JPH07504572A

JPH07504572A - ヘム・タンパク質の製造方法

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Publication number: JPH07504572A
Application number: JP5516177A
Authority: JP
Inventors: イェンセン，エイナー　ベック
Original assignee: ノボザイムスアクティーゼルスカブ
Priority date: 1992-03-20
Filing date: 1993-03-16
Publication date: 1995-05-25
Anticipated expiration: 2017-10-07
Also published as: DE69325169D1; ATE180837T1; DK36592D0; US5681725A; DE69325169T2; CA2132299A1; WO1993019195A1; EP0631631A1; DK0631631T3; JP3330941B2; ES2134844T3; EP0631631B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ヘム・タンパク質の製造方法技術分野本発明は、増加した収率においてヘム・タンパク質を製造する方法に関する。

背景技術バクテリア中の様々なヘム・タンパク質のクローニング及び発現が、先に記載されている。このように、Ｓ、　Ａ、　０ｒｌｅｐｐ　ｅｔ　ａｌ、、ユより１ＯｔｅＣｈｎ、比＋９８９．　ｐｐ、　３５３−３６４は、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）におけるホースラディツシュ・ペルオキシダーゼＣの発現及び特徴について記載している。この酵素は、不溶性凝集体として細胞内に発現されるので、それは溶菌細胞から精製されなければならない。さらに、その酵素は、活性形態において発現されず、そして機能性となるためにはヘム及びＣａ”″の存在中で別々に折り畳まれなければならない。

同様に、Ａ、　Ｔ、　Ｓｍ１ｔｈ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６５（２２）、　１９９０．１１ｐ、　１３３３５−１３３４３は、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌＤにおけるホースラディツシュ・ペルオキシダーゼＣの発現について記載している。この組換え酵素は、生来のホースラディツシュ・ペルオキシダーゼＣよりも低い活性をもち、そして（精製された活性酵素の）２−３％の収率で生産される。Ｓ、　Ｌａｐｒａｓｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂａｃｔ、１７１（９）、１９８９．　ｐｐ、　４８７１−４８７−ニング及び発現にいついて報告している。Ｓ、　Ｊ、　Ｈｏｆｆｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８７．　ｐｐ、　８５２１−８５２５は、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）における機能性ヒト・ヘモグロビンの発現について記載している。Ｚ、Ｗａｎｇ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎ、　１３．１９９０．　ｐｐ、　１３１−１４４は、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　１ｉｖｉｄａｎｓ）におけるストレプトミセス・ビリトスポラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｒｉｄｏｓｐｏｒｕｓ）がらのリグニン・ペルオキシダーゼのクローニング及び発現について記載している。

酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるヒト・ヘモグロビンの発現は、Ｍ、　Ｗａｇｅｎｂａｃｈ　ｅｔ　ａｌ、　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　９．１９９１．　ｐｐ、　５７−６１により記載されている。酵母においては、ヘモグロビンは、完全に組み立てられたヘム含有テトラマーとして発現される。しかしながら、このタンパク質は、酵母細胞から分泌されず、細胞形質空間内に残り、そしてそれから精製されなけらばならない。

それ故、ヘム・タンパク質を生産するだけでなくその細胞膜を通して活性形態においてそれを運び出すことができる糸状菌のような宿主生物を選択し、それにより精製手順を簡略にすることが存利であろう。

近年、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）及びアスペルギルス・ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎ１ｄｕｌａｎｓ）を含む糸状菌の形質転換のための手順が開発されてきた。ＬＩＳ　４，８８５，２４９　（Ａｌｌｅｌｉｘ）は、選択マーカーをエンコードしている遺伝子を担持しているプラスミドの導入により増幅されたアスペルギルス・ニガー（Ａ、　ｎｉｇｅｒ）の形質転換のための一般的方法について記載している。ＢＰ　２１５５９４　（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）は、分泌を提供するために異なるアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）タンパク質のシグナル配列を使用したアスペルギルス・ニジュランス（Ａ、　ｎ１ｄｕｌａｎｓ）における様々なタンパク質の発現及び分泌について記載している。

これらの文献のいずれも、糸状菌内でのヘム・タンパク質の製造の可能性について示していない。反対に、Ｍ、　Ｓａｌｏｈｅｉｍｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）内のフレビア・ラジアタ（Ｐｈｌｅｂｉａ　ｒｅｄｉａｔａ）からのリニン・ペルオキシダーゼのクローニング及び発現について記載している。その著者は、リグニン・ペルオキシダーゼｍＲＮＡがトリコデルマ・レエセイ（Ｔ、　ｒｅｅｓｅｉ）内で発現されるけれども、タンパク質は全く検出されることができなかったと報告している。彼らは、これがヘムの非存在におけるタンパク質の不正確な折り畳み又はその翻訳を妨害する異なる構造のＲＮＡを原因とするプロテアーゼによる細胞内分解に帰することができるであろうと推測している。

