JPS63291586A - 変異型エクオリン遺伝子 - Google Patents
変異型エクオリン遺伝子Info
- Publication number
- JPS63291586A JPS63291586A JP12637487A JP12637487A JPS63291586A JP S63291586 A JPS63291586 A JP S63291586A JP 12637487 A JP12637487 A JP 12637487A JP 12637487 A JP12637487 A JP 12637487A JP S63291586 A JPS63291586 A JP S63291586A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- mutant
- gene
- base
- aequorin
- converted
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108010000239 Aequorin Proteins 0.000 title claims abstract description 33
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 21
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 abstract description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 abstract description 13
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 abstract description 11
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 abstract description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 abstract description 7
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 abstract description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 abstract description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 abstract description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- YHIPILPTUVMWQT-UHFFFAOYSA-N Oplophorus luciferin Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1CC(C(N1C=C(N2)C=3C=CC(O)=CC=3)=O)=NC1=C2CC1=CC=CC=C1 YHIPILPTUVMWQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 6
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 108010041089 apoaequorin Proteins 0.000 description 3
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 3
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000242583 Scyphozoa Species 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 2
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 241000243290 Aequorea Species 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010047357 Luminescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000006830 Luminescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- WRTKMPONLHLBBL-KVQBGUIXSA-N dXTP Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(NC(=O)NC2=O)=C2N=C1 WRTKMPONLHLBBL-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 229910001882 dioxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010200 folin Substances 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43595—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔技術の分野〕
