JP2592623B2 - アポエクオリンの製造法 - Google Patents
アポエクオリンの製造法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 ［技術分野］ 本発明は組換えDNAの手法を用いるカルシュウム受容
発光蛋白エクオリンの蛋白部分（アポエクオリン）の菌
体外での培養に関する製造法及び該培養の濾液からアポ
エクオリン精製法に関する。
発光蛋白エクオリンの蛋白部分（アポエクオリン）の菌
体外での培養に関する製造法及び該培養の濾液からアポ
エクオリン精製法に関する。
［従来の技術とその問題点］ 天然のエクオリンは、米国ワシントン州フライデー、
ハーバー島近郊に生育する発光オワンクラゲの傘周辺に
存在する細胞内に存在する発光蛋白質であり、約５トン
のクラゲより精製エクオリンが200mg程度得られている
のみである。
ハーバー島近郊に生育する発光オワンクラゲの傘周辺に
存在する細胞内に存在する発光蛋白質であり、約５トン
のクラゲより精製エクオリンが200mg程度得られている
のみである。
この発光蛋白エクオリンは、Ca2+イオンと特異的に結
合して発光することにより、種々の分析に利用されて来
た。しかし、その供給量が十分でないため、その有効性
（微弱発光利用による分析）が十分に活用されていな
い。
合して発光することにより、種々の分析に利用されて来
た。しかし、その供給量が十分でないため、その有効性
（微弱発光利用による分析）が十分に活用されていな
い。
そこで我々は、組換えDNAの手法を用いてエクオリン
の蛋白質部分（アポエクオリン）を産生させ、還元剤、
基質等との混合によりエクオリン活性を有する再生エク
オリンを作成することに成功している（特願昭60−2802
59号、同61−249098号）。
の蛋白質部分（アポエクオリン）を産生させ、還元剤、
基質等との混合によりエクオリン活性を有する再生エク
オリンを作成することに成功している（特願昭60−2802
59号、同61−249098号）。
しかし、未だアポエクオリンを大量に産生させ、精製
するには到っていなかった。そこで菌体外発現ベクター
piP−HE（特願昭61−249098号）を用いて種々培養条件
の検討を行い、アポエクオリンを菌体外、すなわち培養
濾液に菌体内と同程度（20μｇ〜50μg/ml）のアポエク
オリンの産生を検出することができた。
するには到っていなかった。そこで菌体外発現ベクター
piP−HE（特願昭61−249098号）を用いて種々培養条件
の検討を行い、アポエクオリンを菌体外、すなわち培養
濾液に菌体内と同程度（20μｇ〜50μg/ml）のアポエク
オリンの産生を検出することができた。
以上の記述から明らかなように、本発明の目的は、ア
ポエクオリンの菌体外生産方法とその精製法を提供する
ことである。
ポエクオリンの菌体外生産方法とその精製法を提供する
ことである。
［問題点を解決するための手段］ 本発明は、下記（１）の主要構成と（２）ないし
（４）の実施態様的構成を有する。
（４）の実施態様的構成を有する。
（１）クラゲ発光蛋白質エクオリンの生合成を特定する
遺伝子（pAQ440）を用いて菌体外分泌ベクターpiPHEに
クローニングして得られたプラスミドを大腸菌にトラン
スホームした菌体を培養し、培養液を菌体と培養濾液に
分離して得られた培養濾液に酸類を添加してそのpHが4.
7以下となる如く処理して白色沈殿を取得することを特
徴とするアポエクオリンの製造法。
遺伝子（pAQ440）を用いて菌体外分泌ベクターpiPHEに
クローニングして得られたプラスミドを大腸菌にトラン
スホームした菌体を培養し、培養液を菌体と培養濾液に
分離して得られた培養濾液に酸類を添加してそのpHが4.