驚くべきことに、ヘム又はヘム・グループを含む他の材料が、ヘム・タンパク質のアポタンパク質を過剰生産する微生物を培養するための発酵培地に添加されたとき、そのヘム・グループがそのタンパク質に結合し、それによりその了ボタンバク質が活性化され、そしてタンパク質分解性の分解に対してそれがより安定であるようなコンホメーションを獲得するということが発見された。ヘム・タンパク質の全体としての収率は、かなり増加される。この方法において、宿主生物内での内発的なヘム合成であってヘム・タンパク質の発現においてしばしばボトル −ネックであるものを克服することができる。

したがって、本発明は、増加した収率において細胞外ヘム・タンパク質を製造するための方法であって、活性な再結合ヘム・タンパク質の生産を許容する条件下でヘム又はヘム含有材料を含む発酵培地中でヘム・アポタンパク質生産微生物を培養し、そしてその培地から得られたヘム・タンパク質を回収することを含んで成る方法に関する。

本文脈においては、用語”ヘム・タンパク質（ｈｅｍｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ）”は、置換基としてヘムを含むタンパク質の群の中のいずれかのメンバー（例えば、プロトポルフィリンＩＸ）を含むと意図される。用語”アポタンパク質（ａｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）”は、置換基を欠いたヘム・タンパク質の形態を示すと意図される。用語”細胞外ヘム・タンパク質”は、バクテリア又は酵母内での生産により従来技術において提供されたヘム・タンパク質とは異なり、ヘム・タンパク質のアポタンパク質形態がその宿主細胞から、それがその培地中へのヘム又はヘム含有材料の添加により提供された置換ヘム基をもつ（ホロタンパク質（ｈｏｌｏｐｒｏｒｅｉｎ）に）再結合するような培養基中に、分泌されるということを示すと理解される。

発明の詳細な開示本発明の方法の好ましい態様においては、ヘム・タンパク質生産微生物は、そのヘム・タンパク質をエンコードしているＤＮＡを含んで成る組換え発現ベクターにより形質転換されたものである。

このＤＮＡ配列は、確立された標準的な方法、例えば、Ｓ、　Ｌ、　Ｂｅａｕｃａｇｅ　ａｎｄ　Ｍ、　Ｈ，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２２．１９８１．　ｐｐ。

１８５９−１８６９により記載されたホスホアミジット法、又はＭａｔｔｈｅｓ　ｅｔａｌｌ、εＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　３．１９８４．　ｐｐ、　８０１−８０５により記載された方法により合成的に調製されることができる。このホスホアミジット法の従って、オリゴヌクレオチドを、例えば、自動ＤＮＡ合成装置内で合成し、精製し、アニールし、連結し、そして好適なベクター内でクローン化する。

このＤＮＡ配列は、ゲノム又はｃＤＮＡ起源であることもでき、例えば、標準的な技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　２ｎｄ　Ｅｄ、、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１（ａｒｂｏｒ、　１９８９を参照のこと。）に従って、ゲノム又はｃＤＮＡライブラリーを調製し、そして合成オリゴヌクレオチド・プローブを使用したハイブリダイゼーションによりそのヘム・タンパク質の全部又は一部をコーディングしているＤＮＡ配列をスクリーニングすることにより、得られることもできる。

この場合には、ヘム・タンパク質をエンコードしているゲノム又はｃＤＮＡ配列は、例えば、よく知られた手順に従って相同的組換えのための所望のアミノ酸配列をエンコードしている合成オリゴヌクレオチドを使用した部位指定突然変異誘発により、アミノ酸置換を導入することが望まれる部位に対応する部位において修飾されることができる。

最終的に、このＤＮＡ配列は、（適切には）合成、ゲノム又はｃＤＮＡ起源の断片を連結することにより調製された合成とゲノムの混合、合成とｃＤＮＡの混合又はゲノムとｃＤＮＡの混合の起源の内にあることができ、その断片は標準的な技術に従った完全なりＮＡ配列の様々な部分に対応スル。、：（７）ＤＮＡ配列は、例えば、ＵＳ　４．６８３．２０２又１ｔＲ，Ｋ。

５ａｉｋｉ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３９．１９８８．　ｐｐ、　４８７−４９１中に記載されているような特異的プライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応により調製されることもできる。

