CN1345374A - HER－2/neu融合蛋白 - Google Patents

HER－2/neu融合蛋白 Download PDF

Info

Publication number
CN1345374A
CN1345374A CN00805752A CN00805752A CN1345374A CN 1345374 A CN1345374 A CN 1345374A CN 00805752 A CN00805752 A CN 00805752A CN 00805752 A CN00805752 A CN 00805752A CN 1345374 A CN1345374 A CN 1345374A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
protein
neu
seq
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN00805752A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1201004C (zh
Inventor
M·A·奇弗
D·加森
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Smith Crane Beecham Public Ltd
Corixa Corp
Original Assignee
Smith Crane Beecham Public Ltd
Corixa Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Smith Crane Beecham Public Ltd, Corixa Corp filed Critical Smith Crane Beecham Public Ltd
Publication of CN1345374A publication Critical patent/CN1345374A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1201004C publication Critical patent/CN1201004C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C07K2319/43—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation containing a FLAG-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/73—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing coiled-coiled motif (leucine zippers)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明主要涉及HER－2/neu融合蛋白,编码该融合蛋白的核酸分子,表达该融合蛋白的病毒载体,包含该融合蛋白和/或编码该融合蛋白的核酸分子的药物组合物(例如疫苗)。本发明还涉及通过激发或增强对HER－2/neu融合蛋白的免疫应答来治疗或预防癌症的方法,包括用于治疗与HER－2/neu致癌基因相关的癌症。