本発明は、変異型エクオリン遺伝子ならびに変異型エク
オリン蛋白の製造法に関する。
オリン蛋白の製造法に関する。
更に詳しくは、合成オリゴヌクレオチドを用いた１１！
基特異的変異法により作成した変異エクオリン遺伝子と
これを用いた上記蛋白の製造法に関するものであり、エ
クオリン分子中の２つ以上のシスティン残基をセリン残
基へ変換した遺伝子に係る。
基特異的変異法により作成した変異エクオリン遺伝子と
これを用いた上記蛋白の製造法に関するものであり、エ
クオリン分子中の２つ以上のシスティン残基をセリン残
基へ変換した遺伝子に係る。
天然に存在するエクオリンは、海洋に生息する発光オワ
ンクラゲから分離、精製して得られるいわゆる発光蛋白
であり、高い利用価値を持った生体微量活性物質として
知られている。すなわち、エクオリンはＣａ２・、 Ｓ
ｒ２・等の金属イオンで発光することから、微量のＣａ
２・（１０−９Ｍ）の検出試薬として利用され、特に細
胞間のＣａ２・の測定には、有効であることが認められ
ている。しかし、その生産量は極めて少なく、研究用試
薬としてすら不足している状態である。
ンクラゲから分離、精製して得られるいわゆる発光蛋白
であり、高い利用価値を持った生体微量活性物質として
知られている。すなわち、エクオリンはＣａ２・、 Ｓ
ｒ２・等の金属イオンで発光することから、微量のＣａ
２・（１０−９Ｍ）の検出試薬として利用され、特に細
胞間のＣａ２・の測定には、有効であることが認められ
ている。しかし、その生産量は極めて少なく、研究用試
薬としてすら不足している状態である。
そこで先づ我々は、発光オワンクラゲより、ｃＤＮＡ遺
伝子を分離同定し、ｐＡＱ４４０と名付けた（特開昭８
１−１３５５８６号）、さらに組換えＩＩＮＡ技術を用
いて大腸菌内でエクオリンを産生せしめることにも成功
しく特願昭６０−２８０２５９号）、このエクオリン蛋
白を用いてＣａ２・等の金属イオンの検出に利用できる
ことも示した（特願昭６１−１０３８４９号）。
伝子を分離同定し、ｐＡＱ４４０と名付けた（特開昭８
１−１３５５８６号）、さらに組換えＩＩＮＡ技術を用
いて大腸菌内でエクオリンを産生せしめることにも成功
しく特願昭６０−２８０２５９号）、このエクオリン蛋
白を用いてＣａ２・等の金属イオンの検出に利用できる
ことも示した（特願昭６１−１０３８４９号）。
また、その発光のメカニズムに関して１部位特異的変異
法により、その構造と機能の解析も行って来た（特願昭
８１−２４５１０８．８１−２４５１０９ ） 。
法により、その構造と機能の解析も行って来た（特願昭
８１−２４５１０８．８１−２４５１０９ ） 。
しかし、エクオリンの再生過程すなわち、アポエクオリ
ン、基質セレンテラジン、分子状酸素、２−メルカプト
エタノールの存在で、カルシュラムによる発光回部なエ
クオリンが再構成されるが、この過程で還元剤である２
−メルカプトエタノールが高濃度に必要であることが知
られている。
ン、基質セレンテラジン、分子状酸素、２−メルカプト
エタノールの存在で、カルシュラムによる発光回部なエ
クオリンが再構成されるが、この過程で還元剤である２
−メルカプトエタノールが高濃度に必要であることが知
られている。
２−メルカプトエタノールが何故必要なのかは不明であ
るが、エクオリン蛋白（アポエクオリン）の−５−Ｓ−
結合を一９Ｈ，Ｈ３−に変換する可能性が示唆される。
るが、エクオリン蛋白（アポエクオリン）の−５−Ｓ−
結合を一９Ｈ，Ｈ３−に変換する可能性が示唆される。
そこで１組換えＤＮＡの技術を用いてエクオリン再生時
に還元剤である２−メルカプトエタノールの存在を必要
としない、変異エクオリン蛋白を製造することは非常に
意味がありそれはエクオリンの再生メカニズムの解明に
つながり、さらには蛋白工学的に意義の深いことであり
、該理解は学術、産業的にも利用価値がある。
に還元剤である２−メルカプトエタノールの存在を必要
としない、変異エクオリン蛋白を製造することは非常に
意味がありそれはエクオリンの再生メカニズムの解明に
つながり、さらには蛋白工学的に意義の深いことであり
、該理解は学術、産業的にも利用価値がある。
工・フォリン蛋白に係る以上の技術的事情にかんがみ、
本発明者らは組換えＯＮ＾技術を用い、天然型エクオリ
ン遺伝子（ＰＡＱ４４０）の変異体を作成し、この遺伝
子を利用して大腸菌内で変異型エクオリン遺伝子を産生
せしめることに成功した。
本発明者らは組換えＯＮ＾技術を用い、天然型エクオリ
ン遺伝子（ＰＡＱ４４０）の変異体を作成し、この遺伝
子を利用して大腸菌内で変異型エクオリン遺伝子を産生