7以下となる如く処理して白色沈殿を取得することを特
徴とするアポエクオリンの製造法。
（２）白色沈殿を緩衝液に溶解し、還元剤を添加して還
元処理することを特徴とする前記第（１）項に記載の製
造法。
元処理することを特徴とする前記第（１）項に記載の製
造法。
（３）還元処理されたアポエクオリンフラクションを陰
イオン交換クロマログラフィー法により吸着処理する前
記第（２）項に記載の製造法。
イオン交換クロマログラフィー法により吸着処理する前
記第（２）項に記載の製造法。
（４）陰イオン交換クロマログラフィー法により吸着処
理して取得されたアポエクオリンをゲル濾過法により処
理する前記第（３）項に記載の製造法。
理して取得されたアポエクオリンをゲル濾過法により処
理する前記第（３）項に記載の製造法。
本発明の構成と効果につき以下に詳述する。
本発明に使用する菌株は、菌体外発現ベクターpiP−H
Eを大腸菌にトランスフォームした菌株である。該piP−
HEに関しては、本発明者らの発明になる特願昭61−2490
98号（以下先願ということがある）に詳述されている
が、その構成を説明するpiP−HE構築工程図は、第１図
のとおりである。
Eを大腸菌にトランスフォームした菌株である。該piP−
HEに関しては、本発明者らの発明になる特願昭61−2490
98号（以下先願ということがある）に詳述されている
が、その構成を説明するpiP−HE構築工程図は、第１図
のとおりである。
同図において、pUC8は高コピーのクローニングベクタ
ーであり、pAQ440はクラゲ発光蛋白エクオリンのクロー
ンプラスミドである。両者から図に示すようにpiQ8HEを
作成し、これにpIN III 113 ompA−１から切り出したり
ポプロテインのプロモーター（lpp.P）、ラクトースオ
ペロンのプロモーターとオペレーター（lacPO）及びシ
グナルペプチド領域を含むフラグメントをpiQ8−HEのSc
a I/Hind III部分に挿入しpiP−HEを構成する。なお、p
UC8の入手方法については、（Messing,J.and Vieira,
（1982）Gene,19:269−276.）参照。さらにpIN−III−1
13−ompA−１から切り出したlpp.P,lacPO及びシグナル
ペプチド領域を含むフラグメントの調製法については
（Ghrayeb,J.,Kimura,H.,Takahara,M.,Hsiung,H.,Masu
i,Y.and Inouye,M.（1984）EMBO J.3:2437−2442.）参
照。
ーであり、pAQ440はクラゲ発光蛋白エクオリンのクロー
ンプラスミドである。両者から図に示すようにpiQ8HEを
作成し、これにpIN III 113 ompA−１から切り出したり
ポプロテインのプロモーター（lpp.P）、ラクトースオ
ペロンのプロモーターとオペレーター（lacPO）及びシ
グナルペプチド領域を含むフラグメントをpiQ8−HEのSc
a I/Hind III部分に挿入しpiP−HEを構成する。なお、p
UC8の入手方法については、（Messing,J.and Vieira,
（1982）Gene,19:269−276.）参照。さらにpIN−III−1
13−ompA−１から切り出したlpp.P,lacPO及びシグナル
ペプチド領域を含むフラグメントの調製法については
（Ghrayeb,J.,Kimura,H.,Takahara,M.,Hsiung,H.,Masu
i,Y.and Inouye,M.（1984）EMBO J.3:2437−2442.）参
照。
piP−HEの大腸菌へのトランスフォーム方法について
は、公知の方法に従う。好ましい大腸菌としてはD1210
若しくはLE392を挙げることができる。
は、公知の方法に従う。好ましい大腸菌としてはD1210
若しくはLE392を挙げることができる。
A.大腸菌の培養条件（製造条件） piP−HEを有する大腸菌を適当な培地（例えばＬ−培
地）で培養する。培養条件は限定されないが、例えば37
℃−昼夜振とう培養する。培地中には、適当量（例えば
50μg/ml）のアンピシリンを添加するのが好ましい。
地）で培養する。培養条件は限定されないが、例えば37
℃−昼夜振とう培養する。培地中には、適当量（例えば
50μg/ml）のアンピシリンを添加するのが好ましい。
かくして得られた培養液の一部を約100倍量のM9培地
（注．組成例は後述の実施例参照）に加えて振とう培養
する。該培地には、好ましくは少量の0.2％カザミノ酸
（Difco社製品）を添加する。
（注．組成例は後述の実施例参照）に加えて振とう培養
する。該培地には、好ましくは少量の0.2％カザミノ酸
（Difco社製品）を添加する。
培養温度は30〜42℃、好ましくは40℃で、培養時間は
12〜20時間程度である。
12〜20時間程度である。
以上の培養により培養液中の菌体外部分に大量のアポ
エクオリンが産生される。産生されたアポエクオリンの
確認は、後述の実施例に係る第２図に示すように、分子
量マーカーと天然のエクオリンを基準としてSDS−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法により可能である。同図
において１〜５は、それぞれ 1:分子量マーカー 2:pUC8を含む大腸菌菌体（200μ相当） 3:piP−HEを含む大腸菌菌体（同上） 4:piP−HEを含む大腸菌の培養濾液（50μ相当） 5:天然のエクオリン（５μｇ） を示す。
エクオリンが産生される。産生されたアポエクオリンの
確認は、後述の実施例に係る第２図に示すように、分子
