WO2019117612A1 - 대사공학적으로 조작된 미생물을 이용한 헴의 세포외 생산방법 - Google Patents

대사공학적으로 조작된 미생물을 이용한 헴의 세포외 생산방법 Download PDF

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이상엽
자오신루이
최경록
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한국과학기술원
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    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/182—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system

Definitions

  • the present invention relates to a microorganism variant having an extracellular ability to produce heme, and more particularly, to a microorganism variant having an extracellular ability to produce a metabolically engineered heme and a method for producing heme using the same.
  • Heme is a porphyrin derivative composed of iron ion (Fe 2+ ) and protoporphyrin, transporting oxygen, eliminating reactive oxygen species, found in most prokaryotic and eukaryotic cells, It is a complexity that plays a role in generating energy. Heme is widely used as a bioavailable iron supplier in the health care and nutritional supplement industry. In particular, hemin is an oxidized form of heme derivative containing a trivalent iron ion (Fe 3+ ) with a chloride ligand, and is used for the treatment of acute intermittent porphyria. Thus, the demand for heme is increasing. Thus, efficient production of heme has been of great interest for decades.
  • Heme is an essential compound in almost all microorganisms, but when present in high concentrations, it causes toxicity in various microorganisms (Anzaldi et al., Infect . Immun . 78, 4977-4989, 2010). Some microorganisms actively transport toxic metabolites generated by heme or heme accumulation outside cells to obtain heme resistance. In Escherichia coli, the gene ccmABC encoding heme exporter, which secretes free heme synthesized in the cell into the surrounding cytoplasm and supplies heme to proteins involved in cytochrome c biosynthesis, is known (Feissner et al. Mol. Microbiol . 61: 219-231, 2006).
  • ALA 5-aminolevulinate
  • Fig. 1 Layer G. et al., Protein Sci . 19: 1137-1161, 2010
  • GluRS glutamyl-tRNA synthetase
  • GluTR glutamyl-tRNA reductase
  • glutamate- It has a C5 pathway that converts L-glutamate to ALA through a series of reactions catalyzed by 1-semialdehyde 2,1-aminomutase (GSAM).
  • GluRS glutamyl-tRNA synthetase
  • GluTR glutamyl-tRNA reductase
  • GSAM 1-semialdehyde 2,1-aminomutase
  • PBG porphobilinogen synthase
  • HMB 1-hydroxymethylbutane
  • PBGD porphobilinogen deaminase
  • UROS Uroporphyrinogen III synthase
  • UROD uroporphyrinogen III decarboxylase
  • CPO coproporphyrinogen III oxidase
  • PPO protoporphyrinogen oxidase
  • FECH ferro chelates
  • E. coli was coexpressed with the hemA gene (hemARsp) from Rhodobacter sphaeroides encoding ALAS, endogenous maeB encoding NADP-dependent malate dehydrogenase and endogenous dctA encoding a dicarboxylate transporter.
  • This strain produced 6.4 mg / L heme in LB medium supplemented with 10 g / L succinic acid and 2 g / L glycine (Kwon OH et al., J. Microbiol. Biotechnol . 19: 604-609, 2009).
  • the heme could be produced by the recombinant E. coli strain described above, the yield of the final heme was very low, and free heme secretion outside the cell has not been reported.
  • the low yields of heme in these studies are mainly due to the use of the metabolic pathway rather than the optimal pathway to supply heme precursors for heme biosynthesis.
  • the addition of L-glycine and succinic acid is not desirable for large-scale production.
  • the present inventors have made extensive efforts to develop mutants capable of secreting extracellular secretion by producing heme at a high yield. As a result, the present inventors have found that the C5 pathway and the heme, which can increase the production of 5-aminolevulinic acid as a precursor of heme in E. coli, It was confirmed that the mutant overexpressing the biosynthetic pathway not only produced heme at a higher yield than that of the existing heme-producing strains but also produced heme extracellularly, and further overexpressed ccmABC, a gene for secreting heme, The production amount was further improved, and the free heme secretion outside the cell was further improved. Thus, the present invention was completed.
  • the present invention provides a microorganism having a gene involved in a biosynthetic pathway for producing 5-aminolevulinic acid (ALA) and a gene involved in a pathway for synthesizing heme from ALA, exporter) is overexpressed.
  • the present invention provides a microorganism variant capable of secreting heme into a cell.
  • the present invention also provides a method for producing microorganisms, comprising: (a) culturing the microorganism variant to produce heme; And (b) obtaining the resulting heme.
  • FIG. 1 shows a biosynthetic pathway for heme production according to the present invention.
  • the items in bold indicate those genes overexpressed in the HEME7 strain according to the present invention.
  • Figure 3 shows ALA and heme production by flask culture of HEME1, HEME2, HEME3, HEME4, HEME5 and HEME6 according to the present invention.
  • FIG. 4 shows heme production by flask culture using TB, TB-Fe7.5, LB, LB-Fe7.5, MR-Fe0 and MR-Fe7.5 medium of HEME6 according to the present invention.
  • FIG. 5 shows heme production by flask culture according to different concentrations of FeSO 4 7H 2 O on the medium used for culturing the HEME6 strain according to the present invention.
  • FIG. 6 shows heme production by flask culture according to different culture temperatures of HEME6 strain according to the present invention.
  • Figure 7 shows the yield of heme by batch culture of HEME6 strain according to the present invention.
  • Heme is a complex salt that is widely used in the health care and food supplements industry. It is produced through chemical synthesis, organic matter extraction or enzymatic hydrolysis. However, it is complex and has low yield, so it can produce heme with high yield using microorganisms. Escherichia coli mutants were prepared. In addition, E. coli mutants which secrete the produced heme into the cells were produced by secreting the produced free heme to the outside of the cell to facilitate the recovery of the free heme.
  • Heme is an essential compound for microorganisms, but when it is present in high concentrations, some microorganisms acquire heme resistance by actively transporting toxic metabolites accumulating due to heme or heme accumulation outside the cell.
  • the gene ccmABC encoding a heme exporter that supplies heme to proteins involved in the biosynthesis of cytochrome c has been known (Feissner et al., Mol. Microbiol . 61: 219-231, 2006) , It has not been reported whether the gene is involved in toxicity resistance due to free heme.
  • the present inventors increased the biosynthesis of free heme, thereby promoting the secretion of extracellular heme by the heme exorporant expressed from the ccmABC gene, thereby determining that extracellular free heme production would be possible.
  • E. coli-derived heme mutants were designed to produce heme through 5-aminolevulinic acid, which provides C4 pathway with L-glycine and succinic acid feed, but the final heme production yield was very low.
  • the present inventors produced an engineered E. coli strain using the C5 pathway which converts L-glutamate to 5-aminolevulinic acid.
  • Various strategies were used to produce heme production in E. coli (Fig. 2).
  • the present invention provides a method for producing a 5-aminolevulinic acid (ALA) -containing microorganism having a gene involved in a pathway for synthesizing heme from ALA and a gene involved in a biosynthetic pathway,
  • the present invention relates to a microorganism variant capable of secreting a heme outside the cell characterized by overexpression of the gene.
  • ALA 5-aminolevulinic acid
  • a microorganism having a gene involved in a biosynthetic pathway for producing 5-aminolevulinic acid (ALA) and a gene involved in a pathway for synthesizing heme from ALA is not only a microorganism having the genes as a wild type, And the like.
  • the microorganism variant may be characterized in that a gene involved in a biosynthetic pathway for producing 5-aminolevulinic acid (ALA) and a gene involved in a pathway for synthesizing heme from ALA are overexpressed.
  • ALA 5-aminolevulinic acid
  • the precursor 5-aminolevulinate is required, and C4 pathway and C5 pathway exist in the ALA biosynthetic pathway.
  • C4 pathways and C5 pathways exist in the ALA biosynthetic pathway.
  • the invention is the first to apply the C5 pathway to mutants for biosynthesis of heme.
  • the microorganism may be a microorganism capable of producing glutamic acid from a carbon source, but is not limited thereto.
  • microbial variants having a C4 pathway and a C5 pathway were produced and their heme production ability was confirmed in order to produce microbial mutants having high productivity of heme.
  • Microbial strains usable in the present invention include bacteria, yeast, yeast, fungi, protozoans (Hemicellidae, Amebiae, Rhodiola, Rhodiola, Cromalba rata), animal cells, microalgae, , More preferably Escherichia coli, Bacillus sp., Corynebacterium sp., Lactobacillus sp., Lactococcus sp., Pseudomonas sp., Anacystis sp., Anabena sp., Chlorobium sp., Chloroflexus sp., Clostridium sp., Methanobacterium , Propionibacterium sp., Rhodopsueomonas sp., Rhodobacter sp., Rhodovulum sp., Streptococcus sp., Saccharomyces sp., Schizosaccharo
  • the gene involved in the biosynthetic pathway is a C5 glutamyl gltX -tRNA synthetase, glutamyl encrypting (GluRS) -tRNA reductase (GluTR) hemA and glutamate-1-semi-aldehyde 2 to encrypt, and hemL coding for the 1-amino-rise myute (GSAM), genes involved in the synthesis of heme path from the ALA is included reportage Billy cyanogen hemB, coding for reportage Four synthase (PBGS) Billy cyanogen dia laminate rise (PBGD ) the hemC, right formate flutes cyanogen III synthase (hemD, right formate flutes cyanogen III dicarboxylic raised (Fort flutes cyanogen III oxy Days (CPO) to hemE, Corp.
  • PBGS bar cyanogen dia laminate rise
  • hemC right formate flutes cyanogen III synthase
  • encrypting UROD) coding for UROS coding for in that the coding for the encryption hemF, hemG protoporphyrinogen oxy Days and ferro keel urethane rise (FECH) coding for the (PPO) that hemH may be characterized.
  • the mutant may be characterized in that a gene encoding a heme exporter is overexpressed.
  • the mutant may be characterized in that the gene coding for the heme or heme intermediate decomposing enzyme is deleted, and the gene coding for the heme or heme intermediate decomposing enzyme is the yfeX gene .
  • genes encoding the heme biosynthetic pathway are overexpressed in the Escherichia coli introduced with the C5 pathway, the vector used for the expression of each enzyme is optimized, the genes involved in the production of acetic acid and lactic acid are deleted, In the case of E. coli mutants deficient in the controversial yfeX gene involved in the degradation of heme, 7.13 mg / L heme in LB medium supplemented with 7.5 mg / L FeSO 4 7H 2 O Respectively.
  • Another aspect of the present invention relates to a mutant in which the yfeX gene is deleted in a microorganism overexpressing the C4 pathway of ALA.
  • E. coli mutant strain prepared above when the E. coli mutant strain prepared above was cultured in an MR culture medium to which 5 g / L yeast extract was added and FeSO 4 7H 2 O concentration was adjusted to 7.5 mg / L, 7.45 mg / L heme was produced.
  • the culture time and temperature were optimized to induce protein overexpression by IPTG. After incubation at 30 °C for 60 hours, 7.78 mg / L heme was produced.
  • the batch fermentation was carried out using the E. coli mutant and the optimization conditions according to the present invention, resulting in a total of 14.24 mg / L of heme at 56 hours of culture, 8.29%) of heme was identified extracellularly.
  • fed-batch culture of the E. coli mutant according to the present invention produced 49.18 mg / L of heme at 56 hours, 16.77 mg / L (34.10%), Of heme was identified outside the cell.
  • the present invention provides a method for producing 5-aminolevulinic acid (ALA) comprising overexpressing a gene involved in a C5 biosynthetic pathway and a gene involved in a pathway for synthesizing heme from ALA, ) Is overexpressed so that microbe mutants capable of secreting heme can be cultured and cultured to produce heme; And a process for producing the heme, which comprises the step of obtaining the produced heme.
  • ALA 5-aminolevulinic acid
  • the strain overexpressing the ccmABC gene coding for heme export in the heme-producing mutant E. coli strain was cultured in a fed- batch manner under the condition of (NH 4 ) 2 SO 4 , L of heme, and 71.91 mg / L (62.64%) of heme was identified extracellularly.
  • the strains of the present invention were cultured under the condition of glutamate addition, and as a result, 246.69 mg / L of heme was produced at 72 hours after the culture, and 164.12 mg / L (66.53% Was confirmed outside the cell.
  • heme was produced at 114.79 mg / L or 246.69 mg / L according to whether the precursor was added in the present example, and the existing heme-producing E. coli mutant was 6.4 mg / L Of heme, respectively, as compared with the yield of 17.9 times or 38.5 times.
  • restriction enzymes used in this example and the following examples were purchased from New England Biolabs (USA) and Enzynomics (Korea), the PCR polymerase was BIOFACT (Korea), and the DNA ligase was purchased from Elpis Biotech (Korea) . Other things are indicated separately.
  • Example 1 Selection of ALA biosynthetic pathway for high efficiency heme production
  • the vector pRSF-C4 capable of expressing the C4 ALA biosynthetic gene is derived from the gene ( hemA Rsp ) of aminolevulinic acid synthase (ALAS) derived from Rhodobacter sphaeroides 2.4.1 and E. coli in the pRSFDuet-1 vector (Novagen, USA) One maeB and coaA genes were inserted.
  • the hemA Rsp gene SEQ ID NO: 1
  • the maeB (SEQ ID NO: 4) and coaA gene (SEQ ID NO: 5) derived from E. coli were obtained by using the genomic DNA of E. coli BL21 (DE3) as a template and using primers of SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: And the primers of SEQ ID NO: 9.
  • the sequence of RBS was added to the 5 'end of the amplified coaA gene by the sequence of the ribosome binding site (RBS) contained in the primer of SEQ ID NO: 7 used in the amplification.
  • RBS ribosome binding site
  • the amplified sequences were sequentially inserted into pRSFDuet-1 vector (Novagen, USA), which was digested with Bgl II and Xho I, Sac I and Sal I, and Nco I and Eco R I and digested with the same restriction enzymes, -C4 was prepared.
  • C5-C5 pRSF ALA vector capable of expressing the biosynthetic gene is inserted into a gltX (SEQ ID NO: 10), hemL (SEQ ID NO: 11) and negative feedback resistance hemA (fbr hemA) gene (SEQ ID NO: 12) derived from E. coli Respectively.
  • SEQ ID NO: 10 gltX
  • hemL SEQ ID NO: 11
  • fbr hemA negative feedback resistance hemA gene derived from E. coli Respectively.
  • Each gene was amplified by PCR using the genomic DNA of E. coli BL21 (DE3) as a template and using the primers of SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14, the primers of SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16, and the primers of SEQ ID NO: Respectively.
  • the sequence of RBS was added to the 5 'end of the amplified hemL gene by the sequence of the ribosome binding site (RBS) contained in the primer of SEQ ID NO: 15 used in the amplification.
  • the BL21 (DE3) -derived hemA gene was converted to the negative feedback-resistant hemA ( hemA fbr ) by the nucleotide sequence encoding threonine and leucine contained in the primer of SEQ ID NO:
  • the amplified gltX , hemA fbr , and hemL gene sequences were digested with Nde I, Xho I, Nco I and BamH I, Sac I and Not I, and then digested with the same restriction enzymes into pRSFDuet-1 vector (Novagen, USA) followeded by sequential insertion to finally produce pRSF-C5.
  • the strain described in Table 3 was inoculated into 5 mL of LB medium (10 g / L NaCl, 10 g / L tryptone , 5 g / L yeast extract) supplemented with 25 ⁇ g / mL kanamycin and cultured at 37 ° C. and 220 rpm for 12 hours .
  • 1 mL of the culture medium in which the cultured cells grew was inoculated in 50 mL of the same fresh medium, and then in a 250-mL Erlenmeyer flask until the OD 600 reached about 0.6, 200 rpm. After the addition of 1 mM IPTG, the cells were cultured at 30 ° C and 200 rpm for 48 hours.
  • Example 2 Production of heme-producing strain introduced with C5 ALA biosynthetic pathway
  • Enzymes expressed from hemB, hemC, hemD, hemE, hemF, hemG, and hemH genes are required to produce heme from ALA produced through the ALA biosynthetic pathway ( Figure 1). Since E. coli inherently possesses the above gene, wild type strain can produce heme but only heme is produced as necessary for survival. Thus, most of the produced heme exists in a form associated with protein, and free heme is detected in wild type strain It is difficult to do. Therefore, in order to produce free heme, overexpression of the gene should increase the flow of metabolism involved in the production of heme from ALA. However, overexpression of all of the genes may overload the metabolism of heme-producing strains due to excessive over- .
  • the vector pET-hemBH which does not interfere with the plasmid overexpressing the two genes and over-expressing the C5 ALA biosynthetic pathway, was constructed through the following procedure.
  • the primers of SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22 and the primers of SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 were used to amplify the hemB and hemH genes from the genomic DNA of E. coli BL21 (DE3)
  • the amplified sequences were digested with NdeI and XhoI and inserted into pETDuet-1 vector (Novagen, USA), which was digested with the same restriction enzymes, to construct pET-hemB and pET-hemH.
  • the hemB gene was amplified from the genomic DNA of E. coli strain BL21 (DE3) using the primers of SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26, and the amplified sequences were digested with Nco I and BamH I, -hemH vector to finally construct pET-hemBH.
  • E. coli C5-B, C5-H and C5-BH strains were prepared by introducing pET-hemB, pET-hemH and pET-hemBH, respectively, into recombinant E. coli strain C5 (Table 6).
  • LB-Fe7.5 medium (10 g / L NaCl, 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract, 7.5 mg / L yeast extract) containing the same antibiotics was added to 1 mL of the cultured medium, L FeSO 4 7H 2 O), and then cultured in a 250-mL Erlenmeyer flask at 37 ° C and 200 rpm until an OD 600 of about 0.6 was reached. After the addition of 1 mM IPTG, the cells were cultured at 30 ° C and 200 rpm for 48 hours.
  • the C5-BH strain produced ueporphyrinogen III and coproporphyrinogen III, which are heme biosynthetic intermediates (Table 7).
  • a smaller amount of ALA was found in C5-BH compared to C5-B and C5-H.
  • free heme could not be detected in all three strains described in Table 6.
  • Heme biosynthesis genes other five genes except hemB and hemH gene of (hemC (SEQ ID NO: 27), hemD heme of (SEQ ID NO: 28), hemE (SEQ ID NO: 29), hemF (SEQ ID NO: 30), hemG (SEQ ID NO: 31)
  • hemC SEQ ID NO: 27
  • hemD heme of SEQ ID NO: 28
  • hemE SEQ ID NO: 29
  • hemF SEQ ID NO: 30
  • hemG SEQ ID NO: 31
  • Plasmids pCDF-hemC, pCDF-hemD, pCDF-hemE, pCDF-hemF and pCDF-hemG were prepared by the following procedure.
  • SEQ ID NO: 32 and SEQ ID NO: 33 primers of SEQ ID NO: 34 and SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 34 and SEQ ID NO: 35, respectively, in order to amplify hemC, hemD, hemE, hemF and hemG genes from the genomic DNA of E. coli BL21 36 and SEQ ID NO: 37, the primers of SEQ ID NO: 38 and SEQ ID NO: 39, and the primers of SEQ ID NO: 40 and SEQ ID NO: 41 were used.
  • the amplified sequence was cleaved with Nco I and BamH I, Nco I and BamH I, Nco I and Eco R I, Nco I and Bam H I, and Nco I and Sac I, and then digested with the same restriction enzymes pCDFDuet-1 vector , PCDF-hemD, pCDF-hemE, pCDF-hemF, and pCDF-hemG were constructed.
  • the prepared one pCDF-hemC, pCDF-hemD, pCDF-hemE, by each introducing a pCDF-hemF and pCDF-hemG the recombinant E. coli strain BH-C5 E. coli C5-BCH, C5- BDH, C5-BEH, C5-BFH and C5-BGH strains were prepared (Table 9).
  • LB-Fe7.5 medium (10 g / L NaCl, 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract, 7.5 mg / L yeast extract) containing the same antibiotics was added to 1 mL of the cultured medium, L FeSO 4 7H 2 O), and then cultured in a 250-mL Erlenmeyer flask at 37 ° C and 200 rpm until OD 600 reached about 0.6. After the addition of 1 mM IPTG, the cells were cultured at 30 ° C and 200 rpm for 48 hours.
  • Heme biosynthetic intermediates include, but make use of the same samples as those used for heme production check, and using the old method using the HPLC-MS (Pranawidjaja et al, J. Microbiol Biotechnol 25, 880-886, 2015;... Bu et al J. Chromatogr B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci . 783, 411-423, 2003).
  • the C5-BGH strains did not reveal any significant differences in ALA and heme biosynthetic intermediates production compared to the C5-BH strain (Table 7) (Table 10).
  • the C5-BH strain wish to reaffirm that the overexpression of hemG essential for Heme production hemC, hemD, hemE and a strain HEME1 and based on the C5-BH strains that overexpress hemF gene hemC, hemD, hemE, hemF and The strain HEME2, which overexpresses all of the hemG genes, was constructed by the following procedure.
  • the hemC, hemD, hemE and plasmid pCDF-hemCDEF to overexpress hemF gene was prepared by the following procedure.
