JP3285544B2 - 熱変性されたタンパク質からカプセル化されたマイクロスフェアを製造する方法 - Google Patents
熱変性されたタンパク質からカプセル化されたマイクロスフェアを製造する方法Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は不溶性のガスをカプ
セル化したタンパク質性のマイクロスフェアから構成さ
れる超音波画像化剤、ならびにその製造および使用のた
めの方法に関する。
セル化したタンパク質性のマイクロスフェアから構成さ
れる超音波画像化剤、ならびにその製造および使用のた
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【０００２】
【従来の技術】診断用超音波イメージングは、目的の領
域に音波エネルギーの焦点を当て得、そしてその画像を
形成するように音波エネルギーを反射させ得るという原
理に基づく。超音波スキャナーを、画像化すべき領域に
重ねて体表面上に置き、そして音波の形態の超音波エネ
ルギーをその領域に向けて発射する。スキャナーは反射
した音波を検出し、そしてこのデータをビデオ画像に変
換する。超音波エネルギーが物質を伝播するとき、反射
するエネルギーの量は、伝播(transmission)速度および
その物質の音響学的性質に依存する。物質の音響学的性
質（例えば、音響的インピーダンス）の変化は、液体−
固体または液体−気体のような異なる音響学的密度の界
面において最も顕著になる。従って、超音波エネルギー
が組織を通って発射されるとき、超音波スキャナーによ
って検出される音波反射シグナルが器官構造から発生す
る。これらのシグナルは、造影剤を適切に使用すること
によって増強され得る。
域に音波エネルギーの焦点を当て得、そしてその画像を
形成するように音波エネルギーを反射させ得るという原
理に基づく。超音波スキャナーを、画像化すべき領域に
重ねて体表面上に置き、そして音波の形態の超音波エネ
ルギーをその領域に向けて発射する。スキャナーは反射
した音波を検出し、そしてこのデータをビデオ画像に変
換する。超音波エネルギーが物質を伝播するとき、反射
するエネルギーの量は、伝播(transmission)速度および
その物質の音響学的性質に依存する。物質の音響学的性
質（例えば、音響的インピーダンス）の変化は、液体−
固体または液体−気体のような異なる音響学的密度の界
面において最も顕著になる。従って、超音波エネルギー
が組織を通って発射されるとき、超音波スキャナーによ
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る。これらのシグナルは、造影剤を適切に使用すること
によって増強され得る。
【０００３】特に重要な超音波画像化剤(imaging agen
t)は、ガスの使用を伴う。ガスは超音波の反射体として
有効だからである。共鳴する気泡は、同じサイズの固体
粒子より千倍も高い効率で音を散乱させる。Ophirおよ
びParkerは２つのタイプのガス含有画像化剤を記載して
いる。これらは、(1)遊離の気泡、および(2)カプセル化
された気泡である（Ultrasound in Medicine and Biolo
gy15(4):319-333,1989)。しかし、適切なサイズの遊離
気泡は、寿命が短すぎてほとんどのインビボ適用につい
て有効ではない(Meltzerら、Ultrasound in Medicine a
nd Biology6:263-269, 1980)。この問題を克服するため
にカプセル化された気泡の開発が試みられたことがOphi
rおよびParkerによって指摘されている。
t)は、ガスの使用を伴う。ガスは超音波の反射体として
有効だからである。共鳴する気泡は、同じサイズの固体
粒子より千倍も高い効率で音を散乱させる。Ophirおよ
びParkerは２つのタイプのガス含有画像化剤を記載して
いる。これらは、(1)遊離の気泡、および(2)カプセル化
された気泡である（Ultrasound in Medicine and Biolo
gy15(4):319-333,1989)。しかし、適切なサイズの遊離
気泡は、寿命が短すぎてほとんどのインビボ適用につい
て有効ではない(Meltzerら、Ultrasound in Medicine a
nd Biology6:263-269, 1980)。この問題を克服するため
にカプセル化された気泡の開発が試みられたことがOphi
rおよびParkerによって指摘されている。
【０００４】OphirおよびParkerによって記載されたガ
ス含有超音波造影剤の第２の主要なクラスは、カプセル
化微小気泡であり、本明細書中では、「マイクロスフェ
ア」と称する。気泡は、タンパク質または他の生体適合
性物質から構成される殻で取り巻かれている。現在市販
されているマイクロスフェア造影剤は、 ALBUNEX(登録
商標)(Molecular Biosystems, Inc., San Diego, CA)で
あり、これは。ヒト血清アルブミンでカプセル化された
空気のマイクロスフェアから構成される。米国特許第4,
572,203号および第4,844,882号を参照のこと。
ス含有超音波造影剤の第２の主要なクラスは、カプセル
化微小気泡であり、本明細書中では、「マイクロスフェ
ア」と称する。気泡は、タンパク質または他の生体適合
性物質から構成される殻で取り巻かれている。現在市販
されているマイクロスフェア造影剤は、 ALBUNEX(登録
商標)(Molecular Biosystems, Inc., San Diego, CA)で
あり、これは。ヒト血清アルブミンでカプセル化された
空気のマイクロスフェアから構成される。米国特許第4,
572,203号および第4,844,882号を参照のこと。
【０００５】空気のマイクロスフェアは、インビボヘの
注入および循環に際して直面するような150mmHgの圧力
がかかると、急速にエコー源性(echogenicity)を失うこ
とが示されている（deJong,N.ら、Ultrasound Med. Bio
l. 19:279-288、1993）。しかし、本発明のカプセル化
技術は、多くの所望される適用のためにインビボで十分
に長い間残存する超音波造影剤として適切な材料を製造
する。実際、心筋壁のイメージングを可能にする造影剤
は、少なくとも250mmHg(約５psig)の一時的な圧力パル
ス耐えなければならない。
注入および循環に際して直面するような150mmHgの圧力
がかかると、急速にエコー源性(echogenicity)を失うこ
とが示されている（deJong,N.ら、Ultrasound Med. Bio
l. 19:279-288、1993）。しかし、本発明のカプセル化
技術は、多くの所望される適用のためにインビボで十分
に長い間残存する超音波造影剤として適切な材料を製造
する。実際、心筋壁のイメージングを可能にする造影剤
は、少なくとも250mmHg(約５psig)の一時的な圧力パル
ス耐えなければならない。
【０００６】マイクロスフェアが圧力に対して不安定で
あるという問題を解決するための努力において、最近の
教示は、殻の改良に集中している。なぜなら、マイクロ
スフェアの殻または「膜」は、圧力下において、弱過ぎ
あるいは脆すぎてその結果、インビボで急速に壊れると
考えられているからである。Gibbey(PCT/EP91/01706;PC
T92/05806)は、「膜は剛性であるために、マイクロスフ
ェアに与えられ得る突然の圧力変化に耐えられない。例
えば、血流中を移動する際の、振動の脈動による変化ま
たは圧力である。」と述べている。殻の剛性を克服する
ために、彼は、高い割合で増粘剤(40％〜80％のポリオ
ール類）を含むタンパク質溶液中で空気を予備乳化さ
せ、これを高速ブレンダー中で機械的剪断に供すること
を提案してした。適切なサイズの泡が集められ、そして
それらを軟らかい殻の中に安定化するために適切な界面
活性剤で被覆される。
あるという問題を解決するための努力において、最近の
教示は、殻の改良に集中している。なぜなら、マイクロ
スフェアの殻または「膜」は、圧力下において、弱過ぎ
あるいは脆すぎてその結果、インビボで急速に壊れると
考えられているからである。Gibbey(PCT/EP91/01706;PC
T92/05806)は、「膜は剛性であるために、マイクロスフ
ェアに与えられ得る突然の圧力変化に耐えられない。例
えば、血流中を移動する際の、振動の脈動による変化ま
たは圧力である。」と述べている。殻の剛性を克服する
ために、彼は、高い割合で増粘剤(40％〜80％のポリオ
ール類）を含むタンパク質溶液中で空気を予備乳化さ
せ、これを高速ブレンダー中で機械的剪断に供すること
を提案してした。適切なサイズの泡が集められ、そして
それらを軟らかい殻の中に安定化するために適切な界面
活性剤で被覆される。
【０００７】Holmes(PCT WO 92/17213)は、生体適合性
の化学架橋剤で殻を強化することによってタンパク質の
マイクロスフェアのインビボ安定性を高めることを提案
した。
の化学架橋剤で殻を強化することによってタンパク質の
マイクロスフェアのインビボ安定性を高めることを提案
した。
【０００８】Bichonら(EPA 90/810367)およびSchneider
ら(Inv. Radiol.27:134-139,1992)は、多孔性（孔サイ
ズ５〜2000nm）のポリマー性「マイクロバルーン」の製
造を記載している。彼らは、この欧州特許出願において
「マイクロバルーンの外皮(envelope)の微小多孔性構造
は、弾力性の要因である。すなわち、このマイクロスフ
ェアは崩壊せずに、容易に圧力変化を受容し得る。」と
報告している。
ら(Inv. Radiol.27:134-139,1992)は、多孔性（孔サイ
ズ５〜2000nm）のポリマー性「マイクロバルーン」の製
造を記載している。彼らは、この欧州特許出願において
「マイクロバルーンの外皮(envelope)の微小多孔性構造
は、弾力性の要因である。すなわち、このマイクロスフ
ェアは崩壊せずに、容易に圧力変化を受容し得る。」と
報告している。
【０００９】ErbelおよびZots（米国特許第5,190,982
号）は、中に空気を取り込んだ架橋したポリマー性のマ
イクロカプセルを記載している。
号）は、中に空気を取り込んだ架橋したポリマー性のマ
イクロカプセルを記載している。
【００１０】Schneiderら(EPA 554,213）は、カプセル
化されるガスのうちの少なくとも一部がSgas/MWgas≦0.
0031を有するガスであることで、マイクロスフェアの耐
圧性を改善し得ることを示している。ここでSgasはガス
の水溶性をリットル／リットルで表したものであり、そ
してMWgasはガスの平均分子量をダルトンで表したもの
である。この参考文献の表１は、この基準に適合するも
のとしてN2、SF6、CBrF3、およびCF4を列記している。
この参考文献は、これらのマイクロスフェアが２つの方
法のいずれかで製造され得ることを教示している。第１
の方法は２段階法である。この方法では、公知の方法に
よって空気を含有するマイクロスフェアを調製し、そし
てこの空気をガス交換法によって（例えば、空気が充填
されたマイクロスフェアを不溶性ガス雰囲気下で適切な
時間インキュベートすることによって）不溶性ガスで置
換する。
化されるガスのうちの少なくとも一部がSgas/MWgas≦0.