量マーカーと天然のエクオリンを基準としてSDS−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法により可能である。同図
において１〜５は、それぞれ 1:分子量マーカー 2:pUC8を含む大腸菌菌体（200μ相当） 3:piP−HEを含む大腸菌菌体（同上） 4:piP−HEを含む大腸菌の培養濾液（50μ相当） 5:天然のエクオリン（５μｇ） を示す。
第２図は、明らかに菌体外に大量のアポエクオリンが
検出されていることを示している。
検出されていることを示している。
後述の実施例に係る第３図は、12.5重量％のSDS−ポ
リアクリルアミドゲルを用いて上述の培養物についてア
ポエクオリンの生成の確認を行ったものである。同図に
おいて −●−は、piP−HEを有する大腸菌（D1210）の生成を −□−は、菌体内のエクオリン活性をそして −■−は、培養濾液のエクオリン活性を 示す。同図から、取得精製物には十分な量のアポエクオ
リンが生成していることが明らかである。
リアクリルアミドゲルを用いて上述の培養物についてア
ポエクオリンの生成の確認を行ったものである。同図に
おいて −●−は、piP−HEを有する大腸菌（D1210）の生成を −□−は、菌体内のエクオリン活性をそして −■−は、培養濾液のエクオリン活性を 示す。同図から、取得精製物には十分な量のアポエクオ
リンが生成していることが明らかである。
B.菌体の分離法 上述Ａで得られた培養液を公知方法で分離して菌体と
培養濾液とする。該分離方法は限定されないが、好まし
くは高速遠心機を用い、好ましくは５〜15分程度遠心処
理して菌体を分離し培養濾液を取得する。処理温度は、
上述の培養温度以下０℃以上であればよく、通常は室温
（15〜25℃）で支障なく実施できる。得られた培養濾液
のエクオリン活性については上述Ａに述べた。
培養濾液とする。該分離方法は限定されないが、好まし
くは高速遠心機を用い、好ましくは５〜15分程度遠心処
理して菌体を分離し培養濾液を取得する。処理温度は、
上述の培養温度以下０℃以上であればよく、通常は室温
（15〜25℃）で支障なく実施できる。得られた培養濾液
のエクオリン活性については上述Ａに述べた。
C.培養濾液からのアポエクオリンの濃縮 上述Ｂで得られた培養濾液を次のように酸性処理する
ことにより、濃縮されたアポエクオリンを取得する。該
酸性処理とは、培養濾液に酸類を添加してそのpHを５以
下、好ましくは4.7以下にすることである。使用する酸
の種類は限定されないが、好ましくは弱酸、殊に水溶性
の有機酸が好ましい。
ことにより、濃縮されたアポエクオリンを取得する。該
酸性処理とは、培養濾液に酸類を添加してそのpHを５以
下、好ましくは4.7以下にすることである。使用する酸
の種類は限定されないが、好ましくは弱酸、殊に水溶性
の有機酸が好ましい。
その具体例としては希塩酸、希硫酸のような無機酸、
トリクロロ酢酸、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸のよ
うな脂肪族モノカルボン酸、修酸、マレイン酸のように
脂肪族ポリカルボン酸、安息香酸、ケイ皮酸のような芳
香族カルボン酸、アスコルビン酸、クエン酸のような脂
肪族オキシカルボン酸を挙げることができる。
トリクロロ酢酸、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸のよ
うな脂肪族モノカルボン酸、修酸、マレイン酸のように
脂肪族ポリカルボン酸、安息香酸、ケイ皮酸のような芳
香族カルボン酸、アスコルビン酸、クエン酸のような脂
肪族オキシカルボン酸を挙げることができる。
かゝる酸類と培養濾液の混合方法は限定されないが、
好ましくは攪拌下の培養濾液に、酸類若しくはその水溶
液等を滴下して該濾液のpHを徐々に低下せしめる（注．
酸類添加前のpHはおおむね6.8〜7.2程度である）。以上
のような酸処理は、０〜40℃、好ましくは０〜15℃で５
分〜２時間行い、終了後１〜30時間、好ましくは５〜15
時間０〜４℃で放置する。
好ましくは攪拌下の培養濾液に、酸類若しくはその水溶
液等を滴下して該濾液のpHを徐々に低下せしめる（注．
酸類添加前のpHはおおむね6.8〜7.2程度である）。以上
のような酸処理は、０〜40℃、好ましくは０〜15℃で５
分〜２時間行い、終了後１〜30時間、好ましくは５〜15
時間０〜４℃で放置する。
アポエクオリンは白色沈澱となって、上述のpHの低下
処理中から析出するが、酸処理後の放置により沈澱が完
結し、収率が向上する。かくして得られた沈澱（濃縮ア
ポエクオリン）を培養濾液と分離して取得する。分離方
法は限定されないが、通常遠心分離法が採用される。
処理中から析出するが、酸処理後の放置により沈澱が完
結し、収率が向上する。かくして得られた沈澱（濃縮ア
ポエクオリン）を培養濾液と分離して取得する。分離方
法は限定されないが、通常遠心分離法が採用される。
D.還元剤処理 上述のＣで得られた濃縮アポエクオリンを適当な緩衝
液（例えば100mM Tris−HCl（pH7.6）,10mM EDTAを含む
もの）に溶解させ該溶液に所定の還元剤を添加する。か
ゝる還元剤としては２−メルカプトエタノールを挙げる
ことができるが、勿論同等に使用できる他の還元剤を使
用してもよい。
液（例えば100mM Tris−HCl（pH7.6）,10mM EDTAを含む
もの）に溶解させ該溶液に所定の還元剤を添加する。か
ゝる還元剤としては２−メルカプトエタノールを挙げる
