JP2001061470A - マウス胚性幹細胞 - Google Patents
マウス胚性幹細胞Info
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- JP2001061470A JP2001061470A JP24276399A JP24276399A JP2001061470A JP 2001061470 A JP2001061470 A JP 2001061470A JP 24276399 A JP24276399 A JP 24276399A JP 24276399 A JP24276399 A JP 24276399A JP 2001061470 A JP2001061470 A JP 2001061470A
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- embryonic stem
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- mouse
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 汎用近交系マウスからキメラ形成能および生
殖細胞への分化能力を有し、インジェクション法及びア
グリゲーション法によるキメラ個体の作出に使用でき
る、雌のＥＳ細胞を樹立する。 【解決手段】 Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ系雌マウスの透明帯か
らイン・ビトロで孵化させた孵化胚盤胞をフィーダー細
胞上で培養し、分離したＩＣＭを培養し、イン・ビトロ
で継代維持が可能なＥＳ細胞を分離する。
殖細胞への分化能力を有し、インジェクション法及びア
グリゲーション法によるキメラ個体の作出に使用でき
る、雌のＥＳ細胞を樹立する。 【解決手段】 Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ系雌マウスの透明帯か
らイン・ビトロで孵化させた孵化胚盤胞をフィーダー細
胞上で培養し、分離したＩＣＭを培養し、イン・ビトロ
で継代維持が可能なＥＳ細胞を分離する。
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明は、Ｃ５７ＢＬマウス
系統から分離された雌の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に関す
るものである。本発明のＥＳ細胞は、インジェクション
( 注入) 法およびアグリゲーション( 集合) 法によるキ
メラ個体の作成に使用される。
系統から分離された雌の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に関す
るものである。本発明のＥＳ細胞は、インジェクション
( 注入) 法およびアグリゲーション( 集合) 法によるキ
メラ個体の作成に使用される。
【０００２】
【従来の技術】胚性幹(Embryonic Stem, ES)細胞は初期
胚から分離された全能性を持つ細胞株である。このES細
胞は正常な胚とキメラ胚を形成させることにより、成体
のあらゆる成熟細胞へと分化する能力を保有しながら培
養維持が可能な細胞である。また、ES細胞はイン・ビト
ロの分化誘導条件によっても様々な細胞を生成させる能
力をもっている。マウス個体を構成する細胞は胚盤胞期
の内部細胞塊（Inner Cell Mass, ICM) あるいは外胚葉
（epiblast、エピブラスト）から派生した一次外胚葉に
由来している。その意味ではICM およびエピブラストは
全能性を持った幹細胞群であるといえる。このICM から
未分化状態を維持したまま培養分離されるのが胚性幹(E
mbryonic Stem, ES)細胞である。
胚から分離された全能性を持つ細胞株である。このES細
胞は正常な胚とキメラ胚を形成させることにより、成体
のあらゆる成熟細胞へと分化する能力を保有しながら培
養維持が可能な細胞である。また、ES細胞はイン・ビト
ロの分化誘導条件によっても様々な細胞を生成させる能
力をもっている。マウス個体を構成する細胞は胚盤胞期
の内部細胞塊（Inner Cell Mass, ICM) あるいは外胚葉
（epiblast、エピブラスト）から派生した一次外胚葉に
由来している。その意味ではICM およびエピブラストは
全能性を持った幹細胞群であるといえる。このICM から
未分化状態を維持したまま培養分離されるのが胚性幹(E
mbryonic Stem, ES)細胞である。
【０００３】このES細胞は形態的には胚性癌(Embryonal
Carcinoma,EC)細胞と類似しているが、イン・ビボおよ
びイン・ビトロでの分化能は高く、初期胚とキメラ胚を
形成させることにより、正常な胎仔発生に貢献し、成体
のあらゆる臓器にES細胞由来の成熟細胞が検出されるこ
とから、全能性の幹細胞と見なされている。ES細胞を未
分化状態で維持するには白血病抑制因子(leukaemia inh
ibitry factor, LIF)存在下にゼラチンコートしたプレ
ート上で、あるいは胎仔由来の線維芽細胞をフィーダー
細胞として培養することが必要である。この条件下では
遺伝子導入およびクローン化が可能であり、遺伝子改変
動物の作製において有力な手法として知られている。
Carcinoma,EC)細胞と類似しているが、イン・ビボおよ
びイン・ビトロでの分化能は高く、初期胚とキメラ胚を
形成させることにより、正常な胎仔発生に貢献し、成体
のあらゆる臓器にES細胞由来の成熟細胞が検出されるこ
とから、全能性の幹細胞と見なされている。ES細胞を未
分化状態で維持するには白血病抑制因子(leukaemia inh
ibitry factor, LIF)存在下にゼラチンコートしたプレ
ート上で、あるいは胎仔由来の線維芽細胞をフィーダー
細胞として培養することが必要である。この条件下では
遺伝子導入およびクローン化が可能であり、遺伝子改変
動物の作製において有力な手法として知られている。
【０００４】一方、培養系を操作することにより、ＥＳ
細胞から血球系、心筋、骨格筋、神経など多数の細胞群
へ分化させることが可能である．ＥＳ細胞は、塊( 胚様
体)を形成して三次元的に増殖し、内胚葉、中胚葉、外
胚葉の三胚葉を構成しながら各成熟細胞へと分化するこ
とから、嚢胚期の胚の発生過程を再現していると見られ
ている。しかも、培養細胞であることからスケールアッ