せしめることに成功した。
そして、２−メルカプトエタノールの存在を必要とする
ことなく、エクオリンへの可成が可能であるアポエクオ
リンを、後述の本発明に係る変異型ン残基となりうる塩
基配列、 ＴＧＯのａ＠Ｃに変換し、セリン残基に変換
を行い、アポエクオリン分子内よりシスティン残基を除
去をすることにより得ることができた。
ことなく、エクオリンへの可成が可能であるアポエクオ
リンを、後述の本発明に係る変異型ン残基となりうる塩
基配列、 ＴＧＯのａ＠Ｃに変換し、セリン残基に変換
を行い、アポエクオリン分子内よりシスティン残基を除
去をすることにより得ることができた。
本発明は、下記（１）の構成を有する。
（１）エクオリン遺伝子ｐＡＱ４４０の下記塩基配列に
おいて、 ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＡＴＧＣＡＡＴＴＣＡＴＣＴＴＴＧ
ＣＡＴＣＡＡＡＧＡＡＴＴＡＣＡＴＣＡＡＡＴＣＴＣＴ
ＡＧＴＴＧＡＴＣＡＡＣＴＡＡＡＴＴＧＴＣＴＣＧＡＣ
ＡＡＣＡＡＣＡＡＧＣＡＡＡＣＡＴＧＡＣＡＡＧＣＡＡ
ＡＣＡＡＴＡＣＴＣＡＧＴＣＡＡＧＣＴＴＡＣＡＴＣＡ
ＧＡＣＴＴＣＧＡＣＡＡＣＣＣＡＡＧＡＴＧＧＡＴＴＧ
ＧＡＣＧＡＣＡＣＡＡＧＣＡＴＡＴＧＴＴＣＡＡＴＴＴ
ＣＣＴＴＧＡＴＧＴＣＡＡＣＣＡＣＡＡＴＧＧＡＡＡＡ
ＡＴＣＴＣＴＣＴＴＧＡＣＧＡＧＡＴＧＧＴＣＴＡＣＡ
ＡＧＧＣＡＴＣＴＧＡＴＡＴＴＧＴＣＡＴＣＡＡＴＡＡ
ＣＣＴＴＧＧＡＧＣＡＡＣＡＣＣＴＧＡＧＣＡＡＧＣＣ
ＡＡＡＣＧＡＣＡＣＡＡＡＧＡＴＧＣＴＧＴＡＧＡＡＧ
ＣＣＴＴＣＴＴＣＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＡＡＴＧＡＡ
ＡＴＡＴＧＧＴＧＴＧＧＡＡＡＣＴＧＡＴＴＧＧＣＣＴ
ＧＣＡＴＡＴＡＴＴＧＡＡＧＧＡＴＧＧＡＡＡＡＡＡＴ
ＴＧＧＣＴＡＣＴＧＡＴＧＡＡＴＴＧＧＡＧＡＡＡＴＡ
ＣＧＣＣＡＡＡＡＡＣＧＡＡＣＣＡＡＣＧＣＴＣＡＴＣ
ＣＧＴＡＴＡＴＧＧＧＧＴＧＡＴＧＣＴＴＴＧＴＴＴＧ
ＡＴＡＴＣＧＴＴＧＡＣＡＡＡＧＡＴＣＡＡＡＡＴＧＧ
ＡＧＣＣＡＴＴＡＣＡＣＴＧＧＡＴＧＡＡＴＧＧＡＡＡ
ＧＣＡＴＡＣＡＣＣＡＡＡＧＣＴＧＣＴＧＧＴＡＴＣＡ
ＴＣＣＡＡＴＣＡＴＣＡＧＡＡＧＡＴＴＧＣＧＡＧＧＡ
ＡＡＣＡＴＴＣＡＧＡＧＴＧＴＧＣＧＡＴＡＴＴＧＡＴ
ＧＡＡＡＧＴＧＧＡＣＡＡＣＴＣＧＡＴＧＴＴＧＡＴＧ
ＡＧＡＴＧＡＣＡＡＧＡＣＡＡＣＡＴＴＴＡＧＧＡＴＴ
ＴＴＧＧＴＡＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＣＣＴＧＣＴＴＧＣ
ＧＡＡＡＡＧＣＴＣＴＡＣＧＧＴＧＧＡＧＣＴＧＴＣＣ
ＣＣＴＡＡＧＡＡＧＣＴＣＴＡＣＧＧＴＧＧＴＧＡＴＧ
ＣＡＣＣＣＴＡＧＧＡＡＧＡＴＧＡＴＧＴＧＡＴＴＴＴ
ＧＡＡＴＡＡＡＡＣＡＣＴＧＡＴＧＡＡＴＴＣＡＡＴＣ
ＡＡＡＡＴＴＴＴＣＣＡＡＡＴＴＴＴＴＧＡＡＣＧＡＴ
ＴＴＣＡＡＴＣＧＴＴＴＧＴＧＴＴＧＡＴＴＴＴＴＧＴ
ＡＡＴＴＡＧＧＡＡＣＡＧＡＴＴＡＡＡＴＣＧＡＡＴＧ
ＡＴＴＡＧＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＡＡＴＣＡＡＣＡＧＡ
ＡＣＴＴＡＣＡＡＡＴＣＧＡＡＡＡＡＧＴＡＡＡＡＡＡ
ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
ＡＡＡＡＡＡＡＡ（ア）〜（ニ）に示すいづれかの塩基
が所定の他の塩基に変換されてなる変異遺伝子。
おいて、 ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ
ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＡＴＧＣＡＡＴＴＣＡＴＣＴＴＴＧ
ＣＡＴＣＡＡＡＧＡＡＴＴＡＣＡＴＣＡＡＡＴＣＴＣＴ
ＡＧＴＴＧＡＴＣＡＡＣＴＡＡＡＴＴＧＴＣＴＣＧＡＣ
ＡＡＣＡＡＣＡＡＧＣＡＡＡＣＡＴＧＡＣＡＡＧＣＡＡ
ＡＣＡＡＴＡＣＴＣＡＧＴＣＡＡＧＣＴＴＡＣＡＴＣＡ
ＧＡＣＴＴＣＧＡＣＡＡＣＣＣＡＡＧＡＴＧＧＡＴＴＧ
ＧＡＣＧＡＣＡＣＡＡＧＣＡＴＡＴＧＴＴＣＡＡＴＴＴ
ＣＣＴＴＧＡＴＧＴＣＡＡＣＣＡＣＡＡＴＧＧＡＡＡＡ
ＡＴＣＴＣＴＣＴＴＧＡＣＧＡＧＡＴＧＧＴＣＴＡＣＡ
ＡＧＧＣＡＴＣＴＧＡＴＡＴＴＧＴＣＡＴＣＡＡＴＡＡ
ＣＣＴＴＧＧＡＧＣＡＡＣＡＣＣＴＧＡＧＣＡＡＧＣＣ
ＡＡＡＣＧＡＣＡＣＡＡＡＧＡＴＧＣＴＧＴＡＧＡＡＧ
ＣＣＴＴＣＴＴＣＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＡＡＴＧＡＡ
ＡＴＡＴＧＧＴＧＴＧＧＡＡＡＣＴＧＡＴＴＧＧＣＣＴ
ＧＣＡＴＡＴＡＴＴＧＡＡＧＧＡＴＧＧＡＡＡＡＡＡＴ
ＴＧＧＣＴＡＣＴＧＡＴＧＡＡＴＴＧＧＡＧＡＡＡＴＡ
ＣＧＣＣＡＡＡＡＡＣＧＡＡＣＣＡＡＣＧＣＴＣＡＴＣ
ＣＧＴＡＴＡＴＧＧＧＧＴＧＡＴＧＣＴＴＴＧＴＴＴＧ
ＡＴＡＴＣＧＴＴＧＡＣＡＡＡＧＡＴＣＡＡＡＡＴＧＧ
ＡＧＣＣＡＴＴＡＣＡＣＴＧＧＡＴＧＡＡＴＧＧＡＡＡ
ＧＣＡＴＡＣＡＣＣＡＡＡＧＣＴＧＣＴＧＧＴＡＴＣＡ