Description

HER-2/neu融合蛋白
相关申请
本发明要求1999年1月29日美国临时申请60/117,976的优先权，并参考了该申请的全部内容。
基于联邦政府资助的权利申明
无。
发明领域
本发明主要涉及HER-2/neu融合蛋白，编码该蛋白质的核酸分子，表达该蛋白质的病毒载体，和包含该蛋白质和/或编码该蛋白质的核酸分子的药物组合物(例如疫苗)。本发明还涉及通过激发或增强对HER-2/neu蛋白质免疫应答来治疗或预防癌症的方法，包括用于治疗与HER-2/neu致癌基因相关的癌症。
发明背景
尽管投入了大量人力物力，癌症仍然是主要死因之一。例如，癌症是35-74岁妇女中的头号死因。***癌是妇女中最常见的癌症，而且其发病率正在上升。据估计，9名妇女中就有1名可能被诊断为***癌。***癌的标准治疗方法主要围绕手术、放射和化疗相结合。这些疗法对某些癌症具有显著疗效。然而，如果诊断滞后，***癌将是最难治愈的。所以需要可早期诊断和治疗的方法。
癌症的共同特征之一是细胞不受控制的生长。癌细胞似乎发生了转变，由其正常表型转变为可自主生长的恶性表型。体细胞基因的扩增和过度表达被认为是引起细胞恶变共同的最初行为。由致癌基因编码的恶性表型特征通过细胞***传递给恶变细胞的后代。
至今，已鉴定了至少40个在癌细胞中活动，并引起或参与恶变的致癌基因。已根据这些基因产物(例如致癌基因表达的蛋白质)的推定功能或位置对这些致癌基因进行了分类。
据信，在某些方面，致癌基因正常细胞生理学所必需的。例如，HER-2/neu致癌基因似乎是受体样糖蛋白类酪氨酸激酶家族的一员，与表皮生长因子受体(EGFR)具有高度的相同性。据推测，HER-2/neu在细胞生长和/或分化中起着一定作用。似乎，HER-2/neu通过一种正常基因产物的增加或下调所致的定量机制诱导了恶变。
p185糖蛋白是HER-2/neu致癌基因的产物。在***癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌和***癌等多种癌症中，HER-2/neu基因发生扩增，p185过度表达。p185与恶变相关，被发现存在于卵巢、***、结肠和肺等部位发生的50-60％导管原位癌，20-40％侵袭性***癌和腺癌实质性组分中。HER-2/neu表达不仅与恶性表型密切相关，而且与恶变发展相关。HER-2/neu的过度表达与***癌和卵巢癌的预后不良相关。
p185是一种跨膜蛋白质，估计其分子量约185KD，长约1255个氨基酸。p185有一个645氨基酸的胞外域(ECD)，其氨基酸序列与EGFR具有至少40％相同性，一个高度疏水的跨膜域，和一个约580氨基酸的羧基末端胞内域(ICD)，与EGFR具有至少80％相同性。
目前需要一种针对HER-2/neu相关恶变的抗癌疫苗，以及可激发或增强对HER-2/neu基因免疫应答的组合物和方法。本发明就针对了这些及其它重要目的。
发明概述
本发明提供了HER-2/neu p185融合蛋白，编码该蛋白的核酸分子，包含该编码聚核苷酸的病毒载体，用于免疫温血动物从而抵抗HER-2/neu相关性恶变。可将本发明的融合蛋白或核酸分子制成组合物，还包含药学上认可的的载体或稀释剂，例如水包油乳液，还可含有一种或多种其它活性成分，例如免疫刺激物，例如SBAS-2，3D-MPL，QS21或3D-MPL联合QS21。本发明的组合物可以是疫苗的形式，或以此形式使用。可将所述的融合蛋白、核酸分子、病毒载体、药物组合物和/或疫苗一次性给予(例如，给予具有癌症发生和复发高度危险性的个体，或怀疑患有癌症的人)，或定期给予(例如，给予具有癌症发生和复发高度危险性的个体，或怀疑患有癌症的人)。本发明的化合物或组合物可用于包括人在内的温血动物，用于治疗一种或多种已经存在的肿瘤，或预防肿瘤的发生或复发。
本发明还提供了一种通过激发或增强对HER-2/neu蛋白质免疫应答从而抑制或预防患者体内癌症发展的方法，包括给予患者以上所述的药物组合物或疫苗。所述患者可以是，例如，***癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌或***癌患者，本发明方法可用于治疗这些患者，或者预防性治疗具有以上癌症危发性的患者。实施方式之一中，所述的给予药物组合物或疫苗包括：用本发明核酸分子体外转染温血动物的细胞，或用含本发明核酸分子的病毒载体体外感染温血动物的细胞，然后将转染或感染后的细胞回输给患者。
本发明还提供了一种去除生物样品中肿瘤细胞的方法，包括：将生物样品与HER-2/neu融合蛋白特异性T细胞接触，所述接触步骤的条件和时间足以消除样品中表达该蛋白质的细胞。在相关的内容中，还提供了抑制患者体内癌症发展的方法，包括将如上处理的生物样品给予患者。
另一实施方式中，提供了激发和/或扩增HER-2/neu融合蛋白特异性T细胞的方法，包括将T细胞与一种或多种以下物质接触：(i)上述融合蛋白；(ii)编码该融合蛋白的聚核苷酸，和/或(iii)表达该融合蛋白的抗原呈递细胞，接触的条件和时间足以激发和/或扩增T细胞。还提供了如上所述制备的分离的T细胞群。继而，本发明还提供了将有效量如上所述制备的T细胞群给予患者来抑制其体内癌症发展的方法。
另一实施方式中，本发明还提供了抑制患者体内癌症发展的方法，其步骤包括：(a)将分离自患者的CD4+/CD8+T细胞与一种或多种以下物质共培养：(i)HER-2/neu融合蛋白；(ii)编码该融合蛋白的聚核苷酸；(iii)表达该融合蛋白的抗原呈递细胞；和(b)给予患者有效量的增殖T细胞，由此抑制患者体内癌症的发展。在给予患者前，可以，但非必须，继续增殖细胞的克隆。
最后，本发明还提供了制造HER-2/neu融合蛋白的方法，其步骤包括：(a)在细胞内引入表达载体，该载体包含编码HER-2/neu融合蛋白的聚核苷酸，(b)培养转染后的细胞；和(c)纯化表达产生的蛋白质。在一优选实施方式中，所述细胞是CHO细胞。另一优选实施方式中，对所述细胞进行无血清悬浮培养。另一实施方式中，所表达的蛋白质分两步纯化：Q琼脂糖高效柱上的离子交换层析，和苯基琼脂糖6快速低取代柱上的疏水性层析。
通过以下详细描述和附图，本发明的以上及其它内容将是显而易见的。本发明分别参考了在此引用的各参考文献的全部内容。
附图简述
图1是pFLAGCMV-1/ICD表达质粒的图谱，其大小为6.7kb。
图2是pFLAGCMV-1/KD表达质粒的图谱，其大小为5.7kb。
图3是pFLAGCMV-1/PD表达质粒的图谱，其大小为5.7kb。
图4显示，HER-2/neu的磷酸化区分泌进入培养基，HER-2/neu的胞内域和激酶区不分泌进入培养基，参见实施方式3。
图5是表达载体pcDNA3.1/hygro/ECD-PD的图谱，大小为8.3kb。
图6显示HEK-293和CHO细胞内ECD-PD融合蛋白的表达结果，显示融合蛋白分泌进入培养基，参见实施方式4。
图7显示人HER-2/neu蛋白质的全长氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。
图8显示大鼠HER-2/neu蛋白质的全长氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。激酶区是其中的氨基酸721-998。
图9显示HER-2/neu蛋白质胞外域的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)。
图10显示人HER-2/neu蛋白质磷酸化区(PD)的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。
图11显示人HER-2/neu蛋白质磷酸化区中一优选部分的氨基酸序列(ΔPD)(SEQ ID NO：5)。
图12显示包含人HER-2/neu蛋白质的胞外域(ECD)和磷酸化区(PD)的融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。
图13显示包含人HER-2/neu蛋白质的胞外域(ECD)和磷酸化区中优选部分(ΔPD)的融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)。
图14显示大鼠HER-2/neu蛋白质胞外域(ECD)的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)。
图15显示编码人HER-2/neu蛋白质的DNA分子的全长核苷酸序列(SEQ IDNO：9)。该全长核苷酸序列可参见WO96/30514，本发明全面参考了其内容。
图16显示编码大鼠HER-2/neu蛋白质的DNA分子的全长核苷酸序列(SEQID NO：10)。该全长核苷酸序列可参见Bargmann等(1986)，自然，319：226-30，和GENBANK/X03362，本发明全面参考了其内容。
图17是ELISA试验结果：半抗原与哺乳动物细胞或大肠杆菌细胞内产生的不同ECD-PD融合蛋白结合。大肠杆菌产生的融合蛋白与C-或N-末端6×组氨酸尾(分别记为C-His尾和N-His尾)同框。
图18是无血清条件下悬浮培养，CHO-K1细胞和毕赤氏酵母细胞内HER-2/neu ECD-PD融合蛋白表达的比较。
图19显示小鼠HER-2/neu的核苷酸序列。
图20显示小鼠HER-2/neu的氨基酸序列。
具体实施方式的描述前言
本发明涉及能够调节(以激发或增强为佳)对HER-2/neu致癌基因表达的蛋白质产物的免疫力，包括作用于温血动物体内的如下恶变，其中，扩增的HER-2/neu基因及相关恶变不需要肿瘤上存在该基因的蛋白质表达产物。例如，该基因的过度表达可能涉及肿瘤形成的引发和早期阶段，但此后，该蛋白质的表达减少或消失。本发明可用于激发或增强有效的免疫应答，从而将HER-2/neu阳性肿瘤转变为HER-2/neu阴性，避免HER-2/neu阳性肿瘤的形成，并引起已有HER-2/neu阳性肿瘤的消退。
以下是本发明中的缩写：“ECD”表示胞外域，“ICD”表示胞内域，“PD”表示胞内域中的磷酸化区(即，被磷酸化的区域)，“ΔPD”表示磷酸化区内的一个片段，“KD”表示胞内域中的激酶区。HER-2/neu基因表达的产物在此称为“HER-2/neu蛋白质”，又称“p185”或“c-erbB2”。定义
“HER-2/neu ECD-ICD融合蛋白”，即“ECD-ICD”或“ECD-ICD融合蛋白”，指包含HER-2/neu蛋白质胞外域(或其片段)和胞内域(或其片段)的融合蛋白(或其片段)。在此，ECD-ICD融合蛋白不包括HER-2/neu跨膜域的实质性部分，最好完全不包括HER-2/neu跨膜域。
“HER-2/neu ECD-PD融合蛋白”，即“ECD-PD”或“ECD-PD融合蛋白”，或“HER-2/neu ECD-ΔPD融合蛋白”，即“ECD-ΔPD”或“ECD-ΔPD融合蛋白”，指包含HER-2/neu蛋白质胞外域(或其片段)和磷酸化区(或其片段，如ΔPD)的融合蛋白(或其片段)。ECD-PD和ECD-ΔPD不包括HER-2/neu跨膜域的实质性部分，最好完全不包括HER-2/neu跨膜域。
“HER-2/neu ECD-ICD融合蛋白”和“HER-2/neu ECD-PD融合蛋白”及相关的术语应理解为包括其片段、类似物和功能相当物(统称为“变异体”)，例如有一处或多处氨基酸***、缺失或取代的那些，在本发明优选实施方式中，它们或者(i)比HER-2/neu蛋白质更强地激发或增强免疫应答，或(ii)基本上不影响HER-2/neu蛋白质激发或增强免疫应答(例如，变异体激发辅助T细胞或细胞毒T细胞应答，或激发抗体的产生)。具体的非限定性变异体实例包括HER-2/neuECD-ICD融合蛋白和HER-2/neu ECD-PD融合蛋白的片段、类似物和功能相当物。变异体可以“基本上相同”或“基本上相似”于含有天然多肽组分、并保留了激发免疫应答的能力的融合蛋白。
“融合蛋白”指至少由两段多肽共价连接而成的蛋白质，其中，一段多肽来自一种蛋白质序列或区域，另一段则来自另一蛋白质序列或区域。这些多肽可以直接连接，也可以通过共价接头(例如氨基酸接头(如聚甘氨酸接头)，化合物接头(例如碳酸水合物接头)，脂质接头，脂肪酸接头，或聚醚接头(例如PEG等)连接(参见Hermanson，生物偶联技术(1996))。形成融合蛋白的多肽一般以C末端与N末端相连，但也可能C末端与C末端相连，N末端与N末端相连，或N末端与C末端相连。融合蛋白中多肽的顺序可以任意。“融合蛋白”还包括修饰变异体，多态变异体，等位基因变异体，突变体，构成融合蛋白的多肽的亚序列和种间类似物。融合蛋白的制备可通过将一种蛋白质序列的氨基酸链与另一蛋白质序列的氨基酸链共价连接，例如通过制备连续编码该融合蛋白的重组聚核苷酸。融合蛋白可包含来自相同或不同物种的2、3、4或更多种不同氨基酸链。一个融合蛋白内的不同氨基酸链可以直接拼接在一起，也可以通过化学连接基团或氨基酸连接基团间接拼接在一起。融合蛋白还可以包含本发明所述的其它组分。
“蛋白质”在此与“多肽”和“肽”同义。
“核酸”指脱氧核糖核酸或核糖核酸，以及它们聚合物的单链或双链形式。它还包括如下含有已知核苷酸类似物或修饰骨架残基和连键的核酸：合成的，天然的，非天然的，与所参照的核酸具有相似结合特性的，与之具有相同代谢方式的。此类类似物的例子包括但不限于：硫代磷酸酯，磷酰胺，磷酸甲酯，手性磷酸甲酯，2-O-甲基核糖核苷酸，肽-核酸(PNAs)。
除非另作说明，一段特定的核酸序列还暗含其保守性修饰的变异体(例如简并性密码子的取代)和互补序列，以及明确列出的序列。具体地说，获得简并密码子取代可通过生成多段如下序列：其中，用混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代一个或多个(或全部)选定密码子的第三位(Batzer等(1991)，核酸研究，19：5081；Ohtsuka等(1985)，生物化学杂志，260：2605-2608；Rossolini等(1994)，分子细胞探针，8：91-98)。在此，核酸与基因，cDNA，mRNA，寡核苷酸和聚核苷酸同义。
在严谨条件下，含本发明融合蛋白的聚核苷酸序列可与编码该融合蛋白中各多肽的核苷酸序列杂交。因此，编码融合多肽内各多肽的聚核苷酸序列包括保守性修饰的变异体，多态变异体，等位基因变异体，突变体，亚序列和种间类似物。
“序列相同性百分比”通过在一个比较窗内比较最适排列的两段序列来测定，其中，为了获得两序列的最适排列，聚核苷酸序列比较窗内的部分与参比序列(没有增加或缺失)对比时可以有增加或缺失(例如空格)。百分比的计算为：确定两序列中核酸碱基或氨基酸残基相同的位置数，得出匹配位数，将其除以比较窗内的总位数，再乘以100，得出序列相同性百分比。
聚核苷酸序列“基本相同”表示具有至少25％序列相同性。相同性百分比也可能在25-100％之间。较好的实施方式是，用本发明所述的方法，与参比序列相比的相同性为至少25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，99％，或更高；较好的方法是后文所述采用标准参数的BLAST。本领域技术人员知道，考虑密码子简并性，氨基酸相似性，读码框位置等因素，可对这些数值适当调整，从而确定两核苷酸序列所编码蛋白质的相同性。就此而言，氨基酸序列“基本相同”指序列相同性至少40％，以40-100％为佳，更好的是至少60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％。“基本相似”的多肽其序列共同性如前所述，但不相同残基的位置上可以是保守性氨基酸取代。保守性氨基酸取代指具有相似侧链的残基之间的可互换性。例如，具有脂肪族侧链的氨基酸组是甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的氨基酸组是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的氨基酸组是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的氨基酸组是苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸组是赖氨酸，精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的氨基酸组是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守性氨基酸取代是：缬氨酸-赖氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸-赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸，天冬氨酸-谷氨酸，天冬酰胺-谷氨酰胺。
对比序列的最适排列可按照Smith和Waterman(1981)，Add.APL.Math.2：482所述的局部相同性算法，Needleman和Wunsch(1970)分子生物学杂志，48：443所述的相同性排列算法，Pearson和lipman(1988)美国科学院院报85：2444所述的相似性研究方法，以及这些算法的计算机化形式(Wisconsin基因软件包中的GAP，BESTFIT，BLAST，FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group(GCG)，575 Science Dr.Madison，WI)来进行，或通过目测。
适合用于测定序列相同性或相似性的较好的算法例是BLAST和BLAST 2.0算法，分别参见Altschul等(1977)，核酸研究25：3389-3402和Alschul等(1990)，分子生物学杂志215：403-410。采用本文所述的参数使用BLAST和BLAST2.0，测定本发明核酸和蛋白质的序列相同性百分比。BLAST软件通过国家生物技术信息中心(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)向公众开放。用参数M(匹配残基对的得分；总是＞0)和N(错配碱基对的罚分；总是＜0)计算核苷酸序列的累计分值。用计分矩阵来计算氨基酸序列的累计分值。在以下时刻终止各方向上的计分延续：当累计排列分值由所得最大值下降达X时；当累计分值因一个或多个负分残基排列累积而趋于0或0以下；当达到其中之一序列的末端时。BLAST算法参数W，T和X决定排列对比的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)采用其默认值：字符长度(W)11，期望值(E)10，M＝5，N＝-4，并对两条链都进行比较。对于氨基酸序列，采用BLASTP程序，采用其默认值：字符长度(W)3，期望值(E)10，以及BLOSUM62计分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1989)美国科学院院报89：10915)排列(B)50，期望值(E)10，M＝5，N＝-4，对两条链都进行比较。
如果在中等严谨条件下，最好是高度严谨条件下，两分子能够彼此杂交，或与第三种核酸杂交，也表明它们基本相同。严谨条件视序列而异，而且不同环境下也不同。序列越长，特异性杂交的温度越高。有关核酸杂交的全面论述可参见Tiissen，“生物活性和分子生物学技术-与核酸探针的杂交”中“有关杂交原理和核酸试验策略的综述”(1993)。通常，严谨条件的选择应是：比特定序列在确定离子强度和pH下熔点Tm低约5-10℃。Tm即(确定离子强度和pH下)50％的靶序列与优选匹配探针杂交的温度。通常，严谨条件应选择：pH7.0至8.3时，盐浓度低于1.0M钠离子(通常为0.01-1.0M钠离子或其它盐浓度)，短探针(例如10-50个核苷酸)的温度约30℃，长探针(例如超过50个核苷酸)的温度约60℃。也可以加入甲酰胺之类去稳定剂来获得严谨条件。对于选择性或特异性杂交来说，阳性信号为背景杂交的2倍以上，是其10倍以上则更好。
严谨条件的例子如：50％甲酰胺，5×SSC和1％SDS，42℃培养；或5×SSC，1％SDS，65℃培养，并以0.2×SSC和0.1％SDS在65℃洗涤。
为了实现本发明的目的，合适的“中等严谨条件”包括，例如：在5×SSC，0.5％SDS，1.0mM EDTA(pH8.0)溶液中预洗，在50-65℃，5×SSC中杂交过夜，然后用2×、0.5×和0.25×SSC(含0.1％SDS)65℃洗涤2次，每次20分钟。这些杂交DNA序列也属于本发明范围之内。
“T细胞增殖”在此包括T细胞的繁殖，以及引起其繁殖的T细胞刺激，即，引起有丝***的事件和有丝***本身。检测T细胞增殖的方法如后文所述。本发明的融合蛋白
A.HER-2/neu蛋白质的胞内域和胞外域
根据以上所述对HER-2/neu的研究结果，将HER-2/neu蛋白质选作抗癌疫苗的目标。该方法的主要困难之一在于难以分离到足量的HER-2/neu蛋白。解决该问题的一种代偿是在哺乳动物细胞内分别表达ECD和ICD。ECD是高水平表达的分泌蛋白质，从1L小鼠细胞培养物中可纯化得到约20mg ECD蛋白。然而，ICD的表达水平很低，从1L HEK-293细胞仅可纯化得到约0.2mg ICD蛋白。此外，所得的ICD蛋白在细胞裂解物中很不稳定，会对纯化造成许多预想不到的问题。
如上所述，HER-2/neu是一种癌基因自身蛋白质，对自身蛋白质的免疫耐受性会抑制免疫应答。对特定蛋白质不同部分的免疫耐受性水平可能取决于所表达的蛋白质部分是在细胞膜内还是膜外。ECD在细胞表面，是分泌蛋白。相反，ICD及其部分位于细胞内，不是分泌蛋白。ECD易与机体的免疫***接触，而ICD及其部分与机体的免疫***则相对隔离。因此，对HER-2/neu蛋白ECD的免疫耐受性高于对ICD部分的耐受性。因此，对本发明的疫苗来说，与ECD蛋白和ECD肽相比，ICD蛋白和ICD肽，其变异体，包括PD部分和PD肽可诱导更高水平的免疫应答。
虽然ICD及其变异体的免疫原性高于ECD及其变异体，但对ECD及其变异体的抗体仍是有益的，也可能是必要的。ECD位于细胞表面，而ICD及其部分不是分泌蛋白，隐蔽在细胞内。因此，对ECD的抗体应答具有更高的治疗价值，因而为本发明所优选。ECD本身的免疫原性不高。因为ICD(包括PD和ΔPD)的免疫原性高于ECD，ECD-ICD融合蛋白和/或ECD-PD融合蛋白的免疫原性高于单独的ECD。ECD-ICD融合蛋白和/或ECD-PD融合蛋白也许可比单独ECD更有效地诱导抗ECD的抗体，因而为本发明所优选。
本发明中，将ECD或其变异体与ICD或其变异体(以PD或其变异体为佳)组合、连接或融合(直接或通过接头)。ECD提供的结构构型诱导能与细胞表面HER-2/neu蛋白质反应的抗体，ICD或PD则提高ECD的免疫原性。与单独ECD相比，以上组合诱导对ECD免疫应答的效率有出人意料的提高。
可将ECD或其部分与ICD或其变异体(包括ICD的部分或PD或其变异体(包括PD的部分，例如ΔPD))组合。本发明的ECD最好是人、大鼠或小鼠的ECD。人ECD参见图9，SEQ ID NO：3。大鼠ECD参见图14，SEQ ID NO：8。
本发明的ICD最好是人、大鼠或小鼠的ICD。人ECD参见图7，SEQ ID NO：1，包括其中Lys676-Val1255。大鼠ECD参见图8，SEQ ID NO：2，包括其中的Lys677至Val1256。
本发明的PD最好是人、大鼠或小鼠的PD。人PD参见图10，SEQ ID NO：4。人PD可以是人ΔPD，参见图11，SEQ ID NO：5。大鼠PD参见图8，SEQ ID NO：2，包括其中的Gln991至Val1256。大鼠PD可以是大鼠ΔPD，参见图8，SEQ IDNO：2，包括其中的Gln991至Arg1049。
实施方式之一中，人ECD可与以下所述之一融合：(i)人ICD或大鼠ICD，或(ii)人PD或ΔPD，或大鼠PD或ΔPD。另一实施方式中，大鼠ECD可与以下所述之一融合：(i)人ICD或大鼠ICD，或(ii)人PD或ΔPD，或大鼠PD或ΔPD。
HER-2/neu PD长268氨基酸，位于胞内，可以被蛋白质酪氨酸激酶磷酸化。该区域与其它酪氨酸激酶受体的相应区域没有相同性。因此，该区域的特异性和独特性使其特别适合作为肿瘤疫苗。然而，该区域难以在细菌或哺乳动物相比内单独表达。例如，生成的PD很不稳定，不适合大规模生成。实施方式之一中，本发明通过将该胞内域全部或部分或其磷酸化区与HER-2/neu胞外域的全部或部分融合解决了该问题。本发明ECD-ICD融合蛋白和ECD-PD融合蛋白是可溶蛋白，分泌蛋白，可稳定存在于培养基。该***可提供大量的胞内域或磷酸化区用于癌症疫苗的开发，尤其是***癌疫苗的开发，可用于抵抗以HER-2/neu表达为特征的各种抗癌疫苗。除了可提高胞内域或磷酸化区或其变异体的表达之外，作为与胞外域或其变异体所成的融合蛋白，ECD-ICD和ECD-PD融合蛋白提供了更好的疫苗制剂。
通过在PD的N末端引入一段分泌信号，可将PD改造成分泌蛋白质，成为可溶性、分泌型重组蛋白。因为重组蛋白可在培养基内积累，所以最好有分泌过程。因为该蛋白质不与胞内蛋白质偶联，所以蛋白质裂解有限。应可更方便、更经济地纯化该蛋白质。
如实施方式3所述，用pFLAGCMV-1表达质粒(Kodak)来确定HER-2/neu胞内域的哪个区域可分泌。表达的蛋白质是融合蛋白，在其N末端有一段前胰蛋白酶原(preprotrypsin)分泌信号和FLAG-标签。用这样的构建物转染HEK-293细胞，用FLAG-标签M2抗体作为探针，通过Western印迹法检测细胞和培养液中的FLAG-标签融合蛋白。图4中的结果证明：全长ICD或KD都不分泌，但PD是可溶性和分泌型的，可在培养液中检测到。该结果表明，全长ICD或KD不分泌，即不能穿越细胞膜。
如实施方式4所述，ECD有一段分泌信号序列，可表达为分泌蛋白，可作为PD的融合伴侣。在HEK-293细胞内表达ECD-PD融合蛋白。用HER-2/neu ECD特异性抗体通过ELISA试验，再用HEK-2/neu PD特异性抗体通过Western印迹检测可溶性ECD-PD融合蛋白的分泌。如图6所示，HEK-293表达可溶性的ECD-PD，并分泌进入培养液。
B.本发明融合蛋白的免疫原性
在优选实施方式之一中，本发明涉及基于HER-2/neu基因蛋白质表达产物特定部分的融合蛋白(例如，HER-2/neu ECD-ICD融合蛋白或HER-2/neu ECD-PD融合蛋白)，它能激发抗体应答，并可被胸腺依赖性淋巴细胞(T细胞)识别。因此，可用自身的免疫T细胞应答预防或治疗HER-2/neu正在或已经过度表达的癌症。另一方面，本发明涉及指导ECD-ICD融合蛋白，或ECD-PD融合蛋白，或其变异体表达的核酸分子的免疫用途，其可单独使用或在表达载体中使用。
通常，在被特定抗原激发时，CD4+T细胞群被认为通过释放淋巴因子起着辅助或诱导细胞的作用；然而，CD4+细胞的一个亚群具细胞毒T淋巴细胞的作用(CTL)。类似的，CD8+T细胞的作用被认为是裂解抗原靶细胞；然而，在许多场合，它们可以分泌淋巴因子，起到辅助细胞或DTH作用。尽管功能可能有所重叠，但表型CD4和CD8都与识别I类或II类MHC抗原相结合的肽相关。识别I类或II类MHC中的抗原使得CD4+和CD8+T细胞对不同条件下呈递的不同抗原或相同抗原作出反应。免疫原性肽与II类MHC抗原的结合最常发生于被抗原呈递细胞所摄取的抗原。
如本发明所述，作为HER-2/neu致癌基因蛋白质表达产物的ECD-ICD融合蛋白或ECD-PD融合蛋白可被T细胞识别。循环中的HER-2/neu ECD-ICD融合蛋白或HER-2/neu ECD-PD融合蛋白被降解成肽片段。ECD-ICD融合蛋白或ECD-PD融合蛋白的肽片段可与主组织相容性复合物(MHC)抗原结合。通过在细胞表面展示与HMC抗原结合的肽，并由宿主的T细胞识别肽加自身MHC抗原，则HER-2/neu ECD-ICD或HER-2/neu ECD-PD融合蛋白(包括癌细胞上表达的那些)将对T细胞具有免疫原性。T细胞受体的精确特异性使得各T细胞能辨别相差仅一个氨基酸残基的蛋白质片段。
在对ECD-ICD融合蛋白或ECD-PD融合蛋白的肽片段的免疫应答中，所表达的T细胞受体与肽-MHC复合物具有高结合亲和力的T细胞将与肽-MHC复合物结合，于是被激活、诱导而增殖。在首次遭遇某肽时，少量免疫T细胞会分泌淋巴因子，增殖，并分化为效应和记忆T细胞。体内将发生初次免疫应答，但在体外难以检测到。当记忆T细胞再次遇上同一抗原时，就会引起更快、更强的免疫应答。第二次应答在体内和体外都会发生。通过以下测定即可测定体外反应：测定T细胞群再次接触抗原时的增殖程度，细胞因子产生的程度，或溶胞活性。T细胞群在对特定抗原的应答中显著增殖，被认为表明曾经接触过该抗原，或曾以该抗原初免疫过。
C.本发明的融合蛋白
实施方式之一中，本发明的化合物包含HER-2/neu ECD-ICD融合蛋白或其变异体，或编码该ECD-ICD融合蛋白的聚核苷酸。较好的是，所述核酸分子是DNA分子。在本发明的HER-2/neu ECD-ICD融合蛋白中，ECD和ICD多肽组分可直接融合，或通过接头(例如氨基酸接头或其它化学接头)融合。一优选实施方式中，本发明的ECD-ICD融合蛋白包含完整或部分HER-2/neu ECD与完整或部分HER-2/neu ICD的融合。
另一实施方式中，可通过依次去除ECD羧基末端1-100氨基酸中任一区段来改变ECD-ICD融合蛋白中ECD的大小，最好是去除约100个氨基酸。类似的，可通过依次去除ICD的N末端和/或C末端1-100氨基酸中任一区段来改变ECD-ICD融合蛋白中ICD的大小。得到的变异体可用文献或本发明所述的合适的筛选方法，根据它们的抗原性和/或免疫原性进行筛选，然后用于本发明。
