KR20060129486A - 다능성 줄기세포의 증식 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 ES 세포와 같은 다능성 줄기세포의 신규한 증식 방법에 관한 것이다. 본 발명은 액체 배양 배지와 다능성 줄기세포에 접착할 수 있는 분자가 일정 농도로 기질 고상 표면에 고정 또는 코팅된 배양 용기를 이용하여, 임의의 피더 세포를 사용하지 않고도 미분화성 및 분화 다능성인 상태를 유지시키면서 분산 상태에서 수행되는 다능성 줄기세포의 증식 또는 유전자 도입/발현시키는 것을 특징으로 하는, 미분화성 및 분화 다능성인 상태로 유지시키는 조건하에서의 다능성 줄기세포의 증식 방법을 제공한다.

다능성 줄기세포, 미분화 증식

Description

다능성 줄기세포의 증식 방법{METHOD OF PROLIFERATING PLURIPOTENT STEM CELL}

본 발명은 ES 세포를 포함한 다능성 줄기세포의 증식 방법, 유전자 도입 방법, 및 상기 방법으로 제조된 다능성 줄기세포에 관한 것이다.

생물은 자신의 생명을 유지하기 위해 생체의 결손된 세포와 조직을 신속하게 보완 및 수복하는 능력을 가지고 있는데, 이러한 능력을 "재생력"이라고 한다. 고등동물에서의 "재생력"의 예로 피부나 혈관 등의 창상 치유가 일반적으로 잘 알려져 있지만, 간장이나 신장의 대형 실질 장기에서도 조직 상해시 신속하게 조직 항상성을 회복시키기 위해 세포의 증식 또는 조직의 재구축이 이루어지는 것으로 알려져 있다. 근래, 생물 개체가 선천적으로 가지고 있는 "재생력"을 이용하여 각종 질병이나 창상을 치유 및 개선시키고자 하는 시도가 진행되고 있는데, 이를 "재생 의료"라고 하며, 새로운 의료 기술로서 주목받고 있다.

"재생 의료"를 실시하는데 있어, 중추적인 역할을 하는 것이 "줄기세포(stell cells)"이다. 일반적으로 "줄기세포"는 어느 특정한 또는 복수 개의 기능적 세포로 분화되는 능력 및 스스로 동일한 세포를 반복적으로 생산할 수 있는 자기 복제 능력을 가진, 미분화 세포로 정의할 수 있다. 각종 조직과 세포에는 고 유 줄기세포가 존재하고 있으며, 예컨대, 적혈구, 림프구, 거대핵세포(megakaryocyte) 등의 일련의 혈액 세포는 조혈 줄기세포(hematopoietic stem cell)라고 하는 줄기세포로부터 세포의 유래가 되는 전구세포(progenitor cell)를 거쳐서 생산되며, 골격근 세포는 근위성세포(satellite cell)나 근원세포(myoblast)라고 하는 줄기세포/전구세포로부터 생산된다. 그 이외에도, 뇌 또는 척수 등의 신경 조직에 존재하여, 신경 세포나 신경아교 세포(glial cell)를 생산하는 신경 줄기세포, 표피 세포나 모근 세포를 생산하는 표피 줄기세포, 간 세포나 담관 세포를 만드는 타원형 세포(간 줄기세포), 심근 세포를 만드는 심장 줄기세포 등이 지금까지 특정되어 있다.

줄기세포 또는 상기 세포에서 유래된 전구세포를 이용한 재생 의료 방법은 일부 이미 실용화되고 있으며, 백혈병이나 재생 불량성 빈혈 등의 혈구계 세포의 부족 및 기능 부전으로 인한 질환을 치료하기 위해 조혈 줄기세포 또는 조혈 전구세포를 주입 이식하는 방법이 잘 알려져 있다. 그러나, 뇌, 심장 또는 간장 등의 실질 장기 내에 존재하는 줄기세포의 경우, 생체 조직으로부터 수득 및/또는 시험관내 배양이 기술적으로 어려울 뿐만 아니라 이들 줄기세포는 일반적으로 증식력이 낮다. 게다가, 상기 줄기세포를 사체의 조직으로부터 회수할 수도 있지만, 이와 같이 수득한 세포를 의료에 이용하는 것은 윤리적으로 문제가 된다. 따라서, 신경 질환이나 심장 질환 등의 재생 치료를 위해서는 대상 조직에 존재하는 줄기세포 이외의 세포를 이용하여, 원하는 세포종을 준비하는 기술의 개발이 요구된다.

이러한 관점에 따른 시도로, 우선 "다능성 줄기세포(pluripotent stem cells)"를 이용하는 방법을 들 수 있다. "다능성 줄기세포"는 시험관내(in vitro) 배양으로 미분화 상태를 유지시킨 상태로 거의 영구적 또는 장기간 세포 증식이 가능하며, 정상적인 핵(염색체)형을 나타내며, 적정 조건에서는 3 배엽(외배엽, 중배엽, 및 내배엽)의 모든 계보의 세포로 분화가능한 능력을 지닌 세포이다. 현재, 다능성 줄기세포로는 초기 배아로부터 분리한 배아 줄기세포(Embryonic Stem cells : ES 세포)와 그 유사 세포가 있으며, 태아기의 원시 생식세포(primordial germ cell)에서 분리한 배아 생식세포(Embryonic Germ cells : EG 세포)가 가장 잘 알려져 있으며, 여러가지 연구에 이용되고 있다.

ES 세포는 배반포(blastocyst)기의 배아 내부에 있는 내부 세포 덩어리(inner cell mass)라고 하는 세포 덩어리(細胞集塊)를 시험관내 배양으로 옮겨, 세포 덩어리의 해리와 계대를 반복함으로써, 미분화 줄기세포 집단으로서 분리할 수 있다. 또한, 상기 세포는, 마우스 태아 조직 유래 초대 배양의 섬유아세포(Murine Embryonic Fibroblasts; 이하, AEF 세포)나 ST0 세포 등의 간질계(間質系, stromal line) 세포를 이용하여 제작한 피더 세포(feeder cell) 상에서, 적정 세포 밀도를 유지시키고, 배양액을 자주 교체하면서 이차배양(subculture)을 반복함으로써, 미분화 줄기세포의 성질을 지닌 세포주로서 수립할 수 있다. 또한, ES 세포는 다른 특징으로 텔로머라아제를 가지는데, 염색체의 텔로미어 길이를 유지시키는 활성을 나타내는 상기 효소의 존재에 의해, ES 세포는 시험관내에서 거의 무제한의 세포 분열 능력을 가진다.

이와 같이 제작한 ES 세포주는 정상적인 핵형을 유지하면서 거의 무한정 증 식과 계대를 반복하고, 동시에 여러 종류의 세포로 분화할 수 있는 능력, 즉, 다분화능을 가지고 있다. 예로, ES 세포를 동물 개체의 피하, 복강내 또는 정소내 등에 이식하면 기형종(테라토마)이라고 하는 종양이 형성되는데, 상기 종양은 신경세포, 뼈, 연골세포, 장관세포, 근육세포 등의 여러 종류의 세포와 조직이 서로 혼재된 것이다. 또한, 마우스의 경우, ES 세포를 배반포기 배아에 주입하여 이식하거나 또는 8 세포기의 배아와 응집시켜서 만든 집합 배아를, 가임신 마우스의 자궁 내에 이식함으로써, 체내의 모든 또는 일부의 기관 및 조직내에 ES 세포로부터 유래된 분화 세포를 특정 비율로 포함하는 새끼 개체, 즉 키메라 마우스를 만들어 낼 수 있다. 이러한 기술은 원하는 유전자를 인위적으로 파괴시키거나 또는 변형시킨 마우스 개체, 이른바 낫-아웃 마우스를 제작하기 위한 기초적인 기술로서 자주 사용되고 있다.

또한, ES 세포는 시험관내 배양에서도 각종 다양한 세포종으로 분화 유도될 수 있는 것으로 알려져 있다. 세포종에 따라 구체적인 방법은 다르지만, ES 세포를 부유 배양에 의해 응집시키고, 배아 유사 상태의 세포 덩어리, 이른바 배아체(Embryoid Body; 이하, EB라 축약함)을 형성시킴으로써, 분화를 유도하는 방법을 일반적으로 이용할 수 있다. 이러한 방법으로, 태아기의 내배엽, 외배엽 또는 중배엽의 성질을 가지는 세포나, 혈구 세포, 혈관 내피세포, 연골 세포, 골격근 세포, 평활근 세포, 심근 세포, 신경아교 세포, 신경 세포, 상피세포, 멜라닌세포, 각질형성세포, 지방세포 등의 분화 세포를 제작할 수 있다. 이러한 시험관내 배양으로 제조한 분화 세포는 장기와 조직에 존재하는 세포와 구조적으로 또는 기능적 으로 거의 동일한 형질을 가지고 있어, 실험 동물을 이용한 이식 실험에 의해 ES 세포 유래 세포가 장기 및 조직에 정착하여, 정상적으로 기능하는 것으로 확인되고 있다.

이상, ES 세포의 특성, 배양법, 및 생체내/시험관내 분화 능력에 관한 총설로서, 복수의 참고서적, 예를 들면, Guide to Techniques in Mouse Development(Wasserman et al., Academic Press, 1993); Embryonic Stem Cell Differentiation in vitro(M. V. Wiles, Meth. Enzymol. 225: 900, 1993); Manipulating the Mouse Embryo : A laboratory manual(Hogan et al., Cold Spring /harbor Laboratory Press, 1994)(비특허문헌 1 참조); Embryonic Stem Cells(Turksen 편, Humana Press, 2002)(비특허문헌 2 참조) 등을 참조할 수 있다.

또한, EG 세포는 원시 생식세포이라고 하는 태아기의 생식세포를, ES 세포의 경우와 동일하게, MEF 세포나 ST0 세포 등의 피더 세포 상에서, 백혈병 저해 인자(Leukemia Inhibitory Factor; 이하, LIF라 함) 및 염기성 섬유아세포 증식 인자(basic Fibroblast Growth Factor: 이하, bFGF/FGF-2라 함) 또는 포스콜린(forskolin) 등의 약제로 자극함으로써 제작할 수 있다(Matsui et al., Cell 70: 841, 1992 참조; Koshimizu et al., Development 122: 1235, 1996 참조). EC 세포는 ES 세포와 매우 유사한 성질을 가지고 있어, 분화 다능성을 가지고 있는 것으로 확인되었다(Thomson & 0dorico, Trends Biotechnol. 18: 53, 2000). 그러므로, 이하, "ES 세포"이라고 표기한 경우는 "EG 세포"도 포함하는 것이다.

1995년, Thomson 등이 처음으로 영장류(붉은털 원숭이)로부터 ES 세포를 수 립함으로써, 다능성 줄기세포를 이용한 재생 의료의 실용화가 현실성을 가지게 되었다(미국 특허 제 5,843, 780호; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7844, 1995). 또한 동일한 방법에 의해, 그들은 인간 초기 배아로부터 ES 세포주를 성공적으로 분리 및 수립하였다(Science 282: 114, 1998}. 그 후, 오스트레일리아와 싱가폴의 연구 그룹들에서도 동일한 보고가 있었으며(Reubinoff 등, Nat. Biotech. 18: 399, 2000; 국제 공개번호 제 00/27995호), 현재, 미국 국립위생연구소(NIH)의 리스트(http: //stemcells.nih.gov/registry/index.asp)에는 20종 이상의 인간 ES 세포주가 등록되어 있다. 한편, Gearhart 등은 인간 원시 생식세포로부터 인간 EG 세포주를 수립하는 것에 성공하였다(Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13726, 1998; 미국 특허 제 6,090,622호).

이들 다능성 줄기세포를 연구 재료로 또는 재생 의료 제품의 제작을 위해 사용할 경우, 상기 세포의 미분화성 및 높은 증식능을 유지시키는 방법으로 이차배양하는 것이 불가피하다. 일반적으로 ES/EG 세포는 MEF 세포 또는 그것의 유사 세포(ST0세포 등)를 피더 세포로서 이용함으로써,상기 세포의 미분화성 및 증식성을 유지시킬 수 있다. 배양액에 첨가하는 소태아 혈청(Fetal Bovine Serum; 이하, FBS)의 존재도 중요하며, ES/EG 세포의 배양에 적합한 FBS를 선정하여, 상기 FBS를 통상적으로 10-20%량 첨가하는 것도 중요하다. 또한, 마우스 배아에서 유래된 ES/EG 세포의 경우, 미분화 상태를 유지시키는 인자로서 LIF가 동정되었으며(Smith & Hoopel, Dev. Biol. 121: 1, 1987; Smith et al., Nature 336: 688, 1988; Rathjen et al., Genes Dev. 4: 2308, 1990), 배양액에 LIF를 첨가함으로써, 보다 효과적으로 미분화 상태를 유지시킬 수 있다(이상, 참고서적으로 Manipulating the Mouse Embryo : A laboratory manual(Hogan et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994(비특허문헌 1), 또는 Embryonic Stem Cells(Turksen 저, HullLa na Press, 2002)(비특허문헌 2)등을 참조함).

그러나, 이러한 고전적인 ES/EG 세포의 배양법은, 특히 인간 ES(또는 EG)세포를 재생 의료 또는 다른 실용적인 목적으로 사용할 경우에 적합한 방법이라고 할 수 없다. 그 이유는, 첫째, 인간 ES 세포는 LIF에 대한 반응성이 없으며, 피더 세포가 존재하지 않는 세포는 사멸하거나 미분화성을 상실하여 이종세포로 분화된다(Thomson et al., Science 282: 114, 1998). 또한, 피더 세포의 사용 자체에도 문제가 있어, 공동 배양시스템은 생산 단가를 높이고 배양 규모를 확대시키기 어려우며, 게다가 ES 세포를 실제로 사용할 때 ES 세포를 피더 세포에서 분리 및 정제하여야 한다. 또한, 장래에 인간 ES 세포를 비롯한 다능성 줄기세포를 재생 의료용으로, 특히 세포 이식 치료를 위한 세포 공급원으로 사용할 경우, MEF 세포나 FBS 등의 인간을 제외한 동물 유래 세포나 제품의 사용으로 ES 세포가 이종 동물 유래의 바이러스로 감염될 가능성이 있거나, 또는 이종 항원으로 인식될 수 있는 항원 분자로 오염될 가능성이 있어, 바람직하지 않다(Martin et al., Nature Med. 11: 228, 2005).

그러므로, ES/EG 세포의 배양법을 보다 세련되고, 장래 실용화에 적합한 방법으로 개선시키기 위한, FBS 대체품의 개발(국제 공개 번호 WO98/30679)이나, MEF 세포 대신 인간 세포를 피더 세포로 이용하는 시도(Richards et al., Nature Biotech. 20: 933, 2002; Cheng et al., Stem Cells 21: 131, 2003; Hovatta et al., Human Reprod. 18: 1404, 2003; Amit et al., Biol. Reprod. 68: 2150, 2003)가 활발하게 진행되고 있다. 또한, 피더 세포를 사용하지 않는 배양법의 개발도 매우 진척되고 있다. Carpenter와 공동 연구자들은 ES 세포를 마트리겔 또는 라미닌으로 코팅한 배양 플레이트에 접종하고, MEF 세포의 배양 상청(conditioned medium)을 배양액에 첨가함으로써, 인간 ES 세포를 미분화 및 분화 다능성을 보유한 상태로 장기간 배양할 수 있음을 보고하였다(Xu et al., Nature Biotech. 19: 971, 2001(비특허문헌 3); 국제 공개번호 제 01/51616호(특허문헌 1) 참조). 또한, 상기 연구자들은 bFGF/FGF-2나 줄기세포 증식 인자(Stem Cell Factor; 이하, SCF)를 첨가한 무혈청 배지를 개발함으로써, 보다 효과적인 ES 세포 배양 시스템의 구축에 성공하였다(국제 공개번호 제 03/020920호(특허문헌 2) 참조). 동일한 무혈청 배지를 사용한 피더 세포가 불필요한 ES 세포 배양 시스템이 이스라엘의 연구 그룹에서도 보고되었다(Amit et al., Biol. Reprod. 70: 837, 2004(비특허문헌 4) 참조). 또한, 최근에는 bFGF/FGF-2와 뼈 형성 인자(bone morphogenetic proteins) 길항제인 노긴(Noggin)을 첨가함으로써, 인간 ES 세포의 미분화성을 유지하는 방법도 보고되었다(Xu et, al., Nature Methods 2: 185, 2005). 한편, 글리코겐 합성 효소 키나제(Glycogen Synthase Kinase: GSK)-3 저해제를 배양액에 첨가하는 것만으로도, 특별히 성장 인자 등을 첨가하지 않고 피더 세포를 사용하지 않고도, 마우스 및 인간 ES 세포의 미분화성을 효율적으로 유지시킬 수 있는 것으로 확인되었다(Sato et al., Nature Med. 10: 55, 2004(비특허 문헌 5) 참조).

이와 같이, 피더 세포를 사용하지 않는 다능성 줄기세포의 배양법에 대하여 새로운 방법들이 고안되고 있지만, 상기 세포의 실용화 및 산업적인 사용을 위해서는 다능성 줄기세포의 증식 효과 및 배양법의 편리성을, 보다 한층 향상시킬 필요가 있다.

마우스 ES/EG 세포의 미분화 상태를 유지시키는 동시에 증식력을 높이는 인자로서 상기 LIF가 공지되어 있으며, LIF에 유사한 IL-6계 분자도 동일 범주에 포함되지만(Yoshida et al., Mech. Dev. 45: 163, 1994; Koshimizu et al., Development 122: 1235, 1996 참조), 그 밖의 예는 거의 보고되어 있지 않다. 최근, bFGF/FGF-2나 SCF를 첨가한 무혈청 배지가 인간 ES 세포의 증식력을 매우 개선시킨다는 보고가 있었다(국제 공개번호 제 03/020920호(특허문헌 2) 참조).

종래에는 본래 ES 세포의 특성, 즉, 세포의 증식성이 다른 세포에 비해 왕성하므로 증식력에 대한 정보를 얻고자하는 시도는 적었지만, 동시에, 재생 의료 현장의 요구에 의해 상기 세포의 증식성을 높일 필요성이 있었다.

실제 다능성 줄기세포의 배양에 대한 과제의 하나로서, 상기 세포는 일반적으로 견고한 콜로니를 형성하기 때문에, 이차배양 등을 수행할 때에 취급이 곤란하다. 미분화 상태인 ES/EG 세포는 통상적으로 세포간 서로 강하게 접착한 상태이고, 하나 하나의 세포의 경계가 불명료한 세포 덩어리, 즉, 콜로니를 형성한다. 그러므로, ES/EG 세포의 이차배양이나 분화 유도 등의 실험에 제공할 때에는 트립신 등의 단백질분해 효소액으로 처리하여, 가능한 단시간에 콜로니를 분산시켜야 한다. 그러나, ES/EG 세포의 콜로니를 분산시켜 단일 세포로 제공하기 위해서는 비교적 고농도의 단백질분해 효소 처리 및/또는 강력한 기계적 교반이 요구되며, 이러한 조작은 ES/EG 세포의 생존성이나 생착성을 현저하게 저하시키는 원인이 된다.