プが容易であり、ＩＣＭおよびエピブラストから発生し
てくる様々な系列の前駆細胞を多数単離するのに非常に
都合が良い。したがって、ＥＳ細胞は、このような細胞
の発生過程に必要な液性因子のスクリーニングや遺伝子
機能の検討に威力を発揮する哺乳動物では唯一の実験系
である。
細胞から血球系、心筋、骨格筋、神経など多数の細胞群
へ分化させることが可能である．ＥＳ細胞は、塊( 胚様
体)を形成して三次元的に増殖し、内胚葉、中胚葉、外
胚葉の三胚葉を構成しながら各成熟細胞へと分化するこ
とから、嚢胚期の胚の発生過程を再現していると見られ
ている。しかも、培養細胞であることからスケールアッ
プが容易であり、ＩＣＭおよびエピブラストから発生し
てくる様々な系列の前駆細胞を多数単離するのに非常に
都合が良い。したがって、ＥＳ細胞は、このような細胞
の発生過程に必要な液性因子のスクリーニングや遺伝子
機能の検討に威力を発揮する哺乳動物では唯一の実験系
である。
【０００５】現在までに雌のES細胞でキメラ形成能が確
認されているものは、Evans 等 (In"Genetic Manipuati
on of the Early Mammalian Embryo"（初期哺乳類胚に
おける遺伝子操作） Constantiniおよび Jaenisch 編
集。コールド・スプリング・ハーバー・ニュ−ヨーク発
行、 1985 年 )によって129 系統マウスから樹立された
細胞株2 例と単為発生2 倍体化胚より樹立された129 系
統マウス由来の細胞株2例、CBA とC57BL 系統マウス間
のF1の単為発生胚に由来する2 例の細胞株に限られてい
る。さらに、汎用近交系C57BL マウス由来の細胞株で生
殖細胞への分化能力を維持しているものは、Ledermanお
よびBurki (Experimental Cell Research（エクスペリ
メンタル・セル・ リサーチ） 197, 254-258,1991) によ
り得られた雄の1 株(BL-III)にすぎない。また、その他
の近交系であるDBA(Experimental Cell Research（エク
スペリメンタル・セル・ リサーチ）221, 520-525,1995)
からも生殖細胞への分化能力を保持したES細胞が樹立さ
れているが、この株もやはり雄の細胞株1 株である。
認されているものは、Evans 等 (In"Genetic Manipuati
on of the Early Mammalian Embryo"（初期哺乳類胚に
おける遺伝子操作） Constantiniおよび Jaenisch 編
集。コールド・スプリング・ハーバー・ニュ−ヨーク発
行、 1985 年 )によって129 系統マウスから樹立された
細胞株2 例と単為発生2 倍体化胚より樹立された129 系
統マウス由来の細胞株2例、CBA とC57BL 系統マウス間
のF1の単為発生胚に由来する2 例の細胞株に限られてい
る。さらに、汎用近交系C57BL マウス由来の細胞株で生
殖細胞への分化能力を維持しているものは、Ledermanお
よびBurki (Experimental Cell Research（エクスペリ
メンタル・セル・ リサーチ） 197, 254-258,1991) によ
り得られた雄の1 株(BL-III)にすぎない。また、その他
の近交系であるDBA(Experimental Cell Research（エク
スペリメンタル・セル・ リサーチ）221, 520-525,1995)
からも生殖細胞への分化能力を保持したES細胞が樹立さ
れているが、この株もやはり雄の細胞株1 株である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】現在使用されているES
細胞の殆ど全ては生殖細胞からテラトーマ（奇形腫）、
いわゆる胚性癌細胞（teratocarcinoma ）を高率に形成
する系統として確立された系統である１２９系マウスに
由来する細胞である。汎用近交系から樹立されキメラ形
成能および生殖細胞への分化能力を持っている雌のES細
胞は存在しない。そのため、従来公知のＥＳ細胞は、雌
特異的な遺伝子改変実験には適しておらず、さらにES細
胞を体外で様々な組織に分化させ組織を個体へ移植しよ
うとした場合、拒絶反応を抑える免疫抑制剤投与による
障害を排除するためには雄個体のみへ移植することとな
る。そこで、一般的なマウス系統でしかも免疫系の研究
の蓄積が多く存在する汎用近交系C57BL 系マウスから雌
のES細胞の樹立が望まれている。
細胞の殆ど全ては生殖細胞からテラトーマ（奇形腫）、
いわゆる胚性癌細胞（teratocarcinoma ）を高率に形成
する系統として確立された系統である１２９系マウスに
由来する細胞である。汎用近交系から樹立されキメラ形
成能および生殖細胞への分化能力を持っている雌のES細
胞は存在しない。そのため、従来公知のＥＳ細胞は、雌
特異的な遺伝子改変実験には適しておらず、さらにES細
胞を体外で様々な組織に分化させ組織を個体へ移植しよ
うとした場合、拒絶反応を抑える免疫抑制剤投与による
障害を排除するためには雄個体のみへ移植することとな
る。そこで、一般的なマウス系統でしかも免疫系の研究
の蓄積が多く存在する汎用近交系C57BL 系マウスから雌
のES細胞の樹立が望まれている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】汎用近交系C57BL 系マウ
スからのES細胞を樹立すべく試みたところ、キメラ形成
能および生殖細胞への分化能力を有し、雌特異的な遺伝
子改変実験あるいは免疫抑制剤の障害を排除した組織移
植実験に大きく貢献する雌のES細胞H14-2-1 株の樹立に
はじめて成功し，本発明を完成するに至った。すなわ
ち、透明帯から脱出した孵化胚盤胞をＥＳ細胞の樹立に
使用すると効率的にＥＳ細胞を樹立できること、イン・
ビボで孵化させた場合、胚盤胞の回収率が低下するの
で、Ｃ５７ＢＬ系統由来の胚盤胞をイン・ビトロで培養
することにより、透明帯から脱出させた孵化胚盤胞を作
成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
スからのES細胞を樹立すべく試みたところ、キメラ形成
能および生殖細胞への分化能力を有し、雌特異的な遺伝
子改変実験あるいは免疫抑制剤の障害を排除した組織移
植実験に大きく貢献する雌のES細胞H14-2-1 株の樹立に
はじめて成功し，本発明を完成するに至った。すなわ