  • E. coli BL21 (DE3) in order from the genomic DNA of the strain amplifying hemC, hemD, hemE and hemF gene are shown in SEQ ID No. 42 and the primer of SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44 and a primer of SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46 and SEQ ID NO: Primers of SEQ ID NO: 47 and SEQ ID NO: 49 were used.
  • the sequence of the RBS was added to the 5 'end of SEQ ID NO: 44 and SEQ ID NO: The amplified hemD hemF gene and by the sequence of the ribosome binding site (RBS) contained in the 48 primers used in the amplification process.
  • RBS ribosome binding site
  • the amplified sequence was sequenced to pCDFDuet-1 vector (Novagen, USA) which had been digested with Nde I and Bgl II, Bgl II and Xho I, Nco I and Sac I, Sac I and Pst I and then digested with the same restriction enzymes To construct pCDF-hemCDEF.
  • the plasmid pCDF-hemCDEFG over-expressing the hemC, hemD, hemE, hemF and hemG genes was constructed as follows.
  • the primers of SEQ ID NO: 50 and SEQ ID NO: 51 were used to amplify the hemG gene from the genomic DNA of the E. coli BL21 (DE3) strain. At this time, the sequence of RBS was added to the 5 'end of the amplified hemG gene by the sequence of the ribosome binding site (RBS) contained in the primer of SEQ ID NO: 50 used in the amplification.
  • RBS ribosome binding site
  • the amplified sequence was digested with Pst I and Not I and inserted into pCDF-hemCDEF vector digested with the same restriction enzymes to finally prepare plasmid pCDF-hemCDEFG.
  • the pCDF-hemCDEF and pCDF-hemCDEFG prepared above were introduced into the recombinant E. coli C5-BH strain, respectively, to produce E. coli HEME1 and HEME2 strains (FIG. 2C and Table 13).
  • the strains disclosed in Table 13 were inoculated into 5 mL of LB medium (10 g / L NaCl (100 ⁇ g / mL) containing 25 ⁇ g / mL kanamycin, 50 ⁇ g / mL ampicillin and 100 ⁇ g / mL streptomycin , 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract) and cultured at 37 ° C and 220 rpm for 12 hours.
  • LB medium 10 g / L NaCl (100 ⁇ g / mL) containing 25 ⁇ g / mL kanamycin, 50 ⁇ g / mL ampicillin and 100 ⁇ g / mL streptomycin , 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract
  • LB-Fe7.5 medium (10 g / L NaCl, 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract, 7.5 mg / L Lactobacillus acidophilus) supplemented with the same antibiotics FeSO 4 7H 2 O), and then cultured at 37 ° C and 200 rpm in a 250-mL Erlenmeyer flask until the OD 600 reached about 0.6. After addition of 1 mM IPTG, the cells were cultured at 30 DEG C and 200 rpm for 48 hours.
  • the ALA production amount (308 mg / L) of HEME2 produced in Example 2-1 was significantly higher than the heme production (0.53 mg / L), which was considered to be excessive in the ALA biosynthetic pathway.
  • the total amount of protein overexpressed in the strain was determined to be finite.
  • the metabolism of pathway that produces heme from relatively insufficient ALA decreased the metabolism of the ALA production pathway.
  • the primers of SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18 were used to amplify hemL and the negative feedback resistance hemA ( hemA fbr ) gene from the genomic DNA of E. coli BL21 (DE3) .
  • the sequence of RBS was added to the 5 'end of the amplified hemL gene by the sequence of the ribosome binding site (RBS) contained in the primer of SEQ ID NO: 15 used in the amplification.
  • the BL21 (DE3) -derived hemA gene was converted to the negative feedback-resistant hemA ( hemA fbr ) by the nucleotide sequence encoding threonine and leucine contained in the primer of SEQ ID NO:
  • the amplified sequences were inserted into pCDFDuet-1 vector (Novagen, USA), digested with Nco I and BamH I, Sac I and Not I, respectively, and digested with the same restriction enzymes to prepare pCDF-hemal.
  • Plasmid pRSF-hemBCD overexpressing hemB, hemC, and hemD genes based on pRSFDuet-1 was prepared by the following procedure.
  • the primers of SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26, the primers of SEQ ID NO: 42 and SEQ ID NO: 43, and the primers of SEQ ID NO: 44 and SEQ ID NO: 45 to amplify hemB, hemC and hemD genes from the genomic DNA of E. coli BL21 Primers were used.
  • the sequence of RBS was added to the 5 'end of the amplified hemD gene by the sequence of the ribosome binding site (RBS) contained in the primer of SEQ ID NO: 44 used in the amplification.
  • RBS ribosome binding site
  • the amplified sequences were sequentially inserted into pRSFDuet-1 vector (Novagen, USA), which was digested with Nco I and BamH I, Nde I and Bgl II, and Bgl II and Xho I, and digested with the same restriction enzymes, to obtain pRSF-hemBCD Respectively.
  • Plasmid pET-hemEFGH which overexpresses hemE , hemF, hemG and hemH genes based on pETDuet-1, was prepared by the following procedure.
  • the primer of SEQ ID NO: 51 and the primer of SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 were used.
  • the sequence of the RBS was added to the 5 'end of SEQ ID NO: 48 and SEQ ID NO:, and the amplified hemF gene hemG by the sequence of the ribosome binding site (RBS) contained in the 50 primers used in the amplification process.
  • RBS ribosome binding site
  • the amplified sequences were sequentially digested with pETDuet-1 vector (Novagen, USA), digested with Nco I and Sac I, Sac I and Pst I, Pst I and Not I, and Nde I and Xho I, And then pET-hemEFGH was prepared.
  • the plasmids pCDF-hemAL, pRSF-hemBCD and pET-hemEFGH prepared above were introduced into E. coli BL21 (DE3) strain to produce E. coli HEME3 strain (Fig. 2d and Table 14).
  • the strains described in Table 14 were inoculated into 5 mL of LB medium (10 g / L NaCl (100 ⁇ g / mL) containing 25 ⁇ g / mL kanamycin, 50 ⁇ g / mL ampicillin and 100 ⁇ g / mL streptomycin , 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract) and cultured at 37 ° C and 220 rpm for 12 hours.
  • LB medium 10 g / L NaCl (100 ⁇ g / mL) containing 25 ⁇ g / mL kanamycin, 50 ⁇ g / mL ampicillin and 100 ⁇ g / mL streptomycin , 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract
  • LB-Fe7.5 medium (10 g / L NaCl, 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract, 7.5 mg / L yeast extract) containing the same antibiotics was added to 1 mL of the cultured medium, L FeSO 4 7H 2 O), and then cultured in a 250-mL Erlenmeyer flask at 37 ° C and 200 rpm until OD 600 reached about 0.6. After the addition of 1 mM IPTG, the cells were cultured at 30 ° C and 200 rpm for 48 hours.
  • heme production was increased to 3.79 mg / L in the HEME3 strain compared with the HEME2 strain (0.53 mg / L) (Fig. 2d and Fig. 3).
  • heme was able to be grown by adjusting the expression level of heme biosynthetic pathway genes.
  • Example 3 Competitive metabolic circuit deletion for Heme amplification
  • Metabolic pathways competing with the heme biosynthetic pathway may be deleted for the Heme hyperproliferation.
  • the metabolic products of the process can be prevented from being converted into byproducts such as acetic acid or lactic acid. It is also possible to increase the production of heme by preventing the degradation of the generated heme.
  • the ldhA and pta genes were deleted and DNA fragments required for gene deletion were prepared using the reported ⁇ Red recombineering technique (Datsenko et al., Proc Natl Acad Sci USA 97, 6640-6645, 2000). Plasmid pECmulox (Kim et al., FEMS Microbiol. Lett. 278, 78-85, 2008) from the DNA used for deletion of the ldhA gene segments ( ⁇ ldhA :: cat) and pta to use DNA fragments for deleting the gene ( ⁇ 52 and SEQ ID NO: 53 and the primers of SEQ ID NO: 54 and SEQ ID NO: 55 were used to amplify pTA :: cat .
  • Plasmid pKD46 (Datsenko et al., Proc Natl Acad Sci USA 97, 6640-6645, 2000) was introduced into BL21 (DE3) strain to delete the ldhA gene using the prepared DNA fragment , (10 g / L NaCl, 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract) supplemented with 5 ⁇ g / mL ampicillin and incubated at 30 ° C. overnight at 200 rpm.
  • the cultured cells and the culture medium 1 mL to 50 ⁇ g / mL ampicillin and 1 mM arabinose a 100 mL LB medium after the OD 600 of about 0.6 inoculate (10g / L NaCl, 10g / L tryptone, 5g / L yeast extract) was added The cells were cultured at 30 ° C and 200 rpm until that time. The cultured cells were washed twice with 10% glycerol cooled to 0 ° C after recovery, and then resuspended in 150 ⁇ l of the same aqueous solution.
  • the colonies in which the chloramphenicol resistance gene ( cat ) was introduced with the deletion of the ldhA gene were inserted into the LB containing the chloramphenicol -agar medium (10 g / L NaCl, 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract, 15 g / L agar).
  • Plasmid pJW168 (Wild et al., Gene 223, 55-66, 1998) was introduced after the plasmid pKD46 was removed from the selected colonies at 37 ° C for colony selection and 50 ⁇ g / ml ampicillin and 1 mM IPTG (10 g / L NaCl, 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract, and 15 g / L agar) at 30 ° C to remove the chloramphenicol resistant gene ( cat ). The deletion of the ldhA gene in the prepared strain BL21 (DE3) ⁇ ldhA (Table 16) was confirmed by sequencing.
  • Plasmid pKD46 (Datsenko et al., Proc Natl Acad Sci USA 97, 6640-6645, 2000) was introduced into the BL21 (DE3) strain to delete the pta gene using the prepared DNA fragment , (10 g / L NaCl, 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract) supplemented with 5 ⁇ g / mL ampicillin and incubated at 30 ° C. overnight at 200 rpm.
  • the cultured cells and the culture medium 1 mL to 50 ⁇ g / mL ampicillin and 1 mM arabinose a 100 mL LB medium after the OD 600 of about 0.6 inoculate (10g / L NaCl, 10g / L tryptone, 5g / L yeast extract) was added The cells were cultured at 30 ° C and 200 rpm until that time. The cultured cells were washed twice with 10% glycerol cooled to 0 ° C after recovery, and then resuspended in 150 ⁇ l of the same aqueous solution.
  • the colonies in which the chloramphenicol resistance gene ( cat ) was introduced by the deletion of the pta gene were transfected with 8.5 ⁇ g / mL of chloramphenicol-containing LB -agar medium (10 g / L NaCl, 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract, 15 g / L agar).
  • Plasmid pJW168 (Wild et al., Gene 223, 55-66, 1998) was introduced after the plasmid pKD46 was removed from the selected colonies at 37 ° C for colony selection and 50 ⁇ g / ml ampicillin and 1 mM IPTG (10 g / L NaCl, 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract, and 15 g / L agar) at 30 ° C to remove the chloramphenicol resistant gene ( cat ). The deletion of the pta gene in the prepared strain BL21 (DE3) ⁇ pta ⁇ ldhA was confirmed by sequencing.
  • the plasmids pCDF-hemAL, pRSF-hemBCD and pET-hemEFGH prepared in Example 2-2 were introduced into BL21 (DE3) ⁇ pta ⁇ ldhA shown in Table 17 above to produce E. coli HEME5 strain (Table 18).
  • the strains described in Table 18 were inoculated into 5 mL of LB medium (10 g / L NaCl (50 ⁇ g / mL NaCl) supplemented with 25 ⁇ g / mL kanamycin, 50 ⁇ g / mL ampicillin and 100 ⁇ g / mL streptomycin , 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract) and cultured at 37 ° C and 220 rpm for 12 hours.
  • LB medium 10 g / L NaCl (50 ⁇ g / mL NaCl) supplemented with 25 ⁇ g / mL kanamycin, 50 ⁇ g / mL ampicillin and 100 ⁇ g / mL streptomycin , 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract
  • LB-Fe7.5 medium (10 g / L NaCl, 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract, 7.5 mg / L yeast extract) containing the same antibiotics was added to 1 mL of the cultured medium, L FeSO 4 7H 2 O), and then cultured in a 250-mL Erlenmeyer flask at 37 ° C and 200 rpm until OD 600 reached about 0.6. After the addition of 1 mM IPTG, the cells were cultured at 30 ° C and 200 rpm for 48 hours.
  • proteins expressed from the yfeX gene are heme dechelatases that remove Fe 2+ ions from the heme (Letoffe et al., Proc. Natl. Acad Sci USA 106, 11719-11724, 2009)
  • the expression product of the yfeX gene has been reported to be a peroxidase that converts porphyrinogen to porphyrin rather than heme dechelatase (Dailey et al., MBio 2, e00248-00211, 2011).
  • the DNA fragment for deletion of the yfeX gene was prepared using the ⁇ Red recombination technique (Datsenko et al., Proc Natl Acad Sci USA 97, 6640-6645, 2000).
  • ⁇ yfeX To amplify the DNA fragment ( ⁇ yfeX :: cat ) to be used for deletion of the ldhA gene from the plasmid pECmulox (Kim et al., FEMS Microbiol. Lett. 278, 78-85, 2008), SEQ ID NO: 56 and SEQ ID NO: 57 Primers were used.
  • Plasmid pKD46 (Datsenko et al., Proc Natl Acad Sci USA 97, 6640-6645, 2000) was introduced into BL21 (DE3) strain to delete the yfeX gene using the prepared DNA fragment , (10 g / L NaCl, 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract) supplemented with 5 ⁇ g / mL ampicillin and incubated at 30 ° C. overnight at 200 rpm.
  • the cultured cells and the culture medium 1 mL to 50 ⁇ g / mL ampicillin and 1 mM arabinose a 100 mL LB medium after the OD 600 of about 0.6 inoculate (10g / L NaCl, 10g / L tryptone, 5g / L yeast extract) was added The cells were cultured at 30 ° C and 200 rpm until that time. The cultured cells were washed twice with 10% glycerol cooled to 0 ° C after recovery, and then resuspended in 150 ⁇ l of the same aqueous solution.
  • the colonies into which the chloramphenicol resistance gene (cat) was introduced with deletion of the yfeX gene were inserted into LB containing 8.5 ⁇ g / mL chloramphenicol -agar medium (10 g / L NaCl, 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract, 15 g / L agar).
  • Plasmid pJW168 (Wild et al., Gene 223, 55-66, 1998) was introduced after the plasmid pKD46 was removed from the selected colonies at 37 ° C for colony selection and 50 ⁇ g / ml ampicillin and 1 mM IPTG (10 g / L NaCl, 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract, and 15 g / L agar) at 30 ° C to remove the chloramphenicol resistant gene ( cat ). The deletion of the yfeX gene in the prepared strain BL21 (DE3) ⁇ yfeX (Table 20) was confirmed by sequencing.
  • the plasmids pCDF-hemAL, pRSF-hemBCD and pET-hemEFGH prepared in Example 2-2 were introduced into BL21 (DE3) ⁇ yfeX disclosed in Table 20 above to produce E. coli HEME4 strain (Table 21).
  • the strains described in Table 21 were inoculated into 5 mL of LB medium (10 g / L NaCl (100 ⁇ g / mL) containing 25 ⁇ g / mL kanamycin, 50 ⁇ g / mL ampicillin and 100 ⁇ g / mL streptomycin , 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract) and cultured at 37 ° C and 220 rpm for 12 hours.
  • LB medium 10 g / L NaCl (100 ⁇ g / mL) containing 25 ⁇ g / mL kanamycin, 50 ⁇ g / mL ampicillin and 100 ⁇ g / mL streptomycin , 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract
  • LB-Fe7.5 medium (10 g / L NaCl, 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract, 7.5 mg / L yeast extract) containing the same antibiotics was added to 1 mL of the cultured medium, L FeSO 4 7H 2 O), and then cultured in a 250-mL Erlenmeyer flask at 37 ° C and 200 rpm until OD 600 reached about 0.6. After the addition of 1 mM IPTG, the cells were cultured at 30 ° C and 200 rpm for 48 hours.
  • the strain HEME5 (4.17 mg / mL heme) in which the pta and ldhA genes were deleted and the strain HEME4 (6.21 mg) in which the yfeX gene was deleted were compared with the HEME3 strain (3.79 mg / / mL heme). Therefore, when the gene deletion strategies of Examples 3-1 and 3-2 were used together, a strain in which all three genes were deleted was confirmed by the following procedure to confirm whether heme could be further amplified.
  • the DNA fragment for deletion of the yfeX gene was prepared using the ⁇ Red recombination technique (Datsenko et al., Proc Natl Acad Sci USA 97, 6640-6645, 2000).
  • ⁇ yfeX To amplify the DNA fragment ( ⁇ yfeX :: cat ) to be used for deletion of the ldhA gene from the plasmid pECmulox (Kim et al., FEMS Microbiol. Lett . 278, 78-85, 2008), SEQ ID NO: 56 and SEQ ID NO: 57 Primers were used.
  • Plasmid pKD46 (Datsenko et al., Proc Natl Acad Sci USA 97, 6640-6645, 2000) was introduced into BL21 (DE3) ⁇ PL strain to delete the yfeX gene using the prepared DNA fragment , (10 g / L NaCl, 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract) supplemented with 5 ⁇ g / mL ampicillin and incubated at 30 ° C. overnight at 200 rpm.
  • the cultured cells and the culture medium 1 mL to 50 ⁇ g / mL ampicillin and 1 mM arabinose a 100 mL LB medium after the OD 600 of about 0.6 inoculate (10g / L NaCl, 10g / L tryptone, 5g / L yeast extract) was added The cells were cultured at 30 ° C and 200 rpm until that time. The cultured cells were washed twice with 10% glycerol cooled to 0 ° C after recovery, and then resuspended in 150 ⁇ l of the same aqueous solution.
  • the colonies into which the chloramphenicol resistance gene ( cat ) was introduced with deletion of the yfeX gene were inserted into LB containing 8.5 ⁇ g / mL chloramphenicol -agar medium (10 g / L NaCl, 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract, 15 g / L agar).
  • Plasmid pJW168 (Wild et al., Gene 223, 55-66, 1998) was introduced after the plasmid pKD46 was removed from the selected colonies at 37 ° C for colony selection and 50 ⁇ g / ml ampicillin and 1 mM IPTG (10 g / L NaCl, 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract, and 15 g / L agar) at 30 ° C to remove the chloramphenicol resistant gene ( cat ). Deletion of the yfeX gene in the prepared strain BL21 (DE3) ⁇ pta ⁇ ldhA ⁇ yfeX (Table 22) was confirmed by sequencing.
  • the plasmids pCDF-hemAL, pRSF-hemBCD and pET-hemEFGH prepared in Example 2-2 were introduced into BL21 (DE3) ⁇ pta ⁇ ldhA ⁇ yfeX disclosed in Table 22 above to prepare E. coli HEME6 strain 23).
  • the strains described in Table 14 were inoculated into 5 mL of LB medium (10 g / L NaCl (100 ⁇ g / mL) containing 25 ⁇ g / mL kanamycin, 50 ⁇ g / mL ampicillin and 100 ⁇ g / mL streptomycin , 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract) and cultured at 37 ° C and 220 rpm for 12 hours.
  • LB medium 10 g / L NaCl (100 ⁇ g / mL) containing 25 ⁇ g / mL kanamycin, 50 ⁇ g / mL ampicillin and 100 ⁇ g / mL streptomycin , 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract
  • LB-Fe7.5 medium (10 g / L NaCl, 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract, 7.5 mg / L yeast extract) containing the same antibiotics was added to 1 mL of the cultured medium, L FeSO 4 7H 2 O), and then cultured in a 250-mL Erlenmeyer flask at 37 ° C and 200 rpm until an OD 600 of about 0.6 was reached. After the addition of 1 mM IPTG, the cells were cultured at 30 ° C and 200 rpm for 48 hours.
  • heme production was increased to 7.13 mg / L in HEME6 strain compared with HEME3 strain (3.79 mg / L), HEME5 strain (4.17 mg / mL) and HEME4 strain (6.21 mg / mL) ).
  • the composition of the culture medium used for the strain culture was optimized.
  • LB medium (10 g / L NaCl, 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract)
  • TB medium (16.43 g / LK 2 HPO 4 .3H 2 O, 2.31 g / L, KH 2 PO 4 , 4 g / L glycerol, L of KH 2 PO 4 , 4 g / L of (NH 4 ) 2 HPO 4 , 0.8 g / L of MgSO 4 7H (L), 12 g / L tryptone 12 g / L, 24 g / L yeast extract 24 g / L) L FeSO 4 7H 2 O added to each culture medium was added to each medium containing 0.5 g / L of 2- O, 0.8 g / L citric acid, 5 g / L yeast extract, 5 mL / L trace metal solution, 5,
  • the composition of trace metal solution I is as follows: 0.5 M HCl, 2 g / L CaCl 2 , 2.2 g / L ZnSO 4 7H 2 O, 0.5 g / L MnSO 4 4H 2 O, 1 g / L CuSO 4 5H 2 O, 0.1 g / L (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 4H 2 O, 0.02 g / L Na 2 B 4 O 7 10H 2 O.