또한, ES/EG 세포를 밀집한 상태에서 계속 배양하면 자발적으로 분화가 진행되므로, 계대배양시 단일세포가 될 때까지 분산시키거나, 또는 콜로니가 과도한 크기로 성장하기 전에 계대배양을 실시하여야 한다. 예를 들어, 마우스 ES 세포는 통상적으로 2 내지 3일간의 계대배양이 필요하지만, 이때 적절한 방법으로 계대를 실시하지 않으면, 미분화 상태에서 벗어난 세포가 집단에 출현하여 사용에 적합하지 않은 세포가 되어버린다. 이는 단순히 ES/EG 세포의 미분화성을 유지하는 인자, 예컨대, LIF 또는 GSK-3 저해제를 충분한 양으로 첨가하는 것만으로는 해결할 수 없으며, 콜로니의 과잉 성장은 분화·형질을 가진 세포의 출현을 야기한다. 그러므로, ES/EG 세포가 콜로니를 형성하지 않는 상태에서 즉, 세포가 1개씩 분산된 상태에서 증식시키는 방법이 ES/EG 세포를 산업상의 이용에 제공할 경우에 매우 유용한 것으로 생각된다. 그러나, 이러한 시도 및/또는 성공예는 지금까지 전무한 실정이다.

이전에, 발명자들은 배아 암종 세포의 일종으로, 통상적으로 콜로니를 형성하여 증식하는 것으로 알려져 있는 F9 세포를, E-카드헤린을 코팅한 배양 플레이트(Nagaoka et al., Biotechnol. Lett. 24: 1857, 2002(비특허문헌 6) 참조)에 접종하였을때, 상기 세포의 콜로니가 형성되지 않는 것을 발견하였다(International Symposium on Biomaterials and Drug Delivery Systems, 2002. 04.14 - 16, 타이베 이, 타이완; 제1회 일본 재생 의료학회, 2002.4.18 - 19., 교토, 일본). 즉, F9 세포의 세포 접착 분자로 알려져 있는 E-카드헤린을 무처리의 폴리스티렌제 배양 플레이트에 고상화한 배양 플레이트(이하, E-cad 플레이트) 상에서, F9 세포는 분산형의 세포 형태를 나타내었다.

F9 세포는 ES/EG 세포의 특이 마커로 알려진 알카리성 포스파타아제(ALkaline Phosphatase; 이하, ALP)나 SSEA-1, Oct-3/4 등을 발현하는 등, 일부 ES 세포와 유사한 형질을 나타낸다(Leht onen et al., Int. J. Dev. Biol. 33: 105, 1989, Alonso et al., 35: 389, 1991). 그러나, F9 세포는 세포의 미분화성을 유지하기 위해 피더 세포나 LIF 등을 필요로하지 않으며, 미분화 유지 메커니즘상의 차이가 있다. 또한, ES 세포는 3배엽으로의 분화 능력을 가지고 있는 것에 반해, F9 세포의 분화는 내배엽계 세포로 한정되고 있어, 키메라 형성력도 없다. 즉, F9 세포는 어떤 종류의 실험에서는 ES/EG 세포의 모델 시스템로 사용할 수도 있지만, 배양법이나 배양 조건 측면에서는 ES/EG 세포와 상이한 부분이 많다.

그로인해, 상기 E-cad 플레이트를, 피더 세포를 필요로 하지 않는 ES 세포배양법에 적용할 수 있는지, 또한, 그와 같은 방법으로 배양한 ES 세포가 미분화성 및 분화 다능성을 보유한 상태로 이차배양 가능한지, 나아가 해당 ES 세포의 증식력을 촉진시킬 수 있을지 등은, 과학적인 근거를 기초로 예측하긴 어렵다. 실제로, E-cad 플레이트에서 배양한 F9 세포의 증식력은 종래의 세포 배양용 플레이트에서 배양한 F9 세포와 거의 동일하였으며, ES 세포의 증식력을 촉진시킬 방법을 유추할 수 없었다.

E-카드헤린은 미분화한 마우스 ES 세포에서 발현되는 것으로 공지되어 있으며, 또한, E-카드헤린 유전자의 발현을 유전자 공학적으로 결손시킨 ES 세포에서는 세포간 접착이 현저하게 저해된다는 사실이 알려져 있다(Larue et al., Developnlent 122: 3185, 1996). 그러나, ES/EG 세포의 배양법에서 E-카드헤린을 접착 기질로 사용한 시도는 지금까지 전무한 실정이다.

상기한 효율적인 증식방법과 함께, ES 세포를 비롯한 다능성 줄기세포를 연구 재료 또는 재생 의료 제품의 제작에 사용할 경우, 상기 세포에 원하는 외래 유전자를 효율적으로 도입하고, 발현시키기 위한 방법의 구축도 필요하다. 특히, ES 세포를 여러가지 질환 치료 등의 재생 의료에 응용하기 위해서는, 상기 세포의 증식력, 분화력 등의 세포 특성, 또는 약제 감수성 등을 변이시키는 방법도 하나의 수단으로서 고려되고 있으며, 이를 위해 적합한 외래 유전자를 세포에 도입하여, 발현시키는 방법이 매우 바람직하다. 또한, 마우스 ES 세포의 경우, 그 유전자를 인위적으로 변이시켜, 이른바 형질전환 마우스나 낫-아웃 마우스 등의 제작 방법이 공지되어 있어, 효율적인 유전자 도입 방법으로 매우 유용한다.

일반적으로 세포에 외래 유전자를 도입할 때, 인산 칼슘이나 DEAE-덱스트란 또는 양이온성 지방질 제제 등을 이용하는 방법을 자주 사용한다. 그러나, 이들 방법을 ES 세포에 적용하면, 다른 세포 시스템에 비해 효율이 낮은 것으로 알려져 있다(Lakshmipathy et al., Stem Cells 22: 531, 2004(비특허문헌 8) 참조). 또한, 외래 유전자를 도입하기 위한 방법으로서, 각종 바이러스 벡터를 이용하는 방법도 보고되어 있다. 예를 들면, 레트로바이러스 벡터(Cherry et al., Mol. Cell Biol., 20: 7419, 2000)이나 아데노바이러스 벡터(Smith-Arica et al., Cloning Stem Cells 5: 51, 2003), 렌티바이러스 벡터(Hanaguchi et al. J. Virol. 74: 10778, 2000; Asano et al., Mol. Ther. 6: 162, 2002; 국제 공개번호 제 W002/101057), 센다이바이러스 벡터(Sasaki et al., Gene Ther, 12: 203, 2005; 일본 특허 공개번호 제 2004344001) 등이 공지되어 있다. 그러나, 바이러스 벡터의 구축 및 제작 방법이 비교적 복잡하고, 장기간의 작업이 소요되며 동시에, 사용 바이러스에 따라서는 생물학적 안전성 문제도 우려되어, 편리하면서도 범용적인 방법이라고는 하긴 어렵다.

따라서, ES 세포에 외래 유전자를 도입할 때에는 전기천공법(electroporation)이라고 하는 방법을 흔히 사용한다. 상기 방법은 세포에 전기 펄스를 인가하여 세포막에 일시적으로 구멍을 형성시키고, 외래 유전자를 세포내로 도입시키는 방법으로, 범용성이 높다. 최근에는 이 방법의 개량법으로, 외래 유전자를 세포 핵까지 도입하여, 그 발현 효율을 현저하게 향상시키는 뉴클레오펙션(Nucleofection) 방법도 확립되어 있다(Lorenz et al., Biotech. Lett. 26: 11 589, 2004; Lakshmipathy et al., Stem Cells 22: 531, 2004(비특허문헌 8) 참조). 단, 이러한 방법은 특별한 전기 펄스 발생 장치가 필요하고, 적정 조건을 설정하기 어렵다. 또한, 세포를 일단 트립신 등의 단백질분해 효소로 처리하여 단일 세포로 분산시켜야 하므로, 세포 손상도도 비교적 높은 편이다.

따라서, ES 세포를 비롯한 다능성 줄기세포의 유전자 도입법에서는, 저가로 구입할 수 있거나, 또는 간편하게 제작할 수 있는 유전자 도입제를 이용하고, 세 포를 배양기에서 배양한 그대로의 상태에서 효율적으로 외래 유전자를 도입시킬 수 있는 방법이, 유용성이 매우 높은 것으로 생각할 수 있다.

비특허문헌 1: Manipulating the Mouse Embryo : A laboratory manual(Hogan et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994)

비특허문헌 2: Embryonic Stem Cells(Turksen편, Humana Press, 2002)

비특허문헌 3: Xu et al., Nature Biotech. 19: 971, 2001

비특허문헌 4: Amit et al. Biol. Reprod. 70: 837, 2004

비특허문헌 5: Sato et al. Nature Med. 10: 55, 2C04

비특허문헌 6: Nagaoka et al., Biotechnol. Lett. 24: 1857, 2002

비특허문헌 7: Nagaoka et al., Protein Eng. 16: 243, 2003

비특허문헌 8: Lakshmipathy et al., Stem Cells 22: 531, 2004

특허문헌 1: 국제 공개번호 제 01/51616호

특허문헌 2: 국제 공개번호 제 03/020920호

발명의 개요

전술한 배경으로부터, 본 발명은 ES 세포를 비롯한 다능성 줄기세포를 피더 세포를 이용하지 않고 배양하는 방법에 관한 것으로, 세포의 증식력을 촉진시키는 방법, 및 유전자 도입 효율을 향상시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

이를 위해, 발명자들은 ES 세포를 콜로니로 형성되지 않은 상태, 즉, 분산 상태로 배양함으로써, 상기 세포의 증식력이 촉진될 가능성과 유전자 도입 효율이 촉진될 가능성을 검토하였다.

전술한 바와 같이, 본 발명자들은 배아 암종 세포의 일종인 F9 세포를, 콜로니를 형성하지 않는 상태, 즉, 분산 상태로 성공적으로 배양한 바 있다. E-카드헤린을 고상 표면에 고정 또는 코팅한 세포 배양 플레이트(E-cad 플레이트)를 제작하고, 이 플레이트에 F9 세포를 접종하면, 상기 F9 세포는 콜로니를 형성하지 않고, 분산형의 세포 형태를 나타낸다. 이 때, E-cad 플레이트에서 배양한 F9 세포와 통상적인 플레이트에서 배양한 F9 세포의 증식력은 거의 동일하다.

ES 세포를 E-cad 플레이트에 접종한 결과, 거의 모든 세포가 상기 플레이트에 부착하며, F9 세포와 동일하게 콜로니를 형성하지 않으면서 분산형의 세포 형태를 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 본 배양 조건에서 E-cad 플레이트에 접종한 ES 세포의 증식력이 통상 플레이트에서 배양한 ES 세포의 증식력에 비해 유의적으로 높은 것으로 나타났다. 또한, 외래 유전자의 도입 효율 및 발현량도 유의적으로 높은 것이 나타났다.

E-cad 플레이트에서 수회 이차배양(subcloning)한 ES 세포는, 액체 배지에 미분화성을 유지시키는 인자 등을 첨가함에 의해 미분화 상태로 유지되며, 분화 다능성도 유지할 수 있는 것으로 확인되었다. 또한, 이러한 방법으로 제조한 ES 세포는 기존의 방법을 이용하여 신경 세포나 심근 세포와 같은 기능적 분화 세포로 분화를 유도할 수 있으며, 나아가 마우스 초기 배아에 이식하여 키메라 마우스를 제작할 수 있음을 또한 입증하여, 이를 토대로 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명의 제1 측면은 ES 세포를 비롯한 다능성 줄기세포의 증식 방법에 관한 것으로, 피더 세포를 사용하지 않는 신규한 증식 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 다능성 줄기세포 배양시 접착성을 가지는 분자가 일정 농도로 기재(base material) 고상 표면에 고정 또는 코팅된 배양 용기를 이용하는 것을 특징으로 하며, 상기 세포는 분산 상태로 배양하여 증식력을 향상시킬 수 있다. 이와 같이 하여 제조한 다능성 줄기세포는 미분화성 및 분화 다능성을 보유하고 있다.

제2 측면에 있어서, 본 발명의 방법은 다능성 줄기세포의 배양시 접착성 분자를 일정 농도로 기재 고상 표면에 고정 또는 코팅한 배양 용기를 이용하는 것을 특징으로 하며, 상기 세포를 분산 상태로 배양함으로써 상기 세포에 대한 유전자 도입 효율을 높일 수 있다.

다른 구현예로, 본 발명은 본 발명에 개시된 방법으로 제조한 미분화성 및 분화 다능성을 가진 다능성 줄기세포에 관한 것이다. 본 발명에서, 다능성 줄기세포의 "미분화한" 상태는 적어도 1개 이상의 미분화 마커의 발현에 의해 확인할 수 있다.

또 다른 예로, 본 발명은 본 발명에 따른 방법으로 제조한 다능성 줄기세포로부터 적절한 분화 유도 처리에 의해 제조한 분화 세포에 관한 것이다. 분화 세포는 일반적으로 다능성 줄기세포로부터 분화 유도할 수 있는 종의 세포일 수 있으며, 특별히 한정되지 않는다. 구체적으로는 외배엽 세포 또는 외배엽 유래 세포, 중배엽 세포 또는 중배엽 유래 세포, 내배엽 세포 또는 내배엽 유래 세포 등을 들 수 있다.

또 다른 예로, 본 발명은 본 발명에 따른 방법으로 제조한 다능성 줄기세포를 이용하여 키메라 배아 또는 키메라 동물을 제조하는 방법 및 제조한 키메라 배아 또는 키메라 동물에 관한 것이다.

본 발명은 주로 하기에 관한 것이다.

(1) 액체 배지와 상기 다능성 줄기세포에 접착성을 가지는 분자를 기재 고상 표면에 고정 또는 코팅한 배양 용기를 이용함으로써, 피더 세포를 사용하지 않고, 미분화성 및 분화 다능성을 지닌 분산 상태로 다능성 줄기세포를 증식시키는 것을 특징으로 하는 다능성 줄기세포의 증식 방법.

(2) 액체 배지와 상기 다능성 줄기세포에 접착성을 가지는 분자를 기재 고상 표면에 고정 또는 코팅한 배양 용기를 이용함으로써, 다능성 줄기세포에 유전자를 효율적으로 유전자를 도입 및 발현시키는 것을 특징으로 하는 다능성 줄기세포의 유전자 도입 방법.

(3) 상기 다능성 줄기세포에 접착성을 가지는 분자는 상기 다능성 줄기세포에서 발현되는 분자이거나, 또는 상기 분자와 구조적으로 유사성을 가진 분자이며 다능성 줄기세포와 동종친화적인 결합성을 가지는 분자인 것을 특징으로 하는, 상기 (1) 또는 (2)에 기재된 방법.

(4) 상기 다능성 줄기세포에 접착성을 가지는 분자는 카드헤린계 분자인 것을 특징으로 하는, 상기 (3)에 기재된 방법.

(5) 상기 카드헤린계 분자는 E-카드헤린이거나, 또는 상기 분자와 구조적으로 유사성을 가지는 분자이며, E-카드헤린의 EC1 도메인, EC2 도메인, EC3 도메인, EC4 도메인 및 EC5 도메인 중 1개 이상의 도메인을 포함하고, 상기 다능성 줄기세포와 동종친화적인 결합성을 가지는 분자인 것을 특징으로 하는, 상기 (4)에 기재된 방법.

(6) 상기 E-카드헤린은 포유동물 유래인 것을 특징으로 하는, 상기 (5)에 기재된 방법.

(7) 상기 E-카드헤린은 인간 또는 마우스 유래인 것을 특징으로 하는, 상기 (6)에 기재된 방법.

(8) 상기 다능성 줄기세포에 접착성을 가지는 분자는 면역 글로불린의 Fc 영역과 융합하여, 상기 Fc 영역을 통해 상기 기재 고상 표면에 고정되는 것을 특징으로 하는, 상기 (1)-(7) 중 어느 하나에 기재된 방법.

(9) 상기 다능성 줄기세포는 포유동물의 배아 줄기세포(ES 세포) 또는 배아 생식 세포(EG 세포)인 것을 특징으로 하는, 상기 (1)-(8) 중 어느 하나에 기재된 방법.

(10) 상기 (1) 내지 (9) 중 어느 하나의 방법에 의해 제조된 다능성 줄기세포.

발명의 상세한 설명

정의

본 명세서에서, 용어 "다능성 줄기세포"는 시험관내 배양에 의해 미분화 상태를 유지한 채, 거의 영구적으로 또는 장기간 세포 증식이 가능하며, 정상 핵(염색체)형을 나타내며, 적정 조건에서 3배엽(외배엽, 중배엽, 내배엽)의 모든 계보의 세포로 분화가능한 능력을 가진 세포를 의미한다. "다능성 줄기세포"는 초기 배아로부터 분리되는 ES 세포, 및 그 유사 세포이며, 태아기의 원시 생식 세포에서 분리되는 EG 세포를 포함하지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 본 명세서에서, "ES 세포"라고 표기한 경우 "EG 세포"도 포함할 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "미분화성"은 다능성 줄기세포에서 적어도 1개 이상의 미분화 마커, 예컨대 ALP 활성이나 0ct-3/4 유전자(산물)의 발현, 또는 여러가지 항원 분자의 발현에 의해 확인할 수 있는 미분화한 상태를 나타내는 성질을 의미한다. 다능성 줄기세포의 미분화한 상태는 다능성 줄기세포가 거의 영구적으로 또는 장기간 세포 증식 가능하고, 정상적인 핵(염색체)형을 나타내며, 적당한 조건에서 3배엽의 모든 계보의 세포로 분화가능한 능력을 가진 상태를 의미한다.

본 명세서에서, 용어 "분화 다능성"은 여러 종류의 세포로 분화 가능한 능력을 의미한다. 분화 세포로는 일반적으로 다능성 줄기세포로부터 분화 유도할 수 있는 종류의 세포 모두일 수 있으며, 특히 한정되진 않는다. 구체적으로, 외배엽 세포 또는 외배엽 유래의 세포, 중배엽 세포 또는 중배엽 유래의 세포, 내배엽 세포 또는 내배엽 유래의 세포 등을 들 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "액체 배지"는 다능성 줄기세포를 이차배양하는 종래의 방법에 사용할 수 있는 모든 액체 배지를 포함한다.

본 명세서에서, 용어 "다능성 줄기세포에 접착성을 가지는 분자"는 다능성 줄기세포와 친화성을 가져 결합·부착하는 분자일 수 있으며, 단백질, 펩티드, 당쇄, 저분자 화합물(약제) 등, 형상(形狀)에 특별히 상관하지 않는다. 다능성 줄기세포에 대한 접착 분자는 상기 세포에서 발현되고, 동종친화적인 결합성을 가진 분자가 바람직하며, 그 예로는 카드헤린계 분자를 들 수 있다. 미분화인 ES 세포의 경우, E-카드헤린을 발현하는 것으로 알려져 있어, 상기 분자를 이용하는 것이 바람직하지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 이들 접착성 분자가 단백질성 또는 펩티드성 분자일 경우, 그것의 펩티드 단편이 해당 단백질 또는 펩티드 분자와 동일한 접착 활성을 가지는 것이라면, 상기 단편도 사용할 수 있다.

