ES2348708T3

ES2348708T3 - Proteinas de fusion de her-2/neu.

Info

Publication number: ES2348708T3
Application number: ES00905800T
Authority: ES
Inventors: Dirk Gheysen; Martin A. Cheever
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA; Corixa Corp
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA; Corixa Corp
Priority date: 1999-01-29
Filing date: 2000-01-28
Publication date: 2010-12-13
Anticipated expiration: 2020-01-28
Also published as: NZ513062A; CZ20012587A3; BR0007840A; CA2361009A1; IL144371A0; DE60044665D1; AU2742600A; NO20013701L; HUP0105303A2; CN1345374A; ATE474048T1; KR100766653B1; HK1044798A1; EP1147190A1; WO2000044899A1; JP2002535004A; TR200102191T2; MXPA01007721A; EP1147190B1; AU780109B2

Abstract

Una proteína aislada que comprende: (a) un dominio extracelular de HER-2/neu o un fragmento del domino extracelular, en el que se han eliminado de 1 a aproximadamente 100 aminoácidos del extremo carboxilo-terminal del domino extracelular; fusionado a: (b) un dominio de fosforilación de HER-2/neu o un fragmento del dominio de fosforilación de HER-2/neu, que comprende la SEC ID Nº: 5 o la secuencia de aminoácidos que incluye de Gln 991 a Arg 1049 de la SEC ID Nº: 2, en el que la proteína puede producir una respuesta inmune en un animal de sangre caliente.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere en general a proteínas de fusión de HER-2/neu, moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas de fusión de HER-2/neu, vectores virales que expresan proteínas de fusión de HER-2/neu y composiciones farmacéuticas (por ejemplo, vacunas) que comprenden las proteínas de fusión de HER-2/neu y/o moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas de fusión de HER-2/neu. La presente invención también se refiere a procedimientos para tratar o prevenir el cáncer mediante la inducción o potenciación de una respuesta inmune a la proteína HER-2/neu, incluyendo para usos en el tratamiento de tumores malignos asociados con el oncogén de HER-2/neu. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

A pesar de enormes inversiones de recursos financieros y humanos, el cáncer sigue siendo una de las principales causas de muerte. Por ejemplo, el cáncer es la principal causa de muerte en mujeres de edades comprendidas entre los 35 y 74 años. El cáncer de mama es el tumor maligno más común en mujeres y la incidencia del desarrollo de cáncer de mama está aumentando. Se estima que a una de cada nueve mujeres se le diagnosticará la enfermedad. Los enfoques convencionales para curar el cáncer de mama se han centrado alrededor de una combinación de cirugía, radiación y quimioterapia. Estos enfoques han dado como resultado algunos éxitos espectaculares en ciertos tumores malignos. Sin embargo, el cáncer de mama es con mayor frecuencia incurable cuando se diagnostica más allá de cierta fase. Son necesarios enfoques alternativos para el diagnóstico temprano y la terapia.

Una característica común de los tumores malignos es el crecimiento celular descontrolado. Las células cancerosas parecen sufrir un proceso de transformación del fenotipo normal a un fenotipo maligno capaz de crecimiento autónomo. La amplificación y sobreexpresión de genes celulares somáticos se considera un suceso primario común que da como resultado la transformación de células normales en células malignas. Las características fenotípicas malignas codificadas por los genes oncogénicos se pasan durante la división celular a la progenie de las células transformadas.

Se han identificado al menos cuarenta oncogenes operativos en células malignas y responsables de, o asociados con, la transformación. Estos oncogenes se han clasificado en diferentes grupos basándose en la supuesta función o en la localización de sus productos génicos, así como en la proteína expresada por el oncogén.

Se cree que los oncogenes son esenciales para ciertos aspectos de la fisiología celular normal. A este respecto, el oncogén de HER-2/neu parece ser un miembro de la familia tirosina quinasa de glucoproteínas de tipo receptor y comparte un alto grado de identidad con el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). HER-2/neu supuestamente juega un papel en el crecimiento y/o diferenciación celular. HER-2/neu parece inducir tumores malignos a través de mecanismos cuantitativos que son resultado de una expresión aumentada o desregulada de un producto génico esencialmente normal.

La glicoproteína p185 es el producto proteico del oncogén de HER-2/neu. El gen de HER-2/neu se amplifica y p185 se sobreexpresa en una diversidad de cánceres, incluyendo cáncer de mama, de ovario, de colon, de pulmón y de próstata. p185 está relacionada con la transformación maligna y se encuentra en el 50-60% de carcinomas ductales in situ, en el 2040% de cánceres de mama invasivos, y en una fracción sustancial de adenocarcinomas que surgen en los ovarios, próstata, colon y pulmón. La expresión de HER-2/neu está íntimamente asociada, no sólo con el fenotipo maligno, sino también con la agresividad del tumor maligno. La sobreexpresión de HER-2/neu está relacionada con un mal pronóstico tanto en cánceres de mama como de ovario.

p185 es una proteína transmembrana con una masa molecular relativa esperada de 185 kD que tiene aproximadamente 1255 aminoácidos de longitud. p185 tiene un dominio extracelular (ECD) de aproximadamente 645 aminoácidos con al menos un 40% de identidad con EGFR, un dominio transmembrana altamente hidrófobo, y un dominio intracelular carboxiterminal (ICD) de aproximadamente 580 aminoácidos con al menos un 80% de identidad con EGFR.

Existe la necesidad de vacunas anticáncer que puedan dirigirse a un tumor maligno con el que el esté asociado el oncogén de HER-2/neu, y de composiciones y procedimientos que puedan inducir y potenciar una respuesta inmune contra el gen de HER-2/neu. La presente invención se refiere a éstos, así como a otros, fines importantes.

El documento WO90/14357 desvela el dominio extracelular de Her2 y vacunas que lo contienen.

El documento WO96/30514 desvela fragmentos adicionales de Her-2/neu que pueden ser útiles en el tratamiento de tumores malignos.

Diss y col (1996) J Immunol 156, 3151-3158 desvela que Her-2/neu es una proteína propia y que las ratas inmunizadas con el ICD o ECD de proteína neu de rata desarrollaron inmunidad de células T CD4+ e inmunidad de Ab contra péptidos y proteína neu de rata. SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona proteínas de fusión de pal 85 de HER-2/neu, moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas de fusión de HER-2/neu, y vectores virales que comprenden secuencias polinucleotídicas que codifican proteínas de fusión de HER-2/neu, para usos que incluyen la inmunización de animales de sangre caliente frente a tumores malignos con los que está asociado el oncogén de HER-2/neu. Las proteínas de fusión o moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención pueden estar presentes en composiciones que incluyen un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, una emulsión de aceite en agua y, opcionalmente, incluyen uno o más principios activos adicionales, tales como una sustancia inmunoestimulante, por ejemplo, SBAS-2, 3DMPL, QS21, o una combinación de 3D-MPL y QS21. Las composiciones de la invención son útiles como, y pueden estar en forma de vacunas. Las proteínas de fusión, moléculas de ácido nucleico, vectores virales, composiciones farmacéuticas y/o vacunas pueden administrarse una sola vez (por ejemplo, para un individuo con un alto riesgo de adquirir o readquirir un tumor maligno o cuando se sospeche la presencia un tumor maligno) o periódicamente (por ejemplo, para un individuo con un alto riesgo de adquirir o readquirir un tumor maligno o cuando se sospeche la presencia un tumor maligno). Los compuestos o composiciones de la presente invención son útiles en el tratamiento de uno o más tumores existentes o en la prevención de la aparición o reaparición de tumores, en animales de sangre caliente incluyendo seres humanos.

La presente divulgación también proporciona procedimientos para inhibir o prevenir el desarrollo de un cáncer en un paciente mediante la inducción o potenciación de una respuesta inmune contra la proteína de HER-2/neu, que comprende la administración a un paciente de una composición farmacéutica o una vacuna como se ha relatado anteriormente. El paciente puede estar aquejado de, por ejemplo, cáncer de mama, de ovario, de colon, de pulmón o de próstata, en cuyo caso los procedimientos proporcionan tratamiento para la enfermedad, o un paciente considerado en riesgo de padecer dicha enfermedad puede tratarse profilácticamente. En una realización, la administración de la composición farmacéutica o vacuna comprende transfectar células de un animal de sangre caliente ex vivo con una molécula de ácido nucleico de la invención o infectar células de un animal de sangre caliente ex vivo con un vector viral, que comprende una molécula de ácido nucleico de la invención y, posteriormente, suministrar las células transfectadas o infectadas al animal de sangre caliente.

La presente divulgación proporciona además, dentro de otros aspectos, procedimientos para eliminar células tumorales de una muestra biológica, que comprenden poner en contacto una muestra biológica con células T que reaccionen específicamente con una proteína de fusión de HER-2/neu, en los que la etapa de la puesta en contacto se realiza en condiciones y durante un tiempo suficientes para permitir la eliminación de células que expresan la proteína de la muestra. Dentro de los aspectos relacionados, se proporcionan procedimientos para inhibir el desarrollo de un cáncer en un paciente, que comprenden administrar a un paciente una muestra biológica tratada como se ha descrito anteriormente.

En otra realización, se proporcionan procedimientos para estimular y/o expandir células

T específicas para una proteína de fusión de HER-2/neu, que comprenden poner en contacto células T con uno o más de: (i) una proteína de fusión como se ha descrito anteriormente; (ii) un polinucleótido que codifica dicha proteína de fusión; y/o (iii) una célula presentadora de antígenos que expresa dicha proteína de fusión; en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la estimulación y/o expresión de células T. También se proporcionan poblaciones de células T aisladas que comprenden células T preparados como se ha descrito anteriormente. Dentro de aspectos adicionales, la presente invención proporciona procedimientos para inhibir el desarrollo de un cáncer en un paciente, que comprenden la administración a un paciente de una cantidad eficaz de una población de células T como se ha descrito anteriormente.

En otra realización más, la presente divulgación proporciona además procedimientos para inhibir el desarrollo de un cáncer en un paciente, que comprenden las etapas de:

(a): incubar células T CD4+ y/o CD8+ aisladas de un paciente con uno o más de: (i) una proteína de fusión de HER-2/neu; (ii) un polinucleótido que codifica dicha proteína de fusión; y (iii) una célula presentadora de antígenos que expresa dicha proteína de fusión; y

(b): administrar al paciente una cantidad eficaz de los células T proliferadas, inhibiendo de este modo el desarrollo de un cáncer en el paciente. Las células proliferadas pueden, pero no necesariamente, clonarse antes de su administración al paciente.

Finalmente, la invención proporciona un procedimiento para generar una proteína de fusión de HER-2/neu, comprendiendo el procedimiento las etapas de (a) introducir en una célula un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica una proteína de fusión de HER-2/neu, (b) cultivar la célula transfectada; y (c) purificar la proteína expresada. En una realización preferida, la célula es una célula CHO. En otra realización preferida, la célula se cultiva en suspensión, en condiciones sin suero. En otra realización más, la proteína expresada se purifica mediante un procedimiento de dos etapas, que comprende una cromatografía de intercambio aniónico en columnas de alto rendimiento de Q-sefarosa y una cromatografía hidrófoba en una Phenyl Sepharose 6 Fast Flow de baja sustitución.

Estos y otros aspectos de la presente invención serán evidentes tras consultar la descripción detallada siguiente y los dibujos adjuntos. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 muestra un mapa del plásmido de expresión pFLAGCMV-1/ICD, que tiene un tamaño de 6,7 kb. La Figura 2 muestra un mapa del plásmido de expresión pFLAGCMV-1/KD, que tiene un tamaño de 5,7 kb. La Figura 3 muestra un mapa del plásmido de expresión pFLAGCMV-1/PD, que tiene un tamaño de 5,7 kb. La Figura 4 muestra que el dominio de fosforilación de HER-2/neu se secretaba al medio de cultivo y que el dominio intracelular de HER-2/neu y el dominio quinasa de HER-2/neu no se secretaban al medio de cultivo, como se describe en el Ejemplo 3. La Figura 5 muestra un mapa del vector de expresión pcDNA3.1/hygro/ECD-PD, que tiene un tamaño de 8,3 kb. La Figura 6 ilustra los resultados de la expresión de la proteína de fusión de ECD-PD en células HEK-293 y CHO y muestra que la proteína de fusión se secretaba al medio de cultivo, como se describe en el Ejemplo 4. La Figura 7 muestra la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la proteína HER-2/neu humana (SEC ID Nº: 1). La Figura 8 muestra la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la proteína HER-2/neu de rata (SEC ID Nº: 2). El dominio quinasa abarca la región desde el aminoácido 721 hasta el aminoácido 998, ambos inclusive. La Figura 9 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína extracelular HER-2/neu (SEC ID Nº: 3). La Figura 10 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio de fosforilación (PD) de la proteína HER-2/neu humana (SEC ID Nº: 4). La Figura 11 muestra la secuencia de aminoácidos de una porción preferida del dominio de fosforilación (APD) de la proteína HER-2/neu humana (SEC ID Nº: 5). La Figura 12 muestra la secuencia de aminoácidos de una proteína de fusión que comprende el dominio extracelular (ECD) y el dominio de fosforilación (PD) de la proteína HER-2/neu humana (SEC ID Nº: 6). La Figura 13 muestra la secuencia de aminoácidos de una proteína de fusión que comprende el dominio extracelular (ECD) y una porción preferida del dominio de fosforilación (ΔPD) de la proteína HER-2/neu humana (SEC ID Nº: 7). La Figura 14 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular (ECD) de la proteína HER-2/neu de rata (SEC ID Nº: 8). La Figura 15 muestra la secuencia de nucleótidos de longitud completa (SEC ID Nº: 9) de una molécula de ADN que codifica la proteína HER-2/neu humana. Esta secuencia de nucleótidos de longitud completa se describe en el documento WO 96/30514. La Figura 16 muestra la secuencia de nucleótidos de longitud completa (SEC ID Nº: 10) de una molécula de ADN que codifica la proteína HER-2/neu de rata. Esta secuencia de nucleótidos de longitud completa se describe en Bargmann y col. (1986) Nature, 319: 22630 y GENBANK/X03362.

La Figura 17 ilustra los resultados de un ensayo ELISA para la unión de Herceptina a diferentes proteínas de fusión de ECD-PD producidas en células de mamífero o en E. coli. Las proteínas de fusión producidas en E. coli están en fase de lectura con un marcador de histidina 6x C-o N-terminal (indicados como marcador C-His y marcador N-His, respectivamente). La Figura 18 muestra una comparación de la expresión de la proteína de fusión de ECDPD de HER-2/neu en CHO-K1 cultivadas en suspensión en condiciones sin suero y en células de Pichia. La Figura 19 muestra la secuencia de nucleótidos de Her-2/neu de ratón. La Figura 20 muestra la secuencia de aminoácidos de Her-2/neu de ratón.

DESCRIPCIÓN DE LAS REALIZACIONES ESPECÍFICAS INTRODUCCIÓN

La presente invención se refiere a compuestos y composiciones capaces de modular, preferentemente inducir o potenciar, la inmunidad contra el producto proteico de la expresión del oncogén de HER-2/neu, incluyendo para tumores malignos en un animal de sangre caliente en los que un gen de HER-2/neu amplificado con un tumor maligno no requiera que el producto de expresión proteico del gen esté presente en el tumor. Por ejemplo, la sobreexpresión del gen puede estar implicada en el inicio y las fases tempranas de la formación del tumor, pero la expresión de proteína posteriormente puede reducirse o estar ausente. La presente invención puede usarse para inducir o potenciar una respuesta inmune eficaz para convertir un tumor positivo para HER-2/neu en negativo para HER-2/neu, además de prevenir el establecimiento de tumores positivos para HER-2/neu y provocar la regresión de tumores positivos para HER-2/neu existentes.

Las siguientes abreviaturas se usan durante toda la memoria descriptiva: “ECD” se refiere al dominio extracelular, “ICD” se refiere al dominio intracelular, “PD” se refiere al dominio de fosforilación (es decir, el dominio que está fosforilado) que está dentro del dominio intracelular, “ΔPD” se refiere a un fragmento del dominio de fosforilación que está dentro del dominio de fosforilación y “KD” se refiere al dominio quinasa que está dentro del dominio intracelular. El producto de expresión del gen de HER-2/neu se denomina en el presente documento “proteína HER-2/neu”, también conocida como y denominada “p185” o “c-erbB2”. DEFINICIONES

La “proteína de fusión de ECD-ICD de HER-2/neu”, también denominada en el presente documento “ECD-ICD” o “proteína de fusión de ECD-ICD”, se refiere a una proteína de fusión (o fragmentos de la misma) que comprende el dominio extracelular (o fragmentos del mismo) y el dominio intracelular (o fragmentos del mismo) de la proteína HER-2/neu. Como se usa en el presente documento, la proteína de fusión de ECD-ICD no incluye una porción sustancial del dominio transmembrana de HER-2/neu y, preferentemente, no incluye ninguno de los dominios transmembrana de HER-2/neu.

La “proteína de fusión de ECD-PD de HER-2/neu”, también denominada “ECD-PD” o “proteína de fusión de ECD-PD”, o la “proteína de fusión de ECD-ΔPD de HER-2/neu”, también denominada “ECD-ΔPD” o “proteína de fusión de ECD-ΔPD”, se refiere a proteínas de fusión (o fragmentos de las mismas) que comprenden el dominio extracelular (o fragmentos del mismo) y dominio de fosforilación (o fragmentos del mismo, por ejemplo, ΔPD) de la proteína HER-2/neu. Las proteínas de fusión de ECD-PD y ECD-ΔPD no incluyen una porción sustancial del dominio transmembrana HER-2/neu y, preferentemente, no incluyen ninguno de los dominios transmembrana de HER-2/neu.

Las expresiones “proteína de fusión de ECD-ICD de HER-2/neu” y “proteína de fusión de ECD-PD de HER-2/neu” y sus términos y expresiones relacionadas, también se entiende que se refieren a fragmentos de los mismos, homólogos de los mismos y equivalentes funcionales de los mismos (denominados en su conjunto “variantes”), tales como aquéllos en los que se inserta, deleciona o reemplaza uno o más aminoácidos por otro aminoácido o aminoácidos o no aminoácido o aminoácidos que, en realizaciones preferidas de la invención y la divulgación, (i) aumentan la inducción o potenciación de una respuesta inmune en comparación con la proteína HER-2/neu o (ii) no afectan sustancialmente a la inducción o potenciación de una respuesta inmune en comparación con la proteína HER-2/neu (por ejemplo, la variante estimula una respuesta de células T auxiliares o células T citotóxicas o estimula la producción de anticuerpos). Los ejemplos específicos no limitantes de variantes incluyen fragmentos, homólogos y equivalentes funcionales ejemplares de la proteína de fusión de ECD-ICD de HER-2/neu y la proteína de fusión de ECD-PD de HER-2/neu se describe en más detalle en el presente documento. Las variantes pueden ser “sustancialmente idénticas” o “sustancialmente similares” a una proteína de fusión que comprende componentes polipeptídicos nativos y conservan la capacidad de estimular una respuesta inmune.

Una “proteína de fusión” se refiere a una proteína que tiene al menos dos polipéptidos unidos covalentemente, en la que un polipéptido viene de una secuencia o dominio proteico y el otro polipéptido viene de otra secuencia o dominio proteico. Los polipéptidos pueden estar unidos tanto directamente como mediante un engarce covalente, por ejemplo, un engarce de aminoácidos, tal como un engarce de poliglicina, u otro tipo de engarce químico, por ejemplo, un engarce de carbohidrato, un engarce lipídico, un engarce de ácido graso, un engarce poliéter, por ejemplo, PEG, etc. (Véase, por ejemplo, Hermanson, Bioconjugate techniques (1996)). Los polipéptidos que forman la proteína de fusión están unidos típicamente de Cterminal a N-terminal, aunque también pueden unirse de C-terminal a N-terminal, de N-terminal a N-terminal o de N-terminal a C-terminal. Los polipéptidos de la proteína de fusión pueden estar en cualquier orden. La expresión “proteína de fusión” también se refiere a variantes modificadas de manera conservativa, variantes polimórficas, alelos, mutantes, subsecuencias y homólogos interespecie de los polipéptidos que componen la proteína de fusión. Pueden producirse proteínas de fusión uniendo covalentemente una cadena de aminoácidos de una secuencia proteica a una cadena de aminoácidos de otra secuencia proteica, por ejemplo, mediante la preparación de un polinucleótido recombinante que codifique de forma contigua la proteína de fusión. Las proteínas de fusión pueden comprender 2, 3, 4 o más cadenas diferentes de aminoácidos de la misma o diferentes especies. Las diferentes cadenas de aminoácidos en una proteína de fusión pueden cortarse y empalmarse entre sí directamente o pueden cortarse y empalmarse entre sí indirectamente mediante un grupo de enlace químico o un grupo de enlace de aminoácidos. La proteína de fusión puede comprender opcionalmente otros componentes, como se describe en más detalle en el presente documento.

El término “proteína” se usa en el presente documento indistintamente con “polipéptido” y “péptido”.

El término “ácido nucleico” se refiere a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos en forma monocatenaria o bicatenaria. La expresión abarca ácidos nucleicos que contienen análogos de nucleótidos conocidos o restos o enlaces de cadena principal modificados, que son sintéticos, de origen natural y de origen no natural, que tienen propiedades de unión similares al ácido nucleico de referencia y que se metabolizan de una manera similar a los nucleótidos de referencia. Los ejemplos de dichos análogos incluyen, sin limitación, fosforotioatos, fosforoamidatos, metil fosfonatos, quiralmetil fosfonatos, 2-O-metil ribonucleótidos, ácidos peptidonucleicos (PNA).

A menos que se indique de otro modo, una secuencia de ácido nucleico particular también abarca implícitamente las variantes modificadas de manera conservativa de la misma (por ejemplo, sustituciones de codones degenerados) y secuencias complementarias, así como la secuencia indicada explícitamente. Específicamente, pueden conseguirse sustituciones de codones degenerados mediante la generación de secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) se sustituye con restos de desoxinosina y/o bases mixtas (Batzer y col. (1991) Nucleic Acid Res. 19: 5081; Ohtsuka y col. (1985) J. Biol. Chem.

260: 2605-2608; Rossolini y col. (1994) Mol. Cell. Probes 8: 91-98). La expresión "ácido nucleico" se usa indistintamente con gen, ADNc, ARNm, oligonucleótido y polinucleótido.

Una secuencia polinucleotídica que comprende una proteína de fusión de la invención hibrida en condiciones rigurosas con cada una de las secuencias de nucleótidos que codifican cada polipéptido individual de la proteína de fusión. Las secuencias polinucleotídicas que codifican los polipéptidos individuales del polipéptido de fusión incluyen, por lo tanto, variantes modificadas de forma conservativa, variantes polimórficas, alelos, mutantes, subsecuencias y homólogos interespecie.

El “porcentaje de identidad de secuencia” se determina mediante la comparación de dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación, en la que la porción de la secuencia polinucleotídica en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula mediante la determinación del número de posiciones en las que aparecen bases de ácido nucleico o restos aminoacídicos idénticos en ambas secuencias para dar el número de posiciones emparejadas, dividiendo el número de posiciones emparejadas por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje de identidad de secuencia.

La expresión “identidad sustancial” de secuencias polinucleotídicas se refiere a que un polinucleótido comprende una secuencia que tiene al menos un 25% de identidad de secuencia. Como alternativa, el porcentaje de identidad puede ser cualquier número entero del 25% al 100%. Las realizaciones más preferidas incluyen al menos: 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99% o más, en comparación con una secuencia de referencia usando los programas descritos en el presente documento; preferentemente, BLAST usando parámetros convencionales, como se describe posteriormente. Un experto reconocerá que estos valores pueden ajustarse apropiadamente para determinar la identidad correspondiente de proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos teniendo en cuenta la degeneración de codones, la similitud de aminoácidos, la situación de la fase de lectura y similares. La expresión “identidad sustancial” de secuencias de aminoácidos para estos propósitos normalmente se refiere a una identidad de secuencia de al menos el 40%. El porcentaje preferido de identidad de polipéptidos puede ser cualquier número entero del 40% al 100%. Las realizaciones más preferidas incluyen al menos el 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99%. Los polipéptidos que son “sustancialmente similares” comparten secuencias como se ha indicado anteriormente excepto por que las posiciones de restos que no son idénticos pueden diferir por cambios de aminoácidos conservativos. Las sustituciones de aminoácidos conservativas se refieren a la capacidad de intercambio de restos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas son glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticohidroxilo son serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida son asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas son fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas son lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre son cisteína y metionina. Son grupos de sustitución de aminoácidos conservativa preferidos: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alaninavalina, ácido aspártico-ácido-glutámico y asparagina-glutamina.

Puede realizarse un alineamiento óptimo de secuencias para su comparación mediante el algoritmo de identidad local de Smith y Waterman (1981) Add. APL. Math. 2: 482, mediante el algoritmo de alineamiento de identidad de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443, mediante el procedimiento de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 2444, mediante aplicaciones informatizadas de esos algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr. Madison, WI) o mediante inspección.

Un ejemplo preferido de algoritmos que son adecuados para determinar porcentajes de identidad de secuencia y similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul y col. (1977) Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402 y Altschul y col. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410, respectivamente. Se usan BLAST y BLAST 2.0, con los parámetros descritos en el presente documento, para determinar el porcentaje de identidad de secuencia para los ácidos nucleicos y proteínas de la invención. El programa informático para realizar análisis BLAST está disponible públicamente a través del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Las puntuaciones acumulativas se calculan usando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación positiva para un par de restos emparejados; siempre >0) y N (puntuación negativa para restos emparejados erróneamente; siempre <0). Para secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de las coincidencias de palabras en cada dirección se detienen cuando: la puntuación acumulativa del alineamiento disminuye en una cantidad X de su valor máximo alcanzado; la puntuación acumulativa se hace cero o menos, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de restos con puntuaciones negativas; o se alcanza el extremo de cualquiera de las secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST, W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una esperanza

(E) de 10, M = 5, N = -4 y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa por efecto una longitud de palabra de 3, y una esperanza (E) de 10 y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915) alineamientos (B) de 50, esperanza (E) de 10, M = 5, N = -4 y una comparación de ambas cadenas.

Otro indicio de que las secuencias de nucleótidos son sustancialmente idénticas es si dos moléculas hibridan entre sí, o con un tercer ácido nucleico, en condiciones moderadamente y, preferentemente, altamente rigurosas. Las condiciones rigurosas son dependientes de secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Las secuencias más largas hibridan específicamente a temperaturas más altas. Se encuentra una amplia guía para la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays” (1993). Generalmente, las condiciones rigurosas se seleccionan para que estén aproximadamente 5-10ºC por debajo del punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (a fuerza iónica y pH definidos) a la que el 50% de la secuencia diana hibrida con una sonda perfectamente emparejada. Típicamente, las condiciones rigurosas serán aquellas en las que la concentración salina sea inferior a aproximadamente 1,0 M de ión de sodio, típicamente una concentración de aproximadamente 0,01 a 1,0 M de ión de sodio (u otras sales) a pH de 7,0 a 8,3 y la temperatura sea de al menos aproximadamente 30ºC para sondas cortas (por ejemplo, de 10 a 50 nucleótidos) y de al menos aproximadamente 60ºC para sondas largas (por ejemplo, de más de 50 nucleótidos). También pueden conseguirse condiciones rigurosas con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida. Para una hibridación selectiva o específica, una señal positiva es de al menos dos veces la del fondo, preferentemente 10 veces la hibridación de fondo.

Pueden ser condiciones de hibridación rigurosas ejemplares las siguientes: formamida al 50%, SSC 5x y SDS al 1%, incubando a 42ºC, o SSC 5x, SDS al 1%, incubando a 65ºC, con lavado en SSC 0,2x y SDS al 0,1% a 65ºC.