另一实施方式中，本发明的化合物包含HER-2/neu ECD-PD融合蛋白，或其变异体，或编码该ECD-PD融合蛋白的核酸分子。实施方式之一中，HER-2/neuECD与HER-2/neu ΔPD融合。较好的是，该核酸分子是DNA分子。在本发明的HER-2/neu ECD-PD融合蛋白中，ECD，PD或ΔPD组分可直接融合，或通过接头(例如氨基酸接头或其它化学接头)融合。优选实施方式之一中，本发明的ECD-PD融合蛋白中的HER-2/neu ECD与HER-2/neu PD或ΔPD直接融合。本发明中，优选的本发明融合蛋白是HER-2/neu PD融合蛋白。
另一实施方式中，可通过依次去除ECD羧基末端1-100氨基酸中任一区段来改变ECD-PD融合蛋白中ECD的大小，最好是去除约100个氨基酸。类似的，可通过依次去除PD的N末端和/或C末端1-100氨基酸中任一区段来改变ECD-PD融合蛋白中PD的大小。其它变异体可用文献或本发明所述的合适的筛选方法，根据它们的抗原性和/或免疫原性进行筛选，然后用于本发明。
表1显示，去除ECD羧基末端的100个氨基酸对ECD-PD融合蛋白的表达水平和稳定性没有影响。
表1：ECD截短—PD小结
克隆编号  缺失区域(bp/aa)  #bp  #aa 相对表达
A5  1655-1882/552-628  228  76 ***
B4  1660-1866/554-622  207  69 **
B9  1595-1891/532-631  297  99 ***
C2  1681-1902/561-634  222  74 *
C7  1612-1902/538-634  291  97 *****
F10  1634-1951/545-651  318  106 ****
ECD-PD WT *
ECD-ICD融合蛋白和ECD-PD融合蛋白的变异体还包括天然ECD-ICD融合蛋白和ECD-PD融合蛋白的各种结构形式。因为存在可离子化的氨基和羧基，HER-2/neu ECD-ICD或ECD-PD融合蛋白可以是酸式盐或碱式盐的形式，或者是中性形式。各氨基酸残基还可以通过氧化或还原来修饰。
本发明范围内的其它变异体包括如下ECD-ICD融合蛋白或ECD-PD融合蛋白：其中天然HER-2/neu ECD-ICD或天然HER-2/neu ECD-PD蛋白质的一级氨基酸结构通过与其它肽或多肽或化学基团(例如糖基，脂类，磷酸，乙酰基等)共价偶联或聚集而被修饰。共价衍生物可以通过将特定官能团与氨基酸侧链或N末端或C末端连接来制备。
本发明还包括糖基化或没有糖基化的HER-2/neu ECD-ICD融合蛋白和HER-2/neu ECD-PD融合蛋白。酵母或哺乳动物表达***中表达的ECD-ID融合蛋白或ECD-PD融合蛋白，因为表达***的缘故，在分子量和糖基化方式上可能与天然分子相似或略有不同。编码多肽的DNA在大肠杆菌等细菌内表达通常得到非糖基化的分子。真核蛋白质N糖基化位点的特征是三联氨基酸Asn-A1-Z，其中A1可以是除Pro之外的任意氨基酸，Z是Ser或Thr。具有非活化N糖基化位点的HER-2/neu ECD-ICD或ECD-PD融合蛋白的变异体可用本领域熟知的技术来制备，例如寡核苷酸合成和连接，或定点诱变技术，这些都属于本发明范围之内。或者，也可以将N连接的糖基化位点加入HER-2/neu ECD-ICD或ECD-PD融合蛋白中。
本发明的ECD-ICD融合蛋白(包括其变异体)包括人和非人源多肽所有可能的组合。非人多肽包括来自各种动物的多肽，例如大鼠，小鼠，豚鼠，马，牛，猪，羊，狗等。实施方式之一中，ECD-ICD融合蛋白包括：
(i)人ECD-人ICD融合蛋白，例如：图9(SEQ ID NO：3)的人ECD与图7(SEQID NO：1)氨基酸序列(包括Lys676-Val1255)的人ICD直接或通过化学和/或氨基酸接头连接而成的融合蛋白，或其变异体；
(ii)大鼠ECD-大鼠ICD融合蛋白，例如：图14(SEQ ID NO：8)的大鼠ECD与图8(SEQ ID NO：2)所示氨基酸序列(包括Lys677-Val1256)的大鼠ICD直接或通过化学和/或氨基酸接头连接而成的融合蛋白，或其变异体；
(iii)人ECD-大鼠ICD融合蛋白，例如：图9(SEQ ID NO：3)的人ECD与图8(SEQ ID NO：2)所示氨基酸序列(包括Lys677-Val1256)的大鼠ICD直接或通过化学和/或氨基酸接头连接而成的融合蛋白，或其变异体；
(iv)大鼠ECD-人ICD融合蛋白，例如：图14(SEQ ID NO：8)的大鼠ECD与图7(SEQ ID NO：1)所示氨基酸序列(包括Lys676-Val1255)的人ICD直接或通过化学和/或氨基酸接头连接而成的融合蛋白，或其变异体。
本发明ECD-ICD融合蛋白的各种变异体都属于本发明的实施方式。实施方式之一中，这样的变异体与天然HER-2/neu ECD-ICD蛋白基本相同或基本相似，并保留了激发免疫应答的能力。编码ECD蛋白质的人DNA序列可参见图15(SEQID NO：9)，包括核苷酸1-1959。编码ICD蛋白的人DNA序列可参见图15(SEQ IDNO：9)，包括核苷酸2026-3765。不难测定各种序列修饰对于HER-2/neu ECD-ICD蛋白质引起免疫应答能力的影响，例如，可通过采用本文所述的方法分析突变HER-2/neu ECD-ICD蛋白质诱导T细胞应答的能力，或通过分析突变HER-2/neuECD-ICD蛋白质产生抗体的能力。
本发明ECD-PD融合蛋白(包括变异体)包括人和非人源多肽所有可能的组合。非人多肽包括来自各种动物的多肽，例如大鼠，小鼠，豚鼠，马，牛，猪，羊，狗等。实施方式之一中，ECD-PD融合蛋白包括：
(i)人ECD-人PD融合蛋白，如图12(SEQ ID NO：6)所示或其变异体，例如：图9(SEQ ID NO：3)的人ECD与图10(SEQ ID NO：4)所示的人PD直接或通过化学和/或氨基酸接头连接而成的融合蛋白，或其变异体；
(ii)大鼠ECD-大鼠PD融合蛋白，例如：图14(SEQ ID NO：8)的大鼠ECD与包括图8(SEQ ID NO：2)所示氨基酸序列Gln 991-Val1256的大鼠PD直接或通过化学和/或氨基酸接头连接而成的融合蛋白，或其变异体；
(iii)人ECD-大鼠PD融合蛋白，例如：图9(SEQ ID NO：3)的人ECD与图8(SEQID NO：2)所示氨基酸序列(包括Gln 991-Val1256)的大鼠PD直接或通过化学和/或氨基酸接头连接而成的融合蛋白，或其变异体；
(iv)大鼠ECD-人PD融合蛋白，例如：图14(SEQ ID NO：8)的大鼠ECD与图10(SEQ ID NO：4)所示的人PD直接或通过化学和/或氨基酸接头连接而成的融合蛋白，或其变异体。
本发明ECD-PD融合蛋白的各种变异体都属于本发明的实施方式。实施方式之一中，这样的变异体与天然HER-2/neu ECD-PD蛋白基本相同或基本相似，并保留了激发免疫应答的能力。编码ECD蛋白质的人DNA序列可参见图15(SEQ IDNO：9)，包括核苷酸1-1959。编码PD蛋白的人DNA序列可参见图15(SEQ IDNO：9)，包括核苷酸2986-3765。不难测定各种序列修饰对于HER-2/neu ECD-PD蛋白质产生免疫应答的能力的影响，例如，可通过采用本文所述的方法分析突变HER-2/neu ECD-PD蛋白质诱导T细胞应答的能力，或通过分析突变HER-2/neu ECD-PD蛋白质产生抗体的能力。
另一实施方式中，本发明ECD-PD融合蛋白是ECD-ΔPD融合蛋白(包括变异体)包括人和非人源多肽所有可能的组合。非人多肽包括来自各种动物的多肽，例如大鼠，小鼠，豚鼠，马，牛，猪，羊，狗等。实施方式之一中，ECD-PD融合蛋白包括：
(i)人ECD-人ΔPD融合蛋白，如图13(SEQ ID NO：7)所示或其变异体，例如：图9(SEQ ID NO：3)的人ECD与图11(SEQ ID NO：5)所示的人ΔPD直接或通过化学和/或氨基酸接头连接而成的融合蛋白，或其变异体；
(ii)大鼠ECD-大鼠ΔPD融合蛋白，例如：图14(SEQ ID NO：8)的大鼠ECD与包括图8(SEQ ID NO：2)所示氨基酸序列Gln991-Arg1049的大鼠PD直接或通过化学和/或氨基酸接头连接而成的融合蛋白，或其变异体；
(iii)人ECD-大鼠ΔPD融合蛋白，例如：图9(SEQ ID NO：3)的人ECD与图8(SEQ ID NO：2)所示氨基酸序列(包括Gln991-Arg1049)的大鼠ΔPD直接或通过化学和/或氨基酸接头连接而成的融合蛋白，或其变异体；
(iv)大鼠ECD-人ΔPD融合蛋白，例如：图14(SEQ ID NO：8)的大鼠ECD与图11(SEQ ID NO：5)所示的人ΔPD直接或通过化学和/或氨基酸接头连接而成的融合蛋白，或其变异体。
本发明ECD-ΔPD融合蛋白的各种变异体都属于本发明的实施方式。实施方式之一中，这样的变异体与天然HER-2/neu ECD-ΔPD蛋白基本相同或基本相似，并保留了激发免疫应答的能力。编码ECD蛋白质的人DNA序列可参见图15(SEQID NO：9)，包括核苷酸1-1959。编码ΔPD蛋白的人DNA序列可参见图15(SEQ IDNO：9)，包括核苷酸2968-3144。不难测定各种序列修饰对于HER-2/neu ECD-ΔPD蛋白质产生免疫应答的能力的影响，例如，可通过采用本文所述的方法分析突变HER-2/neu ECD-ΔPD蛋白质诱导T细胞应答的能力，或通过分析突变HER-2/neuECD-ΔPD蛋白质产生抗体的能力。
本发明的优选实施方式中，本发明的HER-2/neu ECD-PD融合蛋白是ECD-ΔPD蛋白。
在某具体实施方式中，本发明的融合蛋白包含某种融合伴侣，例如免疫融合伴侣或表达增强者。例如，融合伴侣可协助提供T辅助细胞表位(免疫融合伴侣)，最好是人可识别的T辅助细胞表位，或者协助以高于重组融合蛋白的得率表达融合蛋白(表达增强者)。某些优选的融合伴侣既是免疫融合伴侣，又是表达增强伴侣。也可选择其它融合伴侣来提高融合蛋白的溶解度，或使得融合蛋白针对于特定的胞内区室。还可以选择具有亲和尾的融合伴侣，用来协助融合蛋白的纯化。
本发明还提供了包含本文所述融合多肽与一种不相关免疫原性蛋白共同构成的融合蛋白。较好的是，所述的免疫原性蛋白能够激发回忆反应。此类蛋白质包括破伤风蛋白，结核蛋白和肝炎蛋白(参见Stoute等(1997)，新英格兰医学杂志，336：86-91)。
其它实施方式中，由蛋白质D，一种革兰氏阴性流感嗜血杆菌B(WO91/18926)的表面蛋白获得了一种免疫融合伴侣。较好的是，蛋白质D衍生物约包含该蛋白质的前三分之一(例如，N末端的前100-110个氨基酸)，而且，蛋白质D衍生物可以脂化。在优选实施方式中，在N末端连接脂蛋白D融合伴侣的前109个残基，为融合蛋白增加例外的外源性T细胞表位，并提高其在大肠杆菌中的表达水平(因此作为表达增强者)。脂质尾可优化融合蛋白向抗原呈递细胞的呈递。其它融合伴侣包括流感病毒的非结构蛋白，NS1(血凝素)。通常采用N末端前81个氨基酸，但也可以使用包含T辅助细胞表位的其它片段。
在另一实施方式中，免疫融合伴侣是LYTA蛋白或其部分(以C末端部分为佳)。LYTA来自可合成N-乙酰基-L-丙氨酸酰胺酶(又称LYTA酰胺酶)(由LytA基因编码)的肺炎链球菌(参见，基因43：265-292，1986)。LYTA是一种自溶酶，特异性降解肽聚糖骨架中的某些键。LYTA的C末端区负责与胆碱或DEAE等胆碱类似物的亲和力。这一特性已被用来开发用于表达融合蛋白的大肠杆菌C-LYTA表达质粒(参见，生物技术10：795-798，1992)。在一优选实施方式中，可在融合蛋白内加入一LYTA重复段。该重复段被发现位于C末端，从第178位残基开始。一段特别好的重复段包含残基188-305。
在一优选实施方式中，本发明的融合蛋白还包含一个融合伴侣。优选的融合伴侣包括但不限于：Ra12或LeIF。特别是，本发明提供了用Ra12或LeIF序列作为融合伴侣提高重组融合多肽稳定性和表达量，或者突破耐受性的材料和方法。
Ra12是结核分支杆菌MTB32A编码序列的一段C末端14kD片段，它能够高水平的自身表达，并在纯化过程中保持可溶形式。LeIF是与真核核糖体蛋白质eIF类似的利什曼原虫抗原，它能够激发Th1和/或CTL免疫应答(参见，例如美国专利5,876,966，5,876,735，5,879,687)。本发明利用Ra12和LeIF多肽的这些特性提供了为了稳定而高水平表达除HER-2/neu融合多肽之外还含Ra12和LeIF多肽的融合多肽的重组核酸分子，表达载体，宿主细胞和方法。编码含Ra12和LeIF多肽的融合多肽的和有意义融合多肽的重组核酸分子可通过传统基因工程技术来构建。最好，构建成的重组核酸分子中，融合伴侣聚核苷酸位于选定融合蛋白序列的5＇端。或者，也可将融合伴侣聚核苷酸序列置于有意义融合蛋白聚核苷酸序列的3＇端，或者将融合蛋白的聚核苷酸***融合伴侣聚核苷酸序列内的某一位点。此外，本文所述的各种编码融合伴侣或其部分或其变异体的合适的聚核苷酸都可用来构建本发明的重组融合核酸。
本发明编码融合伴侣多肽的核酸可以用各种本领域已知的方法来制备。这些方法例如合适序列的克隆和限制性酶切，或者用Narang等(1979)酶学方法68：90-99所述的磷酸三酯法，Brown等(1979)酶学方法68：109-151所述的磷酸二酯法；Beaucage等(1981)Tetra Lett.，22：1859-1862所述的二乙基亚磷酰胺法和美国专利4,458,066所述的固相支持法直接化学合成。
编码包含融合伴侣多肽和选定融合蛋白的融合多肽的重组核酸可用各种本领域的已知方法来制备。如前所述，构建而成的核酸分子中，融合伴侣聚核苷酸宜位于编码有意义融合蛋白的聚核苷酸序列的5＇端。还可以对融合伴侣和融合蛋白聚核苷酸序列进行修饰，促进其融合和表达。
重组核酸分子还可以包含其它核苷酸序列，例如有助于纯化的亲和性尾的编码序列。
D.本发明融合蛋白的变异体
CD4+T细胞一般识别位于肿瘤细胞外的抗原。相反，在一般情况下，只有位于胞质溶胶中并由靶分子自己合成的蛋白质才会与I类MHC的结合，细胞外的蛋白质不在此列。这种情况的例外是外源多肽与高浓度的位于胞外的一类特定I类结合基序结合。因此，CD4+和CD8+T细胞在功能上存在很大差异，各自识别不同的抗原，反映抗原通常所在的位置不同。
另一种进行氨基酸取代来产生本发明变异体的方法是鉴定并替换T细胞基序中可能结合II类MHC分子(对CD4+T细胞应答)或I类MHC分子(对CD8+T细胞应答)的氨基酸。具有理论上可能结合II类分子的基序的(HER-2/neu ECD-ICD或ECD-PD融合蛋白的)肽节段可通过计算机分析来鉴定。例如，可用蛋白质序列分析软件包“T位点”，其中有数个设计用来鉴别可能性T细胞识别位点的计算机程序(Feller等(1991)，自然，349：720-721)。可用两种检索程序：(1)Margalit所述的AMPHI程序(Feller等(1991)，自然，349：720-721；Margalit等(1987)，免疫学杂志，138：2213-2229)根据α螺旋周期和两亲性来鉴定表位基序；(2)Rothbard和Taylor程序根据电荷和极性来鉴定表位基序(Rotherbard等(1988)EMBO，7：93-100)。兼具两种基序的节段最适合与II类MHC分子的结合。CD8+T细胞可识别与I类MHC分子结合的肽。Parker等(1994)免疫学杂志152：163已认定，结合特定MHC分子的肽具有共同的可识别的基序。通过对取自一种培养细胞系的HLA-A2.1分子的肽Edman降解，鉴定了一段结合HLA-A2.1槽区的肽基序(表2，摘自Falk等(1991)，自然，351：290-296)。根据该方法的鉴定，HLA-A2.1结合性肽一般长9个氨基酸，优势锚残基位于2位(L)和9位(V)。常见的强结合性残基是2(M)，4(E，K)，6(V)和8(K)。鉴定到的该基序代表了许多结合肽的普遍基序。
表2：HLA-A2.1限制性基序
                              氨基酸位置  点数
  1   2   3   4   5   6   7   8   9   +3
优势结合性锚残基   L   V   +2
强结合性残基   M   EK   V   K   +1
弱结合性残基   ILFKMY   AYFPMS   GPDT   IKYNGVH   ILT   AYH   ES   L
目前鉴定的衍生肽基序并不特别严谨。有些HLA-A2.1结合性肽不兼具两个优势锚残基，而且优势锚残基两侧的氨基酸对结合或不结合起着重要作用。并非所有具有所述基序的肽都能结合，有些没有该基序的肽也能结合。然而，所述基序足可鉴定出能够结合的肽。需要指出的是，所有MHC和各自的基序在2位和9位的两个优势锚氨基酸之间有6个氨基酸。
在鉴定了HER-2/neu ECD-ICD或ECD-PD融合蛋白内的肽基序后，就可进行保守性或非保守性的氨基酸取代。后一种取代是为了产生更有效和/或交叉反应性更广泛的ECD-ICD或ECD-PD融合蛋白或多肽。更有效蛋白质或肽的一个例子是：它能够以更高的亲和力与天然蛋白质或多肽的同样的MHC分子结合，但不影响T细胞对天然蛋白质或多肽的特异性识别。交叉反应性更广泛的多肽的一个实例是：它能够比天然多肽诱导更广泛的免疫交叉反应(即结合更多种的MHC分子)。同理，位于肽的基序之间并具有间隔功能的一个或多个氨基酸(例如与MHC分子或T细胞受体不反应)可以被保守性或非保守性取代。对本领域技术人员来说显而易见的是，可用多种试验来测定含有一个或多个氨基酸取代的多肽是利于或不利的免疫应答，从而鉴定其激发T细胞识别的能力。
本发明所述的变异体还可以包含其它修饰，包括氨基酸缺失或增加，如前所述，这些修饰对于所需的多肽的免疫特性的影响必须最小。知道，可以使用HER-2/neu ECD-ICD或ECD-PD融合蛋白非天然延伸形式或截短形式，只要所需的免疫特性与全长天然HER-2/neu ECD-ICD或ECD-PD融合蛋白基本相当。为了避免在复性时形成不正确的分子间二硫键，可将半胱氨酸残基去除或取代。其它诱变方法包括修饰相邻碱性氨基酸残基以增强其在酵母***内的表达，该***中存在KEX2蛋白酶活性。本发明融合蛋白的制备
A.编码融合蛋白的聚核苷酸
本发明涉及分离或纯化的聚核苷酸，它编码HER-2/neu融合蛋白。根据本发明，任何编码融合蛋白氨基酸序列的核苷酸都可用来产生重组分子，指导融合蛋白的表达。
为了克隆全长编码序列或类似变异体以产生HER-2/neu融合聚核苷酸，可用标记DNA探针(根据HER-2/neu核酸或其互补序列的任一部分设计而成)筛选基因组或cDNA库，鉴定出融合蛋白各组分的编码序列。HER-2/neu核苷酸可以是任意合适的哺乳动物的，例如大鼠，小鼠，马，牛，猪，羊，狗等。
实施方式之一中，HER-2/neu序列是人、大鼠或小鼠的序列。小鼠HER-2/neu序列可参见图19(SEQ ID NO：11)。可由小鼠的脑RNA扩增得到小鼠HER-2/neu，所用的引物是：5＇引物：CCTAGGAGCTGGCGGCCTGGTGCCGTTG(SEQ IDNO：12)和3＇引物：GGCCTTCTGGTTCATACTGGCACATCCAGGC(SEQ IDNO：13)。小鼠HER-2/neu氨基酸序列参见图20(SEQ ID NO：14)。小鼠HER-2/neu氨基酸序列的一种变异可参见Nagata等，免疫学杂志，159：1336-1343(1997)。
可在合适的表达文库中筛选表达全长HER-2/neu蛋白质的克隆来分离这样的克隆。文库的建立和筛选可按照本领域的常用方法进行，例如Sambrook等，分子克隆：实验室手册，Cold Spring Harbor Laboratories，Cold Spring HarborNY(1989)。简而言之，将噬菌体表达库接种在平板上，然后转移到滤膜上。将滤膜与检测剂共培养。本发明中，“检测剂”即各种能与HER-2/neu蛋白结合，然后可用各种已知方法测定的化合物。典型的检测剂具有与报道基团偶联的“结合剂”，例如A蛋白，G蛋白，IgG或凝集素。优选的报道基团包括酶，底物，辅因子，抑制剂，染料，放射性核素，发光基团，荧光基团和生物素。更好的报道基团是辣根过氧化物酶，它可通过与底物，例如四甲基联苯胺或2，2＇-偶氮-二(3-乙基苯并噻唑啉磺酸共培养来检测。用已知技术分离出含表达HER-2/neu蛋白质的基因组或cDNA序列的噬菌斑，并纯化。合适的方法可参见Sambrook等，分子克隆：实验室手册，Cold Spring Harbor Laboratories，Cold Spring HarborNY(1989)。
也可以用两段简并性寡核苷酸引物，通过聚合酶链反应(PCR)来分离编码序列，所述引物的设计以本发明所述的编码序列为基础。也可以用其它已知的扩增方法来克隆所需的核酸。可用的体外扩增方法包括：PCR，连接酶链反应(LCR)，Qβ-复制酶扩增及其它RNA聚合酶介导的技术，可参见Sambrook和Ausubel所述，以及美国专利4,683,202；PCR方法：方法及应用指南(Innis等编辑，1990)；Amheim&Levinson C&EN pp.36-47(1990年10月1日)；NIH研究杂志3：81-94(1991)；Kwoh等(1989)美国科学院院报86：1173；Guatelli等(1990)美国科学院院报87：1874；Lomell等(1989)临床化学杂志35：1826；Landegren等(1988)科学241：1077-1080；Van Brunt(1990)生物技术8：291-294；Wu等(1989)基因4：560；以及，Barringer等(1990)基因89：117。克隆体外扩增的核酸的改良方法参见Wallace等的美国专利5,426,039。适合用于扩增本发明核酸的引物可根据本文所述的序列来设计。
根据本发明，本发明的聚核苷酸编码融合蛋白、其片段、或其功能相当物，可用它来产生重组核酸分子，从而在合适宿主细胞内引起融合蛋白、其片段、或其功能相当物的表达。可通过对编码序列的分子操作来改变聚核苷酸编码的融合多肽产物。
由于密码子固有的简并性，也可用编码级别相同或功能相当的氨基酸序列的其它DNA序列来实施本发明，以表达该融合多肽。这样的DNA序列包括，能够在中低或高度严谨条件下与后文所述编码序列或其互补序列杂交的那些。
可用于本发明的改变后的核苷酸序列含有不同核苷酸残基的缺失、增加和取代，于是得到一段编码相同或功能相当基因产物的序列。该基因产物本身可以含有氨基酸残基的缺失、增加或取代，引起沉默突变，从而得到功能相当的抗原性表位。可以根据有关残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性、和/或两亲性特征的相似性来制造此类保守性氨基酸取代。例如，负电荷氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；正电荷氨基酸包括赖氨酸，组氨酸和精氨酸；具有无电荷极性头部，且疏水性近似的氨基酸包括：甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸和酪氨酸；具有非极性头部的氨基酸包括丙氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，甲硫氨酸和色氨酸。
为了不同的目的可通过基因工程改造本发明的核苷酸序列，从而改变融合蛋白的编码序列，所述的目的包括但不限于改善基因产物的加工和表达。例如，可用已知技术(例如引入或去除限制酶位点)引入突变，从而改变糖基化方式，磷酸化作用，创建和/或破坏翻译、启动、和/或终止序列，或在编码区内制造变异，从而促进此后的体外修饰。本领域有许多可在给定核酸构建物内进行改变的方法。此类方法包括，例如，定点诱变，用简并寡核苷酸进行的PCR扩增，含核酸的细胞与诱变剂接触或接受辐照，化学合成所需的寡核苷酸(例如，结合连接反应和/或克隆，形成大核酸分子)，以及其它众所周知的技术(参见Giliman等(1979)，基因8：81-97，Hutchinson等(1978)生物化学杂志253：6551；Roberts等(1987)自然328：731-734)。较好的是，所述的操作不破坏融合多肽的免疫原性。
本发明实施方式之一中，可用本领域熟知的方法全部或部分合成融合蛋白的编码序列(参见，Caruthers等(1980)，核酸研究7：215-233；Gre等(1980)核酸研究9(10)：2331；Matteucci等(1980)，Tetrahedron Letter21：719(1980)；和Chow等(1981)核酸研究9(12)：2807-2817。
B.多肽的合成
或者，可用化学合成完整或部分氨基酸序列的方法合成融合多肽本身。例如，可用固相技术合成肽，例如Merrifield固相合成法，其中，将氨基酸依次加到延伸链上(参见Merrifield(1963)美国化学协会杂志85：2149-2146)。已可购买到自动多肽合成设备，例如Perkin Elmer Biosystems，Inc.(Foster City，CA)的产品，一般按照制造者的说明进行操作。然后可从树脂上切下合成的肽，通过例如制备性高效液相层析进行纯化(参见，Greighton，蛋白质结构和分子原理，50-60(198))。合成融合多肽的组成可通过氨基酸分析或测序来检验(例如，Edman降解法；参见Greighton，蛋白质，结构和分子原理，pp.34-49(1983))。
此外，可在序列内引入非经典氨基酸或化学氨基酸类似物作取代或增加。非经典氨基酸包括但不限于，普通氨基酸的D异构型，α-氨基异丁酸，4-氨基丁酸，Abu，2-氨基丁酸，γ-Abu，ε-Ahx，6-氨基己酸，Aib，2-氨基异丁酸，3-氨基丙酸，鸟氨酸，正亮氨酸，正缬氨酸，羟基脯氨酸，肌氨酸，瓜氨酸，半胱磺酸，叔丁基甘氨酸，叔丁基丙氨酸，苯基甘氨酸，环己基丙氨酸，β-丙氨酸，氟氨基酸，β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸，Nα-甲基氨基酸等，以及其它氨基酸类似物。此外，氨基酸可以是D型(右旋)也可以是L型(左旋)。
C.连接基团
实施方式之一中，融合蛋白的多肽，例如ECD与ICD，或ECD与PD，通过连接基团连接。连接基团可以是化学交联剂，包括例如琥珀酰亚氨基-(N-马来酰亚氨基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(SMCC)。连接基团还可以是附加的氨基酸序列，包括例如聚甘氨酸连接基团。
在一种特殊的实施方式中，融合蛋白中各多肽的编码序列可以按照任意顺序，通过肽键直接在氨基或羧基末端相连。
也可以用一段氨基酸接头序列将第一和第二多肽组分隔开足够的距离，从而确保各自能够折叠成各自的二级和三级结构。可用本领域已熟知的方法将此类氨基酸接头序列加入该融合蛋白。可根据以下因素选择合适的肽接头序列：(1)能够形成柔性延展构型；(2)其二级结构不会与第一和第二多肽上的功能性表位相互作用；(3)没有可能与多肽功能性表位相互作用的疏水性或带电残基。优选的肽接头序列含有Gly，Asn和Ser残基。接头序列中也可采用其它近中性氨基酸，例如Thr和Ala。可用作接头的氨基酸序列可参见，Maratea等(1986)基因40：39-46；Murphy等(1986)美国科学院院报83：8258-8262；美国专利4,935,233和4,751,180。接头序列一般长约1-50氨基酸。当第一和第二多肽具有非必须N末端氨基酸区时可以不用接头序列，因为该区可将功能性区域间隔开来，避免立体干扰。
其它化学接头包括糖类接头，脂类接头，脂肪酸接头，聚醚接头，例如PEC等(参见，Hermanson，生物偶联技术(1996))。
D.其它多肽
如上所述，融合蛋白可以与一段或多段其它多肽连接。例如，融合多肽可以与该融合蛋白的一种或两种多肽的一份或多份拷贝相连。或者，可将融合蛋白与一段异源多肽(例如前述Ra12或LeIF)相连。还可将该融合多肽与一段亲和尾融合，从而简便表达后的纯化。例如，由此尾编码的多组氨酸可允许用金属螯合物亲和层析法来纯化融合多肽。其它亲和尾分子的例子包括：例如，Strep-尾，PinPoint，麦芽糖结合蛋白，谷胱甘肽S转移酶等(参见，Glick&Pasternak，分子生物技术原理和重组DNA的应用(第2版，1999))。
实施方式之一中，融合多肽还可以与一脂类部分相连，例如分枝菌酸，lipoaribdomanin(LAMs)或海藻糖衍生物。
如前所述，实施方式之一中，这样的融合蛋白是通过编码该融合蛋白的核酸分子重组表达产生的。可用已知方法，将编码所需氨基酸序列的核酸序列彼此连接，置于正确的读码框内，表达该产物，由此得到融合产物。或者，可通过蛋白质合成来制造这样的产物，例如，用肽合成仪。还可以在该融合聚核苷酸中加入例如细胞因子或佐剂等其它分子的编码序列。
E.序列的修饰
可如下鉴定保留了激发免疫应答能力的本发明融合蛋白的变异体：按以上所述一项或多项内容修饰该序列，然后测定所得融合蛋白激发免疫应答(例如T细胞应答或抗体应答)的能力。例如，一般可如下进行所述的试验：将T细胞与修饰后的融合蛋白接触，并分析应答反应。还可以分离构成融合蛋白的各多肽的天然变异体：例如，用编码各多肽或其变异体的DNA序列筛选合适的cDNA或基因组库。
引入上述序列修饰可采用标准重组技术或通过修饰融合蛋白的自动合成。例如，将突变引入特定基因座可通过合成一段含突变序列的寡核苷酸，其两侧为能将该区连入天然序列的限制酶位点。连接后，所得的构建序列就编码一个具有所需氨基酸***、取代或缺失的类似物。