0031を有するガスであることで、マイクロスフェアの耐
圧性を改善し得ることを示している。ここでSgasはガス
の水溶性をリットル／リットルで表したものであり、そ
してMWgasはガスの平均分子量をダルトンで表したもの
である。この参考文献の表１は、この基準に適合するも
のとしてN2、SF6、CBrF3、およびCF4を列記している。
この参考文献は、これらのマイクロスフェアが２つの方
法のいずれかで製造され得ることを教示している。第１
の方法は２段階法である。この方法では、公知の方法に
よって空気を含有するマイクロスフェアを調製し、そし
てこの空気をガス交換法によって（例えば、空気が充填
されたマイクロスフェアを不溶性ガス雰囲気下で適切な
時間インキュベートすることによって）不溶性ガスで置
換する。
【００１１】第２の方法は、１段階法である。この方法
では、空気の代わりに不溶性ガスを用いて、EPA 324,93
8の方法(この参考文献の実施例１参照）によってマイク
ロスフェアを作製する。この方法においては、殻形成材
料溶液（例えばアルブミン溶液）にガスを通し、この
間、音波発生器(sonicator)のホーンを容器の中に沈
め、そして取り出す。
では、空気の代わりに不溶性ガスを用いて、EPA 324,93
8の方法(この参考文献の実施例１参照）によってマイク
ロスフェアを作製する。この方法においては、殻形成材
料溶液（例えばアルブミン溶液）にガスを通し、この
間、音波発生器(sonicator)のホーンを容器の中に沈
め、そして取り出す。
【００１２】あいにく、これらの方法はいずれも、タン
パク質でカプセル化した不溶性ガスのマイクロスフェア
の安定な懸濁液を作製するために特に有用ではない。第
１の（２段階）方法を用いると、不溶性ガス雰囲気に曝
したときに（２段階法の第２工程）、空気が充填された
アルブミンマイクロスフェアのうち残存し得るものはご
くわずかの数である。マイクロスフェアから流出する可
溶性ガス（空気）がマイクロスフェアに流入する不溶性
ガスより多いと、その結果、マイクロスフェアは完全に
圧潰し、殻の残骸のみが残る。この影響は特にパーフル
オロエタンのような、より不溶性のガスの場合、著し
い。第２のプロセスでは、圧力がかかると体積が減少
し、そして圧力を取り去った後も回復を示さないマイク
ロスフェアが製造される。これらの両プロセスで、劣っ
たマイクロスフェアが製造されるのは、このマイクロス
フェアが相当量の空気を含んでおり、しかも形成の際に
空気が存在すると、不溶性ガス単独の存在下でマイクロ
スフェアを製造する利点を低下させ得るからであると考
えられる。この点に関して、以前の研究者は、キャビテ
ーションによるマイクロスフェアの作製においては酸素
の存在が必須であると考えていたことが注目される。
パク質でカプセル化した不溶性ガスのマイクロスフェア
の安定な懸濁液を作製するために特に有用ではない。第
１の（２段階）方法を用いると、不溶性ガス雰囲気に曝
したときに（２段階法の第２工程）、空気が充填された
アルブミンマイクロスフェアのうち残存し得るものはご
くわずかの数である。マイクロスフェアから流出する可
溶性ガス（空気）がマイクロスフェアに流入する不溶性
ガスより多いと、その結果、マイクロスフェアは完全に
圧潰し、殻の残骸のみが残る。この影響は特にパーフル
オロエタンのような、より不溶性のガスの場合、著し
い。第２のプロセスでは、圧力がかかると体積が減少
し、そして圧力を取り去った後も回復を示さないマイク
ロスフェアが製造される。これらの両プロセスで、劣っ
たマイクロスフェアが製造されるのは、このマイクロス
フェアが相当量の空気を含んでおり、しかも形成の際に
空気が存在すると、不溶性ガス単独の存在下でマイクロ
スフェアを製造する利点を低下させ得るからであると考
えられる。この点に関して、以前の研究者は、キャビテ
ーションによるマイクロスフェアの作製においては酸素
の存在が必須であると考えていたことが注目される。
【００１３】Suslickは、超音波に関連するキャビテー
ションは、酸素の存在下においてのみ、マイクロスフェ
アの製造法として適していると報告した。Suslickらの
詳細な研究において（Proc. Natl. Acad. Sci.88:7708-
7710, 1991; J. Am. Chem. Soc. 112:7807-7809,199
0)、安定なタンパク質殻のために必要とされる、キャビ
テーションが誘起するジスルフィド結合の分子内再配置
に、酸素が関与することが報告された。Suslickは、
「我々は、O2が存在しないとマイクロカプセルの形成が
強く阻害されることを見いだした。」と述べている。彼
はさらに続けて、「反応が不活性雰囲気下（He、Ar、ま
たはN2)で行われると、マイクロカプセルは形成されな
い。」「実験的には、O2または空気の下で反応を行った
場合にのみ、高濃度の微小気泡が合成される。」と述べ
ている。U.S.4,774,958もまた参照のこと。アルブミン
マイクロスフェアの形成には空気が必要であるという従
来の考えは、Holmes（PCT WO 92/17213)にもまた記述さ
れている。ここでは、種々の低分子量のガスを含むマイ
クロスフェアの製造が開示された。しかし、超音波によ
るアルブミンマイクロスフェアの製造を記載する際に、
著者は、「ガス含有気泡を生成するための、別の確立さ
れた記載された方法は（すなわちUS-A-4,774,958）、空
気の存在下における混合物の超音波処理による。」と述
べている（下線付記）。
ションは、酸素の存在下においてのみ、マイクロスフェ
アの製造法として適していると報告した。Suslickらの
詳細な研究において（Proc. Natl. Acad. Sci.88:7708-
7710, 1991; J. Am. Chem. Soc. 112:7807-7809,199
0)、安定なタンパク質殻のために必要とされる、キャビ
テーションが誘起するジスルフィド結合の分子内再配置
に、酸素が関与することが報告された。Suslickは、
「我々は、O2が存在しないとマイクロカプセルの形成が
強く阻害されることを見いだした。」と述べている。彼
はさらに続けて、「反応が不活性雰囲気下（He、Ar、ま
たはN2)で行われると、マイクロカプセルは形成されな
い。」「実験的には、O2または空気の下で反応を行った
場合にのみ、高濃度の微小気泡が合成される。」と述べ
ている。U.S.4,774,958もまた参照のこと。アルブミン
マイクロスフェアの形成には空気が必要であるという従
来の考えは、Holmes（PCT WO 92/17213)にもまた記述さ
れている。ここでは、種々の低分子量のガスを含むマイ
クロスフェアの製造が開示された。しかし、超音波によ
るアルブミンマイクロスフェアの製造を記載する際に、
著者は、「ガス含有気泡を生成するための、別の確立さ
れた記載された方法は（すなわちUS-A-4,774,958）、空
気の存在下における混合物の超音波処理による。」と述
べている（下線付記）。
【００１４】１つの局面において本発明は、酸素不存在
下で、不溶性ガスの存在下において超音波または機械的
キャビテーションプロセスによって、相対的に不溶性の
ガスを取り込んだタンパク質性のマイクロスフェアを高
濃度で作製し得るという、予期せぬ発見に関する。この
ようなマイクロスフェアは、印加圧力に対する、非常に
向上した驚くほどの安定性および弾性を示し、優れたあ
るいは同等のエコー源性を有する。タンパク質性の殻
は、合体を防ぎ、そして溶解した大気ガスの周囲環境か
らの拡散に起因する膨張に対して抵抗性がある。
下で、不溶性ガスの存在下において超音波または機械的
キャビテーションプロセスによって、相対的に不溶性の
ガスを取り込んだタンパク質性のマイクロスフェアを高
濃度で作製し得るという、予期せぬ発見に関する。この
ようなマイクロスフェアは、印加圧力に対する、非常に
向上した驚くほどの安定性および弾性を示し、優れたあ
るいは同等のエコー源性を有する。タンパク質性の殻
は、合体を防ぎ、そして溶解した大気ガスの周囲環境か
らの拡散に起因する膨張に対して抵抗性がある。
【００１５】他の局面において、本発明は、剪断力の形
態の機械的エネルギーを使用する、タンパク質殻のマイ
クロスフェアの製造のための新規な手順に関する。これ
らの力は、液体−気体混合物を機械的に剪断して、微小
気泡懸濁液を形成する原因となり、そしてまた流体力学
的キャビテーションを引き起こし、このキャビテーショ
ンがエネルギーを放出する。このエネルギーは、周囲の
液体に吸収されて、局部的なタンパク質の変性をもたら
し得、そして気体ー液体界面で分離したマイクロスフェ
アを形成し得る。エネルギーの放出に至る、液体系に対
する圧力変化を生じる方法に基づいて、流体力学的キャ
ビテーションと超音波（音響学的）キャビテーションと
は区別され得る。前者においては、圧力変化は、オリフ
ィスを通り、あるいは表面を横切って通過する液体の速
い流れによって生じる。他方、後者においては、高周波
数の音波のサイクルが急速な局部的圧力変化を生じさせ
る。（F. Ron Young. 1989Cavitation 4-5頁、McGraw-H
ill Book Co. London)。さらに、流体力学的キャビテー
ションは流動する液体（すなわち、静止した対象物を通
過するか横切って流れる液体）中で生じる。対照的に、
音響学的キャビテーションは、キャビテーションが現れ
るに十分な、増加および減少する圧力（陽圧および陰
圧）のサイクルの間、定常でなければなければならない
液体系で生成される。米国特許第4,957,656号に記載さ
れているような連続流動超音波系においてさえも、音響
学的キャビテーションプロセスにおける滞留時間(resid
ence time)は、本発明によって記述されるような真の単
一パスの流体力学的キャビテーション系よりも、制御す
ることが困難である。
態の機械的エネルギーを使用する、タンパク質殻のマイ
クロスフェアの製造のための新規な手順に関する。これ
らの力は、液体−気体混合物を機械的に剪断して、微小
気泡懸濁液を形成する原因となり、そしてまた流体力学
的キャビテーションを引き起こし、このキャビテーショ
ンがエネルギーを放出する。このエネルギーは、周囲の
液体に吸収されて、局部的なタンパク質の変性をもたら
し得、そして気体ー液体界面で分離したマイクロスフェ
アを形成し得る。エネルギーの放出に至る、液体系に対
する圧力変化を生じる方法に基づいて、流体力学的キャ
ビテーションと超音波（音響学的）キャビテーションと
は区別され得る。前者においては、圧力変化は、オリフ
ィスを通り、あるいは表面を横切って通過する液体の速
い流れによって生じる。他方、後者においては、高周波
数の音波のサイクルが急速な局部的圧力変化を生じさせ
る。（F. Ron Young. 1989Cavitation 4-5頁、McGraw-H
ill Book Co. London)。さらに、流体力学的キャビテー
ションは流動する液体（すなわち、静止した対象物を通
過するか横切って流れる液体）中で生じる。対照的に、
音響学的キャビテーションは、キャビテーションが現れ
るに十分な、増加および減少する圧力（陽圧および陰
圧）のサイクルの間、定常でなければなければならない
液体系で生成される。米国特許第4,957,656号に記載さ
れているような連続流動超音波系においてさえも、音響
学的キャビテーションプロセスにおける滞留時間(resid
ence time)は、本発明によって記述されるような真の単
一パスの流体力学的キャビテーション系よりも、制御す
ることが困難である。
【００１６】機械的剪断力によって製造される微小気泡
懸濁液は、特に造影剤として使用され、あるいはさらな
る処理によって、マイクロスフェアとして形成される。
例えば、PCT公開番号WO 92/05806は、微小気泡懸濁液の
調製を記載している。これは、フィルム形成性(filmoge
nic)タンパク質の「泡」と呼ばれている。この泡は、増
粘剤を含むタンパク質溶液を、タンパク質が変性する温
度より低い一定温度でホイップして、粗い泡とすること
によって調製される。次いで、得られる泡を、機械的に
剪断し、所望の範囲の気泡を形成する。この気泡は、増
粘剤の存在によって安定化される。次いで、この気泡を
熱変性によって、あるいは気泡を取り巻くタンパク質フ
ィルムを硬化させるための架橋剤の添加によってさらに
処理して、マイクロスフェアとし得る。
懸濁液は、特に造影剤として使用され、あるいはさらな
る処理によって、マイクロスフェアとして形成される。
例えば、PCT公開番号WO 92/05806は、微小気泡懸濁液の
調製を記載している。これは、フィルム形成性(filmoge
nic)タンパク質の「泡」と呼ばれている。この泡は、増
粘剤を含むタンパク質溶液を、タンパク質が変性する温
度より低い一定温度でホイップして、粗い泡とすること
によって調製される。次いで、得られる泡を、機械的に