ち、透明帯から脱出した孵化胚盤胞をＥＳ細胞の樹立に
使用すると効率的にＥＳ細胞を樹立できること、イン・
ビボで孵化させた場合、胚盤胞の回収率が低下するの
で、Ｃ５７ＢＬ系統由来の胚盤胞をイン・ビトロで培養
することにより、透明帯から脱出させた孵化胚盤胞を作
成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】本発明は、以下の発明を包含する。 （１）汎用近交系Ｃ５７ＢＬマウス系統から分離され、
キメラ形成能および生殖細胞への分化能力を有する、雌
の胚性幹細胞。 （２）寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７５３４として寄託さ
れているH14-2-1 株である１項に記載の胚性幹細胞。 （３）イン・ビトロで透明帯から孵化させた胚盤胞を使
用して、胚性幹細胞株を樹立させる１項または２項に記
載の胚性幹細胞の樹立法。 （４）透明帯から孵化させた孵化胚盤胞を、胎仔より採
取し、マイトマイシンCにより***を抑制した線維芽細
胞をフィーダー細胞として、この上に播き、内部細胞塊
を増殖させる３項に記載の胚性幹細胞の樹立法。 （５）インジェクション法またはアグリゲーション法に
よるキメラ個体作成のための１項１または２項に記載の
胚性幹細胞の使用。 （６）ＢＡＬＢ／ｃ系マウス胚を受容体としてキメラ個
体を作成する５項に記載の使用。
キメラ形成能および生殖細胞への分化能力を有する、雌
の胚性幹細胞。 （２）寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７５３４として寄託さ
れているH14-2-1 株である１項に記載の胚性幹細胞。 （３）イン・ビトロで透明帯から孵化させた胚盤胞を使
用して、胚性幹細胞株を樹立させる１項または２項に記
載の胚性幹細胞の樹立法。 （４）透明帯から孵化させた孵化胚盤胞を、胎仔より採
取し、マイトマイシンCにより***を抑制した線維芽細
胞をフィーダー細胞として、この上に播き、内部細胞塊
を増殖させる３項に記載の胚性幹細胞の樹立法。 （５）インジェクション法またはアグリゲーション法に
よるキメラ個体作成のための１項１または２項に記載の
胚性幹細胞の使用。 （６）ＢＡＬＢ／ｃ系マウス胚を受容体としてキメラ個
体を作成する５項に記載の使用。
【０００９】
【発明の実施の形態】汎用近交系C57BL マウスから樹立
され、キメラ形成能および生殖細胞への分化能力を有す
る、本発明の雌の胚性幹細胞(ES 細胞）は、桑実胚期ま
での初期胚に細胞を接着させて集合させるアグリゲーシ
ョン( 集合) 法および胚盤胞の胞胚腔内へ細胞を注入す
るインジェクション( 注入) 法によりキメラ個体を作成
するのに使用される。本発明のＥＳ細胞を使用し、ＢＡ
ＬＢ／ｃ系マウス胚を受容体(宿主胚) としてキメラ個
体を作成するとＥＳ細胞の寄与度の高いキメラ個体が得
られる。
され、キメラ形成能および生殖細胞への分化能力を有す
る、本発明の雌の胚性幹細胞(ES 細胞）は、桑実胚期ま
での初期胚に細胞を接着させて集合させるアグリゲーシ
ョン( 集合) 法および胚盤胞の胞胚腔内へ細胞を注入す
るインジェクション( 注入) 法によりキメラ個体を作成
するのに使用される。本発明のＥＳ細胞を使用し、ＢＡ
ＬＢ／ｃ系マウス胚を受容体(宿主胚) としてキメラ個
体を作成するとＥＳ細胞の寄与度の高いキメラ個体が得
られる。
【００１０】ＥＳ細胞株を樹立するには、通常胚盤胞の
内部細胞塊の細胞を使用して培養を開始する。桑実胚の
解離細胞や着床を遅らせた胚盤胞も使用できる。しかし
ながら、これらの胚細胞は、直ちに上皮様細胞等に分化
するので、ＳＴＯ細胞株やマウス胎仔から調製した初代
繊維芽細胞を使用したフィーダー細胞層の上で、適当な
細胞密度を保ちつつ，培養液を頻繁に交換しながら、細
胞の解離と継代を繰り返すことにより、未分化幹細胞の
性質を保持した細胞を維持できる。
内部細胞塊の細胞を使用して培養を開始する。桑実胚の
解離細胞や着床を遅らせた胚盤胞も使用できる。しかし
ながら、これらの胚細胞は、直ちに上皮様細胞等に分化
するので、ＳＴＯ細胞株やマウス胎仔から調製した初代
繊維芽細胞を使用したフィーダー細胞層の上で、適当な
細胞密度を保ちつつ，培養液を頻繁に交換しながら、細
胞の解離と継代を繰り返すことにより、未分化幹細胞の
性質を保持した細胞を維持できる。
【００１１】ＥＳ細胞の樹立に使用される標準的な方法
は、Ｅｖａｎｓ ｅｔ．ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、２９
２，１５４−１５６（１９８１）；Ｍａｒｔｉｎ ｅ
ｔ．ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．７８、７６３４−７６３８（１９８
１）およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｅ，Ｊ．、Ｅｍｂｒｙ
ｏ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ（胚由来幹
細胞）．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄ
（１９８７）Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓａｎｄ
Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，Ａ Ｐ
ｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ．（奇形腫細胞およ
び胚性幹細胞、実際的なアプローチ）に記載されてい
る。ＥＳ細胞の樹立には、１０％ＦＣＳ添加のウイッテ
ン培地で孵化させた胚を用いる方が、樹立効率が高い傾
向にある。したがって、本発明のＥＳ細胞は、胚盤胞を
イン・ビトロで孵化させて使用するのが好ましい。すな
わち、イン・ビボで孵化させた場合には、胚盤胞の回収
率が低下するので、Ｃ５７ＢＬ系統由来の胚盤胞は、イ
ン・ビトロで培養して、透明帯から脱出させた孵化胚盤
胞をＥＳ細胞の樹立に使用するのが好ましい。
は、Ｅｖａｎｓ ｅｔ．ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、２９
２，１５４−１５６（１９８１）；Ｍａｒｔｉｎ ｅ