  • the strains described in Table 14 were inoculated into 5 mL of LB medium (10 g / L NaCl, 10 g / L kanamycin, 50 ⁇ g / mL ampicillin and 100 ⁇ g / mL streptomycin tryptone, 5 g / L yeast extract) and cultured at 37 ° C and 220 rpm for 12 hours.
  • LB medium 10 g / L NaCl, 10 g / L kanamycin, 50 ⁇ g / mL ampicillin and 100 ⁇ g / mL streptomycin tryptone, 5 g / L yeast extract
  • 1 mL of the culture medium in which the cultured cells grow is inoculated into 50 mL of the above-mentioned six medium supplemented with 25 mu g / mL kanamycin, 50 mu g / mL ampicillin and 100 mu g / mL streptomycin, ml Erlenmeyer flask at 37 ° C and 200 rpm until an OD 600 of about 0.6 was reached.
  • 1 mM IPTG the cells were cultured at 30 ° C and 200 rpm for 48 hours.
  • MR-Fe10, MR-Fe20 and MR-Fe40 were prepared by adding 100 mg / L of FeSO 4 7H 2 O at 0, 10, 20, 40 and 60, respectively, on the basis of the MR- , MR-FE60 and MR-Fe100 medium were prepared.
  • the strains described in Table 14 were inoculated into 5 mL of LB medium (10 g / L NaCl, 10 g / L kanamycin, 50 ⁇ g / mL ampicillin and 100 ⁇ g / mL streptomycin tryptone, 5 g / L yeast extract) and cultured at 37 ° C and 220 rpm for 12 hours.
  • LB medium 10 g / L NaCl, 10 g / L kanamycin, 50 ⁇ g / mL ampicillin and 100 ⁇ g / mL streptomycin tryptone, 5 g / L yeast extract
  • 1 mL of the culture medium in which the cultured cells grow is inoculated into 50 mL of the above-mentioned six medium supplemented with 25 mu g / mL kanamycin, 50 mu g / mL ampicillin and 100 mu g / mL streptomycin, ml Erlenmeyer flask at 37 ° C and 200 rpm until an OD 600 of about 0.6 was reached.
  • 1 mM IPTG the cells were cultured at 30 ° C and 200 rpm for 48 hours.
  • the strain was cultured as follows.
  • the strains described in Table 23 were inoculated into 5 mL of LB medium (10 g / L NaCl, 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract) supplemented with 25 ⁇ g / mL kanamycin, 50 ⁇ g / mL ampicillin and 100 ⁇ g / mL streptomycin, , And 220 rpm for 12 hours.
  • LB medium 10 g / L NaCl, 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract
  • 1 mL of the culture medium in which the cultured cells grew was inoculated into 50 mL of freshly prepared MR-Fe20 medium supplemented with 25 ⁇ g / mL kanamycin, 50 ⁇ g / mL ampicillin, and 100 ⁇ g / mL streptomycin ml Erlenmeyer flask at 37 ° C and 200 rpm until an OD 600 of about 0.6 was reached. Subsequently, 1 mM IPTG was added and incubated at 24 ° C, 30 ° C and 37 ° C at 200 rpm for 72 hours. Sampling was performed every 6 hours for the first 24 hours and then every 12 hours thereafter.
  • the cells recovered by centrifugation from 1 mL of the sample were re-dissolved in 500 ⁇ L of 1 M NaOH aqueous solution and the cells were thawed by ultrasonication.
  • the prepared sample was filtered and the heme concentration was measured by the previously reported method using HPLC (Lee et al., J. Microbiol. Biotechnol . 22, 1653-1658, 2012).
  • Example 5 Extracellular free heme production through ash fermentation and oil-feed cultivation
  • the strains described in Table 23 were inoculated into 5 mL of LB medium (10 g / L NaCl, 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract) supplemented with 25 ⁇ g / mL kanamycin, 50 ⁇ g / mL ampicillin and 100 ⁇ g / mL streptomycin, , And 220 rpm for 12 hours.
  • LB medium 10 g / L NaCl, 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract
  • the cells recovered by centrifugation from 1 mL of the sample were re-dissolved in 500 ⁇ L of 1 M NaOH aqueous solution and the cells were thawed by ultrasonication.
  • the prepared medium and the disrupted cell sample were filtered and then the heme concentration was measured by the previously reported method using HPLC (Lee et al., J. Microbiol. Biotechnol . 22, 1653-1658, 2012).
  • Example 5-1 Based on the batch fermentation results of Example 5-1, fermentation was carried out in the oil-feed culture mode to produce larger amounts of heme.
  • the strains described in Table 23 were inoculated into 5 mL of LB medium (10 g / L NaCl, 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract) supplemented with 25 ⁇ g / mL kanamycin, 50 ⁇ g / mL ampicillin and 100 ⁇ g / mL streptomycin, , And 220 rpm for 12 hours.
  • LB medium 10 g / L NaCl, 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract
  • MR-Fe20 medium pH 7.0
  • 25 ⁇ g / mL kanamycin, 50 ⁇ g / mL ampicillin, 100 ⁇ g / mL streptomycin and 20 g / L glucose was added by stirring at 200 rpm and air-
  • the culture was inoculated in a 6.6-L Bioflo 3000 fermenter (New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ) in an air saturated state and at 30 ° C. During fermentation, the temperature was maintained at 30 ° C and the pH was maintained at 7.0 using 50% NH 4 OH. Also, the air saturation was maintained at 40% of the initial air saturation by increasing the stirring speed up to 1000 rpm.
  • Liquid glucose 700 g / L glucose, 8 g / L MgSO 4 7H 2 O, 20 mg / L FeSO 4 7H 2 O
  • OD 600 5 mM IPTG was added and samples were sampled at 8 hour intervals for heme yield analysis.
  • the cells recovered by centrifugation from 1 mL of the sample were re-dissolved in 500 ⁇ L of 1 M NaOH aqueous solution and the cells were thawed by ultrasonication.
  • the prepared medium and the disrupted cell sample were filtered and then the heme concentration was measured by the previously reported method using HPLC (Lee et al., J. Microbiol. Biotechnol . 22, 1653-1658, 2012).
  • the strains described in Table 23 were inoculated into 5 mL of LB medium (10 g / L NaCl, 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract) supplemented with 25 ⁇ g / mL kanamycin, 50 ⁇ g / mL ampicillin and 100 ⁇ g / mL streptomycin, , And 220 rpm for 12 hours.
  • LB medium 10 g / L NaCl, 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract
  • MR-Fe20 medium pH 7.0
  • 25 ⁇ g / mL kanamycin, 50 ⁇ g / mL ampicillin, 100 ⁇ g / mL streptomycin and 20 g / L glucose was added by stirring at 200 rpm and air-
  • the culture was inoculated in a 6.6-L Bioflo 3000 fermenter (New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ) in an air saturated state and at 30 ° C. During fermentation, the temperature was maintained at 30 ° C and the pH was maintained at 7.0 using 50% NH 4 OH. Also, the air saturation was maintained at 40% of the initial air saturation by increasing the stirring speed up to 1000 rpm.
  • the cells recovered by centrifugation from 1 mL of the sample were re-dissolved in 500 ⁇ L of 1 M NaOH aqueous solution and the cells were thawed by ultrasonication.
  • the prepared medium and the disrupted cell sample were filtered and then the heme concentration was measured by the previously reported method using HPLC (Lee et al., J. Microbiol. Biotechnol . 22, 1653-1658, 2012).
  • the HEME6 strain prepared in the present invention has the advantage of showing the world's highest heme production without supplying the ALA production precursor as has been proved in the above examples.
  • the HEME6 strain has the advantage that the precursor glycine of C4 ALA biosynthetic pathway, which is relatively expensive and cytotoxic.
  • glutamate a precursor of the C5 ALA biosynthetic pathway used by the HEME6 strain, is relatively inexpensive and does not exhibit cytotoxicity. Therefore, in order to test the maximum heme production ability of the HEME6 strain produced in the present invention, glutamate was supplied to the nitrogen source and fermentation was carried out in the oil-fed culture.
  • the strains described in Table 23 were inoculated into 5 mL of LB medium (10 g / L NaCl, 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract) supplemented with 25 ⁇ g / mL kanamycin, 50 ⁇ g / mL ampicillin and 100 ⁇ g / mL streptomycin, , And 220 rpm for 12 hours.
  • LB medium 10 g / L NaCl, 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract
  • MR-Fe20 medium pH 7.0
  • 25 ⁇ g / mL kanamycin, 50 ⁇ g / mL ampicillin, 100 ⁇ g / mL streptomycin and 20 g / L glucose was added by stirring at 200 rpm and air-
  • the culture was inoculated in a 6.6-L Bioflo 3000 fermenter (New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ) in an air saturated state and at 30 ° C. During fermentation, the temperature was maintained at 30 ° C and the pH was maintained at 7.0 using 50% NH 4 OH. Also, the air saturation was maintained at 40% of the initial air saturation by increasing the stirring speed up to 1000 rpm.
  • the cells recovered by centrifugation from 1 mL of the sample were re-dissolved in 500 ⁇ L of 1 M NaOH aqueous solution and the cells were thawed by ultrasonication.
  • the prepared medium and the disrupted cell sample were filtered and then the heme concentration was measured by the previously reported method using HPLC (Lee et al., J. Microbiol. Biotechnol . 22, 1653-1658, 2012).
  • Example 5 it was confirmed that the proportion of heme secreted outside the cell gradually increased as the total production amount of heme increased. This is because heme exporter ccmABC heme secretion (Schulz et al., Proc. Natl. Et al., Infect. Immun . 78, 4977-4989, 2010) Acad Sci USA 96, 6462-6467, 1999) is promoted to produce extracellular free heme. In the same context, we concluded that overexpression of ccmABC gene could further promote heme secretion outside the cell. Thus, a strain overexpressing ccmABC gene was constructed by the following procedure.
  • the plasmid pACYC-ccmABC overexpressing the genes ccmA (SEQ ID NO: 58), ccmB (SEQ ID NO: 59) and ccmC gene (SEQ ID NO: 60) encoding the Heme exporter was constructed through the following procedure.
  • the sequence of RBS was added to the 5 'end of the amplified ccmC gene by the sequence of the ribosome binding site (RBS) contained in the primer of SEQ ID NO: 65 used in the amplification.
  • RBS ribosome binding site
  • the amplified sequences were sequentially inserted into pACYCDuet-1 vector (Novagen, USA), which was digested with Nco I, BamH I, EcoR I and Sal I, Nde I and Xho I, and digested with the same restriction enzymes to generate pACYC-ccmABC Respectively.
  • the plasmid pACYC-ccmABC prepared above was introduced into the HEME6 strain shown in Table 23 to prepare an E. coli HEME7 strain (Table 25).
  • the strains described in Table 25 were inoculated into 5 mL LB medium (10 g / L NaCl, 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract) supplemented with 25 ⁇ g / mL kanamycin, 50 ⁇ g / mL ampicillin, 100 ⁇ g / mL streptomycin and 17 ⁇ g / mL chloramphenicol After inoculation, the cells were cultured at 37 ° C and 220 rpm for 12 hours.
  • the total amount of heme was 114.79 mg / L, which was the highest amount at 64 hours, and 71.91 mg / L heme (62.64%) was detected in the medium.
  • the OD 600 reached 76.9 mg / L, the maximum value at 56 hours (FIG. 9A).
  • the chemABC gene was overexpressed as shown in the hypothesis of this Example, and the heme fraction outside the cells was increased by 10.58%, and the total heme production was also 9.89 mg / L.
  • the strains described in Table 25 were inoculated into 5 mL LB medium (10 g / L NaCl, 10 g / L tryptone, 5 g / L yeast extract) supplemented with 25 ⁇ g / mL kanamycin, 50 ⁇ g / mL ampicillin, 100 ⁇ g / mL streptomycin and 17 ⁇ g / mL chloramphenicol After inoculation, the cells were cultured at 37 ° C and 220 rpm for 12 hours.
  • MR-Fe20 medium pH 7.0
  • 25 ⁇ g / mL kanamycin, 50 ⁇ g / mL ampicillin, 100 ⁇ g / mL streptomycin, 17 ⁇ g / mL chloramphenicol and 20 g / L glucose was added to the agar with 200 rpm and 2 L / (New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ) which had been saturated with air by air supply of 30 [deg.] C, and a 6.6-L Bioflo 3000 fermenter. During fermentation, the temperature was maintained at 30 ° C and the pH was maintained at 7.0 using 50% NH 4 OH.
  • the air saturation was maintained at 40% of the initial air saturation by increasing the stirring speed up to 1000 rpm.
  • L of glucose, 8 g / L MgSO 4 7H 2 O, 20 mg / L FeSO 4 7H 2 O, and 20 g / L glutamate) were fed using continuous pH- .
  • OD 600 was 5
  • 1 mM IPTG was added and the production of Heme was confirmed by sampling at intervals of 8 hours for analysis of heme production.
  • C. glutamicum an aerobic microorganism producing glutamic acid, has a C5 biosynthetic pathway that produces ALA from glutamate and a heme biosynthetic pathway that produces heme from ALA, similar to E. coli.
  • two amino acid lysines were inserted between the second amino acid and the third amino acid of the protein expressed from the hemA gene to modify the sequence of the hemA gene (HemA fbr ) so that the HemA protein is resistant to negative feedback.
  • the amplified two genes were cloned together into the EcoRI site of the pEKEx1 plasmid via Gibson assembly and the pEKEx1-hemAL plasmid expressing HemA fbr and HemL protein when C. glutamicum was introduced.
  • a vector overexpressing the hemB and hemH genes was constructed in order to test the overexpression of the hemB and hemH genes in genes of proteins involved in the production of heme from ALA.
  • hemB and hemH genes were amplified from the genomic DNA of C. glutamicum ATCC 13032 using SEQ ID NOS: 71, 72, 73 and 74, respectively.
  • the pCES208-spc plasmid was amplified using the primers of SEQ ID NOs: 75 and 76 and then ligated with the amplified hemB and hemH genes through the Gibson assembly to prepare a pCES-hemBH plasmid.
  • heme which is a complex salt that is increasingly used for the treatment of porphyria and health food or food supplement, is secreted and produced outside the cell in high yield by using a microorganism variant instead of conventional chemical synthesis or enzyme synthesis, the purification process necessary for using heme can be eco-friendly, economical and easy.

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Abstract

본 발명은 heme의 세포외 생성능을 가지는 미생물 변이체에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 대사공학적으로 조작된 heme의 세포외 생성능을 가지는 미생물 변이체 및 이를 이용한 heme의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 포르피린증의 치료 건강식품 또는 식품보충제로서 사용이 증가하고 있는 착염인 heme을 기존의 화학합성이나 효소합성이 아닌 미생물 변이체를 이용하여 고수율로 세포외로 생산할 수 있는 효과가 있다.

Description

대사공학적으로 조작된 미생물을 이용한 헴의 세포외 생산방법
본 발명은 헴의 세포외 생성능을 가지는 미생물 변이체에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 대사공학적으로 조작된 헴의 세포외 생성능을 가지는 미생물 변이체 및 이를 이용한 헴의 제조방법에 관한 것이다.
헴(heme)은 철이온(Fe2+)과 프로토포르피린(protoporphyrin)으로 구성된 포르피린 유도체로, 대부분의 원핵세포 및 진핵세포에서 발견되는, 산소를 운반하고, 활성산소 종을 제거하며, 전자를 전달하여 에너지를 생성시키는 역할을 하는 착염이다. Heme은 건강관리 및 식품 보조제 산업에서, 생체 이용이 가능한 철 공급제로 널리 사용된다. 특히 hemin은 염화 리간드를 보유하는 3가 철이온 (Fe3+)을 함유하는 산화된 형태의 heme 유도체로, 급성간헐성 포르피린증의 치료에 사용되고 있어 heme에 대한 수요가 증가하고 있다. 따라서, heme의 효율적인 생산은 지난 수십 년 동안 큰 관심의 대상이 되었다.
기존의 화학 합성을 통한 heme의 합성 및 유기물 추출 또는 효소 가수분해를 통한 식물 조직 및 동물 혈액으로부터의 heme 분리 방법은 복잡하고, 수율이 낮으며 시간이 오래 걸릴 뿐만 아니라 친환경적이지 않은 단점이 있다. 따라서, 재조합 미생물, 그 중에서도 대장균을 이용한 생합성 방법을 통해 heme을 생산하려는 몇몇 시도가 있어 왔다. 그러나 생산된 heme이 세포 내에 축적되기 때문에 추후 이용을 위해서는 세포로부터 heme 추출이 불가피하여, 기존의 heme 생산 한계점을 극복하지 못하였다. 미생물을 이용하여 생산한 heme을 헴단백질이나 헴펩타이드 형태로 세포 바깥으로 생산하는 시도가 있었으나(EP 0,631,631; US 5,681,725; 및 US2016-0340411), 자유 heme을 생산하기 위해서는 여전히 세포 밖으로 분비된 헴프로테인이나 헴펩타이드로부터의 추출이 필요하다. 따라서 자유 heme의 친환경적이고 경제적인 산업적 생산을 위해서는 자유 heme의 세포외 생산 구현이 필요하다.
Heme은 거의 모든 미생물에게 필수적인 화합물이지만 고농도로 존재할 경우 다양한 미생물에서 독성을 유발한다(Anzaldi et al., Infect.Immun. 78, 4977-4989, 2010). 일부 미생물은 heme이나 heme이 축적되어 발생하는 독성 대사물질을 세포 바깥으로 능동적으로 수송하여 heme 내성을 획득한다. 대장균에서는 세포 내에서 합성된 자유 heme을 주변 세포질로 분비해 시토크롬 c의 생합성에 관여하는 단백질에 heme을 공급하는 heme 엑스포터 (heme exporter)를 암호화하는 유전자 ccmABC가 알려진 바 있다(Feissner et al., Mol. Microbiol. 61:219-231, 2006). 비록 해당 유전자가 자유 heme으로 인한 독성 내성에 관여하는지는 보고된 바가 없으나, 본 발명자들은 자유 heme의 생합성을 증진시킴으로써 ccmABC 유전자로부터 발현한 heme 엑스포터에 의한 세포 밖으로의 heme 분비를 촉진시키고, 이를 통해 세포외 자유 heme 생산이 가능할 것이라고 판단하였다.
Heme의 생합성은 5-aminolevulinate(ALA)의 생합성으로부터 시작한다(도 1)(Layer G. et al., Protein Sci. 19:1137-1161, 2010). ALA는 종에 따라 두 가지 다른 경로 (C4 또는 C5 경로)를 통해 합성되고, Archaea, 식물 및 대부분의 박테리아는 글루타밀-tRNA 합성 효소(GluRS), 글루타밀-tRNA 환원효소(GluTR) 및 글루타메이트-1-세미알데히드 2,1-아미노뮤테이즈(GSAM)에 의해 촉매되는 일련의 반응을 통해 L-글루타메이트를 ALA로 전환시키는 C5 경로를 보유하고 있다. 반면, 인간을 비롯한 동물, 균류 및 자색 비황 광영양세균은 ALA 합성효소(ALAS)에 의해 L-글리신 및 숙시닐-CoA를 ALA로 전환시키는 C4 경로를 보유하고 있다. 미생물을 이용한 ALA 생산을 위해서는 두 경로 모두가 활발하게 연구되어왔으나 (Ding et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 44:1127-1135, 2017.; Zhang et al., Sci. Rep. 5:8584, 2015; Kang et al., World J. Microbiol. Biotechnol. 33 doi: 10.1007/s11274-017-2366-7, 2017), heme을 생산하는 데에는 C5 ALA 생합성 경로를 이용한 보고가 없다.
Heme 생합성 경로의 하류에서는, C4 혹은 C5 경로를 통해 합성된 ALA 두 분자가 포르포빌리노겐 합성효소(porphobilinogen synthase, PBGS)에 의해 축합되어 포르포빌리노겐(porphobilinogen, PBG)을 형성한다. 4분자의 PBG는 포르포빌리노겐 디아미네이즈(porphobilinogen deaminase, PBGD)에 의해 1-히드록시메틸부탄(HMB)으로 축합되고, 우로포르피리노겐 III 합성효소(Uroporphyrinogen III synthase; UROS)에 의해 HMB의 고리화가 일어난다(도 1). 이어서, 우로포르피노겐 III 디카르복실레이즈(uroporphyrinogen III decarboxylase, UROD), 코프로포르피리노겐 III 옥시데이즈(coproporphyrinogen III oxidase, CPO) 및 프로토포르피리노겐 옥시데이즈(protoporphyrinogen oxidase, PPO)에 의해 촉매된 탈카복실화 및 산화 반응을 포함하는 후속 반응으로 우로포르피리노겐 III(uroporphyrinogen III)를 프로토포르피린 IX로 전환시킨다. 마지막으로 페로킬레테이즈(FECH)는 제1철(Fe2+)을 삽입하여 프로토포르피린 IX를 heme으로 전환시킨다.