剪断し、所望の範囲の気泡を形成する。この気泡は、増
粘剤の存在によって安定化される。次いで、この気泡を
熱変性によって、あるいは気泡を取り巻くタンパク質フ
ィルムを硬化させるための架橋剤の添加によってさらに
処理して、マイクロスフェアとし得る。
【００１７】欧州特許出願公開番号0 450 745 A1は、機
械的剪断によって水中油型乳濁液を形成し、そして同時
にあるいは次に、界面に析出する水不溶性のポリマーを
添加することによってマイクロスフェアを作製するプロ
セスを記載している。次に、疎水性相を蒸発させ、空気
またはガスが充填されたマイクロスフェアを形成する。
械的剪断によって水中油型乳濁液を形成し、そして同時
にあるいは次に、界面に析出する水不溶性のポリマーを
添加することによってマイクロスフェアを作製するプロ
セスを記載している。次に、疎水性相を蒸発させ、空気
またはガスが充填されたマイクロスフェアを形成する。
【００１８】従って、本発明はまた、タンパク質溶液を
機械的剪断力に供することによって、熱変性可能なタン
パク質からマイクロスフェアを作製するための改善され
た方法に関する。このような力は、微小気泡の懸濁液を
形成し、これは、同時にまたは次に、個別の殻でカプセ
ル化される。キャビテーションによる加熱の性質上タン
パク質の変性は局部的であり、そして液体−気体界面に
析出することによって殻を形成する。この新規な方法
は、スケールアップが容易であり、そしてマイクロスフ
ェアを作製するためのいままでの音響学的な方法に比べ
て製造収率の増加へと至る。
機械的剪断力に供することによって、熱変性可能なタン
パク質からマイクロスフェアを作製するための改善され
た方法に関する。このような力は、微小気泡の懸濁液を
形成し、これは、同時にまたは次に、個別の殻でカプセ
ル化される。キャビテーションによる加熱の性質上タン
パク質の変性は局部的であり、そして液体−気体界面に
析出することによって殻を形成する。この新規な方法
は、スケールアップが容易であり、そしてマイクロスフ
ェアを作製するためのいままでの音響学的な方法に比べ
て製造収率の増加へと至る。
【００１９】
【発明が解決しようとする課題】上記のように、従来の
マイクロスフェアの製造においては、製造管理が困難で
あり、そして贈粘剤の使用などさらなる処理が必要であ
った。
マイクロスフェアの製造においては、製造管理が困難で
あり、そして贈粘剤の使用などさらなる処理が必要であ
った。
【００２０】本発明は、上記従来のマイクロスフェアの
製造法を改良し、安定性および耐圧性に優れたマイクロ
スフェアの製造法を提供することを目的とする。
製造法を改良し、安定性および耐圧性に優れたマイクロ
スフェアの製造法を提供することを目的とする。
【００２１】
【課題を解決するための手段】本発明の１つの局面は、
超音波画像化剤として有用なカプセル化されたガスのマ
イクロスフェアの製造方法であって、以下の工程を包含
する方法である：a)次に行われる機械的乳化において初
期変性温度を達成するに必要な温度で熱変性可能なタン
パク質の水溶液を調製する工程、b)該溶液とガスとを合
わせる工程、c)該タンパク質溶液とガスとの混合物を機
械的に剪断し、約0.1ミクロンから約10ミクロンの範囲
の平均直径を有するガスの微小気泡からなる懸濁液を形
成することにより、該混合物を乳化する工程、およびd)
該懸濁液を機械的キャビテーションに供して該タンパク
質を変性させ、該ガスと該溶液との界面に析出させるこ
とにより、該ガスの微小気泡をカプセル化し、マイクロ
スフェアを形成する工程。
超音波画像化剤として有用なカプセル化されたガスのマ
イクロスフェアの製造方法であって、以下の工程を包含
する方法である：a)次に行われる機械的乳化において初
期変性温度を達成するに必要な温度で熱変性可能なタン
パク質の水溶液を調製する工程、b)該溶液とガスとを合
わせる工程、c)該タンパク質溶液とガスとの混合物を機
械的に剪断し、約0.1ミクロンから約10ミクロンの範囲
の平均直径を有するガスの微小気泡からなる懸濁液を形
成することにより、該混合物を乳化する工程、およびd)
該懸濁液を機械的キャビテーションに供して該タンパク
質を変性させ、該ガスと該溶液との界面に析出させるこ
とにより、該ガスの微小気泡をカプセル化し、マイクロ
スフェアを形成する工程。
【００２２】上記温度は前記溶液を加熱することにより
達成され得る。あるいは上記温度は、前記溶液中に前記
タンパク質の変性温度を変える添加剤を含めることによ
り達成され得る。
達成され得る。あるいは上記温度は、前記溶液中に前記
タンパク質の変性温度を変える添加剤を含めることによ
り達成され得る。
【００２３】上記タンパク質は天然に存在するタンパク
質であり得、好ましくは、上記タンパク質はヒト血清ア
ルブミンである得る。あるいは上記タンパク質は合成タ
ンパク質であり得る。
質であり得、好ましくは、上記タンパク質はヒト血清ア
ルブミンである得る。あるいは上記タンパク質は合成タ
ンパク質であり得る。
【００２４】上記溶液中の上記タンパク質の濃度は、通
常、約0.1〜10％ w/v、好ましくは約１〜５％ w/vの範
囲であり、より好ましくは、約１％ w/vである。
常、約0.1〜10％ w/v、好ましくは約１〜５％ w/vの範
囲であり、より好ましくは、約１％ w/vである。
【００２５】通常、上記ガスは不溶性であって、好まし
くは上記不溶性ガスは、六フッ化イオウ、パーフルオロ
メタン、パーフルオロエタン、パーフルオロプロパン、
またはパーフルオロブタンである。あるい上記ガスは空
気であり得る。
くは上記不溶性ガスは、六フッ化イオウ、パーフルオロ
メタン、パーフルオロエタン、パーフルオロプロパン、
またはパーフルオロブタンである。あるい上記ガスは空
気であり得る。
【００２６】上記タンパク質溶液に対する上記ガスの比
は、通常５％〜200％ v/v、好ましくは20％〜100％ v/v
の範囲にある。
は、通常５％〜200％ v/v、好ましくは20％〜100％ v/v
の範囲にある。
【００２７】１つの実施態様において、上記工程(c)お
よび(d)は、上記混合物をミルを通して通過させること
により行われる。
よび(d)は、上記混合物をミルを通して通過させること
により行われる。
【００２８】１つの実施態様において、上記初期変性温
度は、上記タンパク質の変性温度より約１゜〜５゜低
い。
度は、上記タンパク質の変性温度より約１゜〜５゜低
い。
【００２９】本発明の別の局面は、超音波画像化剤とし
て有用なカプセル化されたガスのマイクロスフェアの製
造方法であって、フィルム形成性タンパク質の水溶液と
薬学的に受容可能な水不溶性ガスとの混合物を、酸素の
非存在下で超音波または機械的キャビテーションに供す
る工程を包含する方法である。
て有用なカプセル化されたガスのマイクロスフェアの製
造方法であって、フィルム形成性タンパク質の水溶液と
薬学的に受容可能な水不溶性ガスとの混合物を、酸素の
非存在下で超音波または機械的キャビテーションに供す
る工程を包含する方法である。
【００３０】本発明の別の局面は、超音波画像化剤とし
て有用なカプセル化されたガスのマイクロスフェアの製
造方法であって、フィルム形成性タンパク質の水溶液と
薬学的に受容可能な水不溶性ガスとの混合物を、大気に
対して閉鎖されている装置内で超音波または機械的キャ
ビテーションに供する工程を包含する方法である。
て有用なカプセル化されたガスのマイクロスフェアの製
造方法であって、フィルム形成性タンパク質の水溶液と
薬学的に受容可能な水不溶性ガスとの混合物を、大気に
対して閉鎖されている装置内で超音波または機械的キャ
ビテーションに供する工程を包含する方法である。
【００３１】本発明の別の局面は、熱不溶化フィルム形
成性タンパク質によりカプセル化されたガスのマイクロ
スフェアの水性懸濁液を含有する超音波画像化剤組成物
であって、該カプセル化されたガスが、完全に薬学的に
受容可能な水不溶性ガスである組成物である。
成性タンパク質によりカプセル化されたガスのマイクロ
スフェアの水性懸濁液を含有する超音波画像化剤組成物
であって、該カプセル化されたガスが、完全に薬学的に
受容可能な水不溶性ガスである組成物である。
【００３２】本発明の別の局面は、熱不溶化フィルム形
成性タンパク質によりカプセル化されたパーフルオロプ
ロパンガスのマイクロスフェアの水性懸濁液を含有する
超音波画像化剤組成物である。
成性タンパク質によりカプセル化されたパーフルオロプ
ロパンガスのマイクロスフェアの水性懸濁液を含有する
超音波画像化剤組成物である。
【００３３】
【発明の実施の形態】本発明の新規マイクロスフェア
は、不溶性ガス存在下および実質的に酸素の不在下、す
なわち嫌気的（閉鎖系）条件下で、フィルム形成性タン
パク質の水溶液の超音波または機械的キャビテーション
により、水性懸濁液中で形成される。マイクロスフェア
は、エコー反射性であり、そして10ミクロンより小さく
0.1ミクロンより大きい平均直径を有する経肺通過に適
切なサイズである。サイズ分布は、より大きいまたはよ
り小さいマイクロスフェア集団への分画化により変化し
得る。マイクロスフェアは、過剰の水相の除去により濃
縮され得るかまたは濃縮され得ず、あるいは回収されて
第２の水溶液中に再懸濁され得るかまたはされ得ない。
は、不溶性ガス存在下および実質的に酸素の不在下、す
なわち嫌気的（閉鎖系）条件下で、フィルム形成性タン
パク質の水溶液の超音波または機械的キャビテーション
により、水性懸濁液中で形成される。マイクロスフェア
は、エコー反射性であり、そして10ミクロンより小さく
0.1ミクロンより大きい平均直径を有する経肺通過に適
切なサイズである。サイズ分布は、より大きいまたはよ
り小さいマイクロスフェア集団への分画化により変化し
得る。マイクロスフェアは、過剰の水相の除去により濃
縮され得るかまたは濃縮され得ず、あるいは回収されて
第２の水溶液中に再懸濁され得るかまたはされ得ない。
【００３４】これらの新規マイクロスフェアの製造に用
いられるガスは、薬学的に受容可能であり、それらが配
される水性媒体（すなわち、最初はそれらが製造される
媒体、使用されるときは血液中）に不溶性であることの
み必要とされる。水への溶解度は、このような媒体にお
ける溶解度の近似値である。「ガス」という用語は、イ
メージングが行われる温度（代表的には通常の生理学的
温度）で気体であるかまたは気体を形成し得る任意の化
合物をいう。ガスは、単一の化合物または化合物の混合
物から構成され得る。適切なガスには、六フッ化イオ
ウ、パーフルオロエタン、パーフルオロプロパン、パー
フルオロメタン、およびパーフルオロブタンなどのフッ
素含有ガスが挙げられるが、これらに限定されない。ガ
スの溶解度は、目的のガスのブンゼン(Bunsen)係数を測
定することにより定義され得る。この値は、溶媒の単位
容積により吸収されるガスの容積である。（Wen, W-Y、
Muccitelli, JA、J. Sol. Chem. 8:225-240 (1979)を参
照のこと）。本発明に用いるに適切なガスは、25℃の水
において0.01 mL/mL(溶液)より低いブンゼン係数を有す
るべきである。表１に、数種のガスのブンゼン係数を示
す。
いられるガスは、薬学的に受容可能であり、それらが配
される水性媒体（すなわち、最初はそれらが製造される
媒体、使用されるときは血液中）に不溶性であることの
み必要とされる。水への溶解度は、このような媒体にお
ける溶解度の近似値である。「ガス」という用語は、イ
メージングが行われる温度（代表的には通常の生理学的
温度）で気体であるかまたは気体を形成し得る任意の化
合物をいう。ガスは、単一の化合物または化合物の混合
物から構成され得る。適切なガスには、六フッ化イオ
ウ、パーフルオロエタン、パーフルオロプロパン、パー
フルオロメタン、およびパーフルオロブタンなどのフッ
素含有ガスが挙げられるが、これらに限定されない。ガ
スの溶解度は、目的のガスのブンゼン(Bunsen)係数を測
定することにより定義され得る。この値は、溶媒の単位
容積により吸収されるガスの容積である。（Wen, W-Y、
Muccitelli, JA、J. Sol. Chem. 8:225-240 (1979)を参
照のこと）。本発明に用いるに適切なガスは、25℃の水
において0.01 mL/mL(溶液)より低いブンゼン係数を有す
るべきである。表１に、数種のガスのブンゼン係数を示
す。
【００３５】
【表１】 マイクロスフェア中に含まれるガスの他の特徴は、ガス
の拡散性が25℃の水中で４×10-5cm2/秒よりも低いこと
である。しかし、拡散定数が異なる溶媒でおよび異なる
温度で変化することに留意すべきであるが、ガスの選択
の目的では、ガスはこの基準に一致すべきである。
の拡散性が25℃の水中で４×10-5cm2/秒よりも低いこと
である。しかし、拡散定数が異なる溶媒でおよび異なる
温度で変化することに留意すべきであるが、ガスの選択