ことができるが、勿論同等に使用できる他の還元剤を使
用してもよい。
還元条件は、還元剤濃度が濃縮アポエクオリン溶液中
で１〜30mM、好ましくは５〜15mMとなるように還元剤を
添加混合し、０〜15℃、好ましくは０〜５℃で添加後１
〜10時間、好ましくは２〜６時間放置して還元を進行さ
せる。かくして還元処理されたアポエクオリンフラクシ
ョンが得られる。
で１〜30mM、好ましくは５〜15mMとなるように還元剤を
添加混合し、０〜15℃、好ましくは０〜５℃で添加後１
〜10時間、好ましくは２〜６時間放置して還元を進行さ
せる。かくして還元処理されたアポエクオリンフラクシ
ョンが得られる。
このように還元剤処理することにより、アポエクオリ
ン内に生成している。−Ｓ−Ｓ−結合を−SH HS−と解
離させることになる。この還元剤処理を行うことによ
り、陰イオン交換クロマトグラフィー法によるアポエク
オリンの収量（回収率）が30％以上よくなる。さらには
分離がよくなる。
ン内に生成している。−Ｓ−Ｓ−結合を−SH HS−と解
離させることになる。この還元剤処理を行うことによ
り、陰イオン交換クロマトグラフィー法によるアポエク
オリンの収量（回収率）が30％以上よくなる。さらには
分離がよくなる。
E.陰イオン交換クロマトグラフィー法 この工程は、アポエクオリンの濃縮、精製を目的とす
る。上述のＤで得られた還元処理アポエクオリンを陰イ
オン交換樹脂に吸着させる。具体的クロマトグラフィー
法は限定されないが、好ましくは、DEAE−多孔性セルロ
ーズ球状粒子（セルロファインは商品名）によるカラム
クロマトグラフィー法を用いる。
る。上述のＤで得られた還元処理アポエクオリンを陰イ
オン交換樹脂に吸着させる。具体的クロマトグラフィー
法は限定されないが、好ましくは、DEAE−多孔性セルロ
ーズ球状粒子（セルロファインは商品名）によるカラム
クロマトグラフィー法を用いる。
使用するカラムは、予め所定量のEDTAおよび２−メル
カプトエタノールを含む緩衝液（例えば30mM Tris−HCl
バッファー、pH7.6）で平衡化しておく。
カプトエタノールを含む緩衝液（例えば30mM Tris−HCl
バッファー、pH7.6）で平衡化しておく。
該カラムに上述の還元剤処理アポエクオリンを吸着さ
せ、つづいて前述の緩衝液で洗浄し、洗浄された液の吸
光度が一定値（0.01（280nm））になった時次のアポエ
クオリンの溶出と分注を行う。
せ、つづいて前述の緩衝液で洗浄し、洗浄された液の吸
光度が一定値（0.01（280nm））になった時次のアポエ
クオリンの溶出と分注を行う。
すなわち、アポエクオリンの溶出は０→0.4MのNaClの
直線濃度勾配で行い、一定量（例えば各8ml）で分注す
る。溶出流速は限定されないが、例えば10〜40ml/hr、
好ましくは20〜30ml/hrである。後述の実施例に係る第
４図は、以上のようなカラムクロマトグラフィーの結果
を示す。
直線濃度勾配で行い、一定量（例えば各8ml）で分注す
る。溶出流速は限定されないが、例えば10〜40ml/hr、
好ましくは20〜30ml/hrである。後述の実施例に係る第
４図は、以上のようなカラムクロマトグラフィーの結果
を示す。
図において、 −●−：エクオリン活性、 −−−:NaClの塩濃度勾配、 ………:OD280での吸光度 を示す。同図から、塩濃度が0.15〜0.2Mの部分の溶出物
にエクオリン活性が検出されている。後述の実施例に係
る第５図は該部分のアポエクオリンの純度を12.5重量％
のSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で検定した
結果を示す。
にエクオリン活性が検出されている。後述の実施例に係
る第５図は該部分のアポエクオリンの純度を12.5重量％
のSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で検定した
結果を示す。
図において、Ｍは分子量マーカーを示す。各フラクシ
ョンにおけるアポエクオリンの純度は、デンシトメータ
ー（島津製作所（株）製dual−wavelength chromato sc
anner CS−930）で測定する。後述実施例では、フラク
ションの最高濃度のものは純度95％以上であった。
ョンにおけるアポエクオリンの純度は、デンシトメータ
ー（島津製作所（株）製dual−wavelength chromato sc
anner CS−930）で測定する。後述実施例では、フラク
ションの最高濃度のものは純度95％以上であった。
F.ゲル濾過 上述Ｅで得られたアポエクオリンについて更に高純度
のものが必要の場合には、本工程を実施する。
のものが必要の場合には、本工程を実施する。
例えば、セファデックスＧ−100（ファルマシヤ社
（株）製）（1.8×100cm）のカラムを10mM EDTA、1mMメ
ルカプトエタノールを含む30mM Tris−HCl（pH7.6）バ
ッファーで平衡化した後、上述ＥのDEAE−イオンクロマ
トグラフィーより溶出したアポエクオリンを供給して処
理する。流出速度は限定されないが、例えば２〜10ml/h
r、好ましくは5ml/hrである。
（株）製）（1.8×100cm）のカラムを10mM EDTA、1mMメ
ルカプトエタノールを含む30mM Tris−HCl（pH7.6）バ
ッファーで平衡化した後、上述ＥのDEAE−イオンクロマ
トグラフィーより溶出したアポエクオリンを供給して処
理する。流出速度は限定されないが、例えば２〜10ml/h
r、好ましくは5ml/hrである。
