JP4639904B2 - 蛍光活性を有するルシフェラーゼの活性増強方法 - Google Patents
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Description
Inouye,S.(2004)FEBS Lett.105-110.
式中、
R1は、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のアリールアルキル基、または脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルキル基であり、 R2は、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のアリールアルキル基、置換または非置換のアリールアルケニル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルキル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルケニル基、複素環式基であり、R3は、水素原子、置換または非置換のアルキル基であり、X1は、水素原子、水酸基、ハロゲン原子、アルコキシル基またはアミノ基であり、X2は、水素原子または水酸基であり、Yは1〜4個の炭素原子を有する2価の炭化水素基である。
式中、
R1は、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のアリールアルキル基、または脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルキル基であり、R2は、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のアリールアルキル基、置換または非置換のアリールアルケニル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルキル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルケニル基、複素環式基であり、R3は、水素原子、置換または非置換のアルキル基であり、X1は、水素原子、水酸基、ハロゲン原子、アルコキシル基またはアミノ基であり、X2は、水素原子または水酸基であり、Yは1〜4個の炭素原子を有する2価の炭化水素基である。
1.蛍光活性を有するルシフェラーゼ(BFP−aq)の構成および構造
本発明に用いる化学発光活性を有する蛍光活性を有するルシフェラーゼ(BFP−aqは、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質、セレンテラミドまたはその類縁化合物、およびカルシウムイオンまたはカルシウムイオンと置換可能な2価もしくは3価のイオンより構成されており、好ましくはアポ蛋白質とセレンテラミドまたはその類縁化合物のBFP−aq中の分子数の比は1:1であり、アポ蛋白質とカルシウムイオンまたはカルシウムイオンと置換可能な2価もしくは3価のイオンのBFP−aq中の分子数の比は1:1〜4である。より好ましくは、アポ蛋白質とカルシウムイオンまたはカルシウムイオンと置換可能な2価もしくは3価のイオンの分子数の比は1:2〜3、さらに好ましくは1:3である。このBFP−aq内で、セレンテラミドまたはその類縁化合物は、アポ蛋白質の内部に配位しており、カルシウムイオンは主としてアポ蛋白質のEFハンドに結合している。
このBFP−aqは、他のルシフェラーゼと比較して熱安定性に優れているので、従来ルシフェラーゼを用いることができなかった分野にも応用が可能である。
BFP−aqは、カルシウム結合型発光蛋白質とカルシウムイオンまたはカルシウムイオンと置換可能な2価もしくは3価のイオンを、極めて緩やかな(反応速度が極めて遅い)条件で反応させることにより製造できる。ここで、緩やかに反応させるとは、カルシウム結合型発光蛋白質とカルシウムイオン等のイオンが反応した後に、セレンテラミドまたはその類縁化合物がアポ蛋白質に配位したまま残り、かつ新たなS-S結合が実質上生成しないような条件で反応させることを意味する。
BFP−aqを構成するアポ蛋白質として、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質が用いられる。ここでいうカルシウム結合型発光蛋白質とは、カルシウムイオンまたはそれと同等な2価または3価のイオンと反応して発光する蛋白質を指す。例えば、イクオリン、クライチン、オベリン、マイトロコミン、ミネオプシンおよびベルボインを挙げることができる。これらは、天然から採取したものであっても、遺伝子工学的に製造したものであってよい。さらに、上記の発光活性を有すれば、そのアミノ酸配列を天然のものから遺伝子組換え技術によって変異させたものであってもよい。