대장균을 조작하여 heme을 생산하려는 몇몇 시도가 있었으며, 첫 번째 연구는 C4 경로의 ALAS를 코딩하는 Rhodobacter capsulatus 유래 hemA 유전자 (hemARca)를 비롯하여, 대장균유래 hemB, hemC, hemD 및 Synechocystis sp. 유래의 hemF 및 바실러스 서브틸리스 유래의 hemH 및 hemH를 포함하는 8개의 유전자를 항시적으로 과발현시킨 대장균 변이체를 제작하였다. 상기 대장균 변이체는 LB 배지에서 3.3±0.3μM(2.03±0.18mg/L)의 heme을 생산하였다(Kwon S. J. et al., Appl. Environ. Microbiol. 69: 4875-4883, 2003). 그러나, 이 방법은 전구체(L-glycine과 succinyl-CoA)의 공급이 제한되어 있고, 최적이 아닌 heme 생합성 경로를 사용하기 때문에 수율이 낮았다.
다른 연구에서, ALAS를 코딩하는 Rhodobacter sphaeroides 유래 hemA 유전자 (hemARsp), NADP 의존성 말산탈수소효소를 코딩하는 내인성 maeB 및 디카르복실레이트 트랜스포터를 코딩하는 내인성 dctA를 대장균에서 함께 발현시켰다. 이 균주는 10g/L 숙신산 및 2g/L의 글리신을 첨가한 LB 배지에서 6.4 mg/L의 heme을 생산하였다(Kwon O. H. et al., J. Microbiol. Biotechnol. 19:604-609, 2009). 이 균주를 이용한 추가 연구에서, 내재적인 coaA (판토텐산 키나아제를 암호화 함), hemB, hemC, hemD 및 hemE 유전자를 과발현시키는 경우, 0.49μmol gDCW-1의 heme을 생산하였으며, 실제 heme 농도는 바이오매스 농도가 기재되지 않았기 때문에 알 수 없었다(Lee M. J. et al. J. Microbiol. Biotechnol. 23:668-673, 2013). 최근의 연구에서, 상기 연구자들은 연속 배양으로 250 mL 용량의 배양기에서 9.1 μmol의 gDCW-1 heme (여기서도, 바이오매스 농도를 알 수 없음)을 생산하였다(Pranawidjaja S. et al., J. Microbiol. Biotechnol. 25:880-886, 2015). 상기 기술된 재조합 대장균 균주에 의해 heme이 생성될 수 있지만, 최종 heme의 수율은 매우 낮았으며, 세포 밖으로의 자유 heme 분비가 보고된 바 없다. 상기 연구들에서 heme의 생산량이 낮은 것은 주로 heme 생합성을 위한 heme 전구체를 공급하는 데 있어서, 최적경로가 아닌 대사 경로를 사용하였기 때문이다. 또한, L-글리신 및 숙신산의 첨가는 대규모 생산에 바람직하지 않다.
따라서 heme의 효율적인 생산을 위한 고성능 heme 생산 미생물을 제조하고, heme 생산량 증가에 따른 세포 밖으로의 heme 분비를 확인하여, 효과적으로 세포외 자유 heme을 생산하는 재조합 미생물 제조가 필요하다.
이에, 본 발명자들은 heme을 고수율로 생산하여, 세포외로 분비할 수 있는 변이체를 개발하고자 예의 노력한 결과, 대장균에서 헴의 전구체인 5-아미노레불린산의 생산을 증가시킬 수 있는 C5 경로와 heme 생합성 경로를 과발현시킨 변이체가, 기존 heme 생성균주들 보다 월등한 수율로 heme을 생성할 뿐만 아니라, heme을 세포외로 생산한다는 것을 확인하고, heme을 세포외로 분비하는 유전자인 ccmABC를 추가적으로 과발현시킴으로써, heme 생산량을 보다 향상시키고 세포외로의 자유 heme 분비 역시 더욱 향상시킨 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 heme을 고수율로 생성하면서, 생성된 heme을 세포외로 분비시킬 수 있는 미생물 변이체를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 미생물 변이체를 이용한 heme의 제조방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 5-아미노레뷸론산(ALA)를 생산하는 생합성 경로에 관여하는 유전자와 ALA로부터 heme을 합성하는 경로에 관여하는 유전자를 가지고 있는 미생물에서, heme 엑스포터(heme exporter)를 코딩하는 유전자가 과발현되어 있는 것을 특징으로 하는 heme을 세포외로 분비시킬 수 있는 미생물 변이체를 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 미생물 변이체를 배양하여 heme을 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 heme을 수득하는 단계를 포함하는 heme의 제조방법을 제공한다.
도 1은 본 발명에 따른 heme 생성을 위한 생합성 경로를 나타낸 것이다. 굵게 표시된 항목들은 본 발명에 따른 HEME7 균주에서 해당 유전자가 과발현된 것들을 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따른 대장균에서 heme을 고수율로 생산하기 위한 전략을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 HEME1, HEME2, HEME3, HEME4, HEME5 및 HEME6 균주의 플라스크 배양에 의한 ALA 및 heme 생산량을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 HEME6 균주의 TB, TB-Fe7.5, LB, LB-Fe7.5, MR-Fe0, MR-Fe7.5 배지를 이용한 플라스크 배양에 의한 heme 생산량을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 HEME6 균주의 배양에 이용한 배지 상의 FeSO47H2O의 농도를 달리함에 따른 플라스크 배양에 의한 heme 생산량을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 HEME6 균주의 배양 온도를 달리함에 따른 플라스크 배양에 의한 heme 생산량을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 HEME6 균주의 회분식 배양에 의한 heme의 생산량을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명에 따른 HEME6 균주의 유가식 배양에 의한 heme의 생산량을 나타낸 것으로, 배양 시 유입 용액의 성분을 다음과 같이 달리하여 배양한 것이다 (a) 700 g/L glucose, 8 g/L MgSO4·7H2O, 20 mg/L FeSO4·7H2O; (b) 700 g/L glucose, 8 g/L MgSO4·7H2O, 20 mg/L FeSO4·7H2O, 5 g/L (NH4)2SO4; (c) 700 g/L glucose, 8 g/L MgSO4·7H2O, 20 mg/L FeSO4·7H2O, 20 g/L l-glutamate.
도 9는 본 발명에 따른 HEME7 균주의 유가식 배양에 의한 heme의 생산량을 나타낸 것으로, 배양 시 유입 용액의 성분을 다음과 같이 달리하여 배양한 것이다 (a) 700 g/L glucose, 8 g/L MgSO4·7H2O, 20 mg/L FeSO4·7H2O, 5 g/L (NH4)2SO4; (b) 700 g/L glucose, 8 g/L MgSO4·7H2O, 20 mg/L FeSO4·7H2O, 20 g/L l-glutamate.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
Heme은 건강관리 및 식품 보충제 산업에서 널리 응용되고 있는 착염으로, 기존에는 화학적 합성, 유기물 추출 또는 효소 가수 분해를 통해 제작되고 있으나, 복잡하고, 수율이 낮아 미생물을 이용하여 고수율로 heme을 생성하고자 대장균 변이체를 제작하였다. 또한 생산한 heme을 세포 내에 축적하는 기존의 대장균 변이체와 달리 생산한 자유 heme을 세포 밖으로 분비해 추후 자유 heme의 회수를 용이하게 하는 대장균 변이체를 제작하였다.
Heme은 미생물에게 필수적인 화합물이지만 고농도로 존재할 경우 독성을 유발하기 때문에, 일부 미생물은 heme이나 heme 축적으로 인해 축적되는 독성 대사물질을 세포 바깥으로 능동적으로 수송함으로써 heme 내성을 획득한다. 대장균의 경우 시토크롬 c의 생합성에 관여하는 단백질에 heme을 공급하는 heme 엑스포터 (heme exporter)를 암호화하는 유전자 ccmABC가 알려진 바 있으나 (Feissner et al., Mol. Microbiol. 61:219-231, 2006), 해당 유전자가 자유 heme으로 인한 독성 내성에 관여하는지는 보고된 바가 없다. 그럼에도 본 발명자들은 자유 heme의 생합성을 증진시킴으로써 ccmABC 유전자로부터 발현된 heme 엑스포터에 의한 세포 밖으로의 heme 분비를 촉진시키고, 이를 통해 세포외 자유 heme 생산이 가능할 것이라고 판단하였다.
기존에 대장균을 이용한 heme 생산 변이체는 L-글리신과 숙신산 공급과 함께 C4 경로를 제공하는 5-아미노레불린산을 통해 heme을 생산하도록 설계되었지만 최종 heme 생산수율은 매우 낮았다. 본 발명자들은 heme을 보다 효율적으로 생산하기 위하여, L-glutamate를 5-아미노레불린산으로 전환시키는 C5 경로를 이용한, 공학적으로 설계된 대장균 균주를 제작하였으며, 여러 가지 전략을 사용하여 대장균에서의 heme 생산을 향상시켰다(도 2).
첫째, 전구물질을 공급하지 않고 ALA를 생산하는 C4 및 C5 경로의 용량을 조사하였으며, C4 경로에 비해 C5 경로의 우수한 성능을 확인한 후에, C5 경로의 대사 유전자 및 heme 생합성을 위한 하류 경로를 과발현시켰다. 다음으로, heme 생합성과 관련된 대사 경로는 관련 유전자의 발현 수준을 조절하여 최적화시켰다. 추가적인 heme 생산성 향상을 위하여, heme 분해효소를 코딩하는 유전자로 추정되는 yfeX와 락테이트 및 아세테이트 합성경로를 결실시켰으며, 회분식 발효를 통하여 고수율로 heme이 생성되는 것을 확인하였으며, 또한, 생성된 heme이 세포외로 분비되는 것을 확인하였다. 또한, heme을 세포외로 분비하는 heme exporter를 암호화하는 ccmABC 유전자를 과발현한 대장균 변이체를 제조하고, 회분식 발효를 통하여 heme이 보다 고효율로 생성되는 것을 확인하였으며, 또한, 생성된 heme 중 보다 많은 비율이 세포외로 분비되는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 5-아미노레뷸론산(ALA)를 생산하는 생합성 경로에 관여하는 유전자와 ALA로부터 heme을 합성하는 경로에 관여하는 유전자를 가지고 있는 미생물에서, heme 엑스포터(heme exporter)를 코딩하는 유전자가 과발현되어 있는 것을 특징으로 하는 heme을 세포외로 분비시킬 수 있는 미생물 변이체에 관한 것이다.
본 발명에서 5-아미노레뷸론산(ALA)를 생산하는 생합성 경로에 관여하는 유전자와 ALA로부터 heme을 합성하는 경로에 관여하는 유전자를 가지고 있는 미생물은 야생형으로서 상기 유전자들을 가지고 있는 미생물뿐만 아니라, 상기 유전자들이 도입되어 있는 미생물을 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 미생물 변이체는 5-아미노레뷸론산(ALA)를 생산하는 생합성 경로에 관여하는 유전자와 ALA로부터 heme을 합성하는 경로에 관여하는 유전자가 과발현되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
Heme을 생합성하기 위해서는 전구체인 5-aminolevulinate (ALA) 필요하며, ALA 생합성 경로에는 C4 경로와 C5 경로가 존재한다. ALA 생산을 위한 미생물 변이체에 C4 경로와 C5 경로가 이용된 사례가 모두 있으나, heme을 생합성하기 위한 변이체에서 C5 경로를 적용한 것은 본 발명이 처음이다.
본 발명에 있어서, 상기 미생물은 탄소원으로부터 글루탐산을 생성할 수 있는 미생물을 사용할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
기존의 C4 경로를 채용한 heme 생합성능을 가지는 미생물의 경우, 배양 시에 ALA의 전구체인 숙신산과 글리신을 첨가해 주어야 하였으며, 글리신의 경우 세포독성을 가지기 때문에 고농도로 첨가할 수 없는 문제가 있었다. 또한, 숙신산과 글리신을 첨가해 주어도, 최종적인 heme 생산량은 6.4 mg/L 정도에 불과하였다.
본 발명에서는 heme의 생산성이 높은 미생물 변이체를 제작하기 위하여, C4 경로와 C5 경로를 가지는 미생물 변이체를 각각 제조하고, heme 생성능을 확인하였다.
본 발명에서 사용가능한 미생물 균주는 박테리아, 고세균, 효모, 곰팡이, 원생동물 (편모충류, 아메바류, 깃편모충류, 리조리아, 크로말베올라타), 동물세포, 미세조류, 식물세포 등을 들 수 있으며, 보다 바람직하게는 Escherichia coli, Bacillus sp., Corynebacterium sp., Lactobacillus sp., Lactococcus sp., Pseudomonas sp., Anacystis sp., Anabena sp., Chlorobium sp., Chloroflexus sp., Clostridium sp., methanobacterium, Propionibacterium sp., Rhodopsueomonas sp., Rhodobacter sp., Rhodovulum sp., Streptococcus sp., Saccharomyces sp., Schizosaccharomyces sp., Yarrowia sp., Aspergillus sp.,등을 들 수 있으며, 더욱 바람직하게는 Escherichia coli, Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei, Lactobacillus reuteri, Lactococcus lactis, Aspergillus niger, Saccharomyceses cerevisiae, Saccharomyces pombe 등을 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 양태에서, C4 경로와 C5 경로를 각각 도입한 대장균을 배양 시에 전구체를 첨가하지 않고 배양하는 경우, C5 경로에서 더 많은 ALA를 생산하였다. 따라서, 본 발명에서는 heme 생합성에 C5 경로를 사용하였다.
본 발명에 있어서, 상기 C5 생합성 경로에 관여하는 유전자는 글루타밀-tRNA 합성 효소 (GluRS)를 암호화하는 gltX, 글루타밀-tRNA 환원효소 (GluTR)를 암호화하는 hemA 및 글루타메이트-1-세미알데히드 2,1-아미노뮤테이즈 (GSAM)를 암호화하는 hemL 이고, 상기 ALA로부터 heme을 합성하는 경로에 관여하는 유전자는 포르포빌리노겐 합성 효소 (PBGS)를 암호화하는 hemB, 포르포빌리노겐 디아미네이즈 (PBGD)를 암호화하는 hemC, 우로포르피리노겐 III 합성효소 (UROS)를 암호화하는 hemD, 우로포르피리노겐 III 디카르복실레이즈 (UROD)를 암호화하는 hemE, 코프로포르피리노겐 III 옥시데이즈 (CPO)를 암호화하는 hemF, 프로토포르피리노겐 옥시데이즈 (PPO)를 암호화하는 hemG 및 페로킬레테이즈(FECH)를 암호화하는 hemH인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 변이체는 heme 엑스포터(heme exporter)를 코딩하는 유전자가 과발현되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 변이체는 heme 또는 heme 중간체 분해 효소를 암호화하는 유전자가 결실되어 있는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 heme 또는 heme 중간체 분해 효소를 암호화하는 유전자는 yfeX 유전자인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서, C5 경로를 각각 도입한 대장균에 heme 생합성 경로의 유전자들을 함께 과발현시키고, 각 효소의 발현에 이용한 벡터를 최적화하고, 초산 및 젖산 생산에 관여하는 유전자를 결실시키고, 기존에 heme의 분해에 관여하는지에 대한 여부에 논란이 있어온 yfeX 유전자를 결실시킨 대장균 변이체의 경우, 7.5 mg/L FeSO47H2O를 첨가한 LB 배지를 이용한 플라스크 배양에서, 7.13 mg/L의 heme을 생산하였다.
따라서, 본 발명에서는 yfeX 유전자의 넉아웃이 heme 생산량을 증가시킨다는 것을 최초로 확인하였다.
본 발명의 다른 양태는 ALA의 C4 경로가 과발현된 미생물에 yfeX 유전자가 결실되어 있는 변이체에 관한 것이다.
아울러, 본 발명의 또 다른 양태에서는 상기 제작한 대장균 변이체 균주를 5 g/L yeast extract가 첨가되고 FeSO47H2O 농도가 7.5 mg/L로 조정된 MR 배지에서 플라스크 배양한 경우, 7.45 mg/L heme을 생산하였으며, 배양 시간 및 온도 최적화를 진행하여, IPTG에 의한 단백질 과발현을 유도 후, 30℃에서 60시간 배양한 결과 7.78 mg/L의 heme을 생산하였다.
본 발명의 또 다른 양태에서는 본 발명에 따른 상기 대장균 변이체 및 최적화 조건을 이용하여, 회분식 발효를 수행한 결과, 56시간 배양 시에 총 14.24mg/L의 heme을 생산하였으며, 이중 1.18mg/L(8.29%)의 heme이 세포외에서 확인되었다.
본 발명의 또 다른 양태에서는 본 발명에 따른 상기 대장균 변이체를 유가식 배양(fed-batch culture)한 결과, 56시간째에 49.18mg/L의 heme을 생산하였으며, 이중 16.77 mg/L(34.10%)의 heme이 세포 바깥에서 확인되었다.
본 발명의 또 다른 양태에서는 heme 한 분자에 N 원자가 4개 필요하므로 질소원 결핍(nitrogen deficiency)의 우려를 해소하기 위하여, (NH4)2SO4를 첨가하여 유가식 배양한 결과, 104.90mg/L의 heme을 생산하였다. 이중 54.61mg/L(52.06%)의 heme이 세포외에서 확인되었다.
본 발명의 또 다른 양태에서는 (NH4)2SO4를 대신하여, C5 ALA 생합성 경로의 전구체인 l-glutamate을 첨가하여 배양한 결과, 64시간째에, 228.46mg/L의 heme을 생산하였으며, 이중 131.90 mg/L(57.734%)의 heme이 세포외에서 확인되었다.
상기 결과들을 고려하면, 생산된 heme의 총량이 증가함에 따라, 세포외로 분비되는 heme의 비율이 증가하는 것을 알 수 있다. 이는 세포 내의 높은 heme 농도가 세포에 독성을 나타내기 때문에, 본 발명자들이 수립한 가설과 같이 heme export의 기능 혹은 발현이 촉진되었을 수 있다고 판단하였다. 따라서 heme exporter를 암호화하는 것으로 알려진 ccmABC 유전자를 과발현시킬 경우 세포 밖으로의 heme 분비가 더욱 촉진되고, 그 결과 세포내 자유 heme으로 인한 독성이 줄어 heme 생산량 역시 증가할 것으로 판단하여, ccmABC 유전자를 과발현 시키는 방법을 시도하였다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 5-아미노레뷸론산(ALA)를 생산하는 C5 생합성 경로에 관여하는 유전자와 ALA로부터 heme을 합성하는 경로에 관여하는 유전자가 과발현되어 있고, heme 엑스포터(heme exporter)를 코딩하는 유전자가 과발현되어 있어 heme을 세포외로 분비시킬 수 있는 미생물 변이체를 배양하여 배양하여 heme을 생성시키는 단계; 및 상기 생성된 heme을 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 heme의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태에서는 상기 heme 생성 변이 대장균 균주에서, heme export를 코딩하는 ccmABC 유전자를 과발현시킨 균주를 (NH4)2SO4 첨가조건에서 유가식으로 배양한 결과, 배양 64시간에 114.79 mg/L의 heme을 생산하였으며, 이중 71.91mg/L(62.64%)의 heme이 세포외에서 확인되었다.
본 발명의 다른 양태에서는, 본 발명의 균주를 glutamate 첨가조건에서, 유가식 배양한 결과, 배양 72시간째에, 246.69mg/L의 heme을 생산하였으며, 이중 164.12mg/L(66.53%)의 heme이 세포외에서 확인되었다.
본 발명의 미생물 변이체를 이용한 heme의 생산의 경우, 일 실시예에서, 전구체 첨가 여부에 따라, 114.79mg/L 또는 246.69 mg/L의 heme을 생산하였으며, 이는 기존 heme 생성 대장균 변이체가 6.4 mg/L의 heme을 생성한 것과 비교하여 각각 17.9배 또는 38.5배의 수율을 나타내는 것이다.
또한, 본 발명에서는 미생물의 heme 생산량이 증가함에 따라 세포외 heme의 비율도 증가한다는 것을 최초로 확인하였으며, heme exporter 유전자 ccmABC를 과발현시키는 경우, 세포외 heme의 비율이 증가될 뿐만 아니라, 세포 전체의 heme의 생산량이 증가한다는 것을 최초로 확인하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
본 실시예 및 하기 실시예들에서 사용한 제한효소는 New England Biolabs (미국) 및 Enzynomics(한국), PCR 중합효소는 BIOFACT(한국), DNA 접합 효소 (DNA ligase)는 Elpis Biotech (한국)에서 구입하였다. 이외의 것에 대해서는 별도로 표시하였다.
실시예 1: 고효율 heme 생산을 위한 ALA 생합성 경로 선정
1-1: C4 및 C5 ALA 생합성 유전자를 발현하는 벡터(pRSF-C4 및 pRSF-C5)의 제작
E. coli 균주 BL21(DE3) (Studier et al.,, J. Mol. Biol. 189:113-130, 1986)에서 C4 및 C5 ALA 생합성 유전자를 발현할 수 있는 벡터 pRSF-C4 및 pRSF-C5를 다음과 같은 과정을 통해 제작하였다.