一旦構築されれば、ヘム・タンパク質をエンコードしているＤＮＡ配列は、組換え発現ベクター中に挿入される。これは、組換えＤＮＡ手順に便利に供されることができるいずれのベクターであることができ、そしてベクターの選択は、しばしばそれが導入されるべき宿゛主細胞に依存するであろう。したがって、ベクターは、自己複製ベクター、すなわち染色体外存在物として存在するベクターであってその複製が染色体の複製から独立しているもの、例えば、プラスミドであることができる。あるいは、そのベクターは、宿主細胞中に導入されるとき、宿主細胞のゲノム内に組み込まれ、そしてそれが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであることができる。

ベクター内では、ヘム・タンパク質をエンコードしているＤＮＡ配列は好適なプロモーター及びターミネータ−配列に作用可能な状態で連結されなければならない。このプロモーターは、選択された宿主細胞内で転写活性を示すいずれかのＤＮＡ配列であることができ、そしてその宿主細胞に同種又は異種のいずれかであるタンパク質をエンコードしている遺伝子由来のものであることができる。宿主細胞が糸状菌であるとき、プロモーターは細胞外又は細胞内タンパク質、例えば、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ又は解糖酵素をエンコードシテイル遺伝子由来であることができる。好適なプロモーターの例は、アスペルギルス・オリザエ（Ａ、　ｏｒｙｚａｅ）　ＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・メイヘイ３ｈｉｚｏｍｕｃｏｒ　ｍｅｉｈｅｉ）アスパラギン・プロテアーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａ、　ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガース・リン酸イソメラーゼをエンコードしている遺伝子由来のものである。ターミネータ−配列は、プロモーターと同じ源由来のものであることができる。

細胞外発現のために、ヘム・タンパク質をエンコードしているＤＮＡ配列は、好ましくは、分泌タンパク質をコードしている遺伝子から得ることができるシグナル配列により先行される。したがって、このシグナル配列は、便利には、アスペルギルス・オリザエＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー中性α−アミラーゼ、アスベルギルス・ニガー酸安定性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガーオキシダーゼをエンコードしている遺伝子から得られることができる。

ヘム・タンパク質、プロモーター、ターミネータ−及び場合によりシグナル配列をコードしているＤＮＡ配列をそれぞれ連結するために、そしてそれらを好適なベクター内に挿入するために使用される手順は、当業者によく知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、。

前記を参照のこと。）。

組換え発現ベクターにより形質転換された微生物は、そのヘム・タンパク質と同質（すなわち、その遺伝子がそれが起源として得られたところの生物に形質転換により戻される）又は異質であることができる。それは、好ましくは、菌、特に糸状菌、例えば、フィコミセート（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ザイゴミセート（Ｚｙｇｏｍｙｃｅｔｅｓ）　、アスコミセート（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）　、バシジオミセー）　（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）の群に属する菌又は不完全菌（ｆｕｎｇｉ　ｉｍｐａｒｆｅｃｔｉ）であってヒフォミセート（Ｈｙｐｈｏｍｙｃｅｔｅｓ）例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉ　ｆｌｕｓ）、トリコ糸状菌宿主生物は、便利には、組換えタンパク質のための宿主として先に使用されてきたもの、例えば、アスペルギルス種の株、例えば、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルスンジュランス又はアスペルギルス・オリザエであることができる。組換えタンパク質の生産におけるアスペルギルス・オリザエの使用は、例えば、ＥＰ２３８０２３中に広く記載されている。

本発明の方法により生産されたヘム・タンパク質は、好ましくは、オキシドレダクターゼ、特にリグニン・ペルオキシダーゼ又はＭｎ−ペルオキシダーゼ、又はハロペルオキシダーゼを含むペルオキシダーゼである。目下の好ましい態様においては、ペルオキシダーゼをエンコードしている配列は、コプリナス種、特にコプリナス・マクロリザス又はコプリナス・シネレウス、又はアルスロミセス・ラモサス（Ａｒｔｈｒｏｍｙｃｅｓ　ｒａｍｏｓｕｓ）由来のものである。ヘム・タンパク質は、カタラーゼ、例えば、アスペルギルス・ニガー由来のカタラーゼであることもできる。

形質転換宿主細胞を培養するために使用される培地は、問題の宿主生物を培養するのに好適ないずれかの慣用の培地であることができる。ヘム・グループと分泌アポタンパク質との再結合を得るために培地に添加されるヘム又はヘム含有材料は、好適には、ヘミン（ｈｅｍｉｎ）又は好ましくはヘモグロビン又は赤血球細胞を添加することにより供給されることができる。なぜならそのヘム・グループが加熱の間に機能性を維持し、これらの物質の中の１つを含む培地のオートクレーブを許容するからである。それは、好適には、ｌ−１０００ｍｇ／ｌの、特に１０−１００ｍｇ／　ｌの量で存在することができる。ヘモグロビンが培地に添加されるときは、それは、好適には、０．５−５０ｇ／ｌ　、特に１−２５ｇ／ｌの量で存在することができる。赤血球細胞が培地に添加されるときは、それらは、好適には、０．５−５０ｇ／ｌ　、特に１−２５ｇ／ｌの量で存在することができる。