或者，还可用寡核苷酸指导的定点诱变来产生特定密码子被取代、缺失或***的基因。产生以上改变的方法可参见Walder等(1986)基因42：133；Bauer等(1985)基因37：73；Graik(1985)生物技术，一月：12-19；Smith等，基因工程：原理和方法，Plenum Press(1981)；和美国专利4,518,584和4,737,462。
当然，为表达HER-2/neu蛋白质而构建的核苷酸序列内的突变必须保持编码序列的读码框，而且，不宜形成可杂交形成mRNA二级结构(例如环区或发卡区)的互补区，这些二级结构会阻碍mRNA的翻译。虽然突变的位点可以预定，但上述突变的性质却不一定能预计。例如，为了挑选一个给定位点上具有最佳特性的突变，可以对目标密码子进行随机诱变，对表达的突变HER-2/neu融合蛋白筛选所需活性。并非所有编码HER-2/neu融合蛋白的核苷酸序列内的突变都会表达在最终产物中。例如，可用核苷酸取代来增强表达，主要是避免转录mRNA内二级环结构的形成(参见，欧洲专利申请75,444A)，或者用来提供更可能被选定宿主翻译的密码子，例如用于大肠杆菌表达的常用大肠杆菌偏爱密码子。
F.表达载体
本发明HER-2/neu融合蛋白，其变异体宜通过重组DNA方法来产生。这样的方法包括：将编码HER-2/neu融合蛋白的DNA序列***重组表达载体，然后在有利表达的条件下，在重组的细菌、哺乳动物细胞，真菌或昆虫细胞表达***内表达该DNA序列，而且，最好分泌该融合蛋白。本发明编码HER-2/neu融合蛋白的DNA序列可用cDNA片段与短寡核苷酸接头拼接而成，或由一系列寡核苷酸拼接而成，从而得到能够***重组表达载体，并以一个重组转录单位表达的合成基因。
重组表达载体中，编码HER-2/neu融合蛋白的DNA序列与来自哺乳动物、真菌、细菌、病毒或昆虫基因的合适转录或翻译调控元件操作性连接。所述的调控元件包括转录启动子，任选的控制转录的操纵序列，编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列，和控制转录和翻译终止的序列。还可以含有复制起点和协助转化子鉴别的选择标记。
当DNA区域彼此功能性相关时，需将它们操作性连接。例如，如果需要表达参与多肽分泌的前导肽，则可将信号肽(分泌前导序列)的DNA与多肽的DNA操作性相连；如果一个启动子可控制序列的转录，则可将其与编码区操作性相连；如果一个核糖体结合位点可促进翻译，则可将其与编码序列操作性相连。“操作性相连”一般表示毗邻相连，对分泌性前导序列而言还必需在读码框内相连。用于微生物内表达的编码HER-2/neu融合蛋白的DNA序列最好不含内含子，内含子会提前终止DNA向mRNA的转录。
用于细菌的表达载体可含有市售质粒的选择标记和细菌复制起点，所述的市售质粒含有熟知的克隆载体pBR322(ATCC37017)中的各种遗传元件。这些市售质粒例如：pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)，pGEM 1(PromegaBiotec，Madison，WI)，pET28b(Novagen)和pPDM(pET28b的修饰型，Corixa)。将这些pBR322“骨架”的组件与合适的启动子和待表达的结构序列组合。pBR322是一种来自大肠杆菌的质粒(Bolivar等(1977)基因2：95)，常用其转化大肠杆菌。pBR322具有氨苄青霉素和链霉素抗性，因此可方便地鉴定出转化细胞。重组微生物表达载体的常用启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖启动子***(Chang等(1978)，自然275：615；和Goeddel等(1979)自然281：544；色氨酸(trp)启动子***(Goeddle等1980，核酸研究8：4057)和欧洲专利申请36,776)和tac启动子(Maniatis，分子克隆：实验室手册，Cold Spring Harbor laboratory，p.142(1982))。一种特别有用的细菌表达***采用噬菌体λPL启动子和cI857ts热敏阻抑蛋白。可向美国典型培养物保藏中心获取的含λPL启动子的质粒载体包括大肠杆菌JMB9(ATCC37092)内的pHUB2，和大肠杆菌RR1(ATCC53082)内的pPLc28。
适合酵母载体的合适启动子包括醇氧化酶、金属硫蛋白、3-磷酸甘油酸激酶的启动子(Hitzeman等(1980)，生物化学杂志255：2073)或其它糖酵解酶(Hess等(1968)，J.Adv.Enzyme Reg.7：149；和Holland等(1978)生物化学，17：4900)，例如烯醇化酶，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，己糖激酶，丙酮酸脱羧酶，果糖磷酸激酶，葡萄糖-6-磷酸异构酶，3-磷酸甘油酸变位酶，丙酮酸激酶，丙糖磷酸异构酶，葡萄糖磷酸异构酶和葡糖激酶。有关酵母表达的合适载体和启动子可参见欧洲专利申请73,657。
可将用于在大肠杆菌内选择和复制的pBR322的DNA序列(Ampr基因和复制起点)与包含葡萄糖可抑制性ADH2启动子和α-因子分泌前导序列的酵母DNA序列组装成适用的酵母载体。有关ADH2启动子可参见Russel等(1982)，生物化学杂志258：2674和Beier等(1982)自然300：724。酵母α-因子前导序列引起异源蛋白质的分泌，可将其***启动子与需表达的结构基因之间(参见Kurjan等(1982)，细胞30：933；和Bitter等(1984)美国科学院院报81：5330)。可对该前导序列进行修饰，从而在3＇端包含一个或多个有用的限制酶位点，从而利于该前导序列与异源基因的融合。
可在表达载体中使用病毒来源的转录和翻译调控序列来转化脊椎动物细胞。例如，常用的是多瘤病毒、腺病毒2、猴病毒40(SV40)和人巨细胞病毒的启动子和增强子。可用SV40病毒基因组的DNA序列，例如SV40复制起点，早期和晚期启动子，增强子，剪接和聚腺苷酸化位点提供表达异源DNA序列所需的其它遗传元件。特别有用的是早期和晚期启动子，因为，两者都很容易从病毒中得到，其形式为另含SV40复制起点的片段(Fiers等(1978)自然273：113)。也可以使用更大或更小的SV40片段，只要含有病毒复制起点中从Hind III到BglII之间的约250bp序列。此外，凡与所选的宿主细胞相容的病毒基因组启动子，调控和/或信号序列均可使用。可按照Okayama等(1983)分子细胞生物学3：280所述构建此类载体。
可按照Cosman等(1986)分子免疫学23：935所述，构建在C127小鼠***上皮细胞内稳定高水平表达哺乳动物受体cDNA的***。适合表达本发明融合蛋白的一种真核载体是pCD406(McMahan等(1991)，EMBO杂志10：2821，其中有SV40，人免疫缺陷病毒(HIV)和埃博病毒(EBV)的调控序列)。载体还包括pDC409和pDC410，它们都来自pDC406。pDC410以编码SV40大型T抗原的序列取代了pDC406中的EBV复制起点。pCD409与pDC406的区别在于缺失多克隆位点外的BglII位点，使得多克隆位点内的BglII位点成为唯一。任意其它启动子，只要能够在CMV启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、小鼠***肿瘤病毒启动子、Rous肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子或其它已知可用于哺乳动物细胞内有效表达的启动子调控下表达蛋白质，均可使用。
除了转录和翻译调控序列之外，有些表达***还含有证明基因扩增的标记，例如新霉素、胸腺嘧啶激酶、潮霉素B磷酸转移酶和二氢叶酸还原酶。
可使表达载体(例如pDC406和pDC409，都含有EBV的复制起点)游离型复制的细胞系是CV-1/EBNA(ATCC CRL 10478)。CV-1/EBNA细胞系是用编码EBV核抗原-I(EBNA-I)的基因转染CV-1细胞系而得到的，它可在人CMV立即早期增强子/启动子驱动下组成型地表达EBNA-I。
在培养的哺乳动物细胞内表达的优选载体包括pFLAGCMV-1(Kodak)，pcDNA3.1/hyg(Invitrogen)和pEE14-GS(CellTech)。
G.宿主细胞
转化的宿主细胞即如下宿主细胞：它们被重组DNA技术所构建的表达载体所转化或转染，因而含有编码本发明HER-2/neu融合蛋白的序列。转化的宿主细胞可表达所选的HER-2/neu融合蛋白，但用于克隆或扩增HER-2/neu DNA的宿主细胞不需要表达HER-2/neu融合蛋白。最好能使表达的HER-2/neu融合蛋白分泌到培养液或上清液中，这取决于所选的DNA。本领域技术人员知道，如果HER-2/neu融合蛋白分泌进入培养上清液，则它们也是可溶于培养上清液的。
任何熟知的用于将异源核苷酸序列引入宿主细胞的方法都可用于表达载体的引入。这些方法包括，使用Superfect(Qiagen)，脂质体，磷酸钙转染等试剂，Polvbrene，原生质体融合，电穿孔，显微注射，质粒载体，病毒载体，生物粒子加速(基因枪)，或其它用于将克隆基因组DNA，cDNA，合成DNA或其它异源遗传物质引入宿主细胞的方法(参见Sambrook等，同上)。
适合表达重组蛋白的宿主细胞包括受合适启动子调控的原核细胞、酵母或高等真核细胞。原核细胞包括革兰氏阴性和阳性微生物，例如大肠杆菌或芽孢杆菌。高等真核细胞包括后文所述的已建立的昆虫或哺乳动物细胞系。也可使用无细胞翻译***，用DNA构建物的RNA来生产HER-2/neu融合蛋白。适合用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主的克隆和表达载体如前文所述，例如，参见Pouwels等的“克隆载体：实验室手册”，Elsevier，NewYork(1985)。
可以用原核表达宿主来表达不需要广泛蛋白酶解和二硫键加工的HER-2/neu融合蛋白。原核表达载体一般含有一个或一个以上表型性选择标记，例如编码抗生素抗性蛋白的基因或满足某种营养需要的基因，还有一个可被宿主识别的复制起点，从而确保可在宿主内扩增。适用于转化的原核宿主包括大肠杆菌(例如BL21(DE3)，CodonePlus大肠杆菌)，枯草芽孢杆菌，以及鼠伤寒沙门氏菌和假单胞杆菌属、链霉菌属和葡萄球菌属的各菌种，但也可以使用其它宿主。
还可以在例如P.pastoris的酵母宿主中表达重组HER-2/neu融合蛋白。也可使用酿酒酵母、裂殖酵母、或克鲁维酵母等其它属的酵母。将待表达基因与细菌穿梭质粒(例如Invitrogen Co.的pPICZ系列)连接，然后用该载体转化酵母，并经染色体整合***酵母基因组的醇氧化酶(AOX)基因座，则可实现在毕赤氏酵母中的表达。然后，用例如Zeocin(Invitrogen)选出重组酵母，在培养液中加入甲醇诱导蛋白质的表达(参见Higgin等，“毕赤氏酵母法”，分子生物学方法，第103卷，Humana Press(1988))。适用于蛋白质表达的毕赤氏酵母菌株包括，例如，SMD1168毕赤氏酵母菌种。还可以采用基于其它方法的表达***，例如ESP***(Stratagene)。
合适的酵母转化方法是已知的。例如Hind等，美国科学院院报75：1929(1978)所述，包括，在选择培养液(0.67％酵母氮基本培养液，0.5％酪蛋白氨基酸，2％葡萄糖，10mg/ml腺嘌呤和20mg/ml尿嘧啶)中选择Trp+转化子。在营养培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％葡萄糖，80mg/ml腺嘌呤和80mg/ml尿嘧啶)中培养用载体转化的宿主菌种，所述载体含有ADH2启动子。当培养液中的葡萄糖消耗殆尽则发生ADH2启动子抑制。过滤收集粗制酵母上清液，保存于4℃，以备进一步纯化。
可用各种哺乳动物或昆虫(例如灰翅夜蛾(Spodoptera)或毛翅夜蛾(Trichoplusia))细胞培养***表达重组多肽。用杆状病毒***在昆虫细胞内表达异源多肽可参见例如Luckow等(1988)生物技术6：47。合适的宿主细胞系包括猴肾细胞COS-7细胞系，参见Gluzman(1981)细胞23：175，以及其它能够表达合适的载体的细胞系，例如CV-1/EBNA(ATCC CRL 10478)，L细胞，C127，3T3，中国仓鼠卵巢(CHO)，COS，NS-1，Hela，人胎肾成纤维细胞(HEK293)和BHK细胞系。哺乳动物表达载体可能含有非转录元件(例如复制起点，与待表达基因相连的合适启动子和/或增强子，或其它5＇或3＇非转录序列)，以及5＇或3＇非翻译序列(例如必需的核糖体结合位点，聚腺苷酸化位点，剪接的提供和接受位点，以及转录终止序列)。优选的哺乳动物表达***之一是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。
H.本发明融合蛋白的纯化
培养适合表达本发明DNA的重组翻译产物的宿主/载体***，然后由培养液或细胞提取物中提纯可制得纯化的HER-2/neu融合蛋白。例如，若是向培养液中分泌重组多肽的***，则可先用市售蛋白质浓缩滤膜对该***的上清液进行浓缩，所述滤膜例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元。浓缩后，将浓缩液上样到合适的纯化基质上。例如，合适的亲和基质可以是相对结构蛋白质(即，HER-2/neu融合蛋白基于结构通过特异性结合与之作用的蛋白质)或凝集素或抗体分子结合于合适的支持物上。
或者，可以使用阴离子交换树脂，例如，具有二乙基氨基乙基(DEAE)侧链的基质。该基质可以是丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、纤维素、聚乙烯、琼脂糖凝胶(Sepharose)或其它蛋白质纯化中常用的类型。也可采用阳离子交换。合适的阳离子交换剂包括各种含有磺丙基或羧甲基的不溶性基质，其中以磺丙基为佳。凝胶过滤层析也是HER-2/neu融合蛋白纯化的手段之一。较好的是，通过阴离子交换层析，例如用monoQ柱或Q琼脂糖凝胶高效层析法来纯化本发明的融合蛋白。
亲和力层析是纯化HER-2/neu融合蛋白的另一种优选方法。例如，可按已知方法，用抗HER-2/neu融合蛋白的单克隆抗体进行亲和力层析纯化。
最后，可通过一步或多步使用疏水性RP-HPLC介质(例如具有甲基或其它脂肪族基团侧链的硅胶)的反相高效液相层析(RP-HPLC)来进一步纯化HER-2/neu融合蛋白组合物。也可以将上述纯化步骤中的某些或全部进行各种组合，用来制备匀质的重组蛋白或多肽。
对于细菌培养物中产生的重组HER-2/neu融合蛋白，可先从细胞沉淀中进行萃取，然后进行一步或多步浓缩，盐析，水性离子交换或大小排阻层析。可用高效液相层析(HPLC)作为最终纯化步骤。用于表达重组HER-2/neu融合蛋白的细胞可用各种常规方法来裂解，例如冻融循环，超声波处理，机械破坏，或用细胞裂解剂。
若用表达分泌型HER-2/neu融合蛋白的酵母进行发酵，可大大简化纯化过程。可用类似Urdal等(1984)层析杂志296：171所述的方法纯化大规模发酵产生的分泌型重组蛋白质。该文献描述的是在制备级HPLC柱上，通过两步连续的反相HPLC，纯化重组的人GM-CSF。
在重组培养物中合成的HER-2/neu融合蛋白制品可能含有从培养物中回收HER-2/neu融合蛋白时的非HER-2/neu细胞组分(包括蛋白质)，它们的含量和特征取决于所采用的纯化步骤。这些组分一般来自酵母，原核细胞或非人真核细胞。这样的制品一般不含天然状态下与HER-2/neu蛋白结合的其它蛋白质。
自动合成是制备本发明蛋白质和多肽的另一种方法。例如，任何市售的固相技术都可采用，例如，Merrifield固相合成法，该方法将氨基酸依次加到一氨基酸延伸链上(参见Merrifield(1963)，美国化学协会杂志85：2149-2146)。自动合成多肽的设备有市售的，例如AppliedBiosystems Inc.(Foster城，CA)的产品，一般可按照制造商的说明进行操作。
总而言之，本文所述的多肽(包括融合蛋白)和聚核苷酸都是分离的。“分离”的多肽或聚核苷酸表示脱离了其原来的环境。例如，天然蛋白质如果与天然***中与之共存的其它物质相分离，则认为其是分离的。较好的是，所述多肽的纯度至少90％，更好的是95％，最好至少99％。例如，如果一段聚核苷酸被克隆到一个载体内，而该载体并非其天然环境的一部分，则认为其是分离的。
结合剂
本发明还提供了一些试剂，例如抗体及其抗原结合性片段，它们特异性结合本发明的HER-2/neu融合蛋白。在此，如果抗体或其抗原结合性片段以高于背景信号至少2倍的可测知的水平与HER-2/neu融合蛋白反应(例如在ELISA中)，而且在类似条件下与非相关蛋白质的反应则检测不到，则认为其“特异性结合”HER-2/neu融合蛋白。在此，“结合”表示两分子之间通过非共价键形成复合物。结合能力可通过测定形成复合物的结合常数来确定。结合常数即复合物浓度除以各组分浓度之积所得的数值。通常，在本文中，当形成复合物的结合常数高于1031/ml时，则称两化合物“结合”。结合常数可用已知方法测定。
采用本发明的代表性试验，结合剂也许还能分辨癌症和非癌症患者，所述癌症例如***癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌或***癌。换言之，与HER-2/neu融合蛋白结合的其它抗体或结合剂可产生某种信号，表明至少20％的患者存在癌症，或产生一个阴性信号，表明至少90％的个体没有癌症。为了确定某一结合剂是否满足这一要求，可按本文所述分析癌症和非癌症患者(由标准临床检测确定)的生物样品(例如血液，血清，血浆，尿液和/或肿瘤活检)，检测是否存在与结合剂相结合的多肽。显然，必需对具有统计学显著意义数量的样品进行分析。各结合剂都必需符合上述标准；然而，本领域技术人员知道，可以将多种结合剂组合使用，以提高灵敏度。
能满足上述要求的试剂都可以是结合剂。例如，结合剂可以是含或不含肽的核糖体，RNA或多肽分子。优选实施例之一中，结合剂是抗体或其抗原结合性片段。可用各种已知技术制备抗体，参见Harlow和Lane，“抗体：实验室手册”，Cold Spring Habor Laboratory，1988。通常，可用细胞培养技术生产抗体，包括如本文所述的单克隆抗体生产，或通过将抗体基于转入合适的细菌或哺乳动物细胞宿主来生产重组抗体。技术之一中，先给哺乳动物(可在小鼠、大鼠、兔子、绵羊或山羊等多种中任选)注射免疫原(包含，例如融合多肽，或有意义融合蛋白内各多肽彼此间接头的对应序列(即连接区))。在这一步中，本发明的融合蛋白或其连接区起着非修饰免疫原的作用。或者，对较短的序列来说，可将该序列与某种载体蛋白，例如牛血清白蛋白或匙孔血蓝蛋白相连，从而激发理想的免疫应答。较好的是，按照一个预定的计划给动物宿主注射免疫原，该计划应包括一次或多次加强免疫，并且，可定期抽取动物的血样。然后，例如，可通过亲和层析，即使用偶联于合适的固相支持物上的融合多肽，由抗血清纯化融合多肽的特异性多克隆抗体。
可从用本发明融合蛋白产生的多克隆抗体中挑选出仅与本发明融合蛋白发生特异性免疫应答，而不与构成融合蛋白的各单独多肽反应的多克隆抗体。这样的挑选可以通过扣除与本发明融合蛋白各单独多肽组分交叉反应的抗体来进行。
或者，本发明可采用能识别构成融合蛋白的各多肽组分中单个或全部的抗体。
可用Kohler和Milstein(1976)欧洲免疫学杂志6：511-519所述的方法，以及本文的改进，制备对本发明免疫原性融合多肽具有特异性的单克隆抗体。简而言之，这些方法包括制备能够产生具有所需特异性(即，与有意义融合多肽的反应性)的抗体的无限繁殖细胞系。可如前所述，由免疫动物获得脾细胞。然后将脾细胞与骨髓瘤细胞(最好与免疫动物同品系)融合，得到无限繁殖细胞系。融合可采用多种方法。例如，可将脾细胞和骨髓瘤细胞与非离子除垢剂接触数分钟，然后低密度地接种在支持杂交细胞生长而不支持骨髓瘤细胞生长的选择培养基上。优选选择方法之一是使用HAT(次黄嘌呤，氨基蝶啉，胸腺嘧啶)选择法。足够的时间，一般为1-2周后，可看到杂交集落。选出单个集落，检测其培养上清液与融合多肽的结合活性。优选具有高度反应性兼特异性的杂交瘤。
可从生长中的杂交瘤集落上清液中分离出单克隆抗体。此外，可用各种技术来提高得率，例如，将杂交瘤细胞系注射入合适的脊椎动物宿主，例如小鼠的腹腔。然后，由腹水或血液收获单克隆抗体。污染物可用常规技术去除，例如层析，凝胶过滤，沉淀和抽提。可用本发明的融合多肽于进行纯化，例如用于其中的亲合层析步骤。
某些实施方式中以使用抗体的抗原结合性片段为佳。这些片段包括用标准技术制备的Fab片段。简而言之，通过A蛋白珠层析柱上的亲合层析，从兔血清纯化免疫球蛋白(Harlow和Lane，“抗体：实验室手册”，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)，然后用木瓜蛋白酶消化，制得Fab和Fc片段。可通过A蛋白珠层析柱亲合层析纯化这些Fab和Fc片段。
可将本发明的单克隆抗体与一种或多种治疗剂偶联。合适的治疗剂包括放射性核素，分化诱导剂，药物，毒素，以及它们的衍生物。优选的放射性核素包括90Y，123I，125I，131I，186Re，188Re，211At和212Bi。优选的药物有氨甲蝶啉，以及吡啶、嘌呤类似物。优选的分化诱导剂包括佛波酯和丁酸。优选的毒素包括蓖麻毒蛋白，相思豆毒蛋白，白喉毒素，霍乱毒素，gelonin，假单胞菌外毒素，志贺氏菌毒素和商陆抗病毒蛋白。
可将治疗剂与合适的单克隆抗体直接(例如通过共价键)或间接(例如通过接头基团)偶联。如果药物和抗体都具有能够彼此反应的基团，则两者可能发生直接反应。例如，其中之一上的亲核基团，诸如氨基或巯基，可与另一个上的含羰基基团，例如酸酐或酰卤，或含有优良离去基团(例如卤素)的烷基反应。
或者，也可以将治疗剂与抗体通过接头基团相连。接头基团可以起将抗体与药物分开的间隔基的作用，从而避免对结合能力的影响。接头基团还能够提高药物或抗体上取代基的化学反应活性，从而提高偶联效率。化学反应性的提高还有利于药物或药物上的官能团发挥某些原本不可能的作用。
显然，许多双官能或多官能，均官能或异官能(例如Pierce Chemical Co.，Rockford，IL的目录中的那些)的反应试剂可用作接头基团。偶联可以发生在氨基、羧基、巯基或氧化羰基上。许多参考文献中描述了此类方法，例如美国专利4,671,958。
如果某治疗剂不与本发明免疫偶联物中的抗体部分相连时更有效，则可使用在被细胞内化时或内化后可切断的接头基团。已知许多此类基团。药物与这些接头基团胞内分离的机制包括：因二硫键还原而切断(例如美国专利4,489,710)，通过对光敏感键的辐照(例如美国专利4,625,014)，通过水解衍生的氨基酸链(例如美国专利4,638,045)，通过血清补体介导的水解(例如美国专利4,671,958)，和酸催化的水解(例如美国专利4,569,789)。
可能需要将一种以上药物与一个抗体相连。实施方式之一中，一种药物的多个分子与同一个抗体偶联。另一实施方式中，一种以上药物与一个抗体偶联。不论哪一种实施方式，都可用多种方法制得含有一种以上药物的免疫偶联物。例如，可将一种以上药物直接与一抗体分子相连，或与提供多个结合位点的接头相连。或者，也可以用载体。
载体可以多种方式携带药物，例如直接或通过接头共价结合。合适的载体包括蛋白质，例如白蛋白(美国专利4,507,234)，肽和多糖，例如氨基葡聚糖(美国专利4,699,784)。载体还可以通过非共价结合或通过包裹(例如包裹在脂质体囊泡中(美国专利4,429,008和4,873,088))来携带药物。专用于放射性核素类药物的载体包括放射性卤化小分子和螯合化合物。例如，美国专利4,735,792描述了代表性的放射性卤化小分子及它们的合成。可由螯合化合物制备放射性核素螯合物，这些化合物包括可结合金属或金属氧化物、放射性核素的氮或硫原子作为供电子原子。例如，美国专利4,673,562描述了代表性的螯合化合物及它们的合成。
可采用多种途径给予抗体和免疫偶联物。通常，可通过静脉、肌内、皮下或已切除肿瘤的癌床内给药。显然，抗体/免疫偶联物的确切剂量取决于所用的抗体，肿瘤上的抗原密度，和抗体的清除速度。
适用于本发明融合蛋白的抗体包括但不限于8029K兔多克隆抗体，小鼠单克隆c-neu-3抗体(Calbiochem)，和小鼠单克隆Herceptin抗体(美国专利5,677,171)。单克隆抗体c-neu-3可识别PD区的一连续性表位，该表位没有ECD-ΔPD构建物中的1242-1255aa。Herceptin抗体则与ECD区的一个构象性表位结合。
T细胞
免疫治疗组合物还可以或也可以包含本发明融合蛋白的特异性T细胞。可用标准方法在体外或体内制备这样的细胞。例如，可从患者的骨髓、外周血或其组分中，用市售的细胞分离***分离T细胞(参见美国专利5,240,856和5,215,926；WO89/06280；WO91/16116和WO92/07243)。或者，也可以从相关或不相关的人、非人哺乳动物的细胞系或培养物中制备T细胞。
可用HER-2/neu融合多肽，编码HER-2/neu融合蛋白的聚核苷酸和/或表达融合多肽的抗原呈递细胞(APC)激发T细胞。所述激发的条件和时间应足以产生对所述融合多肽具有特异性的T细胞。较好的是，将HER-2/neu融合多肽或聚核苷酸包含于一传递载体(例如微球体)中，从而促进特异性T细胞的产生。
如果T细胞能够杀死外有融合多肽或表达编码融合多肽的聚核苷酸的细胞，则认为该T细胞具有对HER-2/neu融合多肽的特异性。可用多种标准技术来测定T细胞的特异性。例如，在铬释放试验或增殖试验中，如果裂解作用和/或增殖作用的激发指数比阴性对照高2倍以上，则说明T细胞具有特异性。进行这样的试验可参照例如Chen等(1994)癌症研究54：1065-1070所述。或者，可用多种已知方法检测T细胞是否增殖。例如，测定DNA的合成速度可测知T细胞的增殖(例如，通过用氚化胸腺嘧啶脉冲标记T细胞培养物，然后测定掺入DNA的氚化胸腺嘧啶)。与HER-2/neu融合多肽(100ng/ml一100μg/ml，以200ng/ml-25μg/ml为佳)接触3-7天，应能使T细胞增殖提高至少2倍。如上所述接触2-3小时，根据标准细胞因子试验，应能激活T细胞，在所述试验中，细胞因子(TNF或IFN-γ)释放水平提高2倍则说明T细胞被激活(参见Coligan等，现代免疫学方法，第1卷，Wiley Interscience(Green 1989))。被HER-2/neu融合多肽，聚核苷酸或表达融合多肽的APC激活的T细胞可能是CD4+和/或CD8+。可用标准技术扩增HER-2/neu融合蛋白特异性T细胞。在优选实施方式中，所述T细胞来自患者，或相关或非相关提供者，并在激发和扩增后给予患者。
出于治疗目的，可体外或体内扩增对HER-2/neu融合多肽、聚核苷酸或APC应答而增殖的CD4+和/或CD8+T细胞。此类T细胞的体外扩增有多种途径。例如，可在加或不加T细胞生长因子(例如白介素-2)的条件下，让T细胞与HER-2/neu融合多肽再次接触，和/或与能合成HER-2/neu融合多肽的激发者细胞解除。或者，可通过克隆来扩增对HER-2/neu融合蛋白应答而增殖的T细胞。扩增后，可如Chang等(1996)Crit.Rev.Oncol.Hematol.22：213所述，将细胞回输给患者。包含本发明融合蛋白的药物组合物和疫苗
另一优选实施方式中，本发明涉及包含HER-2/neu融合蛋白或其变异体，以及HER-2/neu ICD蛋白或其变异体的组合物。所述的融合蛋白以本发明所详细描述的ECD-ICD融合蛋白，ECD-PD融合蛋白，或它们的变异体为佳。所述的ICD蛋白以人ICD蛋白为佳，它包括图7(SEQ ID NO：1)中的Lys676-Val1255区域，或大鼠ICD蛋白，即图8(SEQ ID NO：2)中的Lys677-Val1256区域。或者，HER-2/neu ICD蛋白也可以是具有免疫原性或可提高组合物的免疫原性的ICD的各种变异体或其部分。例如，ICD蛋白的部分可以是前述HER-2/neu PD蛋白，HER-2/neuΔPD蛋白，HER-2/neuKD蛋白，或N或C末端1-100氨基酸内任一处缺失的HER-2/neu ICD蛋白。此外，可通过多种途径进行氨基酸取代，从而得到本发明的变异体实施方式。在一优选实施方式中，进行了前文所述的保守性氨基酸取代。
在某些内容中，可将本发明所述的多肽、聚核苷酸、T细胞和/或结合剂加入药物组合物或免疫原性组合物(及疫苗)。药物组合物包含一种或多种以上化合物和生理学上认可的载体。疫苗可包含一种或多种上述化合物和非特异性免疫应答增强剂。非特异性免疫应答增强剂可以是任何能够增强对异源抗原免疫应答的物质。非特异性免疫应答增强剂的例子包括佐剂，可生物降解的微球体(例如聚乳糖半乳糖苷(polylactic galactide))和脂质体(可包裹化合物，参见美国专利4,235,877)。有关疫苗制剂，可参见Powell和Newman编辑的“疫苗设计”(亚基和佐剂方法)，Plunum Press(NY 1995)。可以设计可产生抗体免疫和/或CTL或CD4+引起的细胞免疫的疫苗。
本发明的药物组合物和疫苗还可以包含其它生物活性或非生物活性的化合物。例如，组合物或疫苗中可含有一种或多种其它肿瘤抗原的免疫原性部分，可以将它们结合在融合多肽内，或作为独立的化合物。多肽可以，但非必要，与例如美国专利4,372,945所述的其它大分子偶联。药物组合物和疫苗可用于预防和治疗。