C4 ALA 생합성 유전자를 발현할 수 있는 벡터 pRSF-C4는 pRSFDuet-1 벡터 (Novagen, 미국)에 Rhodobacter sphaeroides 2.4.1에서 유래한 aminolevulinic acid synthase (ALAS)의 유전자(hemA Rsp)와 E. coli 에서 유래한 maeB 및 coaA 유전자를 삽입하여 제작하였다. Rhodobacter sphaeroides 2.4.1에서 유래한 hemA Rsp 유전자를 증폭하기 위해 E. coli 의 코돈출현빈도 (codon usage)에 따라 코돈 최적화 (codon optimization)이 된 hemA Rsp 유전자(서열번호 1)를 합성하여(Genotech, Korea) 템플릿을 준비하였으며, 서열번호 2 및 서열번호 3의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. E. coli 에서 유래한 maeB(서열번호 4) 및 coaA 유전자(서열번호 5)는 E. coli BL21(DE3)의 유전체 DNA를 템플릿으로 사용하고 각각 서열번호 6과 서열번호 7의 프라이머 및 서열번호 8과 서열번호 9의 프라이머를 이용하여 증폭하였다.
이때 증폭하는 과정에서 사용한 서열번호 7의 프라이머에 포함된 ribosome binding site (RBS)의 서열에 의하여, 증폭된 coaA 유전자의 5′ 말단에 RBS의 서열이 첨가되었다.
Figure PCTKR2018015748-appb-T000001
증폭한 서열은 각각 BglII와 XhoI, SacI과 SalI, 그리고 NcoI과 EcoRI으로 절단한 뒤 동일한 제한효소로 절단한 pRSFDuet-1 벡터(Novagen, 미국)에 순차적으로 삽입하여 최종적으로 pRSF-C4를 제작하였다.
C5 ALA 생합성 유전자를 발현할 수 있는 벡터 pRSF-C5는 E. coli 에서 유래한 gltX(서열번호 10), hemL(서열번호 11) 및 음성 피드백 저항성 hemA (hemA fbr) 유전자(서열번호 12)를 삽입하여 제작하였다. 각 유전자는 E. coli BL21(DE3)의 유전체 DNA를 템플릿으로 사용하고 각각 서열번호 13과 서열번호 14의 프라이머, 서열번호 15와 서열번호 16의 프라이머, 그리고 서열번호 17과 서열번호 18의 프라이머를 이용하여 증폭하였다.
이때 증폭하는 과정에서 사용한 서열번호 15의 프라이머에 포함된 ribosome binding site (RBS)의 서열에 의하여, 증폭된 hemL 유전자의 5′ 말단에 RBS의 서열이 첨가되었다. 또한 서열번호 17의 프라이머에 포함된 threonine과 leucine을 암호화하는 염기서열에 의하여 BL21(DE3) 유래 hemA 유전자가 음성 피드백 저항성 hemA (hemA fbr)로 전환되었다.
Figure PCTKR2018015748-appb-T000002
증폭한 gltX, hemA fbr, hemL 유전자 서열은 각각 NdeI과 XhoI, NcoI과 BamHI, 그리고 SacI과 NotI으로 절단한 뒤 동일한 제한효소로 절단한 pRSFDuet-1 벡터 (Novagen, 미국)에 순차적으로 삽입하여 최종적으로 pRSF-C5를 제작하였다.
1-2: C4 및 C5 ALA 생합성 유전자를 과발현한 E. coli BL21(DE3) 균주의 ALA 생산능 비교
C4 및 C5 ALA 생합성 경로를 도입한 균주에 각 경로가 사용하는 전구체 (C4 ALA 생합성 경로의 경우, glycine과 succinate, C5 ALA 생합성 경로의 경우, glutamate)를 공급하지 않고 배양하였을 때, ALA 생산능을 비교하기 위하여, E. coli BL21(DE3) 균주에 실시예 1-1에서 제작한 pRSF-C4 및 pRSF-C5 벡터를 각각 도입하여 E. coli C4 균주 및 C5 균주를 제작하였다(표 3). 음성대조군으로는 E. coli BL21(DE3)를 이용하였다 (표 3).
Figure PCTKR2018015748-appb-T000003
표 3에 개시된 균주를 25μg/mL kanamycin이 첨가된 5 mL LB 배지(10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종한 뒤 37℃, 220rpm의 조건에서 12 시간 동안 배양하였다. 상기 균주를 이용하여 ALA를 생산하기 위하여, 상기 배양한 균체가 자라고 있는 배양액 1 mL를 새롭게 준비한 동일 배지 50 mL에 접종한 뒤 250-mL Erlenmeyer flask에서 OD600이 약 0.6에 이를 때까지 37℃, 200 rpm의 조건에서 배양하였다. 이후 1 mM IPTG를 첨가한 후 30℃, 200 rpm의 조건에서 48 시간 동안 배양하였다.
상기 배양 후 ALA 생산량 분석을 위해 샘플을 취한 뒤 기보고된 방법 (Burnham, Methods Enzymol. 17A, 195-204, 1970)을 통해 샘플을 전처리 및 분석하였다. 그 결과, BL21(DE3) 균주(음성대조군)와 C4 균주 및 C5 균주에서 각각 0.02g/L, 0.31g/L 및 1.74g/L ALA가 생산되어, 전구체를 공급하지 않는 경우 C5 ALA 생합성 경로가 C4 ALA 생합성 경로보다 5배 이상 높은 ALA를 생산하는 것으로 나타났다 (도 2a). 따라서 추후 heme 생산 균주 제작에 있어 ALA 생합성을 위해 C5 ALA 생합성 경로를 이용하기로 결정하였다.
실시예 2: C5 ALA 생합성 경로를 도입한 heme 생산 균주 제작
2-1: Heme 생산을 위한 과발현 표적 유전자 선정
ALA 생합성 경로를 통해 생산된 ALA로부터 heme을 생산하는 데에 hemB, hemC, hemD, hemE, hemF, hemG, hemH 유전자로부터 발현된 효소들이 필요하다 (도 1). E. coli는 내재적으로 상기 유전자를 보유하고 있기 때문에 야생형 균주도 heme을 생산할 수 있으나, 생존에 필수적인 만큼만 heme을 생산하기 때문에 생산된 heme은 대부분 단백질과 결합한 형태로 존재하여 야생형 균주에서는 자유 heme을 검출하기 어렵다. 따라서 자유 heme을 과생산하기 위해서는 상기 유전자를 과발현시켜 ALA로부터 heme을 생산하는 데 포함되는 대사의 흐름을 증가시켜야 하나, 상기 유전자를 모두 과발현시킬 경우 단백질의 과도한 과발현으로 인해 heme 생산 균주의 대사에 과부하가 발생할 수 있다고 판단하였다. 따라서 heme을 과생산하는 데 E. coli BL21(DE3) 균주 고유의 발현 강도가 충분하지 않아 추가적인 과발현이 필수적인 유전자만을 선정하고 최소한의 heme 생합성 유전자만을 선택적으로 과발현시킴으로써, 단백질 과발현으로 인한 균주의 과부하를 최소화하고 heme 과생산을 극대화하기로 하였다.
(a) Heme 생산을 위한 hemB 및 hemH 유전자의 과발현 필요성 확인
Heme 생합성 유전자 중 hemB 유전자(서열번호 19) 및 hemH 유전자(서열번호 20)를 과발현시킬 경우 heme 생산에 전구체로 사용되는 ALA의 생산량이 감소하며 (Zhang et al., Sci. Rep. 5, 8584, 2015), 반대로 상기 두 유전자의 발현량을 감소시킬 경우 ALA로부터 heme을 생산하는 대사경로의 대사량이 감소한다는 보고가 있다(Li et al., FEMS Microbiol. Lett. 350, 209-215, 2014). 따라서 효과적인 heme 과생산을 위해서는 hemB 및 hemH 유전자의 과발현이 필수적이라고 판단하였다.
상기 두 유전자를 과발현하며 C5 ALA 생합성 경로를 과발현시키는 플라스미드와 간섭을 일으키지 않는 벡터 pET-hemBH는 다음과 같은 과정을 통해 제작하였다.
E. coli BL21(DE3) 균주의 유전체 DNA로부터 hemB와 hemH 유전자를 증폭하기 위해 각각 서열번호 21과 서열번호 22의 프라이머 및 서열번호 23 및 서열번호 24의 프라이어머를 이용하였다.
Figure PCTKR2018015748-appb-T000004
증폭한 서열은 NdeI과 XhoI으로 절단한 뒤 동일한 제한효소로 절단한 pETDuet-1 벡터 (Novagen, 미국)에 각각 삽입하여 pET-hemB 및 pET-hemH를 제작하였다.
E. coli BL21(DE3) 균주의 유전체 DNA로부터 서열번호 25와 서열번호 26의 프라이머를 이용해 hemB 유전자를 증폭하였으며, 증폭한 서열은 각각 NcoI과 BamHI으로 절단한 뒤 동일한 제한효소로 절단한 pET-hemH 벡터에 삽입하여 최종적으로 pET-hemBH를 제작하였다.
Figure PCTKR2018015748-appb-T000005
상기 제작한 pET-hemB, pET-hemH 및 pET-hemBH를 재조합 E. coli C5 균주에 각각 도입하여 E. coli C5-B, C5-H 및 C5-BH 균주를 제작하였다(표 6).
Figure PCTKR2018015748-appb-T000006
상기 제작한 E. coli 균주들의 ALA, heme 및 heme 생합성 중간체 (uroporphyrinogen III, coproporphyrinogen III, protoporphyrin IX) 생산 프로필을 확인하기 위해, 표 6에 개시된 균주를 25μg/mL kanamycin 및 50μg/mL ampicillin이 첨가된 5mL LB 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종한 뒤 37℃, 220rpm의 조건에서 12시간 동안 배양하였다. Heme 생산을 위한 본 배양을 위해 상기 배양한 균체가 자라고 있는 배양액 1 mL를 동일 항생제가 포함된 LB-Fe7.5 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract, 7.5 mg/L FeSO47H2O) 50 mL에 접종한 뒤 250-mL Erlenmeyer flask에서 OD600이 약 0.6에 이를 때까지 37℃, 200 rpm의 조건에서 배양하였다. 이후 1 mM IPTG를 첨가한 후 30℃, 200 rpm의 조건에서 48 시간 동안 배양하였다.
상기 배양 후 ALA 생산량 분석을 위해 샘플을 취한 뒤 기보고된 방법 (Burnham, Methods Enzymol. 17A, 195-204, 1970)을 통해 샘플을 전처리 및 분석하였다.
또한 heme의 생산량을 확인하기 위해 샘플 1 mL를 취하고 원심분리를 통해 회수한 세포를 1 M NaOH 수용액 500 μL에 다시 풀어내었으며, 초음파분쇄법을 통해 세포를 융해시켰다. 준비한 샘플을 여과한 뒤 HPLC를 이용하는 기존에 알려진 방법으로 heme 농도를 측정하였다(Lee et al., J. Microbiol. Biotechnol. 22, 1653-1658, 2012).
Heme 생합성 중간체 확인에는 heme 생산량 확인에 이용한 것과 동일한 샘플을 이용하되, HPLC-MS를 이용하는 기보고된 방법 (Pranawidjaja et al., J. Microbiol. Biotechnol. 25, 880-886, 2015; Bu et al., J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 783, 411-423, 2003)을 이용하였다.
그 결과, 예상대로 C5-BH 균주가 다른 두 균주보다 많은 양의 heme 생합성 중간체인 uroporphyrinogen III 및 coproporphyrinogen III)를 생산하였다(표 7). 또한, C5-B 및 C5-H와 비교해 C5-BH에서 더 적은 양의 ALA가 확인되었다. 그러나 표 6에 개시된 세 균주 모두에서 자유 heme을 검출할 수는 없었다.
Figure PCTKR2018015748-appb-T000007
(b) Heme 과생산을 위한 hemC, hemD, hemE, hemF 및 hemG 유전자의 과발현 필요성 확인
Heme 생합성 유전자 중 hemB 및 hemH 유전자를 제외한 나머지 다섯 유전자 (hemC(서열번호 27), hemD(서열번호 28), hemE(서열번호 29), hemF(서열번호 30), hemG(서열번호 31) 중 heme 과생산을 위해 필수적으로 과발현시켜야 하는 유전자를 선별하기 위해 C5-BH 균주에서 상기 5개 유전자를 각각 과발현시킨 후, heme 생산 및 heme 생합성 중간체의 생산 프로필을 분석하였다. 상기 다섯 가지 유전자를 각각 과발현시키는 플라스미드 pCDF-hemC, pCDF-hemD, pCDF-hemE, pCDF-hemF 및 pCDF-hemG는 다음과 같은 과정을 통해 제작하였다.
E. coli BL21(DE3) 균주의 유전체 DNA로부터 hemC, hemD, hemE, hemF, 및 hemG 유전자를 증폭하기 위해 각각 서열번호 32와 서열번호 33의 프라이머, 서열번호 34와 서열번호 35의 프라이머, 서열번호 36과 서열번호 37의 프라이머, 서열번호 38과 서열번호 39의 프라이머 및 서열번호 40과 서열번호 41의 프라이머를 이용하였다.
Figure PCTKR2018015748-appb-T000008
증폭한 서열은 각각 NcoI과 BamHI, NcoI과 BamHI, NcoI과 EcoRI, NcoI과 BamHI 및 NcoI과 SacI으로 절단한 뒤 동일한 제한효소로 절단한 pCDFDuet-1 벡터 (Novagen, 미국)에 각각 삽입하여 pCDF-hemC, pCDF-hemD, pCDF-hemE, pCDF-hemF 및 pCDF-hemG를 제작하였다.
상기 제작한 pCDF-hemC, pCDF-hemD, pCDF-hemE, pCDF-hemF 및 pCDF-hemG를 재조합 E. coli C5-BH 균주에 각각 도입하여 E. coli C5-BCH, C5-BDH, C5-BEH, C5-BFH 및 C5-BGH 균주를 제작하였다 (표 9).
Figure PCTKR2018015748-appb-T000009
상기 제작한 E. coli 균주들의 ALA, heme 및 heme 생합성 중간체 (uroporphyrinogen III, coproporphyrinogen III 및 protoporphyrin IX) 생산 프로필을 확인하기 위해, 표 9에 개시된 균주를 25μg/mL kanamycin 및 50μg/mL ampicillin이 첨가된 5mL LB 배지(10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종한 뒤 37℃, 220 rpm의 조건에서 12 시간 동안 배양하였다. Heme 생산을 위한 본배양을 위해 상기 배양한 균체가 자라고 있는 배양액 1 mL를 동일 항생제가 포함된 LB-Fe7.5 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract, 7.5 mg/L FeSO47H2O) 50 mL에 접종한 뒤 250-mL Erlenmeyer flask에서 OD600이 약 0.6에 이를 때까지 37℃, 200 rpm의 조건에서 배양하였다. 이후 1 mM IPTG를 첨가한 후 30℃, 200 rpm의 조건에서 48시간 동안 배양하였다.
상기 배양 후 ALA 생산량 분석을 위해 샘플을 취한 뒤 기보고된 방법 (Burnham, Methods Enzymol. 17A, 195-204, 1970)을 통해 샘플을 전처리 및 분석하였다.
또한, heme의 생산량을 확인하기 위해 샘플을 1mL를 취하고 원심분리를 통해 회수한 세포를 1M NaOH 수용액 500μL에 다시 풀어내었으며, 초음파분쇄법을 통해 세포를 융해시켰다. 준비한 샘플을 여과한 후, HPLC를 이용하는 기보고된 방법으로 heme 농도를 측정하였다(Lee et al., J. Microbiol. Biotechnol. 22, 1653-1658, 2012).
Heme 생합성 중간체 확인에는 heme 생산량 확인에 이용한 것과 동일한 샘플을 이용하되, HPLC-MS를 이용하는 기존 방법을 이용하였다(Pranawidjaja et al., J. Microbiol. Biotechnol. 25, 880-886, 2015; Bu et al., J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 783, 411-423, 2003).
그 결과, 비록 상기 다섯 균주 모두에서 heme이 검출되지는 않았으나 (도 2b), C5-BH 균주 (표 7)와 비교해 C5-BCH 및 C5-BDH 균주에서는 uroporphyrinogen III의 신호가, C5-BDH, C5-BEH 및 C5-BFH 균주에서는 coproporphyrinogen III의 신호가 더 높게 검출되었다. 특히 C5-BDH 균주에서는 C5-BH 균주에서는 검출되지 않은 protoporphyrin IX이 검출되었다. 상기 결과를 바탕으로 효과적인 heme 과생산을 위해 hemC, hemD, hemE 및 hemF 유전자의 과발현이 필수적이라는 결론을 얻었다.
Figure PCTKR2018015748-appb-T000010
반면 C5-BGH 균주는 C5-BH 균주(표 7)와 비교해 ALA 및 heme 생합성 중간체 생산량에서 두드러진 차이를 발견할 수 없었다(표 10). Heme 과생산을 위해 hemG의 과발현이 필수적인지 재차 확인하고자 C5-BH 균주를 기반으로 hemC, hemD, hemE 및 hemF 유전자를 과발현시키는 균주 HEME1와 C5-BH 균주를 기반으로 hemC, hemD, hemE, hemF 및 hemG 유전자를 모두 과발현시키는 균주 HEME2를 다음과 같은 과정을 통해 제작하였다.
상기 hemC, hemD, hemE 및 hemF 유전자를 과발현시키는 플라스미드 pCDF-hemCDEF는 다음과 같은 과정을 통해 제작하였다.
E. coli BL21(DE3) 균주의 유전체 DNA로부터 hemC, hemD, hemE 및 hemF 유전자를 증폭하기 위해 각각 서열번호 42와 서열번호 43의 프라이머, 서열번호 44와 서열번호 45의 프라이머, 서열번호 46과 서열번호 47의 프라이머 및 서열번호 48과 서열번호 49의 프라이머를 이용하였다.
이때 증폭하는 과정에서 사용한 서열번호 44와 서열번호 48의 프라이머에 포함된 ribosome binding site (RBS)의 서열에 의하여, 증폭된 hemD 및 hemF 유전자의 5′ 말단에 RBS의 서열이 첨가되었다.
Figure PCTKR2018015748-appb-T000011
증폭한 서열은 각각 NdeI과 BglII, BglII와 XhoI, NcoI과 SacI 및 SacI과 PstI으로 절단한 뒤 동일한 제한효소로 절단한 pCDFDuet-1 벡터 (Novagen, 미국) 에 순차적으로 삽입하여 pCDF-hemCDEF를 제작하였다.
상기 hemC, hemD, hemE, hemF 및 hemG 유전자를 과발현시키는 플라스미드 pCDF-hemCDEFG는 다음과 같은 과정을 통해 제작하였다.
E. coli BL21(DE3) 균주의 유전체 DNA로부터 hemG 유전자를 증폭하기 위해 각각 서열번호 50과 서열번호 51의 프라이머를 이용하였다. 이때 증폭하는 과정에서 사용한 서열번호 50의 프라이머에 포함된 ribosome binding site (RBS)의 서열에 의하여, 증폭된 hemG 유전자의 5′ 말단에 RBS의 서열이 첨가되었다.
Figure PCTKR2018015748-appb-T000012
증폭한 서열은 PstI과 NotI으로 절단한 뒤 동일한 제한효소로 절단한 pCDF-hemCDEF 벡터에 삽입하여 최종적으로 플라스미드 pCDF-hemCDEFG를 제작하였다.
상기 제작한 pCDF-hemCDEF 및 pCDF-hemCDEFG를 재조합 E. coli C5-BH 균주에 각각 도입하여 E. coli HEME1 및 HEME2 균주를 제작하였다 (도 2c 및 표 13).
Figure PCTKR2018015748-appb-T000013
상기 제작한 E. coli 균주들의 ALA 및 heme 생산 프로필을 확인하기 위해, 표 13에 개시된 균주를 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin 및 100μg/mL streptomycin이 첨가된 5 mL LB 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종한 뒤 37℃, 220rpm의 조건에서 12시간 동안 배양하였다. Heme 생산을 위한 본 배양을 위해 상기 배양한 균체가 자라고 있는 배양액 1mL를 동일 항생제가 포함된 LB-Fe7.5 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract, 7.5 mg/L FeSO47H2O) 50 mL에 접종한 뒤 250-mL Erlenmeyer flask에서 OD600이 약 0.6에 이를 때까지 37℃, 200 rpm의 조건에서 배양하였다. 이후 1mM IPTG를 첨가한 후 30℃, 200rpm의 조건에서 48시간 동안 배양하였다.
상기 배양 후 ALA 생산량 분석을 위해 샘플을 취한 뒤 샘플을 전처리 및 분석하였다.
또한 heme의 생산량을 확인하기 위해 샘플 1 mL를 취하고 원심분리를 통해 회수한 세포를 1M NaOH 수용액 500μL에 다시 풀어내었으며, 초음파분쇄법을 통해 세포를 융해시켰다. 준비한 샘플을 여과한 후 HPLC를 이용하여 heme 농도를 측정하였다.