다능성 줄기세포에 접착성을 가지는 분자는 배양 용기 또는 배양 기재(이하, 배양 기재라 함)의 고상 표면에 고정 또는 코팅하여, 본 발명의 배양 방법에 사용할 수 있다. 본 발명의 배양 기재로는 플레이트나 플라스크 등의 종래부터 세포 배양에 이용되고 있는 임의의 것을 사용할 수 있다. 이들 배양 기재는 유리 등의 무기 재료, 또는 폴리스티렌이나 폴리프로필렌 등의 유기 재료의 어느 것으로 이루어진 것을 사용할 수 있으며, 멸균가능한 내열성 및 내수성을 가지고 있는 재료로 이루어진 것이 바람직하다.

다능성 줄기세포에 접착성을 가지는 분자를 배양 기재의 고상 표면에 고정 또는 코팅하는 방법으로, 흡착 등의 물리적 방법이나 공유결합 등의 화학적 방법을 적용할 수 있으나, 조작이 쉬운 흡착에 의한 방법이 바람직하다. 또한, 미리 접착성 분자에 인위적으로 항원성 분자를 부가 및/또는 융합시켜 두어, 상기 항원성 분자에 대한 특이 항체와의 결합을 이용할 수도 있다. 이 경우, 특이 항체를 미리 배양 기재의 고상 표면에 흡착 등의 물리적 방법이나 공유결합 등의 화학적 방법에 의해 고정 또는 코팅해 두어야 한다.

전술한 바와 같이, 제조한 배양 기재는 다능성 줄기세포의 통상적인 배양 방법에 그대로 사용할 수 있다. 즉, 적정 수의 다능성 줄기세포를 통상적으로 이용가능한 액체 배지 또는 세포 배양액에 현탁하고, 이를 해당 배양 기재에 첨가하면 된다. 그 후의 액체 배지의 교체나 계대 배양도, 종래 방법과 동일하게 실시할 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "동종 친화적인 결합"은 세포 접착시 세포-세포 또는 세포-기재 간의 접착성 분자를 통한 결합에 있어서, 동일 종의 접착성 분자끼리 결합 또는 회합함으로써 이루어지는 결합을 의미한다.

본 명세서에서, 용어 "피더 세포"는 지지 세포라고도 하며, 단독으로는 생존·배양할 수 없는 세포를 배양할 때, 미리 배양하여 배지에 부족한 영양분이나 증식 인자의 보급 등의 역할을 담당하는 세포를 의미한다. "피더 세포"로 MEF 세포나, STO 세포 등의 간질계(stromal line, 間質系) 세포를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서, 용어 "분산 상태"는 세포가 배양 기재 표면에 접착한 상태로 생육하고 있을 경우에 있어서, 명확한 콜로니를 형성하지 않고, 각각의 세포가 다른 세포와 접촉하지 않거나, 일부 접촉하고 있어도 그 접촉 영역이 매우 작은 상태를 의미한다.

본 명세서에서, 용어 "유전자"는 유전 물질을 가리키며, 전사 단위를 포함하는 핵산을 의미한다. 유전자는 RNA 또는 DNA일 수 있으며, 천연 유래 또는 인위적으로 설계된 서열일 수 있다. 또한, 유전자는 단백질을 코딩하지 않을 수 있으며, 예컨대 유전자는 라이보자임이나 siRNA(short/small interefering RNA) 등의 기능적 RNA를 코딩할 수도 있다.

본 발명의 전술한 효과나 그외 이점 및 특징들은 하기 바람직한 실시예의 상세한 설명에서 설명한다.

본 발명의 실시에 있어서, 분자 생물학이나 재조합 DNA 기술 등의 유전자 공학 방법, 일반적인 세포생물학 방법 및 종래 기술에 대해, 실시자는 특별히 기재하지 않으며, 당해 분야의 표준적인 참고서적을 참조할 수 있다. 그 예로, Molecular Cloning : A Laboratory Manual 제3판(Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001); Current Protocols in Molecular biology(Ausubel et al.편, John Wiley & Sons, 1987); Methods in Enzymology 시리즈(Academic Press); PCR Protocols: Methods in Molecular Biology(Bartlett & Striling편, Humana Press, 2003); Animal Cell Culture: A Practical Approach 제3판(Masters편, 0xford University Press, 2000); Antiboides : A Laboratory Manual(Hatlow et al. & Lane편, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1987) 등을 참조할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 참조되는 세포 배양, 세포 생물학 실험을 위한 시약 및 키트류는 Sigma사나 Aldrich사, Invitrogen/GIBCO사, Clontech사, Stratagene사 등의 시판사로부터 입수가능하다.

또한, 다능성 줄기세포를 이용한 세포 배양, 및 발생·세포 생물학 실험의 일반적 방법에 대해, 실시자는 상기 분야의 표준적인 참고서적을 참조할 수 있다. 그 예로, Guide to Techniques in Mouse Development(Wasserman et al.편, Academic Press, 1993); Embryonic Stem Cell Differentiation in vitro(M.V. Wiles, Meth. Enzymol. 225: 900, 1993); Manipulating the Mouse Embryo: A laboratory manual(Hogan et al.편, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994); Embryonic Stem Cells(Turksen편, Humana Press, 2O02)이 포함된다. 본 명세서에서 참조되는 세포 배양, 발생·세포 생물학 실험을 위한 시약 및 키트류는 Invitrogen/GIBCO사나 Sigma사 등의 시판사로부터 입수가능하다.

마우스 및 인간의 다능성 줄기세포의 제작, 계대, 보존법에 대한 표준적인 프로토콜이 이미 확립되고 있어, 실시자는 전술한 참고서적에 추가로, 복수의 참고 문헌(Matsui et al., Cell 70: 841, 1992; Thomson et al., 미국 특허 제 5,843,780호; Thomson et al., Science 282: 114, 1998; Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13726, 1998; Shamblott et al., 미국 특허 제 6,090,622호; Reubinoff et al., Nat. Biotech. 18: 399, 2000; 국제 공개번호 제 00/27995호) 등을 참조함으로써, 이들 다능성 줄기세포를 사용할 수 있다. 또한, 그 밖의 동물종에 관해서도, 예로 원숭이(Thomson et al., 미국 특허 제 5,843,780호; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 7844, 1996)이나 랫(Iannaccone et al., Dev. Biol. 163: 288, 1994; Loring et al., 국제 공개번호 제 99/27076호), 닭(Pain et al., Development 122: 2339, 1996; 미국 특허 제 5,340,740호; 미국 특허 제5,656,479호), 돼지(Wheeler et al., Reprod. Fertil. Dev. 6: 563, 1994; Shim et al., Biol. Reprod. 57: 1089, 1997) 등에서의 ES 세포 또는 ES형 세포의 수립 방법이 알려져 있어, 각 기재의 방법을 따라, 본 발명에 이용할 수 있는 ES 세포를 제작할 수 있다.

ES 세포는 배반포기 배아의 내부에 있는 내부 세포 덩어리(inner cell mass)라고 하는 세포 집괴(細胞集塊, cell clump)를 시험관내 배양으로 옮겨, 세포 덩어리의 해리와 계대를 반복함으로써, 미분화 줄기세포 집단으로서 분리시킨 다능성 줄기세포이다. 마우스 유래 ES 세포로는 E14, D3, CCE, R1, J1, EB3 등의 여러가지가 알려져 있으며, 일부는 American Type Culture Collection사나 Cell & Molecular Technologies, Thromb-X사 등으로부터 구입할 수 있다. 인간 유래 ES 세포는 현재, 전세계적으로 50종 이상이 수립되어 있으며, 미국 국립위생연구소(NIH)의 리스트( http: //stemcells.nih.gov/registry/index.asp)에는 20종 이상의 세포주가 등록되어 있다. 그 일부는 ES Cell International사나 Wisconsin Alulmi Research Foundation으로부터 구입할 수 있다.

ES 세포는 일반적으로 초기 배아를 배양하여 수립하지만, 체세포의 핵을 핵이식한 초기 배아에서 ES 세포를 제작할 수도 있다(Munsie et al., Curr. Biol. 10: 989, 2000; Wakayama et al., Science 292: 740, 2001; Hwang et al., Science 303: 1669, 2004). 또한, 이종 동물의 난세포 또는 탈핵한 난세포를 수개로 분할한 세포 소포(세포질체(cytoplast) 또는 오플라스토이드(ooplastoid)라 함)에, 원하는 동물의 세포핵을 이식하여 배반포기 배아의 세포 구조체를 제작하고, 그것을 기초로 ES 세포를 제작하는 방법도 고안되어 있다(국제 공개번호 제 99/45100호; 제 01/46401호; 제 01/96532호; 미국 특허 공개 제 02/90722호; 제 02/194637호). 또한, 단성생식(parthenogenesis) 배아를 배반포기와 동등한 수준의 단계까지 발생시킨 후 ES 세포를 제조하는 시도(미국 특허 공개 제 02/168763호; Vrana K et al., Proc, Natl. Acad. Sci, USA 100: 11911-6)나, ES 세포와 체세포를 융합시킴으로써 체세포 핵의 유전 정보를 가진 ES 세포를 만드는 방법도 보고되어 있다(국제 공개 번호 제 00/49137호; Tada et al., Curr. Biol. 11: 1553, 2001). 본 발명에서 사용되는 ES 세포는 이러한 방법에 의해 제조된 ES 세포 또는 ES 세포의 염색체상의 유전자를 유전자 공학 방법으로 변형시킨 세포도 포함한다.

본 발명에 사용할 수 있는 EG 세포는 원시 생식 세포라고 하는 태아기의 생식 세포를, ES 세포의 경우와 마찬가지로, MEF 세포, ST0 세포 또는 S1/S1⁴-m220 세포 등의 피더 상에서 LIF 및 bFGF/FGF-2 또는 포스콜린 등의 약제로 자극하여 제조된 것이며(Matsui et al., Cell 70: 84l, 1992; Koshimizu et al., Development 122: 1235, 1996), ES 세포와 매우 유사한 성질을 가지고 있다(Thomson & 0dorico, Trends Biotechnol. 18: 53, 2000). ES 세포의 경우와 마찬가지로, EG 세포와 체세포를 접촉시켜서 제작한 EG 세포(Tada et al., EMBO J. 16: 6510, 1997; Andrew 등)나 EG 세포의 염색체상의 유전자를 유전자공학 방법으로 변형한 세포도, 본 발명의 방법에 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 증식 방법에 이용가능한 다능성 줄기세포는 ES 세포나 EG 세포에만 한정되지 않으며, 포유 동물의 배아, 태아, 제대혈, 또는 성체 장기나 골수 등의 성체 조직, 혈액 등으로부터 유래된 ES/EG 세포와 유사한 형질을 가지는 모든 다능성 줄기세포를 포함한다. 예를 들면, 생식 세포를 특수한 배양 조건 하에서 배양하여 수득되는 ES형 세포는 ES/EG 세포와 매우 유사한 형질을 나타내고 있어(Kanatsu-Shinohara et al., Cell 119: 101, 2004), 다능성 줄기세포로 사용할 수 있다. 다른 예로는 골수 세포에서 분리된 3배엽의 모든 계보의 세포로의 분화능을 가지는 다능성 성체 줄기세포(multipotent adult progenitor/stem cells: MAPC)를 들 수 있다. 또한, 모근초세포나 각질형성세포(국제 공개번호 제 02/51980호), 장관 상피세포(국제 공개번호 제 02/57430호), 내이세포(Li et al., Nature Med. 9: 1293, 2003) 등을 특별한 배양 조건하에서 배양하여 수득한 다능성 줄기세포나 혈중 단핵구 세포(또는 그 세포핵분(division of a cell nucleus)에 포함되는 줄기세포)를, M-CSF(Macrophage Co1ony Stimulating Factor; 대식세포 콜로니 자극 인자) + PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate) 처리(Zhao et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 2426, 2003), 또는 CR3/43 항체 처리(Abuljadayel, Curr. Med. Res. 0pinion 19: 355, 2003)함으로써, 제조되는 다능성 줄기세포 등도, ES/EG 세포와 유사의 형질을 가지는 줄기세포인 경우 모두 포함된다. 상기 ES/EG 세포와 유사한 형질이란, 상기 세포에 특이적인 표면(항원) 마커가 존재하거나 해당 세포 특이적인 유전자가 발현되며, 나아가 테라토마 형성 능력이나 키메라 마우스 형성 능력이 있으며, ES/EG 세포에 특이적인 세포 생물학적 성질을 가진 것으로 정의할 수 있다.

본 발명은 ES 세포를 비롯한 다능성 줄기세포의 배양 방법에 관한 것으로, 다능성 줄기세포에 접착성을 가지는 분자(이하, 다능성 줄기세포의 접착성 분자라고도 함)를 이용하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 실시에 있어서, 다능성 줄기세포의 접착성 분자는 배양 용기 또는 배양 기재(이하, 배양 기재라고도 함)의 고상 표면에 고정 또는 코팅되어, 본 발명의 배양 방법에 사용된다. 본 발명의 배양 기재로는 다능성 줄기세포를 배양할 수 있는 것이면 어떠한 것이라도 이용할 수 있지만, 바람직하게는 종래부터 세포 배양용으로 이용가능한 것이 바람직하다. 세포 배양용 배양 기재로는, 예컨대, 배양 접시, 플레이트, 플라스크, 챔버 슬라이드, 튜브, 셀팩트리, 롤러보틀, 스피너플라스크, 홀로파이버, 마이크로캐리어, 비즈 등을 들 수 있다. 이들 배양 기재는 유리 등의 무기 재료 또는 폴리스티렌 등의 유기 재료의 어느 것으로 이루어진 것일 수 있으나, 단백질 또는 펩티드 등에 대한 흡착성이 높은 폴리스티렌 등의 재료나, 또는 흡착성을 높이는 처리, 예를 들면 친수 처리나 소수 처리 등을 실시한 재료의 사용이 바람직하다. 또한, 멸균가능한 내열성 및 내수성 재료로 이루어지는 것이 바람직하다. 따라서, 바람직한 기구와 재료의 일 예로는, 주로 대장균 등의 배양에 자주 사용되는, 세포 배양용 처리를 특별히 하지 않은 폴리스티렌제 배양접시 및/또는 플레이트(이하, 무처리 폴리스티렌제 플레이트라고 함)을 들 수 있고, 상기 배양 기재는 일반적으로 시판되고 있다.

다능성 줄기세포의 접착성 분자는 다능성 줄기세포와 친화성을 가진 결합·부착하는 분자일 수 있으며, 단백질, 펩티드, 당쇄, 저분자 화합물 또는 이들 2종 이상으로 구성되는 분자 등으로, 형상은 특별히 한정되지 않는다. 미분화 상태의 ES/EG 세포에 대한 접착성 분자에 관해서는 그다지 보고된 예가 없지만, 예를 들면, 면역 글로불린 슈퍼패밀리에 속하는 ICAM-1, VCAM-1, NCAM 등이 발현되는 것으로 알려져 있다(Tian et al., Biol. Reprod. 57: 561, 1997). 다능성 줄기세포의 접착성 분자는 바람직하게는 사용하는 다능성 줄기세포의 세포막 표면에서 발현되는 것이고, 더욱 바람직하게는 동종친화적인 결합성을 가진 분자가 바람직하다. 세포 접착에 있어서의 동종친화적인 결합은 세포-세포 또는 세포-기질 간의 접착성 분자를 통한 결합에서, 같은 종류의 접착성 분자끼리 결합·회합함으로써 이루어지는 것을 의미한다. 이러한 성질을 나타내는 접착 분자로는 NCAM, L1, 플렉신(plexin), 카드헤린 등이 알려져 있지만, 그중에서도 접착성의 강도 때문에 카드헤린계 분자를 사용하는 것이 바람직하다. 미분화 상태의 ES 세포의 경우, E-카드헤린을 특이적으로 발현하는 것으로(Larue et al., Development 122: 3185, 1996) 보고되어 있으므로, 상기 분자를 사용하는 것이 또한 바람직하다. 그러나, 사용하는 접착성 분자는 E-카드헤린만으로 한정되는 것은 아니며, 사용하는 다능성 줄기세포에서 발현되는 카드헤린계 분자 또는 동종친화성의 접착성 분자이라면, 모두 사용할 수 있다. 또한, 통상의 ES 세포에서 발현되지 않아도, 유전자공학적 방법에 의해, 동종친화적인 결합력을 가지는 분자를 코딩하는 유전자의 전장 또는 일부분을 항상 발현하도록 ES 세포에 유전자 변이를 추가함으로써, 상기 분자를 본 발명의 방법에 사용할 수 있다.

카드헤린은 접착 결합 또는 어드헤렌스 정션(adherens junction)이라 하는 Ca²⁺ 의존성 세포간 접착·결합에 관여하는 접착 분자로, E(상피)형, N(신경)형, P(태반)형의 3종가 대표적인 예로 알려져 있다. 이들 카드헤린 분자는 700 내지 750개의 아미노산 잔기로 이루어진 막 결합형 당단백질 분자이며, 세포외 영역에는 약 110개의 아미노산 잔기로 이루어진 반복 구조, 이른바 세포외 카드헤린(Extracellular Cadherin, EC) 도메인이라고 하는 영역이 5 곳 존재한다. 예를 들면, 인간 E-카드헤린(아미노산 서열을 서열번호 1에 나타냄)의 경우, EC1, EC2, EC3, EC4, EC5의 각 도메인은 각각 157-262, 265-375, 378-486, 487-595, 596-700에 해당한다(숫자는 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열 내의 잔기 번호임). 또한, 마우스E-카드헤린(아미노산 서열을 서열번호 2에 나타냄)의 경우, EC1, EC2, EC3, EC4, EC5의 각 도메인은 각각 159-264, 267-377, 380-488, 489-597, 598-702에 해당한다(숫자는 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열 내의 잔기 번호임). 이들 EC 도메인은 다른 카드헤린 분자 종들 간에 상동성을 가지고 있으며, 특히 N 말단측에 위치하는 도메인(EC1, EC2)의 상동성이 높다. 이와 같이 유사한 구조를 나타내는 카드헤린 분자로는 현재, 50종 이상이 알려져 있으며, 이들 분자를 총칭하여 카드헤린계라고 한다. 이상, 카드헤린에 관한 총설로, Takeichi, Curr. 0pin. Cell Biol. 7: 619, 1995; Marrs & Nelson, Int. Rev. Cytol. 165: 159, 1996; Yap et al., Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 13: 119, 1997; Yagi & Takeichi, Genes Dev. 14: 1169, 2000; Gumbiner, J. Cell Biol. 148: 399, 2000 등을 참조할 수 있다.