ｔ．ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．７８、７６３４−７６３８（１９８
１）およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｅ，Ｊ．、Ｅｍｂｒｙ
ｏ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ（胚由来幹
細胞）．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄ
（１９８７）Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓａｎｄ
Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，Ａ Ｐ
ｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ．（奇形腫細胞およ
び胚性幹細胞、実際的なアプローチ）に記載されてい
る。ＥＳ細胞の樹立には、１０％ＦＣＳ添加のウイッテ
ン培地で孵化させた胚を用いる方が、樹立効率が高い傾
向にある。したがって、本発明のＥＳ細胞は、胚盤胞を
イン・ビトロで孵化させて使用するのが好ましい。すな
わち、イン・ビボで孵化させた場合には、胚盤胞の回収
率が低下するので、Ｃ５７ＢＬ系統由来の胚盤胞は、イ
ン・ビトロで培養して、透明帯から脱出させた孵化胚盤
胞をＥＳ細胞の樹立に使用するのが好ましい。
【００１２】本発明のＥＳ細胞は、以下のようにして作
成される。まず、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ系マウス雌１０匹に
ついて、交配後3.5 日の子宮より36個の胚盤胞を採取
し、16個の胚盤胞は採取直後にフィーダー細胞上に播
き、残りの20個についてはFCS （牛胎児血清）を10% に
なるように添加したウイッテン（Ｗｈｉｔｔｅｎ）培地
で一晩培養して透明帯から孵化させた孵化胚盤胞をフィ
ーダー細胞上に播いた。フィーダー細胞は妊娠15.5日目
の胎仔より線維芽細胞を採取し、マイトマイシンCによ
り***抑制を施して使用した。その結果、胚盤胞、孵化
胚盤胞共に全ての胚でICM （内部細胞塊）の増殖が確認
された。また、孵化胚盤胞由来ICM は胚盤胞由来のもの
に比べて増殖速度が速く、さらに大きなICM の塊を形成
して目立った分化像を示さなかったが、胚盤胞由来のIC
M の場合ICM 塊が小さな状態でも分化像を呈するものが
多く認められた。最終的に6 株の孵化胚盤胞に由来する
ES細胞株の樹立に成功した。
成される。まず、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ系マウス雌１０匹に
ついて、交配後3.5 日の子宮より36個の胚盤胞を採取
し、16個の胚盤胞は採取直後にフィーダー細胞上に播
き、残りの20個についてはFCS （牛胎児血清）を10% に
なるように添加したウイッテン（Ｗｈｉｔｔｅｎ）培地
で一晩培養して透明帯から孵化させた孵化胚盤胞をフィ
ーダー細胞上に播いた。フィーダー細胞は妊娠15.5日目
の胎仔より線維芽細胞を採取し、マイトマイシンCによ
り***抑制を施して使用した。その結果、胚盤胞、孵化
胚盤胞共に全ての胚でICM （内部細胞塊）の増殖が確認
された。また、孵化胚盤胞由来ICM は胚盤胞由来のもの
に比べて増殖速度が速く、さらに大きなICM の塊を形成
して目立った分化像を示さなかったが、胚盤胞由来のIC
M の場合ICM 塊が小さな状態でも分化像を呈するものが
多く認められた。最終的に6 株の孵化胚盤胞に由来する
ES細胞株の樹立に成功した。
【００１３】得られたＥＳ細胞株について染色体検査を
行ったところ、胚盤胞の由来にかかわらず、全てのＥＳ
細胞株において、正２倍体（４０本）の染色体を有する
ことが確認された。また、同時に実施した浮遊培養によ
るイン・ビトロでの分化試験の結果、胚様体を形成し、
培養５日目には原始外胚葉と原始内胚葉様組織を構成し
た。さらに、これら二胚葉を構成した時点で、三次元的
な浮遊培養を継続するものと二次元的に接着培養するも
のとに分けて培養を継続した。その結果、三次元的に培
養したものでは赤血球が形成され、胚葉体が赤く染ま
り、自立的に拍動する心筋細胞経の分化が確認された。
また、二次元的に培養した胚葉体はシート状に広がり、
心筋、骨格筋、神経、上皮系、血管構造を作り出すのが
観察された。このように、イン・ビトロで胚盤胞を透明
帯から脱出させることにより、高率でＣ５７ＢＬ由来の
胚からＥＳ細胞株の樹立に成功した。さらに、得られた
ＥＳ細胞を三次元的に分化誘導することにより赤血球細
胞の生成が確認された。
行ったところ、胚盤胞の由来にかかわらず、全てのＥＳ
細胞株において、正２倍体（４０本）の染色体を有する
ことが確認された。また、同時に実施した浮遊培養によ
るイン・ビトロでの分化試験の結果、胚様体を形成し、
培養５日目には原始外胚葉と原始内胚葉様組織を構成し
た。さらに、これら二胚葉を構成した時点で、三次元的
な浮遊培養を継続するものと二次元的に接着培養するも
のとに分けて培養を継続した。その結果、三次元的に培
養したものでは赤血球が形成され、胚葉体が赤く染ま
り、自立的に拍動する心筋細胞経の分化が確認された。
また、二次元的に培養した胚葉体はシート状に広がり、
心筋、骨格筋、神経、上皮系、血管構造を作り出すのが
観察された。このように、イン・ビトロで胚盤胞を透明
帯から脱出させることにより、高率でＣ５７ＢＬ由来の
胚からＥＳ細胞株の樹立に成功した。さらに、得られた
ＥＳ細胞を三次元的に分化誘導することにより赤血球細
胞の生成が確認された。
【００１４】得られた６株のうち１株についてインジェ
クション法とアグリゲーション法によりキメラマウスを
作製し、ＥＳ細胞由来の産仔を確認した。インジェクシ
ョン法とアグリゲーション法とを比較すると、インジェ
クション法は、宿主胚として宿主胚自身のＩＣＭが存在
する胚盤胞を使用するので、個体への発生率、キメラ産
仔の出現率がアグリゲーション法に比べて高い傾向にあ
る。しかし、１回に処理できる数が限られる。一方、ア
グリゲーション法の場合は、大量の胚を１回で処理でき
るので、キメラ産仔の出現率が低くても、使用する価値
がある。いずれの方法を使用するかは、ＥＳ細胞の性質
により決定される。
クション法とアグリゲーション法によりキメラマウスを
作製し、ＥＳ細胞由来の産仔を確認した。インジェクシ
