为随后的IMAC在本质上是浓缩方法步骤。所述浓缩范围目前是约5倍或对于培养基的总蛋白质而言，不超过3mg/ml(优选地不超过2mg/ml)，但是当蛋白质水平不高并且预期变得更高，诸如20或甚至25倍是可能的时候，使用10倍浓缩的实验似乎也是可以工作的。在手册中描述的超过5倍的进一步浓缩可以改善所述方法，因为其将在随后的IMAC柱上减少上样时间。

针对IMAC的样品制备

在应用到IMAC柱前，可以通过如果在洗脱缓冲液中使用咪唑时，将咪唑加到0-10mM的终浓度来制备渗滤物；如果没有加入咪唑(或相似的物质)，我们进行104.1与其它来自昆虫细胞的蛋白质的共纯化。另一方面，当用L-组氨酸进行洗脱时，替代地将盐加入洗脱缓冲液。另外，加入吐温20到0.1％(v/v)的终浓度(过滤后)。可以将高达5％应用于IMAC步骤并且超过0.1％的更高浓度将导致更小的直径形成。还预期其它的去污剂是有效的，显而易见的有其它的吐温去污剂(吐温40，60，80和85)。

IMAC

所述物质104.1在N-端具有所谓的His-标签，其对于固定在柱基质上的复合二价金属离子具有亲和性。关键的参数是二价金属离子的选择和洗脱剂/方法的选择。还可以将Ni²⁺，Cu²⁺和Zn²⁺都用作鳌合金属离子。然而，Zn²⁺已经提供了良好的回收和更少的杂质。对于被捕获的104.1的洗脱，可以使用一些策略。1)将咪唑施加到所述柱上2)将组氨酸施加到所述柱上3)将高盐浓度缓冲液施加到所述柱上，和4)在所述柱上改变pH。

目前优选的方法使用通过在一个步骤中施加100mM L-组氨酸进行的洗脱。然而，可以使用低至50mM，但是结果是较低浓缩的104.1和回收更低。还可能应用咪唑(施加为200mM溶液)，并且这还可以在更低(低至50mM)的浓度使用，并对于回收具有相同的影响。

SEC

下面的实施例描述所述SEC在TRIS缓冲液中进行。然而，磷酸盐似乎也工作，但是TRIS比磷酸盐更适合于随后的AIE。当使用磷酸盐或包含盐的TRIS缓冲液时，SEC洗脱物的洗脱在施加到AIE柱之前是必须的从而减少磷酸盐的浓度，并且对于仅TRIS缓冲液而言，这将不是必须的。

如果IMAC已经在高于0.4％的吐温-20浓度中运行，在SEC中其应该被调整到＜0.4％，因为如果吐温-20的浓度高于0.2％，104.1蛋白质不与AIE柱结合。当所述AIE在其他缓冲液***中运行时，这可能是不同的。

AIE层析的样品制备

如果在磷酸盐中运行，将来自SEC的相关级分在水中进行稀释，1体积洗脱物+3体积的水来降低磷酸盐的浓度，因为其干扰AIE层析。该问题还在SEC段落中进行了讨论。

AIE层析

关键的参数是样品以及缓冲液***的pH和离子强度。

如果SEC已经在TRIS中进行运行，可以避免所述样品制备(在水中进行稀释)并且减少上样体积(以及上样时间)。当在包括盐的TRIS缓冲液中运行AIE时，所述AIE在TRIS缓冲液中被稀释直到达到的低于3mS/cm的离子强度。

通过SDS-PAGE、蛋白质印迹(WB)、ELISA、HPLC、视觉观察、OD₂₈₀、pH、鲎变形细胞溶解物试验(LAL)和氨基酸分析来分析最终的批量产物(bulk product)。通过SDS-PAGE、WB、ELISA和OD₂₈₀来分析中间产物。

如将显而易见的，优选地将所述AIE进行为两个连续的步骤，其中第一个步骤利用弱阴离子交换基质并且第二个步骤利用强阴离子交换基质。然而，意欲使用弱AIE基质的步骤可以被去除从而被引入介于IMAC和SEC步骤之间。

实施例1

培养HER-2变体104.1

细胞系产生

用pMT载体(DES***，Invitrogen)转染S2果蝇细胞(Drosophilamelanogaster)的多克隆培养物，所述pMT载体包含编码HER2变体104.1的基因；该pMT载体的整个核酸序列在SEQ ID NO：1中列出。用携带赋予潮霉素抗性的基因的质粒平行转染所述细胞，所述抗性使能应用潮霉素来选择被转染的细胞。

将有限稀释技术用于分离单一细胞克隆并且从被选定的细胞系中制备Master Cell Bank(MCB)。

HER2蛋白质Auto Vac制备

将来自MCB的一个小瓶在T-烧瓶中复苏并且在包含ExCell420培养基(JRH)的摇瓶中于25℃进行增殖从而获得足够的生物量以进行生物反应器的接种。将共45×10⁹的细胞稀释到3000mL ExCell 420中，所述ExCell420补充以4mM谷氨酰胺，0.1％Pluronic F68，和0.5mL/L的PD30消泡剂。将所述3000mL用于接种Ap-plikon生物反应器(7L工作体积)，其中所述培养物于25℃培养3天，dO₂＝50％(100％＝空气饱和)，pH＝6.5±0.1(用5％H₃PO₄和0.5M NaOH进行调节)，并在170rpm进行搅拌。