［発明の効果］ 以上に示された本発明の方法は、蛋白精製において非
常に有効であり、重要な点である。培養液に合成培地を
用いることにより、不純物の混入をふせぐことも可能で
あり、培養濾液にアポエクオリンを分泌生産させること
により、以下の精製が容易となる。すなわち、培養濾液
の蛋白質の60％以上はアポエクオリンであり、容易な濃
縮法として、酸性処理を利用することにより培養濾液か
らの濃縮が可能となった。
常に有効であり、重要な点である。培養液に合成培地を
用いることにより、不純物の混入をふせぐことも可能で
あり、培養濾液にアポエクオリンを分泌生産させること
により、以下の精製が容易となる。すなわち、培養濾液
の蛋白質の60％以上はアポエクオリンであり、容易な濃
縮法として、酸性処理を利用することにより培養濾液か
らの濃縮が可能となった。
さらに２−メルカプトエタノール等の還元剤で処理を
行った後、陰イオン交換体（DEAE・セルロファイン）ク
ロマトグラフィー法により、純度95％以上のアポエクオ
リンを200mlの培養濾液から約7mg得た。この収量は約15
0kgのクラゲより分離したアポエクオリンに相当する。
行った後、陰イオン交換体（DEAE・セルロファイン）ク
ロマトグラフィー法により、純度95％以上のアポエクオ
リンを200mlの培養濾液から約7mg得た。この収量は約15
0kgのクラゲより分離したアポエクオリンに相当する。
菌体外分泌ベクターによるアポエクオリンの産生条件
の確立及び精製法の確立により、大量のエクオリンの調
製の道が可能となり、その波及効果は大きい。
の確立及び精製法の確立により、大量のエクオリンの調
製の道が可能となり、その波及効果は大きい。
以下、実施例により本発明を説明する。
［実施例］ 菌体外発現ベクター（piP−HE）を大腸菌にトランス
フォームした菌株を用いる。好ましい大腸菌としてはD1
210、LE392などである。piP−HEのプラスミドを第１図
に示す。
フォームした菌株を用いる。好ましい大腸菌としてはD1
210、LE392などである。piP−HEのプラスミドを第１図
に示す。
以下上記菌株を用いて発現させるアポエクオリンの製
造法と精製法について述べる。
造法と精製法について述べる。
（１）大腸菌の培養条件（製造条件） piP−HEを有する大腸菌を50μg/mlのアンピシリンを
含む適当な培地（たとえばＬ−培地:1中にバクトトリ
プトン10g;イーストエキストラクト5g;塩化ナトリウム5
g）100mlにて37℃で一昼夜、振とう培養を行う。
含む適当な培地（たとえばＬ−培地:1中にバクトトリ
プトン10g;イーストエキストラクト5g;塩化ナトリウム5
g）100mlにて37℃で一昼夜、振とう培養を行う。
この培養液を2mlを200mlの0.2％カザミノ酸（Difco
社）を含むM9培地（Na2HPO46g;KH2Po43g;NaCl0.5g;NH4C
l1g;0.2％グルコース;2mM MgCl2;0.1mM CaCl2を１中
に含）に加え振とう培養を行う。培養温度は37℃であ
る。培養時間は20時間である。
社）を含むM9培地（Na2HPO46g;KH2Po43g;NaCl0.5g;NH4C
l1g;0.2％グルコース;2mM MgCl2;0.1mM CaCl2を１中
に含）に加え振とう培養を行う。培養温度は37℃であ
る。培養時間は20時間である。
第２図に菌体内外に生成するアポエクオリンと菌体外
の生育の関係を示した。明らかに菌体外に大量のアポエ
クオリンが検出されている。12.5％のSDS−ポリアクリ
ルアミドゲルでアポエクオリンの生成を確認したのが第
３図である。
の生育の関係を示した。明らかに菌体外に大量のアポエ
クオリンが検出されている。12.5％のSDS−ポリアクリ
ルアミドゲルでアポエクオリンの生成を確認したのが第
３図である。
培養濾液に20〜50μg/mlのアポエクオリンが生成して
いることがわかり、アポエクオリンの精製には十分の量
である。
いることがわかり、アポエクオリンの精製には十分の量
である。
（２）菌体の分離法 培養液から菌体と培養濾液の分離を行う。すなわち、
高速遠心機（6000×g,10分）遠心分離を行い菌体を分離
する。
高速遠心機（6000×g,10分）遠心分離を行い菌体を分離
する。
（３）培養濾液からアポエクオリンの濃縮法 菌体と分離した培養濾液を酸性処理を行う。酸性処理
とは培養濾液のpHを4.7以下にすることである。pHを下
げるために酸類として1Nの酢酸を用い、攪拌を行いなが
らpH4.2にする。pHが下がるにつれてアポエクオリンの
白沈を生じるが、４℃で一昼夜放置することにより好回
収率が得られる。
とは培養濾液のpHを4.7以下にすることである。pHを下
げるために酸類として1Nの酢酸を用い、攪拌を行いなが
らpH4.2にする。pHが下がるにつれてアポエクオリンの
白沈を生じるが、４℃で一昼夜放置することにより好回
収率が得られる。
一昼夜放置した上記白沈澱を遠心分離（9000×g,10
分）で分離する。この沈澱が濃縮アポエクオリンであ
る。
分）で分離する。この沈澱が濃縮アポエクオリンであ
る。
（４）還元剤処理 濃縮アポエクオリンを100mM Tris−HCl（pH7.6）,10m
M EDTAを含むバッファーに溶解し、還元剤を添加する。
好ましい還元剤としては２−メルカプトエタノールを最
終濃度が10mMとなるように添加を行い、２時間以上、４
℃で放置を行う。
M EDTAを含むバッファーに溶解し、還元剤を添加する。
好ましい還元剤としては２−メルカプトエタノールを最