ＴＣＣＡＡＴＣＡＴＣＡＧＡＡＧＡＴＴＧＣＧＡＧＧＡ
ＡＡＣＡＴＴＣＡＧＡＧＴＧＴＧＣＧＡＴＡＴＴＧＡＴ
ＧＡＡＡＧＴＧＧＡＣＡＡＣＴＣＧＡＴＧＴＴＧＡＴＧ
ＡＧＡＴＧＡＣＡＡＧＡＣＡＡＣＡＴＴＴＡＧＧＡＴＴ
ＴＴＧＧＴＡＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＣＣＴＧＣＴＴＧＣ
ＧＡＡＡＡＧＣＴＣＴＡＣＧＧＴＧＧＡＧＣＴＧＴＣＣ
ＣＣＴＡＡＧＡＡＧＣＴＣＴＡＣＧＧＴＧＧＴＧＡＴＧ
ＣＡＣＣＣＴＡＧＧＡＡＧＡＴＧＡＴＧＴＧＡＴＴＴＴ
ＧＡＡＴＡＡＡＡＣＡＣＴＧＡＴＧＡＡＴＴＣＡＡＴＣ
ＡＡＡＡＴＴＴＴＣＣＡＡＡＴＴＴＴＴＧＡＡＣＧＡＴ
ＴＴＣＡＡＴＣＧＴＴＴＧＴＧＴＴＧＡＴＴＴＴＴＧＴ
ＡＡＴＴＡＧＧＡＡＣＡＧＡＴＴＡＡＡＴＣＧＡＡＴＧ
ＡＴＴＡＧＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＡＡＴＣＡＡＣＡＧＡ
ＡＣＴＴＡＣＡＡＡＴＣＧＡＡＡＡＡＧＴＡＡＡＡＡＡ
ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
ＡＡＡＡＡＡＡＡ（ア）〜（ニ）に示すいづれかの塩基
が所定の他の塩基に変換されてなる変異遺伝子。
（７）５６９番目の塩基ＧをＣに、５９０番目の塩基Ｇ
をＣに変換した変異遺伝子。
をＣに変換した変異遺伝子。
（４）５９０番目の塩基ＧをＣに、６７４番目の塩基ｑ
をＣに変換した変異遺伝子。
をＣに変換した変異遺伝子。
（ハ）６７４番目の塩基ＧをＣに、５６９番目の塩基Ｇ
をＣに、変換した変異遺伝子、もしくは（＝）５６９番
目の塩基ＧをＣに１．５９０番目の塩基ＧをＣに、６７
４番目の塩基ＧをＣに変換した変異遺伝子。
をＣに、変換した変異遺伝子、もしくは（＝）５６９番
目の塩基ＧをＣに１．５９０番目の塩基ＧをＣに、６７
４番目の塩基ＧをＣに変換した変異遺伝子。
本発明の変異型遺伝子は、添付図に示すような工程によ
って製造できる０本発明の方法では、合成オリゴヌクレ
オチドを用い、塩基特異的変異法によりエクオリン遺伝
子へ後述する変異を導入した。該変異法としては、限定
されないが例えば、ギ’ｒ−／ブーデュプレックス法（
Ｍｏｒｉｎａｇａ ｅｔ ａｌ。
って製造できる０本発明の方法では、合成オリゴヌクレ
オチドを用い、塩基特異的変異法によりエクオリン遺伝
子へ後述する変異を導入した。該変異法としては、限定
されないが例えば、ギ’ｒ−／ブーデュプレックス法（
Ｍｏｒｉｎａｇａ ｅｔ ａｌ。
Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｙ Ｊ２ ６３Ｂ−８３
９（１９８４））を採用できる。同法は、例えば後述の
表１に示すように、変異源として合成オリゴヌクレオチ
ドを用いる。
９（１９８４））を採用できる。同法は、例えば後述の
表１に示すように、変異源として合成オリゴヌクレオチ
ドを用いる。
か−る合成オリゴヌクレオチドは市販の自動ＤＮＡ合成
装置を用いて合成でき、精製は好ましくは高速液体クロ
マトグラフィーを用いて行う、精製品は、公知方法で末
端リン酸化を行い、プラスミド作成のためのプライマー
とする。
装置を用いて合成でき、精製は好ましくは高速液体クロ
マトグラフィーを用いて行う、精製品は、公知方法で末
端リン酸化を行い、プラスミド作成のためのプライマー
とする。
他方、図に示すプラスミド ＰＡＱ４４０の…Ｒ１−…
ｄｍフラグメントとＡａｔ ＩＩフラグメントを用い、
Ａａｔ ＩＩフラグメントについては、公知方法で脱リ
ン酸化処理する。
ｄｍフラグメントとＡａｔ ＩＩフラグメントを用い、
Ａａｔ ＩＩフラグメントについては、公知方法で脱リ
ン酸化処理する。
以上のようにして得られたｐＡＱ４４０に基づく二つの
フラグメントを前述の末端リン酸化されたプライマーと
共に、例えば、三段階の処理（所定温度、所定時間処理
）を行って、アニーリングを行う、該段階とは、例えば
（１００℃、５分）、（３０℃、３０分）および（４℃
、３０分）のような順序からなる組合せである。
フラグメントを前述の末端リン酸化されたプライマーと
共に、例えば、三段階の処理（所定温度、所定時間処理
）を行って、アニーリングを行う、該段階とは、例えば
（１００℃、５分）、（３０℃、３０分）および（４℃
、３０分）のような順序からなる組合せである。
次に、得られた変異ｐＡＱ遺伝子を用いて次のようにｊ
、ｃｏｌｉへのトランスフォーメーションを行う、すな
わち、例えば上述のようにして得られたｄＸＴＰ（Ｘ＝
Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ）とＫＩｅｎｏｗ７ラグメント（大腸菌
ポリメレース）とをＴ４−リガーゼの存在下に反応させ
、二重鎖を作成する。かくして生成したプラスミドニ重
鎖を公知方法によって、ｊ、ｃｏｌｉにトランスフォー
メーションを行う、そして上述のそれぞれの変異源プラ
イマーをプローグとして変異体プラスミド（ｐＡ９４４
０の変異体）をコロニーハイブリダイゼーションにより
スクリーニングを行う。