将该培养物用ExCell 420稀释到总细胞浓度为15×10⁶细胞/mL，并用于接种15L的工作体积Applikon生物反应器，所述ExCell 420补充以4mM谷氨酰胺，0.1％Pluronic F68和0.5mL/L的PD30消泡剂，所述生物反应器保持25℃，dO₂＝50％(用纯氧喷气)，pH＝6.5±0.1(用5％H₃PO₄和0.5M NaOH进行调节)，并在142rpm进行搅拌。将所述培养物用ExCell420持续稀释直到达到10L的总体积，所述ExCell 420补充以4mM谷氨酰胺和0.1％Pluronic F68。每日调整稀释率以防止细胞数量降到低于15×10⁶细胞/mL。将PD30消泡剂手动加入培养物中以维持0.5mL/L的总浓度。

当供应完成时，使用BioSep细胞(AppliSens)声保留装置在1RV/日(每日的反应器体积)开始灌流从而阻止随移去的培养基的细胞损失。在30×10⁶细胞/mL的细胞浓度，通过添加总共2μM CdCl₂(10mM贮存液)到培养物和培养基储存器中来诱导所述培养物。

收获所述发酵培养基，对其进行离心以获得无细胞上清液，并通过PALL滤器0.8/0.22μm进行过滤。将得到的无菌上清液贮存于-80℃直到使用(在-80℃贮存多至3个月没有产生可检测到的稳定性问题)或贮存在4℃达多至1周(也没有任何可检测到的蛋白质的降解)。

诱导后10天终止培养并且丢弃在生物反应器中的残余培养基。

实施例2

渗滤/浓缩和缓冲液变化

在使用前，如果实施例1的发酵上清液被贮存于-80℃，将其在4℃缓慢冻融过夜(最后的3到4小时可以在冷水中进行)，并且其后在4℃贮存最多3天。或者，直接使用发酵上清液。

将发酵上清液在Sorvall RE 5C Plus离心机在SCA3000管中以10,000rpm于4℃离心15分钟。

在冷室中于5±3℃在Pro-Flux M12(Millipore)上进行渗滤，所述Pro-Flux M12具有Pellicon 2盒式滤器30K 0.5m²(Millipore，Cat#P2B030A05)。在使用前，将滤器贮存在0.1M NaOH中。因此在渗滤前，通过用milli-Q水对滤器进行彻底洗涤：用milli-Q水(3L)填充标准储存器并用水通过滤器进行洗涤直到200ml留在储存器中。将该方法重复3次直到总共12升已经通过滤器。现在，可以起始渗滤：

如通过比色法测量，将最大15L发酵上清液浓缩约5倍或浓缩至培养基的总蛋白浓度不超过2mg/ml。

启动再循环泵。反压阀被部分锁住，以给出显示反压(例如0.2bar)的出口压。将所述泵速调整到30-50％。压力差应该显示0.7-1.2Bar，因为这是当使用滤器最大容量并且在滤器上的流速对应于3-4L/min(例如，出口压P＝0.2Bar，入口压P＝1.0bar，ΔP＝0.8)的情形。考虑到管的寿命和性能，入口的压力应该显示最大1.4bar。如果需要更高的入口压，可以升高再循环泵压(％)或可以通过将更高的压力应用到管上(1-5级)来升高管上的机械压。当所述反压阀被关闭时，受到更高的入口和更高的出口压力。所述反压阀应该从不被彻底关闭。

随后，被浓缩的发酵上清液在一个或两个步骤中进行缓冲液交换，首先使用10体积的50mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄，pH 7.0，并且接着在任选的第二个步骤中使用10体积的50mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄，pH 7.5：用总共3L总体积的缓冲液来填充在ProFlux M12微孔过滤器装置上的标准储存器并且也用缓冲液填充所述侧面储存器。在所述装置上的设定与当浓缩样品时的设置相同。

测量所述缓冲液交换的样品的体积(Vb)并且将样品取出进行SDS-PAGE(Sb)。将被浓缩的缓冲液交换样品分成11ml和50ml的批次并迅速冷冻至-80℃。

渗滤物的分析

测量pH和离子强度从而确保缓冲液交换的有效性。

通过在1cm比色杯中在280nm处以分光光度法来估计总蛋白质的浓度。将用50mM磷酸钠缓冲液pH 7.5 10倍稀释的样品(在50mM磷酸钠缓冲液pH 7.5中稀释)用作参考(使用Abs₂₈₀ 1＝1mg/ml总蛋白质的近似值)。另外，可以通过量热Bradford方法(BioRad)来对总蛋白质的浓度进行测量。通过ELISA对变体104.1的具体浓度进行测量并且通过SDS-PAGE、银染和WB-ECL检测对渗滤物进行进一步分析。

渗滤步骤的注意事项

重要的是，在变化到pH 7.5之前，在低于7.1的pH下开始缓冲液的交换。另外，沉淀来自发酵培养基的残余组分。

已经将渗滤的样品贮存于-80℃数月，其中在进行定量HER-2 ELISA中性能没有变化。但是，当融化时，甚至短期暴露于37℃和54℃大大减少渗滤物在相同的ELISA中的性能。当在-80℃融化后被保持于0℃(冰/水)和4℃时，渗滤物在ELISA中的性能稳定达至少4小时。

渗滤后，方便的是使任何一种可能出现在渗滤物中的病毒失活。为了进行此，将50％的吐温-20和TnBP分别加到2％和0.3％的终浓度后，将样品在2-8℃融化并且合并，随后通过1.0/0.45/0.2μm的滤器进行过滤。将所述溶液保存在2-8℃达16-20个小时同时轻柔搅拌。接着，在随后的IMAC层析步骤(实施例3)之前，将所述溶液进行0.2μm过滤。