終濃度が10mMとなるように添加を行い、２時間以上、４
℃で放置を行う。
（５）陰イオン交換クロマトグラフィー 還元剤存在下で還元剤処理されたアポエクオリンフラ
クションを、陰イオン交換クロマトフィーに吸着を行
う。DEAE−セルロファイン（多孔性セルローズ球状粒子
の商品名）A800（1.0×18cm）カラムクロマトグラフィ
ー法を用いた。
クションを、陰イオン交換クロマトフィーに吸着を行
う。DEAE−セルロファイン（多孔性セルローズ球状粒子
の商品名）A800（1.0×18cm）カラムクロマトグラフィ
ー法を用いた。
使用するカラムはあらかじめ10mM EDTA,1mM2−メルカ
プトエタノールを含む30mM Tris−HCl（pH7.6）バッフ
ァーで平衡化を行っておき、還元剤処理アポエクオリン
を吸着させたのち、同一バッファーで洗浄を行い、吸光
度が0.01（280nm）以下になったことを確認した後、０
→0.4MのNaClの直線濃度勾配でアポエクオリンを溶出
し、各8mlで分注する。溶出流速は24ml/hrである。
プトエタノールを含む30mM Tris−HCl（pH7.6）バッフ
ァーで平衡化を行っておき、還元剤処理アポエクオリン
を吸着させたのち、同一バッファーで洗浄を行い、吸光
度が0.01（280nm）以下になったことを確認した後、０
→0.4MのNaClの直線濃度勾配でアポエクオリンを溶出
し、各8mlで分注する。溶出流速は24ml/hrである。
第４図にクロマトグラフィーの結果を示す。塩濃度が
0.15〜0.2Mにエクオリン活性が検出されている。この部
分にアポエクオリンが存在することになり、純度を12.5
％のSDS−ポリアクリルアミドゲルで検出したのが第５
図である。フラクション30〜33において、デンシトメー
ター（島津dual−wavelength chromatoscanner CS−93
0）で得られた純度は95％以上である。
0.15〜0.2Mにエクオリン活性が検出されている。この部
分にアポエクオリンが存在することになり、純度を12.5
％のSDS−ポリアクリルアミドゲルで検出したのが第５
図である。フラクション30〜33において、デンシトメー
ター（島津dual−wavelength chromatoscanner CS−93
0）で得られた純度は95％以上である。
（１）〜（５）の精製段階での収率をまとめたものが
下記第１表である。200mlの培養濾液より、95％以上の
アポエクオリンが約7mg得られた。
下記第１表である。200mlの培養濾液より、95％以上の
アポエクオリンが約7mg得られた。
【図面の簡単な説明】 第１〜５図は、本発明の実施例の説明図である。 第１図は、本発明に使用する発現分泌ベクターpiP−HE
の構築説明図である。 第２図は、piP−HEを有する大腸菌によるアポエクオリ
ンの産生の確認を示す図である。 第３図は、piP−HEを有する大腸菌の培養時間とアポエ
クオリン生成の関係を示す図である。 第４図は、アポエクオリンのDEAE−多孔性セルローズ球
状粒子によるクロマトグラフィーの結果を示す図であ
る。 第５図は、アポエクオリンのSDS−ポリアクリルアミド
電気泳動によるアポエクオリンの純度の確認結果を示す
図である。
の構築説明図である。 第２図は、piP−HEを有する大腸菌によるアポエクオリ
ンの産生の確認を示す図である。 第３図は、piP−HEを有する大腸菌の培養時間とアポエ
クオリン生成の関係を示す図である。 第４図は、アポエクオリンのDEAE−多孔性セルローズ球
状粒子によるクロマトグラフィーの結果を示す図であ
る。 第５図は、アポエクオリンのSDS−ポリアクリルアミド
電気泳動によるアポエクオリンの純度の確認結果を示す
図である。
Claims (4)
- 【請求項１】クラゲ発光蛋白質エクオリンの生合成を特
定する遺伝子（pAQ440）を用いて菌体外分泌ベクターpi
PHEにクローニングして得られたプラスミドを大腸菌に
トランスホームした菌体を培養し、培養液を菌体と培養
濾液に分離して得られた培養濾液に酸類を添加してその
pHが4.7以下となる如く処理して白色沈殿を取得するこ
とを特徴とするアポエクオリンの製造法。 - 【請求項２】白色沈殿を緩衝液に溶解し、還元剤を添加
して還元処理することを特徴とする特許請求の範囲第
（１）項に記載の製造法。 - 【請求項３】還元処理されたアポエクオリンフラクショ
ンを陰イオン交換クロマログラフィー法により吸着処理
する特許請求の範囲第（２）項に記載の製造法。 - 【請求項４】陰イオン交換クロマログラフィー法により
吸着処理して取得されたアポエクオリンをゲル濾過法に
より処理する特許請求の範囲第（３）項に記載の製造
法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62291640A JP2592623B2 (ja) | 1987-11-18 | 1987-11-18 | アポエクオリンの製造法 |
| US07/272,900 US5139937A (en) | 1987-11-18 | 1988-11-18 | Process for producing apoaequorin |
| DE8888119212T DE3880440T2 (de) | 1987-11-18 | 1988-11-18 | Verfahren zur herstellung von apoaequorin. |