、ｃｏｌｉへのトランスフォーメーションを行う、すな
わち、例えば上述のようにして得られたｄＸＴＰ（Ｘ＝
Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ）とＫＩｅｎｏｗ７ラグメント（大腸菌
ポリメレース）とをＴ４−リガーゼの存在下に反応させ
、二重鎖を作成する。かくして生成したプラスミドニ重
鎖を公知方法によって、ｊ、ｃｏｌｉにトランスフォー
メーションを行う、そして上述のそれぞれの変異源プラ
イマーをプローグとして変異体プラスミド（ｐＡ９４４
０の変異体）をコロニーハイブリダイゼーションにより
スクリーニングを行う。
変異体の確認法としては限定されないが、例えば（Ｈａ
ｔｔｏｒｉ ｅｔ ａｌ、 Ａｎａｌ、 Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、 １５２ ２３２−２３８．１９８８＋
７）ｄｉｄｅｏｘｔ法により、塩基配列を決定し、変異
塩基の検出を行う、この方法で得られた。ｌカ所変異を
有する変異プラスミドを用いて上述の操作をくり返すこ
とにより、２カ所、及び３カ所変異を有する変異プラス
ミドを作成した。
ｔｔｏｒｉ ｅｔ ａｌ、 Ａｎａｌ、 Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、 １５２ ２３２−２３８．１９８８＋
７）ｄｉｄｅｏｘｔ法により、塩基配列を決定し、変異
塩基の検出を行う、この方法で得られた。ｌカ所変異を
有する変異プラスミドを用いて上述の操作をくり返すこ
とにより、２カ所、及び３カ所変異を有する変異プラス
ミドを作成した。
次に、本発明では、上述の変異エクオリン遺伝子を用い
てエクオリン蛋白の大腸菌内での産生を行う。
てエクオリン蛋白の大腸菌内での産生を行う。
すなわち、そのＩ！ｉ要としては、変異ｐＡＱ４４０遺
伝子の…ｄｍ−…旧のｃＤにＡフラグメント断片をｌａ
ｃのプロモーターを有するプラスミドｐｕｃｓ−２ノ）
Ｉｉｎｄｍ −ＥｃｏＲ１部分ニクローニングを行い得
られたプラスミドを大腸菌例えばＨＢＩＯＩ（０１２１
ＱｉＱ）株にトランスホーメーションし、この大腸菌と
発現誘導体例えばＩＰＴＧを用いて変異エクオリン蛋白
を大腸菌内で産生させる。
伝子の…ｄｍ−…旧のｃＤにＡフラグメント断片をｌａ
ｃのプロモーターを有するプラスミドｐｕｃｓ−２ノ）
Ｉｉｎｄｍ −ＥｃｏＲ１部分ニクローニングを行い得
られたプラスミドを大腸菌例えばＨＢＩＯＩ（０１２１
ＱｉＱ）株にトランスホーメーションし、この大腸菌と
発現誘導体例えばＩＰＴＧを用いて変異エクオリン蛋白
を大腸菌内で産生させる。
該産生方法ならびに集菌方法は、公知方法に従う、集菌
された菌体は、適当な公知のバッファー液に溶解させ、
公知方法（例えば超音波処理）で菌体を破壊し、遠心処
理して上清を取得し、測定酵素溶液とする。
された菌体は、適当な公知のバッファー液に溶解させ、
公知方法（例えば超音波処理）で菌体を破壊し、遠心処
理して上清を取得し、測定酵素溶液とする。
この溶液に対する発光の測定方法は、該溶液の所定量に
基質（セレンテラジン）と還元剤（２−メルカプトエタ
ノール）の所定量を混合したもの鴬と、２−メルカプト
エタノールを加えない未混合の溶液を、２〜３時間水冷
下に熟成して得られた測定液を光電管測定装置中の反応
セルに移し、さらに該セルに所定量のＣａＣｌ２溶液を
注入し、生成する発光を測定する。
基質（セレンテラジン）と還元剤（２−メルカプトエタ
ノール）の所定量を混合したもの鴬と、２−メルカプト
エタノールを加えない未混合の溶液を、２〜３時間水冷
下に熟成して得られた測定液を光電管測定装置中の反応
セルに移し、さらに該セルに所定量のＣａＣｌ２溶液を
注入し、生成する発光を測定する。
測定対象となった本発明の合成オリゴヌクレオチド（プ
ライマー）を後述実施例１の表１に、プライマーのエク
オリン活性を同じく表２に示す。
ライマー）を後述実施例１の表１に、プライマーのエク
オリン活性を同じく表２に示す。
表１，２により、エクオリン遺伝子の塩基配列を変異す
ることにより、２−メルカプトエタノール未添加におい
てもエクオリンが可成することが明白である。
ることにより、２−メルカプトエタノール未添加におい
てもエクオリンが可成することが明白である。
とくに、３カ所すべてのシスティン残基をセリン残基に
変換したＣ１＋２＋３５では、はとんど完全に可成され
ることが明らかである。
変換したＣ１＋２＋３５では、はとんど完全に可成され
ることが明らかである。
以下実施例によって本発明を説明する。
１）合成オリゴヌクレオチドを用いた塩基特異的変異法
によるエクオリン遺伝子（ＰＡＱ４４０）への変異の導
入（図に示す） 塩基特異的変異法は、Ｍｏｒｉｎａｇａら（Ｂｉｏ／Ｔ
ｅｃｈ−ｎｏｌｏｇ２２巻６３Ｂ−８３９（１９８４）
）のギ’？−／ブーディプレックス法により行った。
によるエクオリン遺伝子（ＰＡＱ４４０）への変異の導
入（図に示す） 塩基特異的変異法は、Ｍｏｒｉｎａｇａら（Ｂｉｏ／Ｔ
ｅｃｈ−ｎｏｌｏｇ２２巻６３Ｂ−８３９（１９８４）