E-카드헤린(이명으로 카드헤린-1)은 간장, 신장, 폐 등의 내장 장기의 실질세포나 각질형성세포 등의 상피세포에서 널리 발현되며, 세포간의 접착을 담당하는 중요한 접착 분자인 것으로 알려져 있다(총설로서, Mareel et al., Int. J. Dev. Biol. 37: 227, 1993; Mays et al., Cord Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 60: 763, 1995; E1-Bahrawy & Pignatelli, Microsc. Res. Tech. 43: 224, 1998; Nollet et al., Mol. Cell. Biol. Res. Commun. 2: 77, 1999). 또한, E-카드헤린은 미분화된 마우스 ES 세포에서도 강하게 발현되고 있어, E-카드헤린 유전자의 발현을 유전자공학적으로 결손시킨 ES 세포에서는 세포간 접착이 현저하게 저해되는 것으로 알려져 있다(Larue et al., Development 122: 3185, 1996). 또한, 미국 National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 공식적인 유전자발현 데이터베이스에 등록되어 있는 정보를 통해, E-카드헤린 유전자가 인간 ES 세포주에서도 발현됨을 확인할 수 있다.

본 발명의 실시에 있어서, E-카드헤린을 비롯한 카드헤린 분자 또는 그 밖의 접착성 분자를 제조하는 방법은 특별히 한정되진 않지만, 상기 분자가 단백질성 또는 펩티드성의 분자이면, 분자생물학적 방법으로 재조합 단백질을 제작·정제하여, 이를 사용하는 것이 바람직하다. 그 밖에도, 동일한 효과를 나타내는 방법이라면 임의의 것을 사용할 수 있으며, 예컨대 다능성 줄기세포의 접착성 분자를 생체 조직·세포에서 추출, 정제하여 사용하거나, 또는 해당 펩티드를 화학적으로 합성하여 사용할 수 있다.

다능성 줄기세포의 접착성 분자에 있어서, 재조합 단백질의 제조 방법 및 해당 분자를 코딩하는 유전자를 취득하는 방법은 이미 표준적인 프로토콜이 확립되어 있어, 실시자는 상기에 예시한 참고서적을 참조할 수 있지만, 특별히 한정되지 않는다. E-카드헤린을 예로 한 경우, E-카드헤린 유전자는 이미 인간(서열번호 1), 마우스(서열번호 2), 랫 등의 동물로부터 분리·동정한 염기서열을 NCBI 등의 공식적인 DNA 데이터베이스에서 이용가능하다(액세스 번호: (인간) NM_004360; (마우스) NM_009864; (랫) NM-031334). 따라서, 당업자라면 E-카드헤린 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 설계하고, 일반적인 분자생물학적 방법을 이용하여 E-카드헤린 유전자의 cDNA를 취득 및 사용할 수 있다. 또한, E-카드헤린 유전자의 cDNA는 이화학연구소 유전자은행(일본 쓰쿠바)이나 American Type Culture Collection(ATCC), Invitrogen/ResGen 등으로부터도 구입할 수 있다. 사용하는 접착성 분자를 코딩하는 유전자는 다능성 줄기세포가 유래된 종과 동종의 동물 유래의 것이 바람직하고, 예를 들면, 마우스 ES 세포를 사용할 수도 있다. 본 발명을 실시할 경우, 마우스 E-카드헤린 cDNA를 사용하는 것이 바람직하다. 그러나, 이종동물 유래의 것, 즉, 인간, 원숭이, 소, 말, 돼지, 양, 또는 조류(예, 닭 등), 또는 양서류(예, 아프리카 쯔메가엘 등) 유래의 E-카드헤린 cDNA도 사용할 수 있다.

본 발명의 실시에 이용되는 접착성 분자의 재조합 단백질을 제작하기 위한 바람직한 방법의 일 예는, 상기 분자를 코딩하는 유전자를 C0S 세포나 293 세포, CH0 세포 등의 포유 동물 세포에 도입하고, 발현시키는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 상기 유전자는 광범위한 포유 동물 세포에서 유전자의 전사 및 발현을 가능하게 하는 핵산 서열, 이른바 프로모터의 서열과 상기 프로모터의 제어하에 전사·발현이 가능한 형태로 연결된다. 또한, 전사·발현시키는 유전자는 폴리A 부가 시그널과 연결되는 것이 바람직하다. 바람직한 프로모터로는 SV(Simian Virus) 40 바이러스, 사이토메갈로바이러스(Cytomegamro Virus; CMV), 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus) 등의 바이러스 유래 프로모터나, β-엑틴의프로모터, EF(Elongation Factor) 1α프로모터 등을 들 수 있다.

상기의 재조합 단백질을 제조에 이용하는 유전자는 상기 분자를 코딩하는 유전자의 전장 영역을 포함할 필요는 없으며, 부분적인 유전자 서열이더라도 상기 부분서열을 코딩하는 단백질 또는 펩티드 분자가 본래의 해당분자와 동일한 정도 또는 그 이상의 접착 활성을 가지는 것이면 된다. 예로, 본 발명의 바람직한 예에 이용할 수 있는 E-카드헤린의 경우, 세포외 영역을 코딩하는 N말단 측에서 690 내지 710개의 아미노산 잔기를 포함하는 부분 서열로 제조되는 재조합 단백질, 즉 EC1 - EC5 도메인을 포함하는 단백질을 사용할 수 있다. 또한, 일반적으로 카드헤린 분자는 가장 N 말단 측에 위치하는 도메인(EC1)이, 상기 분자의 결합 특이성, 즉, 동종친화성을 규정하고(Nose et al., Cell 61: 147, 1990) 있으므로, 적어도 EC1을 포함하고 그 이외의 도메인 1개 또는 수 개를 제외한 단백질 분자를 제조 및 사용하는 것도 가능하다. 또한, 상기의 단백질 분자와 아미노산 수준으로 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 나타내며, 동시에, 접착 활성을 가지는 단백질도 사용할 수 있다.

또한, 상기의 재조합 단백질은 다른 단백질이나 펩티드와의 융합 단백질로서 제조할 수 있다. 예를 들면, 면역 글로불린의 Fc 영역이나 GST(Glutathione-S-Transferase) 단백질, MBP(Mannnose-Binding Protein)단백질, 아비딘 단백질, His(올리고·히스티딘)택, HA(Hem Agglutinin)택, Myc택, VSV-G(Vesicular Stromatitis Virus Glycoprotein)택 등과의 융합 단백질로서 제조하고, 단백질 A/G 컬럼이나 특이적 항체 컬럼 등을 이용하여 재조합 단백질의 정제를 용이하고 또한 효율적으로 실시할 수 있다. 특히 Fc 융합 단백질은 폴리스티렌 등을 재료로 한 배양 기재에 대한 흡착 능력이 높아, 본 발명의 실시에 바람직하다.

면역 글로불린의 Fc 영역을 코딩하는 유전자는 이미 인간을 비롯한 포유류 동물들에서 다수 분리 및 동정되어 있다. 염기서열도 많이 보고되고 있으며, 예로 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4의 Fc 영역을 포함하는 염기서열의 서열 정보는 NCBI 등의 공식적인 DNA 데이터베이스에서 이용가능하며, 각각의 액세스 번호: AJ294730, AJ294731, AJ294732, 및 AJ294733로 등록되어 있다. 따라서, 당업자이라면 Fc 영역에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 설계하고, 일반적인 분자생물학적 방법을 이용하여 Fc 영역 부분을 코딩하는 cDNA를 취득 및 사용하는 것이 가능하다. 이 경우, 사용하는 Fc 영역을 코딩하는 유전자의 동물종이나 서브타입은 특별히 이로 한정되지 않지만, 단백질 A/G와 결합성이 강한 인간 IgG1이나 IgG2, 또는 마우스 IgG2a나 IgG2b 등의 Fc 영역을 코딩하는 유전자가 바람직하다. 또한, Fc 영역에 변이를 도입함으로써 단백질 A와의 결합성을 높이는 방법도 알려져 있어(Nagaoka et al., Protein Eng. 16: 243, 2003(비특허문헌 7) 참조), 상기 방법으로 유전자 변이를 추가한 Fc 단백질도 사용할 수도 있다.

그리고, 본 발명의 실시에 바람직하게 이용할 수 있는 E-카드헤린의 경우, 상기 재조합 단백질의 제조 방법의 일 예로서, 발명자들의 이미 보고한 논문을 들 수 있다(Nagaoka et al., Biotechnol. Lett. 24: 1857, 2002(비특허문헌6); Protein Eng. 16: 243, 2003(비특허문헌 7) 참조).

또한, 마우스 또는 인간의 E-카드헤린의 세포외 영역을 코딩하는 cDNA에, 인간 IgG의 Fc 영역을 코딩하는 서열 및 His 프리 서열의 cDNA를 연결시킨 융합 유전자를 마우스 세포에 도입하고, 이것을 발현시켜 제조한 정제 재조합 단백질(Recombinant Human/Mouse E-cadherin-Fc Chimera; R&D systems, Genzyme Techne )이 시판되고 있어, 이를 마우스 또는 인간 유래의 E-카드헤린 단백질로서 사용할 수도 있다.

본 발명에 따른 방법의 실시에 있어서, 다능성 줄기세포의 접착성 분자를 상기의 배양 기재 고상 표면에 고정 또는 코팅하는 방법으로 흡착 등의 물리학적 방법이나 공유결합 등의 화학적 방법을 적용할 수 있지만, 조작이 쉬운 흡착에 의한 방법이 바람직하다. 접착성 분자가 단백질성이나 펩티드성의 분자, 또는 당쇄를 포함하는 고분자 화합물 등일 경우, 플레이트 등의 배양 기재 고상 표면에 해당 분자의 용액을 접촉시키고, 일정시간 후에 용매를 제거함으로써, 간편하게 해당 분자를 흡착시킬 수 있다. 또한 구체적으로, 예를 들면, 증류수나 PBS 등을 용매로 하는 접착성 분자의 용액을, 여과, 멸균한 다음, 플레이트 등의 배양 기재에 접촉시키고, 몇 시간 내지 1주간 방치함으로써, 상기 접착성 분자가 고정 또는 코팅된 세포 배양용 기재가 수득된다. 바람직하게는 증류수나 PBS 등으로 수회 세정하고, PBS 등의 평형 염 용액 등으로 치환하여 사용한다.

또한, 접착성 분자에 미리 인위적으로 항원성 분자가 부가·융합되어 있을 경우, 상기 항원성 분자에 대한 특이 항체와의 결합을 이용할 수도 있으며, 접착성 분자를 효율적으로 기재 표면에 수식(修飾)할 수 있기 때문에, 보다 바람직하다. 이 경우, 특이 항체를 미리 배양 기재 표면에 흡착 등의 물리학적 방법이나 공유결합 등의 화학적 방법에 의해 고정 또는 코팅해 놓을 필요가 있다. 예를 들면, 접착성 분자에 IgG의 Fc 영역 단백질을 융합시킨 재조합 단백질인 경우, 배양 기재에 미리 수식해 놓은 항체는 IgG의 Fc 영역을 특이적으로 인식하는 것을 사용할 수 있다. 접착성 분자에 각종 단백질이나 택 서열 펩티드를 융합시킨 재조합 단백질의 경우, 융합시킨 분자에 특이적인 항체를 배양 기재에 미리 수식함으로써, 사용할 수 있다.

본 발명의 실시에 있어서, 세포 배양 기재의 고상 표면에 고정 또는 코팅시키는 접착성 분자는 적어도 1종이지만, 2종 이상의 접착성 분자를 조합하여 사용할 수도 있다. 이 경우, 각각의 접착성 분자의 용액을 혼합하고, 그 혼합 용액을 전술한 방법에 기초하여, 수식하면 된다.

상기의 접착성 분자 용액의 농도는 상기 분자의 흡착량 및/또는 친화성, 나아가 해당 분자의 물리학적 성질에 따라 적절하게 검토할 필요가 있지만, E-카드헤린의 세포외 영역에 Fc 영역을 융합시킨 재조합 단백질의 경우, 약 0.O1 내지 100O ㎍/㎖의 농도 범위로 하고, 바람직하게는 약 0.1 내지 200 ㎍/㎖, 더욱 바람직하게는 약 1 내지 50 ㎍/㎖, 가장 바람직하게는 5 내지 10 ㎍/㎖이다.

본 발명의 실시에 있어서, 다능성 줄기세포는 상기의 방법으로 제조한 배양 기재에 접종한다. 다능성 줄기세포의 배양 방법이나 배양 조건은 상기 배양 기재를 사용하는 것을 제외하고, 다능성 줄기세포의 통상의 배양 방법이나 배양 조건을 그대로 사용할 수 있다. 다능성 줄기세포의 통상의 배양 방법이나 배양 조건은 상기의 참고서적, 즉, Guide to Techniques in Mouse Development(Wasserman et al.편, Ac adenlic Press, 1993); Embryonic Stem Cell Differentiation in vitro(M.V. Wiles, Meth. Enzymol. 225: 900, 1993); Manipulating the Mouse Embmyo: A laboratory manual(Hogan et al 편, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994); Embryonic Stem Cells(Turksen 편, Humana Press, 2002)이나, 참고 문헌(Matsui et al., Cell 70: 841, 1992; Thomson 등, 미국 특허 제5,843,780호; Thomson et al., Science 282: 114, 1998; Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13726, 1998; Shamblott et al. 미국 특허 제6,090,622호; Reubinoff et al., Nat. Biotech. 18: 399, 2000; 국제 공개번호 제 00/27995호) 등을 참조할 수 있지만, 특별히 이것으로 한정되지 않는다.

다능성 줄기세포를 배양하기 위한 액체 배지는 다능성 줄기세포를 이차배양하는 종래의 방법에 적용가능한 것이면, 모두 사용가능하다. 그 구체적인 예로는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's Medium), GMEM(Glasgow Minimum Essential Medium), RPMI1640 배지 등가 있으며, 통상적으로 약 2 mM의 글루타민 및/또는 약 100 μM의 2-메르캅토에탄올을 첨가하여 사용한다. 또한, ES 세포배양용 배지로서 시판되고 있는 Knockout DMEM(Invitrogen)이나, ES cell-qualified DMEM(Cell & Molecular Technologies), TX-WES(Thromb-X) 등도 이용할 수 있다. 이들 배지에 FBS를 약 5 내지 25% 첨가하는 것이 바람직하지만, 무혈청 배양하는 것도 가능하며, 예를 들면, 15 내지 20%의 KnockOut Serum Replacement(Invitrogen)을 대신 사용할 수 있다. 또한, MEF 세포의 배양 상청이나 bFGF/FGF-2, SCF등을 첨가한 배지를 사용할 수도 있으며, 그 상세한 방법은 공지되어 있다(Xu et al., Nature Biotech. 19: 971, 2001; 국제 공개번호 제 01/51616호; 국제 공개번호 제 03/020920호; Amit et al., Biol. Reprod., 70: 837, 2004).

상기 다능성 줄기세포를 배양하기 위한 액체 배지에는 다능성 줄기세포의 미분화 상태를 유지시키는 작용을 가진 물질·인자를 첨가하는 것이 바람직하다. 구체적인 물질·인자는 특히 이로 한정하진 않지만, 마우스 ES/EG 세포의 경우, LIF가 바람직하다. LIF는 이미 보고된 논문(Smith & Hooper, Dev. Biol. 121: 1, 1987; Smith et al., Nature 336: 688, 1988; Rathjen et al., Genes Dev. 4: 2308, 1990)이나, NCBI의 공식적인 DNA 데이터베이스에 액세스 번호 X13967(인간 LIF), X0638l(마우스 LlF), NM_022196(랫 LIF) 등으로 공지된 단백질성 인자이며, 그 재조합 단백질은 예를 들면 ESGRO(Chemicon)의 상품명으로 구입할 수 있다. GSK-3 저해제를 배양액에 첨가함으로써, 특히 다른 성장 인자·생리 활성 인자 등의 첨가를 하지 않아도, 마우스 및 인간 ES 세포의 미분화성을 효율적으로 유지시킬 수 있다(Sato et al., Nature Med. 10: 55, 2004). 이런 경우, GSK-3의 활성을 저해할 수 있는 작용을 가진 물질이라면, 모두 사용가능하며, 예로는 Wnt계 분자(Manoukian & Woodgett, Adv. Cancer Res. 84: 203, 2002; Doble & Woodgett, J· Cell Sci·116: 1175, 2003) 등이 있다.

본 발명의 실시에 있어서, 종래의 방법에 따라 계대 유지한 다능성 줄기세포를 상기의 방법에 의해 제조한 배양 기재에 접종하고, 동시에, 상기의 배양 조건·방법에 따라서 배양함으로써, 상기 세포를 분산된 상태로, 게다가 해당 세포의 원래 미분화 상태를 유지시킨 상태로 이차배양할 수 있다. 이러한 상태로 배양한 다능성 줄기세포는 세포 분열시 물리적인 억제가 작용하지 않고, 및/또는 세포간 접촉에 기인하는 세포증식 억제 메커니즘이 작용하지 않고, 및/또는 세포의 생존성이 높아지고, 사멸 세포수가 감소하여, 세포의 현저한 증가나 증식이 확인된다. 일 예로서, 본 발명의 방법에 따라 마우스 ES 세포를 배양한 경우, 종래의 방법으로 배양한 경우에 비해 적어도 1.25배 이상, 바람직하게는 1.5배 이상, 보다 바람직하게는 2배 이상의 높은 증식력을 나타낼 수 있다. 또한, 상기 조건으로 약 4대 계대하면, 종래 방법에 비해 적어도 3배, 바람직하게는 10배 이상으로 세포를 회수할 수 있다. 증식력은 단시간의 세포수 증가율이나 배화 속도(倍化速度) 등의 지표로 나타낼 수 있으며, 이의 계측·산출 방법은 일반 세포를 이용한 실험으로 실시하며, 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

전술한 바와 같이, 다능성 줄기세포의 미분화 상태는 다능성 줄기세포이 거의 영구적 또는 장기간의 세포 증식이 가능하며, 정상적인 핵(염색체)형을 나타내고, 적합한 조건 하에서 3배엽의 모든 계보의 세포로 분화가능한 능력을 지닌 상태를 의미한다. 또한, 바람직하게는 다능성 줄기세포의 그 밖의 특성, 예컨대, 텔로머라제 활성 유지, 테라토마 형성 능력, 또는 키메라 형성 능력 등의 성질들중 중 적어도 1가지를 가지고 있는 것이 바람직하다. 이들 성질·특성을 조사하는 방법은 이미 표준적인 프로토콜이 확립되고 있어, 예를 들면, 상기의 참고서적, 즉, Guide to Techniques in Mouse Developme nt(Wasserman들 편, Acade]lic Press , 1993); Embryonic Stelll Cell Differentiation in vitro(M.V. Wiles, Meth. Enzymol. 225: 90O, 1993); Manipulating the Mouse Embryo: A laboratory manual(Hogan et al.편, Cold Spring Harbor Laboratory Press , 1994); Embryonic Stem Cells(Turksen편, Humana Press, 2002) 등을 참조하여 용이하게 실시할 수 있지만, 특히 이들 기재의 방법으로만 한정되지 않는다.