の目的では、ガスはこの基準に一致すべきである。
【００３６】薬学的に受容可能とは、選択したガスが生
体適合性であり、そして毒性が最小でなければならない
という特性をいう。
体適合性であり、そして毒性が最小でなければならない
という特性をいう。
【００３７】パーフルオロプロパンは、(1)製造および
使用の温度で凝縮しない、(2)異性体を有さない、(3)優
れた耐圧性を示すマイクロスフェアを生成する、そして
(4)薬学的に受容可能である、不溶性ガスを提供するの
で、好適である。
使用の温度で凝縮しない、(2)異性体を有さない、(3)優
れた耐圧性を示すマイクロスフェアを生成する、そして
(4)薬学的に受容可能である、不溶性ガスを提供するの
で、好適である。
【００３８】ガス微小気泡は、フィルム形成性タンパク
質殻によりカプセル化されている。フィルム形成性とい
う用語は、（熱変性により生じる）タンパク質の不溶化
において、タンパク質がトラップしたガスの周囲に外向
きに親水性基および内向きに疎水性基を有する殻を形成
する能力をいう。タンパク質は、必ず親水性および疎水
性の両方のアミノ酸を有する。適切なタンパク質には、
アルブミン、γ-グロブリン（ヒト）、アポトランスフ
ェリン（ヒト）、b-ラクトグロブリン、およびウレアー
ゼのような天然に存在するタンパク質が挙げられる。天
然に存在するタンパク質が好適であるが、３次構造を示
しそして熱変性を受けやすい合成タンパク質（ホモポリ
マーまたはヘテロポリマー）が用いられ得る。本発明に
特に適切なものはアルブミンであり、そしてさらに特に
はヒトアルブミンである。タンパク質は、約0.1〜10％w
/vの範囲の濃度で、好適には約１〜５％w/vの範囲の濃
度で、最も好適には約１％w/vの濃度で溶液中に存在す
る。
質殻によりカプセル化されている。フィルム形成性とい
う用語は、（熱変性により生じる）タンパク質の不溶化
において、タンパク質がトラップしたガスの周囲に外向
きに親水性基および内向きに疎水性基を有する殻を形成
する能力をいう。タンパク質は、必ず親水性および疎水
性の両方のアミノ酸を有する。適切なタンパク質には、
アルブミン、γ-グロブリン（ヒト）、アポトランスフ
ェリン（ヒト）、b-ラクトグロブリン、およびウレアー
ゼのような天然に存在するタンパク質が挙げられる。天
然に存在するタンパク質が好適であるが、３次構造を示
しそして熱変性を受けやすい合成タンパク質（ホモポリ
マーまたはヘテロポリマー）が用いられ得る。本発明に
特に適切なものはアルブミンであり、そしてさらに特に
はヒトアルブミンである。タンパク質は、約0.1〜10％w
/vの範囲の濃度で、好適には約１〜５％w/vの範囲の濃
度で、最も好適には約１％w/vの濃度で溶液中に存在す
る。
【００３９】本発明に適切なタンパク質、または得られ
るマイクロスフェアは、器官の標的化または免疫原性活
性を消去する目的で化学的に改変され得る（例えば、ポ
リエチレングリコールを用いる改変）。しかし、本発明
は、マイクロスフェアの形成の目的のための化学的架橋
剤の添加、またはタンパク質の他の改変を包含しない。
るマイクロスフェアは、器官の標的化または免疫原性活
性を消去する目的で化学的に改変され得る（例えば、ポ
リエチレングリコールを用いる改変）。しかし、本発明
は、マイクロスフェアの形成の目的のための化学的架橋
剤の添加、またはタンパク質の他の改変を包含しない。
【００４０】本発明のマイクロスフェアは、不溶性ガス
の存在下、酸素の非存在下で（すなわち、空気の混入が
回避される閉鎖系で）のキャビテーションの結果とし
て、溶液中でタンパク質の一部を不溶化することにより
形成される。このようなタンパク質の不溶化は、局部的
なタンパク質の変性およびガスコアの周囲での配向によ
り主として特徴づけられ、後者は、不溶性ガスの存在下
で増強され得る。
の存在下、酸素の非存在下で（すなわち、空気の混入が
回避される閉鎖系で）のキャビテーションの結果とし
て、溶液中でタンパク質の一部を不溶化することにより
形成される。このようなタンパク質の不溶化は、局部的
なタンパク質の変性およびガスコアの周囲での配向によ
り主として特徴づけられ、後者は、不溶性ガスの存在下
で増強され得る。
【００４１】本発明のマイクロスフェアの形成のために
タンパク質を熱不溶化するに用いられる系は、嫌気的、
すなわち大気に対して閉じられていなければならず、
「閉鎖系」と呼ばれる。比較して、「開放系」とは、大
気に対して開かれている系である。このような閉鎖系で
製造されたマイクロスフェアにトラップされたガスは、
必然的に、その形成に使用された不溶性ガスのみを含
む。大気による混入は、Ｏ 2電極を用いて、系から流出
するＯ2の存在を測定することでモニターし得る。本発
明において、マイクロスフェアは、その形成に使用され
たガスのみを最初に含むように製造される。しかし、ガ
ス含有物が実験的に測定されるとき、実験手順の間に、
大気のガスによるある量の避けがたい混入があり、した
がって、測定により得られたガスの量は100％より低
い。したがって、ガスの測定値が85％より高いものが、
最初のガス含量が完全な不溶性ガスであるマイクロスフ
ェアを示す。
タンパク質を熱不溶化するに用いられる系は、嫌気的、
すなわち大気に対して閉じられていなければならず、
「閉鎖系」と呼ばれる。比較して、「開放系」とは、大
気に対して開かれている系である。このような閉鎖系で
製造されたマイクロスフェアにトラップされたガスは、
必然的に、その形成に使用された不溶性ガスのみを含
む。大気による混入は、Ｏ 2電極を用いて、系から流出
するＯ2の存在を測定することでモニターし得る。本発
明において、マイクロスフェアは、その形成に使用され
たガスのみを最初に含むように製造される。しかし、ガ
ス含有物が実験的に測定されるとき、実験手順の間に、
大気のガスによるある量の避けがたい混入があり、した
がって、測定により得られたガスの量は100％より低
い。したがって、ガスの測定値が85％より高いものが、
最初のガス含量が完全な不溶性ガスであるマイクロスフ
ェアを示す。
【００４２】マイクロスフェアの形成後、大気への曝露
はパッケージングの間は避けるべきである。例えば、マ
イクロスフェアは、閉鎖系から取り出された時点から５
〜30秒以内にバイアルまたは他の気密容器に封入されな
ければならない。さらに、バイアルのすべてのヘッドス
ペースは除去されて、パッケージングの間に形成に用い
たガスで置換されなければならない。
はパッケージングの間は避けるべきである。例えば、マ
イクロスフェアは、閉鎖系から取り出された時点から５
〜30秒以内にバイアルまたは他の気密容器に封入されな
ければならない。さらに、バイアルのすべてのヘッドス
ペースは除去されて、パッケージングの間に形成に用い
たガスで置換されなければならない。
【００４３】不溶性ガスで満たすと、これらのタンパク
質マイクロスフェアは、顕著な安定性を示し、約1.0×1
09マイクロスフェア／mLの濃度で40 psig（＞2000 mmH
g）に曝露しても残存する。マイクロスフェアはまた、
希釈懸濁液中で弾性を示し、３〜10 psigの圧力下での
圧縮を示し、圧力から解放されるともとの容積に回復す
る。追加の化学的架橋剤は不利である。なぜなら、得ら
れるマイクロスフェアは増強した圧力安定性を示すには
構造が剛性になり過ぎるからである。
質マイクロスフェアは、顕著な安定性を示し、約1.0×1
09マイクロスフェア／mLの濃度で40 psig（＞2000 mmH
g）に曝露しても残存する。マイクロスフェアはまた、
希釈懸濁液中で弾性を示し、３〜10 psigの圧力下での
圧縮を示し、圧力から解放されるともとの容積に回復す
る。追加の化学的架橋剤は不利である。なぜなら、得ら
れるマイクロスフェアは増強した圧力安定性を示すには
構造が剛性になり過ぎるからである。
【００４４】本発明のマイクロスフェアは、遊離の微小
気泡とは異なり、合体および拡散させる膨張に耐性であ
る。空気または酸素飽和溶液中で種々の温度でインキュ
ベートした不溶性ガスを含むマイクロスフェアは、平均
直径が増大せず、あるいは総容量が増加しない。タンパ
ク質殻は、圧力をかけると弾性であるが、膨張にあるい
はガス拡散またはガス交換による破裂に抵抗するに十分
強靭である。タンパク質殻の存在は、合体を抑制し、そ
して空気充填されたタンパク質マイクロスフェアと同様
に、数ヶ月まで小さな個々の気泡でガスを維持する。不
溶性ガス充填されたマイクロスフェアが溶媒和された大
気ガスでの交換により測定可能に膨張され得ないこと
は、新規であり、この物質の超音波剤としての使用のた
めの重要な特性である。
気泡とは異なり、合体および拡散させる膨張に耐性であ
る。空気または酸素飽和溶液中で種々の温度でインキュ
ベートした不溶性ガスを含むマイクロスフェアは、平均
直径が増大せず、あるいは総容量が増加しない。タンパ
ク質殻は、圧力をかけると弾性であるが、膨張にあるい
はガス拡散またはガス交換による破裂に抵抗するに十分
強靭である。タンパク質殻の存在は、合体を抑制し、そ
して空気充填されたタンパク質マイクロスフェアと同様
に、数ヶ月まで小さな個々の気泡でガスを維持する。不
溶性ガス充填されたマイクロスフェアが溶媒和された大
気ガスでの交換により測定可能に膨張され得ないこと
は、新規であり、この物質の超音波剤としての使用のた
めの重要な特性である。
【００４５】不溶性ガスをトラップしたタンパク質マイ
クロスフェアは、脱気した水溶液に曝露したときの圧潰
に抵抗性を示す。遊離の微小気泡または空気充填された
カプセル化したマイクロスフェアとは異なり、不溶性ガ
ス充填されたマイクロスフェアは、真空で脱気した水に
加えることができ、高希釈でも一体性を維持し得る。空
気充填された物質は、気相の酸素成分の流出のため、血
液中で圧潰される。不溶性ガス充填されたマイクロスフ
ェアが、部分的に脱気されまたは加圧された環境で圧潰
に抵抗性である能力は、インビボでの超音波コントラス
トの持続を劇的に増加する。
クロスフェアは、脱気した水溶液に曝露したときの圧潰
に抵抗性を示す。遊離の微小気泡または空気充填された
カプセル化したマイクロスフェアとは異なり、不溶性ガ
ス充填されたマイクロスフェアは、真空で脱気した水に
加えることができ、高希釈でも一体性を維持し得る。空
気充填された物質は、気相の酸素成分の流出のため、血
液中で圧潰される。不溶性ガス充填されたマイクロスフ
ェアが、部分的に脱気されまたは加圧された環境で圧潰
に抵抗性である能力は、インビボでの超音波コントラス
トの持続を劇的に増加する。
【００４６】本発明のマイクロスフェアは、超音波キャ
ビテーションまたは機械的キャビテーションによって製
造され得る。空気充填マイクロスフェアの超音波製造方
法は、Cerryによって記載されている（米国特許第4,95
7,656号）。
ビテーションまたは機械的キャビテーションによって製
造され得る。空気充填マイクロスフェアの超音波製造方
法は、Cerryによって記載されている（米国特許第4,95
7,656号）。
【００４７】機械的キャビテーションは、本発明の新規
な不溶性ガス充填マイクロスフェアを製造するために好
ましい方法である。この方法はまた、空気充填または不
溶性ガス（例えば、N2、H2、アルゴン）充填マイクロス
フェアを製造するためにも用いられ得る。
な不溶性ガス充填マイクロスフェアを製造するために好
ましい方法である。この方法はまた、空気充填または不
溶性ガス（例えば、N2、H2、アルゴン）充填マイクロス
フェアを製造するためにも用いられ得る。
【００４８】本発明の新規な機械的キャビテーション手
順においては、熱変性タンパク質の水溶液が、次に行わ
れるこの溶液の機械的乳化において初期変性温度を達成
するに必要な温度で提供される。溶液中のタンパク質の
変性温度は、通常、50℃〜100℃の範囲であり得る。そ
れは、文献中の熱タンパク質変性の表から、または任意
の公知の方法により実験的に得られ得る。例えば、変性
温度を実験的に決定するために、タンパク質溶液は、水
浴中で撹拌しながら加熱され得る。変性温度は、不溶性
物質が最初に観察される温度である。変性温度はタンパ
ク質の性質、純度、および供給源、溶液中のタンパク質
濃度、pH、緩衝液、イオン強度、安定剤の存在、および
化学変性剤または界面活性剤の存在により影響され得る
ことに注意されたい。従って、マイクロスフェアの製造
に用いられる環境において、タンパク質の変性温度を決
定することが必要である。所望であれば、界面活性剤ま
たは極性溶媒のような添加剤が、変性が起こる温度を変
化させるために用いられ得る。
順においては、熱変性タンパク質の水溶液が、次に行わ
れるこの溶液の機械的乳化において初期変性温度を達成
するに必要な温度で提供される。溶液中のタンパク質の
変性温度は、通常、50℃〜100℃の範囲であり得る。そ
れは、文献中の熱タンパク質変性の表から、または任意
の公知の方法により実験的に得られ得る。例えば、変性