Para el propósito de la invención, las “condiciones moderadamente rigurosas” adecuadas incluyen, por ejemplo, prelavar en una solución de SSC 5 X, SDS al 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH 8,0), hibridar a 50ºC-65ºC, SSC 5X durante una noche, seguido de lavar dos veces a 65ºC durante 20 minutos con cada uno de SSC 2X, 0,5X y 0,2X (que contienen SDS al 0,1%). Dichas secuencias de ADN de hibridación también se incluyen en el ámbito de la presente invención.

La “proliferación de células T” como se describe en el presente documento, incluye la multiplicación de células T, así como la estimulación de células T que conduce a su multiplicación, es decir, el inicio de acontecimientos que conducen a mitosis y la propia mitosis. Se analizan a continuación procedimientos para detectar la proliferación de células T.

PROTEÍNAS DE FUSIÓN DE LA INVENCIÓN

A. Dominios intra-y extracelulares de la proteína HER-2/neu

La proteína HER-2/neu se seleccionó como una diana para vacunas anticáncer basándose en observaciones de HER-2/neu como se han descrito anteriormente. Uno de los mayores obstáculos para este enfoque es la dificultad de aislar una cantidad suficiente de proteína HER-2/neu. Un intento de abordar este problema fue expresar el ECD y el ICD por separado en células de mamífero. El ECD se expresaba a un alto nivel como proteína secretada, es decir, aproximadamente 20 mg de la proteína ECD se purificaron a partir de un cultivo celular de ratón de un litro. Sin embargo, el nivel de expresión de ICD era bajo, es decir, sólo se purificaron aproximadamente 0,2 mg de la proteína ICD a partir de un litro de células HEK-293. Además, la proteína ICD resultante era muy lábil en el lisado celular, creando numerosos problemas inesperados para la purificación de cantidades útiles.

Como se ha discutido anteriormente, HER-2/neu es una proteína propia oncogénica y la tolerancia inmunológica a proteínas propias puede frustrar la respuesta inmune. El nivel de tolerancia inmunológica a diferentes porciones de cualquier proteína particular puede depender de si la porción expresada de la proteína reside dentro o fuera de la membrana celular. El ECD reside en la superficie celular y se desprende. Por el contrario, el ICD y porciones del mismo residen dentro de la célula y no se desprenden. El ECD entra en contacto fácilmente con el sistema inmune del cuerpo, mientras que el ICD y las porciones del mismo están relativamente aislados del sistema inmune del cuerpo. Como resultado, el nivel de tolerancia inmunológica a ECD es mayor que a la porción de ICD de la proteína HER-2/neu. Por lo tanto, para vacunas de acuerdo con la presente invención, la proteína ICD y los péptidos ICD y variantes de los mismos, incluyendo proteínas PD y péptidos PD, inducen un nivel relativamente mayor de respuesta inmune que la proteína ECD y los péptidos ECD.

Aunque el ICD y sus variantes son más inmunogénicos que el ECD y sus variantes, el anticuerpo contra ECD y sus variantes es beneficioso y posiblemente deseable. El ECD reside en la superficie celular mientras que el ICD y las porciones del mismo no se secretan y están aislados en el interior de la célula. Por lo tanto, las respuestas de anticuerpos contra el ECD pueden tener un mayor beneficio terapéutico y en consecuencia se prefieren de acuerdo con la invención. El ECD por sí mismo no es muy inmunogénico. Puesto que el ICD (incluyendo el PD y el ΔPD) es más inmunogénico que el ECD, la proteína de fusión de ECD-ICD y/o la proteína de fusión de ECD-PD es más inmunogénica que el ECD solo. Se espera que la proteína de fusión de ECD-ICD y/o la proteína de fusión de ECD-PD sea más eficaz para inducir anticuerpos contra el ECD que el ECD por sí solo.

En la presente invención, el ECD o sus variantes se combinan, unen o fusionan (directa

o indirectamente) con el PD o sus variantes. El ECD proporciona la conformación estructural para inducir anticuerpos que reaccionen con la proteína HER-2/neu en la superficie celular, mientras que el PD aumenta la inmunogenicidad del ECD. La combinación es sorprendentemente más eficaz para inducir una respuesta inmune contra el ECD que el ECD por sí solo.

El ECD, o porciones del ECD, pueden combinarse con el PD o sus variantes, incluyendo porciones del PD (por ejemplo, el ΔPD). El ECD de la presente invención es preferentemente un ECD humano, de ratón o de rata. El ECD humano se expone en la Fig. 9 y como SEC ID Nº: 3. El ECD de rata se expone en la Fig. 14 y como SEC ID Nº: 8.

El ICD de la presente divulgación es preferentemente un ICD humano, de ratón o de rata. El ICD humano se expone en la Fig. 7 y en la SEC ID Nº: 1 que abarca la región de Lys 676 a Val 1255, ambos inclusive. El ICD de rata se expone en la Fig. 8 y en la SEC ID Nº: 2 que abarca la región Lys 677 a Val 1256, ambos inclusive.

El PD de la presente invención es preferentemente un PD humano, de rata o ratón. El PD humano se expone en la Fig. 10 y como SEC ID Nº: 4. El PD humano puede ser el ΔPD humano, que se expone en la Fig. 11 y como SEC ID Nº: 5. El PD de rata se muestra en la Fig. 8 y en la SEC ID Nº: 2 que abarca la región de Gln 991 a Val 1256, ambos inclusive. El PD de rata puede ser el ΔPD de rata, que se muestra en la Fig. 8 y en la SEC ID Nº: 2 que abarca la región de Gln 991 a Arg 1049, ambos inclusive.

En una realización, un ECD humano puede fusionarse con un PD o ΔPD humano, o un PD o ΔPD de rata. En otra realización, un ECD de rata puede fusionarse con un PD o ΔPD humano, o un PD o ΔPD de rata.

El PD de HER-2/neu tiene 268 aminoácidos de longitud, es intracelular y puede fosforilarse por proteína tirosina quinasas. Esta región no comparte identidad con la parte correspondiente de otros receptores tirosina quinasa. Por lo tanto, la especificidad y singularidad de este dominio lo hace particularmente preferido para su uso como una vacuna contra tumores. Sin embargo, la expresión de este dominio por sí solo en bacterias y células de mamífero es problemática. Por ejemplo, la proteína PD resultante es muy lábil y no es apropiada para una producción a gran escala. En una realización, esta invención ha resuelto dichos problemas mediante la fusión de todo o parte del dominio intracelular o del dominio de fosforilación con todo o parte del dominio extracelular de HER-2/neu. Las proteínas de fusión de ECD-ICD y las proteínas de fusión de ECD-PD de la invención y la divulgación son solubles, se secretan y son estables en medios de cultivo. Este sistema puede proporcionar grandes cantidades de proteína de dominio intracelular o dominio de fosforilación para el desarrollo de vacunas contra el cáncer, preferentemente el desarrollo de vacunas contra el cáncer de mama, pero serán útiles para vacunas contra cualquier cáncer caracterizado por expresión de HER-2/neu. Además de permitir un aumento de la expresión del dominio intracelular o dominio de fosforilación, o variantes de los mismos, como una proteína de fusión con el dominio extracelular o sus variantes, las proteínas de fusión de ECD-ID y ECD-PD posibilitan una formulación de vacuna mejorada.

El PD se secretó mediante la introducción de una secuencia señal de secreción que precedía al extremo N-terminal del PD para producir una proteína recombinante secretada soluble. El proceso de secreción se prefiere ya que las proteínas recombinantes se acumulan en los medios de cultivo. Debido a que la proteína no está asociada con las proteínas intracelulares, la proteolisis es limitada. La proteína debería purificarse más fácilmente y económicamente.

Como se describe en el Ejemplo 3, el plásmido de expresión pFLAGCMV-1 (Kodak) se usó para determinar qué región del dominio intracelular de HER-2/neu podía secretarse. Las proteínas se expresaron como proteínas de fusión con una señal de secreción de preprotripsina y marcador FLAG en su extremo N-terminal. Las células HEK-293 se transfectaron con dichas construcciones y las células y medios de cultivo se ensayaron con respecto a proteínas de fusión con marcador FLAG mediante transferencia de western con anticuerpo M2 de marcador FLAG como sonda. Los resultados de la Fig. 4 demuestran que no se secretaron ni el ICD de longitud completa ni el KD, pero que el PD era soluble y se secretaba y detectaba en los medios de cultivo. Los resultados indican que la proteína ICD o KD de estructura de longitud completa no daban como resultado secreción, es decir, paso de la proteína a través de la membrana celular.

Como se describe en el Ejemplo 4, puesto que el ECD tiene una secuencia señal de secreción y puede expresarse bien como proteína secretada, el ECD se usó como compañero de fusión para PD. La proteína de fusión de ECD-PD se expresó en células HEK-293. La secreción de proteínas de fusión de ECD-PD soluble se determinó mediante ensayo ELISA con anticuerpos específicos de ECD de HER-2/neu, seguido de transferencia de western con anticuerpos específicos de PD de HER-2/neu. Como se muestra en la Fig. 6, el ECD-PD soluble se expresó en HEK-293 y se secretó al medio de cultivo.

B. Inmunogenicidad de las proteínas de fusión de la invención

En una realización preferida, la presente invención se refiere a una proteína de fusión basada en porciones particulares (por ejemplo, proteína de fusión de ECD-PD de HER-2/neu) del producto de expresión proteico del gen de HER-2/neu, que es capaz de inducir una respuesta de anticuerpos y puede reconocerse por linfocitos dependientes del timo (“células T”). Por consiguiente, la respuesta inmune de células T autóctona puede usarse de forma profiláctica o para tratar tumores malignos en los que HER-2/neu esté o se haya sobreexpresado. En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso de moléculas de ácido nucleico que dirigen la expresión de dichas proteínas de fusión de ECD-ICD o proteínas de fusión de ECD-PD, o sus variantes, solas o en un vector viral para inmunización.

En general, se considera que las poblaciones de células T CD4+ funcionan como auxiliares o inductores a través de la liberación de linfocinas cuando se estimulan por un antígeno específico; sin embargo, un subconjunto de células CD4+ puede actuar como linfocitos T citotóxicos (CTL). De forma similar, se considera que las células T CD8+ funcionan lisando directamente dianas antigénicas; sin embargo, en una diversidad de circunstancias pueden secretar linfocinas para proporcionar una función auxiliar o DTH. A pesar del potencial de la función solapante, los marcadores fenotípicos CD4 y CD8 están asociados con el reconocimiento de péptidos unidos a antígenos de MHC de clase I o clase II. El reconocimiento de antígenos en el contexto de MHC de clase I o clase II exige que las células T CD4+ y CD8+ respondan a diferentes antígenos o al mismo antígeno presentado en circunstancias diferentes. La unión de péptidos inmunogénicos a antígenos de MHC de clase II se produce más comúnmente para antígenos ingeridos por células presentadoras de antígenos.

Como se desvela dentro de la presente divulgación, una proteína de fusión de ECD-ICD

: o una proteína de fusión de ECD-PD del producto de expresión proteico del oncogén de HER-2/neu se reconoce por células T. La proteína de fusión de ECD-ICD de HER-2/neu o la proteína de fusión de ECD-PD de HER-2/neu circulante se degrada en fragmentos peptídicos. Los fragmentos peptídicos de la proteína de fusión de ECD-ICD o la proteína de fusión de ECD-PD se unen a antígenos del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). Mediante la presentación de un péptido unido a un antígeno de MHC en la superficie celular y el reconocimiento por células T del huésped de la combinación de péptido más antígeno propio de MHC, la proteína de fusión de ECD-ICD de HER-2/neu o de ECD-PD de HER-2/neu (incluyendo la que se expresa en una célula tumoral maligna) será inmunogénica para células

T.: La intensa especificidad del receptor de células T permite que células T individuales discriminen entre fragmentos de proteínas que difieren en un único resto aminoacídico.

Durante la respuesta inmune contra un fragmento peptídico de la proteína de fusión de ECD-ICD o la proteína de fusión de ECD-PD, las células T que expresen un receptor de células T con alta afinidad de unión al complejo de péptido-MHC se unirán al complejo de péptido-MHC y de ese modo se activarán y se inducirá su proliferación. En el primer encuentro con un péptido, un número pequeño de células T inmunes secretarán linfocinas, proliferarán y se diferenciarán en células T efectoras y de memoria. La respuesta inmune primaria sucederá in vivo, pero ha sido difícil detectarla in vitro. Un encuentro posterior con el mismo antígeno por las células T de memoria conducirá a una respuesta inmune más rápida y más intensa. La respuesta secundaria se producirá in vivo o in vitro. La respuesta in vitro se estima fácilmente midiendo el grado de proliferación, el grado de producción de citocinas o la generación de actividad citolítica de la población de células T reexpuestas al antígeno. Una proliferación sustancial de la población de células T en respuesta a un antígeno particular se considera indicativa de una exposición previa o sensibilización con el antígeno.

C. Proteínas de fusión de la invención

En una realización, los compuestos de la presente invención comprenden proteínas de fusión de ECD-PD de HER-2/neu, o variantes o moléculas de ácido nucleico que codifican dichas proteínas de fusión de ECD-PD. En una realización, el ECD de HER-2/neu está fusionado con el ΔPD de HER-2/neu. Preferentemente, las moléculas de ácido nucleico son moléculas de ADN. En las proteínas de fusión de ECD-PD de HER-2/neu de la invención, los componentes polipeptídicos EDC y PD o ΔPD pueden fusionarse directamente o fusionarse mediante un engarce, por ejemplo, un engarce peptídico. En una realización preferida, la proteína de fusión de ECD-PD de la presente invención comprende el ECD de HER-2/neu fusionado directamente con el PD de HER-2/neu o con el ΔPD de HER-2/neu. Aquí y durante toda la memoria descriptiva, una realización preferida de las proteínas de fusión de la invención es la proteína de fusión de PD de HER-2/neu.

En otra realización, el tamaño del ECD en la proteína de fusión de ECD-PD se altera mediante la eliminación secuencial en cualquier parte de entre 1 y aproximadamente 100 aminoácidos del extremo carboxilo terminal del ECD, preferentemente aproximadamente 100 aminoácidos. De forma similar, el tamaño del PD en la proteína de fusión de ECD-PD puede alterarse mediante la eliminación secuencial de aminoácidos del extremo N-terminal del PD. De nuevo, la realización preferida es PD. Pueden seleccionarse otras formas variantes basándose en su antigenicidad y/o inmunogenicidad usando procedimientos de exploración apropiados como se describe en la bibliografía y en el presente documento, para su uso de acuerdo con la invención.

La Tabla 1 muestra que eliminar 100 aminoácidos del extremo carboxilo terminal del ECD no tiene ningún impacto sobre el nivel de expresión y la estabilidad de la proteína de fusión de ECD-PD.

Tabla 1: Sumario de ECDtruncado-PD

I.D. del clon: Área de deleción (pb/aa) Nº de pb Nº de aa Expresión relativa

A5: 1655-1882/552-628 228 76 ***

B4: 1660-1866/554-622 207 69 **

B9: 1595-1891/532-631 297 99 **

C2: 1681-1902/561-634 222 74 *

C7: 1612-1902/538-634 291 97 *****

F10: 1634-1951/545-651 318 106 ****

ECD-PD WT: - - - *

Las variantes de la proteína de fusión de ECD-PD también incluyen diversas formas estructurales de la proteína de fusión de ECD-PD nativa. Debido a la presencia de grupos amino y carboxilo ionizables, por ejemplo, una proteína de fusión de ECD-PD puede estar en

5 forma de una sal ácida o básica, o puede estar en forma neutra. También pueden modificarse restos aminoacídicos individuales por oxidación o reducción.

Otras variantes dentro del ámbito de la invención incluyen proteínas de fusión de ECDPD en las que la proteína ECD-PD de HER-2/neu nativa de estructura de aminoácidos primaria, respectivamente, está modificada por la formación de conjugados covalentes o

10 agregantes con otros péptidos o polipéptidos, o restos químicos tales como grupos glicosilo, lípidos, fosfato, grupos acetilo y similares. Pueden prepararse derivados covalentes, por ejemplo, mediante la unión de grupos funcionales particulares a cadenas laterales de aminoácidos o al extremo N-o C-terminal. La presente invención también incluye proteínas de fusión de ECD-PD de HER-2/neu

15 con o sin glicosilación. Las proteínas de fusión de ECD-PD expresadas en sistemas de expresión de levaduras o de mamíferos pueden ser similares a, o ligeramente diferentes en peso molecular y patrón de glicosilación de, las moléculas nativas, dependiendo del sistema de expresión. La expresión de ADN que codifica polipéptidos en bacterias tales como E. coli proporciona típicamente moléculas no glicosiladas. Los sitios de N-glicosilación de proteínas

20 eucariotas se caracterizan por el triplete de aminoácidos Asn-A1-Z, en el que A1 es cualquier aminoácido excepto Pro y Z es Ser o Thr. Las variantes de proteínas de fusión de ECD-PD de HER-2/neu que tienen sitios de N-glicosilación inactivados pueden producirse mediante técnicas conocidas para el experto en la materia, tales como síntesis y ligación de oligonucleótidos o técnicas de mutagénesis específica, y están dentro del ámbito de la

25 invención. Como alternativa, pueden añadirse sitios de glicosilación ligada a N a una proteína de fusión de ECD-PD de HER-2/neu. Las proteínas de fusión de ECD-ICD de la presente divulgación, que se entenderá que incluye variantes, incluyen cualquier combinación posible entre polipéptidos humanos y no humanos. Los polipéptidos no humanos comprenden polipéptidos de cualquier mamífero, tal

30 como, por ejemplo, rata, ratón, cobaya, caballo, vaca, cerdo, oveja, perro, etc. En una

realización, las proteínas de fusión de ECD-ICD incluyen:

(i): proteínas de fusión de ECD humano-ICD humano, tales como las formadas por unión del ECD humano de la Figura 9 (SEC ID Nº 3) con el ICD humano, que es la secuencia de aminoácidos que abarca de Lys 676 a Val 1255, ambos inclusive, como se muestra en la Figura 7 (SEC ID Nº 1) con o sin un grupo de enlace químico y/o de aminoácidos, y variantes de las mismas;

(ii): proteínas de fusión de ECD de rata-ICD de rata, tales como las formadas por unión del ECD de rata de la Figura 14 (SEC ID Nº 8) con el ICD de rata, que es la secuencia de aminoácidos que abarca de Lys 677 a Val 1256, ambos inclusive, como se muestra en la Figura 8 (SEC ID Nº 2), con o sin un grupo de enlace químico y/o de aminoácidos, y variantes de las mismas;

(iii) proteínas de fusión de ECD humano-ICD de rata, tales como las formadas por unión del ECD humano mostrado en la Figura 9 (SEC ID Nº 3) con el ICD de rata, que es la secuencia de aminoácidos que abarca de Lys 677 a Val 1256, ambos inclusive, como se muestra en la Figura 8 (SEC ID Nº 2) con o sin un grupo de enlace químico y/o de aminoácidos, y variantes de las mismas; y

(iv) proteínas de fusión de ECD de rata-ICD humano, tal como las formadas por unión del ECD de rata, como se muestra en la Figura 14 (SEC ID Nº 8), con el ICD humano, que es la secuencia de aminoácidos que abarca de Lys 676 a Val 1255, ambos inclusive, como se muestra en la Figura 7 (SEC ID Nº 1), con o sin un grupo de enlace químico y/o de aminoácidos, y variantes de las mismas.

Cualquier variante de las proteínas de fusión de ECD-ICD de la presente divulgación está incluida como realización de la presente divulgación. En una realización, dichas variantes son sustancialmente idénticas o sustancialmente similares a la proteína ECD-ICD de HER-2/neu nativa y conservan la capacidad para estimular una respuesta inmune. Las secuencias de ADN humano que codifican la proteína ECD se muestran, por ejemplo, en la Figura 15 (SEC ID Nº 9), que abarca del nucleótido 1 al nucleótido 1959, ambos inclusive. Las secuencias de ADN humano que codifican la proteína ICD se muestran, por ejemplo, en la Figura 15 (SEC ID Nº 9), que abarca del nucleótido 2026 al nucleótido 3765, ambos inclusive. El efecto de cualquier modificación de la secuencia sobre la capacidad de una proteína ECDICD de HER-2/neu para producir una respuesta inmune puede determinarse fácilmente, por ejemplo, analizando la capacidad de la proteína ECD-ICD de HER-2/neu mutada para inducir una respuesta de células T usando, por ejemplo, los procedimientos descritos en el presente documento, o analizando la capacidad de la proteína ECD-ICD de HER-2/neu mutada para producir anticuerpos.

Las proteínas de fusión de ECD-PD de la presente invención, que se entenderá que incluyen variantes, incluyen cualquier posible combinación entre polipéptidos humanos y no humanos. Los polipéptidos no humanos comprenden, por ejemplo, rata, ratón, cobaya, caballo, vaca, cerdo, oveja, perro, etc. En una realización, las proteínas de fusión de ECD-PD incluyen:

(i): proteínas de fusión de ECD humano-PD humano, tal como se muestra en la Figura 12 (SEC ID Nº 6), y variantes de las mismas, incluyendo proteínas de fusión formadas por unión del ECD humano de la Figura 9 (SEC ID Nº 3) con el PD humano de la Figura 10 (SEC ID Nº 4) con o sin un grupo de enlace químico y/o de aminoácidos, y variantes de las mismas;

(ii): proteínas de fusión de ECD de rata-PD de rata, tales como las formadas por unión del ECD de rata de la Figura 14 (SEC ID Nº 8) con el PD de rata, que es la secuencia de aminoácidos que abarca de Gln 991 a Val 1256, ambos inclusive, como se muestra en la Figura 8 (SEC ID Nº 2), con o sin un grupo de enlace químico y/o de aminoácidos, y variantes de las mismas;

(iii) proteínas de fusión de ECD humano-PD de rata, tales como las formadas por unión del ECD humano mostrado en la Figura 9 (SEC ID Nº 3) con el PD de rata, que es la secuencia de aminoácidos que abarca de Gln 991 a Val 1256, ambos inclusive, como se muestra en la Figura 8 (SEC ID Nº 2), con o sin un grupo de enlace químico y/o de aminoácidos, y variantes de las mismas; y

(iv) proteínas de fusión de ECD de rata-PD humano, tales como las formadas por unión del ECD de rata, como se muestra en la Figura 14 (SEC ID Nº 8) con el PD humano, como se muestra en la Figura 10 (SEC ID Nº 4) con o sin un grupo de enlace químico y/o de aminoácidos, y variantes de las mismas.

Cualquier variante de las proteínas de fusión de ECD-PD de la presente invención está incluida como realización de la presente invención. En una realización, dichas variantes son sustancialmente idénticas o sustancialmente similares a la proteína ECD-PD de HER-2/neu nativa y conservan la capacidad para estimular una respuesta inmune. Las secuencias de ADN humano que codifican la proteína ECD se muestran, por ejemplo, en la Figura 15 (SEC ID Nº 9), que abarca del nucleótido 1 al nucleótido 1959, ambos inclusive. Las secuencias de ADN humano que codifican la proteína PD se muestran, por ejemplo, en la Figura 15 (SEC ID Nº 9), que abarca del nucleótido 2968 al nucleótido 3765, ambos inclusive. El efecto de cualquier modificación de secuencia sobre la capacidad de una proteína ECD-PD de HER-2/neu para producir una respuesta inmune puede determinarse fácilmente, por ejemplo, analizando la capacidad de la proteína ECD-PD de HER-2/neu mutada para inducir una respuesta de células T usando, por ejemplo, los procedimientos descritos en el presente documento, o analizando la

capacidad de la proteína ECD-PD de HER-2/neu mutada para producir anticuerpos.

En otra realización, las proteínas de fusión de ECD-PD son proteínas de fusión de ECD-ΔPD de la presente invención, que se entenderá que incluyen variantes, incluyendo cualquier posible combinación entre polipéptidos humanos y no humanos. Los polipéptidos no humanos comprenden, por ejemplo, rata, ratón, cobaya, caballo, vaca, cerdo, oveja, perro, etc. En una realización, las proteínas de fusión de ECD-ΔPD incluyen:

(i): proteínas de fusión de ECD humano-ΔPD humano, tal como se muestran en la Figura 13 (SEC ID Nº 7) y variantes de las mismas, incluyendo proteínas de fusión formadas por unión del ECD humano de la Figura 9 (SEC ID Nº 3) con el ΔPD humano de la Figura 11 (SEC ID Nº 5) con o sin un grupo de enlace químico y/o de aminoácidos, y variantes de las mismas;

(ii): proteínas de fusión de ECD de rata-ΔPD de rata, tales como las formadas por unión del ECD de rata de la Figura 14 (SEC ID Nº 8) con el ΔPD de rata, que es la secuencia de aminoácidos que abarca de Gln 991 a Arg 1049, ambos inclusive, como se muestra en la Figura 8 (SEC ID Nº 2), con o sin un grupo de enlace químico y/o de aminoácidos, y variantes de las mismas;

(iii) proteínas de fusión de ECD humano-ΔPD de rata, tales como las formadas por unión del ECD humano mostrado en la Figura 9 (SEC ID Nº 3) con el ΔPD de rata, que es la secuencia de aminoácidos que abarca de Gln 991 a Arg 1049, ambos inclusive, como se muestra en la Figura 8 (SEC ID Nº 2), con o sin un grupo de enlace químico y/o de aminoácidos, y variantes de las mismas; y

(iv) proteínas de fusión de ECD de rata-ΔPD humano, tal como las formadas por unión del ECD de rata, como se muestra en la Figura 14 (SEC ID Nº 8), con el ΔPD humano, como se muestra en la Figura 11 (SEC ID Nº 5), con o sin un grupo de enlace químico y/o de aminoácidos, y variantes de las mismas.

Cualquier variante de las proteínas de fusión de ECD-ΔPD de la presente invención se incluye como realización de la presente invención. En una realización, dichas variantes son sustancialmente idénticas o sustancialmente similares a la proteína ECD-ΔPD de HER-2/neu nativa y conservan la capacidad para estimular una respuesta inmune. Se muestran secuencias de ADN humano que codifican la proteína ECD, por ejemplo, en la Figura 15 (SEC ID Nº 9), que abarca del nucleótido 1 al nucleótido 1959, ambos inclusive. Se muestran secuencias de ADN humano que codifican la proteína ΔPD, por ejemplo, en la Figura 15 (SEC ID Nº 9), que abarca del nucleótido 2968 al nucleótido 3144, ambos inclusive. El efecto de cualquier modificación de secuencia sobre la capacidad de una proteína ECD-ΔPD de HER-2/neu para producir una respuesta inmune puede determinarse fácilmente, por ejemplo, analizando la capacidad de la proteína de ECD-ΔPD de HER-2/neu mutada para inducir una respuesta de células T usando, por ejemplo, los procedimientos descritos en el presente documento, o analizando la capacidad de la proteína ECD-ΔPD de HER-2/neu mutada para producir anticuerpos.

En una realización preferida, las proteínas de fusión de ECD-PD de HER-2/neu de la invención son proteínas de fusión de ECD-PD.

Dentro de ciertas realizaciones específicas, las proteínas de fusión de la invención pueden comprender un compañero de fusión, tal como, por ejemplo, un compañero de fusión inmunológica o un potenciador de la expresión. Un compañero de fusión puede, por ejemplo, ayudar a proporcionar epítopes de T auxiliares (un compañero de fusión inmunológico), preferentemente epítopes de T auxiliares reconocidos por seres humanos, o puede ayudar a expresar la proteína de fusión (un potenciador de la expresión) a mayores rendimientos que la proteína de fusión recombinante. Ciertos compañeros de fusión preferidos son compañeros de fusión tanto inmunológicos como potenciadores de la expresión. Pueden seleccionarse otros compañeros de fusión para aumentar la solubilidad de la proteína de fusión o permitir que la proteína de fusión se dirija a compartimentos intracelulares deseados. Otros compañeros de fusión adicionales incluyen marcadores de afinidad, que facilitan la purificación de la proteína de fusión.