ョン法とアグリゲーション法とを比較すると、インジェ
クション法は、宿主胚として宿主胚自身のＩＣＭが存在
する胚盤胞を使用するので、個体への発生率、キメラ産
仔の出現率がアグリゲーション法に比べて高い傾向にあ
る。しかし、１回に処理できる数が限られる。一方、ア
グリゲーション法の場合は、大量の胚を１回で処理でき
るので、キメラ産仔の出現率が低くても、使用する価値
がある。いずれの方法を使用するかは、ＥＳ細胞の性質
により決定される。
【００１５】
【実施例】以下の実施例により，本発明をさらに詳細に
説明するが、本発明は，その要旨を超えない限り、以下
の実施例によって制限されるものではない。
説明するが、本発明は，その要旨を超えない限り、以下
の実施例によって制限されるものではない。
【００１６】実施例１ 使用した培地の組成およびその作成法は、以下のとおり
であるＥＳ細胞培養用培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ，ＳＣＭ） ＳＣＭの組成(100ml) ８０ｍｌ ＤＭＥＭ高グルコース ２０ｍｌ ＦＣＳ １ｍｌ ２−メルカプトエタノール ストック(1) １ｍｌ 非必須アミノ酸 (Gibco Cat. No.320-1140PG) １ｍｌヌクレオシド ストック(2) (1) ２−メルカプトエタノール ストック： 10ｍl のPBS に7 μl の２−メルカプトエタノールを溶解する。 (2) ヌクレオシド ストック： アデノシン ８０ｍｇ グアノシン ８５ｍｇ シチジン ７３ｍｇ ウリジン ７３ｍｇ チミジン ２４ｍｇ を100 ｍl のmilli Q 水に添加して37℃に温めながら溶
解し、6ml ずつ分注して−20℃で保存し、添加するとき
は、37℃に温めて完全に溶解してからDMEMに加える。非
必須アミノ酸も同様にして保存して、添加する。
であるＥＳ細胞培養用培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ，ＳＣＭ） ＳＣＭの組成(100ml) ８０ｍｌ ＤＭＥＭ高グルコース ２０ｍｌ ＦＣＳ １ｍｌ ２−メルカプトエタノール ストック(1) １ｍｌ 非必須アミノ酸 (Gibco Cat. No.320-1140PG) １ｍｌヌクレオシド ストック(2) (1) ２−メルカプトエタノール ストック： 10ｍl のPBS に7 μl の２−メルカプトエタノールを溶解する。 (2) ヌクレオシド ストック： アデノシン ８０ｍｇ グアノシン ８５ｍｇ シチジン ７３ｍｇ ウリジン ７３ｍｇ チミジン ２４ｍｇ を100 ｍl のmilli Q 水に添加して37℃に温めながら溶
解し、6ml ずつ分注して−20℃で保存し、添加するとき
は、37℃に温めて完全に溶解してからDMEMに加える。非
必須アミノ酸も同様にして保存して、添加する。
【００１７】リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) １０．０ｇ ＮａＣｌ ０．２５ｇ ＫＣｌ １．４４ｇ Ｎａ2 ＨＰＯ4 ・１２Ｈ2 Ｏ ０．２５ｇ ＫＨ2 ＰＯ4 1000mlのMilli Ｑに溶解してpHを7.2 に調整し、５００
ｍｌづつに分注後オートクレーブする。
ｍｌづつに分注後オートクレーブする。
【００１８】トリプシン-EDTA (T-E) ２．５ｇ トリプシン (Porcine Sigma Cat. No. T-0646) ０．４ｇ ＥＤＴＡ ７．０ｇ ＮａＣｌ ０．３ｇ Ｎａ2 ＨＰＯ4 ・１２Ｈ2 Ｏ ０．２４ｇ ＫＨ2 ＰＯ４ ０．３７ｇ ＫＣｌ １．０ｇ D-グルコース ３．０ｇ Ｔｒｉｓ 1.0ml フェノールレッド (Gibco. 0.5%) 1000mlに溶解してpH7.6 に調整する。0.22μm フィルタ
ーで濾過滅菌後１０ｍｌづつ分注して−２０℃で保存す
る。
ーで濾過滅菌後１０ｍｌづつ分注して−２０℃で保存す
る。
【００１９】凍結培地 ＤＭＥＭ，２０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ，１０％（ｖ／ｖ）
ＤＭＳＯウイッテン（Ｗｈｉｔｔｅｎ）培地 (１００ｍｌ) ５１４ｍｇ ＮａＣｌ ３６ｍｇ ＫＣｌ １６ｍｇ ＫＨ2 ＰＯ4 ５３ｍｇ 乳酸Ｃａ−５Ｈ2 Ｏ ２９ｍｇ ＭｇＳＯ4 −７Ｈ2 Ｏ １９０ｍｇ ＮａＨＣＯ3 １００ｍｇ グルコース ０．３７ｍｌ ６０％乳酸Ｎａ ３．５ｍｇ ピルビン酸Ｎａ ３００ｍｇ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン） ８ｍｇ ペニシリン ５ｍｇ ストレプトマイシン を、１００ｍｌＭｉｌｌｉＱ水に溶解後、0.22μm フィ
ルターで濾過する。ウイッテン（Ｗｈｉｔｔｅｎ）培地
−Ｈｅｐｅｓは、上記ウイッテン培地のＮａＨＣＯ3 を
22ｍｇに減量し、代わりにＨｅｐｅｓ４７７．６ｍｇを
入れ、ＨＣｌでｐＨを７．２に調整して得られる。
ＤＭＳＯウイッテン（Ｗｈｉｔｔｅｎ）培地 (１００ｍｌ) ５１４ｍｇ ＮａＣｌ ３６ｍｇ ＫＣｌ １６ｍｇ ＫＨ2 ＰＯ4 ５３ｍｇ 乳酸Ｃａ−５Ｈ2 Ｏ ２９ｍｇ ＭｇＳＯ4 −７Ｈ2 Ｏ １９０ｍｇ ＮａＨＣＯ3 １００ｍｇ グルコース ０．３７ｍｌ ６０％乳酸Ｎａ ３．５ｍｇ ピルビン酸Ｎａ ３００ｍｇ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン） ８ｍｇ ペニシリン ５ｍｇ ストレプトマイシン を、１００ｍｌＭｉｌｌｉＱ水に溶解後、0.22μm フィ
ルターで濾過する。ウイッテン（Ｗｈｉｔｔｅｎ）培地
−Ｈｅｐｅｓは、上記ウイッテン培地のＮａＨＣＯ3 を
22ｍｇに減量し、代わりにＨｅｐｅｓ４７７．６ｍｇを
入れ、ＨＣｌでｐＨを７．２に調整して得られる。
【００２０】(1) 胚の回収 Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ系マウスの発情雌を外隠部の兆候から
１０匹選び出し、夕方（１６時〜１７時）に雄のケージ
に入れ、翌朝８匹の個体に膣栓を確認し、これを集め
た。３日後（受精から３．５日後）これらの雌個体から
子宮を取り出し、ウイッテン培地−Ｈｅｐｅｓ（Ｗｈｉ
ｔｔｅｎ Ｍｅｄｉｕｍ−Ｈｅｐｅｓ）（組成は培地組
成の項参照）で胚を洗い流した。ここで３６個の胚盤胞
を得た。
１０匹選び出し、夕方（１６時〜１７時）に雄のケージ
に入れ、翌朝８匹の個体に膣栓を確認し、これを集め
た。３日後（受精から３．５日後）これらの雌個体から