発酵培地中の表面活性剤の存在がヘム・タンパク質の増加した収率をもたらすことが発見され、最近、表面活性剤がそのタンパク質を安定化する能力に帰せられた。結果として、表面活性剤、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、（ポリオキシエチレン・ポリマー）、ポリエチレン・グリコール、又はＧｌａｎａｐｏｎ（脂肪酸の側鎖をもつポリエチレン・オキサイドのポリマー）を培地に、例えば、１−１００ａ＋ｌ／ｌの量で添加することが好ましい。

本発明を以下の実施例中でさらに説明するが、これを、いかなる方法においても請求に係る発明の範囲を限定するものと解釈してはならない。

実施例１コプリナス・シネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ　ｃｉｎｅｒｅｕｓ）ペルオキシダーゼをエンコードしているｃＤＮＡのクローニングＰＣＲによるプローブの構築ペルオキシダーゼｃＤＮＡ断片を、コプリナス・マクロリサスのペルオキシダーゼのアミノ酸配列に基づいて構築された特異的オリゴヌクレオチド・ブライ７− （Ｒ，に、　５ａｉｋｉ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３９．１９８８゜ｐｐ、　４８７−４９１）を使用してポリメラーゼ連鎖反応により調製した。

ＰＣＲを製造者の指示に従ってＧｅｎｅ　Ａｍｐキット及び装置（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ、　Ｎｏｒｗａｌｋ、　ＣＴ、　（ＪＳＡから入手可能なもの）を使用して行った。但し、その反応を、（コプリナス・シネレウス、［Ｆｏ　８３７１から得られたｍＲＮＡから調製された）第一ストラントｃＤＮＡへの良好なハイブリダイゼーションを得るために最初の３サイクルの間２８° Ｃにおいて、そしてその後、３０サイクルのＰＣＲの間６５°Ｃにおいて行った。

以下の特異的プライマーを、ＰＣＲのために使用した。

１、　５’−ＧＣＧＣＧＡＡＴＴＣＧＴＮＧＧＮＡＴＮｋＡＣＣＡＣＧＧ−３’ ２．３’−ＴＡＣＡＧＮＴｒＧＡＣＧＧＧＮ（、ＧＣＣＴＡＧＧＣＧ−５’Ａ　ＴＡ４、　３’−ＧＧＮＡＡＧＧＧＮＣＣＮＣＴＣＭＧＣＣＴＡＧＧＣＧ−５’５　、５　’　−ＧＣＧＣＧＭＴＴＣＴＧＧＣＡＧＴＣＮＡＣ−：ｌ　’６、　５’ −ＧＣＧＣＧＡＡＴＴＣＴＧＧＣＡＧＡＧＮＡＴＧ−３’“Ｎ”は、４の全てのヌクレオチドの混合を表す。

プライマーを以下のように組み合わせた：ｌと２．３と４．５と７．６と７．１　と４、■と７、及び３と７゜ＰＣＲ断片を、このように、その５゛末端におけるＥｃｏＲ１部位により、そしてその３′末端におけるＢａｍ８１部位により延長した。予想されたサイズのバンドは１％アガロース・ゲル上で分析された。そのバンドがペルオキシダーゼ特異的配列に一致することを確認するために、そのゲルをサザン・プロッティングに供し、そしてＰＣＲプライマー３と４の間に位置する以下の配列。

ＡＡＡＴ５’−ＧＴＣＴＣＧＡＴＧＴＡＧＭＣＴＧ−３’をもつオリゴヌクレオチド・プローブにハイブリダイズさせた。

このプローブは、約１３０塩基対、４２０塩基対、５４０塩基対及び２４０塩基対のバンドにハイブリダイズすることが確認され、このように、観察されたＤＮＡバンドがペルオキシダーゼ配列に一致することを確認した。

様々なＰＣＲ反応からのＤＮＡを、ＢｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩにより消化し、そしてプラスミドｐＵｃ１９（Ｃ，Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｇｅｎｅ　３３．　１９８５、　ｐｐ、　１０３−１１９）中にクローン化した。正しいＰＣＲ断片を含むコロニーを先に特定したオリゴヌクレオチド・プローブを使用したハイブリダイゼーションにより同定した。陽性コロニーからのＤＮＡを、Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４．１９７７、　ｐｐ、　５４６３−５４６７により記載されている制限酵素マツピング及び部分的ＤＮＡ配列分析により分析した。