| EP88119212A EP0316933B1 (en) | 1987-11-18 | 1988-11-18 | A process for producing apoaequorin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62291640A JP2592623B2 (ja) | 1987-11-18 | 1987-11-18 | アポエクオリンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01132397A JPH01132397A (ja) | 1989-05-24 |
| JP2592623B2 true JP2592623B2 (ja) | 1997-03-19 |
Family
ID=17771567
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62291640A Expired - Lifetime JP2592623B2 (ja) | 1987-11-18 | 1987-11-18 | アポエクオリンの製造法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5139937A (ja) |
| EP (1) | EP0316933B1 (ja) |
| JP (1) | JP2592623B2 (ja) |
| DE (1) | DE3880440T2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| FR2648713B1 (fr) * | 1989-06-26 | 1994-06-10 | Commissariat Energie Atomique | Proteines hybrides entre une enzyme extracytoplasmique et une autre proteine, leur procede de preparation, ainsi que leur application comme agent de diagnostic |
| US5360728A (en) * | 1992-12-01 | 1994-11-01 | Woods Hole Oceanographic Institution (W.H.O.I.) | Modified apoaequorin having increased bioluminescent activity |
| US6329139B1 (en) | 1995-04-25 | 2001-12-11 | Discovery Partners International | Automated sorting system for matrices with memory |
| US6247995B1 (en) | 1996-02-06 | 2001-06-19 | Bruce Bryan | Bioluminescent novelty items |
| US5876995A (en) | 1996-02-06 | 1999-03-02 | Bryan; Bruce | Bioluminescent novelty items |
| US5942407A (en) * | 1996-06-25 | 1999-08-24 | Immunomatrix, Inc. | Light-emitting immunoassay |
| US6416960B1 (en) | 1996-08-08 | 2002-07-09 | Prolume, Ltd. | Detection and visualization of neoplastic tissues and other tissues |
| US6458547B1 (en) | 1996-12-12 | 2002-10-01 | Prolume, Ltd. | Apparatus and method for detecting and identifying infectious agents |
| US6248542B1 (en) * | 1997-12-09 | 2001-06-19 | Massachusetts Institute Of Technology | Optoelectronic sensor |
| US6087114A (en) * | 1997-12-09 | 2000-07-11 | Massachusetts Institute Of Technology | Optoelectronic sensor |
| CA2324648C (en) | 1998-03-27 | 2013-02-26 | Prolume, Ltd. | Luciferases, fluorescent proteins, nucleic acids encoding the luciferases and fluorescent proteins and the use thereof in diagnostics, high throughput screening and novelty items |
| EP1925320A3 (en) | 1998-03-27 | 2008-09-03 | Prolume, Ltd. | Luciferases, fluorescent proteins, nucleic acids encoding the luciferases and fluorescent proteins and the use thereof in diagnostics |