セレンテラミドまたはその類縁化合物は、式(1)または式(2)で示される。
式中、
R1は、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のアリールアルキル基、または脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルキル基である。好ましくは、非置換のアリール基、非置換のアリールアルキル基、水酸基もしくはハロゲン原子で置換されたアリールアルキル基、またはシクロヘキシル基で置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルキル基である。さらに好ましくは、フェニル基、ベンジル基、p−ヒドロキシベンジル基、p−フルオロベンジル基、p−クロロベンジル基、p−ブロモベンジル基、p−ヨードベンジル基、3,4−ジフルオロベンジル基、ペンタフルオロベンジル基、フェニルエチル基、フェニルプロピル基、ナフチルメチル基、シクロヘキシルメチル基、メチル基、1−メチルプロピル基または2−メチルプロピル基である。
R2は、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のアリールアルキル基、置換または非置換のアリールアルケニル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルキル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルケニル基、複素環式基である。好ましくは、非置換のアリール基、水酸基で置換されたアリール基、非置換のアリールアルキル基、水酸基で置換されたアリールアルキル基、非置換のアリールアルケニル基、非置換の直鎖または分枝鎖のアルキル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖のアルキル基、分枝鎖のアルケニル基、硫黄を含む複素環式基である。さらに好ましくは、フェニル基、p−ヒドロキシフェニル基、ベンジル基、α−ヒドロキシベンジル基、フェニルエチル基、フェニルビニル基、シクロヘキシル基、シクロヘキシルメチル基、シクロヘキシルエチル基、メチル基、エチル基、プロピル基、2−メチルプロピル基、2−メチルプロぺニル基、アダマンチルメチル基、シクロペンチルメチル基またはチオフェン−2−イル基である。
R3は、水素原子、置換または非置換のアルキル基である。好ましくは、水素原子、メチル基または2−ヒドロキシエチル基である。
X1は、水素原子、水酸基、ハロゲン原子、アルコキシル基またはアミノ基であり、特に好ましくは水素原子、水酸基、フッ素原子、メトキシ基またはアミノ基である。
X2は、水素原子または水酸基である。
Yは1〜4個の炭素原子を有する2価の炭化水素基であり、好ましくはメチレン基、エチレン基、プロピレン基またはビニレン基である。
セレンテラジンまたはその類縁化合物は、下記式(3)または式(4)で表される。
式中のR1、R2、R3、X1、X2およびYは、式(1)および式(2)と同じである。
BFP−aqに結合する金属イオンは、カルシウムイオンまたはカルシウムイオンと置換可能な2価もしくは3価のイオンである。ここで、カルシウムイオンと置換可能なイオンとは、カルシウムイオンに代えてイクオリンなどのカルシウム結合型発光蛋白質と反応させた場合に、発光反応を起こすイオンのことである。つまり、カルシウム結合型発光蛋白質に対して、カルシウムイオンと同等の作用をするものである。例えば、マグネシウムイオン(Mg2+)、ストロンチウムイオン(Sr2+)、バリウムイオン(Ba2+)、鉛イオン(Pb2+)、コバルトイオン(Co2+)、ニッケルイオン(Ni2+)、カドミウムイオン(Cd2+)、イットリウムイオン(Y3+)、ランタンイオン(La3+)、サマリウムイオン(Sm3+)、ユウロピウムイオン(Eu3+)、ジスプロシウムイオン(Dy3+)、ツリウムイオン(Tm3+)、イットリビウムイオン(Yb3+)を挙げることができる。これらのうち、2価の金属イオンが好ましい。より好ましくは遷移金属以外の2価の金属イオン、例えばCa2+、Sr2+、Pb2+である。
また、これらのイオンは少なくとも1個が、いわゆるカルシウム結合型発光蛋白質のEFハンドに結合していればよいが、2個以上、特に3個のこれらのイオンが結合しているのが好ましい。
以上のように調整した蛍光活性を有するルシフェラーゼ(BFP−aq)に対し、天然型のセレンテラジンを発光基質とした発光反応を行う。この反応において、セレンテラジンのイミダゾピラジノン骨格における−NH−プロトンを引き抜くための化合物、すなわちプロトンのアクセプターになりうる化合物を発光増強剤として添加する。