También se proporcionan proteínas de fusión que comprenden un polipéptido de fusión como se describe en el presente documento junto con una proteína inmunogénica no relacionada. Preferentemente, la proteína inmunogénica es capaz de inducir una respuesta de recuerdo. Los ejemplos de dichas proteínas incluyen proteínas del tétanos, de la tuberculosis y de la hepatitis (véase, por ejemplo, Stoute y col (1997) New Engl. J. Med. 336:86-91).

En otras realizaciones, un compañero de fusión inmunológico deriva de la proteína D, una proteína de superficie de la bacteria gram-negativa Haemophilus influenzae B (documento WO 91/18926). Preferentemente, un derivado de proteína D comprende aproximadamente el primer tercio de la proteína (por ejemplo, los primeros 100-110 aminoácidos N-terminales) y un derivado de proteína D puede estar lipidado. Dentro de ciertas realizaciones preferidas, los primeros 109 restos de un compañero de fusión de Lipoproteína D están incluidos en el extremo N-terminal para proporcionarle a la proteína de fusión epítopes de células T exógenos adicionales y para aumentar el nivel de expresión en E. coli (funcionando de este modo como un potenciador de la expresión). La cola lipídica asegura una presentación óptima de la proteína de fusión a células presentadoras de antígeno. Otros compañeros de fusión incluyen la proteína no estructural del virus de la gripe, NS1 (hemaglutinina). Típicamente, se usan los 81 aminoácidos N-terminales, aunque pueden usarse diferentes fragmentos que incluyen epítopes de T

auxiliares.

En otra realización, el compañero de fusión inmunológico es la proteína conocida como LYTA, o una porción de la misma (preferentemente una porción C-terminal). LYTA procede de Steptococcus pneumoniae, que sintetiza una N-acetil-L-alanina amidasa conocida como amidasa LYTA (codificada por el gen LytA; Gene 43: 265-292, 1986). LYTA es una autolisina que degrada específicamente ciertos enlaces en la cadena principal de peptidoglicano. El dominio C-terminal de la proteína LYTA es responsable de la afinidad con la colina o con algunos análogos de colina, tales como DEAE. Esta propiedad se ha aprovechado para el desarrollo de plásmidos de expresión de C-LYTA en E. coli útiles para la expresión de proteínas de fusión. Se ha descrito la purificación de proteínas híbridas que contienen el fragmento de C-LYTA en el extremo amino terminal (véase Biotechnology 10:795-798, 1992). Dentro de una realización preferida, puede incorporarse una porción de repetición de LYTA en una proteína de fusión. Una porción de repetición se encuentra en la región C-terminal partiendo del resto 178. Una porción de repetición particularmente preferida incorpora los restos 188-205.

En una realización preferida, las proteínas de fusión de la presente invención comprenden adicionalmente un compañero de fusión. Los compañeros de fusión preferidos incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, Ra12 o LeIF. En particular, la invención proporciona materiales y procedimientos para usar una secuencia de Ra12 o LeIF como compañero de fusión para facilitar la expresión estable y de alto rendimiento de polipéptidos de fusión recombinantes o romper la tolerancia.

Ra12 es un fragmento C-terminal de 14 kD de la secuencia codificante de MTB32A de M. tuberculosis, que se expresa a altos niveles por sí misma y sigue siendo soluble durante todo el procedimiento de purificación. LeIF es un antígeno de Leishmania que es homólogo a la proteína ribosómica eucariota eIF y que es capaz de estimular una respuesta inmune de Th1 y/o CTL (Véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos Nº 5.876.966, 5.876.735 y 5.879.687). La presente invención utiliza esas propiedades de los polipéptidos Ra12 y LeIF y proporciona moléculas de ácido nucleico recombinantes; vectores de expresión, células huésped y procedimientos para una expresión estable y de alto rendimiento de los polipéptidos de fusión que comprenden, además de los polipéptidos de fusión de HER-2/neu, un polipéptido Ra12 o LeIF. Pueden construirse fácilmente ácidos nucleicos recombinantes, que codifican un polipétido de fusión que comprende un polipéptido Ra12 o LeIF y una proteína de fusión de interés, mediante técnicas de ingeniería genética convencionales. Se construyen ácidos nucleicos recombinantes de modo que, preferentemente, la secuencia polinucleotídica del compañero de fusión se localiza 5' a una secuencia de proteína de fusión seleccionada. También puede ser apropiado colocar una secuencia polinucleotídica de compañero de fusión 3' a la secuencia polinucleotídica de la proteína de fusión de interés o insertar la secuencia polinucleotídica de la proteína de fusión en un sitio dentro de una secuencia polinucleotídica de compañero de fusión. Además, puede usarse cualquier polinucleótido adecuado que codifique un compañero de fusión

o una porción u otra variante del mismo, como se describe en el presente documento, en la construcción de ácidos nucleicos de fusión recombinantes de la presente invención.

Pueden prepararse ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos compañeros de fusión de la presente invención mediante cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica. Los procedimientos ejemplares incluyen clonación y restricción de secuencias apropiadas o síntesis química directa por procedimientos tales como el procedimiento de fosfotriéster de Narang y col. (1979) Meth. Enzymol. 68: 90-99; el procedimiento de fosfodiéster de Beaucage y col. (1981) Tetra. Lett., 22: 1859-1862; y el procedimiento de soporte sólido de la patente de Estados Unidos Nº 4.458.066.

Pueden prepararse ácidos nucleicos recombinantes que codifican un polipéptido de fusión que comprende un polipéptido compañero de fusión y una proteína de fusión seleccionada usando cualquier procedimiento conocido en la técnica. Como se ha descrito anteriormente, se construyen ácidos nucleicos recombinantes de modo que, preferentemente, la secuencia polinucleotídica del compañero de fusión se localice 5' a la secuencia polinucleotídica que codifica la proteína de fusión de interés. Las secuencias polinucleotídicas del compañero de fusión y de la proteína de fusión también pueden modificarse para facilitar su fusión y su posterior expresión.

Los ácidos nucleicos recombinantes pueden comprender adicionalmente otras secuencias de nucleótidos tales como secuencias que codifican marcadores de afinidad para facilitar el protocolo de purificación de proteínas

D. Variantes de las proteínas de fusión de la invención

Los células T CD4+ generalmente reconocen antígenos que han sido externos a las células tumorales. Por el contrario, en circunstancias normales, la unión de péptidos a MHC de clase I sólo se produce para proteínas presentes en el citosol y sintetizadas por la propia diana, se excluyen las proteínas del entorno externo. Una excepción a esto es la unión de péptidos exógenos con un motivo de unión de clase I preciso que está presente fuera de la célula en alta concentración. Por lo tanto, las células T CD4+ y CD8+ tienen funciones ampliamente diferentes y tienden a reconocer antígenos diferentes como un reflejo de dónde residen normalmente los antígenos.

Otro modo de realizar sustituciones de aminoácidos para producir variantes de la presente invención es identificar y reemplazar aminoácidos en motivos de células T con potencial para unirse a moléculas del MHC de clase II (para una respuesta de células T CD4+) o moléculas

del MHC de clase I (para una respuesta de células T CD8+). Pueden identificarse segmentos peptídicos (de una proteína de fusión de ECD-PD de HER-2/neu) con un motivo con potencial teórico para unirse a moléculas del MHC de clase II mediante análisis informático. Por ejemplo, puede usarse un paquete de análisis de secuencias proteicas, T Sites, que incorpora varios 5 algoritmos informáticos diseñados para distinguir sitios potenciales para el reconocimiento de células T (Feller y col. (1991) Nature, 349:720-721). Se usan dos algoritmos de búsqueda: (1) el algoritmo AMPHI descrito por Margalit (Feller y col. (1991) Nature, 349:720-721; Margalit y col. (1987) J. Immunol., 138:2213-2229) identifica motivos de epítopes de acuerdo con su periodicidad de alfa-hélices y su anfipaticidad; (2) el algoritmo de Rothbard y Taylor identifica 10 motivos de epítopes de acuerdo con su patrón de carga y polaridad (Rothbard y col. (1988) EMBO, 7:93-100). Los segmentos con ambos motivos son los más apropiados para la unión a moléculas del MHC de clase II. Las células T CD8+ reconocen péptidos unidos a moléculas del MHC de clase I. Parker y col. (1994) J. Immunol., 152:163 han determinado que los péptidos que se unen a moléculas del MHC particulares comparten motivos de secuencia apreciables. Un 15 motivo peptídico para la unión en la hendidura de HLA-A2.1 se ha definido por degradación de Edman de péptidos separados de moléculas HLA-A2.1 de una línea celular cultivada (Tabla 2, de Falk y col. (1991) Nature, 351:290-296). El procedimiento identificó que el péptido de unión a HLA-A2.1 típico o promedio tenía una longitud de 9 aminoácidos con restos de anclaje dominantes que aparecen en las posiciones 2 (L) y 9 (V). Se han identificado restos de unión 20 fuerte que aparecen comúnmente en las posiciones 2 (M), 4 (E, K), 6 (V) y 8 (K). El motivo

identificado representa el promedio de muchos péptidos de unión.

Tabla 2: El motivo restringido por HLA-A2.1

Posición de aminoácido: Asignación de puntos

1: 2 3 4 5 6 7 8 9

Resto de anclaje de unión dominante: L V +3

Resto de unión fuerte: M E K V K +2

Resto de unión débil: I L F K A Y F P G P D T I K Y N I L T A Y H E S L +1

M Y: M G V H

El motivo peptídico derivado, como se define actualmente, no es particularmente riguroso. Algunos péptidos de unión a HLA-A2.1 no contienen ambos restos de anclaje dominantes y los aminoácidos que flanquean los restos de anclaje dominantes juegan papeles principales permitiendo o impidiendo la unión. No todos los péptidos con el motivo de unión descrito actual se unirán, y algunos péptidos sin el motivo se unirán. Sin embargo, el motivo actual es suficientemente válido como para permitir la identificación de algunos péptidos capaces de unirse. Cabe destacar que todas las moléculas del MHC y sus motivos respectivos sitúan 6 aminoácidos entre los aminoácidos de anclaje dominantes en los restos 2 y 9.

Después de la identificación de motivos peptídicos dentro de las proteínas de fusión de ECD-PD de HER-2/neu, pueden realizarse sustituciones de aminoácidos de forma conservativa o no conservativa. Se pretende que este último tipo de sustituciones produzcan una proteína o polipéptido de fusión de ECD-PD mejorado que sea más potente y/o tenga una reactividad cruzada más amplia. Un ejemplo de una proteína o péptido más potente es uno que se une con mayor afinidad a la misma molécula del MHC que la proteína o polipéptido natural, sin afectar al reconocimiento por células T específicas para la proteína o polipéptido natural. Un ejemplo de un polipéptido con una reactividad cruzada más amplia es uno que induzca respuestas inmunes de reactividad cruzada más amplia (es decir, se une a una mayor variedad de moléculas de MHC) que el polipéptido natural. De manera similar, uno o más aminoácidos que residen entre motivos peptídicos y que tienen una función espaciadora (por ejemplo, no interaccionan con una molécula de MHC o un receptor de células T) pueden sustituirse de manera conservativa o no conservativa. Resultará evidente para un experto en la materia que los polipéptidos que contienen una o más sustituciones de aminoácidos pueden ensayarse con respecto a interacciones inmunológicas beneficiosas o adversas mediante una diversidad de ensayos, incluyendo los descritos en el presente documento con respecto a la capacidad de estimular el reconocimiento por células T.

Las variantes dentro del ámbito de la presente invención también, o como alternativa, pueden contener otras modificaciones, incluyendo la deleción o adición de aminoácidos, que tienen una influencia mínima sobre las propiedades inmunológicas deseadas del polipéptido, como se ha descrito anteriormente. Resultará evidente para un experto en la materia que pueden usarse formas truncadas o las formas prolongadas no nativas de una proteína de fusión de ECDPD de HER-2/neu, con tal de que las propiedades inmunológicas deseadas sean al menos aproximadamente equivalentes a las de la proteína de fusión de ECD-PD de HER-2/neu nativa de longitud completa. Los restos de cisteína pueden eliminarse o reemplazarse con otros aminoácidos para evitar la formación de puentes disulfuro intramoleculares incorrectos tras la renaturalización. Otros enfoques para la mutagénesis implican la modificación de restos aminoacídicos dibásicos adyacentes para mejorar la expresión en los sistemas de levadura en los que está presente la actividad proteasa de KEX2.

PREPARAR LAS PROTEÍNAS DE FUSIÓN DE LA INVENCIÓN

A. Polinucleótidos que codifican proteínas de fusión

La invención se refiere a polinucleótidos aislados o purificados que codifican las proteínas de fusión de HER-2/neu. De acuerdo con la invención, puede usarse cualquier secuencia de nucleótidos que codifique la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión para generar moléculas recombinantes que dirigen la expresión de la proteína de fusión.

Para clonar secuencias codificantes de longitud completa o variantes homólogas para generar los polinucleótidos de fusión de HER-2/neu, pueden usarse sondas de ADN marcadas diseñadas a partir de cualquier porción de las secuencias de nucleótidos de HER-2/neu o sus complementarias para explorar una biblioteca genómica o de ADNc, para identificar la secuencia codificante de cada componente individual de la proteína de fusión. Las secuencias de nucleótidos de HER-2/neu pueden ser de cualquier mamífero adecuado, por ejemplo, rata, ratón, caballo, vaca, cerdo, oveja, perro, etc.

En una realización, la secuencia de Her-2/neu es de un ser humano, una rata o un ratón. La secuencia de Her-2/neu de ratón se muestra en la Figura 19 (SEC ID Nº:11). La Her-2/neu de ratón también puede amplificarse a partir de ARN de cerebro de ratón usando los cebadores siguientes: cebador 5’: CCATGGAGCTGGCGGCCTGGTGCCGTTG (SEC ID Nº:12) y cebador 3’: GGCCTTCTGGTTCATACTGGCACATCCAGGC (SEC ID Nº:13). La secuencia de aminoácidos de Her-2/neu de ratón se muestra en la Figura 20 (SEC ID Nº:14). Se describe una secuencia de aminoácidos variante para Her-2/neu de ratón en Nagata y col., J. Immunol. 159: 1336-1343 (1997).

Dichos clones pueden aislarse mediante la exploración de una biblioteca de expresión apropiada para determinar clones que expresen proteína HER-2/neu de longitud completa. La preparación y exploración de la biblioteca generalmente pueden realizarse usando procedimientos conocidos para un experto en la materia, tales como procedimientos descritos en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY (1989), que se incorpora en el presente documento por referencia. Brevemente, una biblioteca de expresión de bacteriófagos puede sembrarse en placas y transferirse a filtros. Después, los filtros pueden incubarse con un reactivo de detección. En el contexto de la presente invención, un "reactivo de detección " es cualquier compuesto capaz de unirse a proteína HER-2/neu, que después puede detectarse mediante cualquiera de una diversidad de medios conocidos para un experto en la materia. Los reactivos de detección típicos contienen un "agente de unión", tal como Proteína A, Proteína G, IgG o una lectina, unida a un grupo indicador. Los grupos indicadores preferidos incluyen enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, colorantes, radionúclidos, grupos luminiscentes, grupos fluorescentes y biotina. Más preferentemente, el grupo indicador es peroxidasa de rábano picante, que puede detectarse mediante incubación con un sustrato tal como tetrametilbenzidina o ácido 2,2’-azino-di-3-etillbenztiazolina sulfónico. Las placas que contienen secuencias genómicas o de ADNc que expresan proteína HER-2/neu se aíslan y purifican mediante técnicas conocidas para un experto en la materia. Pueden encontrarse procedimientos apropiados, por ejemplo, en Sambrook y col., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY (1989).

El aislamiento de secuencias codificantes también puede llevarse a cabo por reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) usando dos conjuntos de cebadores oligonucleotídicos degenerados diseñados basándose en las secuencias codificantes desveladas en el presente documento. Los ácidos nucleicos deseados también pueden clonarse usando otras técnicas de amplificación bien conocidas. Se encuentran ejemplos de protocolos suficientes para dirigir a expertos a través de procedimientos de amplificación in vitro, incluyendo PCR, reacción en cadena de la ligasa (LCR), amplificación por Qβ-replicasa y otras técnicas mediadas por ARN polimerasa en Sambrook, y Ausubel, así como en la patente de Estados Unidos Nº 4.683.202; PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis y col. eds. 1990); Arnheim y Levinson C&EN págs. 36-47 (1 de octubre de 1990); The Journal of NIH Research, 3: 81-94 (1991); Kwoh y col. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173; Guatelli y col. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874; Lomell y col. (1989) J. Clin. Chem. 35:1826; Landegren y col. (1988) Science 241:10771080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8: 291-294; Wu y col. (1989) Gene 4: 560; y Barringer y col. (1990) Gene 89:117. Se describen procedimientos mejorados de clonación in vitro de ácidos nucleicos amplificados en Wallace y col., patente de Estados Unidos Nº 5.426.039. Pueden diseñarse cebadores adecuados para su uso en la amplificación de los ácidos nucleicos de la invención basándose en las secuencias proporcionadas en el presente documento.

De acuerdo con la invención, un polinucleótido de la invención que codifica una proteína de fusión, fragmentos de la misma o equivalentes funcionales de la misma puede usarse para generar moléculas de ácido nucleico recombinantes que dirigen la expresión de la proteína de fusión, fragmentos de la misma o equivalentes funcionales de la misma, en células huésped apropiadas. Los productos de polipéptidos de fusión codificados por dichos polinucleótidos pueden alterarse mediante manipulación molecular de la secuencia codificante.

Debido a la degeneración inherente del código genético, otras secuencias de ADN que codifican sustancialmente la misma o una secuencia de aminoácidos funcionalmente equivalente, pueden usarse en la práctica de la invención para la expresión de los polipéptidos de fusión.

Dichas secuencias de ADN incluyen las que son capaces de hibridar con las secuencias codificantes o sus complementarias desveladas en el presente documento en condiciones de rigurosidad baja, moderada o alta descritas en el presente documento.

Las secuencias de nucleótidos alteradas que pueden usarse de acuerdo con la invención incluyen deleciones, adiciones o sustituciones de diferentes restos nucleotídicos, dando como resultado una secuencia que codifica el mismo producto génico o uno funcionalmente equivalente. El propio producto génico puede contener deleciones, adiciones o sustituciones de restos aminoacídicos, que dan como resultado un cambio silencioso produciendo de este modo un epítope antigénico funcionalmente equivalente. Dichas sustituciones de aminoácidos conservativas pueden realizarse basándose en su similitud en la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los restos implicados. Por ejemplo, los aminoácidos cargados negativamente incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos cargados positivamente incluyen lisina, histidina y arginina; los aminoácidos con grupos de cabeza polares no cargados que tienen valores de hidrofilicidad similares incluyen los siguientes: glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina y tirosina; y los aminoácidos con grupos de cabeza no polares incluyen alanina, valina, isoleucina, leucina, fenilalanina, prolina, metionina y triptófano.

Las secuencias de nucleótidos de la invención pueden modificarse por ingeniería genética para alterar la secuencia codificante de la proteína de fusión para una diversidad de fines, incluyendo, pero sin limitación, alteraciones que modifican el procesamiento y la expresión del producto génico. Por ejemplo, pueden introducirse mutaciones usando técnicas que se conocen bien en la materia, por ejemplo, insertar o delecionar sitios de restricción, alterar patrones de glicosilación, fosforilación, crear y/o destruir secuencias de traducción, inicio y/o terminación, o crear variaciones en las reacciones codificantes para facilitar adicionalmente la modificación in vitro. Un experto reconocerá muchas formas de generar alteraciones en una construcción de ácido nucleico dada. Dichos procedimientos bien conocidos incluyen, por ejemplo, mutagénesis dirigida, amplificación por PCR usando oligonucleótidos degenerados, exposición de células que contienen el ácido nucleico a agentes mutagénicos químicos o radiación, síntesis química de un oligonucleótido deseado (por ejemplo, junto con ligación y/o clonación para generar ácidos nucleicos grandes) y otras técnicas bien conocidas (véase, por ejemplo Giliman y col. (1979) Gene 8:81-97, Hutchinson, y col. (1978) J. Biol. Chem. 253:6551; Roberts y col. (1987) Nature

328: 731-734). Preferentemente, las manipulaciones no destruyen la inmunogenicidad de los polipéptidos de fusión.

En una realización de la invención, la secuencia codificante de una proteína de fusión puede sintetizarse, en su totalidad o en parte, usando procedimientos químicos bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Caruthers y col. (1980) Nuc. Acids Res. Symp. Ser. 7: 215-233; Crea y col. (1980) Nuc. Acids Res. 9(10):2331; Matteucci y col. (1980) Tetrahedron Letter 21:719 (1980); y Chow y col. (1981) Nuc. Acids Res. 9(12):2807-2817).

B. Síntesis de polipéptidos

Como alternativa, el propio polipéptido de fusión puede producirse usando procedimientos químicos para sintetizar una secuencia de aminoácidos completa o en parte. Por ejemplo, pueden sintetizarse péptidos mediante técnicas en fase sólida, tales como, por ejemplo, el procedimiento de síntesis en fase sólida de Merrifield, en el que los aminoácidos se añaden secuencialmente a una cadena de aminoácidos en crecimiento (véase, Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2146). Están disponibles en el mercado equipos para la síntesis automática de polipéptidos de proveedores tales como Perkin Elmer Biosystems, Inc. (Foster City, CA) y generalmente puede manejarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los péptidos sintetizados pueden escindirse después de la resina y purificarse, por ejemplo, mediante cromatografía líquida preparativa de alto rendimiento (véase, Creighton, Proteins Structures and Molecular Principles, 50-60 (1983)). La composición de los polipéptidos de fusión sintéticos puede confirmarse mediante análisis de aminoácidos o secuenciación (por ejemplo, el procedimiento de degradación de Edman; véase Creighton, Proteins, Structures and Molecular Principles, págs. 34-49 (1983)).

Además, pueden introducirse aminoácidos no clásicos o análogos de aminoácidos químicos como una sustitución o adición en la secuencia. Los aminoácidos no clásicos incluyen, pero no se limitan a, los isómeros D de los aminoácidos comunes, ácido αaminoisobutírico, ácido 4-aminobutírico, ácido 2-aminobutírico, γ-Abu, ε-Ahx, ácido 6aminohexanoico, Aib, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 3-aminopropiónico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, ácido cisteico, t-butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina, β-alanina, fluoroaminoácidos, aminoácidos de diseño tales como β-metilaminoácidos, Cα-metilaminoácidos, Nα-metilaminoácidos y análogos de aminoácidos en general. Además, el aminoácido puede ser D (dextrógiro) o L (levógiro).

C. Grupos de enlace

En otra realización, los polipéptidos de la proteína de fusión, por ejemplo, ECD e ICD o el ECD y PD, se unen mediante un grupo de enlace. El grupo de enlace puede ser un agente entrecruzante químico, incluyendo, por ejemplo, succinimidil-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1carboxilato (SMCC). El grupo de enlace también puede ser una secuencia o secuencias de aminoácidos adicionales, incluyendo, por ejemplo, un grupo de unión de poliglicina.

En una realización específica, las secuencias codificantes de cada polipéptido de la proteína de fusión se unen directamente en sus extremos amino-o carboxi-terminales

mediante un enlace peptídico en cualquier orden.

Como alternativa, puede emplearse una secuencia de engarce de aminoácidos para separar el primer y segundo componentes polipeptídicos por una distancia suficiente para asegurar que cada polipéptido se pliegue en sus estructuras secundarias y terciarias. Dicha secuencia de engarce de aminoácidos se incorpora en la proteína de fusión usando técnicas convencionales bien conocidas en la materia. Las secuencias de engarce peptídicas adecuadas pueden seleccionarse basándose en los factores siguientes:

(1) su capacidad para adoptar una conformación extendida flexible; (2) su incapacidad para adoptar una estructura secundaria que pudiera interaccionar con epítopes funcionales del primer y segundo polipéptidos; y (3) la ausencia de restos hidrófobos o cargados que podrían reaccionar con los epítopes funcionales de polipéptidos. Las secuencias de engarce peptídicas preferidas contienen restos Gly, Asn y Ser. Otros aminoácidos casi neutros, tales como Thr y Ala también pueden usarse en la secuencia de engarce. Las secuencias de aminoácidos que pueden emplearse de forma útil como engarces incluyen las desveladas en Maratea y col. (1985) Gene 40: 39-46; Murphy y col. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8258-8262; Patentes de Estados Unidos Nº 4.935.233 y 4.751.180. La secuencia de engarce puede ser generalmente de 1 a aproximadamente 50 aminoácidos de longitud. Las secuencias de engarce no son necesarias cuando el primer y segundo polipéptidos tienen regiones de aminoácidos N-terminales no esenciales que pueden usarse para separar los dominios funcionales y evitar la interferencia estérica.

Otros engarces químicos incluyen engarces de carbohidratos, engarces lipídicos, engarces de ácidos grasos, engarces de poliéter, por ejemplo, PEG, etc. (Véase, por ejemplo, Hermanson, Bioconjugate Techniques (1996)).

D. Polipéptidos adicionales

Como se ha descrito anteriormente, la proteína de fusión puede estar unida a uno o más polipéptidos adicionales. Por ejemplo, el polipéptido de fusión puede estar unido a una o más copias de uno de los dos polipéptidos de la proteína de fusión. Como alternativa, la proteína de fusión puede estar unida a un polipéptido heterólogo adicional, tal como, por ejemplo, Ra12 o LeIF, como se ha descrito anteriormente. El polipéptido de fusión también puede fusionarse con un marcador de afinidad para facilitar la purificación tras la expresión. Por ejemplo, múltiples restos de histidina codificados por el marcador permiten el uso de procedimientos de cromatografía de afinidad por quelación metálica para la purificación de polipéptidos de fusión. Otros ejemplos de moléculas marcadoras de afinidad incluyen, por ejemplo, marcador Strep, PinPoint, proteína de unión a maltosa, glutatión S-transferasa, etc. (véase, por ejemplo, Glick y Pasternak, Molecular Biotechnology Principles and Applications of

Recombinant DNA (2ª ed. 1999)).

En una realización, el polipéptido de fusión se une opcionalmente a un resto lipídico, tal como ácido micólico, lipoaribdomaninas ("LAM") o derivados de trehalosa.

Como se ha descrito anteriormente, en una realización, dicha proteína de fusión se produce por expresión recombinante de un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión. Dicho producto de fusión puede prepararse ligando las secuencias de ácidos nucleicos apropiadas que codifican las secuencias de aminoácidos deseadas entre sí por procedimientos conocidos en la técnica, en la fase codificante apropiada, y expresando el producto por procedimientos conocidos en la técnica. Como alternativa, dicho producto puede prepararse mediante técnicas de síntesis de proteínas, por ejemplo, mediante el uso de un sintetizador de péptidos. También pueden añadirse secuencias codificantes para otras moléculas tales como citocinas o un adyuvante al polinucleótido de fusión.

E. Modificaciones de secuencia

Generalmente pueden identificarse variantes de las proteínas de fusión de la invención que conservan la capacidad para estimular una respuesta inmune mediante la modificación de la secuencia en uno o más de los aspectos descritos anteriormente y el ensayo de la proteína de fusión resultante con respecto a su capacidad para estimular una respuesta inmune, por ejemplo, una respuesta de células T o una respuesta de anticuerpos. Por ejemplo, dichos ensayos pueden realizarse generalmente poniendo en contacto células T con la proteína de fusión modificada y ensayando la respuesta. También pueden aislarse variantes de origen natural de los componentes polipeptídicos individuales de la proteína de fusión, por ejemplo, explorando una biblioteca de ADNc o genómica apropiada con una secuencia de ADN que codifica cada polipéptido individual o una variante del mismo.