药物组合物或疫苗可含有编码一种或多种前述Her-2/neu融合蛋白、Her-2/neu ECD-ICD和/或Her-2/neu ECD-PD的聚核苷酸，这样，就可以原位产生融合蛋白。这样的聚核苷酸可以是DNA、RNA、修饰核酸或DNA/RAN杂交链。如上所述，聚核苷酸可包含在各种已知的传递***中，这些***包括核酸表达***，细菌和病毒表达***。已知有多种基因传递技术，例如Rolland(1998)Crit.Rev.Therap.药物载体***15：143-198所述。合适的核酸表达***含有在患者体内表达所必需的DNA序列(例如合适的启动子和终止信号)。细菌传递***包括给予这样的细菌(例如芽孢杆菌Calmette-Guerin)：它可在其细胞表面表达融合蛋白的免疫原性部分，或分泌该表位。在一优选实施方式中，可用病毒表达***(例如牛痘、天花病毒、逆病毒或腺病毒)引入DNA，这包括使用非病原性(缺陷型)可复制病毒。合适的***可参见Fisher-Hoch等(1989)美国科学院院报86：317-321；Flexner等(1989)纽约学术协会年报569：86-103；Flexner等(1990)疫苗8：17-21；美国专利4,603,112，4,769,330，4,777,127和5,017,487；WO89/01973；GB2,200,651；EP0,345,242；WO91/02805；Berkner(1988)生物技术6：616-627；Rosenfeld等(1991)科学252：431-434；Kolls等(1994)美国科学院院报91：215-219；Kass-Eisler等(1993)美国科学院院报90：11498-11502；Guzman等(1993)循环88：2838-2848；和Guzman等(1993)循环***研究73：1202-1207。将DNA引入所述表达***的方法是已知的。也可以用“裸露”DNA，例如Ulmer等(1993)科学259：1745-1749所述，Cohen(1993)科学259：1691-1692所述。将裸露DNA包在可生物降解的微珠上可提高其被摄取率从而有效转运入细胞。显然，疫苗可以既包含聚核苷酸又包含多肽。这样的疫苗可提供更强的免疫应答。
显然，疫苗可含有药学上认可的本发明聚核苷酸和融合多肽的盐。这样的盐可用药学上认可的无毒碱，包括有机碱(例如伯胺、仲胺和叔胺，以及碱性氨基酸的盐)和无机碱(例如钠、钾、锂、铵、钙和镁盐)来制备。
虽然各种合适的已知载体都可用于本发明的药物组合物，但载体的类型根据给药方式不同而不同。可根据各种适合的给药方式来配制本发明组合物，包括例如局部，口服，鼻内，静脉，颅内，腹膜内，皮下或肌内给药。对诸如皮下注射等非肠胃给药而而言，较好的载体是水、盐水、醇、脂类、蜡或缓冲液。对于口服来说，任何上述载体或固体载体均可使用，例如甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，滑石粉，纤维素，葡萄糖，蔗糖和碳酸镁。可生物降解的微球(例如聚乳酸酯聚甘醇酸酯)也可用作本发明药物组合物的载体。合适的可生物降解的微球可参见美国专利4,897,268，5,075,109，5,928,647，5,811,128，5,820,883，可将5，8-2/neu融合蛋白包裹在可生物降解的微球中，或结合于其表面。实施方式之一中，将本发明的ECD-ICD融合蛋白包在可生物降解的微球中。也可以或还可以将本发明的ECD-PD融合蛋白包在可生物降解的微球中。所述的微球体可以既包含ECD-ICD融合蛋白又包含ECD-PD融合蛋白。较好的是，微球体小于25μm，以1-10μm为佳。有关脂质体胶囊化可参见例如美国专利4,235,877。
所述的组合物还可以包含缓冲液(中性缓冲盐溶液，或磷酸盐缓冲液)，糖(例如葡萄糖，甘露糖，蔗糖或葡聚糖)，甘露醇，蛋白质，多肽或甘氨酸等氨基酸，抗氧化剂，抑菌剂，EDTA或谷胱甘肽等螯合剂，佐剂(例如氢氧化铝)，使制剂与受血者的血液达到等渗、低渗或略为高渗的溶剂，悬浮剂，增稠剂和或防腐剂。或者，可将本发明的组合物制成冻干剂。可用熟知的技术将化合物包在脂质体内。
本发明疫苗可包含各种免疫应答增强剂或免疫刺激物。例如，可包含佐剂。大多数佐剂含有可保护抗原不被迅速代谢的物质，例如氢氧化铝或矿物油，以及免疫应答刺激物，例如脂类A，百日咳杆菌或结核分支杆菌产生的蛋白质。合适的佐剂有市售的，例如Freund不完全佐剂和完全佐剂(Difco Laboratories，Detroit，MI)；Merck佐剂65(Merck and Company，Inc.，Rahway，NJ)；AS-2(SmithKlineBeecham)；铝盐，例如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝；钙、铁或锌盐；酰化酪氨酸的不溶性悬浮液；酰化糖；阳离子或阴离子衍生的多肽；聚磷腈；可生物降解的微球体；单磷酰脂类A和quil A。也可用细胞因子，例如GM-CSF或白介素-2、-7或-12作为佐剂。
本发明疫苗中的佐剂组合物最好设计成可诱导以Th1型为主的免疫应答。对于给予的抗原，高水平的Th1型细胞因子(例如IFN-γ，TNF-α，IL-2和IL-12)倾向于诱导细胞免疫应答。相反，高水平的Th2型细胞因子(例如IL-4，IL-5，IL-6和IL-10)则倾向于诱导体液免疫应答。给予本发明的疫苗后，患者将发生既包括Th1型又包括Th2型的免疫应答。在优选实施方式中，即以Th1型为主的免疫应答中，Th1型细胞因子的水平被提高，超过Th2型细胞因子。用标准方法即可测得上述细胞因子的水平。有关细胞因子，可参见Mosmann和Coffman(1989)Ann.Rev.Immunol.7：145-173。
用于激发Th1型为主免疫应答的优选佐剂包括，例如，单磷酰脂类A(优选3-脱氧酰化单磷酰脂类A(3D-MPL))与铝盐的组合。MPL佐剂可购自CorixaCorporation(Hamilton，MT；参见美国专利4,436,727；4,877,611；4,866,034和4,912,094)。含CpG的寡核苷酸(其中，CpG二核苷酸没有甲基化)也能诱导Th1型为主的免疫应答。此类寡核苷酸是业内熟知的，例如可参见WO96/02555和WP99/33488。有关免疫激发性DNA序列还可参见Sato等(1996)科学273：352。另一种优选佐剂是皂苷，以QS21(Aquila，United States)为佳，它可以单用，也可以与其它佐剂联用。例如，一种增强***包含单磷酰脂类A和皂苷的组合物，例如WO94/00153中的QS21与3D-MPL联运，或者，含一种反应原性较低的组合物，其中，QS21被胆固醇所淬息，参见WO96/33739。其它优选制剂包括水包油乳液和生育酚。一种特别有效的佐剂中含有QS21，3D-MPL，和含于水包油乳液中的生育酚，参见WO95/17210。有关QS21和3D-MPL，还可参见EP671 948B1。
其它优选佐剂有：Montanide ISA 720(Seppic，France)，SAF(Chiron，California，United States)，ISCOMS(CSL)，MF-59(Chiron)，SBAS佐剂系列(例如，SBAS-2或SBAS-4，可购自SmithKline Beecham，Rixensart，Belgium)，Detox(CorixaCorporation，Hamilton，MT)，RC-529(Corixa，USA)和氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯(AGPs)。
优选实施例之一中，佐剂是SBAS-2(参见，EP735898B1)。
本发明的各种疫苗都可用已知方法制备，从而得到包含抗原、免疫应答增强剂，合适的载体或赋形剂的组合物。所述的组合物可作为缓释制剂(即胶囊或海绵制剂，可在给予后缓慢地发挥作用)的一部分给予患者。此类制剂一般可用已知方法(参见，Coombes等(1996)疫苗14：1429-1438)来制备，并通过口服、直肠或皮下植入，或目标位置植入来给予。缓释制剂可以将多肽、聚核苷酸或抗体分散在载体基质中，和/或将其包含于储存体中，并外被以控释膜。
此类制剂所用的载体须生物相容，也可以是可生物降解的；较好的是，此类制剂可以相对恒定的水平释放出活性成分。所述载体包括聚(交酯共乙醇酸酯)，以及聚丙烯酸酯，胶乳，淀粉，纤维素和葡聚糖制成的微粒。其它缓释载体还包括超分子生物载体，它们具有一个非液态的亲水核(例如交联多糖或寡糖)，以及可选的两性化合物(例如磷脂)外层(参见美国专利5,151,254和PCT申请WO94/20078，WO94/23701和WO96/06638)。缓释制剂中活性化合物的含量取决于有待植入的部位，释放速度，预期释放时间，以及有待治疗和预防的疾病的性质。
可在药物组合物和疫苗中使用多种传递载体，以促进针对肿瘤的抗原特异性免疫应答。所述传递载体包括抗原呈递细胞(APC)，例如树状细胞，巨噬细胞，B细胞，单核细胞以及其它经基因工程改造后成为有效APC的细胞。可以但非必须对此类细胞进行基因修饰，以提高其呈递抗原的能力，从而加强T细胞应答的活化和/或持续，获得其自身的抗肿瘤效果和/或与受主免疫相容(即HLA单倍体相匹配)。APC可分离自各种生物液和器官，包括肿瘤和肿瘤周组织，并可以是自身、同种异体、同系或异种细胞。
本发明部分优选实施方式使用树状细胞或祖细胞作为抗原呈递细胞。树状细胞是很强的APC(Banchereau等(1998)自然392：245-251)，并已被证明是有效的生理佐剂，可激发预防或治疗性的抗肿瘤免疫力(参见，Timmerman等(1999)医学评论年报50：507-529)。通常，可根据其典型的形状(原位呈星形，体外可观察到明显的胞质突出(树突))，其高效加工和提呈抗原的能力，及其激活原初T细胞应答的能力来鉴别树状细胞。当然，可对树状细胞进行基因工程改造，使其在体内或体外表达树状细胞原来没有的特定细胞表面受体或配体，本发明包括此类修饰过的树状细胞。或者，疫苗中也可以使用分泌型囊泡抗原携带树状细胞(又称外来体(exosome))(参见Zitvogel等(1998)自然医学4：594-600)。
树状细胞和祖细胞可从外周血、骨髓、肿瘤浸润细胞、肿瘤周边组织-浸润细胞、***、脾脏、皮肤、脐带血或其它合适的组织或液体获得。例如，可从外周血获得单核细胞，体外培养，向该培养物中加入GM-CSF、IL-4，IL-3和/或TNFα等细胞因子的组合物，促使树状细胞的体外分化。或者，从外周血、脐带血或骨髓获得CD34阳性细胞，向培养基中加入可诱导树状细胞成熟和增殖的GM-CSF、IL-3、TNFα、CD40配体、LPS、flt3配体和/或其它化合物的组合物，使得它们分化为树状细胞。
一般将树状细胞分为“不成熟”细胞和“成熟”细胞，从而简单区分两种极具特征的表型。然而，不应将这种命名理解为排除所有可能的分化中间状态。不成熟树状细胞的特征在于，它是抗原摄取和加工能力很高的APC，这与Fcγ受体和甘露醇受体的高表达相关。成熟表型的特征在于这些标记的表达水平较低，但与T细胞活化有关的细胞表面分子表达水平较高，例如I类和II类MHC分子、粘附分子(例如CD54和CD11)和协同刺激分子(例如CD40，CD80，和4-1BB)。
可用编码本发明融合蛋白(或其变异体)的聚核苷酸转染APC，这样，该融合蛋白或其变异体可表达于该细胞表面。所述的转染可体外进行，然后，可将含有此类转染细胞的组合物或疫苗用于治疗。或者，可将定向于树状细胞或其它抗原呈递细胞的基因传递载体给予患者，从而进行体内转染。体内和体外树状细胞转染可用已知方法进行，例如WO97/24447所述的方法，或Mahvi等(1997)免疫学和细胞生物学75：456-460所述的基因枪法。树状细胞上的抗原加载可通过将树状细胞或祖细胞与有意义的融合蛋白、DNA(裸露或含于质粒载体内)或RNA或表达融合蛋白的重组细菌或病毒(例如牛痘、禽痘病毒、腺病毒或慢病毒载体)共培养进行。或者，可分别，或在融合蛋白存在下，用非偶联免疫伴侣对树状细胞进行脉冲处理。
疫苗和药物组合物可以呈单位剂量或多剂量的包装形式，例如密封的安瓿瓶或小管。此类容器在使用前应是密封的，以防细菌污染。通常，制剂可以油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液的形式储存。或者，可将疫苗或药物组合物保存在冷冻干燥条件下，使用前，只需加入无菌液体载体即可。
显而易见的是，用于疫苗的HER-2/neu融合蛋白或核酸可以合成，也可以通过自然衍生得到。对本发明融合蛋白的免疫应答
A.对本发明融合蛋白的免疫应答的检测
本发明内容之一中，HER-2/neu融合蛋白(或其编码聚核苷酸)可用于产生对HER-2/neu蛋白(包括HER-2/neu致癌基因相关恶性肿瘤上表达的那些)的免疫应答。所述恶性肿瘤例如***癌，卵巢癌，结肠癌，肺癌和***癌。HER-2/neu融合蛋白诱导的对HER-2/neu蛋白的免疫应答一旦产生可以长期持续，在免疫后较长时间后仍可检测到，与检测时体内是否存在该蛋白质无关。因与HER-2/neu融合蛋白反应而产生的抗HER-2/neu蛋白免疫应答可通过检测CD4+或CD8+T细胞活化是否发生或增强，或检测有否抗体来检测。例如，用常规方法(例如，外周血淋巴细胞Ficoll/Hypaque密度梯度离心)分离出免疫个体的T细胞，将其与HER-2/neu融合蛋白共培养。例如，可将T细胞与HER-2/neu融合蛋白(一般为5μg/ml全蛋白，或相当数量的合成HER-2/neu蛋白质的细胞)37℃体外共培养2-9天(一般为4天)。可能需要将另一份T细胞样品培养在无HER-2/neu融合蛋白条件下以作为对照。
有多种方法可检测CD4+或CD8+T细胞的特异性活化。检测特异性T细胞活化的方法包括：检测T细胞的增殖，细胞因子(例如淋巴因子)的产生，或溶胞活性(即，HER-2/neu融合蛋白特异性细胞毒T细胞的产生)。对CD4+T细胞而言，检测特异性T细胞活化的较好方法是检测T细胞的增殖。对CD8+T细胞而言，较好的方法是检测溶胞活性。
有多种已知方法可检测T细胞增殖。例如，可检测DNA合成速度。受刺激而增殖的T细胞会表现出DNA合成速度提高。测定DNA合成速度的经典方法是，例如，用氚化胸腺嘧啶脉冲标记T细胞培养物，这种核苷前体会掺入新合成的DNA中。可用液相闪烁分光光度计测定掺入的氚化胸腺嘧啶。检测T细胞增殖的其它方法包括检测白介素-2(IL-2)生成，Ca2+通量或染料(例如3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑)的摄取。或者，可以检测淋巴因子(例如γ干扰素)的合成，或测定可对完整p185HER-2/neu蛋白产生反应的T细胞的相对数量。
B.对本发明融合蛋白应答而产生的抗体的检测
本发明还涉及检测这样的HER-2/neu融合蛋白，它不仅具有对T细胞的免疫原性，而且可刺激B细胞产生可识别HER-2/neu融合蛋白的抗体。检测这样的抗体为诊断HER-2/neu致癌基因相关恶性肿瘤提供了另一种方法。HER-2/neu融合蛋白特异性抗体(即结合亲和力约为107L/摩尔或更高)存在于包括血清和腹水等多种体液中。简而言之，分离获取需要检测是否存在该融合蛋白特异性抗体的人等温血动物的体液。将该体液与HER-2/neu融合蛋白共培养，培养条件和时间应足以允许HER-2/neu融合蛋白与其特异性抗体形成免疫复合物。例如，可将体液与HER-2/neu融合蛋白46℃共培养24-48小时。然后，检测反应混合物中有否免疫复合物。可用多种已知方法检测HER-2/neu融合蛋白与其特异性抗体之间形成的一种或多种免疫复合物，例如放射性免疫试验(RIA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)。
合适的免疫试验包括David等(美国专利4,376,110)所述的单克隆抗体夹心免疫试验；单克隆-多克隆抗体夹心试验(Wide等，Kirkham和Hunter编辑的放射性免疫试验方法，E.和S.Livingstone，Edinburgh(1970))；Gordon等的“Western印迹”法(美国专利4,452,901)；标记配体免疫沉淀(Brown等(1980)生物化学杂志255：4980-4983)；Raines等(1982)生物化学杂志257：5154-5160所述的酶联免疫吸附试验；免疫细胞化学技术，包括使用荧光染料(Brooks等(1980)临床实验免疫学39：477)；和活性中和反应(Bowen-Pope等(1984)美国科学院院报81：2396-2400)，本文参考了以上各篇文献。除上述免疫试验之外，本发明还参考了许多其它免疫试验，包括美国专利3,817,827；3,850,752；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876。
用于检测时，HER-2/neu融合蛋白(即抗原)可以标记也可以不标记。不标记时，融合蛋白可用于凝集试验。此外，不标记的融合蛋白还可以与对免疫复合物具有反应性的的标记分子联用，或与标记抗体(第二抗体)联用，该第二抗体具有对抗HER-2/neu融合蛋白抗体的反应性，例如免疫球蛋白的抗体。或者，可直接标记所述融合蛋白。当标记时，报道基团可以是放射性同位素，荧光团，酶，发光团，染料粒子等。以上及其它标记是业内熟知的，可参见例如美国专利3,766,162；3,791,932；3,817,837；3,996,345；和4,233,402。
一般在ELISA试验中，有意义的融合蛋白吸附于微滴板的孔表面。然后用合适的试剂(例如牛血清白蛋白(BSA)，热灭活的普通山羊血清(NGS)，或BLOTTO(脱脂乳的缓冲溶液，另含防腐剂、盐和消泡剂)封闭表面上其余可结合蛋白质的位点。然后，这些孔与怀疑有特异性抗体的样品共保温。可加入原倍样品，但通常用缓冲液进行稀释，缓冲液中含少量(0.1-5.0重量％)蛋白质(例如BSA，NGS或BLOTTO)。保温时间足以发生特异性结合后，洗去孔中未结合的蛋白质，然后再与以报道基团标记的种特异性免疫球蛋白共同保温。所述报道基团可选自多种酶，例如辣根过氧化物酶，β-半乳糖苷酶，碱性磷酸酯酶和葡萄糖氧化酶。保温时间应足以发生特异性结合，然后再次洗去未结合的偶联物，加入酶的底物。令其显色，通过目测或用仪器测定孔中物质的光密度。
这方面的一种优选实施方式中，将一种报道基团与有意义的HER-2/neu融合蛋白结合。检测免疫复合物的步骤包括去除几乎所有未结合的HER-2/neu融合蛋白，然后检测是否存在该报道基团。
另一种优选实施方式中，将报道基团与可结合HER-2/neu融合蛋白特异性抗体的第二抗体偶联。检测免疫复合物的步骤包括：(a)去除几乎所有未结合的抗体；(b)加入第二抗体，(c)去除几乎所有未结合的第二抗体，然后(d)检测是否存在报道基团。其中的HER-2/neu融合蛋白特异性抗体来自人，其中的第二抗体是抗人抗体的抗体。
检测免疫复合物的第三种优选实施方式中，报道基团与一种可结合免疫复合物的分子结合。检测步骤包括：(a)加入该分子，(b)去除几乎所有未结合的分子，然后(c)检测检测是否存在报道基团。所述能结合免疫复合物的分子的一个例子是A蛋白。
显而易见的是，有多种检测免疫复合物的方法可用于本发明。这些方法中合适的报道基团包括，例如，放射性同位素，荧光团，酶，发光团和染料粒子。
在本发明与此相关的内容中，对HER-2/neu融合蛋白与体液内该融合蛋白特异性抗体间所形成免疫复合物的检测可用来反映HER-2/neu致癌基因相关性癌症的治疗方法的效果，所述疗法用到HER-2/neu融合蛋白。可用上述方法，对治疗开始前后分别采集的体液样品进行分析。简而言之，即比较两份样品中测得的免疫复合物数量。若第二份样品(治疗开始后)中的免疫复合物数量与第一份样品(治疗前)相比有显著改变，则说明治疗是成功的。
在本发明的另一方面内容中，本发明的组合物被用于***癌、卵巢癌、结肠、肺和***癌等癌症的免疫治疗。在这类方法中，通常将组合物和疫苗给予患者。“患者”在此指各种温血动物，以人为佳。所述的患者可能患有癌症，也可能没有癌症。所以，上述药物组合物和疫苗或可用于预防癌症，或可用于治疗已经患有癌症的患者。癌症的诊断可采用用业内已普遍认可的标准，包括是否存在恶性肿瘤。药物组合物和疫苗可在手术去除原发肿瘤和/或放射或常规化学治疗之前或之后使用。给药可采用各种合适的方法，包括静脉、腹膜内、肌内、皮下、鼻内、皮内、***、***、局部、舌下和口服等途径。
某些实施方式中，所述免疫疗法是主动免疫疗法，其中的治疗主要依赖于通过给予免疫应答修饰剂(例如本发明的融合多肽和聚核苷酸)激发宿主内源性免疫***对抗肿瘤。
另一些实施方式中，所述的免疫疗法是被动免疫疗法，其中的治疗包括给予已经具备了肿瘤-免疫应答性的物质(例如效应细胞或抗体)，这些物质能够直接或间接介导抗肿瘤效果，不一定依赖于健全的宿主免疫***。效应细胞的例子包括前文所述的T细胞，T淋巴细胞(例如CD8+细胞毒T淋巴细胞和肿瘤浸润性CD4+T辅助淋巴细胞)，杀伤细胞(例如天然杀伤细胞和淋巴因子激活的杀伤细胞)，表达本发明融合蛋白的B细胞和抗原呈递细胞(例如树状细胞和巨噬细胞)。可将本发明融合多肽特异性的T细胞的受体和抗体的受体克隆，表达，然后转移到其它载体或效应细胞中，用于过继免疫疗法。本发明的融合多肽还可用于产生抗体或抗独特型抗体(参见前文所述和美国专利4,918,164)，用于被动免疫疗法。
通常，通过如本发明所述的体外培养可以获得足够数量用于过继免疫疗法的效应细胞。将单抗原特异性效应细胞扩增至数十亿，同时保持其体内识别抗原的能力，这样的培养条件是业内熟知的。这样的体外培养条件一般采用在细胞因子(例如IL-2)和非***饲养细胞存在下用抗原进行间歇性刺激。如前所述，本发明的免疫应答性融合多肽可用于迅速扩增抗原特异性T细胞，从而产生足量用于免疫疗法的细胞。具体地说，可用免疫应答性融合多肽脉冲处理树状细胞、巨噬细胞或B细胞等抗原呈递细胞，或通过标准方法用一种或多种聚核苷酸进行转染。例如，可用含于重组病毒或其它表达载体内的一段聚核苷酸转染抗原呈递细胞，该聚核苷酸含有适合增强表达的启动子。用于治疗的培养后效应细胞应能广泛生长和分布，并能在体内长期存活。研究发现，用抗原加IL-2反复刺激，可诱导培养的效应细胞在体内大量生长并长期存活(参见，例如，Cheever等(1997)免疫学评论157：177)。
或者，可将表达本发明融合多肽的载体导入取自患者的抗原呈递细胞，并在体外克隆扩增，然后回输给该患者。将转染细胞回输给患者可采用各种业内已知的方法，较好的是无菌条件下的静脉、腔内、腹膜内或肿瘤内给予。
给予本发明治疗组合物的途径和频率以及剂量因人而异，但可用标准技术来确定。通常，药物组合物和疫苗的给予可通过注射(皮内、肌内、静脉和皮下)，鼻内(吸入)或口服。较好的是，在52周内进行1-10次给药。较好的是，一个月间期给药6次，然后定期加强免疫。对不同患者有不同的适宜方法。在如上所述给药时，适宜的剂量应能够促进抗肿瘤免疫应答，并高于基线(及未处理)水平至少10-15％。这样的反应可通过测定患者体内的抗肿瘤抗体或疫苗依赖性细胞毒效应细胞(能杀死患者体内的肿瘤细胞)的产生来监测。这样的疫苗还应该能够在接受免疫的患者中引起相比未接受免疫患者的临床效果改善(例如，更频繁的缓解期，完全或部分无疾病或更长的存活期)的免疫应答。通常，对于含有一种或多种聚核苷酸的药物组合物和疫苗来说，每一剂中，各融合蛋白的含量约为每kg宿主体重1μg-5mg，以100μg-5mg为佳，5μg-250μg最好。合适的剂量因患者体型大小而异，一般在约0.1-5ml之间。
较好的是，初次免疫用含有ECD和/或ICD或PD至少其一的HER-2/neu融合蛋白进行，此后免疫或加强免疫则可用含有ECD和/或ICD或PD至少其一的HER-2/neu融合蛋白进行。优选用于免疫的ECD-ICD和/或ECD-PD融合蛋白即本文所述的那些。知道，本发明既考虑到使用一段完好的HER-2/neu融合蛋白，也考虑到将HER-2/neu融合蛋白分成多个肽。具有完整HER-2/neu ECD区域氨基酸序列的完整p185HER-2/neu蛋白或肽都不单独用于免疫。
通常，适当的剂量和治疗发案需要足量的活性化合物，从而提供治疗和/或预防效果。根据接受治疗的患者优于非治疗患者的临床效果(例如，更频繁的缓解期，完全或部分无疾病或更长的存活期)，可对这样的反应进行监测。原有抗HER-2/neu蛋白或融合蛋白免疫应答的增强通常与临床效果改善相关联。所述的免疫应答可用标准的增殖、细胞毒或细胞因子试验来评价，这些试验可用治疗之之前或之后的患者样品进行。监测癌症
A.监测癌症的方法
可根据取自患者的生物样品(例如全血，血清，血浆，尿液和/或肿瘤活检)中是否存在HER-2/neu蛋白和/或其编码聚核苷酸来检测癌症。换言之，所述的蛋白质可用作标记来指示是否存在***癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌、***癌等癌症。通常可用本发明所述的结合剂检测生物样品中可与其结合的HER-2/neu蛋白的水平。可用聚核苷酸引物和探针来检测编码HER-2/neu肿瘤蛋白的mRNA水平，这一水平也可指示是否存在癌症。通常，肿瘤组织内的HER-2/neu肿瘤序列水平比正常组织内高至少3倍。
有多种已知试验可用结合剂来检测样品中的多肽。参见，例如，Hawlow和Lane，“抗体：实验室手册”，Cold Spring Harbor Laboratory，1988。通常，患者是否患有肿瘤可如下测定：(a)将取自患者的生物样品与结合剂接触；(b)检测样品中与结合剂结合的多肽的水平；(c)将该多肽水平与预定的取舍值比较。
优选实施方式之一中，所述试验包括用固定于固相支持物上的结合剂结合本发明多肽并去除剩余样品中的多肽。然后用检测剂检测结合的多肽，该检测剂含有特异性结合此结合剂/多肽复合物的报道基团。这样的检测剂可包含，例如，特异性结合本发明多肽的结合剂或抗体，或特异性结合该结合剂的其它物质，例如抗免疫球蛋白，G蛋白，A蛋白或凝集素。或者，可采用竞争试验，其中，用报道基团标记多肽，经结合剂与样品共培养让其与固定化的结合剂结合。样品与固定化结合剂的反应活性可体现样品中成分抑制标记多肽与结合剂结合的程度。适用于此类试验的合适多肽包括全长HER-2/neu肿瘤蛋白及其中可与结合剂结合的部分，HER-2/neu融合蛋白及其中可与结合剂结合的部分。
固相支持物可以是业内已知的各种材料，只要肿瘤蛋白能够附着。例如，固相支持物可以是微滴板的测试孔，或是硝酸纤维素或其它合适材料的膜。或者，所述支持物可以是玻璃、玻璃纤维、乳胶或聚苯乙烯或聚氯乙烯等塑料的微珠或薄片。所述支持物还可以是磁性颗粒或光纤传感器，参见美国专利5,359,681。结合剂可用多种已知技术固定在固相支持物上，专利及科技文献中对此有充分的记述。在本发明中，“固定化”包括吸附等非共价结合和共价结合(可以是结合剂与支持物上官能团直接连接，也可以通过交联剂连接)。优选吸附于微滴板的测试孔或膜上的固定化。此时，吸附可通过在合适缓冲液中使结合剂与固相支持物接触足够的时间来进行。接触时间因温度而异，但一般在1小时至1天之间。通常，一个(聚苯乙烯或聚氯乙烯)微滴板的测试孔与约10ng-10μg结合剂接触，更好的是100ng-1μg，就足以固定足量的结合剂。
结合剂与固相支持物的共价结合一般可先让支持物与双官能试剂反应，该试剂既可与支持物反应，又可与结合剂上的羟基或氨基等官能团反应。例如，可用苯醌将结合剂共价结合在具有相应聚合物包被层的支持物上，或通过支持物上的醛基与结合剂上的氨基或活泼氢之间的缩合(参见，例如，PierceImmunotechnology Catalog and handbook，1991，A12-13)。
某些实施方式中，所述的试验是双抗体夹心试验。该试验先将固定于固相支持物(一般为微滴板的测试孔)上的一种抗体与样品接触，使得其中的多肽与固定化抗体结合。然后去除未结合的样品，留下固定化的多肽-抗体复合物，然后加入含报道基团的检测剂(以能够结合多肽上其它位点的第二抗体为佳)。然后根据具体的报道基团，用合适的方法检测仍固定于固相支持物上的检测剂的量。
更具体地说，在抗体如上所述固定于支持物上后，通常将支持物上的剩余蛋白质结合位点封闭。各种合适的已知封闭剂均可使用，例如牛血清白蛋白或Tween20TM(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。固定化的抗体然后与样品共培养，让多肽与抗体结合。在孵育前，可用合适的稀释剂，例如磷酸盐缓冲液(PBS)稀释样品。通常，适当的接触时间(即孵育时间)应该足以检测到***癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌或***癌患者样品中存在的多肽。较好的是，接触时间应足以使结合水平达到结合与非结合多肽平衡时结合水平的至少95％。本领域技术人员知道，达到平衡所需的时间不难通过测定一段时间内的结合水平来确定。室温下，通常孵育约30分钟为足够。
然后，用合适的缓冲液，例如含0.1％Tween20的PBS洗涤固相支持物，从而洗去未结合的样品。然后在固相支持物上加入含报道基团的第二抗体。优选的报道基团可参见前文。
然后，将检测剂与固定化的抗体-多肽复合物共孵育足够的时间，以检测结合的多肽。合适的时间长短可通过测定一段时间内的结合水平来确定。然后去除未结合的检测剂，并利用报道基团检测结合的检测剂。用来检测报道基团的方法取决于报道基团的性质。对放射性基团来说，一般宜采用闪烁计数或放射自显影。分光法可用于检测染料、发光基团和荧光团。生物素可用与其它报道基团(一般为放射性或荧光基团或酶)偶联的亲和素来检测。酶报道基团一般通过加入底物来检测(一般需经一段特定时间的反应)，然后用分光法或其它方法分析反应产物。