实施例3

IMAC

进行IMAC的一般层析原理是介于在蛋白质上的“标签”和在柱基质上的金属离子鳌合复合体之间的亲和性。所述层析基质是POROS 20MC或优选地，50MC(两者都来自Applied Biosystems)并且所述鳌合金属离子是Zn²⁺。对104.1分子提供以His-标签并且His-标签与柱基质结合的缓冲液***是50mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄，0.1％吐温20，pH 7.5。

将每ml柱基质2-4mg 104.1进行上样并且随后使用100mM L-组氨酸，50mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄，pH 7.5，0.1％吐温20进行洗脱。或者，当用200mM咪唑进行洗脱时，进行结合的缓冲液***还包含5 mM的咪唑。

仪器：VISION工作站(Applied Biosystems)。

软件：进行显示的数据分析软件，BioCAD 700E，版本3系列的软件，Perseptive Biosystem。

检测：在λ＝280和220nm处的UV吸收值。

电导率：0-200mS

校准的pH在：7.0和10

温度：在室温(20-24℃)用缓冲液和柱进行所述方法并且在冰上进行样品的上样，在10℃进行级分收集。

样品制备

对于包含104.1分子的渗滤物，当将包含咪唑的缓冲液用于在IMAC中的洗脱时，将800mM的咪唑加到终浓度为5mM咪唑，而当将L-组氨酸用于在IMAC中进行洗脱时，将吐温-20加入到0.1％(v/v)的终浓度。紧接着应用到柱之前，立即将所述样品以真空通过0.22μm的滤器进行过滤。将所述样品保持在5±3℃(优选地4℃)直到施加到柱上，其中当应用时其被保持于冰上。在室温的处理时间应该被最小化。

柱

在2000-2500psi下填塞的16×100mm(20.1ml)PEEK柱(AppliedBiosystems)中的POROS 20MC或50MC(优选的)-其它柱(取决于纯化方法的等级)是同等有效的。

柱带电(带状充电)程序

流速：10ml/min.

1.5 CV的50mM NaPO₄(NaH₂PO₄/Na₂HPO₄的缩写)pH 7.5，0.1％吐温-20(带状)

2.5 CV H₂O(Milli-Q).

3.40 CV 100mM ZnCl₂，pH 4.5.

4.40 CV H₂O(Milli-Q).

5.20 CV 50mM NaPO₄ pH 7.5，0.1％吐温-20。

所述柱应该在每次运行之前进行充电。

层析程序

流速30ml/min，上样5ml/分钟

级分收集大小9ml，并且在用100mM L-组氨酸的洗脱峰处5ml(或，当适用时，在用200mM的洗脱峰处)。在冷却(10℃)的级分收集器中进行收集。

将包含病毒被失活的渗滤物的溶液于4℃上载到柱上并且在用50mMNaPO₄pH 7.5，0.1％吐温20，100mM组氨酸进行洗脱之前，用20 CV 50mM NaPO₄ pH 7.5，0.1％吐温20，0.5M NaCl，随后用5CV的50mMNaPO₄ pH 7.5，0.1％吐温20进行洗涤。

从色谱上将来自洗脱峰的级分进行合并(参见图1)。在峰起始处开始合并并且收集总共50ml(或1.5柱体积)或将基于SDS-PAGE/WB结果或ELISA的级分合并到总共50ml。将该合并物在5±3℃保存过夜或直接继续进行到SEC。当在SDS PAGE和WB-ECL上进行分析时，在5±3℃，-20℃和冷于-70℃处的多至7天的贮存在通过0.22μm滤器过滤后没有显示总蛋白质的损失。

柱的清洁

用5CV 1MNaOH，2M NaCl，随后用10CV的水将所述柱进行洗涤。如果需要进一步的清洁，见生产商的RSP。将所述柱于5-30℃贮存在30％的EtOH中。

IMAC中间物的IMAC的分析

通过WB-ECL和SDS-PAGE/银染来分析起始物质，流通和被洗脱的级分。

IMAC合并物的分析

通过WB-ECL和SDS-PAGE/银染，HPLC和OD_280nm(或10倍稀释的样品)来分析所述合并物。通过ELISA来确定具体的104.1浓度。

实施例4

SEC凝胶过滤层析法

在mM Tris，0.1％吐温-20，pH 7.5中运行所述凝胶过滤步骤，但是50mM的Na₂HPO₄/NaH₂PO₄可以取代Tris作为缓冲***。通过在Superdex200制备等级基质上的Superloop(Pharmacia)来将50ml的实施例3的IMAC进行上样。

仪器：进行灌流层析的BioCAD 700E工作站，其装备有半制备的流动池从而减少在所述柱上的反压。

软件：进行显示的数据分析软件，BioCAD 700E，版本3系列软件，透视生物***。

检测：在λ＝280和220nm处的UV吸收值。

传导性：0-200mS

被校准的pH在：7.0和10

温度：缓冲液和柱在室温(20-24℃)并且将所述样品从4℃直接上样。如果所述收集器没有被冷却，包含单体104.1的级分应该在收集后直接被移到4℃。

样品制备

来自在缓冲液，50mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄，0.1％吐温20，100mM L-组氨酸(或200mM咪唑)，pH 7.5中的IMAC的合并物不需要特殊制备。所述样品应该被保持冷却(5±3℃)直到上样。

柱

被包装在Pharmacia柱XK 50×960mm(1884ml)中的Superdex 200制备等级以15ml/min作为最终流速。上样最大50ml。

层析程序

一般流速8ml/min，上样5ml/min.