그 결과, HEME1 및 HEME2 균주에서 각각 0.14 mg/L 및 0.53 mg/L heme이 검출되었다(도 3). HEME1 균주와 비교해 hemG를 추가로 과발현시킨 HEME2 균주에서 3배 이상의 heme이 더 많이 생산된 결과를 통해 효과적인 heme 과생산을 위해 C5-BH 균주에서 hemC, hemD, hemE, hemF 및 hemG 유전자를 모두 과발현시켜야 한다는 결론을 얻었다.
2-2: Heme 증산을 위한 heme 생합성 유전자의 과발현 수준 조정
실시예 2-1에서 제작한 HEME2의 ALA 생산량 (308 mg/L)이 heme 생산량 (0.53 mg/L)보다 현저히 높은 것으로 미루어 보아 ALA 생합성 경로의 대사 흐름이 과도하다고 판단하였다. 균주에서 과발현시킬 수 있는 단백질 총량이 유한하다는 판단 아래 과도한 단밸질의 과발현을 줄임으로써 부족한 단백질의 과발현을 증진시켜 heme을 증산하고자, 다음과 같은 과정을 통해 상대적으로 부족한 ALA로부터 heme을 생산하는 경로의 대사량을 증진시키고 상대적으로 과도한 ALA 생산 경로의 대사량을 감소시켜 heme을 증산하였다.
(a) 플라스미드 pCDF-hemAL의 제작
플라스미드 pRSFDuet-1보다 플라스미드 복제 개수가 적은 플라스미드 pCDFDuet-1(Novagen, 미국)를 기반으로 C5 ALA 생합성 경로의 유전자를 과발현함으로써 pRSF-C5를 이용하는 경우보다 ALA 생합성 유전자의 발현량을 감소시키고 결과적으로 해당 경로의 대사량도 낮출 수 있도록 하였다. 또한 C5 ALA 생합성 경로에서 glutamate를 glutamyl-tRNA로 전환하는 glutamyl tRNA synthetase (GluRS)의 유전자 gltX를 과발현시키지 않음으로써 다른 단백질들의 과발현량이 증진될 수 있도록 하였다. pCDFDuet-1을 기반으로 C5 ALA 생합성 경로를 과발현시키는 플라스미드 pCDF-hemAL은 다음과 같은 과정을 통해 제작하였다.
E. coli BL21(DE3) 균주의 유전체 DNA로부터 hemL 및 음성 피드백 저항성 hemA (hemA fbr) 유전자를 증폭하기 위해 각각 서열번호 15와 서열번호 16의 프라이머, 서열번호 17과 서열번호 18의 프라이머를 이용하였다.
이때 증폭하는 과정에서 사용한 서열번호 15의 프라이머에 포함된 ribosome binding site (RBS)의 서열에 의하여, 증폭된 hemL 유전자의 5′ 말단에 RBS의 서열이 첨가되었다. 또한 서열번호 17의 프라이머에 포함된 threonine과 leucine을 암호화하는 염기서열에 의하여 BL21(DE3) 유래 hemA 유전자가 음성 피드백 저항성 hemA (hemA fbr)로 전환되었다.
증폭한 서열은 각각 NcoI과 BamHI 및 SacI과 NotI 으로 절단한 뒤 동일한 제한효소로 절단한 pCDFDuet-1 벡터 (Novagen, 미국)에 순차적으로 삽입하여 pCDF-hemAL을 제작하였다.
(b) 플라스미드 pRSF-hemBCD의 제작
플라스미드 pETDuet-1 보다 플라스미드 복제 개수가 많은 플라스미드 pRSFDuet-1을 기반으로 ALA로부터 heme을 생산하는 대사 경로의 상단부에 관여하는 유전자 hemB, hemC, hemD를 과발현함으로써 ALA로부터 heme을 생산하는 대사 경로의 흐름이 증진되도록 하였다. pRSFDuet-1을 기반으로 hemB, hemC, hemD 유전자를 과발현시키는 플라스미드 pRSF-hemBCD는 다음과 같은 과정을 통해 제작하였다.
E. coli BL21(DE3) 균주의 유전체 DNA로부터 hemB, hemC, hemD 유전자를 증폭하기 위해 서열번호 25와 서열번호 26의 프라이머, 서열번호 42와 서열번호 43의 프라이머 및 서열번호 44와 서열번호 45의 프라이머를 이용하였다.
이때 증폭하는 과정에서 사용한 서열번호 44의 프라이머에 포함된 ribosome binding site(RBS)의 서열에 의하여, 증폭된 hemD 유전자의 5′ 말단에 RBS의 서열이 첨가되었다.
증폭한 서열은 각각 NcoI과 BamHI, NdeI과 BglII 및 BglII와 XhoI 으로 절단한 뒤 동일한 제한효소로 절단한 pRSFDuet-1 벡터 (Novagen, 미국)에 순차적으로 삽입하여 pRSF-hemBCD를 제작하였다.
(c) 플라스미드 pET-hemEFGH의 제작
플라스미드 pCDFDuet-1보다 플라스미드 복제 개수가 많은 플라스미드 pETDuet-1을 기반으로 ALA로부터 heme을 생산하는 대사 경로의 하류에 관여하는 유전자 hemE, hemF, hemG 및 hemH를 과발현함으로써 ALA로부터 heme을 생산하는 대사 경로의 흐름이 증진되도록 하였다. pETDuet-1을 기반으로 hemE, hemF, hemG 및 hemH 유전자를 과발현시키는 플라스미드 pET-hemEFGH는 다음과 같은 과정을 통해 제작하였다.
E. coli BL21(DE3) 균주의 유전체 DNA로부터 hemE, hemF, hemG 및 hemH 유전자를 증폭하기 위해 각각 서열번호 46과 서열번호 47의 프라이머, 서열번호 48과 서열번호 49의 프라이머, 서열번호 50과 서열번호 51의 프라이머 및 서열번호 23와 서열번호 24의 프라이머를 이용하였다.
이때 증폭하는 과정에서 사용한 서열번호 48과 서열번호 50의 프라이머에 포함된 ribosome binding site (RBS)의 서열에 의하여, 증폭된 hemF 및 hemG 유전자의 5′ 말단에 RBS의 서열이 첨가되었다.
증폭한 서열은 각각 NcoI과 SacI, SacI과 PstI, PstI와 NotI 및 NdeI과 XhoI 으로 절단한 뒤 동일한 제한효소로 절단한 pETDuet-1 벡터 (Novagen, 미국)에 순차적으로 삽입하여 pET-hemEFGH를 제작하였다.
(d) 재조합 E. coli HEME3의 제작
상기 제작한 플라스미드 pCDF-hemAL, pRSF-hemBCD 및 pET-hemEFGH를 E. coli BL21(DE3) 균주에 한데 도입하여 E. coli HEME3 균주를 제작하였다 (도 2d 및 표 14).
Figure PCTKR2018015748-appb-T000014
상기 제작한 E. coli 균주의 ALA 및 heme 생산 프로필을 확인하기 위해, 표 14에 개시된 균주를 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin 및 100μg/mL streptomycin이 첨가된 5 mL LB 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종한 뒤 37℃, 220 rpm의 조건에서 12 시간 동안 배양하였다. Heme 생산을 위한 본배양을 위해 상기 배양한 균체가 자라고 있는 배양액 1 mL를 동일 항생제가 포함된 LB-Fe7.5 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract, 7.5 mg/L FeSO47H2O) 50 mL에 접종한 뒤 250-mL Erlenmeyer flask에서 OD600이 약 0.6에 이를 때까지 37℃, 200 rpm의 조건에서 배양하였다. 이후 1 mM IPTG를 첨가한 후 30℃, 200 rpm의 조건에서 48 시간 동안 배양하였다.
상기 배양 후 ALA 생산량 분석을 위해 샘플을 취한 뒤 기보고된 방법 (Burnham, Methods Enzymol. 17A, 195-204, 1970)을 통해 샘플을 전처리 및 분석하였다.
또한 heme의 생산량을 확인하기 위해 샘플 1 mL를 취하고 원심분리를 통해 회수한 세포를 1 M NaOH 수용액 500 μL에 다시 풀어내었으며, 초음파분쇄법을 통해 세포를 융해시켰다. 준비한 샘플을 필터링한 뒤 HPLC를 이용하는 기보고된 방법 (Lee et al., J. Microbiol. Biotechnol. 22, 1653-1658, 2012)으로 heme 농도를 측정하였다.
그 결과, HEME2 균주 (0.53 mg/L)와 비교해 HEME3 균주에서는 heme 생산량이 3.79 mg/L로 증산되었다 (도 2d 및 도 3). 즉, heme 생합성 경로 유전자들의 발현량을 조정함으로써 heme을 증산할 수 있었다.
실시예3: Heme 증산을 위한 경쟁 대사회로 결실
Heme 증산을 위해 heme 생합성 경로와 경쟁 관계에 있는 대사 경로들을 결실시킬 수 있다. 먼저 포도당으로부터 C5 ALA 생합성 경로의 전구체인 glutamate까지의 대사 흐름을 증가시키기 위해 해당과정의 대사 산물들이 초산이나 젖산 등의 부산물로 전환되는 것을 막을 수 있다. 또한 생성된 heme이 분해되는 것을 막음으로써 heme의 생산량을 높일 수 있다.
3-1: Heme 증산을 위한 ldhA 및 pta 유전자의 결실
C5 ALA 생합성 경로를 이용하는 본 발명의 균주 내에서 포도당이 glutamate로 전환되는 수율 및 대사량을 높이기 위해 해당과정의 대사 산물인 pyruvate 및 acetyl-CoA가 각각 젖산 및 초산으로 전환되는 것을 막는 것이 필요하다. Pyruvate를 젖산으로 전환다는 데 관여하는 ldhA 유전자 및 acetyl-CoA를 초산으로 전환하는 데 관여하는 pta 유전자를 결실시킴으로써 glutamate 생산량을 높일 수 있다는 기존 보고 (Vuoristo et al., AMB Express 5, 61, 2015)에 따라 다음과 같은 과정을 통해 HEME3로부터 ldhA 및 pta 유전자를 결실하였다.
(a) 유전자 결실용 DNA 절편 제작
기보고된 λ Red recombineering 기법 (Datsenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 6640-6645, 2000)을 이용해 ldhA 및 pta 유전자를 결실시키고자 유전자 결실에 필요한 DNA 절편을 제작하였다. 플라스미드 pECmulox(Kim et al., FEMS Microbiol. Lett. 278, 78-85, 2008)로부터 ldhA 유전자를 결실시키는 데 이용할 DNA 절편 (ΔldhA::cat)와 pta 유전자를 결실시키는 데 이용할 DNA 절편 (Δpta::cat)을 증폭하기 위해 서열번호 52와 서열번호 53의 프라이머 및 서열번호 54와 서열번호 55의 프라이머를 이용하였다.
Figure PCTKR2018015748-appb-T000015
(b) BL21(DE3)로부터 ldhA 유전자 결실
상기 제작한 DNA 절편을 이용해 ldhA 유전자를 결실시키기 위해 BL21(DE3) 균주에 플라스미드 pKD46 (Datsenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 6640-6645, 2000)을 도입한 뒤 50μg/mL ampicillin이 첨가된 5 mL LB 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종하여 30℃, 200 rpm에서 overnight 배양하였다. 배양한 균체 및 배지 1 mL를 50μg/mL ampicillin 및 1 mM arabinose가 첨가된 100 mL LB 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종한 뒤 OD600이 약 0.6에 이를 때까지 30℃, 200 rpm에서 배양하였다. 배양한 균체는 회수 후 0℃로 냉각된 10% glycerol로 2회 세척 후 동일한 수용액 150 μL에 다시 풀어내었다. 이후 천공법을 통해 상기 제작한 ldhA 유전자 결실용 DNA 절편 (ΔldhA::cat)을 도입한 뒤 ldhA 유전자가 결실되면서 chloramphenicol 내성 유전자 (cat)가 도입된 콜로니를 8.5μg/mL chloramphenicol이 포함된 LB-agar 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract, 15g/L agar)상에서 37℃로 배양하여 선별하였다.
콜로니 선별을 위한 37℃ 배양 중 상기 선별된 콜로니에서 플라스미드 pKD46이 제거된 것을 확인한 뒤 다시 플라스미드 pJW168 (Wild et al., Gene 223, 55-66, 1998)을 도입하고 50μg/mL ampicillin 및 1 mM IPTG가 첨가된 LB-agar 배지(10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract, 15g/L agar)상에서 30℃로 배양하여 chloramphenicol 내성 유전자 (cat)를 제거하였다. 제작된 균주 BL21(DE3) ΔldhA (표 16)에서 ldhA 유전자의 결실은 sequencing을 통해 확인하였다.
Figure PCTKR2018015748-appb-T000016
(c) BL21(DE3) ΔldhA로부터 pta 유전자 결실
상기 제작한 DNA 절편을 이용해 pta 유전자를 결실시키기 위해 BL21(DE3) 균주에 플라스미드 pKD46 (Datsenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 6640-6645, 2000)을 도입한 뒤 50μg/mL ampicillin이 첨가된 5 mL LB 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종하여 30℃, 200 rpm에서 overnight 배양하였다. 배양한 균체 및 배지 1 mL를 50μg/mL ampicillin 및 1 mM arabinose가 첨가된 100 mL LB 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종한 뒤 OD600이 약 0.6에 이를 때까지 30℃, 200 rpm에서 배양하였다. 배양한 균체는 회수 후 0℃로 냉각된 10% glycerol로 2회 세척 후 동일한 수용액 150 μL 에 다시 풀어내었다. 이후 천공법을 통해 상기 제작한 pta 유전자 결실용 DNA 절편 (Δpta::cat)을 도입한 뒤 pta 유전자가 결실되면서 chloramphenicol 내성 유전자 (cat)가 도입된 콜로니를 8.5μg/mL chloramphenicol이 포함된 LB-agar 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract, 15g/L agar)상에서 37℃로 배양하여 선별하였다.
콜로니 선별을 위한 37℃ 배양 중 상기 선별된 콜로니에서 플라스미드 pKD46이 제거된 것을 확인한 뒤 다시 플라스미드 pJW168(Wild et al., Gene 223, 55-66, 1998)을 도입하고 50μg/mL ampicillin 및 1 mM IPTG가 첨가된 LB-agar 배지(10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract, 15g/L agar)상에서 30℃로 배양하여 chloramphenicol 내성 유전자 (cat)를 제거하였다. 제작된 균주 BL21(DE3) Δpta ΔldhA에서 pta 유전자의 결실은 sequencing을 통해 확인하였다.
Figure PCTKR2018015748-appb-T000017
(d) 재조합 E. coli HEME5의 제작
상기 표 17에 개시된 BL21(DE3) Δpta ΔldhA에 실시예 2-2에서 제작한 플라스미드 pCDF-hemAL, pRSF-hemBCD 및 pET-hemEFGH를 한데 도입하여 E. coli HEME5 균주를 제작하였다 (표 18).
Figure PCTKR2018015748-appb-T000018
상기 제작한 E. coli 균주의 ALA 및 heme 생산 프로필을 확인하기 위해, 표 18에 개시된 균주를 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin 및 100μg/mL streptomycin이 첨가된 5 mL LB 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종한 뒤 37℃, 220 rpm의 조건에서 12 시간 동안 배양하였다. Heme 생산을 위한 본배양을 위해 상기 배양한 균체가 자라고 있는 배양액 1 mL를 동일 항생제가 포함된 LB-Fe7.5 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract, 7.5 mg/L FeSO47H2O) 50 mL에 접종한 뒤 250-mL Erlenmeyer flask에서 OD600이 약 0.6에 이를 때까지 37℃, 200 rpm의 조건에서 배양하였다. 이후 1 mM IPTG를 첨가한 후 30℃, 200 rpm의 조건에서 48 시간 동안 배양하였다.
상기 배양 후 ALA 생산량 분석을 위해 샘플을 취한 뒤 기보고된 방법 (Burnham, Methods Enzymol. 17A, 195-204, 1970)을 통해 샘플을 전처리 및 분석하였다.
또한 heme의 생산량을 확인하기 위해 샘플 1 mL를 취하고 원심분리를 통해 회수한 세포를 1 M NaOH 수용액 500 μL에 다시 풀어내었으며, 초음파분쇄법을 통해 세포를 융해시켰다. 준비한 샘플을 필터링한 뒤 HPLC를 이용하는 기보고된 방법 (Lee et al., J. Microbiol. Biotechnol. 22, 1653-1658, 2012)으로 heme 농도를 측정하였다.
그 결과, HEME3 균주 (3.79 mg/L)와 비교해 HEME5 균주에서는 heme 생산량이 4.17 mg/L로 증산되었다 (도 3).
3-2: Heme 증산을 위한 yfeX 유전자의 결실
기존의 연구에서 yfeX 유전자로부터 발현된 단백질이 heme으로부터 Fe2+ 이온을 제거하는 heme dechelatase라고 보고한 바 (Letoffe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 11719-11724, 2009) 있지만 다른 보고에서는 yfeX 유전자의 발현 산물이 heme dechelatase가 아닌 porphyrinogen을 porphyrin으로 전환하는 peroxidase라고 보고한 바 있다 (Dailey et al., mBio 2, e00248-00211, 2011). 그러나 또 다른 연구에서는 yfeX 유전자를 과발현시킬 경우 heme 항상성이 무너진다고 보고하였다 (Turlin et al., Microbiology Open 3, 849-859, 2014). 여전히 yfeX 유전자의 정확인 기능은 밝혀지지 않았으나 yfeX 유전자를 결실시켰을 때 heme이 증산될 가능성이 있다고 판단하여 yfeX 유전자 결실이 heme 생산량에 미치는 영향을 다음과 같은 과정을 통해 확인하였다.
(a) 유전자 결실용 DNA 절편 제작
기보고된 λ Red recombineering 기법 (Datsenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 6640-6645, 2000)을 이용해 yfeX 유전자를 결실시키고자 유전자 결실에 필요한 DNA 절편을 제작하였다. 플라스미드 pECmulox (Kim et al., FEMS Microbiol. Lett. 278, 78-85, 2008)로부터 ldhA 유전자를 결실시키는 데 이용할 DNA 절편 (ΔyfeX::cat)을 증폭하기 위해 서열번호 56과 서열번호 57의 프라이머를 이용하였다.
Figure PCTKR2018015748-appb-T000019
(b) BL21(DE3)로부터 yfeX 유전자 결실
상기 제작한 DNA 절편을 이용해 yfeX 유전자를 결실시키기 위해 BL21(DE3) 균주에 플라스미드 pKD46 (Datsenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 6640-6645, 2000)을 도입한 뒤 50μg/mL ampicillin이 첨가된 5 mL LB 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종하여 30℃, 200 rpm에서 overnight 배양하였다. 배양한 균체 및 배지 1 mL를 50μg/mL ampicillin 및 1 mM arabinose가 첨가된 100 mL LB 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종한 뒤 OD600이 약 0.6에 이를 때까지 30℃, 200 rpm에서 배양하였다. 배양한 균체는 회수 후 0℃로 냉각된 10% glycerol로 2회 세척 후 동일한 수용액 150 μL에 다시 풀어내었다. 이후 천공법을 통해 상기 제작한 yfeX 유전자 결실용 DNA 절편 (ΔyfeX::cat)을 도입한 뒤 yfeX 유전자가 결실되면서 chloramphenicol 내성 유전자 (cat)가 도입된 콜로니를 8.5μg/mL chloramphenicol이 포함된 LB-agar 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract, 15g/L agar)상에서 37℃로 배양하여 선별하였다.
콜로니 선별을 위한 37℃ 배양 중 상기 선별된 콜로니에서 플라스미드 pKD46이 제거된 것을 확인한 뒤 다시 플라스미드 pJW168(Wild et al., Gene 223, 55-66, 1998)을 도입하고 50μg/mL ampicillin 및 1 mM IPTG가 첨가된 LB-agar 배지(10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract, 15g/L agar)상에서 30℃로 배양하여 chloramphenicol 내성 유전자 (cat)를 제거하였다. 제작된 균주 BL21(DE3) ΔyfeX (표 20)에서 yfeX 유전자의 결실은 sequencing을 통해 확인하였다.
Figure PCTKR2018015748-appb-T000020
(c) 재조합 E. coli HEME4의 제작
상기 표 20에 개시된 BL21(DE3) ΔyfeX에 실시예 2-2에서 제작한 플라스미드 pCDF-hemAL, pRSF-hemBCD 및 pET-hemEFGH를 한데 도입하여 E. coli HEME4 균주를 제작하였다 (표 21).
Figure PCTKR2018015748-appb-T000021
상기 제작한 E. coli 균주의 ALA 및 heme 생산 프로필을 확인하기 위해, 표 21에 개시된 균주를 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin 및 100μg/mL streptomycin이 첨가된 5 mL LB 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종한 뒤 37℃, 220 rpm의 조건에서 12 시간 동안 배양하였다. Heme 생산을 위한 본배양을 위해 상기 배양한 균체가 자라고 있는 배양액 1 mL를 동일 항생제가 포함된 LB-Fe7.5 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract, 7.5 mg/L FeSO47H2O) 50 mL에 접종한 뒤 250-mL Erlenmeyer flask에서 OD600이 약 0.6에 이를 때까지 37℃, 200 rpm의 조건에서 배양하였다. 이후 1 mM IPTG를 첨가한 후 30℃, 200 rpm의 조건에서 48 시간 동안 배양하였다.