子宮を取り出し、ウイッテン培地−Ｈｅｐｅｓ（Ｗｈｉ
ｔｔｅｎ Ｍｅｄｉｕｍ−Ｈｅｐｅｓ）（組成は培地組
成の項参照）で胚を洗い流した。ここで３６個の胚盤胞
を得た。
【００２１】(2) 胚盤胞の孵化 得られた胚盤胞を６０ｍｍディッシュ中にミネラルオイ
ルで覆ったウイッテン培地−１０％ＦＣＳ ０．２ｍｌ
の小滴を作り、その小滴中で１晩培養し、透明帯から孵
化させた。
ルで覆ったウイッテン培地−１０％ＦＣＳ ０．２ｍｌ
の小滴を作り、その小滴中で１晩培養し、透明帯から孵
化させた。
【００２２】(3) 孵化胚盤胞の培養 孵化胚盤胞を、あらかじめフィーダー細胞層を形成させ
た４ウェルプレートに１個ずつ入れＳＣＭ−２０％ＦＣ
Ｓ（組成は培地組成の項参照）１ｍｌ中で培養した。フ
ィーダー細胞に栄養外胚葉（Ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ）
が接着して内部細胞塊（Ｉｎｎｅｒ C ｅｌｌ M ａｓ
ｓ；ＩＣＭ）が増殖を始めた時点（３日〜４日培養後）
で、ＩＣＭが増殖していて、かつそれが目立った分化が
認められないウェルについて、培地をＰＢＳ（培地の項
参照）1 ｍｌに置き換えた。
た４ウェルプレートに１個ずつ入れＳＣＭ−２０％ＦＣ
Ｓ（組成は培地組成の項参照）１ｍｌ中で培養した。フ
ィーダー細胞に栄養外胚葉（Ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ）
が接着して内部細胞塊（Ｉｎｎｅｒ C ｅｌｌ M ａｓ
ｓ；ＩＣＭ）が増殖を始めた時点（３日〜４日培養後）
で、ＩＣＭが増殖していて、かつそれが目立った分化が
認められないウェルについて、培地をＰＢＳ（培地の項
参照）1 ｍｌに置き換えた。
【００２３】なお、フィーダー細胞は、以下のようにし
て作成した。まず、コンフルエントの１００ｍｌディッ
シュにマイトマイシンＣを５ｍｌ添加し、２．５時間処
理して***抑制をかけ、次いで培地を除き、５ｍｌＰＢ
Ｓで５回洗浄し、ＭＭＣを完全に除く。さらに、Ｔ−Ｅ
処理により、細胞を剥がし、遠心して上清を除く。１０
ｍｌＤＭＥＭに再懸濁して、３×１０5 ／ｍｌに調節し
て１、３．５、６０ｍｍプレート当たり各々０．５、
１、２ｍｌずつ播く。なお、フィーダー細胞は、使用す
る前日までに作成する。その使用期間は、ＭＭＣ処理後
７日以内とする。
て作成した。まず、コンフルエントの１００ｍｌディッ
シュにマイトマイシンＣを５ｍｌ添加し、２．５時間処
理して***抑制をかけ、次いで培地を除き、５ｍｌＰＢ
Ｓで５回洗浄し、ＭＭＣを完全に除く。さらに、Ｔ−Ｅ
処理により、細胞を剥がし、遠心して上清を除く。１０
ｍｌＤＭＥＭに再懸濁して、３×１０5 ／ｍｌに調節し
て１、３．５、６０ｍｍプレート当たり各々０．５、
１、２ｍｌずつ播く。なお、フィーダー細胞は、使用す
る前日までに作成する。その使用期間は、ＭＭＣ処理後
７日以内とする。
【００２４】(4) ＩＣＭの分離 ＰＢＳに置き換えたウェルからＩＣＭを、ガラス毛細管
を用いて吸引し、フィーダー細胞と分離採取した。これ
をミネラルオイルで覆った２０μｌのＴ−Ｅ緩衝液（組
成は培地の項参照）中に加え、細胞がばらばらになった
ら（３分〜５分）、ＳＣＭ20μｌを添加しトリプシンの
作用を止めた。このＩＣＭを先端の直径１００〜２００
μｍのガラス毛細管（自家製）を用いて吸引、吹き出し
を繰り返すことによりＩＣＭを１０個くらいの細胞塊に
分離した。
を用いて吸引し、フィーダー細胞と分離採取した。これ
をミネラルオイルで覆った２０μｌのＴ−Ｅ緩衝液（組
成は培地の項参照）中に加え、細胞がばらばらになった
ら（３分〜５分）、ＳＣＭ20μｌを添加しトリプシンの
作用を止めた。このＩＣＭを先端の直径１００〜２００
μｍのガラス毛細管（自家製）を用いて吸引、吹き出し
を繰り返すことによりＩＣＭを１０個くらいの細胞塊に
分離した。
【００２５】
【００２６】(5) ＩＣＭの培養 上記のようにして、ばらばらにしたＩＣＭを、ＳＣＭ１
ｍｌを入れた４ウェルプレートで７日〜１０日（ウェル
によって増殖の仕方が違うので培養時間は異なった）培
養し、ＥＳ細胞様の細胞が増殖し、かつそれが目立った
分化を起こさないまま直径２００μｍ以上になったこと
を確認した。
ｍｌを入れた４ウェルプレートで７日〜１０日（ウェル
によって増殖の仕方が違うので培養時間は異なった）培
養し、ＥＳ細胞様の細胞が増殖し、かつそれが目立った
分化を起こさないまま直径２００μｍ以上になったこと
を確認した。
【００２７】(6) ＥＳ様細胞の分離 上記のようにしてＥＳ様であることを確認した細胞は、
ガラス毛細管で吸い上げ、これをミネラルオイルで覆っ
た２０μｌのＴ−Ｅ溶液（組成は培地の項参照）に加
え、細胞がばらばらになったら（３分〜５分）ＳＣＭ２
０μｌを添加してトリプシンの作用を止めた。このＥＳ
様細胞を含んだ液を１００〜２００μｍのガラス毛細管
（自家製）を用いて吸引、吹き出しを繰り返すことによ
り完全に１個の細胞に分離した。このようにしてＣ５７
ＢＬ系統から分離された雌のＥＳ細胞Ｈ１４−２−１株
は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄
託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７５３４として寄託されている
（寄託日: 平成１１年８月２６日）。
ガラス毛細管で吸い上げ、これをミネラルオイルで覆っ
た２０μｌのＴ−Ｅ溶液（組成は培地の項参照）に加
え、細胞がばらばらになったら（３分〜５分）ＳＣＭ２
０μｌを添加してトリプシンの作用を止めた。このＥＳ
様細胞を含んだ液を１００〜２００μｍのガラス毛細管
（自家製）を用いて吸引、吹き出しを繰り返すことによ
り完全に１個の細胞に分離した。このようにしてＣ５７
ＢＬ系統から分離された雌のＥＳ細胞Ｈ１４−２−１株
は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄
託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７５３４として寄託されている
（寄託日: 平成１１年８月２６日）。
【００２８】(7) ＥＳ細胞の凍結、融解 ６０ｍｍのディッシュにコンフルエントに増殖した上記
のES細胞をT-E 溶液で剥して1500r.p.m で 5分間、遠心
して細胞を集め、冷やしておいた凍結培地（Freezing m