）のギ’？−／ブーディプレックス法により行った。
すなわち、表１に示すように、変異源として合成オリゴ
ヌクレオチド（プライマーとして）を用いた０合成オリ
ゴヌクレオチドは、 ＡＢＩ社の自動ＤＮＡ合成装置
で合成し、高速液体クロマトグラフィーで精製し、Ｔ４
−キナーゼで末端リン酸化を行い用いた。プラスミドｐ
ＡＱ４４０のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄｍフラグメントとＡ
ａｔ ＩＩフラグメントを用い、Ａａｔ Ｕフラグメン
トはアルカリフォスファターゼ処理し脱リン酸化を行っ
た。この２つのフラグメントとプライマーとともに、
１００℃、５ｍ１ｎ処理後、３０℃、３ｍ１ｎ、４℃、
３０ｍ１ｎと放置し、アニーリングを行い、１２℃、
１２時間テｄｘＴＰ（Ｘ−Ｇ、Ａ、〒、Ｃ） とＫｌ
ｅｎｏｗフラグメント（大腸菌ボリメレース）と〒４−
リガーゼの存在下、反応させ、二重鎖を作成する。
ヌクレオチド（プライマーとして）を用いた０合成オリ
ゴヌクレオチドは、 ＡＢＩ社の自動ＤＮＡ合成装置
で合成し、高速液体クロマトグラフィーで精製し、Ｔ４
−キナーゼで末端リン酸化を行い用いた。プラスミドｐ
ＡＱ４４０のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄｍフラグメントとＡ
ａｔ ＩＩフラグメントを用い、Ａａｔ Ｕフラグメン
トはアルカリフォスファターゼ処理し脱リン酸化を行っ
た。この２つのフラグメントとプライマーとともに、
１００℃、５ｍ１ｎ処理後、３０℃、３ｍ１ｎ、４℃、
３０ｍ１ｎと放置し、アニーリングを行い、１２℃、
１２時間テｄｘＴＰ（Ｘ−Ｇ、Ａ、〒、Ｃ） とＫｌ
ｅｎｏｗフラグメント（大腸菌ボリメレース）と〒４−
リガーゼの存在下、反応させ、二重鎖を作成する。
生成したプラスミド二重鎖を常法によりＥ、ｃｏｌｉに
トランスフォーメーションを行い、それぞれの変異源プ
ライマーをプローブとして変異体プラスミド（ｐＡＱ４
４０の変異体）をコロニーハイブリタイゼーションによ
りスクリーニングを行い、変異体の確認は、１ａｔｔｏ
ｒｉ ら（Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ。
トランスフォーメーションを行い、それぞれの変異源プ
ライマーをプローブとして変異体プラスミド（ｐＡＱ４
４０の変異体）をコロニーハイブリタイゼーションによ
りスクリーニングを行い、変異体の確認は、１ａｔｔｏ
ｒｉ ら（Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ。
１５２２３２−２３８．１９８８）ｃ７）ｄｉｄｅｏｘ
７法により、塩基配列を決定し、変異塩基の検出を行っ
た。
７法により、塩基配列を決定し、変異塩基の検出を行っ
た。
２）種々の変異エクオリン遺伝子を用いて大腸菌内での
産生 変異ｐＡＱ４４Ｇ遺伝子のＨｉｎｄｍ−瞼Ｒ夏のｃＤＮ
Ａフラグメント断片を ｌａｃのプロモーターを有する
プラスミドｐＵｃ９−２のＨｉｎｄｍ−瞼Ｒ１部分にク
ローニングを行い、大腸菌）１８１０１（Ｄ１２１０ｉ
Ｑ）株にトランスフォーメーションを行い、発現誘導体
ＩＰＴＯにより大腸菌内で産生させた。
産生 変異ｐＡＱ４４Ｇ遺伝子のＨｉｎｄｍ−瞼Ｒ夏のｃＤＮ
Ａフラグメント断片を ｌａｃのプロモーターを有する
プラスミドｐＵｃ９−２のＨｉｎｄｍ−瞼Ｒ１部分にク
ローニングを行い、大腸菌）１８１０１（Ｄ１２１０ｉ
Ｑ）株にトランスフォーメーションを行い、発現誘導体
ＩＰＴＯにより大腸菌内で産生させた。
すなわち、変異遺伝子を含むｐｕｃｓ−２プラスミドの
１２時間培養菌体の１／１００量を５０ｍｇ／ｍｌのア
ンピシリンを含む１０■皇のＬ−ｂｒｏｔｈ培地に添加
後。
１２時間培養菌体の１／１００量を５０ｍｇ／ｍｌのア
ンピシリンを含む１０■皇のＬ−ｂｒｏｔｈ培地に添加
後。
３７℃で２時間培養し、ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭにな
るように添加し、さらに３７℃で２時間培養後、集菌を
行い、該菌体を５鵬文のＭ３塩溶液で洗節する。この洗
浄物を１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む２．５ｍＭの２０ｇ）
！ Ｔｒｉｓ−ＭＣＩバッファー（ＰＨ７，１３）に溶
解させた後、超音波処理（６０秒）で菌体を破壊し、
１０．００Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離後、上清を測定
酵素液として用いた。
るように添加し、さらに３７℃で２時間培養後、集菌を
行い、該菌体を５鵬文のＭ３塩溶液で洗節する。この洗
浄物を１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む２．５ｍＭの２０ｇ）
！ Ｔｒｉｓ−ＭＣＩバッファー（ＰＨ７，１３）に溶
解させた後、超音波処理（６０秒）で菌体を破壊し、