温度を実験的に決定するために、タンパク質溶液は、水
浴中で撹拌しながら加熱され得る。変性温度は、不溶性
物質が最初に観察される温度である。変性温度はタンパ
ク質の性質、純度、および供給源、溶液中のタンパク質
濃度、pH、緩衝液、イオン強度、安定剤の存在、および
化学変性剤または界面活性剤の存在により影響され得る
ことに注意されたい。従って、マイクロスフェアの製造
に用いられる環境において、タンパク質の変性温度を決
定することが必要である。所望であれば、界面活性剤ま
たは極性溶媒のような添加剤が、変性が起こる温度を変
化させるために用いられ得る。
【００４９】表２は、上記のように実験的に決定され
た、いくつかの天然に存在するタンパク質の変性温度を
示す：
た、いくつかの天然に存在するタンパク質の変性温度を
示す：
【００５０】
【表２】 * TRIS ＝ 2-アミノ-2-（ヒドロキシメチル）-1,3-プ
ロパンジオール** MES ＝ 2-（N-モルホリノ）エタンスルホン酸*** DTT ＝ ジチオトレイトール タンパク質溶液／ガス混合物を剪断するために用いられ
る各装置は、そのタンパク質溶液に加えられる機械的剪
断力によって、溶液に特定量のさらなる加熱を生じさせ
る。その熱は、気−液界面でタンパク質の局所変性を生
じさせるに十分でなければならない。従って、タンパク
質溶液が装置に導入される温度が、このような局所熱変
性を達成するように調整され得るためには、装置により
生じる温度上昇量を決定することが重要である。詳細に
は、装置中の液体の大部分の温度が、キャビテーション
の直前に初期変性温度と一致しなければならない。キャ
ビテーション事象は、タンパク質を局所的に変性させる
に必要なさらなる熱を生成し得る。初期変性温度は、タ
ンパク質が変性のまぎわにあるが、溶液が変性タンパク
質を含有しない温度として定義される。この温度は、変
性温度をちょうど下回る、典型的には１〜５℃下回る温
度である。必要であれば、出発タンパク質溶液は、装置
に導入される前に、初期変性温度が達成され得る温度に
予備加熱され得る。
ロパンジオール** MES ＝ 2-（N-モルホリノ）エタンスルホン酸*** DTT ＝ ジチオトレイトール タンパク質溶液／ガス混合物を剪断するために用いられ
る各装置は、そのタンパク質溶液に加えられる機械的剪
断力によって、溶液に特定量のさらなる加熱を生じさせ
る。その熱は、気−液界面でタンパク質の局所変性を生
じさせるに十分でなければならない。従って、タンパク
質溶液が装置に導入される温度が、このような局所熱変
性を達成するように調整され得るためには、装置により
生じる温度上昇量を決定することが重要である。詳細に
は、装置中の液体の大部分の温度が、キャビテーション
の直前に初期変性温度と一致しなければならない。キャ
ビテーション事象は、タンパク質を局所的に変性させる
に必要なさらなる熱を生成し得る。初期変性温度は、タ
ンパク質が変性のまぎわにあるが、溶液が変性タンパク
質を含有しない温度として定義される。この温度は、変
性温度をちょうど下回る、典型的には１〜５℃下回る温
度である。必要であれば、出発タンパク質溶液は、装置
に導入される前に、初期変性温度が達成され得る温度に
予備加熱され得る。
【００５１】一旦タンパク質溶液の適切な出発温度が達
成されると、溶液は、例えば乳化工程前または工程中
に、約５％〜200％、好ましくは20％〜100％気体：液体
の範囲の体積比でガスをタンパク質溶液中に導入するこ
とによって、適切なガスと合わせられる。適切な気体：
液体比は、装置の幾何学的形状、気体の物理的特性（溶
解度、密度、分子量など）に依存し、そして最適出力に
調整され得る。
成されると、溶液は、例えば乳化工程前または工程中
に、約５％〜200％、好ましくは20％〜100％気体：液体
の範囲の体積比でガスをタンパク質溶液中に導入するこ
とによって、適切なガスと合わせられる。適切な気体：
液体比は、装置の幾何学的形状、気体の物理的特性（溶
解度、密度、分子量など）に依存し、そして最適出力に
調整され得る。
【００５２】ガスおよびタンパク質溶液が合わせられた
後、この混合物は乳化され、そしてマイクロスフェア製
造条件下でキャビテーションに供される。これは、機械
的剪断および流体力学キャビテーションが生成され得る
装置、例えば、高速ミキサー、ミル、フルイダイザーな
ど、を用いて達成される。好ましい装置はコロイドミル
であり、これは、「高速ロータおよびステータからな
り、分散または乳化が対向する面によってなされる装
置」として定義される（Advanced Filtration andSepar
ation Technology, p.108-110）。用いられ得る特定の
ミル装置の例を以下に示す：
後、この混合物は乳化され、そしてマイクロスフェア製
造条件下でキャビテーションに供される。これは、機械
的剪断および流体力学キャビテーションが生成され得る
装置、例えば、高速ミキサー、ミル、フルイダイザーな
ど、を用いて達成される。好ましい装置はコロイドミル
であり、これは、「高速ロータおよびステータからな
り、分散または乳化が対向する面によってなされる装
置」として定義される（Advanced Filtration andSepar
ation Technology, p.108-110）。用いられ得る特定の
ミル装置の例を以下に示す：
【００５３】
【化１】 不溶性ガス充填マイクロスフェアを製造するために用い
られる場合、コロイドミルは、混合物中へ空気が導入さ
れないように大気に対して閉鎖されるべきである。
られる場合、コロイドミルは、混合物中へ空気が導入さ
れないように大気に対して閉鎖されるべきである。
【００５４】図１〜３は、機械的キャビテーションプロ
セスにおいて用いられ得るミルのいくつかのタイプをさ
らに詳細に説明する。
セスにおいて用いられ得るミルのいくつかのタイプをさ
らに詳細に説明する。
【００５５】図１は、Gaulinミルの必須要素を図示す
る。これらは、以下の通りである：モーター（図示せ
ず）に作動可能に接続されている回転シャフト（10）；
シャフト（10）の端部に固定されたディスクロータ（1
2）；およびステータ（11）。ステータ（11）は、中央
ボア開口部（18）とロータを受容するカウンタボア（1
6）とを有する。このミルでは、タンパク質溶液および
ガスが「Ｔ字管(tee)」（15）を介してミルじゅうに供
給される。タンパク質溶液／ガス混合物はロータおよび
ステータの表面間で乳化およびキャビテーションされ
る。このミルの「ギャップ」は、ステータカウンタボア
の半径方向表面（17）とロータの半径方向表面との間の
間隔である。マイクロスフェア生成物の温度は、混合物
がステータ（11）を通過して出ていく際に得られる（例
えば、熱電対（図示せず）によって）。
る。これらは、以下の通りである：モーター（図示せ
ず）に作動可能に接続されている回転シャフト（10）；
シャフト（10）の端部に固定されたディスクロータ（1
2）；およびステータ（11）。ステータ（11）は、中央
ボア開口部（18）とロータを受容するカウンタボア（1
6）とを有する。このミルでは、タンパク質溶液および
ガスが「Ｔ字管(tee)」（15）を介してミルじゅうに供
給される。タンパク質溶液／ガス混合物はロータおよび
ステータの表面間で乳化およびキャビテーションされ
る。このミルの「ギャップ」は、ステータカウンタボア
の半径方向表面（17）とロータの半径方向表面との間の
間隔である。マイクロスフェア生成物の温度は、混合物
がステータ（11）を通過して出ていく際に得られる（例
えば、熱電対（図示せず）によって）。
【００５６】図２は、Bematekミルの必須要素を示す。
このミルは、図１のGaulinミルに構造および機能が似て
いる−−主な違いは、ロータおよびステータカウンタボ
アの配置である。これは、回転シャフト（20）（ネジ状
前縁（22）を有する円錐台形ロータ（21）を支持す
る）、ならびにステータ（23）（中央円筒開口部（2
5）、およびロータを受容するようにつくられている円
錐台形カウンタボア（24）を有する）を備える。タンパ
ク質溶液／ガス混合物は、開口部（25）を介してこのミ
ル中に供給される。ガスおよび溶液は、それらがシャフ
ト上のネジ（22）のそばを通過する際に混合され、そし
て混合物は、ミルのギャップを通過する際に乳化されキ
ャビテーションにかけられる。ギャップは、ロータおよ
びステータの台形表面の間の間隔により定義される。
このミルは、図１のGaulinミルに構造および機能が似て
いる−−主な違いは、ロータおよびステータカウンタボ
アの配置である。これは、回転シャフト（20）（ネジ状
前縁（22）を有する円錐台形ロータ（21）を支持す
る）、ならびにステータ（23）（中央円筒開口部（2
5）、およびロータを受容するようにつくられている円
錐台形カウンタボア（24）を有する）を備える。タンパ
ク質溶液／ガス混合物は、開口部（25）を介してこのミ
ル中に供給される。ガスおよび溶液は、それらがシャフ
ト上のネジ（22）のそばを通過する際に混合され、そし
て混合物は、ミルのギャップを通過する際に乳化されキ
ャビテーションにかけられる。ギャップは、ロータおよ
びステータの台形表面の間の間隔により定義される。
【００５７】図３は、Silversonミルを示す。このミル
の構造は、図１および２のミルの構造とは全く異なる。
図示されたSilversonミルは、回転シャフト（30）（パ
ドルブレードロータ（31）を支持する）を有する。この
ロータは、カップ形多孔スクリーンステータ（32）内に
受容される。ステータは、入口継手（34）がとりつけら
れたハウジング（33）上に備え付けられている。入口継
手は、多孔スクリーンステータ（32）の底部中央部で開
口しているハウジング（33）中にまで延びている。ハウ
ジングは中央開口部（図示せず）を有する。この中央開
口部は、入口継手およびステータの底部の開口部（図示
せず）に通じる。このミルでは、溶液／ガスは、入口継
手を介してステータの底部に供給され、そしてパドルロ
ータの平面（35）とステータの内部円周表面との間で乳
化およびキャビテーションされる。このミルの「ギャッ
プ」は、ロータ（31）とステータ（32）との間の間隔と
して定義され得るが、このプロセスにおけるギャップサ
イズの効果はステータの孔（36）のサイズにより影響さ
れる。
の構造は、図１および２のミルの構造とは全く異なる。
図示されたSilversonミルは、回転シャフト（30）（パ
ドルブレードロータ（31）を支持する）を有する。この
ロータは、カップ形多孔スクリーンステータ（32）内に
受容される。ステータは、入口継手（34）がとりつけら
れたハウジング（33）上に備え付けられている。入口継
手は、多孔スクリーンステータ（32）の底部中央部で開
口しているハウジング（33）中にまで延びている。ハウ
ジングは中央開口部（図示せず）を有する。この中央開
口部は、入口継手およびステータの底部の開口部（図示
せず）に通じる。このミルでは、溶液／ガスは、入口継
手を介してステータの底部に供給され、そしてパドルロ
ータの平面（35）とステータの内部円周表面との間で乳
化およびキャビテーションされる。このミルの「ギャッ
プ」は、ロータ（31）とステータ（32）との間の間隔と
して定義され得るが、このプロセスにおけるギャップサ
イズの効果はステータの孔（36）のサイズにより影響さ
れる。
【００５８】ミルを通過した後、生成物は、典型的には
10〜20℃に冷却され、そして沈澱により、またはマイク
ロスフェアに不利な影響を及ぼさない消泡剤の添加によ
り消泡され得る。
10〜20℃に冷却され、そして沈澱により、またはマイク
ロスフェアに不利な影響を及ぼさない消泡剤の添加によ
り消泡され得る。
【００５９】混合物をこのようなミルまたは等価の装置
を通過させることにより、混合物は乳化およびキャビテ
ーションされ、約0.1〜10ミクロン（平均直径）の範囲
のマイクロスフェアを形成する。マイクロスフェアサイ
ズは、適切な粒子カウンタ、例えば、Coulter Multisiz
er II（Coulter Erectronics, Hialeah, Fl）により決
定され得る。
を通過させることにより、混合物は乳化およびキャビテ
ーションされ、約0.1〜10ミクロン（平均直径）の範囲
のマイクロスフェアを形成する。マイクロスフェアサイ
ズは、適切な粒子カウンタ、例えば、Coulter Multisiz
er II（Coulter Erectronics, Hialeah, Fl）により決
定され得る。
【００６０】図１〜３に記載されるようなミルを用いる
場合、ロータ速度、ギャップサイズ、および気体：液体
比は、マイクロスフェア生成物の特性（平均サイズ、サ
イズ分布、およびマイクロスフェア濃度）に影響する主
要なプロセスパラメータである。これらのパラメータ
は、所望の特性を有する生成物を提供するように経験的