또한, 미분화 상태의 다능성 줄기세포는 하기한 최소 1가지, 바람직하게는 복수 방법으로, 최소한 1개, 바람직하게는 복수개의 마커 분자의 존재를 확인할 수 있는 세포로 정의할 수 있다. 미분화 상태의 다능성 줄기세포에 특이적인 여러가지 마커의 발현은, 종래의 생화학적 또는 면역화학적 방법에 의해 검출한다. 상기 방법은 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 면역조직화학적 염색법이나 면역 전기영동법과 같은 면역화학적 방법을 사용한다. 이들 방법에서는 미분화 상태의 다능성 줄기세포에 결합하는 마커에 특이적 다클론성 항체 또는 단일 클론 항체를 사용할 수 있다. 여러가지 특이적 마커를 표적으로 하는 항체가 시판되고 있어, 용이하게 사용할 수 있다. 미분화 상태의 다능성 줄기세포에 특이적인 마커로는, 예를 들면 ALP 활성이나, 0ct-3/4 또는 Rex-1/Zfp42 등의 유전자 산물의 발현을 이용할 수 있다. 또한, 각종 항원 분자도 이용할 수 있으며, 마우스 ES 세포에서는 SSEA-1, 인간 ES 세포에서는 SSEA-3이나 SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, GCTM-2 등을 미분화 마커로 들 수 있다. 이들 미분화 마커의 발현은 ES 세포가 분화됨에 따라 감소 및 소실된다.

또한, 미분화 상태의 다능성 줄기세포 마커의 발현은 특히 그 방법을 특별히 한정하지 않지만, 역전사 효소 매개 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 혼성화 분석, 임의의 마커 단백질을 코딩하는 mRNA를 증폭, 검출 및 분석하기 위한 종래에 흔히 사용되는 분자생물학적 방법으로 확인할 수 있다. 미분화 상태의 다능성 줄기세포에 특이적인 마커 단백질(예, 0ct-3/4, Rex-1/Zfp42, Nanog 등)을 코딩하는 유전자의 핵산 서열은 이미 공지되어 있으며, NCBI의 공공 데이터베이스 등에 있어서 이용가능하므로, 프라이머 또는 프로브로 사용하기 위해 필요한 마커 특이적 서열을 용이하게 결정할 수 있다.

다능성 줄기세포의 유전자 도입 방법에서의 이용

본 발명의 다른 형태로, 본 발명에 기재된 방법은 원하는 외래 유전자를 다능성 줄기세포에 효율적으로 도입하는 방법으로 사용할 수 있다. 도입하는 외래 유전자는 특별한 제한은 없지만, 예를 들면, 증식 인자, 수용체, 효소, 전사인자 등의 천연 단백질이나, 예를 들면, 유전자공학적 방법으로 변형 제조한 인공 단백질이다. 또한, 도입 유전자는 리보자임이나 siRNA 등의 기능적 RNA일 수도 있다. 나아가, 외래 유전자의 도입 효율 또는 발현 안정성 등을 평가하기 위한 마커 유전자는, 예를 들면, GFP(Green Fluorescent Protein), β-갈락토시다아제, 루시페라아제 등을 코딩하는 유전자를 이용할 수 있다.

바람직한 실시예의 하나로서, 도입하는 외래 유전자는 유전자의 전사 및 발현을 가능하게 하는 핵산 서열, 즉 프로모터 서열과, 상기 프로모터의 제어하에 전사·발현이 가능한 형태로 연결된다. 또한, 이 경우, 상기 유전자는 폴리A 부가 시그널과 연결되는 것이 바람직하다. 다능성 줄기세포에서 외래 유전자의 전사 및 발현을 가능하게 하는 프로모터로는 SV40 바이러스, CMV, 라우스 육종 바이러스 등의 바이러스 유래 프로모터나, β-엑틴·프로모터, EF1α프로모터 등을 들 수 있다. 또한, 목적에 따라 어느 종류의 세포/조직 또는 어느 분화 단계의 세포에서 특이적으로 유전자의 전사 및 발현을 가능하게 하는 핵산 서열, 즉 세포/조직 특이적 프로모터 서열, 분화 단계 특이적 프로모터, 또는 RNA의 발현에 적합한 Pol. III프로모터 등도 사용할 수 있다. 이들 프로모터의 염기서열은 NCBI 등의 공공 DNA 데이터베이스에서 이용할 수 있으며, 일반적인 분자생물학적 방법을 이용하여 원하는 유전자 서열을 이용한 유전자 벡터를 제조할 수 있다. 또한, 이들 프로모터를 이용할 수 있는 벡터는 Invitrogen나, Promega사, Ambion사 등으로부터 구입가능하다.

상기 유전자(벡터) 도입 방법은 특별히 한정적이지 않으나, 예로 인산 칼슘이나 DEAE-덱스트란을 이용한 형질감염 방법이 있다. 또한, 유전자 도입 대상 세포가 세포내 삽입이 가능하며, 동시에, 세포독성이 낮은 지방질 제제, 예컨대 Lipofectoamine(Invitrogen), Superfect(Qiagen), D0TMA(Roche)등을 이용하여, 목적으로 하는 유전자와 리보좀-핵산 복합체를 형성시킨 다음 형질감염하는 방법도 바람직하다. 또는, 레트로바이러스나 아데노바이러스 등의 바이러스 벡터에 목적 유전자를 조립한 다음, 이 재조합 바이러스를 세포에 감염시키는 방법 등도 사용가능하다. 상기 바이러스 벡터는 바이러스 DNA 또는 RNA의 전장 또는 일부를 결손·변형시킨 핵산 서열에 목적으로 하는 유전자를 조립하여, 발현할 수 있는 형태로 제조한 구축물이다.

본 발명의 방법에 의해 증식시킨 다능성 줄기세포의 이용

본 발명에 따른 증식 방법에 의해 증식시킨 다능성 줄기세포는 이어, 공지된 방법에 의한 세포 회수법으로, 미분화한 상태를 유지한 다능성 줄기세포를 효율적으로 다량 수득할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 유전자 도입 방법에 따라 원하는 유전자를 도입·발현시킨 다능성 줄기세포를 효율적으로 다량 수득할 수 있다. 상기와 같이 수득한 다능성 줄기세포를, 이하, 본 발명에서 제조된 다능성 줄기세포라고 한다.

다능성 줄기세포의 회수 방법은 다능성 줄기세포의 일반적인 이차배양법에서 이용가능한 공지된 효소 분해에 의한 방법이다. 그 구체적인 예는, 다능성 줄기세포를 배양하는 배양 용기의 배지를 제거하고, PBS로 수회, 바람직하게는 2 내지 3회 세정하여, 적당한 단백질분해 효소를 포함하는 용액(예, 트립신이나 디스파아제 등의 단백질분해 효소를 포함하는 용액)을 첨가하고, 37℃에서 적정 시간, 바람직하게는 1 내지 20분간, 보다 바람직하게는 약 3 내지 10분간 배양한 후, 상기의 ES 세포 배양용 배지 등의 적정 용액에 현탁하여, 단일 세포 상태로 만드는 방법이다. 또한, 효소를 이용하지 않는 방법도 사용할 수 있으며, 예컨대, 다능성 줄기세포를 배양하고 있는 배양 용기에서 배지를 제거하고, PBS로 수회, 바람직하게는 2 내지 3회 세정한 후, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 용액을 최종 농도 O.O1 내지 1OO mM, 바람직하게는 0.1 내지 50 mM, 보다 바람직하게는 1 내지 10 mM로 첨가하고, 37℃에서 적정 시간, 바람직하게는 1 내지 60분간, 바람직하게는 약 10 내지 30분간 처리하여 세포를 박리시킨 다음, ES 세포 배양용 배지 등의 적정 용액에 현탁하여, 단일세포 상태로 만드는 방법이 있다. 또한, EDTA 대신 에틸렌글리콜비스(2-아미노에틸 에테르)테트라아세트산(EGTA) 용액을, 동일한 방법으로 이용할 수도 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에서 제조된 다능성 줄기세포에 적정 분화 유도를 처리하여 제조한 분화 세포를 제공한다. 분화 세포는 일반적으로 다능성 줄기세포로부터 분화 유도할 수 있는 종류의 세포일 수 있으며, 특별히 이를 한정하진 않는다. 구체적으로, 외배엽 세포 또는 외배엽 유래의 세포, 중배엽 세포 또는 중배엽 유래의 세포, 내배엽 세포 또는 내배엽 유래의 세포 등이 있다.

외배엽 유래의 세포는 신경조직, 송과체(松果체), 부신수질, 색소체 및 표피조직의 조직·기관을 구성하는 세포이지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 중배엽 유래의 세포는 근조직, 결합 조직, 뼈조직, 연골조직, 심장조직, 혈관조직, 혈액조직, 진피조직, 비뇨기 및 생식기의 조직·기관을 구성하는 세포이지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 내배엽 유래의 세포는 소화관, 호흡기, 흉선, 갑상선, 부갑상선, 방광, 중이, 간장 및 췌장의 조직·기관을 구성하는 세포이지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 제조된 다능성 줄기세포, 및/또는 상기 세포로 제조한 분화 세포는 각종 생리 활성 물질(예, 약물)이나 기능이 미확인된 신규 유전자 산물 등의 약리평가나 활성 평가에 유용한다. 예를 들면, 다능성 줄기세포나 각종의 분화 세포의 기능 조절에 관련된 물질이나 약제, 및 /또는 다능성 줄기세포나 각종의 분화 세포에 대하여 독성이나 장애성을 가지는 물질이나 약제의 스크리닝에 이용할 수 있다. 특히, 현재 인간 세포를 이용한 스크리닝 방법이 거의 확립되어 있지 않아, 본 발명에서 제조된 다능성 줄기세포에 유래하는 각종 분화 세포는 상기 스크리닝 방법을 실시하기 위한 유용한 세포 소스가 된다.

또한, 본 발명은 본 발명에서 공개된 방법으로 제조한 다능성 줄기세포를 이용하여 키메라 배아 또는1 키메라 동물을 제조하는 방법, 및 제조한 키메라 배아 또는 키메라 동물을 제공한다. 키메라 배아 또는 키메라 동물의 제조 방법에 대한 표준 프로토콜이 이미 확립되고 있어, 예를 들면, Manipulating the Mouse Embryo : A laboratory manual(Hogan et al.편, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994) 등을 참조함으로써, 용이하게 실시할 수 있지만, 특별히 이에 한정되는 것은 아니다.

도 1은 폴리스티렌 플레이트에 코팅한 E-cad-Fc에 대한 ES 세포(R1 세포주와 EB3 세포주)의 접착성을 나타낸 것이다. 접착율은 젤라틴(0.1%)을 코팅한 플레이트에 대한 접착된 ES 세포 수를 1OO%로 두었을 때의 상대적인 값으로 나타낸다. BSA: 0.1% 소 혈청 알부민으로 코팅한 플레이트에 ES 세포를 접착시킨 실험군. ※: 젤라틴 실험군에 대하여, p< 0.01.

도 2는 E-cad-Fc 플레이트에 접종한 ES 세포의 형태를 나타낸 것이다. ES 세포를 젤라틴, I형 콜라겐, 파이브로넥틴, 또는 E-cad-Fc으로 코팅한 플레이트(도에서 각각 Gel., Col., Fn., E-cad-Fc로 표기)에 접종한 후 2일째의 세포 사진이다.

도 3A는 E-cad-Fc 플레이트에 접종한 ES 세포의 증식력을 나타낸 것이다. ES 세포를 젤라틴 플레이트(대조군) 또는 E-cad-Fc 플레이트에 접종하고, 3일째에 세포수를 비교하였다. ※: 대조군에 대하여, p<0.01.

도 3B는 E-cad-Fc 플레이트에 접종한 ES 세포의 BrdU 결합성을 나타낸 것이다. ES 세포(EB3)를 젤라틴 플레이트(대조군) 또는 E-cad-Fc 플레이트에 접종하고, BrdU로 표지하였다. 3일 후에 세포에 삽입된 BrdU를, 형광 색소를 이용한 항체 염색으로 검출하고, 형광 강도를 측정하였다. ※: 대조군에 대하여, p<O.O1.

도 4A는 E-cad-Fc 플레이트에 접종한 ES 세포의 미분화 마커의 발현을 나타낸 것이다. ES 세포(EB3 세포주)를 젤라틴 플레이트(대조군) 또는 E-cad-Fc 플레이트에 접종하고, 배양 14일째에 ALP 활성을 검출하였다. 도에서 LIF(+) 및(-)는 각각의 배양용 배지에 LIF 을 첨가/미첨가한 것을 나타낸다.

도 4B는 E-cad-Fc 플레이트에 접종한 ES 세포에서의 미분화 마커의 발현을 나타낸 것이다. ES 세포(EB3 세포주)를 젤라틴 플레이트(대조군) 또는 E-cad-Fc 플레이트에 접종하고, 배양 14일째에 0ct-3/4 단백질을 검출하였다. DAPI에 의한 핵 염색 사진을 나타낸다. Merged : DAPI와 Oct-3/4 항체에 의한 염색 사진을 중첩한 사진.

도 5는 E-cad-Fc 플레이트에 접종한 ES 세포에서의 미분화 마커 유전자의 발현을 나타낸 것이다. ES 세포를 젤라틴 플레이트(대조군) 또는 E-cad-Fc 플레이트에 접종하고, 배양 14일째에 0ct-3/4 및 Rex-1 유전자의 발현을 RT-PCR로 조사하였다. 도에서 +및 -는 각각 배양용 배지의 LIF의 첨가와 비첨가를 나타낸 것이다.

도 6은 E-cad-Fc 플레이트에 접종한 ES 세포의 LIF 반응성을 나타낸 것이다. ES 세포(R1주)를 젤라틴 플레이트(대조군) 또는 E-cad-Fc 플레이트에 접종하고, LIF를 다양한 농도로 첨가하여 배양한 후에, 콜로니를 형성시켜, ALP 활성을 검출함으로써, "미분화형" 콜로니 비율을 측정하였다. ※: 대조군/LIF 100OU/㎖ 군에 대하여, p<0.05.

도 7은 E-cad-Fc 플레이트에서 이차배양한 ES 세포의 분화 다능성을 나타낸 것이다. 젤라틴 플레이트(대조군) 또는 E-cad-Fc 플레이트에 접종하고, 이차배양한 ES 세포(R1주)를 회수한 다음 LIF가 첨가되지 않은 배지에서 EB을 형성시킴으로써, 분화를 유도하였다. EB 형성후 16일째에 회수한 샘플(EB)을 이용하여, 각종 분화 마커 유전자의 발현을 RT-PCR로 검토하였다. 대조군은, 이차배양을 실시하기 전의 ES 세포, 및 상기 세포를 이용하여 형성시킨 16일째의 EB(각각, 도 왼쪽에서 1번째와 2번째)를 이용하였다. T/Bra : T/Brachyury, βHl: 헤모글로빈, AFP: α-페토단백질(fetoprotein), TTR: 트랜스티레틴(transthyretin), GAPDH: 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나제(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase).

도 8은 E-cad-Fc 플레이트에서 이차배양한 ES 세포의 분화 다능성을 나타낸 것이다. E-cad-Fc 플레이트에 접종한 ES 세포(R1주)를 신경세포(상) 및 심근세포(하)로 분화 유도하였다. 분화 유도후 12일째에 세포를 고정시켜, 신경 세포 및 심근 세포에 특이적인 마커 분자에 대한 항체 염색 사진을 나타낸다.

도 9는 E-cad-Fc 플레이트에서 배양한 ES 세포의 생식 세포 기여성을 나타낸 것이다. E-cad-Fc 플레이트에서 배양한 ES 세포로 제조한 키메라 마우스를 야생형 C57BL/6계 마우스와 교배시켜, 수득한 새끼 마우스에 대해 2종의 마이크로 새틀라 이트 마커를 이용하여 PCR하였다. M : DNA 크기 마커, ES: ES 세포(EB3 주), B6: C57BL/6 마우스, #1 - #4: 털이 색상으로 판단하여 ES 세포가 기여하지 않는 것으로 예상한 개체, #5 - #8: 털의 색상으로 판단하여 ES 세포가 기여하고 있는 것으로 예상한 개체. 세로 축의 수치는 DNA의 크기(bp)이다.

도 1O은 E-cad-Fc 플레이트에 접종한 ES 세포의 유전자 도입의 발현 효율을 나타낸 것이다. ES 세포(EB3)를 젤라틴 플레이트(대조군) 또는 E-cad-Fc 플레이트에 접종한 다음, GFP 발현 벡터를 유전자 도입하였다. 1일 후, 세포에서의 GFP 단백질을 형광색소를 이용한 항체 염색으로 검출하고, 형광 강도를 측정하였다. ※: 대조군에 대하여, p<O.O1.

도 11은 인간 E-cad-Fc 플레이트에 접종한 ES 세포의 형태를 나타낸다. ES 세포를 젤라틴(대조군) 또는 E-cad-Fc을 코팅한 플레이트에 접종한 후 2일째의 세포 사진이다.

이하의 실시예는 본 발명을 따라 구체적으로 설명하지만, 이들은 본 발명의 단순한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

실시예1 : 재조합 E- 카드헤린 단백질의 제조

마우스 E-카드헤린의 세포외 영역과 IgG의 Fc 부분(IgG/Fc)의 융합 단백질(이하, E-cad-Fc라고 함)을 발현하는 벡터의 구축, 상기 단백질의 생산 및 그 정제 방법은, 발명자들이 보고한 방법(Nagaoka et al., Bioteqhnol. Lett. 24: 1857, 2002(비특허문헌 6): ProteinEng. 16: 243, 2003(비특허문헌 7))에 준한다. 먼저, 마우스 E-카드헤린의 전장을 포함하는 cDNA(이화학연구소 유전자은행에서 분양; RDB No. 1184)을 주형으로, E-카드헤린 cDNA의 세포외 도메인(E-cad-ECD)을 코딩하는 DNA 단편(아미노산 잔기번호 1 -699에 해당)을 증폭시켰다. 마우스 IgG/Fc을 코딩하는 DNA단편은 마우스 IgG1을 발현되는 융합세포로부터 mRNA를 제조하고, 이를 역전사 효소로 역전사하여 제조한 cDNA로부터 분리하였다. 양 DNA단편의 염기서열을 확인한 후, 발현 벡터pRC-CMV(Invitrogen)에 조립하여, E-cad-ECD 및 IgG/Fc 서열을 포함하는 발현 벡터, pRC-E-cad-Fc을 구축하였다.

E-cad-Fc 단백질을 생산하기 위해, CHO-K1세포(이과학연구소 〔쓰쿠바〕 입수)을 이용하였다. 직쇄화한 pRC-E-cad-Fc(1.0 ㎍)을 5.0 ㎕의 리포펙타민(등록상표) 시약(Invitrogen)과 혼합하고, 제품 첨부서에 기재된 추천 프로토콜의 방법에 따라, CH0-K1세포에 유전자 도입을 수행하였다. 이어서, E-cad-Fc 단백질을 항상 대량으로 생산하는 세포 클론을 수득하기 위해, 유전자 도입 2일 후에 세포를 회수하고, 96웰 플레이트(IWAKI) 1웰당 0.2개의 세포가 들어가도록 접종하였다. 400 ㎍/㎖의 G418(Invitrogen)을 첨가한 RPMI 1640 배지에서 7일간 배양한 후, 생존한 세포가 존재하는 웰의 배양 상청을 회수하여, 배양 상청중의 E-cad-Fc 단백질량을 측정하였다. 이로써, E-cad-Fc 단백질 생산량이 가장 높은 세포 클론(4G7주)을 분리하고, 이후의 실험에 사용하였다. 이들 세포는 무혈청배지(CH0-S-SFM II; Invitrogen)에 순화시킨 후, 스피너 플라스크를 이용하여 대량 배양하여 배양 상청을 회수하였다.