Las modificaciones de secuencia descritas anteriormente pueden introducirse usando técnicas recombinantes convencionales o mediante síntesis automática de la proteína de fusión modificada. Por ejemplo, pueden introducirse mutaciones en loci particulares mediante síntesis de oligonucleótidos que contienen una secuencia mutante, flanqueada por sitios de restricción que permiten la ligación a fragmentos de la secuencia nativa. Después de la ligación, la secuencia reconstruida resultante codifica un análogo que tiene la inserción, sustitución o deleción de aminoácidos deseada.

Como alternativa, pueden usarse procedimientos de mutagénesis específica dirigida por oligonucleótidos para proporcionar un gen en el que se alteran codones particulares de acuerdo con la sustitución, deleción o inserción requerida. Se describen procedimientos ejemplares para realizar las alteraciones expuestas anteriormente en Walder y col. (1986) Gene, 42: 133; Bauer y col. (1985) Gene, 37: 73; Craik (1985) BioTechniques, enero: 12-19; Smith y col., Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press (1981); y Patentes de Estados Unidos Nº 4.518.584 y 4.737.462.

Las mutaciones en las secuencias de nucleótidos construidas para la expresión de dichas proteínas de fusión de HER-2/neu deben, por supuesto, conservar la fase de lectura de las secuencias codificantes y, preferentemente, no crearán regiones complementarias que podrían hibridar produciendo estructuras de ARNm secundarias, tales como bucles u horquillas, que afectarían desfavorablemente a la traducción del ARNm. Aunque puede predeterminarse un sitio de mutación, no es necesario que se predetermine la naturaleza de la mutación de por sí. Por ejemplo, para seleccionar características óptimas de mutantes en un sitio dado, puede realizarse mutagénesis aleatoria en el codón diana y los mutantes de proteína de fusión de HER-2/neu expresados explorarse con respecto a la actividad deseada. No todas las mutaciones en una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión de HER-2/neu se expresarán en el producto final. Por ejemplo, pueden realizarse sustituciones de nucleótidos para mejorar la expresión, principalmente para evitar bucles en la estructura secundaria en el ARNm transcrito (véase, por ejemplo, Solicitud de Patente Europea 75.444A),

o para proporcionar codones que se traduzcan más fácilmente en el huésped seleccionado, tales como los codones de preferencia de E. coli bien conocidos para la expresión en E. coli.

F. Vectores de expresión

Las proteínas de fusión de HER-2/neu, y variantes de las mismas, de la presente invención, se producen preferentemente mediante procedimientos de ADN recombinante. Dichos procedimientos incluyen insertar una secuencia de ADN que codifica una proteína de fusión de HER-2/neu en un vector de expresión recombinante y expresar la secuencia de ADN en un sistema de expresión recombinante de células microbianas, de mamíferos, hongos o insectos en condiciones que promuevan la expresión y, preferentemente, la secreción de la proteína de fusión. Las secuencias de ADN que codifican las proteínas de fusión de HER-2/neu proporcionadas por la presente invención pueden ensamblarse a partir de fragmentos de ADNc y engarces oligonucleotídicos cortos, o a partir de una serie de oligonucleótidos, para proporcionar un gen sintético que es capaz de insertarse en un vector de expresión recombinante y expresarse en una unidad transcripcional recombinante.

Los vectores de expresión recombinantes contienen una secuencia de ADN que codifica una proteína de fusión de HER-2/neu unida operativamente a elementos reguladores de la transcripción o de la traducción adecuados derivados de genes mamíferos, fúngicos, microbianos, virales o de insectos. Dichos elementos reguladores incluyen un promotor de la transcripción, una secuencia de operador opcional para controlar la transcripción, una secuencia que codifica sitios de unión al ribosoma de ARNm adecuados y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y traducción. Puede incorporarse adicionalmente un origen de replicación y un marcador de selección para facilitar el reconocimiento de los transformantes.

Las regiones de ADN están unidas operativamente cuando están funcionalmente relacionadas entre sí. Por ejemplo, el ADN de un péptido señal (líder de secreción) está unido operativamente al ADN de un polipéptido si se expresa como un precursor que participa en la secreción del polipéptido; un promotor está unido operativamente a una secuencia codificante si controla la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma está unido operativamente a una secuencia codificante si se sitúa de modo que permita la traducción. Generalmente, "unido operativamente" significa contiguo y, en el caso de líderes de secreción, en fase de lectura. Las secuencias de ADN que codifican las proteínas de fusión de HER-2/neu que van a expresarse en un microorganismo preferentemente no contendrán intrones que podrían terminar la transcripción de ADN en ARNm prematuramente.

Los vectores de expresión para uso bacteriano pueden comprender un marcador de selección y un origen de replicación bacteriano derivados de plásmidos disponibles en el mercado que comprenden elementos genéticos del vector de clonación bien conocido pBR322 (ATCC 37017). Dichos vectores comerciales incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia), pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI), pET28b (Novagen) y pPDM (un pET28b modificado, Corixa). Estas secciones de "cadena principal" de pBR322 se combinan con un promotor apropiado y la secuencia estructural a expresar. Típicamente, se transforman E. coli usando derivados de pBR322, un plásmido derivado de una especie de E. coli (Bolivar y col. (1977) Gene, 2: 95). pBR322 contiene genes para resistencia a ampicilina y tetraciclina y proporciona de este modo un medio simple para identificar las células transformadas. Los promotores usados habitualmente en vectores de expresión microbiana recombinantes incluyen la β-lactamasa (penicilinasa) y el sistema de promotor de lactosa (Chang y col. (1978) Nature, 275: 615; y Goeddel y col. (1979) Nature, 281: 544), el sistema del promotor de triptófano (trp) (Goeddel y col. (1980) Nucl. Acids Res., 8: 4057; y Solicitud de Patente Europea 36.776) y el promotor tac (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, pág. 412 (1982)). Un sistema de expresión bacteriano particularmente útil usa el promotor PL del fago λ y el represor termolábil cI857ts. Los vectores plasmídicos disponibles de la Colección Americana de Cultivos Tipo que incorporan derivados del promotor PL de λ incluyen el plásmido pHUB2, residente en la cepa JMB9 de E. coli (ATCC 37092) y el pPLc28, residente en E. coli RR1 (ATCC 53082).

Las secuencias promotoras adecuadas en vectores de levadura incluyen los promotores para la alcohol oxidasa, metalotioneína, 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman y col.

(1980) J. Biol. Chem., 255: 2073) u otras enzimas glucolíticas (Hess y col. (1968) J. Adv. Enzyme Reg., 7: 149; y Holland y col. (1978) Biochem., 17: 4900), tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa. Se describen adicionalmente vectores y promotores adecuados para su uso en la expresión en levaduras en la Solicitud de Patente Europea Nº 73.657.

Los vectores de levadura preferidos pueden ensamblarse usando secuencias de ADN de pBR322 para su selección y replicación en E. coli (gen Ampr y origen de replicación) y secuencias de ADN de levadura que incluyen un promotor de ADH2 reprimible por glucosa y un líder de secreción de factor α. El promotor de ADH2 se ha descrito por Russell y col. (1982) J Biol. Chem., 258: 2674 y Beier y col. (1982) Nature, 300: 724. El líder del factor α de levadura, que dirige la secreción de proteínas heterólogas, puede insertarse entre el promotor y el gen estructural a expresar (véase, por ejemplo, Kurjan y col. (1982) Cell, 30: 933; y Bitter y col. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 5330. La secuencia líder puede modificarse para que contenga, cerca de su extremo 3’, uno o más sitios de restricción útiles para facilitar la fusión de la secuencia líder con genes extraños.

Las secuencias de control transcripcional y traduccional en los vectores de expresión que se usarán en la transformación de células de vertebrados pueden proporcionarse por fuentes virales. Por ejemplo, los promotores y potenciadores usados habitualmente derivan, por ejemplo, de polioma, adenovirus 2, virus de los simios (SV40) y citomegalovirus humano. Las secuencias de ADN derivadas del genoma viral de SV40, por ejemplo, el origen de SV40, el promotor temprano o tardío, potenciador, corte y empalme y sitios de poliadenilación pueden usarse para proporcionar los otros elementos genéticos necesarios para la expresión de una secuencia de ADN heteróloga. Los promotores temprano y tardío son particularmente útiles porque ambos se obtienen fácilmente del virus como un fragmento que también contiene el origen de replicación viral de SV40 (Fiers y col. (1978) Nature, 273: 113). También pueden usarse fragmentos de SV40 mayores o menores, con tal de que se incluya la secuencia de aproximadamente 250 pb que se extiende desde el sitio Hind III hasta el sitio Bgl II localizado en el origen de replicación viral. Adicionalmente, pueden usarse secuencias promotoras, de control y/o señal genómicas virales, con tal de que dichas secuencias de control sean compatibles con la célula huésped seleccionada. Pueden construirse vectores ejemplares como se desvela en Okayama y col. (1983) Mol. Cell. Biol., 3: 280.

Un sistema útil para un alto nivel de expresión estable de ADNc de receptores de mamíferos en células epiteliales mamarias murinas C 127 puede construirse sustancialmente como se describe en Cosman y col. (1986) Mol. Immunol., 23: 935. Un vector eucariota adecuado para la expresión de las proteínas de fusión de la invención es pDC406 (McMahan y col. (1991) EMBO J., 10: 2821), que incluye secuencias reguladoras derivadas de SV40, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y virus de Epstein-Barr (EBV). Otros vectores incluyen pDC409 y pDC410, que derivan de pDC406. pDC410 deriva de pDC406 por sustitución del origen de replicación de EBV con secuencias que codifican el antígeno T grande de SV40. pDC409 difiere de pDC406 en que se ha delecionado un sitio de restricción a Bgl II fuera del sitio de clonación múltiple, haciendo que el sitio Bgl II dentro del sitio de clonación múltiple sea único. También es adecuado cualquier otro vector que permita la expresión de proteínas bajo el control del promotor de CMV, promotor temprano de SV40, promotor tardío de SV40, promotor de metalotioneína, promotor del virus del tumor mamario murino, promotor del virus del sarcoma de Rous, promotor de polihedrina u otros promotores que han demostrado ser eficaces para la expresión en células de mamíferos.

Además de las secuencias de control de la transcripción y de la traducción, algunos sistemas de expresión tienen marcadores que proporcionan una amplificación génica, tales como neomicina, timidina quinasa, higromicina B fosfotransferasa y dihidrofolato reductasa.

Una línea celular útil que permite la replicación episomal de los vectores de expresión, tales como pDC406 y pDC409, que contienen el origen de replicación de EBV, es CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478). La línea celular CV-1/EBNA se obtuvo por transfección de la línea celular CV-1 con un gen que codifica el antígeno nuclear I del virus Epstein-Barr (EBNA-1) y expresa de forma constitutiva EBNA-1 dirigido por un potenciador/promotor inmediato-temprano de CMV humano.

Los vectores preferidos para la expresión en células cultivadas de mamíferos incluyen pFLAGCMV-1 (Kodak), pcDNA3.1/hyg (Invitrogen) y pEE14-GS (CellTech).

G. Células Huésped

Las células huésped transformadas son células que se han transformado o transfectado con vectores de expresión construidos usando técnicas de ADN recombinante y que contienen secuencias que codifican proteínas de fusión de HER-2/neu de la presente invención. Las células huésped transformadas pueden expresar las proteínas de fusión de HER-2/neu deseadas, pero las células huésped transformadas con el propósito de clonar o amplificar ADN de HER-2/neu no necesitan expresar las proteínas de fusión de HER-2/neu. Las proteínas de fusión de HER-2/neu expresadas se secretarán preferentemente al medio de cultivo o sobrenadante, dependiendo del ADN seleccionado. Un experto en la materia percibirá que si las proteínas de fusión de HER-2/neu se secretan al sobrenadante del cultivo, entonces también son solubles en el sobrenadante de cultivo.

Cualquiera de los procedimientos bien conocidos para introducir secuencias de nucleótidos extrañas en células huésped puede usarse para introducir el vector de expresión. Estos incluyen el uso de reactivos tales como Superfect (Qiagen), liposomas, transfección con fosfato de calcio, polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, microinyección, vectores plasmídicos, vectores virales, aceleración de partículas por biolística (la pistola de genes) o cualquiera de los otros procedimientos bien conocidos para introducir ADN genómico clonado, ADNc, ADN sintético u otro material genético extraño en una célula huésped (véase, por ejemplo, Sambrook y col., anteriormente).

Las células huésped adecuadas para la expresión de proteínas recombinantes incluyen procariotas, levaduras o células eucariotas superiores bajo el control de promotores apropiados. Los procariotas incluyen organismos gram negativos y gram positivos, por ejemplo E. coli o Bacilli. Las células eucariotas superiores incluyen líneas celulares establecidas de origen de mamífero o insecto, como se describen posteriormente. También podrían usarse sistemas de traducción sin células para producir proteínas de fusión de HER-2/neu usando ARN derivados de construcciones de ADN. Se describen vectores de clonación y expresión apropiados para su uso con huéspedes celulares bacterianos, fúngicos, de levadura y de mamífero, por ejemplo, en Pouwels y col., Cloning Vectors: A Laboratory Manual Elsevier, Nueva York (1985).

Pueden usarse huéspedes de expresión procariotas para la expresión de proteínas de fusión de HER -2/neu que no requieran un procesamiento proteolítico y de disulfuros exhaustivo. Los vectores de expresión procariotas comprenden generalmente uno o más marcadores de selección fenotípicos, por ejemplo, un gen que codifique proteínas que confieran resistencia a antibióticos o que proporcionen un requerimiento autótrofo, y un origen de replicación reconocido por el huésped para asegurar la amplificación dentro del huésped. Los huéspedes procariotas adecuados para la transformación incluyen E. coli (por ejemplo, E. coli BL21 (DE3) de CodonPlus), Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y diversas especies dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus, aunque también pueden usarse otros huéspedes.

Las proteínas de fusión de HER-2/neu recombinantes también pueden expresarse en huéspedes de levadura tales como P. pastoris. También pueden usarse levaduras de otros géneros, tales como Saccharomyces, Schizosaccharomyces o Kluyveromyces. La expresión en Pichia se consigue mediante ligación del gen a expresar en un vector lanzadera bacteriano (por ejemplo, la serie pPICZ de Invitrogen Co.), transformación de la levadura con este vector e integración cromosómica en el locus de la alcohol oxidasa (AOX) del genoma de levadura. Después, se realiza una selección para levaduras recombinantes usando, por ejemplo, zeocina (Invitrogen Co.) y se induce la expresión de proteína mediante la adición de metanol al medio de cultivo (Higgins y col. “Pichia Protocols, “Methods in Molecular Biology, Vol. 103, Humana Press (1998)). Las cepas adecuadas de Pichia para la expresión de proteína incluyen, por ejemplo, la cepa de Pichia SMD1168. También pueden usarse sistemas de expresión basados en otras metodologías, tales como el sistema ESP (Stratagene).

Un experto en la materia conoce protocolos de transformación de levaduras adecuados. Una técnica ejemplar descrita por Hind y col., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 75:1929 (1978), implica la selección de transformantes Trp+ en un medio selectivo que consiste en base nitrogenada de levadura al 0,67%, casaminoácidos al 0,5%, glucosa al 2%, adenina 10 mg/ml y uracilo 20 mg/ml. Las cepas huésped transformadas por vectores que comprenden el promotor de ADH2 pueden cultivarse para la expresión en un medio rico que consiste en extracto de levadura al 1%, peptona al 2% y glucosa al 1% complementado con adenina 80 mg/ml y uracilo 80 mg/ml. La desrepresión del promotor de ADH2 se produce tras el agotamiento de la glucosa del medio. Los sobrenadantes de levadura brutos se recogen mediante filtración y se mantienen a 4ºC antes de su purificación adicional. También pueden usarse diversos sistemas de cultivo celular de mamífero o de insecto (por ejemplo, Spodoptera o Trichoplusia) para expresar un polipéptido recombinante. Se revisan sistemas de baculovirus para la producción de polipéptidos heterólogos en células de insectos, por ejemplo, en Luckow y col. (1988) Bio Technology 6:47. Los ejemplos de líneas celulares huésped de mamíferos adecuadas incluyen las líneas COS -7 de células renales de mono, descritas por Gluzman (1981) Cell, 23:175, y otras líneas celulares capaces de expresar un vector apropiado incluyendo, por ejemplo, líneas celulares CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478), células L, C127, 3T3, de ovario de hámster chino (CHO), COS, NS-1, HeLa, de fibroblastos de riñón embrionario humano (HEK 293) y BHK. Los vectores de expresión de mamíferos pueden comprender elementos no transcritos (por ejemplo, un origen de replicación, un promotor adecuado y/o un potenciador unido al gen a expresar y otras secuencias flanqueantes 5’ o 3’ no transcritas) y secuencias 5’ ó 3’ no traducidas (por ejemplo, sitios de unión al ribosoma necesarios, un sitio de poliadenilación, sitios donadores y aceptores de corte y empalme y secuencias de terminación de la transcripción). Un sistema de expresión de mamífero preferido es la línea celular de ovario de hámster chino (CHO).

H. Purificación de las proteínas de fusión de la invención

Pueden prepararse proteínas de fusión de HER-2/neu purificadas mediante el cultivo de sistemas de huésped/vector adecuados para expresar los productos de traducción recombinantes de los ADN de la presente invención, que después se purifican a partir del medio de cultivo o de los extractos celulares. Por ejemplo, los sobrenadantes de sistemas que secretan polipéptido recombinante a los medios de cultivo pueden concentrarse primero usando un filtro de concentración de proteínas disponible en el mercado, tal como, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Después de la etapa de concentración, el concentrado puede aplicarse a una matriz de purificación adecuada. Por ejemplo, una matriz de afinidad adecuada puede comprender una proteína de contraestructura (es decir, una proteína a la que una proteína de fusión de HER-2/neu se une en una interacción específica basada en la estructura) o una molécula de lectina o anticuerpo unida a un soporte adecuado.

Como alternativa, puede usarse una resina de intercambio aniónico, por ejemplo, una matriz o sustrato que tenga grupos dietilaminoetilo (DEAE) colgantes. Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa, poliestireno, sefarosa u otros tipos usados habitualmente en la purificación de proteínas. Como alternativa, puede usarse una etapa de intercambio catiónico. Los intercambiadores catiónicos adecuados incluyen diversas matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo, preferentemente grupos sulfopropilo. La cromatografía de filtración en gel también proporciona un medio para purificar proteínas de fusión de HER-2/neu. Las proteínas de fusión de la invención se purifican preferentemente mediante cromatografía de intercambio aniónico usando, por ejemplo, columnas monoQ o cromatografía de alto rendimiento de Q-sefarosa.

La cromatografía de afinidad es otro procedimiento preferido para purificar proteínas de fusión de HER-2/neu. Por ejemplo, pueden ser útiles anticuerpos monoclonales contra las proteínas de fusión de HER-2/neu en la purificación por cromatografía de afinidad, usando procedimientos que se conocen bien en la técnica.

Finalmente, pueden usarse una o más etapas de cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC) usando medios de RP-HPLC hidrófobos (por ejemplo, gel de sílice que tiene grupos metilos u otros grupos alifáticos colgantes) para purificar adicionalmente composiciones de proteínas de fusión de HER-2/neu. Algunas o todas las etapas de purificación anteriores, en diversas combinaciones, también pueden usarse para proporcionar una proteína o polipéptido recombinante homogéneo.

Las proteínas de fusión de HER-2/neu recombinantes producidas en cultivos bacterianos pueden generarse por extracción inicial a partir de sedimentos celulares, seguida de una o más etapas de concentración, precipitación salina, intercambio iónico acuoso o cromatografía de exclusión por tamaño. Puede usarse cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) para etapas de purificación finales. Las células microbianas usadas en la expresión de proteínas de fusión de HER-2/neu recombinantes pueden romperse por cualquier procedimiento conveniente, incluyendo ciclos de congelación y descongelación, sonicación, ruptura mecánica o uso de agentes de lisis celular.

La fermentación de la levadura que expresa proteínas de fusión de HER-2/neu como una proteína secretada simplifica en gran medida la purificación. Las proteínas recombinantes secretadas obtenidas como resultado de una fermentación a gran escala pueden purificarse mediante procedimientos análogos a los desvelados por Urdal y col. (1984) J. Chromatog,

296:171. Esta referencia describe dos etapas de HPLC de fase inversa secuenciales para la purificación de GM-CSF humano recombinante en una columna de HPLC preparativa.

Las preparaciones de proteínas de fusión de HER-2/neu sintetizadas en cultivos recombinantes pueden contener componentes celulares que no sean HER-2/neu, incluyendo proteínas, en cantidades y con un carácter que dependerá de las etapas de purificación llevadas a cabo para recuperar las proteínas de fusión de HER-2/neu del cultivo. Estos componentes son comúnmente de origen de levadura, procariota o eucariota no humano. Dichas preparaciones están típicamente libres de otras proteínas que normalmente pueden estar asociadas con la proteína HER-2/neu, como se encuentra en la naturaleza en su especie de origen.

La síntesis automática proporciona un procedimiento alternativo para preparar proteínas y polipéptidos de la presente invención. Por ejemplo, puede usarse cualquiera de las técnicas en fase sólida disponibles en el mercado, tales como, por ejemplo, el procedimiento de síntesis en fase sólida de Merrifield, en el que se añaden secuencialmente aminoácidos a una cadena de aminoácidos en crecimiento. (Véase, Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2146). Están disponibles en el mercado equipos para la síntesis automática de polipéptidos de proveedores tales como Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA) y generalmente pueden manejarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

En general, los polipéptidos (incluyendo proteínas de fusión) y polinucleótidos como se describe en el presente documento están asilados. Un polipéptido o polinucleótido “aislado” es uno que se retira de su entorno original. Por ejemplo, una proteína de origen natural está aislada si está separada de algunos o todos los materiales coexistentes en el sistema natural. Preferentemente, dichos polipéptidos tienen una pureza de al menos aproximadamente el 90%, más preferentemente tienen una pureza de al menos aproximadamente el 95% y, más preferentemente, tienen una pureza de al menos aproximadamente el 99%. Un polinucleótido se considera que está aislado si, por ejemplo, se clona en un vector que no es parte del entorno natural. AGENTES DE UNIÓN

La presente invención proporciona adicionalmente agentes, tales como anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen específicamente a una proteína de fusión de HER-2/neu de la invención. Como se usa en el presente documento, se dice que un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, “se une específicamente” a una proteína de fusión de HER-2/neu si reacciona a un nivel detectable, es decir, al menos dos veces por encima de la señal de fondo (dentro de, por ejemplo, un ELISA) con una proteína de fusión de HER-2/neu y no reacciona de forma detectable con proteínas no relacionadas en condiciones similares. Como se usa en el presente documento, la “unión” se refiere a una asociación no covalente entre dos moléculas separadas de modo que se forma un complejo. La capacidad para unirse puede evaluarse mediante, por ejemplo, la determinación de una constante de unión para la formación del complejo. La constante de unión es el valor obtenido cuando la concentración del complejo se divide por el producto de las concentraciones de los componentes. En general, se dice que dos compuestos se “unen”, en el contexto de la presente invención, cuando la constante de unión para la formación del complejo supera aproximadamente 103 l/mol. La constante de unión puede determinarse usando procedimientos bien conocidos en la técnica.

Los agentes de unión pueden ser capaces además de diferenciar entre pacientes con y sin un cáncer, tal como cáncer de mama, de ovario, de colon, de pulmón o de próstata, usando los ensayos representativos proporcionados en el presente documento. En otras palabras, los anticuerpos u otros agentes de unión que se unen a una proteína de fusión de HER-2/neu generarán una señal que indica la presencia de un cáncer en al menos aproximadamente el 20% de los pacientes con la enfermedad, y generarán una señal negativa indicando la ausencia de la enfermedad en al menos aproximadamente el 90% de los individuos sin el cáncer. Para determinar si un agente de unión satisface este requisito, las muestras biológicas (por ejemplo, sangre, sueros, plasma, orina y/o biopsias tumorales) de pacientes con y sin un cáncer (como se determina usando ensayos clínicos convencionales) pueden ensayarse como se describe en el presente documento para determinar la presencia de polipéptidos que se unen al agente de unión. Será evidente que deberían ensayarse un número estadísticamente significativo de muestras con y sin la enfermedad. Cada agente de unión debería satisfacer los criterios anteriores; sin embargo, los expertos en la materia reconocerán que pueden usarse agentes de unión en combinación para mejorar la sensibilidad.

Cualquier agente que satisfaga los requisitos anteriores puede ser un agente de unión. Por ejemplo, un agente de unión puede ser un ribosoma, con o sin un componente peptídico, una molécula de ARN o un polipéptido. En una realización preferida, un agente de unión es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Pueden prepararse anticuerpos mediante cualquiera de una diversidad de técnicas conocidas para los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. En general, pueden producirse anticuerpos mediante técnicas de cultivo celular, incluyendo la generación de anticuerpos monoclonales como se describe en el presente documento, o mediante transfección de genes de anticuerpos en huéspedes celulares bacterianos o de mamíferos adecuados, para permitir la producción de anticuerpos recombinantes. En una técnica, un inmunógeno que comprende, por ejemplo, un polipéptido de fusión o la secuencia correspondiente a la unión entre los polipéptidos individuales de una proteína de fusión de interés (denominada “región de unión”), se inyecta inicialmente en cualquiera de una amplia diversidad de mamíferos (por ejemplo, ratones, ratas, conejos, ovejas o cabras). En esta etapa, la proteína de fusión de interés, o la región de unión de la proteína de fusión de la invención, puede servir como inmunógeno sin modificación. Como alternativa, particularmente para secuencias relativamente cortas, puede inducirse una respuesta inmune superior si la secuencia se une a una proteína transportadora, tal como albúmina de suero bovino

o hemocianina lapa californiana. El inmunógeno se inyecta en el huésped animal, preferentemente de acuerdo con un programa predeterminado que incorpora una o más inmunizaciones de refuerzo, y se extrae sangre de los animales periódicamente. Los anticuerpos policlonales específicos para el polipéptido de fusión pueden purificarse después a partir de dichos antisueros mediante, por ejemplo, cromatografía de afinidad usando el polipéptido de fusión acoplado a un soporte sólido adecuado.

Pueden seleccionarse anticuerpos policlonales inducidos contra una proteína de fusión de la invención para obtener sólo los anticuerpos policlonales que sean específicamente inmunorreactivos con la proteína de fusión de interés y no con los componentes polipeptídicos individuales de las proteínas de fusión. Esta selección puede conseguirse retirando los anticuerpos que presenten reactividad cruzada con los componentes polipeptídicos individuales de la proteína de fusión de interés.

Como alternativa, los anticuerpos que reconocen cada uno o todos los componentes polipeptídicos individuales de una proteína de fusión pueden ser útiles en el contexto de la presente invención.

Pueden prepararse anticuerpos monoclonales específicos para un polipéptido de fusión inmunogénico de interés, por ejemplo, usando la técnica de Kohler y Milstein (1976) Eur. J. Imnunol. 6:511-519, y mejoras de la misma. Brevemente, estos procedimientos implican la preparación de líneas celulares inmortales capaces de producir anticuerpos que tienen la especificidad deseada (es decir, la reactividad con el polipéptido de fusión de interés). Dichas líneas celulares pueden producirse, por ejemplo, a partir de células de bazo obtenidas de un animal inmunizado como se ha descrito anteriormente. Después, las células del bazo se inmortalizan mediante, por ejemplo, fusión con un compañero de fusión de célula de mieloma, preferentemente una que sea singénica con el animal inmunizado. Pueden emplearse una diversidad de técnicas de fusión. Por ejemplo, las células de bazo y las células de mieloma pueden combinarse con un detergente no iónico durante unos pocos minutos y después sembrarse en placas a baja densidad en un medio selectivo que sirve de soporte al crecimiento de células híbridas, pero no células de mieloma. Una técnica de selección preferida usa selección por HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina). Después de un tiempo suficiente, habitualmente de aproximadamente 1 a 2 semanas, se observan colonias de híbridos. Se seleccionan colonias individuales y se ensayan sus sobrenadantes de cultivo para determinar su actividad de unión contra el polipéptido de fusión. Se prefieren hibridomas que tengan una reactividad y especificidad alta.