に調整され得る。いかなる生成物に対しても、その特性
は臨床的に定義される。例えば、心筋灌流のために用い
られるパーフルオロプロパンマイクロスフェアの推定上
の詳細は以下の通りである：平均サイズ、４ミクロン；
サイズ分布、10ミクロン以下が90％；濃度、７×108〜
２×109マイクロスフェア／mL。
場合、ロータ速度、ギャップサイズ、および気体：液体
比は、マイクロスフェア生成物の特性（平均サイズ、サ
イズ分布、およびマイクロスフェア濃度）に影響する主
要なプロセスパラメータである。これらのパラメータ
は、所望の特性を有する生成物を提供するように経験的
に調整され得る。いかなる生成物に対しても、その特性
は臨床的に定義される。例えば、心筋灌流のために用い
られるパーフルオロプロパンマイクロスフェアの推定上
の詳細は以下の通りである：平均サイズ、４ミクロン；
サイズ分布、10ミクロン以下が90％；濃度、７×108〜
２×109マイクロスフェア／mL。
【００６１】本発明は、以下の実施例によりさらに説明
される。これらの実施例は本発明をいかなるようにも限
定しない。
される。これらの実施例は本発明をいかなるようにも限
定しない。
【００６２】
【実施例】（実施例１）機械的キャビテーションプロセ
スの温度モニタリングおよびヒト血清アルブミンの制御 上述のように、タンパク質溶液は、プロセス温度が初期
変性温度に達しそして維持され得るように処理の前に予
熱される。
スの温度モニタリングおよびヒト血清アルブミンの制御 上述のように、タンパク質溶液は、プロセス温度が初期
変性温度に達しそして維持され得るように処理の前に予
熱される。
【００６３】実施の代表的な方法は以下の通りである。
【００６４】モデル２ 1/2インチBematek Colloid Mill
（図２；Bematek Systems、BeverlyMA）を、入口ポート
が熱交換器に連結するように配管した。ガス不透過性の
管を用いて、熱交換器蛇管の接続部(barb)間をソフトに
連結した。
（図２；Bematek Systems、BeverlyMA）を、入口ポート
が熱交換器に連結するように配管した。ガス不透過性の
管を用いて、熱交換器蛇管の接続部(barb)間をソフトに
連結した。
【００６５】プロセスヘッドからの出口ポートを、ステ
ンレス鋼のプロセス後の冷却器に連結した。
ンレス鋼のプロセス後の冷却器に連結した。
【００６６】溶液温度を３ヶ所（T1、T2、およびT3）で
モニターした。T1熱電対を予熱熱交換器とミルヘッドと
の間のSwagelokの「Ｔ字管(Tee)」に取り付けて、タン
パク質溶液の供給温度を測定した。ガスを導入するため
の第２の「Ｔ字管」もまた供給ポートに配置した。プロ
セスの温度が正確に測定され得るようにプロセスヘッド
からの出口の内部（ロータから約１cm、そしてシャフト
から約２cm）にT2熱電対を配置した。このように、２ヶ
所の温度（供給温度(T1)およびプロセス温度(T2)）は独
立に測定され得、そして処理の間、溶液の加熱量を決定
するために比較される。
モニターした。T1熱電対を予熱熱交換器とミルヘッドと
の間のSwagelokの「Ｔ字管(Tee)」に取り付けて、タン
パク質溶液の供給温度を測定した。ガスを導入するため
の第２の「Ｔ字管」もまた供給ポートに配置した。プロ
セスの温度が正確に測定され得るようにプロセスヘッド
からの出口の内部（ロータから約１cm、そしてシャフト
から約２cm）にT2熱電対を配置した。このように、２ヶ
所の温度（供給温度(T1)およびプロセス温度(T2)）は独
立に測定され得、そして処理の間、溶液の加熱量を決定
するために比較される。
【００６７】本実施例には、U.S.P.アルブミンを通常の
生理食塩水で希釈して、１％(w/v)溶液を作製した。記
載されたように、変性温度が実験的に78℃であると測定
された。脱気した後に、100mL/分（50％ v/v）のパーフ
ルオロプロパンとともに200mL/分でミルに供給した。T1
とT2との間には10℃〜15℃の差が認められた。77℃のプ
ロセス温度（変性温度より１℃低い）を得るために、供
給温度を62℃〜67℃の範囲に調整した。発生する熱量は
異なるミル処理のパラメーターにより変化するので、変
性タンパク質の薄い殻でガス微小気泡を首尾良くカプセ
ル化しながら、タンパク質のバルク変性を回避するプロ
セス温度を目標にするためには、ミル処理のパラメータ
ー（ミルの選択、ミルのセッティング、流速、ガス：液
体比など）のそれぞれの変化によるT1とT2との差を測定
することが必要である。冷却器出口温度（T3）もまたモ
ニターし、そして最高の結果のために20℃を目標にし
た。
生理食塩水で希釈して、１％(w/v)溶液を作製した。記
載されたように、変性温度が実験的に78℃であると測定
された。脱気した後に、100mL/分（50％ v/v）のパーフ
ルオロプロパンとともに200mL/分でミルに供給した。T1
とT2との間には10℃〜15℃の差が認められた。77℃のプ
ロセス温度（変性温度より１℃低い）を得るために、供
給温度を62℃〜67℃の範囲に調整した。発生する熱量は
異なるミル処理のパラメーターにより変化するので、変
性タンパク質の薄い殻でガス微小気泡を首尾良くカプセ
ル化しながら、タンパク質のバルク変性を回避するプロ
セス温度を目標にするためには、ミル処理のパラメータ
ー（ミルの選択、ミルのセッティング、流速、ガス：液
体比など）のそれぞれの変化によるT1とT2との差を測定
することが必要である。冷却器出口温度（T3）もまたモ
ニターし、そして最高の結果のために20℃を目標にし
た。
【００６８】（実施例２）異なるガスを含有するマイク
ロスフェアを作製する機械的キャビテーション法 種々のガスを含有するマイクロスフェアを以下のように
作製した。５％ヒトアルブミン溶液（USP）を、２時間
の連続減圧下で脱気した。排気された容器を目的のガス
で充填することにより減圧から開放した。利用される不
溶性ガスには、六フッ化イオウ、パーフルオロエタン、
およびパーフルオロプロパンが包含される。より可溶性
のガス（空気、窒素、酸素、およびアルゴン）を含有す
るマイクロスフェアもまた作製された。アルゴンの使用
は、高分子量のガス（しかし比較的可溶性のガス）の代
表であった。アルブミン溶液をインライン熱交換器を経
由して68℃に調整し、そして100mL/分で２ 1/2インチコ
ロイドミル（Greerco、Hudson、NH、モデルW250Vまたは
AF Gaulin、Everett、MA、モデル2F）にポンプで供給し
た。室温で特定のガスを、120〜220mL/分の流速で入口
ポートのすぐ直前の上流の供給液体に加えた。ロータと
ステータとの間のギャップを2/1000インチ（0.005cm）
に調整し、そしてアルブミン溶液を73℃のプロセス温
度、約7000rpmで連続的に処理した。
ロスフェアを作製する機械的キャビテーション法 種々のガスを含有するマイクロスフェアを以下のように
作製した。５％ヒトアルブミン溶液（USP）を、２時間
の連続減圧下で脱気した。排気された容器を目的のガス
で充填することにより減圧から開放した。利用される不
溶性ガスには、六フッ化イオウ、パーフルオロエタン、
およびパーフルオロプロパンが包含される。より可溶性
のガス（空気、窒素、酸素、およびアルゴン）を含有す
るマイクロスフェアもまた作製された。アルゴンの使用
は、高分子量のガス（しかし比較的可溶性のガス）の代
表であった。アルブミン溶液をインライン熱交換器を経
由して68℃に調整し、そして100mL/分で２ 1/2インチコ
ロイドミル（Greerco、Hudson、NH、モデルW250Vまたは
AF Gaulin、Everett、MA、モデル2F）にポンプで供給し
た。室温で特定のガスを、120〜220mL/分の流速で入口
ポートのすぐ直前の上流の供給液体に加えた。ロータと
ステータとの間のギャップを2/1000インチ（0.005cm）
に調整し、そしてアルブミン溶液を73℃のプロセス温
度、約7000rpmで連続的に処理した。
【００６９】このように形成されたマイクロスフェアの
濃厚白色溶液を、直ちに熱交換器で10℃の温度まで冷却
し、そしてガラスバイアルに回収した。このバイアルを
直ちに密封した。この物質を、コールターカウンター(C
oulter Counter)を用いて濃度およびサイズ分布に関し
て特徴付けした。結果を以下の表３に示す。
濃厚白色溶液を、直ちに熱交換器で10℃の温度まで冷却
し、そしてガラスバイアルに回収した。このバイアルを
直ちに密封した。この物質を、コールターカウンター(C
oulter Counter)を用いて濃度およびサイズ分布に関し
て特徴付けした。結果を以下の表３に示す。
【００７０】
【表３】 （実施例３）ロータスピードおよびギャップサイズの影
響 １％アルブミン溶液（200mL/分）を、ガスの液体に対す
る比(v/v) 50％でパーフルオロプロパン（100mL/分）と
合わせた。マイクロスフェアを、ロータスピードおよび
ギャップサイズを変えて実施例１に記載の手順により調
製した。得られたデータを表４に示す。
響 １％アルブミン溶液（200mL/分）を、ガスの液体に対す
る比(v/v) 50％でパーフルオロプロパン（100mL/分）と
合わせた。マイクロスフェアを、ロータスピードおよび
ギャップサイズを変えて実施例１に記載の手順により調
製した。得られたデータを表４に示す。
【００７１】
【表４】 これらの結果は、ロータスピードの増加により濃度が増
加しそして平均サイズが減少することを示し、その一方
ギャップサイズが増加すると濃度が減少することを示
す。
加しそして平均サイズが減少することを示し、その一方
ギャップサイズが増加すると濃度が減少することを示
す。
【００７２】（実施例４）ガスの液体に対する比の影響 0.5％アルブミン溶液（100mL/分）を、約0.012のギャッ
プおよび9950ft/分のロータ先端スピードを有するGauli
nミルを用いて20、50、70、または100mL/分（液体に対
して20％、50％、70％、または100％(v/v)のガス）のパ
ーフルオロプロパンと合わせた。得られたデータを表５
に示す。
プおよび9950ft/分のロータ先端スピードを有するGauli
nミルを用いて20、50、70、または100mL/分（液体に対
して20％、50％、70％、または100％(v/v)のガス）のパ
ーフルオロプロパンと合わせた。得られたデータを表５
に示す。
【００７３】
【表５】 これらの結果は、ガス：液体比の増加とともに濃度およ
び平均サイズの両方が増加することを示す。
び平均サイズの両方が増加することを示す。
【００７４】（実施例５）音波キャビテーションにより
不溶性ガス充填マイクロスフェアを作製する方法 空気、六フッ化イオウ、およびパーフルオロエタンマイ
クロスフェアを、回分および連続超音波キャビテーショ
ンプロセスの両方により調製した。ヒトアルブミンの溶
液（５％ USP）を減圧下で脱気し、そして特定のガス雰
囲気下で保存した。連続音波処理プロセスを、空気の代
わりに不溶性ガスを用いてCerny(米国特許第4,957,656
号)に記載されるように行った。回分プロセスを3/4イン
チの液体処理ホーン（Sonics and Materials、Danbury
CT）を利用して行った。プロセス全体で空気を排除する
ように、ガスをホーンに沿ってアルブミン中に通した。
アルブミンを73℃まで加温し、そしてBranson圧電コン
バーターおよび電源（Branson Ultrasonics、Danbury C
T）を用いて、20KHzで60ミクロンのダブル振幅で５秒間
超音波処理した。生成物を直ちにガラスバイアルに移
し、そしてガスの下で密封した。
不溶性ガス充填マイクロスフェアを作製する方法 空気、六フッ化イオウ、およびパーフルオロエタンマイ
クロスフェアを、回分および連続超音波キャビテーショ
ンプロセスの両方により調製した。ヒトアルブミンの溶
液（５％ USP）を減圧下で脱気し、そして特定のガス雰
囲気下で保存した。連続音波処理プロセスを、空気の代
わりに不溶性ガスを用いてCerny(米国特許第4,957,656
号)に記載されるように行った。回分プロセスを3/4イン
チの液体処理ホーン（Sonics and Materials、Danbury
CT）を利用して行った。プロセス全体で空気を排除する
ように、ガスをホーンに沿ってアルブミン中に通した。
アルブミンを73℃まで加温し、そしてBranson圧電コン
バーターおよび電源（Branson Ultrasonics、Danbury C
T）を用いて、20KHzで60ミクロンのダブル振幅で５秒間
超音波処理した。生成物を直ちにガラスバイアルに移
し、そしてガスの下で密封した。
【００７５】この生成物は、2.5〜3.3ミクロンの平均サ
イズを有する1.4×108〜1.0×109マイクロスフェア/mL
濃度のマイクロスフェアの濃厚な乳状懸濁液であった。
