JP4120968B2 - イクオリンとその精製分離方法 - Google Patents
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Description
アポイクオリンの過剰発現方法は既に報告されている方法を用いた(非特許文献10、参照)。発現用プラスミドはpiP−HE、ホストの大腸菌はWA802を使用した。アポイクオリンのN−末端と大腸菌のompA(outer membrane protein A)シグナルペプチドを融合させてあるので、タンパク質はペリプラズムに蓄積し、培養液中に産生される。大腸菌は3.0LのLB培地中で37℃、3.0L/minのエアレーションと穏やかな震盪下で培養した。20時間培養後に、培養液を4℃、5,000xgで5分間遠心した。上清は1M酢酸でpH4.2(アポイクオリンのpIは4.7)まで下げることによりタンパク質を析出させ、4℃で1−2時間撹拌した。その後4℃、9,000xgで10分間遠心し、上澄みをデカントして、粗精製アポイクオリンの沈殿物を30mlの1M Tris−Hcl pH10で溶解した。クルードなアポイクオリン溶液は30mM Tris−Hcl pH7.6/5mM CaCl2で3回(1回に付5時間撹拌)、4℃で透析し、透析液は4℃、10,000xgで5分間遠心した。上清は0.22μmのフィルターに通し、次の精製ステップまでは4℃で保存した。活性測定用に分注したアポイクオリン溶液は測定まで−20℃で冷凍保存した。
4℃のクロマトチャンバー内にLCC−501コントローラ、二波長紫外線モニターおよびフラクションコレクターFrac−200が装備されたAmersham Biosciences社製のFPLCシステムを設置、濃度勾配溶出クロマトグラフィーに用いた。
集めたフラクションはSDS−PAGE(10%ゲル)及び非還元条件下のnative PAGE(5−20%勾配のゲル及びTris−Tricine泳動バッファーを使用)により解析し、ゲルはCBBで染色した。タンパク質濃度はウシ血清アルブミンをスタンダードとしブラッドフォード法により測定した。N−末端アミノ酸シーケンス決定のために、タンパク質のバンドはPVDF膜にelectroblottingによって転写し、その配列はModel 494 Procise Sequencer(Applied Biosystems社)を使用してUCSD大学にて決定された。
イクオリン活性はアポイクオリンをセレンテラジン、EDTA、2−メルカプトエタノールおよび分子状酸素と2時間インキュベートし、イクオリンに再生した後測定した。再生溶液は少量、反応バイアルに移し、Mitchell−Hastingsの光電子増倍管測光器のサンプル室に置いて、1.5mlの30mM CaCl2/10mMTris−Hcl pH7.6を注入した。初期の極大光度はPanasonic VP−6712Aチャート式記録計にrluとして記録された。
Claims (6)
- 粗製アポイクオリンをクロマトグラフィーにかけ、還元型および酸化型アポイクオリンを分離し精製することを特徴とするアポイクオリンの精製分離方法。
- 請求項1のアポイクオリンの精製分離方法で得られた酸化型アポイクオリンを用いて、セレンテラジン、酸素および還元剤存在下においてイクオリンを再生し、クロマトグラフィーにかけ、発光する性質を有する一つのアイソフォームおよび蛍光を発しない三つのアイソフォームに分離し精製することを特徴とするイクオリンの精製分離方法。
- 請求項2記載のイクオリンの精製分離方法を用いて分離された前記発光する性質を有する一つのアイソフォームからなることを特徴とするイクオリン。
- セレンテラジン、酸素および還元剤存在下においてアポイクオリンから再生されたイクオリンをクロマトグラフィーにかけ、発光する性質を有する一つのアイソフォームおよび蛍光を発しない三つのアイソフォームに分離し精製するイクオリンの精製分離方法。
- 請求項4記載のイクオリンの精製分離方法によって得られた前記発光する性質を有する一つのアイソフォームからなることを特徴とするイクオリン。
- 請求項3又は5記載のイクオリンを用いたことを特徴とするカルシウムイオン検出方法。
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