상기 배양 후 ALA 생산량 분석을 위해 샘플을 취한 뒤 기보고된 방법 (Burnham, Methods Enzymol. 17A, 195-204, 1970)을 통해 샘플을 전처리 및 분석하였다.
또한 heme의 생산량을 확인하기 위해 샘플 1 mL를 취하고 원심분리를 통해 회수한 세포를 1 M NaOH 수용액 500 μL에 다시 풀어내었으며, 초음파분쇄법을 통해 세포를 융해시켰다. 준비한 샘플을 필터링한 뒤 HPLC를 이용하는 기보고된 방법 (Lee et al., J. Microbiol. Biotechnol. 22, 1653-1658, 2012)으로 heme 농도를 측정하였다.
그 결과, HEME3 균주 (3.79 mg/L)와 비교해 HEME4 균주에서는 heme 생산량이 6.21 mg/L로 증산되었다 (도 3).
3-3: Heme 증산을 위한 pta, ldhA 및 yfeX 유전자의 결실
실시에 3-1 및 3-2에 개시된 바와 같이 HEME3 균주 (3.79 mg/L)와 비교해 pta 및 ldhA 유전자를 결실시킨 균주 HEME5 (4.17mg/mL heme)와 yfeX 유전자를 결실시킨 균주 HEME4 (6.21mg/mL heme)에서 heme이 증산되었다. 따라서 실시예 3-1 및 실시예 3-2의 유전자 결실 전략을 함께 사용할 경우 heme을 추가 증산할 수 있는지 확인하기 위해 상기 세가지 유전자를 모두 결실시킨 균주를 다음과 같은 과정을 통해 확인하였다.
(a) 유전자 결실용 DNA 절편 제작
기보고된 λ Red recombineering 기법 (Datsenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 6640-6645, 2000)을 이용해 yfeX 유전자를 결실시키고자 유전자 결실에 필요한 DNA 절편을 제작하였다. 플라스미드 pECmulox (Kim et al., FEMS Microbiol. Lett. 278, 78-85, 2008)로부터 ldhA 유전자를 결실시키는 데 이용할 DNA 절편 (ΔyfeX::cat)을 증폭하기 위해 서열번호 56과 서열번호 57의 프라이머를 이용하였다.
(b) BL21(DE3) ΔPL 로부터 yfeX 유전자 결실
상기 제작한 DNA 절편을 이용해 yfeX 유전자를 결실시키기 위해 BL21(DE3) ΔPL 균주에 플라스미드 pKD46(Datsenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 6640-6645, 2000)을 도입한 뒤 50μg/mL ampicillin이 첨가된 5 mL LB 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종하여 30℃, 200 rpm에서 overnight 배양하였다. 배양한 균체 및 배지 1 mL를 50μg/mL ampicillin 및 1 mM arabinose가 첨가된 100 mL LB 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종한 뒤 OD600이 약 0.6에 이를 때까지 30℃, 200 rpm에서 배양하였다. 배양한 균체는 회수 후 0℃로 냉각된 10% glycerol로 2회 세척 후 동일한 수용액 150 μL 에 다시 풀어내었다. 이후 천공법을 통해 상기 제작한 yfeX 유전자 결실용 DNA 절편 (ΔyfeX::cat)을 도입한 뒤 yfeX 유전자가 결실되면서 chloramphenicol 내성 유전자 (cat)가 도입된 콜로니를 8.5μg/mL chloramphenicol이 포함된 LB-agar 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract, 15g/L agar)상에서 37℃로 배양하여 선별하였다.
콜로니 선별을 위한 37℃ 배양 중 상기 선별된 콜로니에서 플라스미드 pKD46이 제거된 것을 확인한 뒤 다시 플라스미드 pJW168(Wild et al., Gene 223, 55-66, 1998)을 도입하고 50μg/mL ampicillin 및 1 mM IPTG가 첨가된 LB-agar 배지(10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract, 15g/L agar)상에서 30℃로 배양하여 chloramphenicol 내성 유전자 (cat)를 제거하였다. 제작된 균주 BL21(DE3) Δpta ΔldhA ΔyfeX (표 22)에서 yfeX 유전자의 결실은 sequencing을 통해 확인하였다.
Figure PCTKR2018015748-appb-T000022
(c) 재조합 E. coli HEME6의 제작
상기 표 22에 개시된 BL21(DE3) Δpta ΔldhA ΔyfeX에 실시예 2-2에서 제작한 플라스미드 pCDF-hemAL, pRSF-hemBCD 및 pET-hemEFGH를 한데 도입하여 E. coli HEME6 균주를 제작하였다 (도 2e 및 표 23).
Figure PCTKR2018015748-appb-T000023
상기 제작한 E. coli 균주의 ALA 및 heme 생산 프로필을 확인하기 위해, 표 14에 개시된 균주를 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin 및 100μg/mL streptomycin이 첨가된 5 mL LB 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종한 뒤 37℃, 220 rpm의 조건에서 12 시간 동안 배양하였다. Heme 생산을 위한 본배양을 위해 상기 배양한 균체가 자라고 있는 배양액 1 mL를 동일 항생제가 포함된 LB-Fe7.5 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract, 7.5 mg/L FeSO47H2O) 50 mL에 접종한 뒤 250-mL Erlenmeyer flask에서 OD600이 약 0.6에 이를 때까지 37℃, 200 rpm의 조건에서 배양하였다. 이후 1 mM IPTG를 첨가한 후 30℃, 200 rpm의 조건에서 48 시간 동안 배양하였다.
상기 배양 후 ALA 생산량 분석을 위해 샘플을 취한 뒤 기보고된 방법 (Burnham, Methods Enzymol. 17A, 195-204, 1970)을 통해 샘플을 전처리 및 분석하였다.
또한 heme의 생산량을 확인하기 위해 샘플 1 mL를 취하고 원심분리를 통해 회수한 세포를 1 M NaOH 수용액 500 μL에 다시 풀어내었으며, 초음파분쇄법을 통해 세포를 융해시켰다. 준비한 샘플을 필터링한 뒤 HPLC를 이용하는 기보고된 방법 (Lee et al., J. Microbiol. Biotechnol. 22, 1653-1658, 2012)으로 heme 농도를 측정하였다.
그 결과, HEME3 균주 (3.79 mg/L), HEME5 균주 (4.17mg/mL) 및 HEME4 균주 (6.21mg/mL)와 비교해 HEME6 균주에서는 heme 생산량이 7.13 mg/L로 증산되었다 (도 2e 및 도 3).
실시예4: Heme 증산을 위한 배양 조건 최적화
4-1: Heme 생산 배지 최적화: 기본 배지 조성 선별
실시예 3에서 제작한 HEME6 균주의 heme 생산량을 추가로 증진시기키 위해 균주 배양에 이용하는 배지의 조성을 최적화하였다. LB 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract), TB 배지 (16.43g/L K2HPO4·3H20, 2.31g/L, KH2PO4, 4g/L glycerol, 12g/L tryptone 12g/L, 24g/L yeast extract 24g/L) 및 MR-Fe0 배지 (6.67g/L KH2PO4, 4g/L (NH4)2HPO4, 0.8g/L MgSO47H2O, 0.8g/L citric acid, 5 g/L yeast extract, 5 mL/L trace metal solution, pH7.0)를 포함에 각 배지에 7.5 mg/L FeSO47H2O를 첨가한 LB-Fe7.5, TB-Fe7.5 및 MR-Fe7.5 배지에서 HEME6 균주를 배양해 heme 생산량을 측정하였다. 단, trace metal solution I의 조성은 다음과 같다: 0.5 M HCl, 2g/L CaCl2, 2.2g/L ZnSO47H2O, 0.5g/L MnSO44H2O, 1g/L CuSO45H2O, 0.1g/L (NH4)6Mo7O244H2O, 0.02g/L Na2B4O710H2O.
상기 배지에서 HEME6 균주의 heme 생산 프로필을 확인하기 위해, 표 14에 개시된 균주를 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin 및 100μg/mL streptomycin이 첨가된 5 mL LB 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종한 뒤 37℃, 220 rpm의 조건에서 12 시간 동안 배양하였다. Heme 생산을 위한 본배양을 위해 상기 배양한 균체가 자라고 있는 배양액 1 mL를 새롭게 준비한, 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin 및 100μg/mL streptomycin이 첨가된 상기 6가지 배지 50 mL에 접종한 뒤 250-mL Erlenmeyer flask에서 OD600이 약 0.6에 이를 때까지 37℃, 200 rpm의 조건에서 배양하였다. 이후 1 mM IPTG를 첨가한 후 30℃, 200 rpm의 조건에서 48 시간 동안 배양하였다.
Heme의 생산량을 확인하기 위해 샘플 1 mL를 취하고 원심분리를 통해 회수한 세포를 1 M NaOH 수용액 500 μL에 다시 풀어내었으며, 초음파분쇄법을 통해 세포를 융해시켰다. 준비한 샘플을 필터링한 뒤 HPLC를 이용하는 기보고된 방법 (Lee et al., J. Microbiol. Biotechnol. 22, 1653-1658, 2012)으로 heme 농도를 측정하였다.
그 결과, MR-Fe7.5 배지에서 HEME6 균주를 배양한 경우 (7.45 mg/L) 가장 많은 양의 heme을 생산하는 것을 확인하였다 (도 4).
4-2: Heme 생산 배지 최적화: 철 이온 농도 선별
실시예 4-1에서 선별한 MR-Fe7.5 배지에서의 heme 생산량과 MR-Fe0 배지에서의 heme 생산량 차이가 두드러지게 차이난다는 결과로부터 철 이온의 농도가 heme 생산량에 큰 영향을 준는지 여부를 확인하였다. 따라서 배지의 철 이온 농도를 최적화함으로써 HEME6 균주의 heme 생산량을 추가로 증진시키고자 하였다. 실시예 4-1의 MR-Fe0 배지를 기준으로 FeSO47H2O를 각각 0, 10, 20, 40, 60 100 mg/L 첨가하여 MR-Fe0, MR-Fe10, MR-Fe20, MR-Fe40, MR-FE60, MR-Fe100 배지를 제작하였다.
상기 배지에서 HEME6 균주의 heme 생산 프로필을 확인하기 위해, 표 14에 개시된 균주를 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin 및 100μg/mL streptomycin이 첨가된 5 mL LB 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종한 뒤 37℃, 220 rpm의 조건에서 12 시간 동안 배양하였다. Heme 생산을 위한 본배양을 위해 상기 배양한 균체가 자라고 있는 배양액 1 mL를 새롭게 준비한, 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin 및 100μg/mL streptomycin이 첨가된 상기 6가지 배지 50 mL에 접종한 뒤 250-mL Erlenmeyer flask에서 OD600이 약 0.6에 이를 때까지 37℃, 200 rpm의 조건에서 배양하였다. 이후 1 mM IPTG를 첨가한 후 30℃, 200 rpm의 조건에서 48 시간 동안 배양하였다.
Heme의 생산량을 확인하기 위하여 샘플 1 mL를 취하고 원심분리를 통해 회수한 세포를 1 M NaOH 수용액 500 μL에 다시 풀어내었으며, 초음파분쇄법을 통해 세포를 융해시켰다. 준비한 샘플을 필터링한 뒤 HPLC를 이용하는 기보고된 방법 (Lee et al., J. Microbiol. Biotechnol. 22, 1653-1658, 2012)으로 heme 농도를 측정하였다.
그 결과, 20 mg/L FeSO47H2O을 포함한 경우 (MR-Fe20 배지) 가장 많은 양의 heme을 생산하였다 (도 5).
4-3: 배양 온도 최적화
HEME6 균주를 이용해 heme을 생산하는데 최적의 배양 온도를 선정하기 위해 다음과 같은 과정을 통해 균주를 배양하였다.
표 23에 개시된 균주를 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin 및 100μg/mL streptomycin이 첨가된 5 mL LB 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종한 뒤 37℃, 220 rpm의 조건에서 12 시간 동안 배양하였다. Heme 생산을 위한 본배양을 위해 상기 배양한 균체가 자라고 있는 배양액 1 mL를 새롭게 준비한, 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin 및 100μg/mL streptomycin이 첨가된 MR-Fe20 배지 50 mL에 접종한 뒤 250-mL Erlenmeyer flask에서 OD600이 약 0.6에 이를 때까지 37℃, 200 rpm의 조건에서 배양하였다. 이후 1 mM IPTG를 첨가한 후 24℃, 30℃ 및 37℃, 200 rpm의 조건에서 72시간 동안 배양하였으며, 첫 24시간 동안은 6시간 간격으로, 이후로는 12시간 간격으로 샘플링을 하였다.
Heme의 생산량을 확인하기 위해 샘플 1 mL로부터 원심분리를 통해 회수한 세포를 1 M NaOH 수용액 500 μL에 다시 풀어내었으며, 초음파분쇄법을 통해 세포를 융해시켰다. 준비한 샘플을 필터링한 뒤 HPLC를 이용하는 기보고된 방법 (Lee et al., J. Microbiol. Biotechnol. 22, 1653-1658, 2012)으로 heme 농도를 측정하였다.
그 결과, 1 mM IPTG를 첨가하고 30℃에서 60시간 동안 배양한 경우 (7.78g/L) 가장 많은 양의 heme을 생산하는 것을 확인하였다 (도 6).
실시예5: 회분 발효 및 유가 배양식 발효를 통한 세포외 자유 heme 생산
5-1: 회분 발효를 통한 세포외 자유 heme 생산
Heme 생산을 위해 발효기를 이용한 발효를 진행한 사례가 보고된 바 없으므로 실시예4에서 최적화한 배양 조건을 기반으로 HEME6 균주를 이용한 회분식 발효를 진행하였다.
표 23에 개시된 균주를 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin 및 100μg/mL streptomycin이 첨가된 5 mL LB 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종한 뒤 37℃, 220 rpm의 조건에서 12 시간 동안 배양하였다. Heme 생산을 위한 본배양을 위해 상기 배양한 균체가 자라고 있는 배양액 1 mL를 새롭게 준비한, 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin 및 100μg/mL streptomycin이 첨가된 MR-Fe20 배지 200 mL에 접종한 뒤 500-mL Erlenmeyer flask에서 37℃, 200 rpm의 조건으로 12시간 동안 배양하였다. 이후 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin, 100μg/mL streptomycin 및 20g/L 포도당이 첨가된 MR-Fe20 배지 (pH7.0) 1.8L가 200 rpm의 교반 및 2 L/min 유속의 공기 공급에 의해 공기 포화된 상태 및 30℃로 담겨져 있는 6.6-L Bioflo3000 발효기 (New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ)에 상기 배양체를 접종하였다. 발효 도중 온도는 30℃로 유지되었으며, 50% NH4OH를 이용해 pH를 7.0으로 유지하였다. 또한 공기 포화도는 교반 속도를 최대 1000 rpm까지 증가시켜 초기 공기 포화도의 40% 수준을 유지하였다. OD600이 5에 이렀을 때 1 mM IPTG를 첨가하였으며, heme 생산량 분석을 위해 8시간 간격으로 샘플링을 하였다.
Heme의 생산량을 확인하기 위해 샘플 1 mL로부터 원심분리를 통해 회수한 세포를 1 M NaOH 수용액 500 μL에 다시 풀어내었으며, 초음파분쇄법을 통해 세포를 융해시켰다. 준비한 배지 및 파쇄한 세포 샘플은 필터링한 뒤 HPLC를 이용하는 기보고된 방법 (Lee et al., J. Microbiol. Biotechnol. 22, 1653-1658, 2012)으로 heme 농도를 측정하였다.
그 결과, 56시간 째에 가장 많은 양인 총 14.24 mg/L의 heme이 생산되었으며, 이중 1.18 mg/L의 heme (8.29%)이 배지에서 검출되었다. 56시간 동안 전체 생산성은 0.25 mg/L/h였다 (도 7). 본 실시예의 회분식 발표를 통해 1 mg/L 이상의 세포외 자유 heme을 검출할 수 있었다는 데 큰 의의가 있다.
5-2: 유가 배양식 발효를 통한 세포외 자유 heme 생산
실시예 5-1의 회분식 발효 결과를 바탕으로 보다 많은 양의 heme을 생산하기 위해 유가 배양식 발효를 진행하였다.
표 23에 개시된 균주를 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin 및 100μg/mL streptomycin이 첨가된 5 mL LB 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종한 뒤 37℃, 220 rpm의 조건에서 12 시간 동안 배양하였다. Heme 생산을 위한 본배양을 위해 상기 배양한 균체가 자라고 있는 배양액 1 mL를 새롭게 준비한, 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin 및 100μg/mL streptomycin이 첨가된 MR-Fe20 배지 200 mL에 접종한 뒤 500-mL Erlenmeyer flask에서 37℃, 200 rpm의 조건으로 12시간 동안 배양하였다. 이후 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin, 100μg/mL streptomycin 및 20g/L 포도당이 첨가된 MR-Fe20 배지 (pH7.0) 1.8L가 200 rpm의 교반 및 2 L/min 유속의 공기 공급에 의해 공기 포화된 상태 및 30℃로 담겨져 있는 6.6-L Bioflo3000 발효기 (New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ)에 상기 배양체를 접종하였다. 발효 도중 온도는 30℃로 유지되었으며, 50% NH4OH를 이용해 pH를 7.0으로 유지하였다. 또한 공기 포화도는 교반 속도를 최대 1000 rpm까지 증가시켜 초기 공기 포화도의 40% 수준을 유지하였다. 유가 배양 중 계속적인 포도당 공급을 위해 pH 고정 기법을 이용하여 유입 용액 (700g/L glucose, 8g/L MgSO47H2O, 20 mg/L FeSO47H2O)를 공급하였다. OD600이 5에 이렀을 때 1 mM IPTG를 첨가하였으며, heme 생산량 분석을 위해 8시간 간격으로 샘플링을 하였다.
Heme의 생산량을 확인하기 위해 샘플 1 mL로부터 원심분리를 통해 회수한 세포를 1 M NaOH 수용액 500 μL에 다시 풀어내었으며, 초음파분쇄법을 통해 세포를 융해시켰다. 준비한 배지 및 파쇄한 세포 샘플은 필터링한 뒤 HPLC를 이용하는 기보고된 방법 (Lee et al., J. Microbiol. Biotechnol. 22, 1653-1658, 2012)으로 heme 농도를 측정하였다.
그 결과, 56시간째에 가장 많은 양인 총 49.18 mg/L의 heme이 생산되었으며, 이중 16.77 mg/L의 heme (34.10%)이 배지에서 검출되었다. OD600은 32시간 째에 최대치인 67.2에 이렀다 (도 8a).
5-3: (NH4)2SO4를 공급한 유가 배양식 발효를 통한 세포외 자유 heme 생산
Heme 한 분자를 생산하는 데 질소 원자가 4개 필요하다는 사실에 착안하여 질소원을 공급함으로써 heme을 증산할 수 있을 것이라 판단하였다. 가설을 검증하기 위해 (NH4)2SO4를 질소원으로 공급하며 유가 배양식 발효를 진행하였다.
표 23에 개시된 균주를 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin 및 100μg/mL streptomycin이 첨가된 5 mL LB 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종한 뒤 37℃, 220 rpm의 조건에서 12 시간 동안 배양하였다. Heme 생산을 위한 본배양을 위해 상기 배양한 균체가 자라고 있는 배양액 1 mL를 새롭게 준비한, 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin 및 100μg/mL streptomycin이 첨가된 MR-Fe20 배지 200 mL에 접종한 뒤 500-mL Erlenmeyer flask에서 37℃, 200 rpm의 조건으로 12시간 동안 배양하였다. 이후 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin, 100μg/mL streptomycin 및 20g/L 포도당이 첨가된 MR-Fe20 배지 (pH7.0) 1.8L가 200 rpm의 교반 및 2 L/min 유속의 공기 공급에 의해 공기 포화된 상태 및 30℃로 담겨져 있는 6.6-L Bioflo3000 발효기 (New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ)에 상기 배양체를 접종하였다. 발효 도중 온도는 30℃로 유지되었으며, 50% NH4OH를 이용해 pH를 7.0으로 유지하였다. 또한 공기 포화도는 교반 속도를 최대 1000 rpm까지 증가시켜 초기 공기 포화도의 40% 수준을 유지하였다. 유가 배양 중 계속적인 포도당 공급을 위해 pH 고정 기법을 이용하여 유입 용액 (700g/L glucose, 8g/L MgSO47H2O, 20 mg/L FeSO47H2O, 5g/L (NH4)2SO4)를 공급하였다. OD600이 5에 이렀을 때 1 mM IPTG를 첨가하였으며, heme 생산량 분석을 위해 8시간 간격으로 샘플링을 하였다.
Heme의 생산량을 확인하기 위해 샘플 1 mL로부터 원심분리를 통해 회수한 세포를 1 M NaOH 수용액 500 μL에 다시 풀어내었으며, 초음파분쇄법을 통해 세포를 융해시켰다. 준비한 배지 및 파쇄한 세포 샘플은 필터링한 뒤 HPLC를 이용하는 기보고된 방법 (Lee et al., J. Microbiol. Biotechnol. 22, 1653-1658, 2012)으로 heme 농도를 측정하였다.