Pueden aislarse anticuerpos monoclonales a partir de los sobrenadantes de colonias de hibridoma en cultivo. Además, pueden emplearse diversas técnicas para mejorar el rendimiento, tales como inyección de la línea celular de hibridoma en la cavidad peritoneal de un huésped vertebrado adecuado, tal como un ratón. Después, pueden recogerse anticuerpos monoclonales a partir del líquido ascítico o de la sangre. Pueden eliminarse los contaminantes de los anticuerpos mediante técnicas convencionales, tales como cromatografía, filtración en gel, precipitación y extracción. Los polipéptidos de fusión de la presente invención pueden usarse en el procedimiento de purificación, por ejemplo, en una etapa de cromatografía de afinidad.

Dentro de ciertas realizaciones, puede preferirse el uso de fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos. Dichos fragmentos incluyen fragmentos Fab, que pueden prepararse usando técnicas convencionales. Brevemente, pueden purificarse inmunoglobulinas a partir de suero de conejo por cromatografía de afinidad en columnas de perlas de Proteína A (Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratoy Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) y digerirse con papaína para producir fragmentos Fab y Fc. Los fragmentos Fab y Fc pueden separarse por cromatografía de afinidad en columnas de perlas de proteína A.

Los anticuerpos monoclonales de la presente invención pueden acoplarse a uno o más agentes terapéuticos. Los agentes adecuados a este respecto incluyen radionúclidos, inductores de diferenciación, fármacos, toxinas y derivados de los mismos. Los radionúclidos preferidos incluyen 90Y, 123I, 125I, 131I, 186Re, 211At y 212Bi. Los fármacos preferidos incluyen metotrexato y análogos de pirimidina y purina. Los inductores de diferenciación preferidos incluyen ésteres de forbol y ácido butírico. Las toxinas preferidas incluyen ricina, abrina, toxina de Diptheria, toxina del cólera, gelonina, exotoxina de Pseudomonas, toxina de Shigella y proteína antiviral de ombú.

Un agente terapéutico puede acoplarse (por ejemplo, unirse covalentemente) a un anticuerpo monoclonal adecuado directa o indirectamente (por ejemplo, mediante un grupo de engarce). Es posible una reacción directa entre un agente y un anticuerpo cuando cada uno posee un sustituyente capaz de reaccionar con el otro. Por ejemplo, un grupo nucleofílico, tal como un grupo amino o sulfhidrilo, en uno puede ser capaz de reaccionar con un grupo que contiene carbonilo, tal como un anhídrido o un haluro de ácido, o con un grupo de alquilo que contiene un buen grupo saliente (por ejemplo, un haluro) en el otro.

Como alternativa, puede ser deseable acoplar un agente terapéutico y un anticuerpo

mediante un grupo de engarce. Un grupo de engarce puede funcionar como un espaciador para distanciar un anticuerpo de un agente para evitar la interferencia con sus capacidades de unión. Un grupo de engarce también puede servir para aumentar la reactividad química de un sustituyente en un agente o un anticuerpo, y por lo tanto aumentar la eficacia de acoplamiento. Un aumento en la reactividad química también puede facilitar el uso de agentes o grupos funcionales en agentes, que de otro modo no sería posible.

Resultará evidente para los expertos en la materia que una diversidad de reactivos bifuncionales o polifuncionales, tanto homo-como heterofuncionales (tales como los descritos en el catálogo de The Pierce Chemical Co., Rockford, IL), pueden emplearse como el grupo de engarce. El acoplamiento puede efectuarse, por ejemplo, a través de grupos amino, grupo carboxilo, grupos sulfhidrilo, o restos carbohidrato oxidados. Existen numerosas referencias que describen dicha metodología, incluyendo, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº

4.671.958.

Cuando un agente terapéutico es más potente si está libre de la porción de anticuerpo de los inmunoconjugados de la presente invención, puede ser deseable usar un grupo de engarce que pueda escindirse durante o tras la internalización en una célula. Se han descrito varios grupos de engarce escindibles diferentes. Los mecanismos para la liberación intracelular de un agente a partir de estos grupos de engarce incluyen la escisión por reducción de un enlace disulfuro (por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 4.489.710), por irradiación de un enlace fotolábil (por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 4.625.014), por hidrólisis de cadenas laterales de aminoácidos derivatizadas (por ejemplo, Patente de Estados Unidos 4.638.045), por hidrólisis mediada por el complemento del suero (por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 4.671.958) e hidrólisis catalizada por ácido (por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 4.569.789).

Puede ser deseable acoplar más de un agente a un anticuerpo. En una realización, se acoplan múltiples moléculas de un agente a una molécula de anticuerpo. En otra realización, puede acoplarse más de un tipo de agente a un anticuerpo. Independientemente de la realización particular, los inmunoconjugados con más de un agente pueden prepararse de una diversidad de maneras. Por ejemplo, puede acoplarse más de un agente directamente a una molécula de anticuerpo o pueden usarse engarces que proporcionen múltiples sitios de unión. Como alternativa, puede usarse un vehículo.

Un vehículo puede portar los agentes de una diversidad de maneras, incluyendo el enlace covalente directamente o mediante un grupo de engarce. Los vehículos adecuados incluyen proteínas tales como, por ejemplo, albúminas (por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 4.507.234), péptidos y polisacáridos tales como, por ejemplo, aminodextrano, (por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 4.699.784). Un vehículo también puede portar un agente mediante enlaces no covalentes o por encapsulación, tal como dentro de una vesícula de liposoma (por ejemplo, Patentes de Estados Unidos Nº 4.429.008 y 4.873.088). Los vehículos específicos para agentes radionúclidos incluyen moléculas pequeñas radiohalogenadas y compuestos quelantes. Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 4.735.792 desvela moléculas pequeñas radiohalogenadas representativas y su síntesis. Puede formarse un quelado de radionúclido a partir de compuestos quelantes que incluyen los que contienen átomos de nitrógeno y de azufre como átomos donadores para unir el radionúclido metálico o de óxido metálico. Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 4.673.562 desvela compuestos quelantes representativos y su síntesis.

Pueden usarse una diversidad de vías de administración para los anticuerpos e inmunoconjugados. Típicamente, la administración será intravenosa, intramuscular, subcutánea o en el lecho de un tumor resecado. Resultará evidente que la dosis exacta del anticuerpo/inmunoconjugado variará dependiendo del anticuerpo usado, la densidad de antígeno del tumor y la velocidad de aclaramiento del anticuerpo.

Los ejemplos de anticuerpos adecuados disponibles contra las proteínas de fusión de la invención incluyen, pero sin limitación, el anticuerpo policlonal de conejo 8029K, el anticuerpo monoclonal de ratón c-neu-3 (Calbiochem) y el anticuerpo monoclonal de ratón de Herceptina (Patente de Estados Unidos Nº 5.677.171). El anticuerpo monoclonal c-neu-3 reconoce un epítope secuencial en el dominio PD que se deleciona (1242-1255aa) en la construcción ECDΔPD. El anticuerpo de herceptina se une a un epítope conformacional en el dominio ECD. CÉLULAS T

Las composiciones inmunoterapéuticas pueden también, o como alternativa, comprender células T específicas para una proteína de fusión de la presente invención. Dichas células generalmente pueden prepararse in vitro o ex vivo, usando procedimientos convencionales. Por ejemplo, las células T pueden aislarse de médula ósea, sangre periférica o una fracción de médula ósea o de sangre periférica de un paciente, usando un sistema de separación celular disponible en el mercado (véanse también las Patentes de Estados Unidos Nº 5.240.856 y 5.215.926; los documentos WO 89/06280; WO 91/16116 y WO 92/07243). Como alternativa, las células T pueden proceder de seres humanos relacionados o no relacionados, mamíferos no humanos, cultivos o líneas celulares.

Las células T pueden estimularse con un polipéptido de fusión de HER-2/neu, un polinucleótido que codifica una proteína de fusión de HER-2/neu y/o una célula presentadora de antígenos (APC) que expresa dicho polipéptido de fusión. Dicha estimulación se realiza en condiciones y durante un tiempo suficientes para permitir la generación de células T que son específicas para el polipéptido de fusión. Preferentemente, un polipéptido o polinucleótido de fusión de HER-2/neu está presente dentro de un vehículo de suministro, tal como una microesfera, para facilitar la generación de células T específicas.

Se considera que las células T son específicas para un polipéptido de fusión de HER-2/neu si las células T destruyen células diana revestidas con el polipéptido de fusión o que expresan un polinucleótido que codifica el polipéptido de fusión. La especificidad de las células T puede evaluarse usando cualquiera de una diversidad de técnicas convencionales. Por ejemplo, dentro de un ensayo de proliferación o ensayo de liberación de cromo, un índice de estimulación con un aumento de más de dos veces en lisis y/o proliferación, en comparación con controles negativos, indica la especificidad de las células T. Dichos ensayos pueden realizarse, por ejemplo, como se describe en Chen y col. (1994) Cancer Res. 54:1065-1070. Como alternativa, la detección de la proliferación de células T puede conseguirse mediante una diversidad de técnicas conocidas. Por ejemplo, la proliferación de las células T puede detectarse midiendo una tasa aumentada de la síntesis de ADN (por ejemplo, marcando por impulsos cultivos de células T con timidina tritiada y midiendo la cantidad de timidina tritiada incorporada en el ADN). El contacto con un polipéptido de fusión HER-2/neu (100 ng/ml-100 µg/ml, preferentemente 200 ng/ml-25 µg/ml) durante 3-7 días daría como resultado al menos un incremento de dos veces en la proliferación de las células T. El contacto como se describe anteriormente durante 2-3 horas daría como resultado la activación de las células T, según se mide usando ensayos de citocina convencionales en los que un incremento de dos veces en el nivel de liberación de citocina (por ejemplo TNF o IFN-γ) es indicativo de la activación de las células T (véase Coligan y col, Current Protocols in Immunology, vol. 1, Wiley Interscience (Greene 1998)). Las células T que se han activado en respuesta a un polipéptido de fusión de HER-2/neu, polinucleótido o polipéptido de fusión que expresa APC pueden ser CD4+ y/o CD8+. Las células T específicas de proteínas de fusión de HER-2/neu pueden extenderse usando técnicas convencionales. Dentro de las realizaciones preferidas, las células T proceden de un paciente o proceden de un donante emparentado o no emparentado y se administran al paciente después de la estimulación y expansión.

Para propósitos terapéuticos, las células T CD4+ o CD8+ que proliferan en respuesta a un polipéptido de fusión de HER-2/neu, polinucleótido o APC pueden extenderse en número in vitro

o in vivo. La proliferación de dichas células T in vitro puede conseguirse de una diversidad de maneras. Por ejemplo, las células T pueden volverse a exponer a un polipéptido de fusión de HER-2/neu con o sin la adición de factores de crecimiento de linfocitos T, tales como interleucina2 y/o células estimuladoras que sintetizan un polipéptido de fusión de HER-2/neu. Como alternativa, una o más células T que proliferan en presencia de una proteína de fusión de HER2/neu pueden extenderse en número por clonación. Los procedimientos para la clonación de células se conocen bien en la técnica e incluyen dilución limitante. Después de la expansión, las células pueden administrarse de nuevo al paciente como han descrito, por ejemplo, Chang y col. (1996) Crit. Rev. Onco/. Hematol. 22:213.

COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Y VACUNAS QUE COMPRENDEN PROTEÍNAS DE FUSIÓN DE LA INVENCIÓN

En otra realización preferida, la presente invención se refiere a composiciones que comprenden proteínas de fusión de HER-2/neu, o variantes de las mismas. Las proteínas de fusión son proteínas de fusión de ECD-PD o variantes de las mismas de la presente invención, como se describe con detalle en el presente documento. Por ejemplo, la proteína puede ser la proteína de PD de HER-2/neu, como se describe en el presente documento o la proteína de ΔPD de HER-2/neu, como se describe en el presente documento. Además, pueden realizarse sustituciones de aminoácidos generalmente de una diversidad de maneras para proporcionar otras realizaciones de variantes dentro de la presente invención. En una realización preferida, se realizan sustituciones de aminoácidos conservativas como se ha descrito anteriormente.

Dentro de determinados aspectos, polipéptidos, polinucleótidos, las células T y/o agentes de unión descritos en el presente documento pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas o composiciones inmunogénicas (por ejemplo, vacunas). Las composiciones farmacéuticas comprenden uno o más de dichos compuestos y un vehículo fisiológicamente aceptable. Las vacunas pueden comprender uno o más de dichos compuestos y un potenciador de inmuno respuesta no específico. Un potenciador de inmuno respuesta no específico puede ser cualquier sustancia que potencia una respuesta inmune frente a un antígeno exógeno. Los ejemplos de potenciadores de inmuno respuesta no específicos incluyen adyuvantes, microesferas biodegradables (por ejemplo, galactida poliláctica) y liposomas (en los cuales se incorpora el compuesto; véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 4.235.877). La preparación de vacunas se describe generalmente en, por ejemplo, Powell y Newman, eds., Vaccine Design (the subunit and adjuvant approach), Plenum Press (NY, 1995). Pueden diseñarse vacunas para generar inmunidad frente al anticuerpo y/o inmunidad celular tal como las que surgen a partir de células T CTL o CD4+.

Las composiciones farmacéuticas y vacunas dentro del ámbito de la presente invención también pueden contener otros compuestos, que pueden ser biológicamente activos o inactivos. Por ejemplo, una o más partes inmunogénicas de otros antígenos tumorales pueden estar presentes, incorporadas en un polipéptido de fusión o como un compuesto individual, dentro de la composición o vacuna. Los polipéptidos pueden, pero no necesariamente, conjugarse con otras macromoléculas como se ha descrito, por ejemplo, dentro de las Patentes de Estados Unidos Nº 4.372.945 y 4.474.757. Las composiciones farmacéuticas y las vacunas pueden generalmente usarse para fines profilácticos y terapéuticos.

Una composición o vacuna farmacéutica puede contener un polinucleótido que codifica una o más de las proteínas de fusión de HER-2/neu, por ejemplo, de ECD-PD de HER-2/neu, como se ha descrito anteriormente, de manera que la proteína de fusión se genera in situ. Dicho polinucleótido puede comprender ADN, ARN, un ácido nucleico modificado o un híbrido de ADN/ARN. Como se ha indicado anteriormente, un polinucleótido puede estar presente dentro de cualquiera de una diversidad de sistemas de suministro conocidos por un experto habitual en la materia, que incluye sistemas de expresión de ácidos nucleicos, sistemas de expresión bacterianos y virales. Numerosas técnicas de suministro de genes se conocen bien en la técnica, tales como las descritas por Rolland (1998) Crit. Rev. Therap. Drug. Carrier Systems 15:143-198 y referencias citadas en ese documento. Los sistemas de expresión de ácidos nucleicos apropiados contienen las secuencias necesarias de ADN para la expresión en el paciente (tales como un promotor adecuado y una señal de terminación). Los sistemas de suministro bacterianos implican la administración de una bacteria (tal como Bacillus de Calmette-Guerin) que expresa una parte inmunogénica de la proteína de fusión en su superficie celular o secreta dicho epítope. En una realización preferida, el ADN puede introducirse usando un sistema de expresión viral (por ejemplo, vacuna, virus de la viruela, retrovirus o adenovirus), que puede implicar el uso de un virus competente de replicación no patógena (defectuoso). Los sistemas adecuados se describen, por ejemplo, en Fisher-Hoch y col. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:317-321; Flexner y col (1989) Ann. N. Y. Acad. Sci. 569:86-103; Flexner y col (1990) Vaccine 8:17-21; Patentes de Estados Unidos Nº 4.603.112, 4.769.330, 4.777.127 y 5.017.487; documento WO 89/01973; documento GB 2.200.651; documento EP 0.345.242; documento WO 91/02805; Berkner (1988) Biotechniques 6:616-627; Rosenfeld y col (1991) Science 252:431-434; Kolls y col (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:215-219; Kass-Eisler y col (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11498-11502; Guzman y col (1993) Circulation 88:2838-2848; y Guzman y col (1993) Cir. Res. 73:1202-1207. Las técnicas para incorporar ADN en dichos sistemas de expresión se conocen bien para los expertos habituales en la materia. El ADN también puede ser “desnudo”, como se describe, por ejemplo, en Ulmer y col (1993) Science 259:1745-1749 y revisado por Cohen (1993) Science 259:1691-1692. La captación de ADN desnudo puede aumentarse revistiendo con el ADN perlas biodegradables, que se transportan eficazmente en el interior de las células. Resultará evidente que una vacuna puede comprender tanto un componente polinucleotídico como uno polipeptídico. Dichas vacunas pueden proporcionar una respuesta inmune potenciada.

Resultará evidente que una vacuna puede contener sales farmacéuticamente aceptables

de los polinucleótidos y de los polipéptidos de fusión proporcionados en el presente documento. Dichas sales pueden prepararse a partir de bases no tóxicas farmacéuticamente aceptables, incluyendo bases orgánicas (por ejemplo, sales de aminas primarias, secundarias y terciarias y aminoácidos básicos) y bases inorgánicas (por ejemplo, sales de sodio, potasio, litio, amonio, calcio y magnesio).

Aunque en la composición farmacéutica de la presente invención puede usarse cualquier vehículo adecuado conocido para los expertos en la materia, el tipo de vehículo variará dependiendo del modo de administración. Las composiciones de la presente invención pueden formularse para cualquier manera de administración apropiada, incluyendo por ejemplo, administración tópica, oral, nasal, intravenosa, intracraneal, intraperitoneal, subcutánea o intramuscular. Para la administración parenteral, tal como inyección subcutánea, el vehículo preferentemente comprende agua, solución salina, alcohol, una grasa, una cera o un tampón. Para la administración oral puede emplearse cualquiera de los vehículos anteriores o un vehículo sólido, tal como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa y carbonato de magnesio. También pueden emplearse microesferas biodegradables (por ejemplo, polilactato, poliglicolato) como vehículos para las composiciones farmacéuticas de la presente invención. Se desvelan microesferas biodegradables adecuadas, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos nº 4.897.268; 5.075.109; 5.928.647; 5.811.128; 5.820.883; la proteína de fusión 5,8-2/neu puede encapsularse dentro de la microesfera biodegradable o asociarse con la superficie de la microesfera. En una realización, una proteína de fusión de ECD-ICD descrita en el presente documento se encapsula dentro de una microesfera biodegradable. Como alternativa o además, una proteína de fusión de ECD-PD descrita en el presente documento se encapsula dentro de una microesfera biodegradable. Las microesfera puede comprender, por ejemplo, tanto la proteína de fusión de ECD-ICD como una proteína de fusión de ECD-PD. Preferentemente la microesfera puede ser menor de aproximadamente 25 µm, preferentemente de aproximadamente 1 µm a aproximadamente 10 µm. La encapsulación en liposomas se describe, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 4.235.877.

Dichas composiciones también pueden comprender tampones (por ejemplo, solución salina tamponada neutra o solución salina tamponada con fosfato), carbohidratos (por ejemplo, glucosa, manosa, sacarosa o dextranos), manitol, proteínas, polipéptidos o aminoácidos tales como glicina, antioxidantes, bacteriostáticos, agentes quelantes tales como EDTA o glutatión, adyuvantes (por ejemplo, hidróxido de aluminio), solutos que hacen a la formulación isotónica, hipotónica o débilmente hipertónica con la sangre de un receptor, agentes de suspensión, agentes espesantes y/o conservantes. Como alternativa, las composiciones de la presente invención pueden formularse como un liofilizado. Los compuestos también pueden encapsularse dentro de liposomas usando tecnología bien conocida.

También puede emplearse cualquiera de una diversidad de potenciadores de inmuno respuesta o sustancias inmunoestimulantes en las vacunas de la presente invención. Por ejemplo, puede incluirse un adyuvante. La mayoría de los adyuvantes contienen una sustancia diseñada para proteger al antígeno del catabolismo rápido, tal como hidróxido de aluminio o aceite mineral y un estimulador de respuestas inmunes, tal como lípido A, proteínas derivadas de Bordetella pertussis o de Mycobacterium tuberculosis. Los adyuvantes adecuados se encuentran disponibles en el mercado como, por ejemplo, adyuvante completo y adyuvante incompleto de Freund (Difco Laboratories, Detroit, MI); adyuvante Merck 65; (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ); AS-2 (SmithKline Beecham); sales de aluminio tales como gel de hidróxido de aluminio (alúmina) o fosfato de aluminio; sales de calcio, hierro o zinc; una suspensión insoluble de tirosina acilada; azúcares acilados; polisacáridos derivatizados catiónica o aniónicamente; polifosfacenos; microesferas biodegradables; monofosforil lípido A y quil A. Como adyuvantes también pueden usarse citocinas, tales como GM-CSF o interleucina-2, 7 ó 12.

Dentro de las vacunas proporcionadas en el presente documento, la composición del adyuvante se diseña preferentemente para inducir una respuesta inmune predominantemente del tipo Th1. Niveles elevados de citocinas de tipo Th1 (por ejemplo, IFN-γ, TNF-α, IL-2 e IL-12) tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes mediadas por células para un antígeno administrado. Por contra, niveles elevados de citocinas de tipo Th2 (por ejemplo, IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10) tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes humorales. Después de la aplicación de una vacuna como se proporciona en el presente documento, un paciente soportará una respuesta inmune que incluye respuestas de tipo Th1 y Th2. Dentro de una realización preferida, en la que una respuesta es predominantemente de tipo Th1, el nivel de citocinas de tipo Th1 aumentará a un mayor grado que el nivel de citocinas de tipo Th2. Los niveles de estas citocinas pueden evaluarse fácilmente usando ensayos convencionales. Para una revisión de las familias de citocinas, véase Mosmann y Coffman (1989) Ann. Rev. Immunol. 7:145-173.

Los adyuvantes preferidos para su uso en la inducción de una respuesta predominantemente de tipo Th1 incluyen, por ejemplo, una combinación de monofosforil lípido A, preferentemente monofosforil lípido A 3-de-O-acilado (3D-MPL), junto con una sal de aluminio. Los adyuvantes de MPL se encuentran disponibles de Corixa Corporation (Hamilton, MT; véanse las Patentes de Estados Unidos Nº 4.436.727; 4.877.611; 4.866.034 y 4.912.094). Los oligonucleótidos que contienen CpG (en los que el dinucleótido CpG no está metilado) también inducen una respuesta predominantemente Th1. Dichos oligonucleótidos se conocen bien y se describen, por ejemplo, en los documentos WO 96/02555 y WP 99/33488. También se describen secuencias de ADN inmunoestimulantes, por ejemplo, por Sato y col (1996) Science 273:352. Otro adyuvante preferido es una saponina, preferentemente QS21 (Aquila, Estados Unidos), que puede usarse en solitario o en combinación con otros adyuvantes. Por ejemplo, un sistema de potenciación implica la combinación de un monofosforil lípido A y derivado de saponina, tal como la combinación de QS21 y 3D-MPL como se ha descrito en el documento WO 94/00153 o una composición menos reactogénica en la que el QS21 se inactiva con colesterol, como se describe en el documento WO 96/33739. Otra formulación preferida comprende una emulsión de aceite en agua y tocoferol. Una formulación de adyuvante particularmente fuerte que implica QS21, 3DMPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua se describe en el documento WO 95/17210. También se describen QS -21 y 3D-MPL en el documento EP 671 948 B1.

Otros adyuvantes preferidos incluyen Montanide ISA 720 (Seppic, Francia), SAF (Chiron, California, Estados Unidos), ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron), las series de adyuvantes SBAS (por ejemplo, SBAS-2 o SBAS-4, disponible de SmithKline Beecham, Rixensart, Bélgica), Detox (Corixa Corporation, Hamilton, MT), RC-529 (Corixa, Estados) y aminoalquil glucosaminida 4fosfatos (AGP).

En una realización preferida, el adyuvante es SBAS -2 (Véase, por ejemplo, el documento EP 735898B1).

Cualquier vacuna proporcionada en el presente documento puede prepararse usando procedimientos bien conocidos que dan como resultado una combinación de antígeno, potenciador de la respuesta inmune y un vehículo o excipiente adecuado. Las composiciones descritas en el presente documento pueden administrarse como parte de una formulación de liberación prolongada (es decir, una formulación tal como una cápsula o esponja que efectúa una liberación retardada del compuesto después de la administración). Dichas formulaciones pueden prepararse generalmente usando tecnología bien conocida (véase, por ejemplo, Coombes y col. (1996) Vaccine 14:1429-1438) y administrarse, por ejemplo, por implantación oral, rectal o subcutánea o por implantación en el sitio diana deseado. Las formulaciones de liberación prolongada pueden contener un polipéptido, polinucleótido o anticuerpo disperso en una matriz vehículo y/o incluirse dentro de un depósito envuelto por una membrana que controla la velocidad.

Los vehículos para su uso dentro de dichas formulaciones son biocompatibles y también pueden ser biodegradables; preferentemente la formulación proporciona un nivel relativamente constante de liberación del componente activo. Dichos vehículos incluyen micropartículas de poli(lactida-co-glicolida), así como poliacrilato, látex, almidón, celulosa y dextrano. Otros vehículos de liberación prolongada incluyen biovectores supramoleculares, que comprenden un núcleo hidrófilo no líquido (por ejemplo, un polisacárido u oligosacárido reticulado) y, opcionalmente, una capa externa que comprende un compuesto anfifílico, tal como un fosfolípido (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.151.254 y las solicitudes PCT WO 94/20078, WO/94/23701 y WO 96/06638). La cantidad de compuesto activo contenido dentro de una formulación de liberación prolongada depende del sitio de implantación, la velocidad y la duración esperada de liberación y la naturaleza de la afección a tratar o prevenir.

Puede emplearse cualquiera de una diversidad de vehículos de suministro dentro de composiciones farmacéuticas y vacunas para facilitar la producción de una respuesta inmune específica de antígenos que se dirige a células tumorales. Los vehículos de suministro incluyen células presentadoras de antígenos (APC), tales como células dendríticas, macrófagos, células B, monocitos y otras células que pueden modificarse por ingeniería genética para ser APC eficaces. Dichas células pueden, pero no necesariamente, modificarse genéticamente para aumentar la capacidad para la presentación del antígeno, para mejorar la activación y/o el mantenimiento de la respuesta de las células T, tener efectos antitumorales per se y/o ser inmunológicamente compatibles con el receptor (es decir, coincidir con el haplotipo HLA). Las APC pueden generalmente aislarse de cualquiera de una diversidad de fluidos y órganos biológicos, que incluyen tejidos tumorales y peritumorales, y pueden ser células autólogas, alogénicas, singénicas o xenogénicas.

Algunas realizaciones preferidas de la presente invención usan células dendríticas o progenitoras de las mismas como células presentadoras de antígenos. Las células dendríticas son APC muy potentes (Banchereau y col. (1998) Nature 392:245-251) y han demostrado ser eficaces como un adyuvante fisiológico para inducir inmunidad profiláctica o terapéutica antitumoral (véase Tim-merman y col. (1999) Ann. Rev. Med. 50:507-529). En general, las células dendríticas pueden identificarse basándose en su forma típica (estrelladas in situ, con procesos citoplásmicos marcados (dendritas) visibles in vitro), su capacidad para recoger procesos y presentar antígenos con elevada eficacia y su capacidad para activar respuestas de células T activadas sin tratamiento previo. Las células dendríticas pueden, por supuesto, modificarse por ingeniería genética para que expresen receptores o ligandos específicos en la superficie celular que habitualmente no se encuentran en las células dendríticas in vivo o ex vivo, y la presente invención contempla dichas células dendríticas modificadas. Como una alternativa a las células dendríticas, pueden usarse células dendríticas cargadas con antígenos secretados en vesículas (denominadas exosomas) dentro de una vacuna (véase Zitvogel y col. (1998) Nature Med. 4:594-600).