배양 상청은 0.45 μm의 멤브레인 필터로 여과한 후, 구멍 크기 10O kDa의 한외여과막(YM10O; Amicon) 및 교반식 셀(amicon 8200; amicon)을 이용하여 농축하였다. 이 농축액을 20 ㎖의 인산완충액(pH7.2)으로 투석한 후, 통상의 방법으로 단백질 A 컬럼(Amershalrl Biosciences)을 이용하여 정제하였고, 이를 이하의 실험에 사용하였다.

실시예 2 : E- cad - Fc 플레이트에 ES 세포의 접착

E-cad-Fc 단백질을 코팅한 세포 배양용 플레이트(이하, E-cad-Fc 플레이트)에 대한 ES 세포의 접착성을 검토하였다. E-cad-Fc 단백질의 PBS 희석 용액을 각종 크기의 무처리 폴리스티렌제 배양 플레이트에 주입하고, 37℃에서 하룻밤동안 코팅 처리를 하였다. 세정한 후, 세포의 비특이적 접착을 억제하기 위해, 세포를 접종하기 전에, O.1% BSA 용액으로 1-2시간동안 블로킹 처리하였다. 한편, 대조군은 BSA(O.1%)이나 젤라틴(O.1%), I형 콜라겐(O.01%; K0KEN), 피브로넥틴(5.0 ㎍/㎖; K0KEN)으로 코팅한 플레이트를 사용하였다.

ES 세포주로는 EB3 세포(니와히토시히로시〔이과학 연구소〕), R1 세포(Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8424, 1993), 및 129 SV 세포(다이니폰제약 주식회사에서 구입)를 이용하였으나, 대개 ES 세포종의 차이에 따른 실험 결과의 차이는 보이지 않았다. 이들 ES 세포는 10% FBS, 0.1 mM MEM 비필수 아미노산 용액, 2 mM L-글루타민, 및 0.1 mM 2-메르캅토에탄올을 포함하는 낫아웃-DMEM(Invitrogen)배지(이하, ESM라고 함)에 100O U/㎖의 LIF(ESGRO; Chemicon)을 첨가한 것을 이용하고, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual(Hogan et al.편, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994); Embryonic Stem Cells: Methods and Protocols(Turksen편, Humana Press, 2002) 등에 기재된 방법에 따라, 미분화 형질을 유지하면서 이차배양한 것을 실험에 제공하였다. 이하, 상기 조건으로 이차배양한 ES 세포를, 통상적인 배양 조건하에서 이차배양한 ES 세포라 한다.

통상의 배양 조건하에서 이차배양한 ES 세포를 무혈청 배지로 2회 세정한 후, 1 mM EDTA를 포함하는 0.25% 트립신 용액으로 처리하여 단일세포로 만든 다음 ESM에 현탁하였다. 이하, 특별히 명시하지 않는 한, ES 세포를 플레이트로부터 박리하고, 이차배양 이외의 실험에 사용할 때는 상기 조건을 이용하였다. 정제한 E-cad-Fc 단백질을 상기의 방법으로, 무처리 96웰 플레이트(IWAKI)에 코팅하고, 그 위에 3.0 x 10⁵ 세포/㎖로 준비한 세포 현탁액을 100 ㎕씩 접종하여, 4시간 배양하였다. 무혈청 배지로 세정한 후, 10%의 AlamarBlue(B止source lnterna tional)을 포함하는 배지로 교체하고, 4시간 반응시킨 후에 흡광도를 측정하여, 순 세포수의 지표로 하였다.

결과를 도 1에 나타낸 바와 같이, ES 세포는 일반적인 섬유아세포나 상피계 세포에 비해 접착력이 강하지 않았으며, 무처리 또는 BSA로 코팅한 폴리스티렌제 플레이트에는 거의 접착하지 않아 배지 중에 세포 응집 덩어리를 형성하였으나, 배양 플레이트를 젤라틴, 콜라겐 또는 피브로넥틴 등으로 전처리한 경우 통상의 세포 배양용 플레이트에 접종했을 때와 동일하게 접착시킬 수 있었다. E-cad-Fc의 농도를 달리하여 코팅한 플레이트를 이용하여 ES 세포의 접착성을 검토한 바, 5.0 ㎍/ ㎖ 이상의 농도 조건에서, R1 세포주 및 EB3 세포주 모두 양호한 접착성을 나타내었다. 한편, ES 세포는 무혈청 조건하에서도 E-cad-Fc 플레이트에 접착가능한 것으로 확인되어, 상기 플레이트 접착은 혈청 중의 접착 분자, 예를 들면 피브로넥틴 등을 통하지 않는 것이 명확하다.

E-카드헤린을 통한 결합은 Ca^{2 +} 의존적인 것으로 알려져 있다(Mareel et al., Int. J. Dev. Biol. 37: 227, 1993; Takeichi, Curr. 0pin. Cell Biol. 7: 619, 1995; Marrs & Nelson, Int. Rev. Cytol. 165: 159, 1996). ES 세포의 E-cad-Fc 플레이트 접착성에 미치는 킬레이트제 첨가 영향을 조사하기 위해서, 상기와 동일하게 E-cad-Fc 플레이트 상에서 4시간 배양시킨 ES 세포를, 최종 농도 5 mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 또는 에틸렌글리콜비스(2-아미노에틸에테르)테트라아세트산(EGTA) 용액으로 30분간 처리하고, 세포를 PBS로 세정한 후, 상기와 동일하게 AlamarBlue로 세포수를 측정하였다. 금속 이온에 대해 선택성이 낮은 EDTA로 처리한 경우, E-cad-Fc 및 피브로넥틴에 대한 ES 세포의 접착은 모두 분해되었지만, Ca^{2 +} 선택성이 높은 EGTA에서 처리한 경우, 피브로넥틴에 대한 결합은 저해되지 않고, E-카드헤린에 대한 결합만이 특이적으로 분해되었다. 또한, EGTA 처리시 5 mM의 Mg^{2 +}을 첨가하여도 그 효과는 억제되지 않았다. 이상의 결과로, E-cad-Fc 플레이트에 대한 ES 세포의 접착은 ES 세포의 표면상에 존재하는 E-카드헤린 분자와, E-cad-Fc 플레이트 고상 표면에 고정된 E-카드헤린 분자와의 상호작용에 의한 것으로 시사된다.

다음으로, 통상의 배양 조건에서 이차배양한 ES 세포를, E-cad-Fc 플레이트 또는 다른 기질로 코팅한 24웰 플레이트(IWAKI)에 접종하여 배양하였다. 일반적으로, ES 세포는 피더 세포상 또는 세포 배양용 통상의 플레이트상에서 견고하고, 고조된 상태의 콜로니를 형성하는 것으로 알려져 있다. 이번, 무처리 폴리스티렌제 배양 플레이트에 젤라틴, I형 콜라겐, 또는 피브로넥틴을 코팅한 플레이트에서도, ES 세포는 동일하게 명료하고, 견고한 콜로니를 형성하였다(도 2 참조). 그러나, E-cad-Fc 플레이트에 접종한 ES 세포, EB3 세포주와 R1 세포주는 모두에서는 접종 후 2, 3일 후에 명료한 콜로니를 거의 형성하지 않고, 1개 1개의 세포가 분산되어 증가하는 상태로 관찰되었다.

E-cad-Fc 플레이트 상에서의 ES 세포의 증식력을 검토하기 위해, 통상의 배양 조건으로 이차배양한 ES 세포를 회수하고, 500개의 ES 세포를 E-cad-Fc 플레이트 또는 젤라틴 플레이트(96웰 플레이트)에 접종하여, 3일간 내지 4일간 배양하였다. 세포를 무혈청 배지로 세정한 후, 상기와 동일하게 AlamarBlue로 세포수를 측정하였다. 그 결과, 배양 3일째에 젤라틴 플레이트에서 배양한 ES 세포에 비해, E-cad-Fc 플레이트에서 배양한 ES 세포의 수가 EB3 세포주 및 R1 세포주 모두에서 유의적으로 많았다(도 3A 참조). 또한, 배양 4일째에는 두가지 ES 세포주 모두 E-cad-Fc 플레이트 군의 세포수가 약 2배 정도 많았다. 또한, 동일한 이차배양을 4회 실시한 후에 ES 세포를 회수하고, 그 수를 측정한 결과, 통상의 젤라틴 플레이트에서 배양한 것에 비해, E-cad-Fc 플레이트로 배양한 ES 세포의 수가 3-5배 이상 많았다. ES 세포를 접종한 직후의 접착율은 양쪽 플레이트 모두 차이가 없어, E- cad-Fc 플레이트에서 배양한 ES 세포쪽이 높은 증식력 및 생존 능력을 가지고 있는 것으로 시사되었다. 한편, 상기와 같은 실험을 F9 세포로 수행한 경우, E-cad-Fc 플레이트 배양군과 통상 플레이트 배양군간의 세포 증식력 차이는 확인되지 않았다.

계속하여, 5-브로모-2'-데옥시우리딘(5-Bromo-2'-deoxyuridine; BrdU)의 삽입을 지표로 ES 세포의 DNA 합성 능력을 검토하였다. 상기 조건으로 3일간 배양한 ES 세포를 BrdU(10 μM)로 30분간 표지한 후, 단일세포로 회수하여 96웰 플레이트에 재접종하였다. 4시간 후, 부착한 ES 세포를 FixDenat 용액(Roche Applied Science)으로서 고정하고, PBS로 세정한 후, 항BrdU 항체(BMG 6H8; Roche Applied Science)(100배 희석)와 반응시킨 다음, 시아노겐 3(Cy3) 표지 항체(Jackson Immunoresearch Laboratory)(1: 1000 희석)로 염색하였다. 또한, 세포핵은 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI) 용액(O.1 ㎍/㎖)으로 염색하였다. 이들 항체나 색소에 의한 염색 사진을, ArrayScan^TM시스템(Cellomics) 하에서 관찰하였다. 그 결과, E-cad-Fc 플레이트 배양군은 통상적으로 플레이트 배양군보다도 유의적으로 높은 BrdU 삽입율을 보였다(도 3 B참조).

일반적으로, ES 세포는 밀집하여, 콜로니를 형성한 상태에서는 자발적으로 분화가 진행되는 것으로 알려져 있다. 그러므로, 본 검토에 이용한 3종의 마우스 ES 세포의 경우, 통상의 플레이트로 배양할 때 2일 또는 3일에 계대를 하지 않으면, 콜로니가 과도하게 성장하여, 형태가 상이한, 분화형의 세포가 출현한다. 한 편, E-cad-Fc 플레이트에서 배양하는 경우는 최초의 접종 수를 적게 함으로써, 5-7일간에 1회 정도의 계대로도 충분하며, 이러한 배양 조건하에서는 콜로니의 과대 형성이나 분화 세포의 출현은 확인되지 않았다. 따라서, E-cad-Fc 플레이트 상에서 배양한 ES 세포가 미분화 상태를 유지하고 있거나, 수 회의 이차배양을 거쳐도, ES 세포의 분산 상태 및 미분화 상태가 유지되는 것을 확인하기 위해, 상기 플레이트 상에서 수회 계대를 수행하고, 그 후의 ES 세포의 특성을 조사하였다.

먼저, ES 세포의 분화 상태를 확인하기 위해, 미분화된 ES 세포의 지표인 ALP활성 및 Oct-3/4 단백질의 발현을 검토하였다. ALP 활성의 검출은 Sigma Diagnostics Alkaline phosphatase 키트(시그마)을 이용하여 실시하였다. 배양한 ES 세포(EB3 세포주와 R1 세포주)를 PBS로 세정한 후, 66% 아세톤/ 3% 포르말린을 포함하는 구연산 용액으로 고정하고, PBS로 세정한 후, 상기 키트에 첨부된 나프톨 AS-BI 포스페이트 알카리 염색액을 15분간 처리하여, 발색 반응을 수행하였다(도 4A 참조).

0ct-3/4 단백질의 발현은 면역 염색법으로 조사하였다. 즉, 배양한 ES 세포를 8% 포름알데히드(Wako Pure Chemical)로 고정하고, PBS로 세정한 후, 항 Oct-3/4 항체(제품번호; Santa Cruz)(1: 200 희석)와 반응시킨 후, Alexa Fluor 표지 항체(Alexa-488; Molecular Probes)(1: 1000 희석)로 염색하였다. 또한, 세포핵은 DAPI 용액(O.1 ㎍/㎖)으로 염색하였다. 이들 항체나 색소에 의한 염색 사진을 형광현미경하에서 관찰하였다(도 4B참조).

그 결과, E-cad-Fc 플레이트로 14일간 배양한 ES 세포에서, 대조군으로 이용 한 젤라틴으로 코팅한 플레이트(이하, 젤라틴 플레이트)에서 배양한 ES 세포와 마찬가지로, 높은 ALP 활성(도 4A 참조) 및 0ct-3/4 단백질의 발현(도 4 B참조)을 확인할 수 있었다.

그 다음으로, 미분화 ES 세포의 마커가 되는 0ct-3/4, 및 Rex-1/Zfp 42 유전자의 발현을 조사하였다. E-cad-Fc 플레이트 또는 젤라틴 플레이트에서 14일간 배양한 ES 세포를 회수하고, 1 ㎖의 TRIZOL(Invitrogen)로 전체 RNA를 준비하였다. 계속해서, 통상의 방법을 따라, M-MLV 역전사효소(Invitrogen)로 cDNA를 합성하고, 이를 주형으로 하기 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)을 수행하여, 여러가지 유전자 단편을 증폭시켰다.

Oct -3/4 [증폭 크기: 528 bp ]

5'-프라이머: 5'-GAAGTTGGAGAAGGTGGAACC-3'(서열번호 3)

3'-프라이머: 5'-GCCTCATACTCTTCTCGTTGG-3'(서열번호 4)

Rex -1 [증폭 크기: 930 bp ]

5'-프라이머: 5'-AAAGTGAGATTAGCCCCGAG-3'(서열번호 5)

3'-프라이머: 5'-TCCCATCCCCTTCAATAGCA-3'(서열번호 6)

Nanog [증폭 크기: 710 bp ]

5'-프라이머: 5'-GAGGAAGCATCGAATTCTGG-3'(서열번호 7)

3'-프라이머: 5'-AAGTTATGGAGCGGAGCAGC-3'(서열번호 8)

GAPDH ( glyceraldehyde -3- phosphate dehydrogenase ) [증폭 크기: 858 bp ]

5'-프라이머: 5'-GGAAGCTTGTCATCAACGG-3'(서열번호 9)

3'-프라이머: 5'-CTCTTGCTCAGTGTCCTTGC-3'(서열번호 10)

내열성 DNA 중합효소로 TaKaRa Taq(TAKARA)을 사용하고, TaKaRa PCR Thermal Cycler MP(TaKaRa)를 이용하였다. 우선, cDNA를 포함하는 PCR 반응 용액을 94℃로 가열한 후, 94℃: 30초 → 59 ℃: 30초 → 72℃: 60초의 가열 사이클을 22회 반복하고, 마지막으로 72℃로 5분 가열한 후, 4℃로 냉각시켰다. PCR 산물을 1.5% 아가로스겔에 전기영동하고, SYBR 그린 I(TAKARA)으로 염색하여, Typhoon 8600(Amersham Biosciences)에서 검출하였다.

결과는 도 5에 나타낸다. 통상의 젤라틴 플레이트에서 배양한 ES 세포에서는 LIF 존재하에, 0ct-3/4 및 Rex-1, Nanog이 강하게 발현되었으며, LIF 비존재 하에서는 그 발현이 유의적으로 감소하였다. E-cad-Fc 플레이트에서 배양한 ES 세포 역시 동일하여, LIF 존재하에서는 0ct-3/4 및 Rex-1, Nanog을 강하게 발현하였다. 한편, 동일 샘플을 이용하여 신경계 세포, 중배엽계 세포 또는 내배엽계 세포의 지표가 되는 분화 마커 유전자, 예를 들면, NeuroD3, Sox-1, T/Brachyury, Flk-1, 헤모글로빈, α-페토단백질(fetoprotein), 트랜스티레틴(transthyretin) 등의 발현도 동일하게 조사하였으나, LIF 존재하에서는 젤라틴 플레이트 및 E-cad-Fc 플레이트에서 배양한 ES 세포의 어느쪽에서도, 분화 마커 유전자의 발현은 확인되지 않았다. 도 4A, 도 4B, 및 도 5의 결과로 나타낸 바와 같이, E-cad-Fc 플레이트에서 배양한 ES 세포는 콜로니를 형성하지 않고, 통상의 배양시와 다른 형태를 나타내면서 증식하지만, 미분화 상태는 유지되고 있는 것으로 확인되었다.

계속하여, E-cad-Fc 플레이트에서 배양한 ES 세포의 LIF에 대한 반응성이 변 화하는지를 검토하였다. 통상의 젤라틴 플레이트 및 E-cad-Fc 플레이트에서 계대한 ES 세포를, O-1O0O U/㎖의 LIF 농도 하에서 5일간 계대를 하지 않고 배양한 후, 양 군의 세포도 젤라틴 플레이트에 접종하고, 다시 3일간 배양하였다(LIF 농도는 배양 기간중 일정함). 플레이트 상에 형성된 ES 세포 콜로니의 ALP 활성을 상기와 동일한 방법으로 검출하고, 미분화 상태로 유지되고 있는 콜로니의 비율을 계측하였다. 콜로니중, 80% 이상의 세포에 ALP 활성이 확인되는 콜로니를 "미분화형"이라고 판정하였다.

젤라틴 플레이트에서 배양한 ES 세포는 최초 5일간의 배양이 끝난 시점에 과대한 콜로니를 형성하고 있었지만, 이 시점에서 명료하게 분화형 세포라고 판단할 수 있는 세포는 관찰되지 않았다. E-cad-Fc 플레이트에서 배양한 ES 세포는 상기 실험과 동일하게 콜로니를 형성하지 않고 증식하며, 분산된 상태를 유지하였다. 재접종한 후, 통상 플레이트에서 배양한 ES 세포는 1OO0 U/㎖의 LIF 농도를 첨가한 군에서는 대부분의 콜로니가 ALP 활성을 유지하고 있었지만, 처리한 LIF 농도가 낮아질수록, 미분화형 콜로니의 비율도 낮아졌다(도 6 참조). 한편, 미리 E-cad-Fc 플레이트에서 배양한 ES 세포는 100 U/㎖의 LIF 농도에서도 거의 콜로니가 미분화형의 성질을 유지하였다. 이 때, LIF 농도의 저하에 따른 증식력의 억제는 확인되지 않았다. 그 결과, E-cad-Fc 플레이트를 이용하여 배양함으로써, LIF 등 ES 세포의 배양에 필요한 첨가 인자의 양을 종래 방법의 경우보다 감소시킬 수 있는 것으로 시사되었다.