级分大小9.0ml。

1.平衡1.5 CV 20mM Tris，0.1％吐温-20，pH 7.5

2.上样：通过50ml Super Loop，5ml/min

3.洗脱1.2 CV 20mM Tris，0.1％吐温-20，pH 7.5

通过比较凝胶和/或SE/RP-HPLC的结果合并来自单体峰的级分(参见图2)从而获得纯产物(大约130ml)。该合并物可以在5±3℃保存过夜，或直接进行到实施例5的AIE层析。当通过SDS PAGE和WB-ECL进行分析时，合并物在5±3℃，-20℃和冷于-70℃的多至7天的贮存在经过0.22μm滤器过滤后没有显示总蛋白质的损失。

所述柱的卫生处理和清洁

通过将0.5NaOH在逆流方向上以6.5ml/min(20cm/h)运行1-2小时，随后运行3个柱床体积的缓冲液来清洁所述柱。对于卫生处理，将0.5-1.0NaOH以逆流方向，13ml/min(40cm/h)运行30-60分钟，随后运行3-5个柱床体积的无菌缓冲液来进行。将所述柱于4-8℃贮存在20％乙醇中。对于另外的信息，见生产商的指南。

SEC中间物的分析

通过WB-ECL，SDS-PAGE/银染和SE/RP-HPLC来分析起始物质和被洗脱的级分。

SEC合并物的分析

通过WB-ECL和SDS-PAGE/银染，HPLC和OD_280nm来分析所述合并物。通过ELISA来确定具体的104.1浓度。

SEC的注意事项

在IMAC和从Superloop上样之间，确定将所述样品保持在5±3℃。

如果级分合并器没有被冷却(10℃)，确定在收集后，立即将级分移到冷室/冰箱中。

当频繁使用所述柱时，将定量流动(0.2ml/min)的20mM Tris，pH 7.5，0.1％吐温20施加到所述柱上(或者使用50mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄来取代20mM Tris并且如果是该情形，使用0.5％的吐温-20)。

实施例5

AIE层析

第一个任选步骤

阴离子交换层析是第一个任选地在Poros 50PI基质柱上进行的步骤。用20mM Tris HCl，0.1％吐温20在pH 7.5来平衡所述柱。平衡后，将所述样品留待进行生物负荷检验。

将所述SEC洗脱物于4℃上载到所述柱上并且用20 CV 20mM TrisHCl，0.1％吐温20在pH 7.5进行洗涤，随后用20mM Tris HCl，250mMNaCl，0.1％吐温20 pH 7.5进行产物洗脱。将产物合并物进行0.2μm过滤，通过OD280nm，104.1 ELISA，RP-HPLC和SE-HPLC进行分析并在2-8℃贮存多至3天。

在贮存于20mM NaOH之前，用H₂O(milli-Q)对Poros 50PI柱进行冲洗并且用10CV的2M NaCl，1M NaOH进行清洁。在平衡和随后的再利用之前，其用5CV的0.5M NaOH进行卫生处理并且用H₂O(milli-Q)进行冲洗。

强制性步骤

阴离子交换层析在pH 7.5(20mM TRIS)上进行，优选地在PEEK 4.6×100mm(1.662ml)柱中，在强阴离子交换灌流基质POROS 50HQ (AppliedBiosystems)上进行。104.1在200mM NaCl中进行洗脱。

仪器：进行灌流层析的VISION工作站

软件：进行显示的数据分析软件，BioCAD 700E，版本3系列软件，透视性生物***.

检测：在λ＝280和220nm处的UV吸收值。

传导性：0-200mS

被校准的pH：7.0和10

温度：用缓冲液和柱在室温(20-24℃)进行所述方法并且从冰上上载样品。将级分收集器冷却到10℃。

样品制备

如果第一个任选的AI步骤被省略，在温和磁力搅拌下，可以将所述SEC中间物在包含0.1％吐温-20的水中稀释1+3(到25％)。否则，将POROS 50PI洗脱物稀释在15个体积的20mM Tris HCl，0.1％吐温-20，pH 7.5中从而减少传导性。所述样品应该被保持冷却(5±3℃)直到并且在整个上样过程中。

柱

以2000-2500psi，将POROS 50HQ填充在4.6×100mm(1.662ml)PEEK柱(Applied Biosystems)中。

层析程序

一般流速10ml/min，上载样品5ml/min。

级分大小：在样品上载过程中9ml，在第一个洗脱步骤中1ml，和在第二个洗脱步骤中5ml。

在Poros 50HQ基质柱上于4℃进行阴离子交换层析。用20mM TrisHCl，0.1％吐温20在pH 7.5平衡所述柱。平衡后，将样品留待进行生物负担检验。

将所述样品上载到所述柱上并且用10CV 20mM Tris HCl，0.1％吐温20在pH 7.5和10 CV 20mM Tris HCl，20mM NaCl，0.1％吐温20在pH 7.5进行洗涤，随后用20mM Tris HC l，200mM NaCl，0.1％吐温20 pH7.5进行产物洗脱。

通过比较凝胶结果将来自洗脱峰(参见图3)的级分进行合并从而获得超过2.5mg/ml的浓度或OD_280nm超过2.5。在合并前，可以将所述级分在5±3℃保持过夜。当通过SDS PAGE和WB-ECL进行分析时，合并物在5±3℃，-20℃和冷于-70℃的多至7天的贮存在经过0.22μm滤器过滤后没有显示总蛋白质的损失。

柱的卫生处理

用10个柱体积(CV)的1M NaOH，2M NaCl，随后用20CV的水来洗涤所述柱。如果需要进一步的卫生处理，参见生产商的指南。将所述柱于5-30℃贮存在30％的乙醇中。