edium ） 1mlに懸濁して1.8ml クライオチューブに入
れ、凍結ボックス（freezing box）に納めて-80 ℃に一
晩、その後液体窒素中で保存する。凍結したＥＳ細胞は
使用する都度融解する。凍結バイアル（Freezing vial
）を30℃の微温湯で融解し、10mlのDMEMに懸濁して150
0r.p.m で 5分間遠心して細胞を集め、これをSCM4mlに
再懸濁して60mmディッシュ中でコンフルエントになるま
で培養する。
のES細胞をT-E 溶液で剥して1500r.p.m で 5分間、遠心
して細胞を集め、冷やしておいた凍結培地（Freezing m
edium ） 1mlに懸濁して1.8ml クライオチューブに入
れ、凍結ボックス（freezing box）に納めて-80 ℃に一
晩、その後液体窒素中で保存する。凍結したＥＳ細胞は
使用する都度融解する。凍結バイアル（Freezing vial
）を30℃の微温湯で融解し、10mlのDMEMに懸濁して150
0r.p.m で 5分間遠心して細胞を集め、これをSCM4mlに
再懸濁して60mmディッシュ中でコンフルエントになるま
で培養する。
【００２９】(8) ＥＳ細胞の培養 凍結しておいたＥＳ細胞を融解し、６０ｍｍのフィーダ
ー細胞層の存在するディッシュにまき、細胞がコンフル
エントになったディッシュはＳＣＭを捨て、５ｍｌのＰ
ＢＳで洗い、１ｍｌのＴ−Ｅ溶液で２〜３分処理した。
Ｔ−Ｅ溶液で処理したディッシュに１ｍｌのＳＣＭを加
えトリプシンの反応を中和し、先端を炎で焼いて滑らか
にしたパスツールピペットで単一の細胞になるまでピペ
ッティングした。次に１５００ｒｐｍで遠心して細胞を
集め、５〜１０ｍｌのＳＣＭに再懸濁して５〜１０枚の
フィーダー細胞層の存在するディッシュにまきかえる。
このようなな継代作業を繰り返して未分化状態を維持し
たまま培養できることを確認した。
ー細胞層の存在するディッシュにまき、細胞がコンフル
エントになったディッシュはＳＣＭを捨て、５ｍｌのＰ
ＢＳで洗い、１ｍｌのＴ−Ｅ溶液で２〜３分処理した。
Ｔ−Ｅ溶液で処理したディッシュに１ｍｌのＳＣＭを加
えトリプシンの反応を中和し、先端を炎で焼いて滑らか
にしたパスツールピペットで単一の細胞になるまでピペ
ッティングした。次に１５００ｒｐｍで遠心して細胞を
集め、５〜１０ｍｌのＳＣＭに再懸濁して５〜１０枚の
フィーダー細胞層の存在するディッシュにまきかえる。
このようなな継代作業を繰り返して未分化状態を維持し
たまま培養できることを確認した。
【００３０】なお、ＥＳ細胞は、非常に良く増殖する細
胞なので、培地交換を毎日行う必要があり、ｐＨを酸性
にしたままにすると分化する。また、ＥＳ細胞は、凝集
が分化シグナルになるので、継代のときに完全に単一に
する最初の段階では、ピペッティング後顕微鏡で凝集を
確認するのが好ましい。さらに、継代のときの細胞数を
一定にしないと分化が起こる。
胞なので、培地交換を毎日行う必要があり、ｐＨを酸性
にしたままにすると分化する。また、ＥＳ細胞は、凝集
が分化シグナルになるので、継代のときに完全に単一に
する最初の段階では、ピペッティング後顕微鏡で凝集を
確認するのが好ましい。さらに、継代のときの細胞数を
一定にしないと分化が起こる。
【００３１】(9) キメラマウスの作出（注入法；インジ
ェクション法） 標準的な方法は、文献（Robertson,E.J.,Embryo-derive
d stem cells.,IRL Press Ltd,Oxford(1987) Teraroca
rcinomas and Embryonic Stem Cells, A Prectical App
roach.）に記載されており、以下に記載の方法はこれに
則して行った。
ェクション法） 標準的な方法は、文献（Robertson,E.J.,Embryo-derive
d stem cells.,IRL Press Ltd,Oxford(1987) Teraroca
rcinomas and Embryonic Stem Cells, A Prectical App
roach.）に記載されており、以下に記載の方法はこれに
則して行った。
【００３２】インジェクションピペット（Ｄｒｕｍｍｏ
ｎｄ社製；１００ ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ ｍｉｃｒｏ
−ｐｉｐｅｔ）に１０個〜１５個のＥＳ細胞を吸引し、
そのインジェクションピペットを差込んで、６〜１２週
齢のＢＡＬＢ／Ｃ系雌マウスから得た胚盤胞の胞胚腔内
にＥＳ細胞を注入した。ＥＳ細胞の注入は２３個の胚盤
胞について行い、それらの胚盤胞を６０ｍｍディッシュ
中にミネラルオイルで覆ったウイッテン培地−２０％Ｆ
ＣＳ ０．２ｍｌの小滴を作り、その小滴中で１時間培
養し、再び胞胚腔を形成させた。この胚を１１〜１２個
ずつ、偽妊娠２．５日目のＩＣＲ系マウス、計２匹の受
容雌子宮角に移植した。
ｎｄ社製；１００ ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ ｍｉｃｒｏ
−ｐｉｐｅｔ）に１０個〜１５個のＥＳ細胞を吸引し、
そのインジェクションピペットを差込んで、６〜１２週
齢のＢＡＬＢ／Ｃ系雌マウスから得た胚盤胞の胞胚腔内
にＥＳ細胞を注入した。ＥＳ細胞の注入は２３個の胚盤
胞について行い、それらの胚盤胞を６０ｍｍディッシュ
中にミネラルオイルで覆ったウイッテン培地−２０％Ｆ
ＣＳ ０．２ｍｌの小滴を作り、その小滴中で１時間培
養し、再び胞胚腔を形成させた。この胚を１１〜１２個
ずつ、偽妊娠２．５日目のＩＣＲ系マウス、計２匹の受
容雌子宮角に移植した。
【００３３】(10)キメラマウスの作出（集合法；アグリ
ゲーション法） 標準的な方法は文献（Nagy, A. and Rossant, J.(199
3) Production of completely ES cell-derived fetus
es.In Gene Targeting: A Practical Approach(ed.A.L.
Joyner).IRL Press, Oxford）に記載されており、以下
に記載の方法はこれに則して行った。
ゲーション法） 標準的な方法は文献（Nagy, A. and Rossant, J.(199
3) Production of completely ES cell-derived fetus
es.In Gene Targeting: A Practical Approach(ed.A.L.