이어, ES 세포를 피더 세포 비의존적인 조건에 순화시킬 때에, E-cad-Fc 플 레이트를 이용할 수 있는지 여부를 검토하였다. 일반적으로, ES/EG 세포는 피더 세포와의 공배양에 의해 계대·유지되지만, 이러한 피더 의존적인 배양 상태를 피더 세포비의존적인 상태로 순화시킬 수 있다. 그러나, 이런 경우에는 ES 세포를 고밀도로, 게다가 고농도의 LIF(통상의 약 5-10 배량)을 첨가한 배지에서 이차배양을 반복하여야 한다. 예를 들면, 피더 세포 의존적인 상태에서 이차배양한 ES 세포(R1 주)를 피더 비의존적인 상태로 순화시키기 위해서는, 약 5.0 x 10⁴ 세포/cm²의 세포밀도로 접종하고, 1 x 10⁴ U/㎖의 LIF를 첨가하여야 한다. 그러나, 500 세포/cm²의 세포밀도로 ES 세포를 E-cad-Fc 플레이트에 접종하고, 1 x 10³U /㎖의 LIF를 첨가한 ESM에서 이차배양을 실시한 바, 종래의 경우와 동일하게 ES 세포를 피더 비의존적인 상태로 순화시킬 수 있었다. 또한, 이와 같이 제조한 ES 세포가 미분화성 및 분화 다능성을 충분히 보유하고 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 4 : E- cad - Fc 플레이트에서 배양한 ES 세포의 분화력 검토

E-cad-Fc 플레이트에서 수회 이차배양한 ES 세포가, 분화 다능성을 보유하는지를 확인하였다. 먼저, 해당 ES 세포를 LIF 비존재하에 부유 배양하여 배아체(Embryoid Body: EB)를 형성시키고, 이의 자발적인 분화 진행을 분화 마커 유전자의 발현을 토대로 조사하였다. 구체적으로, ES 세포로부터 EB를 형성시키기 위해, E-cad-Fc 플레이트에서 3회 이상 계대한 ES 세포를 회수하여 단일 세포 상태로 만든 다음, LIF 비첨가된 ESM 15 ㎕에 500개의 세포를 포함하는 물방울을 제작해서 현적(hanging-drop) 배양하였다. 현적중에 형성된 EB은 경시적으로 회수하고, 상 기의 방법과 동일하게 RNA의 제조 및 cDNA의 합성을 수행하였다. 이 cDNA를 주형으로 하기 프라이머를 이용하여 RT-PCR 반응을 수행함으로써, 여러가지 마커 유전자 단편을 증폭시켰다.

NeuroD3 [증폭 크기: 405 bp ]

5'-프라이머: 5'-CATCTCTGATCTCGACTGC-3'(서열번호 11)

3'-프라이머: 5'-CCAGATGTAGTTGTAGGCG-3'(서열번호 12)

Sox -1 [증폭 크기: 407 bp ]

5'-프라이머: 5'-GCACACAGCGTTTTCTCGG-3'(서열번호 13)

3'-프라이머: 5'-ACATCCGACTCCTCTTCCC-3'(서열번호 14)

T/ Brachyury [증폭 크기: 528 bp ]

5'-프라이머: 5'-TCCAGGTGCTATATATTGCC-3'(서열번호 15)

3'-프라이머: 5'-TGCTGCCTGTGAGTCACAAC-3'(서열번호 16)

Flk -1 [증폭 크기: 398 bp ]

5'-프라이머: 5'-TAGGTGCCTCCCCATACCCTGG-3'(서열번호 17)

3'-프라이머: 5'-TGGCCGGCTCTTTCGCTTACTG-3'(서열번호 18)

헤모글로빈 [증폭 크기: 415 bp ]

5'-프라이머: 5'-AACCCTCAATGGCCTGTGG-3'(서열 번 호 19)

3'-프라이머: 5'-TCAGTGGTACTTGTGGGACAGC-3'(서열번호 20)

α- 페토단백질 [증폭 크기: 997 bp ]

5'-프라이머: 5'-TGCTCAGTACGACAAGGTCG-3'(서열번호 21)

3'-프라이머: 5'-ACTGGTGATGCATAGCCTCC-3'(서열번호 22)

트랜스티레틴 [증폭 크기: 440 bp ]

5'-프라이머: 5'-AGTCCTCGATGCTGTCCGAG-3'(서열번호 23)

3'-프라이머: 5'-TCAGAGGTCGGGCAGCCCAGC-3'(서열번호 24)

결과는 도 7에 나타낸다. 통상의 젤라틴 플레이트에서 배양한 ES 세포의 경우 LIF가 결핍된 배지에서 EB의 자발적 분화를 유도한 바, 외배엽(NeuroD3, Sox-1), 중배엽(T/Brachyury, Flk-1, hemoglobin), 및 내배엽(α-fetoprotein, transthyretin)의 모든 배엽에 특이적 마커 유전자가 발현되었다. 또한, E-cad-Fc 플레이트에서 배양한 ES 세포의 경우, 모든 배엽에 특이적인 마커의 유전자 발현이 젤라틴 플레이트 군과 거의 동일한 강도로 확인되었다.

이어, 상기 ES 세포의 신경 세포 및 심근 세포로의 분화 능력을 검토하였다. ES 세포는 배양 플레이트 상에 미리 접종한 간질계(stromal) 세포를 피더 세포로서 함께 공배양함으로써, 신경 세포 및/또는 심근 세포로의 분화를 유도할 수 있는 것으로 보고되어 있다(Yamane et al., Methods Mol. Biol. 184: 261, 2002; Schroeder et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USAl00: 4018, 2003). 그리고, ES 세포의 신경 세포로의 분화 능력은 PA6 세포를 이용한 분화 시스템으로, 심근세포로의 분화 능력은 ST2세포를 이용한 시스템으로 조사하였다. PA6 세포 또는 ST2 세포(양 세포와도 연구·세포은행에서 구입)을 세포 배양용 6웰 플레이트(CORNING)에 접종하고, DMEM(Invitrogen)에 10%의 FBS를 첨가한 배지로 컨플런트(confluent) 상태로 배양한 것을 피더 세포로 사용하였다. 이어, 단일 세포 상태의 ES 세포 현탁 액을 준비하고, 피더 세포는 PBS로 2회 세정한 다음, 각 웰에 2000개의 세포를 각각 접종하였다. 다음날, 배양액은 신경 분화 시스템(PA6 피더)인 경우 20% 낫아웃 혈청 교체(Invitrogen)을 포함하는 ESM로, 심근 분화 시스템(ST2 피더)은 10% FBS를 포함하는 ESM로 교환하였다. 배양후 12일째에 세포를 70% 에탄올 용액으로 고정하고, 1차 항체로서 항 마이크로튜블-관련 단백질(Microtubule-Associated Protein-2)(MAP-2) 항체(AB5622; Chemicon), 또는 항 근절·미오신 항체(MF20; American Type Culture Collection)와 반응시킨 다음, 호르세라디시 페록시다제 표지 2차 항체(히스토파인 심플스테인 PO(R) 또는 P0(M); 니치레이)와 순차적으로 반응시키고, 마지막으로 ACE(3-amino-9-ethylcarbazole) 기질 용액(니치레이)으로 발색 반응을 수행한 후, 광학 현미경하에서 관찰하였다. 결과는 도 8에 나타낸다.

상기한 배양 조건에서, 통상의 젤라틴 플레이트에서 배양한 ES 세포를 PA6 세포 상에 접종한 경우, 배양 개시 후 수일 이내에 육안으로 관찰할 수 있는 크기의 콜로니를 형성하고, 배양 7일째 전후에 명확한 신경돌기형 구조를 나타낸 분화 세포로 형태적인 변화를 나타내었다. 이 세포는 신경 세포 마커인 MAP-2에 강한 양성을 나타내어, ES 세포가 신경 세포로 분화된 것임을 알 수 있다. 또한, ST2 세포 상에 접종한 ES 세포는, 배양 12일째 전후에 자립적 박동을 나타내는 세포 콜로니를 형성하고, 이 세포 콜로니는 심근 세포 마커인 근절·미오신에 강한 양성을 나타내므로, ES 세포가 심근세포로 분화되었음이 명확해졌다. E-cad-Fc 플레이트에서 배양한 ES 세포를 이용한 경우에서도, 대조군과 동일하게 신경 세포 및 심근 세포로의 분화를 확인할 수 있었다. 이상의 실험 결과로부터, E-cad-Fc 플레이트 에서 배양한 ES 세포가 시험관 내에서 분화 다능성을 보유하고 있음이 증명되었다.

또한, 상기 ES 세포의 테라토마(teratoma: 기형종) 형성 능력을 검토하였다. 테라토마는 ES 세포를 마우스 등의 동물의 체내에 이식한 경우에 생기는 내배엽, 중배엽, 외배엽의 3배엽으로부터 유래된 태아성 조직 및 성숙성 조직을 포함하는 종양으로, 테라토마 형성 능력은 ES 세포의 분화 다능성을 나타내는 지표의 하나로 이용할 수 있다.

ES 세포(EB3 주)를 젤라틴 플레이트 및 E-cad-Fc 플레이트에 접종하고, 3일간 5회의 이차배양을 실시하였다. 이들 ES 세포를 통상의 방법에 따라 Balb/c계 누드마우스의 정소(약 200 개씩)에 주입한 결과, 60일 후에 ES 세포를 이식한 모든 정소에서 테라토마의 형성이 확인되었으며, 젤라틴 플레이트 배양군과 E-cad-Fc 플레이트 배양군간의 종양 크기 차이는 확인되지 않았다. 또한, 통상의 방법에 따라 조직 절편을 제작하여 조직 사진을 관찰한 결과, 양쪽 군의 테라토마에서 표피 조직이나 각종 신경 마커(βIII-튜블린, GFAP, 뉴로필라멘트 M, GAP-43) 양성의 신경 세포 외배엽성 조직/세포, 뼈 또는 연골, 골격근 조직 등 중배엽성 조직/세포, 장관이나 기관지 상피 조직 등의 내배엽성 조직/세포의 형성이 관찰되어, E-cad-Fc 플레이트에서 배양한 ES 세포는, 테라토마 형성 능력을 보유하고 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 5 : E- cad - Fc 플레이트에서 배양한 ES 세포의 키메라 형성 능력 검토

E-cad-Fc 플레이트에서 수회 이차배양한 ES 세포가 키메라 형성 능력을 보유하고 있는지를 확인하였다. 동일 루트 세포에서 키메라 형성 능력이 확인된 동결 저장중인 ES 세포(EB3 세포주)를, 젤라틴 플레이트 및 E-cad-Fc 플레이트에 접종하여, 3일간 5회 이차배양하였다. 이들 ES 세포를, 통상의 방법에 따라 C57BL/6계 마우스의 배반포(약 100개씩)에 주입하고, 가임신 ICR 마우스(생후 8-10주)의 자궁에 이식하여, 출산시켰다. 원래, C57BL/6 마우스의 털색은 검정이지만, 태어난 새끼 중에는 몸의 일부(5-80%)가 ES 세포로부터 유래된 들판 쥐(agouti) 색의 털인 개체가 존재하였으며, 이러한 키메라 마우스는 젤라틴 플레이트에서 배양한 ES 세포에서는 총 4마리, E-cad-Fc 플레이트에서 배양한 ES 세포에서는 총 7마리 나타났다.

이어, 상기 키메라 마우스를 정상 ICR계 마우스와 교배시켜 새끼 마우스를 출산시키고, ES 세포로부터 유래된 털색이 다음 세대로 전달되는 것을 확인하였다. E-cad-Fc 플레이트에서 배양한 ES 세포의 이식으로 제조한 키메라 마우스 수컷 2마리로부터 각각 14마리, 17마리의 새끼를 얻었고, 숙주 배반포를 이용한 C57BL/6 마우스 유래 털색을 나타내는 개체들 중, ES 세포 유래 털색을 나타내는 개체는 각 5마리 및 6마리였다. 이들 개체가 ES 세포에 유래하는 유전 형질을 가지고 있다는 것을 계통 특이적인 마이크로 새틀라이트·마커에 의한 해석으로도 확인할 수 있었다(도 9). 즉, 각 새끼 개체로부터 통상의 방법으로 게놈 DNA를 회수하고, ES 세포가 유래하는 129계 마우스와, 키메라 마우스 제작 및 교배에 이용한 C57BL/6계 마우스의 유전자의 차이를 인식할 수 있는 D4Mit72, D4MitlI6, D7Mit276, D10Mit186의 4종의 마이크로 새틀라이트·마커를 검출하였다. 그 결과, 털색으로 ES 세포의 유전적 기여가 없다고 추정되는 개체(도에서, #1-4)에서 모든 마이크로 새틀라이트·마커는 C57BL/6계 마우스와 동일한 패턴을 보였다. 한편, 털색으로 ES 세포의 유전적 기여가 있다고 추정된 개체(도에서, #5-8)에서는 C57BL/6계 마우스의 패턴도, ES 세포에 특이적인 패턴과 함께 확인되어, 이들 개체에 ES 세포의 유전자가 전달되었음을 확인할 수 있었다.

실시예 6 : E- cad - Fc 플레이트에서 배양한 ES 세포의 유전자 도입율에 대한 효과

젤라틴 플레이트 및 E-cad-Fc 플레이트에서 3일간 배양한 ES 세포에, GFP 발현 벡터인 pEGFP-N2(Clontech)을 통상의 방법에 따라 리포펙타민 2000(Invitrogen)을 이용하여 도입하였다. 1일 후에 단일 세포로 회수하여 96웰 플레이트에 재접종하였다. 그리고 4시간 후, 부착된 ES 세포를 8% 포르말린 용액으로 10분간 고정시킨 후, O.2% Triton X-100/PBS 용액, Image-iT FX 시그널 인핸서(Invitrogen)를 처리하였다. PBS로 세정한 후, 항GFP 단일 클론 항체(Nacalai Tesque)와 반응시킨 후, Alexa Fluor 546이 표지된 랫 IgG 항체로 염색하였다. 세포핵은 DAPI 용액(O.1 ㎍/㎖)으로 염색하였다. 항체나 색소에 의한 염색 사진은 ArrayScan^TM 시스템(Cellomics) 하에서 관찰하였다. 그 결과, E-cad-Fc 플레이트 배양군의 경우 통상적인 플레이트 배양군에 비해 GFP의 발현이 유의적으로 높았으며, E-cad-Fc 플레이트에서 배양한 ES 세포는 통상의 배양 방법으로 배양한 ES 세포와 비교하여 유전자 도입 효율 및/또는 발현 효율이 높은 것으로 나타났다(도 10 참조).

실시예 7 : 인간 E- cad - Fc 단백질의 제조와 유용성의 검토

인간 E-카드헤린의 세포외 영역과 IgG/Fc의 융합 단백질(이하, hE-cad-Fc라 고 함)을 발현하는 벡터를 구축하기 위해, 인간 편평 상피 암세포주인 A431 세포 유래 cDNA를 주형으로, 인간 E-카드헤린 cDNA의 세포외 도메인(hE-cad- ECD)을 코딩하는 DNA 단편(아미노산 잔기 번호 1-697)을 증폭시켰다. 염기서열을 확인한 후, 실시예 1에 기재된 IgG/Fc 서열을 포함하는 발현 벡터에 조립하여, pRC-hE-cad-Fc을 구축하였다. 상기 벡터를 이용한 hE-cad-Fc의 제작 및 정제는 실시예 1에 기재된 방법에 따라 수행하였다.

hE-cad-Fc 단백질로 코팅한 세포 배양용 플레이트(이하, hE-cad-Fc 플레이트)에 대한 마우스 ES 세포의 접착 및 증식성을 검토하였다. hE-cad-Fc 플레이트의 제조 방법은 상기 실시예 2에 기재된 방법과 동일하다. 즉, hE-cad-Fc 단백질의 PBS 희석 용액을 무처리 폴리스티렌제 배양 플레이트에 넣어 37℃에서 하룻밤동안 코팅 처리를 한 것을, hE-cad-Fc 플레이트로 사용하였다. ES 세포(EB3 주 및 R1 주)를 상기 플레이트에 접종한 경우, 마우스형 hE-cad-Fc 단백질을 코팅한 플레이트를 사용하였을때와 동일하게 강한 접착성이 확인되었다. 또한, hE-cad-Fc 플레이트에 접종한 ES 세포는 접종 2, 3일 후에도 명확한 콜로니를 거의 형성하지 않았으며, 하나 하나의 세포가 분산되어 활발하게 증식되는 상태인 것으로 관찰되었다(도 11). ES 세포의 미분화성 및 분화 다능성 역시 마우스 E-cad-Fc 플레이트를 이용한 배양 실험과 동일하게, 유지되고 있었다.

본 발명의 증식 방법을 이용함으로써, ES 세포 등의 다능성 줄기세포를 피더 세포를 사용하지 않고도 효율적으로 대량 생산할 수 있다. 이때, 다능성 줄기세포 를 분산 상태로 배양할 수 있어, 이차배양이나 세포의 회수가 매우 용이하다. 또한, 배양용 액체 배지에 첨가하는 LIF 등의 인자를 감소시킬 수도 있다. 또한, 본 발명의 방법을 이용함으로써, ES 세포 등의 다능성 줄기세포에 원하는 유전자를 효율적으로 도입하는 할 수 있으며, 또한 이를 강하게 발현시킬 수 있다. 본 발명에 따라 제조된 다능성 줄기세포는 기존의 적정 분화 유도 처리 방법을 이용함으로써, 여러가지 기능적으로 분화된 세포를 제조하는데에 이용할 수 있으며, 각종 생리활성물질이나 미확인된 기능의 신규 유전자 산물 등의 약리 평가 및 활성 평가에 유용하다.