１０．００Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離後、上清を測定
酵素液として用いた。
測定方法は、該酵素溶液１層文に基質セレンテラジン８
ｇｇおよび２−メルカプトエタノール１０ｇＪＬを添加
あるいは２−メルカプトエタノール１０濤交を未添加の
後、氷上で２〜３時間放置し、光電管測定装置中の反応
セル中に移し、さらに２０５Ｍ ＣａＣ１ｚ１．５ｍＭ
を注入することにより、生成する発光を測定した。
ｇｇおよび２−メルカプトエタノール１０ｇＪＬを添加
あるいは２−メルカプトエタノール１０濤交を未添加の
後、氷上で２〜３時間放置し、光電管測定装置中の反応
セル中に移し、さらに２０５Ｍ ＣａＣ１ｚ１．５ｍＭ
を注入することにより、生成する発光を測定した。
結果を表２に示した。
表１．塩基特異的変異法に用いた合成オリゴヌクレオチ
ド（プライマー）と変異位置 表２．大１ｙＡ菌で産生した変異エクオリンの可成（２
−メルカプトエタノールの添加の効果）註、ここで１０
０％は３．ＯＸ １０−９・光量子７秒Ｃ１＋２３は
１番目と２番目のシスティンをセリンへと変換した変異
体。
ド（プライマー）と変異位置 表２．大１ｙＡ菌で産生した変異エクオリンの可成（２
−メルカプトエタノールの添加の効果）註、ここで１０
０％は３．ＯＸ １０−９・光量子７秒Ｃ１＋２３は
１番目と２番目のシスティンをセリンへと変換した変異
体。
Ｃ２＋３３は ２番目と３番目のシスティンをセリンへ
と変換した変異体。
と変換した変異体。
Ｃ３＋ｌＳは ３番目と１番目のシスティンをセリンへ
と変換した変異体。
と変換した変異体。
Ｃ１＋２＋３３は １番目と２番目と３番目のシスティ
ンをセリンへと変 換した変異体。
ンをセリンへと変 換した変異体。
第１図は１本発明の実施例に係る塩基特異的変異法を示
す。 以上
す。 以上
Claims (1)
- （１）エクオリン遺伝子ｐＡＱ４４０の下記塩基配列に
おいて、 【遺伝子配列があります】 （ア）〜（ニ）に示すいづれかの塩基かつ所定の他の塩
基に変換されてなる変異遺伝子。 （ア）６５９番目の塩基Ｇおよび、５９０番目の塩基Ｇ
がそれぞれＣに変換されている。 （イ）５９０番目の塩基Ｇおよび、６７４番目の塩基Ｇ
がそれぞれＣに変換されている。 （ハ）６７４番目の塩基Ｇおよび、５６９番目の塩基Ｇ
がそれぞれＣに変換されている、もしくは（ニ）５６９
番目の塩基Ｇ、５９０番目の塩基Ｇおよび、６７４番目
の塩基ＧがそれぞれをＣに変換されている。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12637487A JPS63291586A (ja) | 1987-05-23 | 1987-05-23 | 変異型エクオリン遺伝子 |
| US07/105,602 US5093240A (en) | 1986-10-15 | 1987-10-08 | Variant aequorin genes and process for producing variant aequorin proteins |
| EP87115044A EP0264819B1 (en) | 1986-10-15 | 1987-10-14 | Variant aequorin genes and process for producing variant aequorin proteins |
| DE8787115044T DE3776857D1 (de) | 1986-10-15 | 1987-10-14 | Aequoringen-varianten und verfahren zur herstellung von entsprechenden aequorinproteinen. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12637487A JPS63291586A (ja) | 1987-05-23 | 1987-05-23 | 変異型エクオリン遺伝子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63291586A true JPS63291586A (ja) | 1988-11-29 |
| JPH0513629B2 JPH0513629B2 (ja) | 1993-02-23 |
Family
ID=14933588
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12637487A Granted JPS63291586A (ja) | 1986-10-15 | 1987-05-23 | 変異型エクオリン遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS63291586A (ja) |
-
1987