Las células dendríticas y progenitoras pueden obtenerse a partir de sangre periférica, médula ósea, células infiltrantes tumorales, células infiltrantes de tejidos peritumorales, ganglios linfáticos, bazo, dermis, sangre del cordón umbilical y cualquier otro tejido o fluido adecuado. Por ejemplo, las células dendríticas pueden diferenciarse ex vivo añadiendo una combinación de citocinas tales como GM-CSF, IL-4, IL-13 y/o TNFα a cultivos de monocitos recogidos de sangre periférica. Como alternativa, las células CD34 positivas recogidas de sangre periférica, sangre de cordón umbilical o médula ósea pueden diferenciarse en células dendríticas añadiendo al medio de cultivo combinaciones de GM-CSF, IL-3, TNFα, ligando CD40, LPS, ligando flt3 y/u otro compuesto (o compuestos) que induce la maduración y proliferación de las células dendríticas.

Las células dendríticas se clasifican convenientemente como células "inmaduras" y "maduras", lo que permite una forma sencilla para discriminar entre dos fenotipos bien caracterizados. Sin embargo, esta nomenclatura no debe interpretarse como excluyente de todas las fases de diferenciación intermedias posibles. Las células dendríticas inmaduras se caracterizan como APC con una elevada capacidad de captación y procesamiento del antígeno, que se correlaciona con la elevada expresión del receptor de Fcγ y del receptor de manosa. El fenotipo maduro se caracteriza típicamente por una menor expresión de estos marcadores, pero una elevada expresión de moléculas de superficie celular responsables de la activación de células T tales como MHC de clase I y clase II, moléculas de adhesión (por ejemplo, CD54 y CD11) y moléculas coestimulantes (por ejemplo, CD40, CD80, CD86 y 4-1BB).

Las APC pueden generalmente transfectarse con un polinucleótido que codifica una proteína de fusión de la invención (o variante de la misma) de manera que la proteína de fusión, o una variante de la misma, se expresa sobre la superficie celular. Dicha transfección puede tener lugar ex vivo y después puede usarse una composición o vacuna que comprende dicha células transfectadas para propósitos terapéuticos, como se describe en el presente documento. Como alternativa, puede administrarse a un paciente un vehículo de suministro de genes que se dirige a una célula dendrítica u otra célula presentadora de antígenos, haciendo que la transfección se produzca in vivo. La transfección in vivo y ex vivo de células dendríticas, por ejemplo, puede generalmente realizarse usando cualquiera de los procedimientos conocidos en la técnica, tales como los descritos en el documento WO 97/24447, o la estrategia biolística descrita por Mahvi y col. (1997) Immunology and cell Biology 75:456-460. La carga antigénica de las células dendríticas puede conseguirse incubando células dendríticas o células progenitoras con la proteína de fusión de interés, ADN (desnudo o dentro de un vector plasmídico) o ARN; o con bacterias o virus recombinantes que expresan la proteína de fusión (por ejemplo, vectores de vaccinia, virus de la viruela, adenovirus o lentivirus). Antes de realizar la carga, la proteína de fusión de interés puede conjugarse covalentemente con un compañero inmunológico que proporcione células T auxiliares (por ejemplo, una molécula vehículo). Como alternativa, una célula dendrítica puede impulsarse con un compañero inmunológico no conjugado independientemente o en presencia de la proteína de fusión.

Las vacunas y composiciones farmacéuticas pueden presentarse en envases monodosis

o multidosis, tales como ampollas o viales sellados. Dichos envases están preferentemente herméticamente sellados para preservar la esterilidad de la formulación hasta su uso. En general, las formulaciones pueden almacenarse como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleaginosos o acuosos. Como alternativa, una vacuna o composición farmacéutica puede almacenarse en un estado liofilizado que solo requiere la adición de un vehículo líquido estéril inmediatamente antes del uso.

Para un experto en la materia será evidente que una proteína de fusión o ácido nucleico de HER-2/neu para una vacuna puede prepararse sintéticamente o puede ser un derivado de origen natural. RESPUESTA INMUNE CONTRA PROTEÍNAS DE FUSIÓN DE LA INVENCIÓN

A. Detección de una respuesta inmune contra proteínas de fusión de la invención.

En un aspecto de la invención, las proteínas de fusión de HER-2/neu (o polinucleótidos que codifican proteínas de fusión de HER-2/neu) se usan para generar una respuesta inmune para la proteína de HER-2/neu, incluyendo la expresada en un tumor maligno en el que se asocia un oncogén de HER-2/neu. Los ejemplos representativos de dichos tumores malignos incluyen cáncer de mama, ovario, colon, pulmón y próstata. Una respuesta inmune para la proteína de HER-2/neu, una vez generada por las proteínas de fusión de HER-2/neu, puede tener larga vida y puede detectarse mucho tiempo después de la inmunización, independientemente de si la proteína está presente o no en el cuerpo en el momento del ensayo. Una respuesta inmune para la proteína de HER-2/neu generada por la reacción frente a una proteína de fusión de HER-2/neu puede detectarse examinando la presencia o ausencia o potenciación de la activación específica de células T CD4+ o CD8+ o por anticuerpos. Por ejemplo, células T aisladas de un individuo inmunizado por técnicas rutinarias (por ejemplo, por centrifugación en gradiente de densidad Ficoll/Hypaque de linfocitos de sangre periférica) se incuban con proteínas de fusión de HER-2/neu. Por ejemplo, las células T pueden incubarse in vitro durante 2-9 días (típicamente 4 días) a 37ºC con una proteína de fusión de HER-2/neu (típicamente, 5 µg/ml de proteína completa o algunas células clasificadas que sintetizan la proteína de HER-2/neu). Puede ser deseable incubar otra alícuota de una muestra de células T en ausencia de proteína de fusión de HER-2/neu para que sirva como un control.

La activación específica de células T CD4+ o CD8+ puede detectarse de diversas maneras. Los procedimientos para detectar la activación específica de células T incluyen detectar la proliferación de células T, la producción de citocinas (por ejemplo, linfocinas) o la generación de actividad citolítica (es decir, generación de células T citotóxicas específicas para una proteína de fusión de HER-2/neu). Para las células T CD4+, un procedimiento preferido para detectar la activación específica de células T es la detección de la proliferación de células T. Para las células T CD8+ un procedimiento preferido para detectar la activación específica de células T es la detección de la generación de actividad citolítica.

La detección de la proliferación de células T puede conseguirse mediante una diversidad de técnicas conocidas. Por ejemplo, la proliferación de células T puede detectarse midiendo la velocidad de síntesis de ADN. Las células T que se han estimulado para proliferar muestran una velocidad de síntesis de ADN aumentada. Una manera típica de medir la velocidad de síntesis del ADN es, por ejemplo, marcando por pulsos cultivos de células T con timidina tritiada, un nucleósido precursor que se incorpora dentro del ADN de nueva síntesis. La cantidad de timidina tritiada incorporada puede determinarse usando un espectrofotómetro de escintilación líquida.

Otras maneras para detectar la proliferación de células T incluyen la medición de aumentos en la producción de interleucina-2 (IL-2), flujo de Ca2+ o la captación de colorante, tal como 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio. Como alternativa, puede medirse la síntesis de linfocinas (por ejemplo, interferón-gamma) o puede cuantificarse el número relativo de células T que pueden responder a la proteína p185HER-2/neu intacta.

B. Detección de la producción de anticuerpos en respuesta a proteínas de fusión de la invención.

La presente invención también se refiere a proteínas de fusión de HER-2/neu que, además de ser inmunogénicas con respecto a las células T, parecen estimular células B para producir anticuerpos capaces de reconocer proteínas de fusión de HER-2/neu. La detección de dichos anticuerpos proporciona otra manera para diagnosticar un tumor maligno en el que un oncogén de HER-2/neu está asociado con el tumor maligno. Los anticuerpos específicos (es decir, que muestran una afinidad de unión de aproximadamente 107 litros/mol o mejor) para las proteínas de fusión de HER-2/neu pueden encontrarse en una diversidad de fluidos corporales incluyendo sueros y ascitis. En resumen, una muestra de fluido corporal se aísla de un animal de sangre caliente, tal como un ser humano, para la que se desea determinar si los anticuerpos específicos para las proteínas de fusión están presentes. El fluido corporal se incuba con proteínas de fusión de HER-2/neu en condiciones y durante un tiempo suficientes para permitir la formación de inmunocomplejos entre las proteínas de fusión de HER-2/neu y anticuerpos específicos para las proteínas de fusión. Por ejemplo, un fluido corporal y proteínas de fusión de HER-2/neu pueden incubarse a 46ºC durante 24-48 horas. Después de la incubación, la mezcla de reacción se ensaya con respecto a la presencia de inmunocomplejos. La detección de uno o más inmunocomplejos formados entre la proteína de fusión de HER-2/neu y anticuerpos específicos para la proteína de fusión de HER-2/neu puede conseguirse mediante una diversidad de técnicas conocidas, tales como radioinmunoensayos (RIA) y ensayos inmunoabsorbentes

ligados a enzimas (ELISA).

Los inmunoensayos adecuados incluyen la doble técnica de inmunoensayo de tipo sándwich para anticuerpos monoclonales de David y col. (Patente de Estados Unidos Nº 4.376.110); ensayos de tipo sándwich para anticuerpos monoclonales-policlonales (Wide y col., en Kirkham and Hunter, eds., Radioimmunoassay Methods, E. y S. Livingstone, Edimburgo (1970)); el procedimiento de "transferencia de western" de Gordon y col. (Patente de Estados Unidos Nº 4.452.901); inmunoprecipitación de ligando marcado (Brown y col. (1980) J. Biol. Chem., 255:4980-4983); ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas, por ejemplo, por Raines y col. (1982) J. Biol. Chem., 257:5154-5160; técnicas inmunocitoquímicas, que incluyen el uso de fluorocromos (Brooks y col. (1980) Clin. Exp. Immunol., 39:477); y neutralización de actividad (Bowen-Pope y col. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 81:2396-2400), incorporados todos ellos en el presente documento por referencia en su totalidad. Además de los inmunoensayos descritos anteriormente, se encuentran disponibles algunos otros inmunoensayos, incluyendo los descritos en las Patentes de Estados Unidos Nº: 3.817.827; 3.850.752; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; y 4.098.876, todas ellas incorporadas por referencia en el presente documento.

Para propósitos de detección, las proteínas de fusión de HER-2/neu (es decir, antígenos) pueden marcarse o no marcarse. Cuando no se marcan las proteínas de fusión encuentran su uso en ensayos de aglutinación. Además, las proteínas de fusión no marcadas pueden usarse en combinación con moléculas marcadas que reaccionan con inmunocomplejos o en combinación con anticuerpos marcados (anticuerpos secundarios) que reaccionan con el anticuerpo dirigido contra la proteína de fusión de HER-2/neu, tales como anticuerpos específicos para inmunoglobulina. Como alternativa, la proteína de fusión puede marcarse directamente. Cuando ésta está marcada, el grupo indicador puede incluir, por ejemplo, radioisótopos, fluoróforos, enzimas, luminiscentes, partículas colorantes y similares. Estos y otros marcadores se conocen bien en la técnica y se describen como, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nº: 3.766.162; 3.791.932; 3.817.837; 3.996.345; y 4.233.402, todas ellas incorporadas por referencia en el presente documento.

Típicamente en un ensayo ELISA, la proteína de fusión de interés se adsorbe a la superficie de un pocillo de microtitulación. Los sitios de unión a proteína residuales sobre la superficie se bloquean después con un agente apropiado, tal como albúmina de suero bovino (BSA), suero de cabra normal termoinactivado (NGS) o BLOTTO (solución tamponada de leche en polvo desnatada que también contiene un conservante, sales y un agente antiespumante). Después, el pocillo se incuba con una muestra que se sospecha que contiene el anticuerpo específico. La muestra puede aplicarse sin mezcla o, más frecuentemente, puede diluirse, habitualmente en una solución tamponada que contiene una pequeña cantidad (0,1%-5,0% en peso) de proteína, tal como BSA, NGS o BLOTTO. Después de incubar durante una duración de tiempo suficiente para permitir que se produzca la unión específica, el pocillo se lava para retirar la proteína no unida y después se incuba con un anticuerpo de inmunoglobulina anti-especie específico marcado con un grupo indicador. El grupo indicador puede seleccionarse de una diversidad de enzimas, incluyendo, por ejemplo, peroxidasa de rábano rusticano, betagalactosidasa, fosfatasa alcalina y glucosa oxidasa. Se deja tiempo suficiente para permitir que se produzca la unión específica, después el pocillo se lava de nuevo para eliminar el conjugado no unido y se añade el sustrato para la enzima. Se deja que se desarrolle el color y la densidad óptica de los contenidos del pocillo se determina visual o instrumentalmente.

En una realización preferida de este aspecto de la presente invención, un grupo indicador se une a la proteína de fusión de HER-2/neu de interés. La etapa de detectar inmunocomplejos implica eliminar sustancialmente cualquier proteína de fusión de HER-2/neu no unida y después detectar la presencia o ausencia del grupo indicador.

En otra realización preferida, un grupo indicador se une a un segundo anticuerpo que puede unirse a los anticuerpos específicos para las proteínas de fusión de HER-2/neu. La etapa de detectar inmunocomplejos implica (a) eliminar sustancialmente cualquier anticuerpo no unido,

(b): añadir el segundo anticuerpo, (c) eliminar sustancialmente cualquier anticuerpo secundario no unido y después (d) detectar la presencia o ausencia del grupo indicador. Cuando el anticuerpo específico para las proteínas de fusión de HER-2/neu procede de un ser humano, el segundo anticuerpo es un anticuerpo anti-humano.

En una tercera realización preferida para detectar inmunocomplejos, un grupo indicador se une a una molécula que puede unirse a los inmunocomplejos. La etapa de detección implica

(a): añadir la molécula, (b) eliminar sustancialmente cualquier molécula no unida y después (c) detectar la presencia o ausencia del grupo indicador. Un ejemplo de una molécula que puede unirse a los inmunocomplejos es la proteína A.

Será evidente para un experto en la materia que pueden usarse una diversidad de procedimientos para detectar los inmunocomplejos dentro de la presente invención. Los grupos indicadores adecuados para su uso en cualquiera de los procedimientos incluyen, por ejemplo, radioisótopos, fluoróforos, enzimas, partículas luminiscentes y colorantes.

En un aspecto relacionado de la presente invención, la detección de inmunocomplejos formados entre proteínas de fusión de HER-2/neu y anticuerpos en el fluido corporal que son específicos para las proteínas de fusión de HER-2/neu puede usarse para controlar la eficacia de la terapia contra el cáncer, que implica una proteína de fusión de HER-2/neu, para un tumor maligno en el que está asociado el oncogén de HER-2/neu. Pueden analizarse muestras de fluido corporal extraídas de un individuo antes y después de iniciar la terapia con respecto a los inmunocomplejos mediante los procedimientos descritos anteriormente. En resumen, se compara el número de inmunocomplejos detectados en ambas muestras. Un cambio sustancial en el número de inmunocomplejos en la segunda muestra (iniciación post terapia) con respecto a la primera muestra (preterapia) indica una terapia exitosa

TERAPIA CONTRA EL CÁNCER

En otros aspectos de la presente invención, las composiciones descritas en el presente documento pueden usarse para inmunoterapia del cáncer, tal como cáncer de mama, ovario, colon, pulmón y próstata. Dentro de dichos procedimientos, las composiciones farmacéuticas y vacunas se administran típicamente a un paciente. Como se usa en el presente documento, un "paciente" se refiere a cualquier animal de sangre caliente, preferentemente un ser humano. Un paciente puede o no padecer cáncer. Por consiguiente, las composiciones farmacéuticas y vacunas anteriores pueden usarse para prevenir el desarrollo de un cáncer o para tratar un paciente que padece cáncer. Un cáncer puede diagnosticarse usando criterios generalmente aceptados en la técnica, incluyendo la presencia de un tumor maligno. Las composiciones farmacéuticas y vacunas pueden administrarse antes o después de la extracción quirúrgica de tumores primarios y/o tratamiento tal como la administración de radioterapia o fármacos quimioterapéuticos convencionales. La administración puede ser mediante cualquier procedimiento adecuado, incluyendo la administración por vía intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal, intradérmica, anal, vaginal, tópica, sublingual y oral.

En determinadas realizaciones, la inmunoterapia puede ser inmunoterapia activa, en la que el tratamiento se basa en la estimulación in vivo del sistema endógeno inmune del huésped para reaccionar contra tumores con la administración de agentes modificadores de la respuesta inmune (tales como polipéptidos y polinucleótidos de fusión, como se proporcionan en el presente documento).

En otras realizaciones, la inmunoterapia puede ser inmunoterapia pasiva, en la que el tratamiento implica el suministro de agentes con reactividad inmune al tumor establecida (tales como células efectoras o anticuerpos) que pueden mediar directa o indirectamente efectos antitumorales y no necesariamente dependen de un sistema inmune intacto del huésped. Los ejemplos de células efectoras incluyen células T como se ha descrito anteriormente, linfocitos T (tales como linfocitos T citotóxicos CD8+ y linfocitos T auxiliares infiltrantes de tumor CD4+), linfocitos citolíticos (tales como linfocitos citolíticos naturales y linfocitos citolíticos activados por linfocina), células B y células presentadoras de antígeno (tales como células dendríticas y macrófagos) que expresan una proteína de fusión proporcionada en el presente documento. Los receptores de células T y receptores de anticuerpos específicos para los polipéptidos de fusión indicados en el presente documento pueden clonarse, expresarse y transferirse a otros vectores

o células efectoras para inmunoterapia adoptiva. Los polipéptidos de fusión proporcionados en el presente documento también pueden usarse para generar anticuerpos o anticuerpos antiidiotípicos (como se ha descrito anteriormente y en la Patente de Estados Unidos Nº 4.918.164) para inmunoterapia pasiva.

Las células efectoras puede obtenerse generalmente en cantidades suficientes para inmunoterapia adoptiva mediante cultivo in vitro como se describe en el presente documento. En la técnica se conocen bien las condiciones de cultivo para expandir las células efectoras sencillas específicas de antígeno hasta varios millones en número con retención del reconocimiento de antígenos in vivo. Dichas condiciones de cultivo in vitro típicamente usan estimulación intermitente con antígeno, a menudo en presencia de citocinas (tales como IL-2) y sin dividir células alimenticias. Como se ha indicado anteriormente, los polipéptidos de fusión inmunorreactivos como se proporcionan en el presente documento pueden usarse para expandir rápidamente cultivos de células T específicas de antígenos para generar una cantidad suficiente de células para inmunoterapia. En particular, las células presentadoras de antígenos, tales como dendríticas, macrófagos o células B, pueden impulsarse con polipéptidos de fusión inmunorreactivos o transfectarse con uno o más polinucleótidos usando técnicas convencionales bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, las células presentadoras de antígenos pueden transfectarse con un polinucleótido que tiene un promotor apropiado para aumentar la expresión en un virus recombinante u otro sistema de expresión. Las células efectoras cultivadas para su uso en terapia deben ser capaces de crecer y distribuirse ampliamente y sobrevivir a largo plazo in vivo. Mediante estudios se ha demostrado que puede inducirse a células efectoras cultivadas a crecer in vivo y sobrevivir a largo plazo en números sustanciales por estimulación repetida con antígeno complementado con IL-2 (véase, por ejemplo, Cheever y col. (1997) Immunological Reviews 157:177).

Como alternativa, puede introducirse un vector que expresa un polipéptido de fusión indicado en el presente documento en células presentadoras de antígenos extraídas de un paciente y propagarse por clonación ex vivo para transplantarlas de nuevo al mismo paciente. Las células transfectadas pueden reintroducirse dentro del paciente usando cualquiera de los procedimientos conocidos en la técnica, preferentemente en forma estéril por administración intravenosa, intracavitaria, intraperitoneal o intratumoral.

Las vías y frecuencia de administración de las composiciones terapéuticas descritas en el presente documento, así como la dosificación, variará de individuo a individuo y puede establecerse fácilmente usando procedimientos convencionales. En general, las composiciones farmacéuticas y vacunas puede administrarse por inyección (por ejemplo, intracutánea, intramuscular, intravenosa o subcutánea), por vía intranasal (por ejemplo, por aspiración) o por vía oral. Preferentemente, pueden administrarse entre 1 y 10 dosis durante un periodo de 52 semanas. Preferentemente, se administran 6 dosis, a intervalos de 1 mes y posteriormente pueden proporcionarse periódicamente vacunaciones de refuerzo. Los protocolos alternativos pueden ser apropiados para pacientes individuales. Una dosis adecuada es una cantidad de un compuesto que, cuando se administra como se ha descrito anteriormente, puede promover una respuesta inmune antitumoral, y está por encima del nivel basal (es decir, no tratado) en al menos un 10-50%. Dicha respuesta puede controlarse midiendo los anticuerpos antitumorales en un paciente o por generación dependiente de vacuna de células efectoras citolíticas que pueden destruir las células tumorales del paciente in vitro. Dichas vacunas deberían ser también capaces de causar una respuesta inmune que conduzca a un resultado clínico mejorado (por ejemplo, remisiones más frecuentes, supervivencia sin enfermedad completa o parcial o más larga) en pacientes vacunados en comparación con pacientes no vacunados. En general, para las composiciones farmacéuticas y vacunas que comprenden uno o más polipéptidos de fusión, la cantidad de cada proteína de fusión presente en una dosis varía de aproximadamente 1 µga5 mg, preferentemente 100 µg a 5 mg y más preferentemente de 5 µg a 200 µg por kg de huésped. Los tamaños de dosis adecuados variaran con el tamaño del paciente, pero variarán típicamente de aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 5 ml.

Preferentemente, se realizará una inmunización inicial o primaria con una proteína de fusión de HER-2/neu que tiene, por ejemplo, al menos uno de un ECD y/o un ICD o PD, y se realizará una inmunización posterior o de refuerzo con una proteína de fusión de HER-2/neu que tiene, por ejemplo, al menos uno de un ECD y/o un ICD o PD. Las proteínas de fusión preferidas ECD-ICD y/o ECD-PD para la inmunización incluyen las descritas en el presente documento. Un experto en la materia apreciará que la presente invención contempla el uso de una proteína de fusión de HER-2/neu intacta así como la división de la proteína de fusión de HER-2/neu en una pluralidad de péptidos. Para la inmunización ni la proteína p185HER-2/neu intacta ni un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos del dominio ECD de HER-2/neu completo (o una parte del dominio ECD de HER-2/neu) se usan en solitario.

En general, una dosificación y régimen de tratamiento apropiados proporcionan el compuesto (o compuestos) activo en una cantidad suficiente para proporcionar beneficio terapéutico y/o profiláctico. Dicha respuesta puede controlarse estableciendo un resultado clínico mejorado (por ejemplo, remisiones más frecuentes, supervivencia sin enfermedad completa o parcial o más larga) en pacientes tratados en comparación con pacientes no tratados. Aumentos en respuestas inmunes preexistentes con respecto a una proteína o proteína de fusión de HER-2/neu generalmente se correlaciona con un resultado clínico mejorado. Dichas respuestas inmunes pueden evaluarse generalmente usando ensayos de proliferación, citotoxicidad o citocinas convencionales, que pueden realizarse usando muestras obtenidas de un paciente antes y después del tratamiento.

DETECCIÓN DEL CÁNCER

A. Procedimientos de detección del cáncer

En general, un cáncer puede detectarse en un paciente basándose en la presencia de proteínas de HER-2/neu y/o polinucleótidos que codifican dichas proteínas en una muestra biológica (tal como sangre, suero, plasma, orina y/o biopsias tumorales) obtenida de un paciente. En otras palabras, dichas proteínas pueden usarse como marcadores para indicar la presencia o ausencia de cáncer tal como, por ejemplo, cáncer de mama, ovario, colon, pulmón, próstata, etc. Los agentes de unión proporcionados en el presente documento generalmente permiten detectar el nivel de la proteína de HER-2/neu que se une al agente en la muestra biológica. Pueden usarse cebadores y sondas polinucleotídicos para detectar el nivel de ARNm que codifica una proteína tumoral de HER-2/neu, que también indica la presencia o ausencia de un cáncer. En general, una secuencia tumoral de HER-2/neu debe estar presente a un nivel que es al menos tres veces superior en el tejido tumoral que en el tejido normal.

Existe una diversidad de formatos de ensayos conocidos por los expertos en la materia para usar un agente de unión para detectar marcadores polipeptídicos en una muestra. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. En general, la presencia o ausencia de un cáncer en un paciente puede determinarse (a) poniendo en contacto una muestra biológica obtenida de un paciente con un agente de unión; (b) detectando en la muestra un nivel de polipéptido que se una al agente de unión y (c) comparando el nivel de polipéptido con un valor discriminante predeterminado.

En una realización preferida, el ensayo implica el uso de un agente de unión inmovilizado sobre un soporte sólido para unirse y eliminar el polipéptido del resto de la muestra. El polipéptido unido puede después detectarse usando un reactivo de detección que contiene un grupo indicador y se une específicamente al complejo agente/polipéptido de unión. Dichos reactivos de detección pueden comprender, por ejemplo, un agente de unión que se une específicamente al polipéptido o un anticuerpo u otro agente que se une específicamente al agente de unión, tal como una anti-inmunoglobulina, proteína G, proteína A o una lectina. Como alternativa, puede utilizarse un ensayo competitivo, en el que se marca un polipéptido con un grupo indicador y se deja que se una al agente de unión inmovilizado después de la incubación del agente de unión con la muestra. El grado en el que los componentes de la muestra inhiben la unión del polipéptido marcado con el agente de unión es indicativo de la reactividad de la muestra con el agente de unión inmovilizado. Los polipéptidos adecuados para su uso dentro de dichos ensayos incluyen proteínas tumorales de HER-2/neu de longitud completa y partes de las mismas a las que se une el agente de unión y proteínas de fusión de HER-2/neu y partes de las mismas a las que se une el agente de unión, como se ha descrito anteriormente.

El soporte sólido puede ser cualquier material conocido por un experto en la materia al que puede unirse la proteína tumoral. Por ejemplo, el soporte sólido puede ser un pocillo de ensayo en una placa de microtitulación o una nitrocelulosa u otra membrana adecuada. Como alternativa, el soporte puede ser una perla o un disco, tal como de vidrio, fibra de vidrio, látex o de material plástico tal como poliestireno o cloruro de polivinilo. El soporte también puede ser una partícula magnética o un detector de fibra óptica, tal como los descritos, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 5.359.681. El agente de unión puede inmovilizarse sobre el soporte sólido usando una diversidad de técnicas conocidas por los expertos en le materia, que están ampliamente descritas en la bibliografía de patentes y científica. En el contexto de la presente invención, el término "inmovilización" se refiere a una asociación no covalente, tal como adsorción, y unión covalente (que puede ser un enlace directo entre el agente y grupos funcionales sobre el soporte o puede ser un enlace por medio de un agente de reticulación). Se prefiere la inmovilización por adsorción a un pocillo en una placa de microtitulación o a una membrana. En dichos casos, la adsorción puede conseguirse poniendo en contacto el agente de unión, en un tampón adecuado, con el soporte sólido durante una cantidad de tiempo adecuada. El tiempo de contacto varía con la temperatura pero es típicamente entre aproximadamente una hora y aproximadamente un día. En general, la puesta en contacto de un pocillo de una placa de plástico de microtitulación (tal como poliestireno o cloruro de polivinilo) con una cantidad de agente de unión que varía de aproximadamente 10 ng a aproximadamente 10 µgy preferentemente de aproximadamente 100 ng a aproximadamente 1 µg, es suficiente para inmovilizar una cantidad adecuada de agente de unión.