プライマーｌ及び４を使用して得られたコロニーの中の１つからの４３０塩基対の断片を、以下に記載するようなコプリナス・シネレウスのｃＤＮＡライブラリーをスクリーンするために使用した。

大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）内でのコブロナス・シネレウスｃＤＮＡライブラリーのり記載された方法によるペルオキシダーゼの最大活性のための時間において採取された均質化されたコプリナス・シネレウス（ＩＦＯ８３７１）菌糸体から抽出された。ポリ（Ａ）含有ＲＮＡは、Ａｖｉｖ　ａｎｄ　Ｌｅｄｅｒ（ＰＮＡＳ、　ＵＳＡ旦１４０８−１４１２．１９７２）により記載されたようなオリゴ（ｄＴ）−セルロース上のアフィニティー・クロマトグラフィーの２サイクルにより得られる。ｃＤＮＡは、製造者の指示に従って［ｎＶｉｔｒＯｇｅｎがらのｃＤＮＡ合成キットの手段により合成される。コプリナス・シネレウスｃＤＮＡライブラリーからの約５０．０００の大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）組換え体を、Ｗｈａｔｍａｎ　５４０ペーパー・フィルターに移した。コロニーを溶菌し、そしてＧｅｒｇｅｎ　ｅｔ　ａｌ、（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　７．　２１１５−２１３５．　１９７９）により記載されたように固定化した。このフィルターを、０．２　ｘ　ＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ中のＺｉｐ−標識の４３０塩基対ペルオキシダーゼ特異的プローブとハイブリダイズさせた。このフィルターのハイブリダイゼーション及び洗浄を、６５°Ｃにおいて行い、その後増感スクリーンにより２４時間のオートラジオグラフィーを行った。オートラジオグラフィー後、そのフィルターを増加した温度において洗浄し、その後増感スクリーンにより２４時間のオートラジオグラフィーを行った。

この方法において、５０以上の陽性コロニーを同定した。ミニ調製プラスミドＤＮＡを、標準的な手順（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　ａｎｄ　Ｄｏｌｙ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、　７．１５１３−１５２３．１９７９）によりハイブリダイジング−＝を口＝−から単離し、そしてｃＤＮＡ挿入物のＤＮＡ配列をＳａｎｇｅｒのジデオキシ手順（Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４．１９７７、　ｐｐ、　５４６３− ５４６７）により測定した。ペルオキシダーゼｃＤＮＡ断片をＨｉｎｄｌｌｌ／Ｘｈｏｌによる解裂によりベクターから切除し、そして連結反応の準備をした。

ｃＤＮＡ断片をＨｉｎｄｌ［Ｉ／Ｘｈｏ［消化ｐＨＤ４１４に連結し、そのｃＤＮＡがアスペルギルス・オリザエからのＴＡＫＡプロモーター及びアスペルギルス・ニガーからのＡＭＣターミネータ−の転写制御下にあるところのｐｃｉｐを作った。

アスペルギルス発現ベクターｐＨ０４１４の構築ベクターｐＨ０４１４は、（ＨＰ　２３８０２３中に記載された）プラスミドｐ７７５の誘導体である。ｐ７７５に反して、ｐＨＤ４１４は、そのプロモーターとターミネータ−との間にユニーク制限部位のストリングをもつ。

このプラスミドをそのターミネータ−の３′末端において（不所望の制限部位を含む）約２００塩基対の長い断片を除去し、そして次にそのプロモーターの５′ 末端において、これもまた不所望の制限部位を含む約２５０塩基対の長い断片を除去することにより構築した。この２００塩基対の領域は、（ｐＵｃベクター中にある）ＮａｒＩ及び（そのターミネータ−のちょうど３′にある）Ｘｂａ［による解裂によりｐ７７５から除去し、次に生じた末端をフレノウＤＮＡポリメラーゼ＋ｄＮＴＰによりフィル・インし、ゲル上でそのベクター断片を精製し、そしてそのベクター断片を複製した。このＤＮＡを先に記載したように大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＭＣｌ０６１中に形質転換した。ｉｏクローン（＋）ＨＤ４１３ −１〜−１０）を選択し、制限酵素分析により分析した。その制限酵素分析において予想されたバンドのパターンを示すコロニーの中の１つを、ｐＨＤ４１４の構築において使用した。

ｐＨ０４１３を（そのプロモーターの５′末端内にある）Ｓｔｕ［及び（そのｐＵＣベクベク内にある）Ｐｖｕｌｌにより切断し、そしてゲル上で分画した。このベクター断片を精製し、再連結し、そして大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１中に形質転換した。１２コロニーを選択し、そして制限酵素分析により分析した。１２コロニーのすべてが予想されたバンドのパターンを示した。プラスミドｐＨＤ４１４を図１中に示す。