分析

AIE合并物的分析

通过WB-ECL和SDS-PAGE/银染，外观和描述，pH，HPLC，LAL和OD_280nm(使用3倍稀释的样品)对所述合并物进行分析。通过ELISA来对具体的104.1浓度进行测定。

AIE的注意事项

如果SEC中间物被少于1+3(25％)的进行稀释，由于来自磷酸盐缓冲液的干扰，104.1在AIE的整个运行中被检测到。

已经将多至25mg的104.1施加到AIE柱，而在整个运行中没有可检测量的104.1。

任选的病毒过滤

病毒过滤和药物的随后的稀释和填充发生在等级(Class)100环境中。将来自一个和多个Poros 50HQ运行的预过滤的纯化批量从冷冻贮存中移去并在2-8℃融化。接着，将它们进行0.1μm过滤，并通过Planova 20N病毒过滤膜。所述滤器留待进行完整性检验。通过OD280nm的测量，将病毒被过滤的物质调整到2.5-3.0mg/ml的浓度。

最终批量产物的贮存

在通过0.22μm滤器后，将最终批量产物在冷于-70℃的温度下贮存于聚丙烯容器中或CZ小瓶中。

如此获得的产品具有适合于临床应用的纯度。

序列表

<110>法麦克萨有限公司

<120>HER-2变体的纯化

<130>P1020DK00

<160>2

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>5661

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>衍生于pMT的重组表达质粒

<220>

<221>polyA_信号

<222>(263)..(268)

<223>SV40晚期聚腺苷酸化位点

<220>

<221>misc_feature

<222>(1579)..(2439)

<223>氨苄青霉素抗性基因，由互补链编码

<220>

<221>启动子

<222>(3050)..(3415)

<223>金属硫蛋白启动子

<220>

<221>RBS

<222>(3493)..(3501)

<223>类Kozak序列

<220>

<221>CDS

<222>(3502)..(5592)

<223>编码人HER-2的免疫原性的，带his标签的变体DNA

<220>

<221>sig_肽

<222>(3502)..(3555)

<223>BiP信号序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(3556)..(3597)

<223>组氨酸标签

<220>

<221>mat肽

<222>(3556)..(5589)

<220>

<221>misc_feature

<222>(3598)..(3603)

<223>二肽酶终止序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(3604)..(5589)

<223>编码hHER2MA5-5DUH蛋白的基因

<220>

<221>misc_feature

<222>(4357)..(4401)

<223>白喉类毒素P2表位

<220>

<221>misc_feature

<222>(5500)..(5562)

<223>白喉类毒素P30表位

<400>1

ggccgctcga gtctagaggg cccttcgaag gtaagcctat ccctaaccct ctcctcggtc 60

tcgattctac gcgtaccggt catcatcacc atcaccattg agtttaaacc cgctgatcag 120

cctcgactgt gccttctaag atccagacat gataagatac attgatgagt ttggacaaac 180

cacaactaga atgcagtgaa aaaaatgctt tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt 240

atttgtaacc attataagct gcaataaaca agttaacaac aacaattgca ttcattttat 300

gtttcaggtt cagggggagg tgtgggaggt tttttaaagc aagtaaaacc tctacaaatg 360

tggtatggct gattatgatc agtcgacctg caggcatgca agcttggcgt aatcatggtc 420

atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg 480

aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt 540

gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg 600

ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga 660

ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat 720

acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca 780

aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc 840

tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata 900

aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc 960

gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc 1020

acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga 1080

accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc 1140

ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag 1200

gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag 1260

gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag 1320

ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca 1380

gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga 1440

cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat 1500

cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga 1560

gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg 1620

tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga 1680

gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc 1740

agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac 1800

tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc 1860

agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc 1920

gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc 1980

catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt 2040

ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc 2100

atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg 2160

tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag 2220

cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat 2280

cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc 2340

atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa 2400

aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta 2460

ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa 2520

aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga 2580

aaccattatt atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc cctttcgttc 2640

gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca 2700

gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt 2760

ggcgggtgtc ggggctggct taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac 2820

catatgcggt gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgccat 2880

tcgccattca ggctgcgcaa ctgttgggaa gggcgatcgg tgcgggcctc ttcgctatta 2940

cgccagctgg cgaaaggggg atgtgctgca aggcgattaa gttgggtaac gccagggttt 3000

tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtgccagtg aattaattcg ttgcaggaca 3060

ggatgtggtg cccgatgtga ctagctcttt gctgcaggcc gtcctatcct ctggttccga 3120

taagagaccc agaactccgg ccccccaccg cccaccgcca cccccataca tatgtggtac 3180

gcaagtaaga gtgcctgcgc atgccccatg tgccccacca agagttttgc atcccataca 3240

agtccccaaa gtggagaacc gaaccaattc ttcgcgggca gaacaaaagc ttctgcacac 3300

gtctccactc gaatttggag ccggccggcg tgtgcaaaag aggtgaatcg aacgaaagac 3360

ccgtgtgtaa agccgcgttt ccaaaatgta taaaaccgag agcatctggc caatgtgcat 3420

cagttgtggt cagcagcaaa atcaagtgaa tcatctcagt gcaactaaag gggggatcta 3480

gatcggggta ccaaagtcac c atg aag ttg tgc atc ttg ctg gcc gtc gtg 3531

Met Lys Leu Cys Ile Leu Leu Ala Val Val

-15 -10

gcc ttc gtg ggc ctg tcg ctg ggc atg aag cac caa cac caa cat caa 3579

Ala Phe Val Gly Leu Ser Leu Gly Met Lys His Gln His Gln His Gln

-5 -1 1 5

cat caa cat caa cat caa gcc ccc tcc acc caa gtg tgt acc ggc aca 3627

His Gln His Gln His Gln Ala Pro Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr

10 15 20

gac atg aag ctg cgg ctc cct gcc agt ccc gag acc cac ctg gac atg 3675

Asp Met Lys Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met

25 30 35 40

ctc cgc cac ctc tac cag ggc tgc cag gtg gtg cag gga aac ctg gaa 3723

Leu Arg His Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu

45 50 55

ctc acc tac ctg ccc acc aat gcc agc tta agt ttc ctg cag gat atc 3771

Leu Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile

60 65 70

cag gag gtg cag ggc tac gtg ctc atc gct cac aac caa gtg agg cag 3819

Gln Glu Val Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln

75 80 85

gtc cca ctg cag agg ctg cgg att gtg cga ggc acc cag ctc ttt gag 3867

Val Pro Leu Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu

90 95 100

gac aac tat gcc ctg gcc gtg cta gac aat gga gac ccg ctg aac aat 3915

Asp Asn Tyr Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn

105 110 115 120

acc acc cct gtc aca ggg gcc tcc cca gga ggc ctg cgg gag ctg cag 3963

Thr Thr Pro Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln

125 130 135

ctt cga agc ctc aca gag atc ttg aaa gga ggg gtc ttg atc cag cgg 4011

Leu Arg Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg

140 145 150

aac ccc cag ctc tgc tac cag gac acg att ttg tgg aag gac atc ttc 4059

Asn Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe

155 160 165

cac aag aac aac cag ctg gct ctc aca ctg ata gac acc aac cgc tct 4107

His Lys Asn Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser

170 175 180

cgg gcc tgc cac ccc tgt tct ccg atg tgt aag ggc tcc cgc tgc tgg 4155

Arg Ala Cys His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp

185 190 195 200

gga gag agt tct gag gat tgt cag agc ctg acg cgc act gtc tgt gcc 4203

Gly Glu Ser Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala

205 210 215

ggt ggc tgt gcc cgc tgc aag ggg cca ctg ccc act gac tgc tgc cat 4251

Gly Gly Cys Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His

220 225 230

gag cag tgt gct gcc ggc tgc acg ggc ccc aag cac tct gac tgc ctg 4299

Glu Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu

235 240 245

gcc tgc ctc cac ttc aac cac agt ggc atc tgt gag ctg cac tgc cca 4347

Ala Cys Leu His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro

250 255 260

gcc ctg gtc cag tac atc aaa gct aac tcc aaa ttc atc ggt atc acc 4395

Ala Leu Val Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr

265 270 275 280

gag ctg cgg tat aca ttc ggc gcc agc tgt gtg act gcc tgt ccc tac 4443

Glu Leu Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr

285 290 295

aac tac ctt tct acg gac gtg gga tcc tgc acc ctc gtc tgc ccc ctg 4491

Asn Tyr Leu Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu

300 305 310

cac aac caa gag gtg aca gca gag gat gga aca cag cgg tgt gag aag 4539

His Asn Gln Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys

315 320 325

tgc agc aag ccc tgt gcc cga gtg tgc tat ggt ctg ggc atg gag cac 4587

Cys Ser Lys Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His

330 335 340

ttg cga gag gtg agg gca gtt acc agt gcc aat atc cag gag ttt gct 4635

Leu Arg Glu Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala

345 350 355 360

ggc tgc aag aag atc ttt ggg agc ctg gca ttt ctg ccg gag agc ttt 4683

Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe

365 370 375

gat ggg gac cca gcc tcc aac act gcc ccg ctc cag cca gag cag ctc 4731

Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu

380 385 390

caa gtg ttt gag act ctg gaa gag atc aca ggt tac cta tac atc tca 4779

Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser

395 400 405

gca tgg ccg gac agc ctg cct gac ctc agc gtc ttc cag aac ctg caa 4827

Ala Trp Pro Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln

410 415 420

gta atc cgg gga cga att ctg cac aat ggc gcc tac tcg ctg acc ctg 4875

Val Ile Arg Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu

425 430 435 440

caa ggg ctg ggc atc agc tgg ctg ggg ctg cgc tca ctg agg gaa ctg 4923

Gln Gly Leu Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu

445 450 455

ggc agt gga ctg gcc ctc atc cac cat aac acc cac ctc tgc ttc gtg 4971

Gly Ser Gly Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val

460 465 470

cac acg gtg ccc tgg gac cag ctc ttt cgg aac ccg cac caa gct ctg 5019

His Thr Val Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu

475 480 485

ctc cac act gcc aac cgg cca gag gac gag tgt gtg ggc gag ggc ctg 5067

Leu His Thr Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu

490 495 500

gcc tgc cac cag ctg tgc gcc cga ggg cac tgc tgg ggt cca ggg ccc 5115

Ala Cys His Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro

505 510 515 520

acc cag tgt gtc aac tgc agc cag ttc ctt cgg ggc cag gag tgc gtg 5163

Thr Gln Cys Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val

525 530 535

gag gaa tgc cga gta ctg cag ggg ctc ccc agg gag tat gtg aat gcc 5211

Glu Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala

540 545 550

agg cac tgt ttg ccg tgc cac cct gag tgt cag ccc cag aat ggc tca 5259

Arg His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser

555 560 565

gtg acc tgt ttt gga ccg gag gct gac cag tgt gtg gcc tgt gcc cac 5307

Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His

570 575 580

tat aag gac cct ccc ttc tgc gtg gcc cgc tgc ccc agc ggt gtg aaa 5355

Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys

585 590 595 600