SEQUENCE LISTING <110> Daiichi Asubio Pharma Co., Ltd. <120> Method for expansion of pluripotent stem cells <130> fP05-02KR-1 <160> 24 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 882 <212> PRT <213> Human E-cadherin <220> <221> DOMAIN <222> (157)..(262) <223> EC1 <220> <221> DOMAIN <222> (265)..(375) <223> EC2 <220> <221> DOMAIN <222> (378)..(486) <223> EC3 <220> <221> DOMAIN <222> (487)..(595) <223> EC4 <220> <221> DOMAIN <222> (596)..(700) <223> EC5 <400> 1 Met Gly Pro Trp Ser Arg Ser Leu Ser Ala Leu Leu Leu Leu Leu Gln 1 5 10 15 Val Ser Ser Trp Leu Cys Gln Glu Pro Glu Pro Cys His Pro Gly Phe 20 25 30 Asp Ala Glu Ser Tyr Thr Phe Thr Val Pro Arg Arg His Leu Glu Arg 35 40 45 Gly Arg Val Leu Gly Arg Val Asn Phe Glu Asp Cys Thr Gly Arg Gln 50 55 60 Arg Thr Ala Tyr Phe Ser Leu Asp Thr Arg Phe Lys Val Gly Thr Asp 65 70 75 80 Gly Val Ile Thr Val Lys Arg Pro Leu Arg Phe His Asn Pro Gln Ile 85 90 95 His Phe Leu Val Tyr Ala Trp Asp Ser Thr Tyr Arg Lys Phe Ser Thr 100 105 110 Lys Val Thr Leu Asn Thr Val Gly His His His Arg Pro Pro Pro His 115 120 125 Gln Ala Ser Val Ser Gly Ile Gln Ala Glu Leu Leu Thr Phe Pro Asn 130 135 140 Ser Ser Pro Gly Leu Arg Arg Gln Lys Arg Asp Trp Val Ile Pro Pro 145 150 155 160 Ile Ser Cys Pro Glu Asn Glu Lys Gly Pro Phe Pro Lys Asn Leu Val 165 170 175 Gln Ile Lys Ser Asn Lys Asp Lys Glu Gly Lys Val Phe Tyr Ser Ile 180 185 190 Thr Gly Gln Gly Ala Asp Thr Pro Pro Val Gly Val Phe Ile Ile Glu 195 200 205 Arg Glu Thr Gly Trp Leu Lys Val Thr Glu Pro Leu Asp Arg Glu Arg 210 215 220 Ile Ala Thr Tyr Thr Leu Phe Ser His Ala Val Ser Ser Asn Gly Asn 225 230 235 240 Ala Val Glu Asp Pro Met Glu Ile Leu Ile Thr Val Thr Asp Gln Asn 245 250 255 Asp Asn Lys Pro Glu Phe Thr Gln Glu Val Phe Lys Gly Ser Val Met 260 265 270 Glu Gly Ala Leu Pro Gly Thr Ser Val Met Glu Val Thr Ala Thr Asp 275 280 285 Ala Asp Asp Asp Val Asn Thr Tyr Asn Ala Ala Ile Ala Tyr Thr Ile 290 295 300 Leu Ser Gln Asp Pro Glu Leu Pro Asp Lys Asn Met Phe Thr Ile Asn 305 310 315 320 Arg Asn Thr Gly Val Ile Ser Val Val Thr Thr Gly Leu Asp Arg Glu 325 330 335 Ser Phe Pro Thr Tyr Thr Leu Val Val Gln Ala Ala Asp Leu Gln Gly 340 345 350 Glu Gly Leu Ser Thr Thr Ala Thr Ala Val Ile Thr Val Thr Asp Thr 355 360 365 Asn Asp Asn Pro Pro Ile Phe Asn Pro Thr Thr Tyr Lys Gly Gln Val 370 375 380 Pro Glu Asn Glu Ala Asn Val Val Ile Thr Thr Leu Lys Val Thr Asp 385 390 395 400 Ala Asp Ala Pro Asn Thr Pro Ala Trp Glu Ala Val Tyr Thr Ile Leu 405 410 415 Asn Asp Asp Gly Gly Gln Phe Val Val Thr Thr Asn Pro Val Asn Asn 420 425 430 Asp Gly Ile Leu Lys Thr Ala Lys Gly Leu Asp Phe Glu Ala Lys Gln 435 440 445 Gln Tyr Ile Leu His Val Ala Val Thr Asn Val Val Pro Phe Glu Val 450 455 460 Ser Leu Thr Thr Ser Thr Ala Thr Val Thr Val Asp Val Leu Asp Val 465 470 475 480 Asn Glu Ala Pro Ile Phe Val Pro Pro Glu Lys Arg Val Glu Val Ser 485 490 495 Glu Asp Phe Gly Val Gly Gln Glu Ile Thr Ser Tyr Thr Ala Gln Glu 500 505 510 Pro Asp Thr Phe Met Glu Gln Lys Ile Thr Tyr Arg Ile Trp Arg Asp 515 520 525 Thr Ala Asn Trp Leu Glu Ile Asn Pro Asp Thr Gly Ala Ile Ser Thr 530 535 540 Arg Ala Glu Leu Asp Arg Glu Asp Phe Glu His Val Lys Asn Ser Thr 545 550 555 560 Tyr Thr Ala Leu Ile Ile Ala Thr Asp Asn Gly Ser Pro Val Ala Thr 565 570 575 Gly Thr Gly Thr Leu Leu Leu Ile Leu Ser Asp Val Asn Asp Asn Ala 580 585 590 Pro Ile Pro Glu Pro Arg Thr Ile Phe Phe Cys Glu Arg Asn Pro Lys 595 600 605 Pro Gln Val Ile Asn Ile Ile Asp Ala Asp Leu Pro Pro Asn Thr Ser 610 615 620 Pro Phe Thr Ala Glu Leu Thr His Gly Ala Ser Ala Asn Trp Thr Ile 625 630 635 640 Gln Tyr Asn Asp Pro Thr Gln Glu Ser Ile Ile Leu Lys Pro Lys Met 645 650 655 Ala Leu Glu Val Gly Asp Tyr Lys Ile Asn Leu Lys Leu Met Asp Asn 660 665 670 Gln Asn Lys Asp Gln Val Thr Thr Leu Glu Val Ser Val Cys Asp Cys 675 680 685 Glu Gly Ala Ala Gly Val Cys Arg Lys Ala Gln Pro Val Glu Ala Gly 690 695 700 Leu Gln Ile Pro Ala Ile Leu Gly Ile Leu Gly Gly Ile Leu Ala Leu 705 710 715 720 Leu Ile Leu Ile Leu Leu Leu Leu Leu Phe Leu Arg Arg Arg Ala Val 725 730 735 Val Lys Glu Pro Leu Leu Pro Pro Glu Asp Asp Thr Arg Asp Asn Val 740 745 750 Tyr Tyr Tyr Asp Glu Glu Gly Gly Gly Glu Glu Asp Gln Asp Phe Asp 755 760 765 Leu Ser Gln Leu His Arg Gly Leu Asp Ala Arg Pro Glu Val Thr Arg 770 775 780 Asn Asp Val Ala Pro Thr Leu Met Ser Val Pro Arg Tyr Leu Pro Arg 785 790 795 800 Pro Ala Asn Pro Asp Glu Ile Gly Asn Phe Ile Asp Glu Asn Leu Lys 805 810 815 Ala Ala Asp Thr Asp Pro Thr Ala Pro Pro Tyr Asp Ser Leu Leu Val 820 825 830 Phe Asp Tyr Glu Gly Ser Gly Ser Glu Ala Ala Ser Leu Ser Ser Leu 835 840 845 Asn Ser Ser Glu Ser Asp Lys Asp Gln Asp Tyr Asp Tyr Leu Asn Glu 850 855 860 Trp Gly Asn Arg Phe Lys Lys Leu Ala Asp Met Tyr Gly Gly Gly Glu 865 870 875 880 Asp Asp <210> 2 <211> 884 <212> PRT <213> Mouse E-cadherin <220> <221> DOMAIN <222> (159)..(264) <223> EC1 <220> <221> DOMAIN <222> (267)..(377) <223> EC2 <220> <221> DOMAIN <222> (380)..(488) <223> EC3 <220> <221> DOMAIN <222> (489)..(597) <223> EC4 <220> <221> DOMAIN <222> (598)..(702) <223> EC5 <400> 2 Met Gly Ala Arg Cys Arg Ser Phe Ser Ala Leu Leu Leu Leu Leu Gln 1 5 10 15 Val Ser Ser Trp Leu Cys Gln Glu Leu Glu Pro Glu Ser Cys Ser Pro 20 25 30 Gly Phe Ser Ser Glu Val Tyr Thr Phe Pro Val Pro Glu Arg His Leu 35 40 45 Glu Arg Gly His Val Leu Gly Arg Val Arg Phe Glu Gly Cys Thr Gly 50 55 60 Arg Pro Arg Thr Ala Phe Phe Ser Glu Asp Ser Arg Phe Lys Val Ala 65 70 75 80 Thr Asp Gly Thr Ile Thr Val Lys Arg His Leu Lys Leu His Lys Leu 85 90 95 Glu Thr Ser Phe Leu Val Arg Ala Arg Asp Ser Ser His Arg Glu Leu 100 105 110 Ser Thr Lys Val Thr Leu Lys Ser Met Gly His His His His Arg His 115 120 125 His His Arg Asp Pro Ala Ser Glu Ser Asn Pro Glu Leu Leu Met Phe 130 135 140 Pro Ser Val Tyr Pro Gly Leu Arg Arg Gln Lys Arg Asp Trp Val Ile 145 150 155 160 Pro Pro Ile Ser Cys Pro Glu Asn Glu Lys Gly Glu Phe Pro Lys Asn 165 170 175 Leu Val Gln Ile Lys Ser Asn Arg Asp Lys Glu Thr Lys Val Phe Tyr 180 185 190 Ser Ile Thr Gly Gln Gly Ala Asp Lys Pro Pro Val Gly Val Phe Ile 195 200 205 Ile Glu Arg Glu Thr Gly Trp Leu Lys Val Thr Gln Pro Leu Asp Arg 210 215 220 Glu Ala Ile Ala Lys Tyr Ile Leu Tyr Ser His Ala Val Ser Ser Asn 225 230 235 240 Gly Glu Ala Val Glu Asp Pro Met Glu Ile Val Ile Thr Val Thr Asp 245 250 255 Gln Asn Asp Asn Arg Pro Glu Phe Thr Gln Pro Val Phe Glu Gly Phe 260 265 270 Val Ala Glu Gly Ala Val Pro Gly Thr Ser Val Met Lys Val Ser Ala 275 280 285 Thr Asp Ala Asp Asp Asp Val Asn Thr Tyr Asn Ala Ala Ile Ala Tyr 290 295 300 Thr Ile Val Ser Gln Asp Pro Glu Leu Pro His Lys Asn Met Phe Thr 305 310 315 320 Val Asn Arg Asp Thr Gly Val Ile Ser Val Leu Thr Ser Gly Leu Asp 325 330 335 Arg Glu Ser Tyr Pro Thr Tyr Thr Leu Val Val Gln Ala Ala Asp Leu 340 345 350 Gln Gly Glu Gly Leu Ser Thr Thr Ala Lys Ala Val Ile Thr Val Lys 355 360 365 Asp Ile Asn Asp Asn Ala Pro Val Phe Asn Pro Ser Thr Tyr Gln Gly 370 375 380 Gln Val Pro Glu Asn Glu Val Asn Ala Arg Ile Ala Thr Leu Lys Val 385 390 395 400 Thr Asp Asp Asp Ala Pro Asn Thr Pro Ala Trp Lys Ala Val Tyr Thr 405 410 415 Val Val Asn Asp Pro Asp Gln Gln Phe Val Val Val Thr Asp Pro Thr 420 425 430 Thr Asn Asp Gly Ile Leu Lys Thr Ala Lys Gly Leu Asp Phe Glu Ala 435 440 445 Lys Gln Gln Tyr Ile Leu His Val Arg Val Glu Asn Glu Glu Pro Phe 450 455 460 Glu Gly Ser Leu Val Pro Ser Thr Ala Thr Val Thr Val Asp Val Val 465 470 475 480 Asp Val Asn Glu Ala Pro Ile Phe Met Pro Ala Glu Arg Arg Val Glu 485 490 495 Val Pro Glu Asp Phe Gly Val Gly Gln Glu Ile Thr Ser Tyr Thr Ala 500 505 510 Arg Glu Pro Asp Thr Phe Met Asp Gln Lys Ile Thr Tyr Arg Ile Trp 515 520 525 Arg Asp Thr Ala Asn Trp Leu Glu Ile Asn Pro Glu Thr Gly Ala Ile 530 535 540 Phe Thr Arg Ala Glu Met Asp Arg Glu Asp Ala Glu His Val Lys Asn 545 550 555 560 Ser Thr Tyr Val Ala Leu Ile Ile Ala Thr Asp Asp Gly Ser Pro Ile 565 570 575 Ala Thr Gly Thr Gly Thr Leu Leu Leu Val Leu Leu Asp Val Asn Asp 580 585 590 Asn Ala Pro Ile Pro Glu Pro Arg Asn Met Gln Phe Cys Gln Arg Asn 595 600 605 Pro Gln Pro His Ile Ile Thr Ile Leu Asp Pro Asp Leu Pro Pro Asn 610 615 620 Thr Ser Pro Phe Thr Ala Glu Leu Thr His Gly Ala Ser Val Asn Trp 625 630 635 640 Thr Ile Glu Tyr Asn Asp Ala Ala Gln Glu Ser Leu Ile Leu Gln Pro 645 650 655 Arg Lys Asp Leu Glu Ile Gly Glu Tyr Lys Ile His Leu Lys Leu Ala 660 665 670 Asp Asn Gln Asn Lys Asp Gln Val Thr Thr Leu Asp Val His Val Cys 675 680 685 Asp Cys Glu Gly Thr Val Asn Asn Cys Met Lys Ala Gly Ile Val Ala 690 695 700 Ala Gly Leu Gln Val Pro Ala Ile Leu Gly Ile Leu Gly Gly Ile Leu 705 710 715 720 Ala Leu Leu Ile Leu Ile Leu Leu Leu Leu Leu Phe Leu Arg Arg Arg 725 730 735 Thr Val Val Lys Glu Pro Leu Leu Pro Pro Asp Asp Asp Thr Arg Asp 740 745 750 Asn Val Tyr Tyr Tyr Asp Glu Glu Gly Gly Gly Glu Glu Asp Gln Asp 755 760 765 Phe Asp Leu Ser Gln Leu His Arg Gly Leu Asp Ala Arg Pro Glu Val 770 775 780 Thr Arg Asn Asp Val Ala Pro Thr Leu Met Ser Val Pro Gln Tyr Arg 785 790 795 800 Pro Arg Pro Ala Asn Pro Asp Glu Ile Gly Asn Phe Ile Asp Glu Asn 805 810 815 Leu Lys Ala Ala Asp Ser Asp Pro Thr Ala Pro Pro Tyr Asp Ser Leu 820 825 830 Leu Val Phe Asp Tyr Glu Gly Ser Gly Ser Glu Ala Ala Ser Leu Ser 835 840 845 Ser Leu Asn Ser Ser Glu Ser Asp Gln Asp Gln Asp Tyr Asp Tyr Leu 850 855 860 Asn Glu Trp Gly Asn Arg Phe Lys Lys Leu Ala Asp Met Tyr Gly Gly 865 870 875 880 Gly Glu Asp Asp <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Oct-3/4,size 528 bp,5'primer <400> 3 gaagttggag aaggtggaac c 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Oct-3/4,size 528 bp,3'primer <400> 4 gcctcatact cttctcgttg g 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Rex1,size 930 bp,5'primer <400> 5 aaagtgagat tagccccgag 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Rex1,size 930 bp,3'primer <400> 6 tcccatcccc ttcaatagca 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Nanog,size 930 bp,5'primer <400> 7 gaggaagcat cgaattctgg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Nanog, size 930 bp,3'primer <400> 8 aagttatgga gcggagcagc 20 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> GAPDH,size 858 bp,5'primer <400> 9 ggaagcttgt catcaacgg 19 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> GAPDH, size 858 bp,3'primer <400> 10 ctcttgctca gtgtccttgc 20 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> NeuroD3, size 405 bp,5'primer <400> 11 catctctgat ctcgactgc 19 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> NeuroD3, size 405 bp,3'primer <400> 12 ccagatgtag ttgtaggcg 19 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Sox1, size 407 bp, 5'primer <400> 13 gcacacagcg ttttctcgg 19 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Sox1, size 407 bp, 3'primer <400> 14 acatccgact cctcttccc 19 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> T/Brachyury, size 528 bp, 5'primer <400> 15 tccaggtgct atatattgcc 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> T/Brachyury, size 528 bp, 3'primer <400> 16 tgctgcctgt gagtcacaac 20 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Flk1, size 398 bp, 5'primer <400> 17 taggtgcctc cccataccct gg 22 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Flk1, size 398 bp, 3'primer <400> 18 tggccggctc tttcgcttac tg 22 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> beta-H1, size 415 bp, 5'primer <400> 19 aaccctcaat ggcctgtgg 19 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> beta-H1, size 415 bp,3'primer <400> 20 tcagtggtac ttgtgggaca gc 22 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> alpha-fetoprotein, size 997 bp,5'primer <400> 21 tgctcagtac gacaaggtcg 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> alpha-fetoprotein, size 997 bp, 3'primer <400> 22 actggtgatg catagcctcc 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> transthyretin, size 440 bp, 5'primer <400> 23 agtcctggat gctgtccgag 20 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> transthyretin, size 440 bp, 3'primer <400> 24 tcagaggtcg ggcagcccag c 21

Claims (10)

1. 다능성 줄기세포(pluripotent stem cell)의 증식 방법에 있어서,

   액체 배지와 상기 다능성 줄기세포에 접착성을 가지는 분자를 기재 고상 표면에 고정 또는 코팅한 배양 용기를 이용하며,

   피더 세포(feeder cell)를 사용하지 않고, 미분화성 및 분화 다능성을 지닌 분산 상태로 상기 다능성 줄기세포를 증식시키는 것을 특징으로 하는 다능성 줄기세포의 증식 방법.
2. 다능성 줄기세포의 유전자 도입 방법에 있어서,

   액체배지와 상기 다능성 줄기세포에 접착성을 가지는 분자를 기재 고상 표면에 고정 또는 코팅한 배양 용기를 이용하며,

   피더 세포를 사용하지 않고, 미분화성 및 분화 다능성을 지닌 분산 상태의 상기 다능성 줄기세포에 유전자를 도입 및 발현시키는 것을 특징으로 하는 다능성 줄기세포의 유전자 도입 방법.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 다능성 줄기세포에 접착성을 가지는 분자는 상기 다능성 줄기세포에서 발현되는 분자 또는 상기 분자와 구조적으로 유사한 분자이며, 상기 다능성 줄기세포와 동종친화적인 결합성을 지닌 분자인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 3항에 있어서, 상기 다능성 줄기세포에 접착성을 가지는 분자는 카드헤린계 분자인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 4항에 있어서, 상기 카드헤린계 분자는 E-카드헤린 또는 상기 분자와 구조적으로 유사한 분자이며, E-카드헤린의 EC1 도메인 및 EC2 도메인, EC3 도메인, EC4 도메인 및 EC5 도메인 중 하나 이상의 도메인을 포함하며, 상기 다능성 줄기세포와 동종친화적인 결합성을 지닌 분자인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 5항에 있어서, 상기 E-카드헤린은 포유 동물 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 6항에 있어서, 상기 E-카드헤린은 인간 또는 마우스 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한항에 있어서, 상기 다능성 줄기세포에 접착성을 가지는 분자는 면역 글로불린의 Fc 영역과 융합되어, 상기 Fc 영역을 통하여 상기 기재 고상 표면에 고정되는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한항에 있어서, 상기 다능성 줄기세포는 포유 동물의 배아 줄기세포(ES 세포) 또는 배아 생식 세포(EG 세포)인 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한항에 따른 방법으로 제조된 다능성 줄기세포.

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