イズを有する1.4×108〜1.0×109マイクロスフェア/mL
濃度のマイクロスフェアの濃厚な乳状懸濁液であった。
【００７６】（実施例６）マイクロスフェアの顕微鏡検
査 種々のガスを含有するアルブミンマイクロスフェアを、
実施例２または５に記載されるように調製した。生成物
のマイクロスフェア検査によって、球状マイクロスフェ
アの単一分散懸濁液であることが明らかになった。この
マイクロスフェアは、懸濁液が清澄化されるまでシリン
ジ中で高圧力を印加することにより圧潰した。全ての場
合で、顕微鏡再検査により、崩壊したマイクロスフェア
由来の透明な膜状の殻の存在が示された。
査 種々のガスを含有するアルブミンマイクロスフェアを、
実施例２または５に記載されるように調製した。生成物
のマイクロスフェア検査によって、球状マイクロスフェ
アの単一分散懸濁液であることが明らかになった。この
マイクロスフェアは、懸濁液が清澄化されるまでシリン
ジ中で高圧力を印加することにより圧潰した。全ての場
合で、顕微鏡再検査により、崩壊したマイクロスフェア
由来の透明な膜状の殻の存在が示された。
【００７７】（実施例７）マイクロスフェアの耐圧性 種々のガスを含有するアルブミンマイクロスフェアを、
実施例２に記載されるように調製した。各懸濁液の10mL
を、圧力ゲージを取り付けた10mLの気密ガラスシリンジ
（Hamilton、Reno NV）に入れた。全てのヘッドスペー
スをなくし、そして器具を密封した。40psigの一定圧力
を３分間印加した。次いで、コールターカウンターを用
いて、サンプル粒子の濃度および分布を測定した。加圧
の前後のデータ（図４〜図８）の比較により、40psigま
での不溶性ガスマイクロスフェアの相対耐性が示され
た。
実施例２に記載されるように調製した。各懸濁液の10mL
を、圧力ゲージを取り付けた10mLの気密ガラスシリンジ
（Hamilton、Reno NV）に入れた。全てのヘッドスペー
スをなくし、そして器具を密封した。40psigの一定圧力
を３分間印加した。次いで、コールターカウンターを用
いて、サンプル粒子の濃度および分布を測定した。加圧
の前後のデータ（図４〜図８）の比較により、40psigま
での不溶性ガスマイクロスフェアの相対耐性が示され
た。
【００７８】（実施例８）マイクロスフェアの希釈懸濁
液の耐圧性 種々のガスを含有するマイクロスフェアを、実施例２に
記載されるように調製した。マイクロスフェアの各サン
プルを、リン酸緩衝化生理食塩水(0.15M)１mLあたり等
容量のカプセル化されたガスが含まれるまで、約１：60
希釈で希釈した。希釈懸濁液は、適切なヘッドスペース
を有する密封された容器中で0.5psig〜7.5psigの即時の
静的圧力を受けた。図９は、マイクロスフェア濃度に対
する圧力の影響を示す。不溶性ガスである、パーフルオ
ロプロパン、パーフルオロエタン、および六フッ化イオ
ウを含有するマイクロスフェアは、同じ濃度および同じ
サイズ分布の、空気または高分子量のアルゴン充填マイ
クロスフェアよりもかなり耐圧性がある（図１０）。血
流中の生理的圧力は、末梢静脈圧の1.5psigから心筋壁
中における2.5psigまでの範囲に及ぶ。
液の耐圧性 種々のガスを含有するマイクロスフェアを、実施例２に
記載されるように調製した。マイクロスフェアの各サン
プルを、リン酸緩衝化生理食塩水(0.15M)１mLあたり等
容量のカプセル化されたガスが含まれるまで、約１：60
希釈で希釈した。希釈懸濁液は、適切なヘッドスペース
を有する密封された容器中で0.5psig〜7.5psigの即時の
静的圧力を受けた。図９は、マイクロスフェア濃度に対
する圧力の影響を示す。不溶性ガスである、パーフルオ
ロプロパン、パーフルオロエタン、および六フッ化イオ
ウを含有するマイクロスフェアは、同じ濃度および同じ
サイズ分布の、空気または高分子量のアルゴン充填マイ
クロスフェアよりもかなり耐圧性がある（図１０）。血
流中の生理的圧力は、末梢静脈圧の1.5psigから心筋壁
中における2.5psigまでの範囲に及ぶ。
【００７９】（実施例９）マイクロスフェアに対する脱
気した緩衝液の影響 種々のガスを含有するアルブミンマイクロスフェアを、
実施例２に記載されるように調製した。リン酸緩衝化生
理食塩水（PBS）を、使用する直前に沸騰させることに
よって脱気した。熱い緩衝液の0.05mL〜1.5mLのアリコ
ートを、13×100の試験管に入れ、そして１分間水浴で
冷却して室温にした。一定容積のマイクロスフェアを各
試験管に加えた。混合した後、最終容積をPBSで3.0mLに
し、そしてマイクロスフェア濃度を測定した。図１１
は、脱気溶液中で改善された残存率が、不溶性ガスであ
るパーフルオロプロパン、パーフルオロエタン、および
六フッ化イオウを含有するマイクロスフェアについて得
られたことを示す。
気した緩衝液の影響 種々のガスを含有するアルブミンマイクロスフェアを、
実施例２に記載されるように調製した。リン酸緩衝化生
理食塩水（PBS）を、使用する直前に沸騰させることに
よって脱気した。熱い緩衝液の0.05mL〜1.5mLのアリコ
ートを、13×100の試験管に入れ、そして１分間水浴で
冷却して室温にした。一定容積のマイクロスフェアを各
試験管に加えた。混合した後、最終容積をPBSで3.0mLに
し、そしてマイクロスフェア濃度を測定した。図１１
は、脱気溶液中で改善された残存率が、不溶性ガスであ
るパーフルオロプロパン、パーフルオロエタン、および
六フッ化イオウを含有するマイクロスフェアについて得
られたことを示す。
【００８０】空気、六フッ化イオウ、またはパーフルオ
ロエタンを含有するマイクロスフェアを全血中に希釈し
た。空気を充填したマイクロスフェアは圧潰を示した。
不溶性ガスを充填したマイクロスフェアは、新鮮全血で
の希釈において残存することを示した。
ロエタンを含有するマイクロスフェアを全血中に希釈し
た。空気を充填したマイクロスフェアは圧潰を示した。
不溶性ガスを充填したマイクロスフェアは、新鮮全血で
の希釈において残存することを示した。
【００８１】（実施例１０）弾力性 種々のガスから調製したマイクロスフェアを、実施例２
に記載のように調製した。マイクロスフェアを、実施例
８に記載のように、リン酸緩衝化生理食塩水中に希釈
し、そして顕微鏡のステージ上に置いた透明なセル中に
入れた。セルを窒素供給源に接続し、そのことにより、
マイクロスフェアに対する生理学的圧力の急速な印加お
よび開放の影響の観察を可能にした。
に記載のように調製した。マイクロスフェアを、実施例
８に記載のように、リン酸緩衝化生理食塩水中に希釈
し、そして顕微鏡のステージ上に置いた透明なセル中に
入れた。セルを窒素供給源に接続し、そのことにより、
マイクロスフェアに対する生理学的圧力の急速な印加お
よび開放の影響の観察を可能にした。
【００８２】可溶性ガス含有マイクロスフェアに対する
1.5psigまたはそれより大きい圧力の印加の結果は、球
形体の完全損失が観察された。マイクロスフェアは、圧
力から開放されても再形成せず、不可逆的破壊であるこ
とを示した。1.5psigより小さい圧力の印加は、マイク
ロスフェアの不完全損失を伴う殻の変形およびしわを生
じた。球状の外観または集団は印加された圧力からの開
放に際し回復され得なかった。
1.5psigまたはそれより大きい圧力の印加の結果は、球
形体の完全損失が観察された。マイクロスフェアは、圧
力から開放されても再形成せず、不可逆的破壊であるこ
とを示した。1.5psigより小さい圧力の印加は、マイク
ロスフェアの不完全損失を伴う殻の変形およびしわを生
じた。球状の外観または集団は印加された圧力からの開
放に際し回復され得なかった。
【００８３】不溶性のパーフルオロカーボンガスを含む
マイクロスフェアの懸濁液に対する数psigまでの圧力の
印加により、マイクロスフェアの直径が減少した。マイ
クロスフェアの直径は、圧力からの開放に際しもとの大
きさに戻った。
マイクロスフェアの懸濁液に対する数psigまでの圧力の
印加により、マイクロスフェアの直径が減少した。マイ
クロスフェアの直径は、圧力からの開放に際しもとの大
きさに戻った。
【００８４】六フッ化イオウのマイクロスフェアはま
た、印加された生理学的圧力下で、空気が充填されたマ
イクロスフェアに比べて増加した弾力性を示したが、パ
ーフルオロカーボンのマイクロスフェアに比べて低い弾
性を示した。
た、印加された生理学的圧力下で、空気が充填されたマ
イクロスフェアに比べて増加した弾力性を示したが、パ
ーフルオロカーボンのマイクロスフェアに比べて低い弾
性を示した。
【００８５】これらの観察は、不溶性ガスを含むマイク
ロスフェアが圧力に対して耐性であっただけではなく、
圧力が開放された後も回復したことをも示す。このこと
は、タンパク質殻が弾力性であることを示す。
ロスフェアが圧力に対して耐性であっただけではなく、
圧力が開放された後も回復したことをも示す。このこと
は、タンパク質殻が弾力性であることを示す。
【００８６】（実施例１１）開放系および閉鎖系で作製
されたマイクロスフェアの比較処理方法 A)手動音波処理： 開放系(EPA554,213の１段階法に相
当する) 米国特許第4,844,882号および欧州特許出願第554,213号
に記載された方法を用いてマイクロスフェアを以下のよ
うに調製した：20ccのシリンジ円筒にその先端を通じて
挿入したＴ型熱電対をはめ込み、支持スタンド上に設置
した。このシリンジに、スイス赤十字(SwissRedCross)
５%ヒト血清アルブミンを16ccの印まで満たした。ガス
(パーフルオロプロパン(C3F8)または六フッ化イオウ(SF
6))をシリンジ円筒の上部に導入し、そして液体表面上
に流した。音波ホーンを、液面下の10ccの印まで下げ、
そして溶液温度が72.8〜73℃まで上昇するまで(約１分
間)、50％の出力で稼働した。ホーンを直ちにメニスカ
ス±１mmまで引き上げ、そして出力レベルを65％まで増
加した。音波処理をさらに５秒間続け、温度がさらに1.
2〜２℃上昇した。生成物をガラスバイアル中に容量ま
で注ぎそして密封した。 B)連続音波処理：閉鎖系 米国特許第4,957,656号に記載される方法を使用して以
下のようにパーフルオロプロパンおよび六フッ化イオウ
マイクロスフェアを調製した：ヒト血清アルブミンを、
殺菌生理食塩水を用いて１％W/V溶液まで希釈した。こ
の溶液を約76℃まで加熱して初期変性させた。この系は
外部大気に対して閉鎖されており、そしてパーフルオロ
プロパンまたは六フッ化イオウガスを空気の代わりに液
体流(1:1)中に導入した。音波発生器ホーンを通過させ
て約100ml液体/分でガス/アルブミン混合物を流すこと
により生成物が連続的に作製された。生成物を、音波処
理チャンバーから出すときに、熱交換器を通過させるこ
とにより冷却し、そしてマイクロスフェアのバルク液体
懸濁液として収集した。取り扱いと貯蔵条件は、手動で
生成したマイクロスフェアについて与えられた条件と同
様であった。 C)機械的キャビテーション：閉鎖系 パーフルオロプロパンまたは六フッ化イオウガスを含む
アルブミンマイクロスフェアはまた、閉鎖系中で、１％
ヒト血清アルブミンとガスとの混合物をミル処理(milli
ng)することにより、実施例２に記載されたように生成
された。アルブミン溶液を、所定のミルの機械的キャビ
テーションによるマイクロスフェア形成を可能にするに
十分な温度まで加熱し、1:1(v:v)でガスと混合し、そし
てコロイドミル中に導入した。液体流速は、ミルの容量
またはサイズに依存し、代表的には100〜500ml/分であ
った。SilversonL4RミルおよびBematek3インチ製造コロ
イドミルをこの評価のために使用した。ミルからの流出
物を熱交換系を通過させることにより冷却し、そして得
られるアルブミンマイクロスフェア懸濁液をバルクで集
めた。生成物を、他のプロセスと同様にガラスバイアル
中に満たした。
されたマイクロスフェアの比較処理方法 A)手動音波処理： 開放系(EPA554,213の１段階法に相
当する) 米国特許第4,844,882号および欧州特許出願第554,213号
に記載された方法を用いてマイクロスフェアを以下のよ
うに調製した：20ccのシリンジ円筒にその先端を通じて
挿入したＴ型熱電対をはめ込み、支持スタンド上に設置
した。このシリンジに、スイス赤十字(SwissRedCross)
５%ヒト血清アルブミンを16ccの印まで満たした。ガス
(パーフルオロプロパン(C3F8)または六フッ化イオウ(SF
6))をシリンジ円筒の上部に導入し、そして液体表面上
に流した。音波ホーンを、液面下の10ccの印まで下げ、
そして溶液温度が72.8〜73℃まで上昇するまで(約１分
間)、50％の出力で稼働した。ホーンを直ちにメニスカ
ス±１mmまで引き上げ、そして出力レベルを65％まで増
加した。音波処理をさらに５秒間続け、温度がさらに1.