cct gac ctc tcc tac atg ccc atc tgg aag ttt cca gat gag gag ggc 5403

Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly

605 610 615

gca tgc cag cct tgc ccc atc aac tgc acc cac tcc tgt gtg gac ctg 5451

Ala Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu

620 625 630

gat gac aag ggc tgc ccc gcc gag cag aga gcc agc cct ctg acg tcc 5499

Asp Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser

635 640 645

ttc aac aac ttc acc gtg agc ttc tgg ctg cgc gtg ccc aag gtg agc 5547

Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser

650 655 660

gcc agc cac ctg gag atc gtc tct gcg gtg gtt ggc att ctg 5589

Ala Ser His Leu Glu Ile Val Ser Ala Val Val Gly Ile Leu

665 670 675

tagaagcttg gtaccgagct cggatccact agtccagtgt ggtggaattc tgcagatatc 5649

cagcacagtg gc 5661

<210>2

<211>696

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>衍生于PSI的重组表达质粒

<400>2

Met Lys Leu Cys Ile Leu Leu Ala Val Val Ala Phe Val Gly Leu Ser

-15 -10 -5

Leu Gly Met Lys His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln

-1 1 5 10

Ala Pro Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys Leu Arg Leu

15 20 25 30

Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gln

35 40 45

Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr

50 55 60

Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val Gln Gly Tyr

65 70 75

Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu Gln Arg Leu

80 85 90

Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr Ala Leu Ala

95 100 105 110

Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro Val Thr Gly

115 120 125

Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser Leu Thr Glu

130 135 140

Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln Leu Cys Tyr

145 150 155

Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn Asn Gln Leu

160 165 170

Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys His Pro Cys

175 180 185 190

Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser Ser Glu Asp

195 200 205

Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys Ala Arg Cys

210 215 220

Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys Ala Ala Gly

225 230 235

Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu His Phe Asn

240 245 250

His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val Gln Tyr Ile

255 260 265 270

Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Arg Tyr Thr Phe

275 280 285

Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu Ser Thr Asp

290 295 300

Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln Glu Val Thr

305 310 315

Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro Cys Ala

320 325 330

Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala

335 340 345 350

Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe

355 360 365

Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser

370 375 380

Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu

385 390 395

Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu

400 405 410

Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg Gly Arg Ile

415 420 425 430

Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly Ile Ser

435 440 445

Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu Ala Leu

450 455 460

Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val Pro Trp Asp

465 470 475

Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr Ala Asn Arg

480 485 490

Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His Gln Leu Cys

495 500 505 510

Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys Val Asn Cys

515 520 525

Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys Arg Val Leu

530 535 540

Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys Leu Pro Cys

545 550 555

His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly Pro

560 565 570

Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe

575 580 585 590

Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met

595 600 605

Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys Pro

610 615 620

Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro

625 630 635

Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Phe Asn Asn Phe Thr Val

640 645 650

Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Ile

655 660 665 670

Val Ser Ala Val Val Gly Ile Leu

675

Claims

1.一种纯化EGFR家族衍生蛋白质的方法，所述蛋白质在昆虫细胞培养物中被重组生产并且所述蛋白质是适合于通过固定化金属亲和层析的方式进行纯化的蛋白质，所述方法包括从所述昆虫细胞培养物中获得包含所述EGFR家族衍生蛋白质的、基本不含细胞的样品，其后，通过下列连续步骤对所述EGFR家族衍生蛋白进行富集：

-用缓冲液渗滤和交换培养基，

-固定化金属亲和层析(IMAC)，

-大小排阻层析(SEC)，和

-阴离子交换层析(AIE)。

2.权利要求1的方法，其中所述EGFR家族衍生蛋白质包括促进通过IMAC方式进行纯化的异源氨基酸序列。

3.权利要求2的方法，其中所述异源氨基酸序列富含组氨酸残基。

4.按照权利要求3的方法，其中所述异源氨基酸序列包括SEQ ID NO：2的残基1-14。

5.按照前述权利要求任一项的方法，其中所述EGFR家族衍生蛋白质包括人EGFR或人HER-2的氨基酸序列的基本部分。

6.按照权利要求5的方法，其中所述基本部分主要衍生自EGFR或HER-2的细胞外部分。

7.按照权利要求5或6的方法，其中所述EGFR家族衍生蛋白质是人HER-2的变体。

8.按照权利要求7的方法，其中人HER-2的变体包括至少一个外源T辅助细胞表位。

9.按照权利要求8的方法，其中人HER-2的变体包括破伤风类毒素表位P2(SEQ ID NO：2的残基269-282)和P30(SEQ ID NO：2的残基649-669)。

10.按照权利要求9的方法，其中人HER-2的变体包括SEQ ID NO：2的氨基酸残基17-677。

11.按照权利要求10的方法，其中人HER-2的变体的氨基酸序列由SEQID NO：2的残基1-677组成。

12.按照前述权利要求任一项的方法，其中在约2到约25℃，优选地在约3到约8℃的温度下进行渗滤/缓冲液交换的步骤，其中当温度超过10℃时，任选地添加去污剂诸如吐温。

13.按照权利要求12的方法，其中在两轮中进行所述渗滤从而首先浓缩在培养基样品中的大分子化合物并且其后用缓冲液交换培养基。

14.按照权利要求13的方法，其中将所述大分子化合物浓缩约2至25倍。

15.按照权利要求14的方法，其中将所述大分子化合物浓缩约3-5倍。

16.按照权利要求12-15任一项的方法，其中在一个或两个连续步骤中进行缓冲液交换，其中第一个步骤发生在至少6.5和至多7.2的pH下，并且其中第二个任选的步骤发生在至少7.0和最多8.0的pH下。