組換えアポイクオリンを得るために、アポイクオリン遺伝子を有するpAQ440(特開昭61−135586号公報)から構築されたアポイクオリン遺伝子発現ベクターpiP−HE(特開平1−132397号公報)を用いた。このベクターにコードされた組換えアポイクオリンのN−末端は、Ala−Asn−Ser−より始まる191個のアミノ酸より構成されている(配列表1のN−末端のValがAla−Asn−Ser−で置換されたもの)。
実施例1記載の精製イクオリンを、10mM Tris−HCl(pH7.6)、2mM EDTA、1.2M 硫酸アンモニウムを含む緩衝液に溶解し、イクオリン濃度が8mg/mlのイクオリン溶液を調製した。
ウミシイタケルシフェラーゼはウミシイタケ(Renilla reniformis)に由来する単量体の発光酵素(36kDa)で、基質であるセレンテラジンの酸化を触媒し光を発生させるが、ここでは、蛍光活性を有さないルシフェラーゼの一例として、コントロール(対照実験)に用いた。
pH7.6の50mM Tris−HCl緩衝液(200μl)を25℃に保温後、エタノールに溶解した基質セレンテラジン(1μg/μl)を加え、ウミシイタケルシフェラーゼ(1.2μg)を添加することにより発光反応を開始させた。発光測定装置Luminescencer−PSN AB2200(アトー社製)で60秒間発光活性の測定を行い、発光活性の最大値(Imax)で示した。
各々pH5.0〜10.5の50mM Tris−HCl緩衝液(200μ1)を25℃に保温後、基質セレンテラジン(1μg)を加え、BFP−aq(1.2μg)を添加し反応を開始させ、発光測定装置Luminescencer−PSN AB2200(アトー社製)で60秒間発光活性の測定を行った。50mM Tris−HCl(pH8.0)中でのBFP−aqの発光活性の最大値(Imax)を100%とし、各pHでの相対発光活性値を図1に示した。
表3に示した種々の市販有機化合物をそれぞれ含む50mM Tris−HCl(pH8.0)溶液を調整し、25℃に保温した。この化合物を含む溶液(200μl)に、基質セレンテラジン(1μg)を加え、さらにBFP−aq(1.2μg)添加し撹拌後、発光測定装置Luminescencer−PSN AB2200(アトー社製)で60秒間発光活性の測定を行った。50mM Tris−HCl(pH8.0)中でのBFP−aqの発光活性の最大値(Imax)を100%とし、相対発光活性値を表4に示した。また各有機化合物の構造式を図2に示す。
イミダゾールをそれぞれの濃度(0.1,0.3,1,3,10,30,60,100,150,200,250,300,400,500,600,700,800,900,1000mM)を含む50mM Tris−HCl(pH8.0)を調整し、25℃に保った。イミダゾールを含む溶液(200μl)に、基質セレンテラジン(1μg)を加え、さらにBFP−aq(1.2μg)添加し撹拌後、発光測定装置Luminescencer−PSN AB2200(アトー社製)で60秒間発光活性の測定を行った。50mM Tris−HCl(pH8.0)中でのBFP−aqの発光活性の最大値(Imax)を100%とし、イミダゾール濃度と発光活性の関係を図5に示した。対象実験として、セレンテラジンを発光基質とするウミシイタケルシフェラーゼを用いて同様の実験を行った。その結果、ウミシイタケルシフェラーゼではイミダゾールの濃度が高くなるにつれ発光活性が著しく阻害されるが、BFP−aqの発光活性はイミダゾール30mM〜250mMにおいて促進されることが判明した。特に150mM イミダゾールを添加することで、イミダゾールを添加しない系の2倍以上の発光活性を得ることができた。すなわち、イミダゾール添加による発光活性の増強効果は、BFP−aqに特異的な効果であることが明らかとなった。
150mM イミダゾールを含む50mM Tris−HCl(pH8.0)を調整し、25℃に保った。この溶液を5本の容器に200μlずつ入れ、基質セレンテラジン(CTZ)及びそのアナログ4種(h−CTZ,cp−CTZ,hcp−CTZ,f−CTZ)1μgをそれぞれに加え、さらにBFP−aq(1.2μg)添加し撹拌後、発光測定装置Luminescencer−PSN AB2200(アトー社製)で60秒間発光活性の測定を行った。50mM Tris−HCl(pH8.0)中で基質をセレンテラジンとしたBFP−aqの発光活性の最大値(Imax)および初速を100%とし、イミダゾール添加の有無による発光活性の影響を調べた。