- 1987-05-23 JP JP12637487A patent/JPS63291586A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0513629B2 (ja) | 1993-02-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Illarionov et al. | Recombinant obelin: Cloning and expression of cDNA, purification, and characterization as a calcium indicator | |
| JP2655981B2 (ja) | アポエクオリンをコードするヌクレオチド配列、該配列を含む組換えベクター及び該ベクターを含む組換え微生物 | |
| Jiang et al. | Escherichia coli endonuclease VIII: cloning, sequencing, and overexpression of the nei structural gene and characterization of nei and nei nth mutants | |
| US5660980A (en) | Methods for identifying and isolating variant T4 DNA polymerases | |
| US5093240A (en) | Variant aequorin genes and process for producing variant aequorin proteins | |
| EP1041151B1 (en) | Luciferase and method for assaying intracellular atp by using the same | |
| JP2003135084A (ja) | ウオークスルー突然変異誘発 | |
| JP4639904B2 (ja) | 蛍光活性を有するルシフェラーゼの活性増強方法 | |
| JPH08510387A (ja) | 突然変異体ルシフェラーゼ | |
| Qi et al. | Structure-function relationship of bacterial prolipoprotein diacylglyceryl transferase: functionally significant conserved regions | |
| Lee et al. | Identification of four novel mutations in the CYP21 gene in congenital adrenal hyperplasia in the Chinese | |
| EP0303817B1 (en) | A process for preparing a calcium-dependent oxygenase | |
| Knappskog et al. | Tryptophan fluorescence of human phenylalanine hydroxylase produced in Escherichia coli | |
| JP6691558B2 (ja) | 改善された活性を持つ新規のｐ４５０−ｂｍ３バリアント | |
| Stone et al. | Purification and partial amino acid sequence of a high‐activity human stomach alcohol dehydrogenase | |
| EP0245093B1 (en) | Method for detecting metals | |
| KR102018248B1 (ko) | 생물발광 강도가 증폭된 변이 가우시아 루시퍼라아제 | |
| JPH0956383A (ja) | 変異型ウリカーゼ、変異型ウリカーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及び変異型ウリカーゼの製造法 | |
| JP7094655B2 (ja) | アニオン性界面活性剤耐性が向上したアマドリアーゼ | |
| JPS63291586A (ja) | 変異型エクオリン遺伝子 | |
| JP3694181B2 (ja) | 変異型ルシフェラーゼ、変異型ルシフェラーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及び変異型ルシフェラーゼの製造法 | |
| JPH10114794A (ja) | ルシフェリンの再生に係わる蛋白質 | |
| EP0302381B1 (en) | A fused gene having aequorin gene linked to a functional B-galactosidase gene | |
| JPS63291593A (ja) | 変異型エクオリン蛋白の製造法 | |
| JPS6398387A (ja) | 変異型エクオリン遺伝子 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080223 Year of fee payment: 15 |