为了测定是否存在***癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌或***癌等癌症，将仍结合于固相支持物上的报道基团发出的信号与相应的预定取舍值比较。优选实施方式之一中，该检测癌症的取舍值是将固定化抗体与非癌症患者的样品共培养所得信号的平均值。通常，如果样品产生的信号高于预定取舍值3个标准差，则认为是癌症阳性。另一优选实施方式中，取舍值用接受者操作者曲线(ReceiverOpertor Curve)，按照Sackett等“临床流行病学：临床医学的基础科学”，LittleBrown and Co.，1985，p.106-7所述的方法测定。简而言之，该实施方式中，将对应于诊断结果各个可能的取舍值的真阳性率(即灵敏度)和假阳性率(100％特异性)绘制成图，从该图测定取舍值。图中最靠近左上角的取舍值(即包围面积最大的值)是最准确的取舍值，如果样品产生的信号高于该取舍值，则可认定为阳性。或者，若要尽可能降低假阳性率，可将取舍值沿曲线向左移动，要尽可能降低假阴性率，则可向右移动。通常，如果样品产生的信号高于如此测得的取舍值，则可认定为癌症阳性。
在一相关的实施方式中，所述试验以流过或剥离方式进行，其中，将结合剂固定在硝基纤维素等膜上。在流过式试验中，当样品流过膜时，样品中的多肽与固定化的结合剂结合。然后，当含有第二结合剂的溶液流过膜时，其中的经标记结合剂与结合剂-多肽复合物结合。然后可如前所述检测结合的第二结合剂。在剥离方式中，将结合有结合剂的膜的一端浸在含样品的溶液中。样品沿膜迁移，通过含第二结合剂的区域，到达固定化结合剂所在区域。根据固定化抗体所在区的第二结合剂浓集确定是否有癌症。通常，所在处第二结合剂的浓集会产生目测不难发现的一定模式，例如一条带。没有这样的模式，即为阴性结果。通常，膜上固定化结合剂量的选择应该是：当生物样品所含多肽的水平足以在双抗体夹心试验中产生阳性信号时，所选的量能够产生上述可目测分辨的模式。此类试验中较好的结合剂是抗体及其抗原结合性片段。较好的是，固定于膜上抗体量在约25ng-1μg，约50ng-500ng为佳。此类试验一般用极少量的生物样品进行。
当然，还有许多其它试验方法适用本发明肿瘤蛋白或本发明的结合剂进行。以上描述只是举例。例如，显而易见的是，上述方法可改用HER-2/neu多肽来检测生物样品中可与之结合的抗体。可将此类HER-2/neu蛋白质特异性抗体的检测与是否有癌症相关联。
也可以根据生物样品中有否能与HER-2/neu融合蛋白特异性T细胞来检测癌症。在某些方法中，将取自患者的含有CD4+和/或CD8+T细胞的生物样品与HER-2/neu融合多肽，编码该融合蛋白的聚核苷酸和/或至少表达该融合多肽的APC共孵育，然后检测T细胞是否被特异性地激活。合适的生物样品包括但不限于分离的T细胞。例如，可用常规技术(例如Ficoll/Hypaque密度梯度离心外周血淋巴细胞)分离出患者的T细胞。可将T细胞与HER-2/neu融合多肽(例如5-25μg/ml)37℃体外孵育2-9天(一般为4天)。也许需要将另一份T细胞样品在无HER-2/neu融合多肽的条件下孵育，作为对照。对CD4+细胞而言，宜通过评价T细胞的增殖来检测活化现象。对CD8+细胞而言，宜通过评价溶胞活性来检测活化现象。如果与无疾病患者相比，增殖水平高至少2被，和/或溶胞活性高至少20％，则指示患者患有癌症。
如上所述，还可以根据生物样品中编码HER-2/neu蛋白质的mRNA水平检测癌症。例如，在聚合酶链反应(PCR)试验中，用至少2个寡核苷酸引物扩增自生物样品得到的HER-2/neu cDNA的一部分，其中，至少寡核苷酸引物之一对编码HER-2/neu蛋白质的聚核苷酸具有特异性(即可与之杂交)。然后，分离出扩增所得cDNA，并用已知方法(例如凝胶电泳)检测。与此类似，可在杂交试验中使用与编码HER-2/neu蛋白或融合蛋白的聚核苷酸特异性杂交的寡核苷酸探针，检测生物样品中有否编码HER-2/neu蛋白的聚核苷酸。
为了能在试验条件下杂交，寡核苷酸引物和探针应含有一段至少60％，75％，更好的是90％与编码HER-2/neu蛋白或融合蛋白的聚核苷酸的一部分相同的寡核苷酸序列，并且，长至少10个核苷酸，至少20个核苷酸更好。较好的是，寡核苷酸引物和/或探针在前述中等严谨条件下与编码HER-2/neu蛋白或融合蛋白的聚核苷酸杂交。适用于本发明诊断方法的寡核苷酸引物和/或探针以长10-40个核苷酸为佳。优选实施方式之一中的寡核苷酸长至少10个毗连核苷酸，至少15个毗连核苷酸更好，具有SEQ ID NO：6或7序列的DNA分子。PCR和杂交试验技术都是业内已知的(参见，Mullis等(1987)冷泉港定量生物学学会，51：263；Erlich编辑，PCR技术，Stockton Press，NY，1989)。
优选试验之一使用RT-PCR，即与逆转录相结合的PCR。通常，从生物样品，例如活检组织中抽提RNA，然后逆转录成cDNA分子。使用至少一种特异性引物的PCR扩增产生一种cDNA分子，并通过例如凝胶电泳使之分离和展现。可以对待测患者或非癌症个体的生物样品进行扩增。可对跨越2个数量级的数个稀释度的cDNA进行扩增反应。如果待测患者样品的几个稀释度的扩增都比同一稀释度的非癌症样品高2倍以上，则认定为阳性。
另一实施方式中，HER-2/neu蛋白或融合蛋白及其编码聚核苷酸被用作标记，以监测癌症的发展。这种实施方式中，可在一段时间内多次进行上述癌症诊断，然后评价反应性多肽水平的变化。例如，可以在6个月至1年的时间内，每隔24-72小时进行一次试验，然后根据需要进行试验。通常，如果用结合剂测得，患者体内的多肽水平随时间升高，说明该患者体内的癌症在发展。相反，如果反应性多肽的水平维持恒定或随时间下降，则表示癌症没有发展。
癌症的体内诊断试验可直接对肿瘤进行。此类试验包括将肿瘤细胞与结合剂接触，然后直接检测被结合的结合剂，或通过报道基团进行检测。此类结合剂还可用于组织学方法。或者，可将聚核苷酸探针用于此类方法。
如上所述，要提高灵敏度，可对给定样品中的多种HER-2/neu融合蛋白标记进行分析。显然，可将本发明所述的不同蛋白质的特异性结合剂联合用于同一试验。而且，可同时使用多种引物或探针。可根据常规实验选择肿瘤蛋白标记，以确定最佳灵敏度的引物或探针的组合。此外，针对本发明肿瘤蛋白的试验还可以与用于其它已知肿瘤抗原的试验联用。
B.诊断试剂盒
本发明还提供了一种用于上述诊断方法的试剂盒。这样的试剂盒一般包括进行诊断试验所必需的两个或更多个组件。所述组件可以是化合物、反应试剂、容器和/或仪器。例如，试剂盒中的一个容器内含有特异性结合HER-2/neu融合蛋白的单克隆抗体或其片段。所述的抗体或其片段可以已经(如前所述)结合于支持物上。另外的一个或多个容器可含有试验需用的试剂或缓冲液等。或者，这样的试剂盒还含有如前所述的检测剂，该检测剂具有适合直接或间接检测抗体结合现象的报道基团。
或者，可将试剂盒设计成可检测生物样品中编码HER-2/neu蛋白质的mRNA水平。这样的试剂盒一般包括至少一种前述核苷酸探针或引物，它们可与编码HER-2/neu蛋白或融合蛋白的聚核苷酸杂交。例如，可将这样的寡核苷酸用于PCR或杂交试验。此类试剂盒中的其它组件可以包括协助检测编码HER-2/neu蛋白的聚核苷酸的第二种寡核苷酸和/或诊断试剂或容器。
本发明分别并全面地参考了本说明书中提及的各篇出版物和专利。
虽然，为了清楚的理解本发明，通过说明和实施例对本发明进行了较为详细的描述，但本领域技术人员不难看出，根据本文所述，在后文权利要求书的精神和范围中，可以进行某些修改。
实施例
以下实施例以说明为目的，并非限定，本发明的范围仅由后文权利要求书限定。
在实施例中，普通分子生物学试剂，例如寡核苷酸引物、Lipofectamine和限制性核酸内切酶，主要购自Gibco/BRL(Grand Island，NY)。限制性核酸内切酶AatII和PflM-1购自New England Biolabs(Beverly，MA)。HER-2/neu ELISA试验试剂盒和HER-2/neu特异性单克隆抗体Ab-3购自Oncogene Science(Manhasset，NY)。pFLAGCMV-1表达载体和FLAG-Tag M2抗体购自Kodak(Rochester，NY)。Pfu聚合酶购自Strategene(La Jolla，CA)。pcDNA3.1/hyg表达载体购自Invitrogen(Carlsbad，CA)。
实施例1
HER-2/neu ICD、KD和PD片段进入pFLAGCMV-1表达载体的克隆
用聚合酶链反应分别制备编码胞内域(ICD)、激酶区(KD)和磷酸化区(PD)的HER-2/neu DNA片段。分别在它们的5＇和3＇末端引入限制性消化位点HindIII和XhoI。这样的设计可将这些DNA片段克隆入pFLAGCMV-1表达载体(Kodak)，并与它们N末端的前胰蛋白酶原前导序列和FLAG-尾同框。凝胶纯化PCR产物，将其克隆到pFLAGCMV-1的HindIII和XhoI位点。所得的表达质粒称为pFLAGCMV-1/ICD(图1)，pFLAGCMV-1/KD(图2)和pFLAGCMV-1/PD(图3)。
实施例2
ECD-PD融合蛋白进入pcDNA3.1/hyg表达载体的克隆
用聚合酶链反应扩增编码HER-2/neu PD的DNA片段。凝胶纯化后，将其克隆到pT7-HER-2/neu质粒中的AatII和XhoI位点。由此得到一个新的克隆载体，pT7/ECD-PD，它将ECD与PD连接在一起(包括跨膜域的一个Ser)。pT7/ECD-PD质粒用HindIII和XhoI在37℃消化1小时。凝胶纯化编码ECD-PD融合蛋白的2.7kb DNA片段，并亚克隆到pcDNA3.1/hyg(Invitrogen)的HindIII和XhoI位点。所得的表达载体称为pcDNA3.1/hyg/ECD-PD(图5)。
实施例3
HER2/neu ICD、KD和PD片段在HEK-293细胞内的表达
用pFLAGCMV-1表达载体(Kodak)确定HER-2/neu胞内域中哪一段可分泌到培养液中。所表达的蛋白是N末端带有前胰蛋白酶原分泌信号和FLAG-尾的融合蛋白，参见实施例1。
如下转染并培养表达ICD、KD和PD的细胞系：将人胎肾成纤维细胞(HEK-293)培养在Dulbecco改良的Eagle＇s培养液中，其中含10％胎牛血清。转染前1天，在6孔板的每孔中接种1.5×105个细胞。在无血清培养基中，用1μg质粒DNA，通过lipofectamine(Gibeo/BRL)法进行转染。72小时后收获培养液和细胞。为了选出稳定的转化子，将转染细胞培养在含200μg/ml潮霉素的培养基中。
如下所述，通过Western印迹法检测细胞和培养基中有否FLAG-尾融合蛋白：在7.5％SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离转染HEK-293细胞的培养液和细胞裂解物。将蛋白质电泳转移到聚二氟乙烯(PVDF)滤膜上。该PVDF膜先在5％牛血清白蛋白的TBST(20mM Tris，pH7.5，150mM NaCl，0.01％Tween 20)溶液中孵育1小时，然后与第一抗体一起孵育1小时，最后与过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠抗体孵育1小时。免疫斑点用ECL***(AmershamCorp.)显影。用小鼠单克隆抗体c-neuAb-3(“Ab-3”)(Oncogene Science)检测HER-2/neu蛋白。Ab-3识别人HER-2/neu蛋白的羧基末端。为了检测FLAG-尾融合蛋白，用M2单克隆抗体(Kodak)作为第一抗体进行分析。
图4所示的结果显示，全长的ICD和KD都不分泌，但PD被分泌到培养液中。该结果表明，KD的结构使得蛋白质无法通过细胞膜。
实施例4
用pcDNA3.1/hyg表达载体在HEK-293和CHO细胞中
表达ECD-PD融合蛋白
如实施例2所述构建N末端带有前胰蛋白酶原分泌信号和FLAG-尾的ECD-PD融合蛋白。
如下转染和培养表达ECD-PD的细胞系：将HEK-293细胞和中国仓鼠卵巢细胞(CHO)培养在Dulbecco改良的Eagle＇s培养液中，其中含10％胎牛血清。转染前1天，在6孔板的每孔中接种1.5×105个细胞。在无血清培养基中，用1μg质粒DNA，通过lipofectamine(Gibco/BRL)法进行转染。72小时后收获培养液和细胞。为了选出稳定的转化子，将转染细胞培养在含200μg/ml潮霉素的培养基中。
如下所述，用HER-2/neu ECD特异性抗体，通过ELISA试验检测可溶性ECD-PD融合蛋白的分泌：先用能捕获样品中的HER-2/neu蛋白的HER-2/neu特异性小鼠抗体(Oncogene Science)覆盖微滴板。待测样品与检测抗体在微滴板中室温孵育1小时，然后再与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠抗体孵育1小时。加入过氧化物酶的底物邻苯二胺后，可形成有颜色的产物。通过比色法定量检测有色产物。以490nm处的吸光度代表样品中neu蛋白的量。
然后，如下所述，用HER-2/neu PD特异性抗体，通过Western印迹法测定可溶性ECD-PD融合蛋白的分泌：在7.5％SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离转染的HEK-293细胞的培养液和细胞裂解物。将蛋白质电泳转移到聚二氟乙烯(PVDF)滤膜上。该PVDF膜先在5％牛血清白蛋白的TBST(20mM Tris，pH7.5，150mMNaCl，0.01％Tween 20)溶液中孵育1小时，然后与第一抗体一起孵育1小时，最后与过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠抗体孵育1小时。免疫斑点用ECL***(Amersham Corp.)显影。用小鼠Ab-3单克隆抗体(Oncogene Science)检测HER-2/neu蛋白。Ab-3识别人HER-2/neu蛋白的羧基末端。为了检测FLAG-尾融合蛋白，用M2单克隆抗体(Kodak)作为第一抗体进行分析。结果见图6。
实施例5
用以下引物，通过聚合酶链反应(PCR)制备图13(SEQ ID NO：17)所示的人ECD-ΔPD融合蛋白：PDM-251：5＇-cctgaatcgcgaacccaagtgtgcaccggcac-3＇(SEQ ID NO：15)，Tm69℃PDM-2795＇-ctggactcgagtcattagcggtgcctgtggtgg-3＇(SEQ ID NO：16)，Tm69℃
聚合酶链反应条件如下：10μl 10×Pfu缓冲液(Stratagen)，1μl 10Mm dNTPs，10μM寡核苷酸各2μl，83μl无菌水，1.5μl Pfu DNA聚合酶，和50ng模板，96℃，2分钟，1轮；(96℃20秒，69℃15秒，72℃5分钟)×40轮；72℃5分钟，1轮。PCR产物用NruI和XhoI消化，克隆到pPDM His载体中(改造的pET28载体，具有与钝端限制性酶切点Eco72I同框的His尾，用Eco72I和XhoI剪切。验证序列，然后将该重组质粒转化到用于大肠杆菌表达的BL21 pLys s中。然后用BamHI和XhoI消化该质粒构建物，克隆到pcDNA3.1/hyg/ECD-PD中，并用同样的限制性酶剪切。
实施例6
人ECD-PD-CT-His尾融合蛋白在大肠杆菌内的表达
如实施例2所述，将人ECD-PD融合蛋白克隆到pcDNA3.1/hyg载体中，以此作为模板构建与C末端6His尾同框的hECD-PD。用以下引物通过PCR扩增hECD-PD：
AWO28 hECD-PD有义引物，带有NcoI位点：
5＇-GGGccatggggAGCACCCAAGTGTGCACCGGC-3＇(SEQ ID NO：17)
AWO29 hECD-PD反义引物，带有XhoI位点，无中止子：
5＇-GGGctcgagCACTGGCACGTCCAGACCCAGG-3＇(SEQ ID NO：18)
用NcoI和XhoI限制酶剪切PCR产物，纯化，连接到已用上述两种酶线性化的pET28B表达载体中。用连接产物转化NovaBlue细胞，挑选几个集落进行筛选。其中，通过DNA测序检验出hECD-PD.CTHis克隆，用于此后的蛋白质表达。
为了表达蛋白质，将hECD-PD.CTHis克隆转化到BL21(DE3)CodonPlus-RIU大肠杆菌感受态细胞中。用转化形成的克隆进行一次标准的小量表达筛选，以测定诱导得率。将细胞培养在TB培养基中37℃培养2小时，可获得最佳结果。
然后用monoQ柱纯化大肠杆菌生成的hECD-PD.CTHis，在20mMTris-HCl(pH8.0)缓冲液中恢复折叠。通过Western印迹法和ELISA检验折叠后蛋白质，发现为Herceptin结合阳性(图17)。然而，Herceptin结合活性随后会丧失，这可能是因为蛋白质发生了变性。
实施例7
人NT-His尾-ECD-PD融金蛋白在大肠杆菌内的表达
将人ECD-PD融合蛋白克隆在5＇有NdeI位点，3＇端有XhoI位点的pPDM表达载体中。ECD-PD***片段与N末端的6His尾同框融合。
为了表达蛋白质，将含有NT-his-ECD-PD融合蛋白的pPDM载体转化到BL21(DE3)CodonPlus-RIU大肠杆菌感受态细胞中。用转化形成的克隆进行一次标准的小量表达筛选，以测定诱导得率。将细胞培养在TB培养基中37℃培养2小时，可获得最佳结果。
大肠杆菌产生的未纯化NT-his-ECD-PD融合蛋白可被小鼠c-neu-3抗体和兔-抗ECD抗体识别。纯化后，在Western印迹和ELISA中，大肠杆菌产生的NT-his-ECD-PD都可被Herceptin识别(图17)。
实施例8
小鼠ECD-PD-CT-His尾融合蛋白在大肠杆菌内的表达
参照实施例2中人ECD-PD融合蛋白的克隆，将小鼠ECD-PD融合蛋白克隆在poDNA3.1载体中。然后以该构建物为模板构建与C末端6His尾同框的mECD-PD，6His尾后为中止密码子。用以下引物对mECD-PD/pcDNA3.1构建物内部的NcoI位点(ORF第1932位碱基对)进行定点沉默诱变：
AWO038引物：
5＇-GGCCCCTCCAGCCCGATGGACAGCACCTTCTACCG-3＇(SEQ ID NO：19)
AWO039引物：
5＇-CGGTAGAAGGTGCTGTCCATCGGGCTGGAGGGGCC-3＇(SEQ IDNO：20)
检验序列后，用以下引物PCR扩增mECD-PD融合构建物：
AWO036引物，含NcoI限制酶位点：
5＇-GGGccatggGTACCCAAGTGTGTACCGG-3＇(SEQ ID NO：21)
AWO037引物，含XhoI限制酶位点：
5＇-GGGctcgagTCAATGGTGATGGTGATGGTGTCATGG
CACATCCAGGCCTAGGTACTCAGGG-3＇(SEQ ID NO：22)
然后，用NcoI和XhoI限制酶剪切PCR产物，纯化，连接到已用上述两种限制酶线性化的pET28b表达载体中。将连接产物转化到NovaBlue中，产生多个克隆，挑选4个克隆进行测序。其中，选出序列正确的mECD-PD.CT his克隆，将其转化到BL21(DE3)CodonPlus-RIU大肠杆菌感受态细胞中。用转化形成的克隆进行一次标准的小量表达筛选，以测定诱导得率。将细胞培养在2xYT培养基中30℃培养3小时，可获得最佳结果。
实施例9
Ra12-mECD-PD-CT-His尾融合蛋白在大肠杆菌内的表达
如实施例8所述，将小鼠ECD-PD融合蛋白克隆到pET28b表达载体中。用5＇端和3＇端加有NcoI位点的以下PCR片段扩增Ra12序列：
Ra12.JC05：5＇-CCGccatggGCACGGCCGCGTCCGATAACTTCC-3＇(SEQ IDNO：23)
Ra12.JC06：5＇-GCGccatggCGGCCGGGGGTCCCTCGGCC-3＇(SEQ ID NO：24)
为了获得与mECD-PD融合的Ra12佐剂，用NcoI限制酶消化Ra12的PCR产物，连接到经NcoI消化和CIAP处理的pET28b-mECD-PD载体中。将连接产物转化到NovaBlue细胞中，得到多个克隆。由于是非方向特异性连接，挑选双倍克隆进行质粒的小量制备。通过AfiIII限制酶消化来筛选***方向正确的克隆。对少量方向正确的克隆进行分析。将序列正确的克隆转化到BL21(DE3)CodonPlus-RIU大肠杆菌感受态细胞中。用转化形成的克隆进行一次标准的小量表达筛选，以测定诱导得率。将细胞培养在LB培养基中37℃培养3小时，可获得最佳结果。
实施例10
LeIF.mECD-PD-CT-His尾融合蛋白在大肠杆菌内的表达
如实施例8所述，将小鼠ECD-PD融合蛋白克隆到pET28b表达载体中。用5＇端和3＇端加有NcoI位点的以下PCR片段扩增LeIF序列：
LeIF.JC03：5＇-CGCccatggCGCAGAATGATAAGATCGCCC-3＇(SEQ IDNO：25)
LeIF.JC04：5＇-GCCccatggCGTCGCGCATGAACTTCTTCGTC-3＇(SEQ IDNO：26)
为了获得与mECD-PD融合的LeIF佐剂，用NcoI限制酶消化LeIF PCR产物，将其连接到经NcoI消化和CIAP处理的pET28b-mECD-PD载体中。将连接产物转化到NovaBlue细胞中，得到多个克隆。由于是非方向特异性连接，挑选双倍克隆进行质粒的小量制备。通过KpnI限制酶消化来筛选***方向正确的克隆。对少量方向正确的克隆进行分析。将序列正确的克隆转化到BL21(DE3)CodonPlus-RIU大肠杆菌感受态细胞中。用转化形成的克隆进行一次标准的小量表达筛选，以测定诱导得率。将细胞培养在2xYT培养基中30℃培养3小时，可获得最佳结果。
实施例11
ECD-PD融合蛋白在毕赤氏酵母细胞内的表达
设计用于在毕赤氏酵母细胞内表达的ECD-PD重组蛋白与用于CHO表达的相同，但有两处改动：(i)HER-2/neu基因的天然分泌信号序列被酿酒酵母的αpre-pro信号序列取代；(ii)在重组蛋白的C末端增加一个甘氨酸和6个组氨酸。
用Spheroplast法，将ECD-PD融合蛋白表达盒整合到SMD1168毕赤氏酵母细胞株中。通过定量斑点印迹分析，从250个克隆中挑选出6个多拷贝整合克隆。选出的克隆在缓冲甲醇—复合培养基(BMMY-1％甲醇)中振荡诱导72小时。6个候选克隆在无细胞上清液和全细胞提取物中的表达情况相同。
在无细胞上清液中，全长ECD-PD重组蛋白的分泌很弱，只能在Western印迹中用c-neu-3小鼠抗体(Calbiochem)检测到。在银染色SDS-PAGE上可看到一种+70kDa蛋白质的分泌和累积(72小时后达到最大)，这也可以用Herceptin小鼠抗体在非还原条件下进行Western印迹检测到。该蛋白质无法用小鼠c-neu-3抗体或小鼠抗组氨酸抗体(QIAGEN)检测。
在细胞总抽提物中，用DAIICHI染色试剂盒进行的银染色SDS-PAGE上，没有发现特定条带。在用小鼠c-neu-3抗体或小鼠抗组氨酸抗体进行的Western印迹上检测到2条带。其中一条的分子量与CHO细胞表达并分泌的ECD-PD产物相同。另一条看似“污点”，约100-120kDa。这两个信号反映保留在E.R.内的重组蛋白，表明有多种不同的糖基化形式。
实施例12
ECD-PD和ECD-ΔPD融合蛋白在CHOK1细胞内的表达
用XbaI限制酶消化pcDNA3.1/hyg/ECD-PD和pcDNA3.1/hyg/ECD-ΔPD质粒，凝胶纯化含ECD-PD和ECD-ΔPD的DNA片段，分别得到2783bp和2166bp的XbaI片段。将片段各自转染到已用XbaI(CMV立即早期启动子下游的克隆位点)线性化的pEE14-GS载体(CellTech)。连接后，将其转化到DH5α感受态大肠杆菌细胞中。用限制酶消化分析了16个集落，其中2个为ECD-PD阳性，1个为ECD-ΔPD阳性。大规模制备所得的质粒，用双CsCl-EtBr梯度离心纯化。对质粒进行限制酶消化分析，以及***片段和载体间5＇和3＇端连接序列的测序，没有发现异常。
通过经典DNA磷酸钙共沉淀技术，用pEE14-ECD-PD和pEE14-ECD-ΔPD质粒转染来自Master Cell Bank MCB CHO-K1 028W 1996/2 SHF P31的CHO-K1细胞，悬浮培养于无血清条件下。计数转染后48小时的细胞数，转移到96孔板上，每孔5000个细胞。按照Grockett等(1990)生物技术8：662所述的谷氨酰胺合成酶(GS)表达***方法挑选转染细胞，在30μM甲硫氨酸亚硫酰亚胺(methionine sulphoximine)(MSX)存在下，在无谷氨酰胺而加有添加剂(甘氨酸/天冬酰胺/核苷酸)和5％经透析胎牛血清(FBS)的GMEM培养基中扩增。转染后的第一周，细胞洗涤3次，第二周洗涤2次。第三次洗涤时，加入20％条件培养基。为了提高选择水平，经5次洗涤后，将MSX浓缩提高到50μM。
转染3-5周后，将MSX转染子克隆转移到24孔板上，收获培养物上清液。通过Hercptin抗体非还原条件下的Westone印迹分析检测ECD-PD或ECD-ΔPD融合蛋白的表达。被测52个克隆中的18个可检测到ECD-PD融合蛋白表达，被测47个克隆中的13个为ECD-ΔPD表达阳性。挑选出表达融合蛋白的细胞，重新进行无血清悬浮培养。根据表达水平、生长情况和细胞活力，进一步对5个带有ECD-PD构建物的克隆和3个带有ECD-ΔPD构建物的克隆进行了评价和鉴定。就ECD-PD而言，克隆560F3的表达水平最高。
在33℃，丁酸钠(2mM)和DMSO(2％)存在和不存在的条件下，评价表达水平。部分克隆可用NaB或DMSO诱导。ECD-PD和ECD-ΔPD在CHO-K1细胞内的表达分析为：进行Western印迹和银染色或考马斯染色的SDS-PAGE。Western印迹分析使用Herceptin和c-neu-3小鼠单克隆抗体，以及8029K兔多克隆抗体。对ECD-PD和ECD-ΔPD克隆培养上清液的分析在银染色或考马斯染色凝胶上显示各自150kDa和98kDa的条带。用Hercptin和8029K多克隆抗血清以及只具有ECD-PD特异性的c-neu-3抗体也发现同样的条带(图18)。CHO表达的HER-2/neu融合蛋白可被Herceptin抗体识别(图18)。
还就不同细胞的传代稳定性对融合蛋白的表达水平进行了跟踪。对5个ECD-PD克隆和2个ECD-ΔPD克隆进行了传代跟踪，用Western印迹分析表达稳定性。被测的7个克隆中，4个在传代32次后仍然稳定，但其中之一的死亡率很高，另一个则产生大细胞。
用最佳的2个ECD-PD和ECD-ΔPD克隆进行小规模生产。将细胞于33℃悬浮培养于存在2mM丁酸钠的无血清条件下，120小时。用Herceptin抗体进行Western印迹和用Daiichi试剂盒进行银染色的SDS-PAGE，如此评价两种融合蛋白的表达。结果发现，两种融合蛋白的表达都在+/-100μg/ml水平。
实施例13
CHO细胞表达的ECD-PD和ECD-ΔPD融合蛋白的纯化
经CHO细胞表达并分泌后，通过Q琼脂糖高效柱上的阴离子交换层析纯化ECD-PD和ECD-ΔPD融合蛋白。上清液上柱前，用1N HCl将pH调至6.5。用1ml的Q琼脂糖高效树脂(Pharmacia)充填C10/10柱(Pharmacia)，用于层析。
层析柱先平衡：10倍柱体积的H2O，流速4ml/min，然后是1倍柱体积的0.5MNaCl，流速4ml/min，和10倍柱体积的缓冲液A(20mM Bis-Tris丙烷pH6.5-50mMNaCl)，流速4ml/min。然后上样，以1ml/min流速通过。然后用缓冲液A以1ml/min流速洗柱，直至280nm的OD降至0.1，接着进行20倍柱体积的洗涤。洗脱前，逆向流动，并进行一步3倍柱体积的洗涤。
用1ml/min的流速洗脱，先用缓冲液B(20mM Bis-Tris丙烷pH6.5-250mMNaCl)，然后用缓冲液C(20mM Bis-Tris丙烷pH6.5-1mM NaCl)。有意义的融合蛋白由缓冲液B洗出。
接着，通过苯基琼脂糖6快速低取代疏水层析进一步纯化融合蛋白。在含有ECD-PD和ECD-ΔPD融合蛋白的洗脱液(缓冲液B洗脱液)中加入固体硫酸铵(AMS)(140g/L溶液)，使得AMS浓度为1M。将该溶液的pH校正至7.0。
层析用0.5ml苯基琼脂糖6快速低取代(Pharmacia)和C10/10柱(Pharmacia)进行。然后，进行柱平衡：10倍柱体积的H2O，流速4ml/min，1倍柱体积的0.5MNaOH，流速4ml/min，和10倍柱体积的缓冲液D(1mM PO4 pH7.0-1mM AMS)，流速4ml/min。然后上样，以0.5ml/min流速通过。然后用缓冲液D以1ml/min流速洗柱，直至280nm的OD降至基线，接着进行10倍柱体积1ml/min流速的洗涤。洗脱前，逆向流动，并进行一步3倍柱体积的洗涤。用缓冲液E(1mM PO4pH7.0)洗脱，1ml/min。
进行SDS-PAGE，然后用Daiichi试剂盒银染色，并用8029K兔多克隆抗体或小鼠Herceptin抗体进行Western印迹，如此分析经纯化的融合蛋白。分析显示，根据光密度(Bioard GS-700造影光密度计)，两步纯化后的纯度水平约+/-90％。Western印迹分析显示，纯化过程中，单体始终是主带，氧化水平没有升高，而且，根据Herceptin抗体分析显示，纯化条件没有改变有义表位的检测结果。用蛋白质比色试验(DOC TCA BCA)测定回收所得各融合蛋白的总量。该试验估计，从75ml培养物可分别纯化得到2mg ECD-PD融合蛋白和4mg ECD-ΔPD融合蛋白，纯度为+/-90％。