150mM イミダゾールを含む50mM Tris−HCl(pH8.0)200μlに、基質セレンテラジンの最終濃度を1.2〜11.8μM範囲内で、各濃度のセレンテラジンを添加し25℃で保温後、BFP−aqを1.2μg添加し撹拌後、発光測定装置Luminescencer−PSN AB2200(アトー社製)で60秒間発光活性の測定を行った。発光反応3秒での発光活性を初速値として、ラインウェーバーバーグプロット法でKm値を決定した。
Claims (13)
- アポ蛋白質を有し、該アポ蛋白質の内部にセレンテラミドあるいはその類縁化合物が配位した、蛍光活性を有するルシフェラーゼの発光増強法であって、該蛍光活性を有するルシフェラーゼ溶液に対し、該ルシフェラーゼの発光基質であるセレンテラジンあるいはその類縁化合物、及び該セレンテラジンあるいはその類縁化合物におけるイミダゾピラジン骨格のピラジン環のNHプロトン引き抜き効果のある化合物としてイミダゾールを添加することを特徴とする発光増強法。
- 前記ルシフェラーゼが、カルシウム結合型発光蛋白質のアポ蛋白質とセレンテラミドまたはその類縁化合物およびカルシウムイオンまたはカルシウムイオンと置換可能な2価もしくは3価のイオンからなり、前記ルシフェラーゼ分子内における、該アポ蛋白質と該セレンテラミドまたはその類縁化合物の分子数比が1:1であり、該アポ蛋白質とカルシウムイオンまたはカルシウムイオンと置換可能な2価または3価のイオンの分子数比が1:1〜4である、ことを特徴とする請求項1に記載の発光増強法。
- 前記アポ蛋白質が、アポイクオリン、アポクライチン、アポオベリン、アポマイトロコミン、アポミネオプシンおよびアポベルボインからなる群から選ばれる少なくとも1種であることを特徴とする請求項1または2に記載の発光増強法。
- 前記蛍光活性を有するルシフェラーゼが、配列番号1〜4で表されるアミノ酸配列を有するアポ蛋白質または配列番号1〜4で表されるアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された変異体アポ蛋白質を含有することを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の発光増強法。
- 前記セレンテラミドあるいはその類縁化合物が下記式(1)または式(2)で表されることを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の発光増強法。
式中、
R1は、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のアリールアルキル基、または脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルキル基であり、 R2は、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のアリールアルキル基、置換または非置換のアリールアルケニル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルキル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルケニル基、複素環式基であり、R3は、水素原子、置換または非置換のアルキル基であり、X1は、水素原子、水酸基、ハロゲン原子、アルコキシル基またはアミノ基であり、X2は、水素原子または水酸基であり、Yは1〜4個の炭素原子を有する2価の炭化水素基である。 - 前記式(1)または前記式(2)において、R1が非置換のアリール基、非置換のアリールアルキル基、水酸基またはハロゲン原子で置換されたアリールアルキル基、またはシクロヘキシル基で置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルキル基であり、R2が非置換のアリール基、水酸基で置換されたアリール基、非置換のアリールアルキル基、水酸基で置換されたアリールアルキル基、非置換のアリールアルケニル基、非置換の直鎖または分枝鎖のアルキル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖のアルキル基、分枝鎖のアルケニル基、硫黄を含む複素環式基であり、R3は、水素原子、メチル基または2−ヒドロキシエチル基であり、X1は、水素原子、水酸基、フッ素原子、メトキシ基またはアミノ基であり、Yはメチレン基、エチレン基、プロピレン基またはビニレン基である請求項5に記載の発光増強法。