La unión covalente del agente de unión a un soporte sólido puede conseguirse generalmente haciendo reaccionar en primer lugar el soporte con un reactivo bifuncional que reaccionará con el soporte y con un grupo funcional, tal como un grupo hidroxilo o amino, sobre el agente de unión. Por ejemplo, el agente de unión puede unirse covalentemente a soportes que tienen un revestimiento polimérico apropiado usando benzoquinona o mediante condensación de un grupo aldehído sobre el soporte con una amina y un hidrógeno activo en el compañero de unión (véase, por ejemplo, Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, 1991, en A12A13).

En algunas realizaciones, el ensayo es un ensayo de tipo sándwich de dos anticuerpos. Este ensayo puede realizarse poniendo en contacto en primer lugar el anticuerpo que se ha inmovilizado en un soporte sólido, comúnmente el pocillo de una placa de microtitulación, con la muestra, de manera que se permite que los polipéptidos dentro de la muestra se unan al anticuerpo inmovilizado. La muestra no unida se elimina después del complejo polipéptidoanticuerpo inmovilizado y se añade un reactivo de detección (preferentemente un segundo anticuerpo que puede unirse a un sitio diferente en el polipéptido) que contiene un grupo indicador. La cantidad de reactivo de detección que permanece unido al soporte sólido se determina posteriormente usando un procedimiento apropiado para el grupo indicador específico.

Más específicamente, una vez que el anticuerpo se ha inmovilizado en el soporte como se ha descrito anteriormente, los sitios de unión a proteína restantes sobre el soporte típicamente se bloquean. Puede usarse cualquier agente bloqueador adecuado conocido por los expertos en la materia, tal como albúmina de suero bovino o Tween 20™ (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Después, el anticuerpo inmovilizado se incuba con la muestra y se permite que el polipéptido se una al anticuerpo. La muestra puede diluirse con un diluyente adecuado, tal como solución salina tamponada con fosfato (PBS) antes de la incubación. En general, un tiempo de contacto apropiado (es decir, tiempo de incubación) es un periodo de tiempo que es suficiente para detectar la presencia de polipéptido dentro de una muestra obtenida a partir de un individuo con cáncer de mama, ovario, colon, pulmón o próstata. Preferentemente, el tiempo de contacto es suficiente para conseguir un nivel de unión que sea al menos aproximadamente un 95 % del conseguido en equilibrio entre el polipéptido unido y no unido. Los expertos habituales en la materia reconocerán que el tiempo necesario para conseguir el equilibrio puede determinarse fácilmente ensayando el nivel de unión que se produce durante un periodo de tiempo. Generalmente es suficiente un tiempo de incubación de aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente.

Después, la muestra no unida se retira por lavado del soporte sólido con un tampón apropiado, tal como PBS que contiene Tween 20™ al 0.1 %. El segundo anticuerpo, que contiene un grupo indicador, puede añadirse después al soporte sólido. Los grupos indicadores preferidos incluyen los grupos indicados anteriormente.

Después, el reactivo de detección se incuba con el complejo anticuerpo-polipéptido inmovilizado durante una cantidad de tiempo suficiente para detectar el polipéptido unido. Puede determinarse una cantidad apropiada de tiempo generalmente ensayando el nivel de unión que se produce durante un periodo de tiempo. Después el reactivo de detección no unido se elimina y el reactivo de detección unido se detecta usando el grupo indicador. El procedimiento empleado para detectar el grupo indicador depende de la naturaleza del grupo indicador. Para grupos radiactivos, son generalmente apropiados los procedimientos de recuento por escintilación o autoradiográficos. Los procedimientos de espectroscopía pueden usarse para detectar colorantes, grupos luminiscentes y grupos fluorescentes. La biotina puede detectarse usando avidina, acoplada a un grupo indicador diferente (comúnmente un grupo radiactivo o fluorescente

o una enzima). Los grupos indicadores enzimáticos pueden detectarse generalmente mediante la adición de sustrato (generalmente durante un periodo de tiempo específico), seguido de espectroscopía u otro análisis de los productos de reacción.

Para determinar la presencia o ausencia de un cáncer, tal como cáncer de mama, ovario, colon, pulmón o próstata, la señal detectada del grupo indicador que permanece unida al soporte sólido se compara generalmente con una señal que corresponde a un valor discriminante determinado. En una realización preferida, el valor discriminante para la detección de un cáncer es la señal media promedio obtenida cuando el anticuerpo inmovilizado se incuba con muestras de pacientes sin cáncer. En general, una muestra que genera una señal que está tres desviaciones típicas por encima del valor discriminante predeterminado se considera positiva para el cáncer. En una realización preferida alternativa, el valor discriminante se determina usando una curva operadora receptora, de acuerdo con el procedimiento de Sackett y col., Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown and Co., 1985, p. 106-7. En resumen, en esta realización, el valor discriminante puede determinarse a partir de una gráfica de pares de índices de positivos verdaderos (es decir, sensibilidad) e índices de falsos positivos (100%-especificidad) que se corresponden con cada valor discriminante posible para el resultado de la prueba de diagnóstico. El valor discriminante del gráfico que está más cerca del margen superior izquierdo (es decir, el valor que incluye el área más amplia) es el valor discriminante más preciso y una muestra que genera una señal que es superior al valor discriminante determinado por este procedimiento puede considerarse positiva. Como alternativa, el valor discriminante puede cambiar a la izquierda a lo largo de la gráfica, para minimizar el índice de falso positivo o a la derecha, para minimizar el índice de falso negativo. En general, una muestra que genera una señal que es superior al valor discriminante determinada por este procedimiento se considera positiva para un cáncer.

En una realización relacionada el ensayo se realiza en un formato de flujo continuo o de ensayo de tira, en el que el agente de unión se inmoviliza en una membrana tal como nitrocelulosa. En el ensayo de flujo continuo, los polipéptidos dentro de la muestra se unen al agente de unión inmovilizado a medida que la muestra pasa a través de la membrana. Después un segundo agente de unión marcado se une al complejo agente de unión-polipéptido a medida que una solución que contiene el segundo agente de unión fluye a través de la membrana. La detección del segundo agente de unión unido puede realizarse después como se ha descrito anteriormente. En el formato de ensayo de tira, un extremo de la membrana a la que se une agente de unión se sumerge en una solución que contiene la muestra. La muestra migra a lo largo de la membrana a través de una región que contiene un segundo agente de unión y hacia el área del agente de unión inmovilizado. La concentración del segundo agente de unión en el área del anticuerpo inmovilizado indica la presencia de un cáncer. Típicamente, la concentración del segundo agente de unión en ese sitio genera un patrón, tal como una línea, que puede leerse visualmente. La ausencia de dicho patrón indica un resultado negativo. En general, la cantidad de agente de unión inmovilizado en la membrana se selecciona para generar un patrón visualmente discernible cuando la muestra biológica contiene un nivel de polipéptido que sería suficiente para generar una señal positiva en el ensayo de tipo sándwich de dos anticuerpos, en el formato descrito anteriormente. Los agentes de unión preferidos para su uso en dichos ensayos son anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos. Preferentemente, la cantidad de anticuerpo inmovilizado en la membrana varía de aproximadamente 25 ng a aproximadamente1 µg y más preferentemente de aproximadamente 50 ng a aproximadamente 500 ng. Dichos ensayos pueden realizarse típicamente con una cantidad muy pequeña de muestra biológica.

Por supuesto, existen otros numerosos protocolos de ensayo que son adecuados para su uso con las proteínas tumorales o agentes de unión de la presente invención. Las anteriores descripciones pretenden ser únicamente ejemplares. Por ejemplo, para los expertos en la materia será evidente que los protocolos anteriores pueden modificarse fácilmente para usar polipéptidos de HER-2/neu para detectar anticuerpos que se unan a dichos polipéptidos en una muestra biológica. La detección de dichos anticuerpos específicos de la proteína de HER-2/neu puede correlacionarse con la presencia de un cáncer.

Un cáncer puede también, o de manera alternativa, detectarse basándose en la presencia de células T que reaccionan específicamente con una proteína de fusión de HER-2/neu en una muestra biológica. En algunos procedimientos una muestra biológica que comprende células T CD4+ y/o CD8+ aisladas de un paciente se incuban con un polipéptido de fusión de HER-2/neu, un polinucleótido que codifica dicho polipéptido de difusión y/o una APC que expresa al menos dicho polipéptido de fusión y se detecta la presencia o ausencia de la activación específica de las células T. Las muestras biológicas adecuadas incluyen, pero sin limitación, células T aisladas. Por ejemplo, las células T pueden aislarse de un paciente por técnicas rutinarias (tales como centrifugación por gradiente de densidad Ficoll/Hypaque de linfocitos de sangre periférica). Las células T pueden incubarse in vitro durante 2-9 días (típicamente 4 días) a 37 ºC con un polipéptido de fusión de HER-2/neu (por ejemplo, 5-25 µg/ml). Puede ser deseable incubar otra alícuota de una muestra de célula T en ausencia del polipéptido de fusión de HER-2/neu para servir como un control. Para las células T CD4+, la activación se detecta preferentemente evaluando la proliferación de células T. Para las células T CD8+, la activación se detecta preferentemente evaluando la actividad citolítica. Un nivel de proliferación que es al menos dos veces mayor y/o un nivel de actividad citolítica que es al menos un 20 % superior que en

pacientes sin la enfermedad indica la presencia de un cáncer en el paciente.

Como se ha indicado anteriormente, cualquier cáncer puede también, o de manera alternativa, detectarse basándose en el nivel de ARNm que codifica una proteína de HER-2/neu en una muestra biológica. Por ejemplo, pueden emplearse al menos dos cebadores oligonucleotídicos en un ensayo basado en reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar una parte de un ADNc de HER-2/neu procedente de una muestra biológica, en la que al menos uno de los cebadores oligonucleotídicos es específico para (es decir, se hibrida con) un polinucleótido que codifica la proteína de HER-2/neu. Después, el ADNc amplificado se separa y se detecta usando técnicas bien conocidas en la técnica, tal como electroforesis en gel. De manera similar, pueden usarse sondas oligonucleotídicas que se hibridan específicamente con un polinucleótido que codifica una proteína o proteína de fusión de HER-2/neu en un ensayo de hibridación para detectar la presencia de polinucleótido que codifica la proteína de HER-2/neu en una muestra biológica.

Para permitir la hibridación en las condiciones del ensayo, los cebadores y las sondas oligonucleotídicos deben comprender una secuencia oligonucleotídica que tenga al menos aproximadamente un 60 %, preferentemente al menos aproximadamente un 75 % y más preferentemente al menos aproximadamente un 90 % de identidad con una parte de un polinucleótido que codifica una proteína o proteína de fusión de HER-2/neu que tenga al menos 10 nucleótidos y preferentemente al menos 20 nucleótidos de longitud. Preferentemente, los cebadores y/o sondas oligonucleotídicas se hibridan con un polinucleótido que codifica una proteína o proteína de fusión de HER-2/neu descrita en el presente documento en condiciones moderadamente rigurosas, como se ha definido anteriormente. Los cebadores y/o sondas oligonucleotídicas que pueden emplearse de manera útil en los procedimientos de diagnóstico descritos en el presente documento tienen preferentemente al menos 10-40 nucleótidos de longitud. En una realización preferida, los cebadores de oligonucleótidos comprenden al menos 10 nucleótidos contiguos, más preferentemente al menos 15 nucleótidos contiguos de una molécula de ADN que tiene una secuencia indicada en la SEC ID Nº: 6 ó 7. Las técnicas para los ensayos basados en PCR y ensayos de hibridación se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, Mullis y col. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263; Erlich ed., PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989).

Un ensayo preferido emplea RT-PCR, en el que se aplica PCR junto con transcripción inversa. Típicamente, se extrae ARN de una muestra biológica tal como un tejido de biopsia y se transcribe de manera inversa para producir moléculas de ADNc. La amplificación por PCR que usa al menos un cebador específico genera una molécula de ADNc, que puede separarse y visualizarse usando, por ejemplo, electroforesis en gel. La amplificación puede realizarse en muestras biológicas extraídas de un paciente de ensayo y de un individuo que no padece cáncer. La reacción de amplificación puede realizarse en varias diluciones de ADNc abarcando dos órdenes de magnitud. Un aumento doble o superior en la expresión en varias diluciones de la muestra del paciente de ensayo en comparación con las mismas diluciones de la muestra no cancerosa se considera típicamente positivo.

En otra realización, las proteínas o proteínas de fusión de HER-2/neu y polinucleótidos que codifican dichas proteínas o proteínas de fusión pueden usarse como marcadores para controlar el avance del cáncer. En esta realización, pueden realizarse ensayos como se ha descrito anteriormente para el diagnóstico de un cáncer a lo largo del tiempo y se evalúa el cambio en el nivel de polipéptido (o polipéptidos) reactivo. Por ejemplo, los ensayos pueden realizarse cada 24-72 durante un periodo de 6 meses a 1 año y por lo tanto realizarse según sea necesario. En general, un cáncer avanza en aquellos pacientes en los que el nivel de polipéptido detectado por el agente de unión aumenta a lo largo del tiempo. Por el contrario, el cáncer no avanza cuando el nivel de polipéptido reactivo permanece constante o disminuye con el tiempo.

Determinados ensayos de diagnóstico in vivo pueden realizarse directamente en un tumor. Un ensayo de este tipo implica poner en contacto células tumorales con un agente de unión. El agente de unión unido puede después detectarse directa o indirectamente mediante un grupo indicador. También pueden usarse dichos agentes de unión en aplicaciones histológicas. Como alternativa, pueden usarse sondas polinucleotídicas dentro de dichas aplicaciones.

Como se ha indicado anteriormente, para mejorar la sensibilidad, pueden ensayarse marcadores múltiples de proteínas de fusión de HER-2/neu dentro de una muestra proporcionada. Será evidente que los agentes de unión específicos para diferentes proteínas proporcionados en el presente documento pueden combinarse dentro de un solo ensayo. Adicionalmente, pueden usarse simultáneamente cebadores o sondas múltiples. La selección de marcadores de proteínas tumorales puede basarse en experimentos rutinarios para determinar combinaciones que den como resultado sensibilidad óptima. Además, o como alternativa, pueden combinarse ensayos para proteínas tumorales proporcionados en el presente documento con ensayos para otros antígenos tumorales conocidos.

B. Kits de diagnóstico

La presente invención proporciona adicionalmente kits para su uso dentro de cualquiera de los procedimientos de diagnóstico anteriores. Dichos kits comprenden típicamente dos o más componentes necesarios para realizar un ensayo de diagnóstico. Los componentes pueden ser compuestos, reactivos, envases y/o equipos. Por ejemplo, un envase dentro de un kit puede contener un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo que se une específicamente a una proteína de fusión de HER-2/neu. Dichos anticuerpos o fragmentos pueden proporcionarse unidos al material de soporte, como se ha descrito anteriormente. Uno o más envases adicionales pueden incluir elementos tales como reactivos o tampones, para usar en el ensayo. Estos kits pueden también, o como alternativa, contener un reactivo de detección como se ha descrito anteriormente que contiene un grupo indicador adecuado para la detección directa o indirecta de la unión al anticuerpo.

Como alternativa, puede diseñarse un kit para detectar el nivel de ARNm que codifica una proteína de HER-2/neu en una muestra biológica. Dichos kits generalmente comprenden al menos una sonda o cebador oligonucleotídico, como se ha descrito anteriormente, que se hibrida con un polinucleótido que codifica una proteína de HER-2/neu o proteína de fusión. Dicho oligonucleótido puede usarse, por ejemplo, dentro de un ensayo de PCR o de hibridación. Los componentes adicionales que pueden estar presentes dentro de dichos kits incluyen un segundo oligonucleótido y/o un reactivo de diagnóstico o envase para facilitar la detección de un polinucleótido que codifica una proteína de HER-2/neu. EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no pretenden limitar el ámbito de la presente invención o de las reivindicaciones adjuntas.

En los ejemplos, los reactivos de biología molecular generales, tales como cebadores oligonucleotídicos, lipofectamina y endonucleasas de restricción, se obtuvieron principalmente de Gibco/BRL (Grand Island, NY). La endonucleasas de restricción, Aat II y PflM-1 se obtuvieron de New England Biolabs (Beverly, MA). El kit de ensayo de ELISA de HER-2/neu y el anticuerpo monoclonal específico de HER-2/neu Ab-3 se adquirieron en Oncogene Science (Manhasset, NY). El vector de expresión pFLAGCMV-1 y el anticuerpo M2 marcado con FLAG se adquirieron en Kodak (Rochester, NY). La polimerasa Pfu se obtuvo de Strategene (La Jolla, CA). El vector de expresión pcDNA3.1/hyg se adquirió en Invitrogen (Carlsbad, CA). Ejemplo 1 CLONACIÓN DE LOS FRAGMENTOS ICD, KD Y PD DE HER-2/NEU EN EL VECTOR DE EXPRESIÓN pFLAGCMV-1

Se obtuvieron por separado los fragmentos de ADN de HER-2/neu que codifican el dominio intracelular (ICD), dominio quinasa (KD) y dominio de fosforilación (PD) mediante reacción en cadena de la polimerasa.

Se introdujeron sitios de digestión de restricción, Hind III y Xho I, en sus extremos 5’ y 3’ respectivamente. Este diseño permitió la clonación de los fragmentos de ADN en el vector de expresión pFLAGCMV-1 (Kodak) en fase de lectura con una secuencia líder de preprotripsina y una secuencia de marcador FLAG en su extremo N-terminal. Los productos PCR se purificaron en gel y se clonaron en los sitios Hind III y Sal I de pFLAGCMV-1. Los plásmidos de expresión resultantes se denominaron pFLAGCMV-1/ICD (Fig. 1), pFLAGCMV-1/KD (Fig. 2) y pFLAGCMV-1/PD (Fig. 3).

Ejemplo 2

CLONACIÓN DE LA PROTEÍNA DE FUSIÓN DE ECD-PD EN EL VECTOR DE EXPRESIÓN pcDNA3.1/hyg

El fragmento de ADN que codifica el PD de HER-2/neu se amplificó mediante reacción en cadena de la polimerasa. Después de la purificación en gel, se clonó en los sitios Aat II y Xho I del plásmido pT7-HER-2/neu. Este procedimiento generó un nuevo vector de clonación, pT7/ECD-PD que se unió a ECD y PD juntos (incluyendo una Ser del dominio transmembrana). El plásmido pT7/ECD-PD se digirió con Hind Ill y Xho I a 37 ºC durante 1 hora. El fragmento de ADN de 2,7 kb que codifica la proteína de fusión de ECD-PD se purificó en gel y se subclonó en los sitios Hind III y Xho I de pcDNA3.1/hyg (Invitrogen). El vector de expresión resultante se denominó pcDNA3.1/hyg/ECD-PD (Fig. 5). Ejemplo 3 EXPRESIÓN DE LOS FRAGMENTOS ICD, KD Y PD DE HER-2/NEU EN CÉLULAS HEK-293

Para determinar qué región del dominio intracelular de HER-2/neu podía secretarse al medio de cultivo se usó el plásmido de expresión pFLAGCMV-1 (Kodak). Las proteínas se expresaron como fusiones con una señal de secreción de preprotripsina y un marcador FLAG en el extremo N-terminal, como se describe en el Ejemplo 1.

La transfección y el cultivo de líneas celulares que expresan ICD, KD y PD se realizó de la siguiente manera: se cultivaron fibroblastos de riñón embrionario humano (células HEK-293) en medio de Eagle modificado por Dulbecco que contenía suero fetal de ternera al 10%. Un día antes la transfección, se sembraron 1,5 x 105 células en cada pocillo de una placa de seis pocillos. La transfección se realizó usando 1 µg de ADN plasmídico mediante lipofectamina (Gibco/BRL) en medio sin suero. Los medios de cultivo y las células se recogieron 74 horas después. Para la selección de transformantes estables, las células transfectadas se cultivaron en medios que contenían 200 µg/ml de higromicina.

Las células y los medios de cultivo se ensayaron con respecto a las proteínas de fusión marcadas con FLAG mediante análisis por transferencia de Western de la siguiente manera: se separaron los medios de cultivo y lisados celulares de células HEK-293 transfectadas en un gel de SDS poliacrilamida al 7,5%. Las proteínas se transfirieron electroforéticamente a filtros de difluoruro de polivinilideno (PVDF). Los filtros de PVDF se incubaron en primer lugar con albúmina de suero bovino al 5% en TBST (Tris 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, Tween 20 al 0,01%), después se incubaron durante 1 hora con el anticuerpo primario y finalmente se incubaron otra hora con anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado con peroxidasa. Las inmunotransferencias se revelaron usando el sistema ECL (Amersham Corp.). Se usó el anticuerpo monoclonal de ratón c-neu Ab-3 (“Ab-3”) (Oncogene Science) para detectar la proteína HER-2/neu. Ab-3 reconoce el extremo carboxilo-terminal de la proteína HER-2/neu humana. Para detectar proteínas de fusión marcadas con FLAG, el anticuerpo monoclonal M2 (Kodak) se usó como anticuerpo primario en el análisis.

Los resultados presentados en la Figura 4 muestran que ni el ICD de longitud completa ni el KD se secretaban, pero que se detectó PD en los medios de cultivo. Los resultados indican que la estructura de KD no permitía el paso de la proteína a través de la membrana celular. Ejemplo 4 EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA DE FUSIÓN DE ECD-PD EN CÉLULAS HEK-293 Y CHO USANDO EL VECTOR DE EXPRESIÓN pcDNA3.1/hyg

Se construyó la proteína de fusión de ECD-PD con una señal de secreción de preprotripsina y un marcador FLAG en su extremo N-terminal, como se ha descrito en el Ejemplo

2.

La transfección y el cultivo de líneas celulares que expresan ECD-PD se realizó de la siguiente manera: se cultivaron células HEK-293 y de ovario de hámster Chino (CHO) en medio Eagle modificado por Dulbecco que contenía suero fetal de ternera al 10%. Un día antes de la transfección, se sembraron 1,5 x 105 células en cada pocillo de una placa de seis pocillos. La transfección se realizó usando 1 µg de ADN plasmídico mediante lipofectamina (Gibco/BRL) en medios sin suero. Los medios de cultivo y las células se recogieron 72 horas después. Para la selección de transformantes estables, las células transfectadas se cultivaron en medio que contenía 200 µg/ml de higromicina.

La secreción de la proteína de fusión de ECD-PD soluble se determinó por un ensayo ELISA con anticuerpos específicos de ECD de HER-2/neu de la siguiente manera: la microplaca se revistió previamente con el anticuerpo de ratón específico de HER-2/neu (Oncogene Science) para capturar la proteína HER-2/neu en las muestras. Las muestras de ensayo se incubaron en la microplaca durante una noche a temperatura ambiente, se incubaron durante 1 hora con anticuerpo detector y se incubaron otra hora con un anticuerpo de cabra anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante. Después de añadir el sustrato de peroxidasa o-fenilendiamina, se formó un producto coloreado. El producto coloreado se cuantificó por espectrofotometría. La absorbancia a 490 nm reflejó la cantidad de proteína neu en las muestras.

Por lo tanto, la secreción de la proteína de fusión de ECD-PD soluble se determinó mediante análisis de transferencia de Western con anticuerpos específicos de PD de HER-2/neu de la siguiente manera: se separaron los medios de cultivo y lisados celulares de las células HEK-293 transfectadas en un gel de SDS poliacrilamida al 7,5%. Para el análisis de transferencia de Western, las proteínas se transfirieron electroforéticamente a filtros PVDF. Los filtros PVDF se incubaron con albúmina de suero bovino al 5% en TBST, se incubaron durante 1 hora con el anticuerpo primario y se incubaron durante otra hora con anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado con peroxidasa. Las inmunotransferencias se revelaron usando el sistema ECL (Amersham Corp.). En los presentes experimentos, se usó el anticuerpo monoclonal Ab-3 de ratón para detectar la proteína HER-2/neu. El Ab-3 reconoce el extremo carboxilo-terminal de la proteína HER-2/neu humana. Para detectar proteínas de fusión marcadas con FLAG, se usó el anticuerpo monoclonal M2 (Kodak) como anticuerpo primario en el análisis. Los resultados se presentan en la Figura 6.

Ejemplo 5

CLONACIÓN DE LA PROTEÍNA DE FUSIÓN DE ECD-ΔPD EN EL VECTOR DE EXPRESIÓN pcDNA3.1/hyg

Se preparó la proteína de fusión de ECD-ΔPD humana mostrada en la Figura 13 (SEC ID Nº: 7) mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con los siguientes cebadores: PDM251 5’-cctgaatcgcgaacccaagtgtgcaccggcac-3’ (SEC ID Nº: 15) Tm 69ºC, PDM-279 5’ctggactcgagtcattagcggtgcctgtggtgg-3’ (SEC ID Nº: 16) Tm 69ºC.

Las condiciones de la reacción en cadena de la polimerasa fueron: 10 µl de Tampón de Pfu 10x (Stratagene), 1 µl de dNTP 10 mM, 2 µl de cada oligo 10 µM, 83 µl de agua estéril, 1,5 µl de ADN polimerasa Pfu y 50 ng de molde a 96ºC durante 2 minutos x 1 ciclo; (96ºC durante 20 segundos, 69ºC durante 15 segundos, 72ºC durante 5 minutos) x 40 ciclos; 72ºC durante 5 minutos x 1 ciclo. El producto de PCR se digirió con Nru I y Xho I y se clonó en un vector pPDM His (un vector pET28 modificado que tiene un marcador His en fase de lectura con un punto de corte para enzima de restricción romo Eco 721), que se cortó con Eco 721 y Xho I. La secuencia se confirmó y después el plásmido recombinante se transformó en BL21 pLys para la expresión en E. coli. La construcción plasmídica se digirió después con BamHI y XhoI y se clonó en pcDNA3.1/hyg/ECD-PD que se cortó con las mismas enzimas de restricción. Ejemplo 6 EXPRESIÓN EN E. coli DE LA PROTEÍNA DE FUSIÓN DE ECD-PD-MARCADOR HIS CT HUMANA

La proteína de fusión de ECD-PD humana se clonó en el vector pcDNA3.1/hyg como se describe en el ejemplo 2 y se usó como molde para construir la hECD-PD en fase de lectura con un marcador histidina 6 x C-terminal. La hECD-PD se amplificó mediante PCR usando los siguientes cebadores:

cebador con sentido de hECD-PD AWO28, con un sitio Nco I:

5’-GGGccatggggAGCACCCAAGTGTGCACCGGC-3 (SEC ID Nº: 17) cebador antisentido de hECD-PD AW029, con un sitio Xho I sin terminación:

5’-GGGctcgagCACTGGCACGTCCAGACCCAGG-3’ (SEC ID Nº: 18)

Después, el producto de PCR se cortó con las enzimas de restricción Nco I y Xho I, se purificó y se ligó en el vector de expresión pET28b linealizado con las mismas dos enzimas de restricción. El producto de ligación se usó para transformar células NovaBlue y se seleccionaron varias colonias para la exploración. De ellas, los clones de hECD-PD.CThis se confirmaron mediante secuenciación de ADN y se usaron para la expresión de proteínas posterior.

Para la expresión de proteínas, un clon de hECD-PD.CThis se usó para transformar células competentes de E. coli BL21 (DE3) CodonPlus-RIU. Se realizó una miniexploración de la expresión convencional con clones de la transformación para determinar el rendimiento de la inducción. Los mejores resultados se obtuvieron cuando las células se cultivaron en medio TB a 37ºC durante 2 horas.