| US7109315B2 (en) * | 2000-03-15 | 2006-09-19 | Bruce J. Bryan | Renilla reniformis fluorescent proteins, nucleic acids encoding the fluorescent proteins and the use thereof in diagnostics, high throughput screening and novelty items |
| US7422860B2 (en) * | 2001-02-07 | 2008-09-09 | Massachusetts Institute Of Technology | Optoelectronic detection system |
| BR0207084A (pt) * | 2001-02-07 | 2004-01-20 | Massachusetts Inst Technology | Sistema de detecção optoeletrÈnico |
| US8216797B2 (en) | 2001-02-07 | 2012-07-10 | Massachusetts Institute Of Technology | Pathogen detection biosensor |
| US8710195B2 (en) | 2003-08-12 | 2014-04-29 | Jnc Corporation | Fluorescent proteins |
| US7345160B2 (en) * | 2004-03-29 | 2008-03-18 | University Of Kentucky Research Foundation | Aequorin and obelin mutants with differing wavelengths and bioluminescence |
| JP4639904B2 (ja) | 2005-03-30 | 2011-02-23 | チッソ株式会社 | 蛍光活性を有するルシフェラーゼの活性増強方法 |
| JP4609177B2 (ja) | 2005-04-28 | 2011-01-12 | チッソ株式会社 | カルシウム結合型発光蛋白質溶液の発光時間延長方法 |
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| JPS63102695A (ja) * | 1986-10-20 | 1988-05-07 | Chisso Corp | 大腸菌の菌体外分泌ベクタ−を用いる発光蛋白エクオリンの製造法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JPS61135586A (ja) * | 1984-08-24 | 1986-06-23 | Chisso Corp | 発光蛋白アクアリン遺伝子を有するプラスミドおよび該発光蛋白の生合成法 |
| NZ214563A (en) * | 1984-12-31 | 1991-05-28 | Univ Georgia | Production of apoaeqorin using recombinant dna |
| JPS62171695A (ja) * | 1985-12-14 | 1987-07-28 | Chisso Corp | 発光蛋白アクアリン遺伝子を用いるアクアリン活性を有する蛋白質の製造法 |
| US5093240A (en) * | 1986-10-15 | 1992-03-03 | Chisso Corporation | Variant aequorin genes and process for producing variant aequorin proteins |
-
1987
- 1987-11-18 JP JP62291640A patent/JP2592623B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-11-18 US US07/272,900 patent/US5139937A/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-11-18 DE DE8888119212T patent/DE3880440T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-11-18 EP EP88119212A patent/EP0316933B1/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61249098A (ja) * | 1985-04-26 | 1986-11-06 | 三菱電機株式会社 | 話者照合システム |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3880440D1 (de) | 1993-05-27 |
| JPH01132397A (ja) | 1989-05-24 |
| EP0316933B1 (en) | 1993-04-21 |
| DE3880440T2 (de) | 1993-09-09 |
| US5139937A (en) | 1992-08-18 |
| EP0316933A2 (en) | 1989-05-24 |
| EP0316933A3 (en) | 1990-07-04 |
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