- 前記式(1)または前記式(2)において、R1がフェニル基、ベンジル基、p−ヒドロキシベンジル基、p−フルオロベンジル基、p−クロロベンジル基、p−ブロモベンジル基、p−ヨードベンジル基、3,4−ジフルオロベンジル基、ペンタフルオロベンジル基、フェニルエチル基、フェニルプロピル基、ナフチルメチル基、シクロヘキシルメチル基、メチル基、1−メチルプロピル基または2−メチルプロピル基であり、R2がフェニル基、p−ヒドロキシフェニル基、ベンジル基、α−ヒドロキシベンジル基、フェニルエチル基、フェニルビニル基、シクロヘキシル基、シクロヘキシルメチル基、シクロヘキシルエチル基、メチル基、エチル基、プロピル基、2−メチルプロピル基、2−メチルプロぺニル基、アダマンチルメチル基、シクロペンチルメチル基またはチオフェン−2−イル基であることを特徴とする請求項6に記載の発光増強法。
- 前記セレンテラジンあるいはその類縁化合物が下記式(3)または式(4)で表されることを特徴とする請求項1〜7のいずれかに記載の発光増強法。
式中、
R1は、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のアリールアルキル基、または脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルキル基であり、R2は、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のアリールアルキル基、置換または非置換のアリールアルケニル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルキル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルケニル基、複素環式基であり、R3は、水素原子、置換または非置換のアルキル基であり、X1は、水素原子、水酸基、ハロゲン原子、アルコキシル基またはアミノ基であり、X2は、水素原子または水酸基であり、Yは1〜4個の炭素原子を有する2価の炭化水素基である。 - 前記式(3)または前記式(4)において、R1が非置換のアリール基、非置換のアリールアルキル基、水酸基またはハロゲン原子で置換されたアリールアルキル基、またはシクロヘキシル基で置換されていてもよい直鎖または分枝鎖のアルキル基であり、R2が非置換のアリール基、水酸基で置換されたアリール基、非置換のアリールアルキル基、水酸基で置換されたアリールアルキル基、非置換のアリールアルケニル基、非置換の直鎖または分枝鎖のアルキル基、脂肪族環式基によって置換されていてもよい直鎖のアルキル基、分枝鎖のアルケニル基、硫黄を含む複素環式基であり、R3は、水素原子、メチル基または2−ヒドロキシエチル基であり、X1は、水素原子、水酸基、フッ素原子、メトキシ基またはアミノ基であり、Yはメチレン基、エチレン基、プロピレン基またはビニレン基であることを特徴とする請求項8に記載の発光増強法。
- 前記式(3)または前記式(4)において、R1がフェニル基、ベンジル基、p−ヒドロキシベンジル基、p−フルオロベンジル基、p−クロロベンジル基、p−ブロモベンジル基、P−ヨードベンジル基、3,4−ジフルオロベンジル基、ペンタフルオロベンジル基、フェニルエチル基、フェニルプロピル基、ナフチルメチル基、シクロヘキシルメチル基、メチル基、1−メチルプロピル基または2−メチルプロピル基であり、R2がフェニル基、p−ヒドロキシフェニル基、ベンジル基、α−ヒドロキシベンジル基、フェニルエチル基、フェニルビニル基、シクロヘキシル基、シクロヘキシルメチル基、シクロヘキシルエチル基、メチル基、エチル基、プロピル基、2−メチルプロピル基、2−メチルプロペニル基、アダマンチルメチル基、シクロペンチルメチル基またはチオフェン−2−イル基であることを特徴とする請求項9に記載の発光増強法。
- 前記セレンテラジンの類縁化合物が、h−セレンテラジン、f−セレンテラジン、cp−セレンテラジン、hcp−セレンテラジンから選ばれる少なくとも1種である請求項1〜7のいずれかに記載の発光増強法。
- セレンテラジンあるいはその類縁化合物を発光基質として、アポ蛋白質を有し、該アポ蛋白質の内部にセレンテラミドあるいはその類縁化合物が配位した、蛍光活性を有するルシフェラーゼが放射する発光を増強させる発光増強剤であって、該セレンテラジンあるいはその類縁化合物におけるイミダゾピラジン骨格のピラジン環のNHプロトン引き抜き効果のある化合物としてイミダゾールを含有することを特徴とする発光増強剤。
- アポ蛋白質を有し、該アポ蛋白質の内部にセレンテラミドあるいはその類縁化合物が配位した、蛍光活性を有するルシフェラーゼ、発光基質であるセレンテラジンあるいはその類縁化合物、前記ルシフェラーゼの発光を増強させ得る発光増強剤を含むキットであって、前記発光増強剤は、前記セレンテラジンあるいはその類縁化合物におけるイミダゾピラジン骨格のピラジン環のNHプロトン引き抜き効果のある化合物であるイミダゾールを含有することを特徴とするキット。
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