17.按照权利要求12-16任一项的方法，其中将磷酸盐缓冲液用于缓冲液交换。

18.按照前述权利要求任一项的方法，其中将咪唑、组氨酸或高盐浓度缓冲液加入渗滤的和缓冲液交换的样品，或其中缓冲液交换的样品是基本上没有改变的。

19.按照权利要求18的方法，其中当被加入时，将咪唑加入以达到约0.05到约20mM的浓度。

20.按照前述权利要求任一项的方法，其中将去污剂加入所述渗滤的和缓冲液交换的样品以达到介于约0.05％(v/v)和10％(v/v)之间的、诸如约0.1％(v/v)的浓度，所述去污剂选自聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯诸如吐温20、吐温40、吐温60、吐温80、和吐温85，烷基芳基聚醚醇诸如Triton X100，非离子去污剂，和基于碳水化合物的去污剂诸如辛基糖苷。

21.按照前述权利要求任一项的方法，其中所述IMAC步骤包括在施加缓冲液交换的样品前，用二价金属离子使层析介质带电。

22.按照权利要求21的方法，其中所述二价金属离子选自由Ni²⁺，Cu²⁺，Zn²⁺，Co²⁺，和Fe²⁺组成的组，优选地是Zn²⁺。

23.按照权利要求21或22的方法，其中通过将咪唑、组氨酸、高盐浓度缓冲液或pH的变化施加到层析介质中来进行层析介质的洗脱。

24.按照权利要求23的方法，其中通过以介于约50mM和约500mM之间，优选地约200mM的浓度以一个单一步骤施加咪唑进行层析介质的洗脱，或其中通过以介于约20mM和400mM之间，优选地约100mM的浓度以一个单一步骤施加组氨酸来进行洗脱。

25.按照前述权利要求任一项的方法，其中所述SEC步骤包括用磷酸盐或TRIS缓冲液或生物学缓冲液诸如HEPES进行洗脱。

26.按照权利要求25的方法，其中将所述pH维持在约7-8，优选地约7.5。

27.按照权利要求25或26的方法，其中SEC基质的平均孔径分离介于10kDa和600kDa之间的球蛋白。

28.按照前述权利要求任一项的方法，其中，如果必要，将获自SEC的包含EGFR家族衍生蛋白质的样品在AIE步骤前进行稀释从而将磷酸盐浓度调整到小于15mM，诸如调整到介于10和12.5mM之间的范围。

29.按照前述权利要求任一项的方法，其中所述AIE步骤包括将在SEC后获得的包含EGFR家族衍生蛋白质的样品上载到强或弱阴离子交换基质，或两者上。

30.按照权利要求29的方法，其中在介于7和8之间的pH下用缓冲的NaCl溶液进行洗脱。

31.按照前述权利要求任一项的方法，其中将使病毒失活的步骤引入介于渗滤/缓冲液交换和IMAC步骤之间。

32.按照前述权利要求任一项的方法，其中在所述AIE步骤后是病毒过滤步骤。

33.按照前述权利要求任一项的方法，其中将使用弱阴离子交换柱的AIE步骤引入IMAC和SEC步骤之间。

34.HER-2蛋白质的免疫原性变体，其包含SEQ ID NO：2，残基17-677所示的氨基酸序列。

35.按照权利要求34的HER-2蛋白质的免疫原性变体，其由SEQ IDNO：2，残基1-677所示的氨基酸序列组成。

36.一种核酸片段，其编码按照权利要求34或35的HER-2蛋白质的免疫原性变体。

37.按照权利要求36的核酸片段，其是DNA片段。

38.一种载体，其携带按照权利要求36或37的核酸片段。

39.按照权利要求37的载体，其能够自主复制。

40.按照权利要求37或39的载体，其选自由质粒、噬菌体、粘粒、微型染色体和病毒组成的组。

41.按照权利要求37-40任一项的载体，其是表达载体。

42.按照权利要求41的载体，其在5′→3′方向上并且在可操作的连接中，包括驱动按照权利要求36或37的核酸片段表达的启动子，任选地编码多肽片段的前导肽的核酸序列，按照权利要求36或37的核酸片段，以及任选地编码终止子的核酸序列，所述前导肽使多肽片段能够分泌或整合到膜中。

43.一种转化的宿主细胞，其携带权利要求37-42的任一项的载体。

44.一种稳定的细胞系，其携带按照权利要求41或42的载体并且表达按照权利要求36或37的核酸片段，并且其任选地在其表面上分泌或携带按照权利要求34或35的HER-2蛋白质的免疫原性变体。

45.一种免疫原性组合物，其用于在人中针对HER-2蛋白质进行免疫，该组合物包括混合以药用载体或赋形剂以及任选地佐剂的按照权利要求34或35的HER-2蛋白质的免疫原性变体。

46.一种免疫原性组合物，其用于在人中针对HER-2蛋白质进行免疫，该组合物包括混合以药用载体或赋形剂以及任选地佐剂的按照权利要求41或42的载体。

47.一种针对自体HER-2对人进行免疫的方法，所述方法包括向人施用免疫原性有效量的

-按照权利要求34或35的HER-2蛋白质的免疫原性变体

-按照权利要求45的免疫原性组合物，或

-按照权利要求41或42的载体，或

-按照权利要求46的免疫原性组合物。

48.按照权利要求47的方法，其中将针对自体HER-2蛋白质的免疫用于治疗或改善癌症。