Claims (92)

1.一种分离的蛋白质，其中，HER-2/neu胞外域与HER-2/neu磷酸化区融合，该蛋白质能够在温血动物中引起免疫应答。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，该蛋白质的序列至少80％与SEQ IDNO：6相同，或者，该蛋白质中一段至少80％与SEQ ID NO：3相同的序列与一段至少80％与SEQ ID NO：4相同的序列融合。
3.根据权利要求1所述的蛋白质，其中，一段至少80％与SEQ ID NO：3相同的序列与一段至少80％与SEQ ID NO：2中Gln991-Val1256相同的氨基酸序列直接融合，或者，其中，一段至少80％与SEQ ID NO：3相同的序列与一段至少80％与SEQ ID NO：2中Gln991-Val1256相同的氨基酸序列融合。
4.根据权利要求1所述的蛋白质，其中，一段至少80％与SEQ ID NO：8相同的序列与一段至少80％与SEQ ID NO：4相同的序列直接融合，或者，其中，一段至少80％与SEQ ID NO：8相同的序列与一段至少80％与SEQ ID NO：4相同的序列融合。
5.根据权利要求1所述的蛋白质，其中，一段至少80％与SEQ ID NO：8相同的序列与一段至少80％与SEQ ID NO：2中Gln991-Val1256相同的氨基酸序列直接融合，或者，其中，一段至少80％与SEQ ID NO：8相同的序列与一段至少80％与SEQ ID NO：2中Gln991-Val1256相同的氨基酸序列融合。
6.根据权利要求1所述的蛋白质，其中HER-2/neu的胞外域与HER-2/neu磷酸化区通过化学接头融合。
7.根据权利要求6所述的蛋白质，其中的化学接头是氨基酸接头。
8.一种编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。
9.一种病毒载体，含有编码权利要求1所述蛋白质的聚核苷酸序列。
10.一种药物组合物，包含权利要求1所述蛋白质和药学上认可的载体或稀释剂。
11.根据权利要求10所述的药物组合物，该组合物是疫苗。
12.根据权利要求10所述的药物组合物，还包含免疫刺激物。
13.根据权利要求12所述的药物组合物，其中的蛋白质包含在水包油乳液中。
14.根据权利要求12所述的药物组合物，其中所含免疫刺激物是SBAS2，3D-MPL，QS21，或3D-MPL与QS21相组合。
15.一种药物组合物，包含权利要求8所述的核酸分子，和药学上认可的载体或稀释剂。
16.根据权利要求15所述的药物组合物，该组合物是疫苗。
17.根据权利要求15所述的药物组合物，还包含免疫刺激物。
18.根据权利要求15所述的药物组合物，所述的核酸分子是DNA分子。
19.一种激发或增强对HER-2/neu蛋白质免疫应答的方法，包括：给予温血动物激发或增强免疫应答有效量的权利要求1所述蛋白质。
20.根据权利要求19所述的方法，所述蛋白质以疫苗的形式给药。
21.一种激发或增强对HER-2/neu蛋白质免疫应答的方法，包括：给予温血动物激发或增强免疫应答有效量的权利要求8所述核酸分子。
22.根据权利要求21所述的方法，所述核酸分子以疫苗的形式给药。
23.根据权利要求21所述的方法，所述给予步骤包括先用所述核酸分子体外转染温血动物的细胞，然后将转染细胞回输给温血动物。
24.一种激发或增强对HER-2/neu蛋白质免疫应答的方法，包括：予温血动物激发或增强免疫应答有效量的权利要求9所述病毒载体。
25.根据权利要求24所述的方法，其中的给予步骤包括：用所述病毒载体体外转染温血动物的细胞，然后将转染细胞回输给温血动物。
26.一种分离的蛋白质，其中HER-2/neu的胞外域与HER-2/neu磷酸化区的片段融合，该蛋白质能够在温血动物中引起免疫应答。
27.根据权利要求26所述的蛋白质，该蛋白质含有一段至少80％与SEQ IDNO：7相同的序列，或者该蛋白质中一段至少80％与SEQ ID NO：3相同的序列与一段至少80％与SEQ ID NO：5相同的序列融合。
28.根据权利要求26所述的蛋白质，其中一段至少80％与SEQ ID NO：3相同的序列与一段至少80％与SEQ ID NO：2中Gln991-Arg1049相同的序列直接融合，或者，其中一段至少80％与SEQ ID NO：3相同的序列与一段至少80％与SEQID NO：2中Gln991-Arg1049相同的序列融合。
29.根据权利要求26所述的蛋白质，其中一段至少80％与SEQ ID NO：8相同的序列与一段至少80％与SEQ ID NO：5相同的序列直接融合，或者，其中一段至少80％与SEQ ID NO：8相同的序列与一段至少80％与SEQ ID NO：5相同的序列融合。
30.根据权利要求26所述的蛋白质，其中一段至少80％与SEQ ID NO：8相同的序列与一段至少80％与SEQ ID NO：2中Gln991-Arg1049相同的序列直接融合，或者，其中一段至少80％与SEQ ID NO：8相同的序列与一段至少80％与SEQID NO：2中Gln991-Arg1049相同的序列融合。
31.根据权利要求26所述的蛋白质，其中HER-2/neu的胞外域与HER-2/neu磷酸化区通过化学接头融合。
32.根据权利要求31所述的蛋白质，其中的化学接头是氨基酸接头。
33.一种编码权利要求26所述蛋白质的核酸分子。
34.一种病毒载体，含有编码权利要求26所述蛋白质的聚核苷酸序列。
35.一种药物组合物，包含权利要求26所述蛋白质和药学上认可的载体或稀释剂。
36.根据权利要求35所述的药物组合物，该组合物是疫苗。
37.根据权利要求35所述的药物组合物，还包含免疫刺激物。
38.根据权利要求37所述的药物组合物，其中的蛋白质包含在水包油乳液中。
39.根据权利要求37所述的药物组合物，其中所含免疫刺激物是SBAS2，3D-MPL，QS21，或3D-MPL与QS21相组合物。
40.一种药物组合物，包含权利要求8所述的核酸分子，和药学上认可的载体或稀释剂。
41.根据权利要求40所述的药物组合物，该组合物是疫苗。
42.根据权利要求40所述的药物组合物，还包含免疫刺激物。
43.根据权利要求40所述的药物组合物，所述的核酸分子是DNA分子。
44.一种激发或增强对HER-2/neu蛋白质免疫应答的方法，包括：给予温血动物激发或增强免疫应答有效量的权利要求26所述蛋白质。
45.根据权利要求44所述的方法，所述蛋白质以疫苗的形式给药。
46.一种激发或增强对HER-2/neu蛋白质免疫应答的方法，包括：给予温血动物激发或增强免疫应答有效量的权利要求33所述核酸分子。
47.根据权利要求46所述的方法，所述核酸分子以疫苗的形式给药。
48.根据权利要求46所述的方法，所述的给予步骤包括先用所述核酸分子体外转染温血动物的细胞，然后将转染细胞回输给温血动物。
49.一种激发或增强对HER-2/neu蛋白质免疫应答的方法，包括：予温血动物激发或增强免疫应答有效量的权利要求34所述病毒载体。
50.根据权利要求49所述的方法，其中的给予步骤包括：用所述病毒载体体外转染温血动物的细胞，然后将转染细胞回输给温血动物。
51.一种分离的蛋白质，其中，HER-2/neu胞外域与HER-2/neu胞内域融合，该蛋白质能够在温血动物中引起免疫应答。
52.根据权利要求51所述的蛋白质，该蛋白质中，一段至少80％与SEQ IDNO：3的序列与一段至少80％与SEQ ID NO：1中Lys676-Val1255相同的序列直接融合，或者，其中，一段至少80％与SEQ ID NO：3的序列与一段至少80％与SEQ ID NO：1中Lys676-Val1255相同的序列通过至少一个化学或氨基酸接头融合。
53.根据权利要求51所述的蛋白质，该蛋白质中，一段至少80％与SEQ IDNO：3的序列与一段至少80％与SEQ ID NO：2中Lys677-Val1256相同的序列直接融合，或者，其中，一段至少80％与SEQ ID NO：3的序列与一段至少80％与SEQ ID NO：2中Lys677-Val1256相同的序列通过至少一个化学或氨基酸接头融合。
54.根据权利要求51所述的蛋白质，其中，一段至少80％与SEQ ID NO：8相同的序列与一段至少80％与SEQ ID NO：1中Lys676-Val1255相同的序列直接融合，或者，其中，一段至少80％与SEQ ID NO：8相同的序列与一段至少80％与SEQ ID NO：1中Lys676-Val1255相同的序列通过至少一个化学或氨基酸接头融合。
55.根据权利要求51所述的蛋白质，其中，一段至少80％与SEQ ID NO：8相同的序列与一段至少80％与SEQ ID NO：2中Lys677-Val1256相同的序列直接融合，或者，其中，一段至少80％与SEQ ID NO：8相同的序列与一段至少80％与SEQ ID NO：2中Lys677-Val1256相同的序列通过至少一个化学或氨基酸接头融合。
56.根据权利要求51所述的蛋白质，其中HER-2/neu的胞外域与HER-2/neu胞内域通过化学接头融合。
57.根据权利要求56所述的蛋白质，其中的化学接头是氨基酸接头。
58.一种编码权利要求51所述蛋白质的核酸分子。
59.一种病毒载体，含有编码权利要求51所述蛋白质的聚核苷酸序列。
60.一种药物组合物，包含权利要求51所述蛋白质和药学上认可的载体或稀释剂。
61.根据权利要求60所述的药物组合物，该组合物是疫苗。
62.根据权利要求60所述的药物组合物，还包含免疫刺激物。
63.根据权利要求62所述的药物组合物，其中的蛋白质包含在水包油乳液中。
64.根据权利要求62所述的药物组合物，其中所含免疫刺激物是SBAS2，3D-MPL，QS21，或3D-MPL与QS21相组合。
65.一种药物组合物，包含权利要求58所述的核酸分子，和药学上认可的载体或稀释剂。
66.根据权利要求65所述的药物组合物，该组合物是疫苗。
67.根据权利要求65所述的药物组合物，还包含免疫刺激物。
68.根据权利要求65所述的药物组合物，所述的核酸分子是DNA分子。
69.一种激发或增强对HER-2/neu蛋白质免疫应答的方法，包括：给予温血动物激发或增强免疫应答有效量的权利要求1所述蛋白质。
70.根据权利要求69所述的方法，所述蛋白质以疫苗的形式给药。
71.一种激发或增强对HER-2/neu蛋白质免疫应答的方法，包括：给予温血动物激发或增强免疫应答有效量的权利要求58所述核酸分子。
72.根据权利要求71所述的方法，所述核酸分子以疫苗的形式给药。
73.根据权利要求71所述的方法，所述的给予步骤包括先用核酸分子体外转染温血动物的细胞，然后将转染细胞回输给温血动物。
74.一种激发或增强对HER-2/neu蛋白质免疫应答的方法，包括：予温血动物激发或增强免疫应答有效量的权利要求59所述病毒载体。
75.根据权利要求74所述的方法，其中的给予步骤包括：用病毒载体体外转染温血动物的细胞，然后将转染细胞回输给温血动物。
76.一种抑制患者体内癌症发展的方法，包括：给予患者有效量的 1，26或51所述的融合多肽，从而抑制患者体内癌症的发展。
77.一种抑制患者体内癌症发展的方法，包括：给予患者有效量的 8，33或58所述的聚核苷酸，从而抑制患者体内癌症的发展。
78.一种抑制患者体内癌症发展的方法，包括：给予患者有效量的抗原呈递细胞，该细胞表达权利要求1，26或51所述的融合多肽，从而抑制患者体内癌症的发展。
79.根据权利要求78所述的方法，其中的抗原呈递细胞是树状细胞。
80.根据权利要求76-79中任一项所述的方法，其中的癌症是***癌，卵巢癌，结肠癌，肺癌或***癌。
81.一种去除生物样品中肿瘤细胞的方法，包括：让生物样品与HER-2/neu融合蛋白特异性T细胞接触，所述融合蛋白的氨基酸序列由以下聚核苷酸之一编码：
(i)聚核苷酸SEQ ID NO：8，33或58；和
(ii)上述聚核苷酸的互补序列；
所述接触步骤的条件和时间足以去除样品中表达所述抗原的细胞。
82.根据权利要求81所述的方法，其中的生物样品是血液或其组分。
83.一种抑制患者体内癌症发展的方法，包括：将经过权利要求81所述方法处理的生物样品给予患者。
84.一种刺激和/或扩增HER-2/neu融合蛋白特异性T细胞的方法，该方法包括：将T细胞与以下物质中一种或多种接触
(i)权利要求1，26或51所述的融合蛋白；
(ii)编码该融合蛋白的聚核苷酸；或
(iii)表达该融合蛋白的抗原呈递细胞；
接触的条件和时间应足以刺激和/或扩增T细胞。
85.一种分离的T细胞群，包含按照权利要求84制得的T细胞。
86.一种抑制患者体内癌症发展的方法，包括：将有效量的经过权利要求85所述方法处理的T细胞群给予患者。
87.一种抑制患者体内癌症发展的方法，包括：
(a)将分离自患者的CD4+和/或CD8+T细胞与至少一种以下物质共孵育：
(i)权利要求1，26或51所述的融合蛋白；
(ii)编码该融合蛋白的聚核苷酸；或
(iii)表达该融合蛋白的抗原呈递细胞；
引起T细胞增殖；并
(b)将有效量的增殖T细胞给予患者，从而抑制其体内癌症的发展。
88.一种抑制患者体内癌症发展的方法，包括：
(a)将分离自患者的CD4+和/或CD8+T细胞与至少一种以下物质共孵育：
(i)权利要求1，26或51所述的融合蛋白；
(ii)编码该融合蛋白的聚核苷酸；或
(iii)表达该融合蛋白的抗原呈递细胞；引起T细胞增殖；并
(b)用至少一个增殖T细胞克隆；
(c)将有效量的克隆T细胞给予患者，从而抑制其体内癌症的发展。
89.一种制备权利要求1，26或51所述融合蛋白的方法，包括：
(a)在细胞内引入含有权利要求8，33或58所述聚核苷酸的表达载体；
(b)培养转染细胞；
(c)纯化表达的蛋白质。
90.根据权利要求89所述的方法，其中的细胞是CHO细胞。
91.根据权利要求89所述的方法，其中的细胞在无血清条件下悬浮培养。
92.根据权利要求89所述的方法，其中纯化表所达蛋白质分两步：
(a)Q琼脂糖高效柱上进行阴离子交换层析；
(b)苯基琼脂糖6快速低取代柱上进行疏水性层析。
CNB008057524A 1999-01-29 2000-01-28 HER－2/neu融合蛋白 Expired - Fee Related CN1201004C (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11797699P 1999-01-29 1999-01-29
US60/117,976 1999-01-29