La hECD-PD.CThis producido en E. coli se purificó después en una columna monoQ y se volvió a plegar en tampón Tris-HCl 20 mM (pH 8,0). La proteína vuelta a plegar se ensayó y se descubrió que era positiva para la unión de Herceptina mediante transferencia de Western y ELISA (Figura 17). Sin embargo, la actividad de unión a Herceptina se perdió más tarde, probablemente debido a la desnaturalización de la proteína. Ejemplo 7 EXPRESIÓN EN E. coli DE LA PROTEÍNA DE FUSIÓN DE MARCADOR HIS NTECD-PD HUMANA

La proteína de fusión de ECD-PD humana se clonó en el vector de expresión pPDM con un sitio de restricción Nde I 5’ y uno Xho I 3’. El inserto de ECD-PD se fusionó en fase de lectura con un marcador de histidina 6 x N-terminal.

Para la expresión de la proteína, el vector pPDM que contenía la proteína de fusión NThis-hECD-PD se usó para transformar células competentes de E. coli BL21 (DE3) CodonPlus-RIU. Se realizó una miniexploración de la expresión convencional con clones de la transformación para determinar el rendimiento de la inducción. Los mejores resultados se obtuvieron cuando las células se cultivaron en medio TB a 37ºC durante 2 horas.

La proteína de fusión NThis-hECD-PD no purificada procedente de E coli se reconoció mediante el anticuerpo de ratón c-neu-3 y mediante un anticuerpo de conejo anti-ECD. Después de la purificación, la NThis-hECD-PD procedente de E. coli se reconoció por Herceptina tanto en transferencias de Western como en ensayos ELISA (Figura 17). Ejemplo 8 EXPRESIÓN EN E. coli DE LA PROTEÍNA DE FUSIÓN DE ECD-PD-MARCADOR HIS CT DE RATÓN

La proteína de fusión de ECD-PD de ratón se clonó en el vector pcDNA3.1 después de un protocolo similar al descrito en el ejemplo 2 para la clonación de la proteína de fusión de ECD-PD humana. Después esta construcción se usó como molde para la construcción de la mECD-PD en fase de lectura con un marcador de histidina 6 x C-terminal seguido de un codón de terminación. El sitio Nco I interno y la construcción mECD-PD/pcDNA3.1 (1932 pares de bases de la ORF) se mutaron silenciosamente mediante mutagénesis dirigida usando los siguientes cebadores:

Cebador AW038:

5’-GGCCCCTCCAGCCCGATGGACAGCACCTTCTACCG-3’ (SEC ID Nº: 19)

Cebador AW039:

5’-CGGTAGAAGGTGCTGTCCATCGGGCTGGAGGGGCC-3’ (SEC ID Nº: 20)

Después de que se confirmara la secuencia, la construcción de fusión mECD-PD se amplificó mediante PCR usando los siguientes cebadores: Cebador con sentido AW036, con un sitio de restricción Nco I: 5’-GGGccatggGTACCCAAGTGTGTACCGG-3’ (SEC ID Nº: 21) Cebador antisentido AW037, con un sitio de restricción Xho I:

5’-GGGctcgagTCAATGGTGATGGTGATGGTGTCATGG CACATCCAGGCCTAGGTACTCAGGG-3’ (SEC ID Nº: 22)

Después, el producto PCR se cortó con las enzimas de restricción Nco I y Xho I, se purificó y se ligó en el vector de expresión pET28b linealizado con las mismas dos enzimas de restricción.

El producto de ligación se usó para transformar NovaBlue y produjo múltiples colonias. Se seleccionaron cuatro colonias para el análisis de secuencia. De ellas, un clon mECD-PD.CThis que tenía la secuencia correcta se usó para transformar células competentes de E. coli BL21 (DE3) CodonPlus-RIU. Se realizó una miniexploración de la expresión convencional con clones de la transformación para determinar el rendimiento de la inducción. Los mejores resultados se obtuvieron cuando las células se cultivaron en medio 2xYT a 30ºC durante 3 horas. Ejemplo 9 EXPRESIÓN EN E. Coli DE LA PROTEÍNA DE FUSIÓN DE Ra12-mECD-PD-MARCADOR HIS CT

La proteína de fusión de ECD-PD de ratón se clonó en el vector de expresión pET28b como se ha descrito en el Ejemplo 8. La secuencia de Ra12 se amplificó usando los siguientes fragmentos de PCR, que añadían sitios Nco I en los extremos 5’ y 3’:

Ra12.JC05: 5’-CCGccatggGCACGGCCGCGTCCGATAACTTCC-3’ (SEC ID Nº: 23) Ra12.JC06: 5’-GCGccatggCGGCCGGGGGTCCCTCGGCC-3’ (SEC ID Nº: 24)

Para obtener la fusión del adyuvante Ra12 con mECD-PD, el producto de PCR Ra12 se digirió después con la enzima de restricción Nco I y se ligó en el vector pET28b-mECD-PD digerido con Nco I y tratado con CIAP. El producto de ligación se usó para transformar células NovaBlue y produjo múltiples colonias. Debido a la reacción de ligación no específica de dirección, se escogieron el doble de clones para la minipreparación de plásmido. Estos clones se exploraron por digestión con la enzima de restricción Afi III para determinar la orientación correcta del inserto. Se analizó la secuencia de algunos clones correctamente orientados. Un clon con una secuencia correcta se usó para transformar células competentes de E. coli BL21 (DE3) CodonPlus-RIU. Se realizó una miniexploración de la expresión convencional con clones de la transformación para determinar el rendimiento de la inducción. Los mejores resultados se obtuvieron cuando las células se cultivaron en medio TB a 37ºC durante 3 horas.

Ejemplo 10

EXPRESIÓN EN E. Coli DE LA PROTEÍNA DE FUSIÓN DE LeIF.mECD-PD-MARCADOR HIS CT

La proteína de fusión de ECD-PD de ratón se clonó en el vector de expresión pET28b como se ha descrito en el Ejemplo 8. La secuencia de LeIF se amplificó usando los siguientes fragmentos de PCR que añadían sitios Nco I en los extremos 5’ y 3’:

LeIF.JC03: 5’-CGCccatggCGCAGAATGATAAGATCGCCC-3’ (SEC ID Nº: 25) LeIF.JC04: 5’-GCCccatggCGTCGCGCATGAACTTCTTCGTC-3’ (SEC ID Nº: 26)

Para obtener la fusión del adyuvante LeIF con mECD-PD, el producto de PCR LeIF se digirió después por la enzima de restricción Nco I y se ligó en el vector pET28b-mECD-PD digerido con Nco I y tratado con CIAP. El producto de ligación se transformó en células NovaBlue y produjo múltiples colonias. Debido a la reacción de ligación no específica de dirección, se escogieron el doble de clones para la minipreparación de plásmido. Estos clones se exploraron por digestión con la enzima de restricción Kpn I para determinar la orientación correcta del inserto. Se analizó la secuencia de unos pocos clones orientados correctamente. Un clon con una secuencia correcta se usó para transformar células competentes de E. coli BL21 (DE3) CodonPlus-RIU. Se realizó una miniexploración de la expresión convencional con clones de la transformación para determinar el rendimiento de la inducción. Los mejores resultados se obtuvieron cuando las células se cultivaron en medio 2xYT a 30ºC durante 3 horas.

Ejemplo 11

EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA DE FUSIÓN DE ECD-PD EN PICHIA

La proteína recombinante de ECD-PD usada para la expresión en Pichia tenía el mismo diseño que para la expresión en CHO con dos modificaciones: (i) la secuencia señal de secreción nativa del gen de HER-2/neu se había sustituido por la secuencia señal pre-pro alfa de Saccharomyces cerevisiae; y (ii) la parte C-terminal de la proteína recombinante se alargó mediante una glicina y seis histidinas.

El casete de expresión de la proteína de fusión de ECD-PD se integró en la cepa SMD1168 de Pichia usando el procedimiento Spheroplast. Se seleccionaron seis clones integrantes de múltiples copias entre 250 clones mediante análisis de transferencia puntual cuantitativo. Los clones seleccionados se indujeron durante 72 horas en medio complejo con metanol tamponado (BMMY-metanol al 1%) en condiciones de matraces agitadores. Los seis clones candidatos mostraban el mismo perfil de expresión en los sobrenadantes sin células y en los extractos celulares totales.

En los sobrenadantes sin células, la secreción de la proteína recombinante ECD-PD de longitud completa era muy débil y únicamente se detectó en transferencias de Western usando el anticuerpo de ratón c-neu-3 (Calbiochem). La secreción y acumulación (máxima después de 72 horas) de una proteína de ± 70 kDa era visible en un SDS-PAGE con tinción de plata y se detectó en una transferencia de Western en condiciones no reductoras con anticuerpo de ratón de Herceptina. Esta proteína no se detectó usando el anticuerpo de ratón c-neu-3 o un anticuerpo de ratón anti-histidina (QIAGEN).

En los extractos celulares totales, no se detectaron bandas específicas en SDS-PAGE usando el kit de coloración DAIICHI de tinción con plata. En las transferencias de Western se detectaron dos bandas usando el anticuerpo de ratón c-neu-3 o el anticuerpo de ratón antihistidina. Una banda tenía el mismo tamaño molecular que el observado para el producto ECDPD secretado después de la expresión en células CHO. La otra banda aparecía como una “mancha” que variaba de 100 a 120 kDa. Estas dos señales podían corresponder a proteínas recombinantes ECD-PD retenidas en el E.R. y que presentan diversas formas de glicosilaciones. Ejemplo 12 EXPRESIÓN EN CÉLULAS CHOK1 DE PROTEÍNAS DE FUSIÓN DE ECD-PD Y ECD-ΔPD

Los plásmidos pcDNA3.1/hyg/ECD-PD y pcDNA3.1/hyg/ECD-ΔPD se digirieron por la enzima de restricción Xba I y los fragmentos de ADN que abarcaban las proteínas de fusión de ECD-PD y ECD-ΔPD se purificaron en gel como fragmentos Xba I de 2783 y 2166 pb, respectivamente. Cada fragmento se transfirió al vector pEE14-GS (CellTech) linealizado con Xba I (sitio de clonación cadena abajo del promotor temprano inmediato de CMV). Después de la ligación, la transformación se realizó en células de E. coli competentes DH5α. De las dieciséis colonias analizadas por digestión con enzimas de restricción, se descubrieron 2 colonias positivas para ECD-PD y se descubrió 1 colonia positiva para ECD-ΔPD. Los plásmidos obtenidos se prepararon a gran escala y se purificaron mediante centrifugación en doble gradiente de CsCI-EtBr. Los plásmidos se analizaron por digestión con enzimas de restricción y secuenciación de

las uniones 5’ y 3’ entre inserto y vector y no se encontraron anomalías.

Se realizó la transfección de células CHO-K1 procedentes del Master Cell Bank MCB CHO-K1 028W 1996/2 SHF P31, que crecen en suspensión en condiciones sin suero, con los plásmidos tanto pEE14-ECD-PD como pEE14-ECD-ΔPD usando la técnica de coprecipitación en fosfato de calcio de ADN clásica. Se realizó un recuento de las células 48 horas después de la transfección y se transfirieron a placas de 96 pocillos a una densidad de 5000 células/pocillo. Las células transfectadas se seleccionaron de acuerdo con el procedimiento del sistema de expresión de glutamina sintasa (GS) descrito por Crockett y col. ((1990) Biotech., 8: 662) y se amplificaron en presencia de metionina sulfoximina (MSX) 30 µM en medio GMEM que no contenía glutamina y complementado con aditivos (glutamato/asparagina/nucleósidos) y Suero Bovino Fetal (FBS) dializado al 5%. Después, las células se lavaron tres veces durante la primera semana y dos veces durante la segunda semana después de la transfección. Durante el tercer lavado, se añadió medio acondicionado al 20%. Durante el quinto lavado, la concentración de MSX se aumentó a 50 µM para aumentar el nivel de selección.

Los clones transfectantes en MSX se transfirieron a las 3-5 semanas después de la transfección en placas de 24 pocillos y los sobrenadantes del cultivo se recogieron. Se ensayó la expresión de las proteínas de fusión de ECD-PD o ECD-ΔPD mediante análisis de transferencia de Western usando el anticuerpo de Herceptina en condiciones no reductoras. Se detectó la expresión de la proteína de fusión de ECD-PD en 18 de los 52 clones ensayados, mientras que 13 de los 47 clones ensayados eran positivos para la expresión de ECD-ΔPD. Los clones seleccionados que expresaban las proteínas de fusión se readaptaron después a condiciones sin suero en suspensión. Basándose en el nivel de expresión, cultivo y viabilidad, 5 clones que portaban la construcción de ECD-PD y 3 clones que portaban la construcción de ECD-ΔPD se evaluaron y se caracterizaron adicionalmente. Para la construcción de ECD-PD, el clon 560 F3 mostraba el nivel de expresión más alto.

La expresión se evaluó a 33ºC en presencia o ausencia de butirato de sodio (2 mM) y de DMSO (al 2%). Algunos de estos clones eran inducibles por NaB o DMSO. La expresión de ECDPD y ECD-ΔPD en células CHO-K1 se analizó por transferencias de Western y SDS-PAGE seguido por tinción de Plata o Coomassie. Para el análisis de transferencia de Western se usaron los anticuerpos monoclonales de ratón de herceptina y c-neu-3, así como el anticuerpo policlonal de conejo 8029K. Los análisis de los sobrenadantes de cultivo de los clones de ECD-PD y ECDΔPD mostraban una banda en geles teñidos con Coomassie/Plata a 150 kDa y a 98 kDa, respectivamente. Las mismas bandas se pusieron de manifiesto por Herceptina y por el antisuero policlonal 8029K, así como por el anticuerpo c-neu-3 para ECD-PD solamente (Figura 18). El anticuerpo de Herceptina reconoció las proteínas de fusión de HER-2/neu expresadas en CHO

(Figura 18).

El nivel de expresión de las proteínas de fusión también se siguió en términos de estabilidad durante los diferentes pases celulares. Se realizó un seguimiento de cinco clones de ECD-PD y dos clones de ECD-ΔPD durante los pases y se evaluó la estabilidad de la expresión mediante análisis de transferencia de Western. De los siete clones analizados, cuatro eran estables después de más de 32 pases, aunque uno de ellos mostró una elevada mortalidad y el otro presentaba células grandes.

Se realizaron procesamientos de producción a pequeña escala con los dos mejores clones de ECD-PD y ECD-ΔPD. Las células se cultivaron en suspensión en condiciones sin suero durante 120 horas a 33ºC en presencia de butirato de sodio 2 mM. Se evaluó la expresión de ambas proteínas de fusión mediante transferencia de Western usando el anticuerpo de Herceptina y mediante SDS-PAGE seguido de tinción de plata usando el kit Daiichi. Se descubrió que ambas proteínas de fusión se expresan a +/-100 µg/ml. Ejemplo 13 PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS DE FUSIÓN DE ECD-PD Y ECD-ΔPD DESPUÉS DE LA EXPRESIÓN EN CÉLULAS CHO

Después de la expresión en células CHO y de la secreción, las proteínas de fusión de ECD-PD y ECD-ΔPD se purificaron mediante cromatografía de intercambio aniónico en columnas de alto rendimiento de Q-sefarosa. Antes de cargar el sobrenadante sobre la columna, se ajustó el pH a 6,5 añadiendo HCl 1 N. Para la cromatografía, se usó 1 ml de resina de alto rendimiento de Q-Sefarosa (Pharmacia) para una columna C10/10 (Pharmacia).

La columna se equilibró primero con 10 volúmenes de columna de H2O a 4 ml/min, seguido de 1 volumen de columna de NaOH 0,5 M a 4 ml/min y 10 volúmenes de columna de tampón A (Bis-Tris propano 20 mM pH 6,5-NaCl 50 mM) a 4 ml/min. Después, la muestra se cargó sobre la columna y se dejó que pasara a su través a un caudal de 1 ml/min. Después, la columna se lavó con Tampón A a 1 ml/min hasta que la D. O. a 280 nm alcanzó 0,1 y después se realizó una etapa de lavado adicional de 20 volúmenes de columna. Antes de la elución, la corriente de flujo se invirtió y se realizó una etapa de lavado adicional de 3 volúmenes de columna.

La elución se realizó a 1 ml/min, primero con Tampón B (Bis-Tris propano 20 mM pH 6,5NaCl 250 mM) y después con Tampón C (Bis-Tris propano 20 mM pH 6,5-NaCl 1 mM). Las proteínas de fusión de interés se eluyeron con Tampón B.

Las proteínas de fusión se purificaron adicionalmente por cromatografía hidrófoba en Phenyl Sepharose 6 Fast Flow de baja sustitución. El eluido que contenía las proteínas de fusión de ECD-PD y ECD-ΔPD (eluido de Tampón B) se ajustó hasta obtener una concentración de

sulfato de amonio 1 M (AMS) por adición de AMS sólido (140 g/l de solución). El pH de la solución se comprobó que fuera de 7,0. Para la cromatografía, se usaron 0,5 ml de Phenyl Sepharose 6 Fast Flow de baja sustitución (Pharmacia) con una C10/10 (Pharmacia). Después, la columna se equilibró con 10

5 volúmenes de columna de H2O, a 4 ml/min, 1 volumen de columna de NaOH 0,5 M a 4 ml/min y 10 volúmenes de columna de tampón D (PO4 1 mM pH 7,0-AMS 1 M) a 4 ml/min. Después del equilibrado, la muestra se cargó y se dejó pasar a través de la columna a un caudal de 0,5 ml/min. Después, la columna se lavó en Tampón D a 0,5 ml/min hasta que la D.O. a 280 nm alcanzó la línea basal, y después a 1 ml/min para 10 volúmenes de columna. Antes de la elución,

10 la corriente de flujo se invirtió y se realizó una etapa de lavado adicional de 3 volúmenes de columna. La elución se realizó a 1 ml/min con tampón E (PO4 1 mM pH 7,0). Las proteínas de fusión purificadas se analizaron mediante SDS-PAGE seguido de tinción de plata usando el kit Daiichi y mediante transferencia de Western, usando el anticuerpo policlonal de conejo 8029K o el anticuerpo de ratón de Herceptina. El análisis mostró que el nivel

15 de pureza después de dos etapas de purificación se estimó al +/-90% por densitometría (Biorad GS-700 Imaging Densitometer). El análisis de transferencia de Western mostró que los monómeros continuaban siendo la banda principal durante toda la purificación, que el nivel de oxidación no aumentaba y que la detección del epítope de interés no se modificaba por las condiciones de purificación, como se demuestra mediante el uso del anticuerpo de Herceptina.

20 La cantidad total de cada proteína de fusión recuperada se midió usando un ensayo de proteína colorimétrico (DOC TCA BCA). Estos ensayos estimaron que 2 y 4 mg de proteína de fusión de ECD-PD y ECD-ΔPD, respectivamente, se purificaban a partir de 75 ml de cultivo, con un nivel de pureza de +/-90%.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una proteína aislada que comprende:

(a)

un dominio extracelular de HER-2/neu o un fragmento del domino extracelular, en el que se han eliminado de 1 a aproximadamente 100 aminoácidos del extremo carboxilo-terminal del domino extracelular; fusionado a:

(b)

un dominio de fosforilación de HER-2/neu o un fragmento del dominio de fosforilación de HER-2/neu, que comprende la SEC ID Nº: 5 o la secuencia de aminoácidos que incluye de Gln 991 a Arg 1049 de la SEC ID Nº: 2, en el que la proteína puede producir una respuesta inmune en un animal de sangre caliente.
2. Una proteína aislada de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende:

(a)

un dominio extracelular de HER-2/neu o un fragmento del domino extracelular, en el que se han eliminado de 1 a aproximadamente 100 aminoácidos del extremo carboxilo-terminal del domino extracelular; fusionado a:

(b)

un dominio de fosforilación de HER-2/neu o un fragmento del dominio de fosforilación de HER-2/neu, que consiste en la SEC ID Nº: 5 o la secuencia de aminoácidos que incluye de Gln 991 a Arg 1049 de la SEC ID Nº: 2.
3. Una proteína aislada seleccionada de:

(a)

una proteína que tiene una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 6, o en la que la proteína comprende una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 3, directa o indirectamente fusionada a una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 4;

(b)

una proteína que comprende una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 3, directa o indirectamente fusionada a una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos el 90% con la secuencia que incluye de Gln 991 a Val 1256 de la SEC ID Nº: 2;

(c)

una proteína que comprende una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 8, directa o indirectamente fusionada a una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 4;

(d)

una proteína que comprende una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 8, directa o indirectamente fusionada a la secuencia de aminoácidos que incluye de Gln 991 a Val 1256 de la SEC ID Nº: 2;

(e)

una proteína que tiene una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 7, o en la que la proteína comprende una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 3, directa o indirectamente fusionada a una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 5;

(f)

una proteína que comprende una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 3, directa o indirectamente fusionada a una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de aminoácidos que incluye de Gln 991 a Arg 1049 de la SEC ID Nº: 2;

(g)

una proteína que comprende una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 8, directa o indirectamente fusionada a una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 5; y

(h)

una proteína que comprende una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 8, directa o indirectamente fusionada a una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de aminoácidos que incluye de Gln 991 a Arg 1049 de la SEC ID Nº: 2;

en la que la proteína es capaz de producir una respuesta inmune en un animal de sangre caliente.
4.

La proteína de la reivindicación 3, en la que la proteína tiene una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 6, o en la que la proteína comprende una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 3, directa o indirectamente fusionada a una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 4.
5.

La proteína de la reivindicación 3, en la que la proteína: comprende una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 3, directa o indirectamente fusionada a una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos el 90% con la secuencia que incluye de Gln 991 a Val 1256 de la SEC ID Nº: 2.
6.

La proteína de la reivindicación 3, en la que la proteína comprende una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia SEC ID Nº: 8, directa o indirectamente fusionada a una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 4.
7.

La proteína de la reivindicación 3, en la que la proteína comprende una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 8, directa o indirectamente fusionada a la secuencia de aminoácidos que incluye de Gln 991 a Val 1256 de la SEC ID Nº: 2.
8.

La proteína de la reivindicación 3, en la que la proteína tiene una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 7, o en la que la proteína comprende una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 3, directa o indirectamente fusionada a una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 5.
9.

La proteína de la reivindicación 3, en la que la proteína comprende una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 3, directa o indirectamente fusionada a una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de aminoácidos que incluye de Gln 991 a Arg 1049 de la SEC ID Nº: 2.
10.

La proteína de la reivindicación 3, en la que la proteína comprende una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 8, directa o indirectamente fusionada a una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 5.
11.

La proteína de la reivindicación 3, en la que la proteína comprende una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de la SEC ID Nº: 8, directa o indirectamente fusionada a una secuencia con una identidad de al menos el 90% con la secuencia de aminoácidos que incluye de Gln 991 a Arg 1049 de la SEC ID Nº: 2.
12.

La proteína de cualquier reivindicación anterior, en la que el dominio extracelular de HER-2/neu se fusiona al dominio de fosforilación de HER-2/neu o fragmento del domino de fosforilación mediante un engarce químico.
13.

La proteína de la reivindicación 12, en la que el engarce químico es un engarce de aminoácidos.
14.

Una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 ó 13.
15.

Un vector viral que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica la proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 ó 13.
16.

Una composición farmacéutica que comprende la proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 o la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 14 y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
17.

La composición farmacéutica de la reivindicación 16, en la que la composición farmacéutica es una vacuna.
18.

La composición farmacéutica de la reivindicación 16, que comprende adicionalmente una sustancia inmunoestimulante o un potenciador de la respuesta inmune.
19.

La composición farmacéutica de la reivindicación 18, en la que el potenciador de la respuesta inmune comprende: un adyuvante, microesferas biodegradables o liposomas.
20.

La composición farmacéutica de la reivindicación 18, en la que el adyuvante comprende AS-2; monofosforil lípido A; monofosforil lípido A 3-des-O-acilado (3D-MPL); oligonucleótidos que contienen CpG; saponina; QS21; una combinación de QS21 y 3D-MPL; QS21 inactivado con colesterol; una combinación de una emulsión de aceite en agua y tocoferol; una combinación de QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua; ISCOMS; RC-529; o Aminoalquil glucosaminida 4-fosfatos (AGP).
21.

La composición farmacéutica de la reivindicación 18, en la que proteína se presenta en una emulsión de aceite en agua.
22.

La composición farmacéutica de la reivindicación 18, que comprende la proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en la que la sustancia inmunoestimulante es SBAS2, 3D-MPL, QS21 o una combinación de 3D-MPL y QS21.
23.

La composición farmacéutica de la reivindicación 16, en la que la molécula de ácido nucleico es una molécula de ADN.
24.

Uso de la proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, el ácido nucleico de la reivindicación 14, o el vector viral de la reivindicación 15, o células infectadas ex vivo con el

vector viral de la reivindicación 15, o células transfectadas ex vivo con el ácido nucleico de la reivindicación 14, para la fabricación de un medicamento para inducir o potenciar una respuesta inmune contra la proteína Her-2/neu.
25.

Uso de acuerdo con la reivindicación 24, en el que el medicamento que contiene proteína

o ácido nucleico se administrará en forma de vacuna.
26.

Uso de la proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, el ácido nucleico de la reivindicación 14, o una célula presentadora de antígenos que expresa una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para la fabricación de un medicamento para inhibir el desarrollo de un cáncer en un paciente.
27.

El uso de la reivindicación 26, en el que la célula presentadora de antígenos es una célula dendrítica.
28.

El uso de la reivindicación 26 ó 27 en el que el cáncer es cáncer de mama, de ovario, de colon, de pulmón o de próstata.
29.

Un procedimiento para eliminar células tumorales de una muestra biológica, comprendiendo el procedimiento la etapa de poner en contacto una muestra biológica con células T que reaccionan específicamente con una proteína de fusión de HER-2/neu, en el que la proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos que está codificada por una secuencia polinucleotídica seleccionada del grupo que consiste en:

(i) el polinucleótido de la reivindicación 14; y

(ii) complementarias de los polinucleótidos anteriores; en el que la etapa de contacto se realiza en condiciones y durante un tiempo suficientes para permitir la eliminación de las células que expresan el antígeno de la muestra, y en el que la muestra biológica es sangre o una fracción de la misma.
30.

Un procedimiento para estimular y/o expandir in vitro o ex vivo células T específicas para una proteína de fusión de HER-2/neu, comprendiendo el procedimiento la etapa de poner en contacto células T con: la proteína de las reivindicaciones 1 a 13; un polinucleótido que codifique dicha proteína de fusión; o una célula presentadora de antígenos que exprese dicha proteína de fusión.
31.

Una población de células T aislada, que comprende células T preparadas de acuerdo con el procedimiento de la reivindicación 30.
32. Un procedimiento para generar una proteína de fusión de Her-2/neu de acuerdo con 5 cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

(a)

introducir en una célula un vector de expresión que comprende un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 14;

(b)

cultivar la célula transfectada; y

(c)

purificar la proteína expresada.

10
33. El procedimiento de la reivindicación 32, en el que la célula es una de las siguientes células o líneas celulares: líneas celulares CV-1/EBNA, células L, C127, 3T3, de ovario de hámster chino (CHO), COS, NS-1, HeLa, de fibroblastos de riñón embrionario humano (HEK 293) y BHK.

15
34. El procedimiento de la reivindicación 33, en el que la célula se cultiva en suspensión, en condiciones sin suero.
35. El procedimiento de la reivindicación 32, en el que la proteína expresada se purifica por 20 un procedimiento de dos etapas, comprendiendo el procedimiento:

(a)

cromatografía de intercambio aniónico en columnas de alto rendimiento de Q-sefarosa; y

(b)

cromatografía hidrófoba en Phenyl Sepharose 6 Fast Flow de baja sustitución.