１００ｍ１のＹＰＤ培地（Ｓｈｅｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８１）に、アスペルギルス・オリザエ又はアスペルギルス・ニガーの胞子を接種し、そして約２日間３７°Ｃにおいて振とうしながらインキュベートした。この菌糸体をミラクロス（ｍｉｒａｃｌｏｔｈ）を通しての濾過により収穫し、そして２００ｍ１の０．６　Ｍ　ＭｇＳＯ４により洗浄した。この菌糸体を１５ｍ１の１．２　Ｍ　Ｍｇ５Ｏａ、　１０ｍＭ　ＮａＨｚ　ＰＯ４、ｐＨ□　５．８中に懸濁させた。懸濁液を氷上で冷却し、そして１２０ｍｇのＮｏｖｏｚｙｍ■２３４．　バッチ１６８７を含む１ｍｌのバッファーを添加した。５分後、１ｍｌの１２ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ（ｓｉｇｍａ　ｔｙｐｅ　Ｈ２Ｓ）添加し、穏やかな攪拌を伴ったインキュベーションを、多数のプロトプラストが顕微鏡下で検査されるサンプル中に見えるようになるまで３７°Ｃにおいて１．５−２．５時間続けた。

懸濁液をミラクロスを通して濾過し、その濾液を滅菌チューブに移し、そして５ｍｌの０．６Ｍソルビトール、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ＝　７゜０により重層した。遠心分離を１００ｇにおいて１５分間行い、そしてプロトプラストをこのＭｇＳＯ４クッションの上から回収した。２容量の５ＴＣ（１，２Ｍソルビトール、１０＋ｎＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　ｐＨ＝　７．５．１０ｍＭ　ＣａＣ１２）をこのプロトプラスト懸濁液に加え、そしてその混合物を１１００Ｏｘにおいて５分間遠心分離した。このプロトプラスト・ベレットを、３ｍｌのＳＴＣ中に再懸濁した。この手順を繰り返した。最後に、このプロトプラストを０．２−１ｍ１のＳＴＣ中に再懸濁した。

１００μｌのプロトプラスト懸濁液を５−２５μｇの適当なりＮＡと１０μｌのＳＴＣ中で混合した。ａｒｇＢ株からのプロトプラストをｐｓａ１４３　ＤＮＡ（アスペルギルス・ニジュランス（Ａ、旧ｄｕｌａｎｓ）　ａｒｇＢ遺伝子担持プラスミド）と混合し、そしてａｒｇＢ＋株からのプロトプラストをｐ３ＳＲ２（アスペルギルス・ニジュランス（Ａ、旧ｄｕｌａｎｓ）　ａｍｄＳ遺伝子担持プラスミド）と混合した。この混合物を室温において２５分間放置した。

０．２ｍｌの６０％ＰＥＧ　４０００（ＢＤＨ２９５７６）　、１０ｍＭ　ＣａＣ１！及び１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　ｐＨ＝　７．５を添加し、そして注意して（２回）混合し、そして最後に０．８５ｍ１の同一溶液を添加し、そして注意して混合した。この混合物を室温において２５分間放置し、そしてそのペレットを２ｍｌの１゜２Ｍソルビトール中に再懸濁した。他の沈降後、プロトプラストを適当なプレート上に広げた。ｐｓａ１４３により形質転換されたａｒｇＢ株からのプロトプラストを、それぞれ炭素及び窒素源としてグルコース及び尿素を含み、そして浸透圧の安定化のための１．２Ｍソルビトールを含む最小プレート（Ｃｏｖｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　１１３　（１９６６）　５ｌ−５６）上に広げた。ｐ３ＳＲ２により形質転換されたａｒｇＢ −株からのブロドブラストを、１．０Ｍシュクロース、ｐＨ＝７．０、窒素源としてのｌｏ−アセトアミド及び背景増殖を阻害するための２０ｍＭ　ＣｓＣ１を含む最小プレート（Ｃｏｖｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　１１３　（１９６６）　５ｌ−５６）上に広げた。３７℃において４−７日間のインキュベーション後、胞子を拾い上げ、無菌水中に懸濁し、そして第二単離の後の単一コロニーの胞子を所定の形質転換体として保存した。

実施例２ヘミンを含む発酵培地中のアスペルギルス・オリザエ株における組換え体コプリナス・シネレウスのペルオキシダーゼの生産ｐｃｉｐを、先に記載したようなアスペルギルス・ニジュランスからのａｍｄｓ遺伝子を含むｐ３ＳＲ２とｐＣｉｐ及びｐ３ＳＲ２の等景況合物（それぞれ約５μｇ）との同時形質転換によりアスペルギルス・オリザエＡ１５６０（ＩＦＯ４１７７）中に形質転換した。それらの全窒素源としてのアセトアミドを使用することができる形質転換細胞を２回再単離した。