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1345374A true CN1345374A (zh) 2002-04-17
CN1201004C CN1201004C (zh) 2005-05-11

Family

ID=22375831

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB008057524A Expired - Fee Related CN1201004C (zh) 1999-01-29 2000-01-28 HER－2/neu融合蛋白

Country Status (20)

Country Link
EP (1) EP1147190B1 (zh)
JP (1) JP5164300B2 (zh)
KR (1) KR100766653B1 (zh)
CN (1) CN1201004C (zh)
AT (1) ATE474048T1 (zh)
AU (1) AU780109B2 (zh)
BR (1) BR0007840A (zh)
CA (1) CA2361009C (zh)
CZ (1) CZ20012587A3 (zh)
DE (1) DE60044665D1 (zh)
ES (1) ES2348708T3 (zh)
HK (1) HK1044798A1 (zh)
HU (1) HUP0105303A2 (zh)
IL (1) IL144371A0 (zh)
MX (1) MXPA01007721A (zh)
NO (1) NO20013701L (zh)
NZ (1) NZ513062A (zh)
TR (1) TR200102191T2 (zh)
WO (1) WO2000044899A1 (zh)
ZA (1) ZA200106179B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101173282B (zh) * 2003-07-21 2011-04-06 P.安杰莱蒂分子生物学研究所 编码人表皮生长因子2/neu抗原的合成基因及其用途

Families Citing this family (93)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7198920B1 (en) 1999-01-29 2007-04-03 Corika Corporation HER-2/neu fusion proteins
WO2001023421A2 (en) 1999-09-30 2001-04-05 Corixa Corporation Stress protein compositions and methods for prevention and treatment of cancer and infectious disease
US7378096B2 (en) 1999-09-30 2008-05-27 Health Research, Inc. Stress protein compositions and methods for prevention and treatment of cancer and infectious disease
AU2744201A (en) * 1999-12-29 2001-07-09 Corixa Corporation Murine neu sequences and methods of use therefor
AU4791901A (en) * 2000-03-30 2001-10-15 Dendreon Corp Compositions and methods for dendritic cell-based immunotherapy
US7229623B1 (en) * 2000-08-03 2007-06-12 Corixa Corporation Her-2/neu fusion proteins
CN1537164A (zh) * 2000-08-14 2004-10-13 治疗和诊断Her-2/neu相关恶性肿瘤的组合物和方法
NZ525320A (en) * 2000-10-18 2004-10-29 Glaxosmithkline Biolog S Combinations of immunostimulatory oligonucleotides (CpG), saponin and optionally lipopolysaccharides as potent vaccine adjuvants
US20050019340A1 (en) 2000-10-18 2005-01-27 Nathalie Garcon Vaccines
GB0109297D0 (en) 2001-04-12 2001-05-30 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
EP1417236A4 (en) 2001-07-10 2010-03-17 Corixa Corp COMPOSITIONS AND METHODS FOR ADMINISTRATION OF ENCAPSULATED PROTEINS AND ADJUVANTS IN MICROSPHERES
US7638270B2 (en) * 2003-01-24 2009-12-29 Agensys, Inc. Nucleic acids and corresponding proteins entitled 254P1D6B useful in treatment and detection of cancer
WO2005046571A2 (en) 2003-06-06 2005-05-26 Agennix Incorporated Lactoferrin as an adjuvant in cancer vaccines
WO2004113377A1 (en) * 2003-06-25 2004-12-29 Pharmexa A/S Purification of her-2 variants
CN101094864A (zh) 2003-06-25 2007-12-26 法麦克萨有限公司 Her－2变体的纯化
GB0321615D0 (en) 2003-09-15 2003-10-15 Glaxo Group Ltd Improvements in vaccination
KR101438983B1 (ko) 2003-11-06 2014-09-05 시애틀 지네틱스, 인크. 리간드에 접합될 수 있는 모노메틸발린 화합물
AU2005249490B2 (en) 2004-06-01 2010-07-29 Genentech, Inc. Antibody drug conjugates and methods
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
PL1791565T3 (pl) 2004-09-23 2016-10-31 Modyfikowane cysteiną przeciwciała i koniugaty
ITMI20041965A1 (it) 2004-10-15 2005-01-15 Augusto Amici "dna codificante forme tronche e chimeriche della proteina p185neu e suoi usi terapeutici"
GB0427131D0 (en) * 2004-12-10 2005-01-12 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel combination
TWI457133B (zh) 2005-12-13 2014-10-21 Glaxosmithkline Biolog Sa 新穎組合物
EP2390363A1 (en) 2006-06-02 2011-11-30 GlaxoSmithKline Biologicals s.a. Method for identifying whether a patient will be responder or not to immunotherapy based on the differential expression of the PRF1 gene
AR066676A1 (es) 2007-05-24 2009-09-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Composicion antigenica liofilizada que contiene un agonista del receptor tipo toll
US8470980B2 (en) 2009-09-09 2013-06-25 Centrose, Llc Extracellular targeted drug conjugates
GB0917457D0 (en) 2009-10-06 2009-11-18 Glaxosmithkline Biolog Sa Method
WO2011130598A1 (en) 2010-04-15 2011-10-20 Spirogen Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
MX336540B (es) 2010-06-08 2016-01-22 Genentech Inc Conjugados y anticuerpos manipulados geneticamente con cisteina.
CA2816426A1 (en) 2010-11-17 2012-06-07 Genentech, Inc. Alaninyl maytansinol antibody conjugates
CA2833212C (en) 2011-05-12 2020-06-09 Genentech, Inc. Multiple reaction monitoring lc-ms/ms method to detect therapeutic antibodies in animal samples using framework signature peptides
US11135303B2 (en) 2011-10-14 2021-10-05 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
WO2013130093A1 (en) 2012-03-02 2013-09-06 Genentech, Inc. Biomarkers for treatment with anti-tubulin chemotherapeutic compounds
WO2014057114A1 (en) 2012-10-12 2014-04-17 Adc Therapeutics Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-anti-psma antibody conjugates
EP2839860B1 (en) 2012-10-12 2019-05-01 MedImmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
JP6392765B2 (ja) 2012-10-12 2018-09-19 エイディーシー・セラピューティクス・エス・アーＡｄｃ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｓａ ピロロベンゾジアゼピン−抗体結合体
CA2887895C (en) 2012-10-12 2019-10-29 Adc Therapeutics Sarl Pyrrolobenzodiazepine-anti-cd19 antibody conjugates
EP2906297B1 (en) 2012-10-12 2017-12-06 ADC Therapeutics SA Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
MX364328B (es) 2012-10-12 2019-04-23 Medimmune Ltd Conjugados del anticuerpo pirrolobenzodiazepina.
CN105102003B (zh) 2012-10-12 2019-03-05 Adc疗法责任有限公司 吡咯并苯并二氮杂卓-抗psma抗体结合物
AU2013366493B2 (en) 2012-12-21 2017-08-24 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
WO2014096365A1 (en) 2012-12-21 2014-06-26 Spirogen Sàrl Unsymmetrical pyrrolobenzodiazepines-dimers for use in the treatment of proliferative and autoimmune diseases
BR112015021965B1 (pt) 2013-03-13 2022-05-03 Medimmune Limited Conjugados e compostos de pirrolobenzodiazepinas, composição farmacêutica, uso dos mesmos para o tratamento de uma doença proliferativa e método de síntese dos ditos compostos
JP6444902B2 (ja) 2013-03-13 2018-12-26 メドイミューン・リミテッドＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ ピロロベンゾジアゼピン及びその結合体
KR102057755B1 (ko) 2013-03-13 2019-12-19 메디뮨 리미티드 피롤로벤조디아제핀 및 그의 컨쥬게이트
EA201690195A1 (ru) 2013-08-12 2016-05-31 Дженентек, Инк. Конъюгатные соединения антитело-лекарство на основе димера 1-(хлорметил)-2,3-дигидро-1h-бензо[e]индола и способы применения и лечения
EP3054983B1 (en) 2013-10-11 2019-03-20 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
GB201317982D0 (en) 2013-10-11 2013-11-27 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
EP3054985B1 (en) 2013-10-11 2018-12-26 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
US9956299B2 (en) 2013-10-11 2018-05-01 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine—antibody conjugates
JP6425327B2 (ja) * 2013-12-12 2018-11-21 国立大学法人東京農工大学 タンパク質−磁性粒子複合体及びその製造方法
CN105828840B (zh) 2013-12-16 2020-08-04 基因泰克公司 1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚二聚体抗体-药物缀合物化合物及使用和治疗方法
RU2689388C1 (ru) 2013-12-16 2019-05-28 Дженентек, Инк. Пептидомиметические соединения и их конъюгаты антител с лекарственными средствами
CA2933557A1 (en) 2013-12-16 2015-06-25 Genentech, Inc. Peptidomimetic compounds and antibody-drug conjugates thereof
US10188746B2 (en) 2014-09-10 2019-01-29 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
EP3191521A2 (en) 2014-09-12 2017-07-19 F. Hoffmann-La Roche AG Cysteine engineered antibodies and conjugates
CN106714844B (zh) 2014-09-12 2022-08-05 基因泰克公司 蒽环类二硫化物中间体、抗体-药物缀合物和方法
GB201416112D0 (en) 2014-09-12 2014-10-29 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
PE20170905A1 (es) 2014-09-17 2017-07-12 Genentech Inc Pirrolobenzodiazepinas y conjugados de anticuerpo-disulfuro de las mismas
CA2968447A1 (en) 2014-11-25 2016-06-02 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates and their use to treat neoplasms
CN107206101B (zh) 2014-12-03 2021-06-25 基因泰克公司 季铵化合物及其抗体-药物缀合物
GB201506402D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W Site-specific antibody-drug conjugates
GB201506411D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Bergenbio As Humanized anti-axl antibodies
MA43345A (fr) 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Conjugués anticorps-médicaments de pyrrolobenzodiazépine et méthodes d'utilisation
MA43354A (fr) 2015-10-16 2018-08-22 Genentech Inc Conjugués médicamenteux à pont disulfure encombré
MA45326A (fr) 2015-10-20 2018-08-29 Genentech Inc Conjugués calichéamicine-anticorps-médicament et procédés d'utilisation
GB201601431D0 (en) 2016-01-26 2016-03-09 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines
GB201602356D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
GB201602359D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
JP6943872B2 (ja) 2016-03-25 2021-10-06 ジェネンテック， インコーポレイテッド 多重全抗体及び抗体複合体化薬物定量化アッセイ
GB201607478D0 (en) 2016-04-29 2016-06-15 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
PL3458101T3 (pl) 2016-05-20 2021-05-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Koniugaty PROTAC-przeciwciało i sposoby ich stosowania
CN109313200B (zh) 2016-05-27 2022-10-04 豪夫迈·罗氏有限公司 用于表征位点特异性抗体-药物缀合物的生物分析性方法
JP7043425B2 (ja) 2016-06-06 2022-03-29 ジェネンテック， インコーポレイテッド シルベストロール抗体－薬物コンジュゲート及び使用方法
JP7093767B2 (ja) 2016-08-11 2022-06-30 ジェネンテック， インコーポレイテッド ピロロベンゾジアゼピンプロドラッグ及びその抗体コンジュゲート
CN110139674B (zh) 2016-10-05 2023-05-16 豪夫迈·罗氏有限公司 制备抗体药物缀合物的方法
GB201617466D0 (en) 2016-10-14 2016-11-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine conjugates
GB201702031D0 (en) 2017-02-08 2017-03-22 Medlmmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
JP6671555B2 (ja) 2017-02-08 2020-03-25 アーデーセー セラピューティクス ソシエテ アノニム ピロロベンゾジアゼピン抗体複合体
JP2020517609A (ja) 2017-04-18 2020-06-18 メディミューン リミテッド ピロロベンゾジアゼピン複合体
CA3057748A1 (en) 2017-04-20 2018-10-25 Adc Therapeutics Sa Combination therapy with an anti-axl antibody-drug conjugate
WO2018229222A1 (en) 2017-06-14 2018-12-20 Adc Therapeutics Sa Dosage regimes for the administration of an anti-cd19 adc
WO2019034764A1 (en) 2017-08-18 2019-02-21 Medimmune Limited CONJUGATES OF PYRROLOBENZODIAZEPINE
JP2020534300A (ja) 2017-09-20 2020-11-26 ピーエイチ・ファーマ・カンパニー・リミテッドＰｈ Ｐｈａｒｍａ Ｃｏ．， Ｌｔｄ． タイランスタチン類似体
GB201803342D0 (en) 2018-03-01 2018-04-18 Medimmune Ltd Methods
GB201806022D0 (en) 2018-04-12 2018-05-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
GB201814281D0 (en) 2018-09-03 2018-10-17 Femtogenix Ltd Cytotoxic agents
WO2020086858A1 (en) 2018-10-24 2020-04-30 Genentech, Inc. Conjugated chemical inducers of degradation and methods of use
WO2020123275A1 (en) 2018-12-10 2020-06-18 Genentech, Inc. Photocrosslinking peptides for site specific conjugation to fc-containing proteins
GB201901197D0 (en) 2019-01-29 2019-03-20 Femtogenix Ltd G-A Crosslinking cytotoxic agents
KR20230037560A (ko) * 2020-07-14 2023-03-16 에프. 호프만-라 로슈 아게 고정 용량 조합에 대한 분석
GB2597532A (en) 2020-07-28 2022-02-02 Femtogenix Ltd Cytotoxic compounds
KR102584276B1 (ko) * 2023-03-30 2023-10-10 주식회사 애스톤사이언스 Her2 백신, 및 면역관문 억제제의 조합 요법

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK0474727T3 (da) * 1989-05-19 1998-01-12 Genentech Inc HER2 ekstracellulært domæne
US5801005A (en) * 1993-03-17 1998-09-01 University Of Washington Immune reactivity to HER-2/neu protein for diagnosis of malignancies in which the HER-2/neu oncogene is associated
JPH0914357A (ja) * 1995-06-27 1997-01-14 Honda Motor Co Ltd 伝動ベルト用ブロック

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101173282B (zh) * 2003-07-21 2011-04-06 P.安杰莱蒂分子生物学研究所 编码人表皮生长因子2/neu抗原的合成基因及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
NZ513062A (en) 2003-10-31
CZ20012587A3 (cs) 2002-05-15
BR0007840A (pt) 2002-01-22
CA2361009A1 (en) 2000-08-03
IL144371A0 (en) 2002-05-23
DE60044665D1 (de) 2010-08-26
AU2742600A (en) 2000-08-18
NO20013701L (no) 2001-09-28
HUP0105303A2 (en) 2002-05-29
ATE474048T1 (de) 2010-07-15
KR100766653B1 (ko) 2007-10-15
HK1044798A1 (en) 2002-11-01
EP1147190A1 (en) 2001-10-24
WO2000044899A1 (en) 2000-08-03
JP2002535004A (ja) 2002-10-22
TR200102191T2 (tr) 2001-12-21
MXPA01007721A (es) 2003-07-14
EP1147190B1 (en) 2010-07-14
AU780109B2 (en) 2005-03-03
ES2348708T3 (es) 2010-12-13
ZA200106179B (en) 2002-12-24
KR20010101865A (ko) 2001-11-15
CN1201004C (zh) 2005-05-11
CA2361009C (en) 2012-10-23
NO20013701D0 (no) 2001-07-27
JP5164300B2 (ja) 2013-03-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1201004C (zh) HER－2/neu融合蛋白
CN1150318C (zh) 用于预防或治疗恶性肿瘤的HER-2/neu蛋白胞内区
RU2642300C2 (ru) Иммунотерапевтические композиции на основе дрожжей-muc1 и способы их применения
CN1308037C (zh) 增强蛋白和肽抗原免疫原性的Fc融合蛋白
KR102319839B1 (ko) 항원-특이적 tcr의 신규 생성
CN1537164A (zh) 治疗和诊断Her-2/neu相关恶性肿瘤的组合物和方法
CN1336935A (zh) 用于wt1特异性免疫治疗的组合物和方法
CN1589279A (zh) 有效***和其它需要除去或破坏细胞的疾病的肽
CN1277614A (zh) ***珠蛋白,一种***特异性乳腺癌分泌蛋白
CN1942202A (zh) 与自身免疫疾病相关的自身和非－自身抗原的识别
CN1606453A (zh) Cripto阻断抗体及其用途
CN1649895A (zh) 有效***和其它需要除去或破坏细胞的疾病的肽
CN1694901A (zh) Kdr肽和包括该肽的疫苗
CN1675237A (zh) 免疫原性组合物
CN1675362A (zh) Hla－a24限制性癌抗原肽
CN1203603A (zh) 由抗－Fc受体抗体组成的治疗化合物
CN1543476A (zh) 用于将蛋白定向到胞外体的方法和化合物
CN1096032A (zh) 新的活性化合物
CN1067382A (zh) 人类***状瘤病毒肽的表达以及在致免疫组合物中的应用
CN1278865A (zh) 肿瘤特异性抗原,其制备方法以及它们在免疫和诊断中的应用
CN1345246A (zh) 预防或治疗癌症及与癌症相关的骨损失的组合物和方法
CN1201003C (zh) 脂肪细胞特异性蛋白质同系物
CN108602875B (zh) T细胞受体及其用途
CN1357006A (zh) 由hlaii类分子呈递的mage－a1肽
CN1150030C (zh) 重组人甲胎蛋白及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C06 Publication
PB01 Publication
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20050511

Termination date: 20100301