그 결과, 56시간 째에 가장 많은 양인 총 104.90 mg/L의 heme이 생산되었으며, 이중 54.61 mg/L의 heme (52.06%)이 배지에서 검출되었다. OD600은 48시간 째에 최대치인 93.8에 이렀다 (도 8b).
5-4: Glutamate를 공급한 유가 배양식 발효를 통한 세포외 자유 heme 생산
본 발명에서 제작한 HEME6 균주는 상기 실시예들에서 검증된 바와 같이 ALA 생산 전구체를 공급하지 않고도 세계 최고 heme 생산량을 보이는 것이 장점이나, 가격이 비교적 비싸고 세포 독성이 있는 C4 ALA 생합성 경로의 전구체 glycine과 달리 HEME6 균주가 이용하는 C5 ALA 생합성 경로의 전구체인 glutamate는 비교적 값이 저렴할뿐더러 세포독성을 보이지 않는다. 따라서 본 발명에서 제작한 HEME6 균주의 최대 heme 생산능을 시험하기 위해 glutamate를 질소원으로 공급하며 유가 배양식 발효를 진행하였다.
표 23에 개시된 균주를 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin 및 100μg/mL streptomycin이 첨가된 5 mL LB 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종한 뒤 37℃, 220 rpm의 조건에서 12 시간 동안 배양하였다. Heme 생산을 위한 본배양을 위해 상기 배양한 균체가 자라고 있는 배양액 1 mL를 새롭게 준비한, 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin 및 100μg/mL streptomycin이 첨가된 MR-Fe20 배지 200 mL에 접종한 뒤 500-mL Erlenmeyer flask에서 37℃, 200 rpm의 조건으로 12시간 동안 배양하였다. 이후 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin, 100μg/mL streptomycin 및 20g/L 포도당이 첨가된 MR-Fe20 배지 (pH7.0) 1.8L가 200 rpm의 교반 및 2 L/min 유속의 공기 공급에 의해 공기 포화된 상태 및 30℃로 담겨져 있는 6.6-L Bioflo3000 발효기 (New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ)에 상기 배양체를 접종하였다. 발효 도중 온도는 30℃로 유지되었으며, 50% NH4OH를 이용해 pH를 7.0으로 유지하였다. 또한 공기 포화도는 교반 속도를 최대 1000 rpm까지 증가시켜 초기 공기 포화도의 40% 수준을 유지하였다. 유가 배양 중 계속적인 포도당 공급을 위해 pH 고정 기법을 이용하여 유입 용액 (700g/L glucose, 8g/L MgSO47H2O, 20 mg/L FeSO47H2O, 20g/L glutamate)를 공급하였다. OD600이 5에 이렀을 때 1 mM IPTG를 첨가하였으며, heme 생산량 분석을 위해 8시간 간격으로 샘플링을 하였다.
Heme의 생산량을 확인하기 위해 샘플 1 mL로부터 원심분리를 통해 회수한 세포를 1 M NaOH 수용액 500 μL에 다시 풀어내었으며, 초음파분쇄법을 통해 세포를 융해시켰다. 준비한 배지 및 파쇄한 세포 샘플은 필터링한 뒤 HPLC를 이용하는 기보고된 방법 (Lee et al., J. Microbiol. Biotechnol. 22, 1653-1658, 2012)으로 heme 농도를 측정하였다.
그 결과, 64시간 째에 가장 많은 양인 총 228.46 mg/L의 heme이 생산되었으며, 이중 131.90 mg/L의 heme (57.734%)이 배지에서 검출되었다. OD600은 48시간 째에 최대치인 172.8에 이렀다 (도 8c).
실시예6: Heme exporter 과발현을 통한 heme 증산 및 세포 밖으로의 heme 분비 증진
6-1: Heme exporter 유전자 ccmABC을 과발현하는 균주 제작
실시예 5에서 heme의 총 생산량이 증가함에 따라 세포 바깥으로 분비된 heme의 비율이 점차 증가함을 확인할 수 있었다. 이는, 세포 독성이 있는 heme (Anzaldi et al., Infect. Immun. 78, 4977-4989, 2010)이 과량 생산될 경우 heme exporter ccmABC에 의한 세포 바깥으로의 heme 분비 (Schulz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 6462-6467, 1999)가 촉진되어 세포외 자유 heme을 생산할 수 있을 것이라는 본 발명의 시작에 앞선 가설을 뒷받침한다. 동일 맥락으로 ccmABC 유전자를 과발현하면 세포 바깥으로의 heme 분비를 더욱 촉진시킬 수 있을 것이라고 판단하여 다음과 같은 과정을 통해 ccmABC 유전자를 과발현하는 균주를 제작하였다.
(a) 플라스미드 pACYC-ccmABC의 제작
Heme exporter를 암호화하는 유전자 ccmA (서열번호 58), ccmB (서열번호 59) 및 ccmC 유전자 (서열번호 60)를 과발현시키는 플라스미드 pACYC-ccmABC는 다음과 같은 과정을 통해 제작하였다.
E. coli BL21(DE3) 균주의 유전체 DNA로부터 ccmA, ccmB 및 ccmC 유전자를 증폭하기 위해 각각 서열번호 61과 서열번호 62의 프라이머, 서열번호 63과 서열번호 64의 프라이머 및 서열번호 65와 서열번호 66의 프라이머를 이용하였다.
이때 증폭하는 과정에서 사용한 서열번호 65의 프라이머에 포함된 ribosome binding site (RBS)의 서열에 의하여, 증폭된 ccmC 유전자의 5′ 말단에 RBS의 서열이 첨가되었다.
Figure PCTKR2018015748-appb-T000024
증폭한 서열은 각각 NcoI과 BamHI, EcoRI과 SalI 및 NdeI과 XhoI 으로 절단한 뒤 동일한 제한효소로 절단한 pACYCDuet-1 벡터 (Novagen, 미국)에 순차적으로 삽입하여 pACYC-ccmABC를 제작하였다.
(b) 재조합 E. coli HEME7의 제작
상기 제작한 플라스미드 pACYC-ccmABC를 표 23에 개시된 HEME6 균주에 도입하여 E. coli HEME7 균주를 제작하였다 (표 25).
Figure PCTKR2018015748-appb-T000025
6-2: (NH4)2SO4를 공급한 HEME7 균주의 유가 배양식 발효를 통한 세포외 자유 heme 생산
실시예 6-1에서 제작한, heme exporter 유전자 ccmABC를 과발현하는 HEME7 균주의 heme 생산능을 확인하고자 (NH4)2SO4를 질소원으로 공급하며 유가 배양식 발효를 진행하였다.
표 25에 개시된 균주를 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin, 100μg/mL streptomycin 및 17μg/mL chloramphenicol이 첨가된 5 mL LB 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종한 뒤 37℃, 220 rpm의 조건에서 12 시간 동안 배양하였다. Heme 생산을 위한 본배양을 위해 상기 배양한 균체가 자라고 있는 배양액 1 mL를 새롭게 준비한, 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin, 100μg/mL streptomycin 및 17μg/mL chloramphenicol이 첨가된 MR-Fe20 배지 200 mL에 접종한 뒤 500-mL Erlenmeyer flask에서 37℃, 200 rpm의 조건으로 12시간 동안 배양하였다. 이후 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin, 100μg/mL streptomycin, 17μg/mL chloramphenicol 및 20g/L 포도당이 첨가된 MR-Fe20 배지 (pH7.0) 1.8L가 200 rpm의 교반 및 2 L/min 유속의 공기 공급에 의해 공기 포화된 상태 및 30℃로 담겨 있는 6.6-L Bioflo3000 발효기 (New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ)에 상기 배양체를 접종하였다. 발효 도중 온도는 30℃로 유지되었으며, 50% NH4OH를 이용해 pH를 7.0으로 유지하였다. 또한 공기 포화도는 교반 속도를 최대 1000 rpm까지 증가시켜 초기 공기 포화도의 40% 수준을 유지하였다. 유가 배양 중 계속적인 포도당 공급을 위해 pH 고정 기법을 이용하여 유입 용액 (700g/L glucose, 8g/L MgSO47H2O, 20 mg/L FeSO47H2O, 5g/L (NH4)2SO4)를 공급하였다. OD600이 5에 이렀을 때 1 mM IPTG를 첨가하였으며, heme 생산량 분석을 위해 8시간 간격으로 샘플링을 하여, Heme의 생산량을 확인하였다.
그 결과, 64시간째에 가장 많은 양인 총 114.79 mg/L의 heme이 생산되었으며, 이중 71.91mg/L의 heme (62.64%)이 배지에서 검출되었다. OD600은 56시간 째에 최대치인 76.9mg/L에 이르렀다 (도 9a). 실시예 5-3의 유가 배양식 발효 결과와 비교할 때, 본 실시예에서의 가설과 같이 ccmABC 유전자를 과발현시킴으로써 세포 바깥으로의 heme 분비율을 10.58% 증진시킬 수 있었으며, 동시에 총 heme의 생산량 역시 9.89mg/L 증진시킬 수 있었다.
6-3: Glutamate를 공급한 HEME7 균주의 유가 배양식 발효를 통한 세포외 자유 heme 생산
실시예 6-1에서 제작한, heme exporter 유전자 ccmABC를 과발현하는 HEME7 균주의 C5 ALA 생합성 경로의 전구체가 공급되었을 때 heme 최대 생산능을 확인하고자 glutamate를 질소원으로 공급하며 유가 배양식 발효를 진행하였다.
표 25에 개시된 균주를 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin, 100μg/mL streptomycin 및 17μg/mL chloramphenicol이 첨가된 5 mL LB 배지 (10g/L NaCl, 10g/L tryptone, 5g/L yeast extract)에 접종한 뒤 37℃, 220 rpm의 조건에서 12 시간 동안 배양하였다. Heme 생산을 위한 본 배양을 위해 상기 배양한 균체가 자라고 있는 배양액 1 mL를 새롭게 준비한, 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin, 100μg/mL streptomycin 및 17μg/mL chloramphenicol이 첨가된 MR-Fe20 배지 200 mL에 접종한 뒤 500-mL Erlenmeyer flask에서 37℃, 200 rpm의 조건으로 12시간 동안 배양하였다. 이후 25μg/mL kanamycin, 50μg/mL ampicillin, 100μg/mL streptomycin, 17μg/mL chloramphenicol 및 20g/L 포도당이 첨가된 MR-Fe20 배지 (pH7.0) 1.8L가 200 rpm의 교반 및 2 L/min 유속의 공기 공급에 의해 공기 포화된 상태 및 30℃로 담겨져 있는 6.6-L Bioflo3000 발효기 (New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ)에 상기 배양체를 접종하였다. 발효 시 온도는 30℃로 유지되었으며, 50% NH4OH를 이용해 pH를 7.0으로 유지하였다. 또한 공기포화도는 교반 속도를 최대 1000 rpm까지 증가시켜 초기 공기포화도의 40% 수준을 유지하였다. 유가 배양 중 계속적인 포도당 공급을 위해 pH 고정 기법을 이용하여 유입 용액 (700g/L glucose, 8g/L MgSO47H2O, 20 mg/L FeSO47H2O, 20g/L glutamate)를 공급하였다. OD600이 5에 이렀을 때 1 mM IPTG를 첨가하였으며, heme 생산량 분석을 위해 8시간 간격으로 샘플링을 하여 Heme의 생산량을 확인하였다.
그 결과, 72시간 째에 가장 많은 양인 총 246.69 mg/L의 heme이 생산되었으며, 이중 164.12 mg/L의 heme (66.529%)이 배지에서 검출되었다. OD600은 64시간 째에 최대치인 142.8에 이렀다 (도 9b). 실시예 5-4의 유가 배양식 발효 결과와 비교할 때, ccmABC 유전자를 과발현시킴으로써 세포 바깥으로의 heme 분비율을 8.759% 증진시킬 수 있었으며, 동시에 총 heme의 생산량 역시 18.23 mg/L 증진시킬 수 있었다.
실시예7: Corynebacterium glutamicum에서의 heme 생산
자유 heme을 생산하고 세포 외로 분비하는 대장균을 개발하기 위해 사용한 전략이 다른 균주에서도 heme하는 데 적용될 수 있는지 확인하고자 인체에 무해함이 입증되어 글루탐산을 비롯한 아미노산 생산에 널리 이용되고 있는 Corynebacterium glutamicum에서 C5 ALA 생합성경로를 도입하여 heme을 생산하였다.
글루탐산을 과생산하는 호기성 미생물인 C. glutamicum은 대장균과 유사하게 글루타메이트로부터 ALA를 생산하는 C5 생합성 경로 및 ALA로부터 heme을 생산하는 heme 생합성 경로를 보유하고 있다. C5 생합성 경로에 상응하는 C. glutamicum의 hemA 및 hemL 유전자를 과발현시키기 위해 산업 C. glutamicum ATCC 13032의 유전체 DNA로부터 서열번호 67과 68의 프라이머, 서열번호 69와 70의 프라이머를 이용해 각각 hemA와 hemL 유전자를 증폭하였다. 이 과정에서 hemA 유전자로부터 발현되는 단백질의 두 번째 아미노산과 세 번째 아미노산 사이에 아미노산 리신 두 개가 삽입되어 HemA 단백질이 음성 피드백에 저항성을 보이도록 (HemAfbr) hemA 유전자의 서열이 수정되었다. 증폭된 두 유전자는 깁슨어셈블리(Gibson assembly)를 통해 pEKEx1 플라스미드의 EcoRI site에 함께 클로닝하여 C. glutamicum에 도입되었을 때 HemAfbr 및 HemL 단백질을 발현하는 pEKEx1-hemAL 플라스미드를 제작하였다.
Figure PCTKR2018015748-appb-T000026
또한 상기 실시예 2-1의 (a)와 같이 ALA로부터 heme을 생산하는 데 관여하는 단백질의 유전자 중 hemB 및 hemH 유전자의 과발현을 먼저 시험하기 위해 hemB와 hemH 유전자를 과발현하는 벡터를 구축하였다. 이를 위해 서열번호 71과 72, 73과 74를 이용해 C. glutamicum ATCC 13032의 유전체 DNA로부터 각각 hemB와 hemH 유전자를 증폭하였다. 또한 pCES208-spc 플라스미드를 서열번호 75 및 76의 프라이머를 이용해 증폭한 뒤 Gibson assembly를 통해 상기 증폭된 hemB 및 hemH 유전자와 결합시켜 pCES-hemBH 플라스미드를 제작하였다.
Figure PCTKR2018015748-appb-T000027
산업 균주인 C. glutamicum S112 균주에 상기 제작한 플라스미드 pEKEx1-hemAL 혹은 두 플라스미드 pEKEx1-hemAL과 pCES-hemBH를 도입함으로써 C. glutamicum S112-AL 및 S112-AL-BH 균주를 제작하였다.
Figure PCTKR2018015748-appb-T000028
상기 제작한 두 C. glutamicum 균주 S112-Al과 S112-AL-BH의 heme 생성능을 확인하기 위한 플라스크 배양을 위해 250 mL 배플 플라스크에 담긴, 표 29의 조성을 가지는 seed 배지 10 mL에 상기 균주를 각각 접종하고 OD600이 20에 이를 때까지 약 12 시간 동안 30℃, 200 rpm의 조건으로 배양하였다.
Figure PCTKR2018015748-appb-T000029
이후 배양액 100 μL를 250 mL 배플 플라스크에 담긴, 표 30의 조성을 가지는 주 배지 10 mL에 접종하고 30℃, 200 rpm의 조건에서 48 시간 동안 배양하였다.
Figure PCTKR2018015748-appb-T000030
그 결과, heme 생합성 관련 유전자를 과발현하지 않는 C. glutmicum S112에서는 heme이 생산되지 않은 데 반해 S112-AL 및 S112-AL-BH 균주에서는 세포 내에 heme이 각각 0.77 ± 0.23 및 1.64 ± 0.30 mg/L (배양액 부피 기준)씩 축적되는 것을 확인하였다. 이로써 C. glutamicum에서도 C5 생합성 경로 및 heme 생합성 경로를 과발현시킴으로써 heme을 생산할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에 따르면, 포르피린증의 치료 및 건강식품 또는 식품보충제로서 사용이 증가하고 있는 착염인 heme을 기존의 화학합성이나 효소합성이 아닌 미생물 변이체를 이용하여 고수율로 세포외로 분비·생산함으로써, 생산한 heme을 이용하기 위해 필요한 정제 과정을 친환경적이고 경제적이며 용이하게 할 수 있는 효과가 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (12)

  1. 5-아미노레뷸론산(ALA)를 생산하는 생합성 경로에 관여하는 유전자와 ALA로부터 heme을 합성하는 경로에 관여하는 유전자를 가지고 있는 미생물에서, heme 엑스포터(heme exporter)를 코딩하는 유전자가 과발현되어 있는 것을 특징으로 하는 heme을 세포외로 분비시킬 수 있는 미생물 변이체.
  2. 제1항에 있어서, 탄소원으로부터 글루탐산을 생성할 수 있는 미생물인 것을 특징으로 하는 미생물 변이체.
  3. 제1항에 있어서, 5-아미노레뷸론산(ALA)를 생산하는 생합성 경로에 관여하는 유전자와 ALA로부터 heme을 합성하는 경로에 관여하는 유전자가 과발현되어 있는 것을 특징으로 하는 미생물 변이체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 5-아미노레뷸론산(ALA)를 생산하는 생합성 경로는 C5생합성 경로인 것을 특징으로 하는 미생물 변이체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 C5 생합성 경로에 관여하는 유전자는 글루타밀-tRNA 합성 효소 (GluRS)를 암호화하는 gltX 유전자, 글루타밀-tRNA 환원효소 (GluTR)를 암호화하는 hemA 유전자 및 글루타메이트-1-세미알데히드 2,1-아미노뮤테이즈 (GSAM)를 암호화하는 hemL 유전자로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 변이체.
  6. 제3항에 있어서, 상기 ALA로부터 heme을 합성하는 경로에 관여하는 유전자는 포르포빌리노겐 합성 효소 (PBGS)를 암호화하는 hemB 유전자, 포르포빌리노겐 디아미네이즈 (PBGD)를 암호화하는 hemC 유전자, 우로포르피리노겐 III 합성효소 (UROS)를 암호화하는 hemD 유전자, 우로포르피리노겐 III 디카르복실레이즈 (UROD)를 암호화하는 hemE 유전자, 코프로포르피리노겐 III 옥시데이즈 (CPO)를 암호화하는 hemF 유전자, 프로토포르피리노겐 옥시데이즈 (PPO)를 암호화하는 hemG 유전자 및 페로킬레테이즈(FECH)를 암호화하는 hemH 유전자로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 변이체.
  7. 제4항에 있어서, 상기 C5 생합성 경로에 관여하는 유전자글루타밀-tRNA 합성 효소 (GluRS)를 암호화하는 gltX 유전자, 글루타밀-tRNA 환원효소 (GluTR)를 암호화하는 hemA 유전자 및 글루타메이트-1-세미알데히드 2,1-아미노뮤테이즈 (GSAM)를 암호화하는 hemL 유전자가 과발현되어있고, 상기 ALA로부터 heme을 합성하는 경로에 관여하는 유전자로 포르포빌리노겐 합성 효소 (PBGS)를 암호화하는 hemB 유전자, 포르포빌리노겐 디아미네이즈 (PBGD)를 암호화하는 hemC 유전자, 우로포르피리노겐 III 합성효소 (UROS)를 암호화하는 hemD 유전자, 우로포르피리노겐 III 디카르복실레이즈 (UROD)를 암호화하는 hemE 유전자, 코프로포르피리노겐 III 옥시데이즈 (CPO)를 암호화하는 hemF 유전자, 프로토포르피리노겐 옥시데이즈 (PPO)를 암호화하는 hemG 유전자 및 페로킬레테이즈(FECH)를 암호화하는 hemH 유전자가 과발현되어 있는 것을 특징으로 하는 변이체.
  8. 제1항에 있어서, heme 또는 heme 중간체 분해 효소를 암호화하는 유전자가 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 변이체.
  9. 제7항에 있어서, yfeX 유전자가 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 변이체.
  10. 제1항에 있어서 Escherichia coli, Bacillus sp., Corynebacterium sp., Lactobacillus sp., Lactococcus sp., Pseudomonas sp., Anacystis sp., Anabena sp., Chlorobium sp., Chloroflexus sp., Clostridium sp., methanobacteria, Propionibacterium sp., Rhodopsueomonas sp., Rhodobacter sp., Rhodovulum sp., Streptococcus sp., Saccharomyces sp., Schizosaccharomyces sp., Yarrowia sp. 및 Aspergillus sp.으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 미생물 변이체.
  11. 다음 단계를 포함하는 heme의 제조방법;
    (a) 제1항 내지 제10항 중 어느 한항의 미생물 변이체를 배양하여 heme을 생성시키는 단계; 및
    (b) 상기 생성된 heme을 수득하는 단계.
  12. 제11항에 있어서, (a) 단계의 배양에 질소원을 추가로 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
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