以下の組成：酵母エキス　１　ｇ／ｌ琥珀酸　ｌｏ　ｇ／ｌＭｇＣ１，・６８２０　０．８２　ｇ／ｌＫＣｌ　１．８３　ｇ／ＩＮａＨ２ＰＯ，−２８２０１，０１ｇ／ｌＮａＳＯ４１，８ｇ／ｌ尿素　２　ｇ／ｌクエン酸　２ｇ／ｌ微量金属溶液　０．５　ｍｌ／ＩＰｌｕｒｏｎｉｃ　０．１　ｍｌ／１水　１０１００ＯまでＰＨをＮａＯＨにより６．００に調整するをもつ５０ｍ１　ＡＳＰＯ３培地を含む３００ｍ１プロピレン振とうフラスコであって１２１　’Ｃにおいて６０分間コートクレープにかけ、その後０．０１　Ｍ　ＮａＯＨ中に溶解し、そして０．２μｍ膜を通してそのフラスコ中に無菌濾過した（ｐＨ１２）　２０　ｇ／ｌのマルトデキストリン及び変動量のヘミン（Ｓｉｇｍａ　Ｈ−２２５０）を添加したものを、アスペルギルス・オリザエ形質転換体の１ｍｌの胞子懸濁液（約１０ ”胞子／ｍｌ）により接種し、そして３００ｒｐｍにおいて７２時間３４℃においてインキュベートした。

結果を以下の表中に示す。ペルオキシダーゼ活性をＰＯＤＵ／ｍｌにおいて測定した。（Ｉ　ＰＯＤＵ（ペルオキシダーゼ・ユニット））は、２．２’　−アジンｂｉｓ［３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホネート］が２５℃の温度においてＪｍＭ　Ｈｚ　Ｏｆの存在中で酸化されるところの系において１分間当たり１μモルのＨｌｏ、の変換を触媒する酵素の量として定義される。

培地中のヘミン濃度　７２時間後のペルオキシダーゼ活性Ｏｍｇ／ｌ　３００　ＰＯＤＵ／ｍ１上記の表から明らかなように、培養基へのヘミンの添加は、ペルオキシダーゼの収率をかなり増加させる。

実施例３先に記載したように得られたアスペルギルス・オリザエ形質転換体を実施例２中に記載したように、オートクレーブ前に表面活性剤として（Ｂｕｓｓｅｔｔｉから入手可能な）　Ｇｌａｎａｐｏｎ　ＤＧ　１６０を添加された培地中で培養した。結果を以下の表に表す。

ヘム濃度　Ｇｌａｎａｐｏｎ１１度　７２時間後のＰＯＤ作用Ｏｍｇ／ｌ　Ｏｍｌ／ｌ　３００　ＰＯＤＵ／ｍ１表から明らかなように、添加されたＧｌａｎａｐｏｎは、ペルオキシダーゼの収率に対してヘミンとの優れたシナジー効果をもっている。

先に記載したように得られたアスペルギルス・オリザエ形質転換体を、ヘミン、ヘモグロビン（Ｍｅｒｃｋ　Ａｒｔ　４３００）又は赤血球細胞（スプレー・ドライ混合ブタ及びウシ赤血球細胞、食品グレード）を（オートクレーブの前又は後に）添加された培地中で実施例２中に記載したように培養した。ヘモグロビン及び赤血球細胞をオートクレーブ前にｐＨ１０，５（ＮａＯＨ）において溶解し、そして滅菌濾過した、結果を以下の表に表す。

７２時間後のペルオキシダーゼ活性ヘム源　滅菌濾過　オートクレーブ１２１℃、２０分間ヘミン　８００　ＰＯＤＵ／ｍｌ　４８８　ＰＯＤＵ／ｍ１（１０ｍｇ／ｌ）ヘモグロビン　１０２０　−　９５８　−（１ｇ／ｌ）赤血球細胞　９０３− 表から明らかなように、ヘム基がグロビンに結合する場合に、ヘム源がペルオキシダーゼの収率にかなりの増加をもたらす。さらなる利点は、それらを非常に安価に得ることができるということ、及びそのヘム基が加熱滅菌の間に破壊から保護されるということである。