Joyner).IRL Press, Oxford）に記載されており、以下
に記載の方法はこれに則して行った。
【００３４】６０ｍｍディッシュにダーニングニードル
（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＤＮ−０９；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｌｔｄ．
製）を用いてくぼみを作製した。このくぼみにＥＳ細胞
１〜２０個を入れ、その上にかぶさるようにＩＣＲ、Ｂ
ＡＬＢ／ｃ系雌マウスから採取し、あらかじめ酸性タイ
ロード溶液（Sigma 社 Cad.No.T1788）で透明体を除去
した後、ウイッテン培地＋１０％ＦＣＳでｐＨを中和し
た８細胞期胚１個を入れた。これを１晩培養し、胞胚腔
が開き始めたところでＩＣＲ系偽妊娠２．５日雌マウス
合計１２匹の子宮角に移植した。
（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＤＮ−０９；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｌｔｄ．
製）を用いてくぼみを作製した。このくぼみにＥＳ細胞
１〜２０個を入れ、その上にかぶさるようにＩＣＲ、Ｂ
ＡＬＢ／ｃ系雌マウスから採取し、あらかじめ酸性タイ
ロード溶液（Sigma 社 Cad.No.T1788）で透明体を除去
した後、ウイッテン培地＋１０％ＦＣＳでｐＨを中和し
た８細胞期胚１個を入れた。これを１晩培養し、胞胚腔
が開き始めたところでＩＣＲ系偽妊娠２．５日雌マウス
合計１２匹の子宮角に移植した。
【００３５】(11)ＥＳ細胞の生殖細胞への分化の確認 (9)(10) で作製したキメラマウスを、ＢＡＬＢ／ｃ系マ
ウス（アルビノ様）と交配し、その産仔を生後３週間目
で毛色の表現型を観察した。アルビノの個体は受容胚由
来の産仔で、有色の個体はＥＳ細胞由来の産仔である。
最終的な結果を以下の表１に示した。
ウス（アルビノ様）と交配し、その産仔を生後３週間目
で毛色の表現型を観察した。アルビノの個体は受容胚由
来の産仔で、有色の個体はＥＳ細胞由来の産仔である。
最終的な結果を以下の表１に示した。
【００３６】
【表１】
【００３７】
【発明の効果】透明帯から孵化させた、汎用近交系であ
るＣ５７ＢＬ／６Ｎ系マウスの孵化胚盤胞を、マイトマ
イシンＣにより***抑制したフィーダー細胞で培養し、
次いで増殖したＩＣＭを培養して得られるＥＳ細胞は、
キメラ形成能および生殖細胞系への分化能力を有し、雌
特異的な遺伝子改変実験あるいは免疫抑制剤の障害を排
除した組織移植実験に使用できる。本発明のＥＳ細胞
は、インジェクション法及びアグリゲーション法による
２種類のキメラ作出法のどちらを使用してもキメラ個体
が得られる。また、ＢＡＬＢ／ｃ系マウス胚を受容体と
してキメラ個体を作成すると、ＥＳ細胞の寄与度の高い
キメラ個体が得られる。
るＣ５７ＢＬ／６Ｎ系マウスの孵化胚盤胞を、マイトマ
イシンＣにより***抑制したフィーダー細胞で培養し、
次いで増殖したＩＣＭを培養して得られるＥＳ細胞は、
キメラ形成能および生殖細胞系への分化能力を有し、雌
特異的な遺伝子改変実験あるいは免疫抑制剤の障害を排
除した組織移植実験に使用できる。本発明のＥＳ細胞
は、インジェクション法及びアグリゲーション法による
２種類のキメラ作出法のどちらを使用してもキメラ個体
が得られる。また、ＢＡＬＢ／ｃ系マウス胚を受容体と
してキメラ個体を作成すると、ＥＳ細胞の寄与度の高い
キメラ個体が得られる。
Claims (6)
- 【請求項１】 汎用近交系Ｃ５７ＢＬマウス系統から分
離され、キメラ形成能および生殖細胞への分化能力を有
する、雌の胚性幹細胞。 - 【請求項２】 寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７５３４とし
て寄託されているH14-2-1 株である請求項１に記載の胚
性幹細胞。 - 【請求項３】 イン・ビトロで透明帯から孵化させた胚
盤胞を使用して、胚性幹細胞株を樹立させることを特徴
とする請求項１または２に記載の胚性幹細胞の樹立法。 - 【請求項４】 透明帯から孵化させた孵化胚盤胞を、胎
仔より採取し、マイトマイシンC により***を抑制した
線維芽細胞をフィーダー細胞として、この上に播き、内
部細胞塊を増殖させることを特徴とする請求項３に記載
の胚性幹細胞の樹立法。 - 【請求項５】 インジェクション法またはアグリゲーシ
ョン法によるキメラ個体作成のための請求項１または２
に記載の胚性幹細胞の使用。 - 【請求項６】 ＢＡＬＢ／ｃ系マウス胚を受容体として
キメラ個体を作成する請求項５に記載の使用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24276399A JP2001061470A (ja) | 1999-08-30 | 1999-08-30 | マウス胚性幹細胞 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24276399A JP2001061470A (ja) | 1999-08-30 | 1999-08-30 | マウス胚性幹細胞 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001061470A true JP2001061470A (ja) | 2001-03-13 |
Family
ID=17093923
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24276399A Pending JP2001061470A (ja) | 1999-08-30 | 1999-08-30 | マウス胚性幹細胞 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001061470A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005090557A1 (ja) * | 2004-03-23 | 2005-09-29 | Daiichi Asubio Pharma Co., Ltd. | 多能性幹細胞の増殖方法 |
| JP2007503204A (ja) * | 2003-08-22 | 2007-02-22 | ザ ジャクソン ラボラトリー | 近交系動物の遺伝的安定性を維持するための方法 |
| WO2008026548A1 (fr) * | 2006-08-28 | 2008-03-06 | Matsumoto Dental University | Procédé d'inhibition du développement de tératome |
| JP2013094098A (ja) * | 2011-10-31 | 2013-05-20 | Michiyo Tsuru | 平行線維性結合組織の製造方法 |
| US9453242B2 (en) | 2010-09-13 | 2016-09-27 | National Univeristy Corporation Kumamoto University | Method and culture medium for preparing mammalian ovum or embryo in which zona pellucida has been thinned or eliminated, and method for fertilization using mammalian ovum prepared by same method |
| CN115466718A (zh) * | 2022-08-09 | 2022-12-13 | 广州明迅生物科技有限责任公司 | 雌性胚胎干细胞及其制备方法和应用 |
-
1999
- 1999-08-30 JP JP24276399A patent/JP2001061470A/ja active Pending
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007503204A (ja) * | 2003-08-22 | 2007-02-22 | ザ ジャクソン ラボラトリー | 近交系動物の遺伝的安定性を維持するための方法 |
| JP2012105688A (ja) * | 2003-08-22 | 2012-06-07 | Jackson Lab | 近交系動物の遺伝的安定性を維持するための方法 |
| WO2005090557A1 (ja) * | 2004-03-23 | 2005-09-29 | Daiichi Asubio Pharma Co., Ltd. | 多能性幹細胞の増殖方法 |
| JPWO2005090557A1 (ja) * | 2004-03-23 | 2008-02-07 | 敏宏 赤池 | 多能性幹細胞の増殖方法 |
| US7892835B2 (en) | 2004-03-23 | 2011-02-22 | Daiichi Sankyo Company, Limited | Pluripotent stem cell growing method |
| JP4688793B2 (ja) * | 2004-03-23 | 2011-05-25 | 敏宏 赤池 | 多能性幹細胞の増殖方法 |
| WO2008026548A1 (fr) * | 2006-08-28 | 2008-03-06 | Matsumoto Dental University | Procédé d'inhibition du développement de tératome |
| US9453242B2 (en) | 2010-09-13 | 2016-09-27 | National Univeristy Corporation Kumamoto University | Method and culture medium for preparing mammalian ovum or embryo in which zona pellucida has been thinned or eliminated, and method for fertilization using mammalian ovum prepared by same method |
| US9994868B2 (en) | 2010-09-13 | 2018-06-12 | National University Corporation Kumamoto University | Method and culture medium for preparing mammalian ovum or embryo in which zona pellucida has been thinned or eliminated, and method for fertilization using mammalian ovum prepared by same method |
| JP2013094098A (ja) * | 2011-10-31 | 2013-05-20 | Michiyo Tsuru | 平行線維性結合組織の製造方法 |
| CN115466718A (zh) * | 2022-08-09 | 2022-12-13 | 广州明迅生物科技有限责任公司 | 雌性胚胎干细胞及其制备方法和应用 |
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