先に記載したように得られたアスペルギルス・オリザエを以下のような供給バッチ工程において２リツタ一実験室発酵槽内で発酵させた。

タンク培地：　Ｎａ５Ｏａ　−７Ｈｔ０　２　ｇ／ＩＫ）ＩｔＰＯａ　２　ｇ／ＩＫ、ＳＯａ　３　ｇ／ｌクエン酸　４ｇ／ｌ微量金属酵母エキス　１　ｇ／ＩＰｌｕｒｏｎｉｃ　Ｏ，２ｍｌ／１供給培地：　マルトース　２５０　ｇ／ｌ酵母エキス　７　ｇ／ｌＦｅ５０．　−７１４　、　Ｏｌ　ｇ／ｌ尿素　２０　ｇ／ＬＰｌｕｒｏｎｉｃ　２　ｍｌ／１発酵条件：　２．０１発酵槽温度３４℃ ｐＨ＝７．８ｐＯ□〉２０％（増加攪拌速度による）通気：　Ｉ■ｖＭ供給特性：　３　ｇ／ｌｘｈ　０−２４時間６　ｇ／ｌｘｈ　２４−１４４時間５０ｍ１の２４時間後のＡＳＰＯ３振とうフラスコ培養物により接種。

滅菌の間、ｐｏを、タンク培地及び／又は供給培地（ヘモグロビンを供給する場合）にために１０．５に増加させた。ヘモグロビンをｐＨ１０，５において４０分間１２１°Ｃにおいてオートクレーブにかけた。発酵前、ｐＨを７．８に調整した。

結果を以下の表に表す。

発酵番号　ヘモグロビンの濃度　１４４時間後のタンク培地中　供給培地中　ペルオキシダーゼの収率７４　０ｇ／ｌ　Ｏｇ／ｌ　１００７８　１ｇ／ｌ　Ｏｇ／ｌ　１１７７９　５　ｇ／ｌ　５　ｇ／ｌ　２５０１１５（赤血球細胞）３００５　ｇ／ｌ　１０　ｇ／１２６（ヘミン滅菌濾過）１１７０添加ヘモグロビンを含まない培地中のペルオキシダーゼの収率を任意に１００％に設定する。

表から明らかなように、ペルオキシダーゼの収率を、発酵培地へのヘモグロビンの添加によりかなり増加させることができる。ヘミンによる収率の増加と同程度のものを得ることはできなかった。

Ｆｉｇ、　１フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５１０９／／（Ｃ１２Ｎ　９１０４　ＺＣ１２Ｒ１：６６）（Ｃ１２Ｎ　９１０４Ｃ１２Ｒ１：６６）（Ｃ１２Ｎ　１５１０９Ｃ１２Ｒ１：０１）ＩＣ１２Ｒ１：０１）

Claims

【特許請求の範囲】

１．増加した収率における細胞外ヘム・タンパク質の製造方法であって、アポ・タンパク質生産微生物をヘム又はヘム含有材料を含む発酵培地中で活性な再結合ヘム・タンパク質の生産を許容する条件下で培養し、そしてその培養基から得られたヘム・タンパク質を回収することを含んで成る方法。
２．微生物がヘム・タンパク質をエンコードしているＤＮＡ配列を含んで成る組換え発現ベクターにより形質転換されたものである、請求項１に記載の方法。
３．ＤＮＡ配列が異種ヘム・タンパク質をエンコードしている、請求項２に記載の方法。
４．微生物が菌（ｆｕｎｇｕｓ）である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
５．菌が糸状菌である、請求項４に記載の方法。
６．糸状菌がアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の株、例えば、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）又はアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）である、請求項５に記載の方法。
７．ヘム・タンパク質がオキシドレダクターゼ又はカタラーゼである、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
８．オキシドレダクターゼがペルオキシダーゼ又はハロペルオキシダーゼである、請求項７に記載の方法。
９．ペルオキシダーゼがコプリナス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）種、例えば、コプリナス・マクロリザス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ　ｍａｃｒｏｒｈｉｚｕｓ）又はコプリナス・シネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ　ｃｉｎｅｒｅｕｓ）、又はアルスロミセス（Ａｒｔｈｒｏｍｙｃｅｓ）種、例えば、アルスロミセス・ラモサス（Ａｒｔｈｒｏｍｙｃｅｓ　ｒａｍｏｓｕｓ）由来のものである、請求項８に記載の方法。
１０．ヘム含有材料がヘモグロビン又は赤血球細胞である、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
１１．発酵培地が１−１０００ｍｇ／ｌの量で、特に１０−１００ｍｇ／ｌの量でヘミンを含む、請求項１に記載の方法。
１２．発酵培地が０．５−５０ｇ／ｌの量で、特に１−２５ｇ／ｌの量でヘモグロビンを含む、請求項１０に記載の方法。
１３．発酵培地が０．５−５０ｇ／ｌの量で、特に１−２５ｇ／ｌの量で赤血球細胞を含む、請求項１０に記載の方法。
１４．発酵培地が表面活性剤をさらに含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
１５．発酵培地が１−１００ｍｌ／ｌの量で表面活性剤を含む、請求項１４に記載の方法。