2〜２℃上昇した。生成物をガラスバイアル中に容量ま
で注ぎそして密封した。 B)連続音波処理：閉鎖系 米国特許第4,957,656号に記載される方法を使用して以
下のようにパーフルオロプロパンおよび六フッ化イオウ
マイクロスフェアを調製した：ヒト血清アルブミンを、
殺菌生理食塩水を用いて１％W/V溶液まで希釈した。こ
の溶液を約76℃まで加熱して初期変性させた。この系は
外部大気に対して閉鎖されており、そしてパーフルオロ
プロパンまたは六フッ化イオウガスを空気の代わりに液
体流(1:1)中に導入した。音波発生器ホーンを通過させ
て約100ml液体/分でガス/アルブミン混合物を流すこと
により生成物が連続的に作製された。生成物を、音波処
理チャンバーから出すときに、熱交換器を通過させるこ
とにより冷却し、そしてマイクロスフェアのバルク液体
懸濁液として収集した。取り扱いと貯蔵条件は、手動で
生成したマイクロスフェアについて与えられた条件と同
様であった。 C)機械的キャビテーション：閉鎖系 パーフルオロプロパンまたは六フッ化イオウガスを含む
アルブミンマイクロスフェアはまた、閉鎖系中で、１％
ヒト血清アルブミンとガスとの混合物をミル処理(milli
ng)することにより、実施例２に記載されたように生成
された。アルブミン溶液を、所定のミルの機械的キャビ
テーションによるマイクロスフェア形成を可能にするに
十分な温度まで加熱し、1:1(v:v)でガスと混合し、そし
てコロイドミル中に導入した。液体流速は、ミルの容量
またはサイズに依存し、代表的には100〜500ml/分であ
った。SilversonL4RミルおよびBematek3インチ製造コロ
イドミルをこの評価のために使用した。ミルからの流出
物を熱交換系を通過させることにより冷却し、そして得
られるアルブミンマイクロスフェア懸濁液をバルクで集
めた。生成物を、他のプロセスと同様にガラスバイアル
中に満たした。
【００８７】分析方法 A)集団動力学 集団動力学を、50ミクロンの開口度を用いてCoulterMul
tisizerIIを用いて評価した。「処理方法」の項で記載
されたように調製されたアルブミンマイクロスフェア
を、Isoton中に１：10,000に希釈し、そして500μlの試
料を分析した。もとのマイクロスフェア懸濁液の濃度、
平均サイズ、および１mlあたりのカプセル化ガス容量を
得た。 B)ガス含有量 「処理方法」の項で記載されたように調製された２つの
ロットのマイクロスフェア中にトラップされたパーフル
オロプロパンの百分率は、HewlettPackard5890によるガ
スクロマトグラフィーにより測定した。マイクロスフェ
ア懸濁液試料を気密シリンジ中に採った。エタノール中
の消泡剤を用いてマイクロスフェアからガスを放出し、
そしてトラップされたガスを熱伝導度により検出した。 C)耐圧性 アルブミンマイクロスフェアの耐圧性をSinteticaによ
る欧州特許出願第554,213号により報告された方法と同
様の方法により評価した。マイクロスフェアを、３mlの
圧力キュベット中、600nmで約１吸光度単位まで、曝気
リン酸緩衝化生理食塩水中に希釈した。首部を圧力供給
源に取り付けて、キュベットを記録用分光光度計中に置
いた。キュベット中の圧力を、０から５または10psigま
で150秒間にわたって直線的に増加させ、その時点で圧
力を開放した。圧力勾配は、20psiの圧力供給源(N2タン
ク)と５リットルのステンレス鋼リザーバーとの間に置
いた電磁弁(Honeywell)および圧力トランスデューサー
(Omega)を比例動作させることにより生じさせた。キュ
ベットをデジタル圧力計を通じてステンレス鋼リザーバ
ーに接続した。アナログ−デジタルコンバーターおよび
デジタル−アナログコンバーターボード(NationalInstr
uments)を備えたPC型コンピューターが、バルブの開口
を制御し、そして圧力トランスデューサーを読み取っ
た。リザーバーおよびキュベットを、所望の圧力が達成
されるまで、選択された速度で加圧した。マイクロスフ
ェア懸濁液の光学密度を時間および圧力の関数としてモ
ニターした。データをキュベット中のマイクロスフェア
の自然浮上速度に対して補正した。
tisizerIIを用いて評価した。「処理方法」の項で記載
されたように調製されたアルブミンマイクロスフェア
を、Isoton中に１：10,000に希釈し、そして500μlの試
料を分析した。もとのマイクロスフェア懸濁液の濃度、
平均サイズ、および１mlあたりのカプセル化ガス容量を
得た。 B)ガス含有量 「処理方法」の項で記載されたように調製された２つの
ロットのマイクロスフェア中にトラップされたパーフル
オロプロパンの百分率は、HewlettPackard5890によるガ
スクロマトグラフィーにより測定した。マイクロスフェ
ア懸濁液試料を気密シリンジ中に採った。エタノール中
の消泡剤を用いてマイクロスフェアからガスを放出し、
そしてトラップされたガスを熱伝導度により検出した。 C)耐圧性 アルブミンマイクロスフェアの耐圧性をSinteticaによ
る欧州特許出願第554,213号により報告された方法と同
様の方法により評価した。マイクロスフェアを、３mlの
圧力キュベット中、600nmで約１吸光度単位まで、曝気
リン酸緩衝化生理食塩水中に希釈した。首部を圧力供給
源に取り付けて、キュベットを記録用分光光度計中に置
いた。キュベット中の圧力を、０から５または10psigま
で150秒間にわたって直線的に増加させ、その時点で圧
力を開放した。圧力勾配は、20psiの圧力供給源(N2タン
ク)と５リットルのステンレス鋼リザーバーとの間に置
いた電磁弁(Honeywell)および圧力トランスデューサー
(Omega)を比例動作させることにより生じさせた。キュ
ベットをデジタル圧力計を通じてステンレス鋼リザーバ
ーに接続した。アナログ−デジタルコンバーターおよび
デジタル−アナログコンバーターボード(NationalInstr
uments)を備えたPC型コンピューターが、バルブの開口
を制御し、そして圧力トランスデューサーを読み取っ
た。リザーバーおよびキュベットを、所望の圧力が達成
されるまで、選択された速度で加圧した。マイクロスフ
ェア懸濁液の光学密度を時間および圧力の関数としてモ
ニターした。データをキュベット中のマイクロスフェア
の自然浮上速度に対して補正した。
【００８８】結果 A)集団動力学 手動音波処理、連続音波処理および機械的キャビテーシ
ョンの方法により生成されたアルブミンマイクロスフェ
アを、製造後24時間以内に、濃度、平均サイズ、カプセ
ル化ガス容量およびサイズ分布について分析した。すべ
ての測定は、最小限２回行い、そして平均として表し
た。これらの測定の結果を表６中に示す。
ョンの方法により生成されたアルブミンマイクロスフェ
アを、製造後24時間以内に、濃度、平均サイズ、カプセ
ル化ガス容量およびサイズ分布について分析した。すべ
ての測定は、最小限２回行い、そして平均として表し
た。これらの測定の結果を表６中に示す。
【００８９】
【表６】 すべての方法により生成されたマイクロスフェアは、本
研究の継続期間中、４℃で少なくとも数週間、安定であ
った。 B)ガス含有量 マイクロスフェアの２つのロット中の、トラップされた
パーフルオロプロパンガスの組成分析を、表７に示す。
研究の継続期間中、４℃で少なくとも数週間、安定であ
った。 B)ガス含有量 マイクロスフェアの２つのロット中の、トラップされた
パーフルオロプロパンガスの組成分析を、表７に示す。
【００９０】
【表７】 *２つのロットの平均の結果。
【００９１】これらの結果は、手動音波処理を用いて開
放系で作製されたマイクロスフェアが、閉鎖系(連続音
波処理および機械的キャビテーション)中で作製された
マイクロスフェアに比べ、マイクロスフェアを形成する
ために用いられたガスのカプセル化がかなり少ないこと
を示す。閉鎖系で作製されるマイクロスフェアは、酸素
電極を用いて測定されるように、酸素の非存在下で作製
された。３つのすべての方法により作成されたマイクロ
スフェアは、取り扱いおよびサンプリングの間、大気に
対し同程度に曝された(２つの閉鎖系手順を用いて作製
されたマイクロスフェアで測定される100％未満のパー
フルオロプロパンガスで説明される)、従って、開放系
での形成の間酸素(およびその他の大気ガス)が存在し、
そのことがガスカプセル化の効率を小さくする。 C)耐圧性 ガス充填されたマイクロスフェアの懸濁液は、圧力が増
大すると、サイズ減少および関連する表面領域の変化に
より光学密度が減少する。収縮は２つの因子に起因す
る；気体法則に従った可逆的圧縮、およびヘンリーの法
則に従い増加した溶解度による周辺液体へのガスコアの
不可逆的損失である。印加圧力の開放に際し、圧縮によ
る容量損失の部分のみが回復し、そしてそれは光学密度
の増加により観察され得る。周辺溶液へのトラップガス
の損失は、減圧に際しマイクロスフェアに再び入らず、
溶液上のヘッドスペースに失われる。
放系で作製されたマイクロスフェアが、閉鎖系(連続音
波処理および機械的キャビテーション)中で作製された
マイクロスフェアに比べ、マイクロスフェアを形成する
ために用いられたガスのカプセル化がかなり少ないこと
を示す。閉鎖系で作製されるマイクロスフェアは、酸素
電極を用いて測定されるように、酸素の非存在下で作製
された。３つのすべての方法により作成されたマイクロ
スフェアは、取り扱いおよびサンプリングの間、大気に
対し同程度に曝された(２つの閉鎖系手順を用いて作製
されたマイクロスフェアで測定される100％未満のパー
フルオロプロパンガスで説明される)、従って、開放系
での形成の間酸素(およびその他の大気ガス)が存在し、
そのことがガスカプセル化の効率を小さくする。 C)耐圧性 ガス充填されたマイクロスフェアの懸濁液は、圧力が増
大すると、サイズ減少および関連する表面領域の変化に
より光学密度が減少する。収縮は２つの因子に起因す
る；気体法則に従った可逆的圧縮、およびヘンリーの法
則に従い増加した溶解度による周辺液体へのガスコアの
不可逆的損失である。印加圧力の開放に際し、圧縮によ
る容量損失の部分のみが回復し、そしてそれは光学密度
の増加により観察され得る。周辺溶液へのトラップガス
の損失は、減圧に際しマイクロスフェアに再び入らず、
溶液上のヘッドスペースに失われる。
【００９２】図１２は、手動音波処理(開放系)法、なら
びに連続音波処理および機械的キャビテーション(閉鎖
系)法によりパーフルオロプロパンガスを用いて調製さ
れたアルブミンマイクロスフェアの１OD懸濁液に関して
10psiまでの直線状圧力勾配を課した結果を示す。両方
の閉鎖系法は、増加する圧力で圧縮され、勾配の最後で
圧力の開放に際し全容積が回復するマイクロスフェアを
生じる。周辺溶液へのトラップされたガスの損失は観察
されなかった。開放系(手動音波処理法)で調製されたア
ルブミンマイクロスフェアは、印可された圧力でより大
きな圧縮を示し、そしてガスコアの不可逆的損失のため
に圧力の開放に際し容積は部分的に回復するのみであ
り、マイクロスフェアの40％が破壊された。
びに連続音波処理および機械的キャビテーション(閉鎖
系)法によりパーフルオロプロパンガスを用いて調製さ
れたアルブミンマイクロスフェアの１OD懸濁液に関して
10psiまでの直線状圧力勾配を課した結果を示す。両方
の閉鎖系法は、増加する圧力で圧縮され、勾配の最後で
圧力の開放に際し全容積が回復するマイクロスフェアを
生じる。周辺溶液へのトラップされたガスの損失は観察
されなかった。開放系(手動音波処理法)で調製されたア
ルブミンマイクロスフェアは、印可された圧力でより大
きな圧縮を示し、そしてガスコアの不可逆的損失のため
に圧力の開放に際し容積は部分的に回復するのみであ
り、マイクロスフェアの40％が破壊された。
【００９３】
【発明の効果】改善された耐圧性および安定性を有する
カプセル化ガスマイクロスフェアの製造方法が提供され
る。フィルム形成性タンパク質の水溶液とパーフルオロ
プロパンのような水不溶性ガスとを混合し、この混合物
を、大気に対して閉鎖された装置内で、超音波または機
械的キャビテーションに供するので、ガス微小気泡がフ
ィルム形成性タンパク質殻によりカプセル化される。こ
のガス微小気泡は、遊離の微小気泡と異なり、合体およ
び拡散させる膨張に耐性であり、タンパク質殻の存在に
より、長期間の間、微小な個々の気泡でガス、そしてそ
れ故優れたエコー反射性を維持する。
カプセル化ガスマイクロスフェアの製造方法が提供され
る。フィルム形成性タンパク質の水溶液とパーフルオロ
プロパンのような水不溶性ガスとを混合し、この混合物
を、大気に対して閉鎖された装置内で、超音波または機
械的キャビテーションに供するので、ガス微小気泡がフ
ィルム形成性タンパク質殻によりカプセル化される。こ
のガス微小気泡は、遊離の微小気泡と異なり、合体およ
び拡散させる膨張に耐性であり、タンパク質殻の存在に
より、長期間の間、微小な個々の気泡でガス、そしてそ
れ故優れたエコー反射性を維持する。
【図１】本発明の機械的キャビテーションプロセスにお
いて使用され得るミルの一例（Gaulinミル）の概略分解
図である。
いて使用され得るミルの一例（Gaulinミル）の概略分解
図である。
【図２】本発明の機械的キャビテーションプロセスにお
いて使用され得るミルの別の例（Bematekミル）の概略
分解図である。
いて使用され得るミルの別の例（Bematekミル）の概略
分解図である。
【図３】本発明の機械的キャビテーションプロセスにお
いて使用され得るミルのさらに別の例（Silversonミ
ル）の概略分解図である。
いて使用され得るミルのさらに別の例（Silversonミ
ル）の概略分解図である。
【図４】空気充填されたアルブミンマイクロスフェアの
耐圧性を示すグラフを示す図である。マイクロスフェア
懸濁液を注射器内に入れ、40psigで加圧した。加圧前後
の粒子分布を示す。
耐圧性を示すグラフを示す図である。マイクロスフェア
懸濁液を注射器内に入れ、40psigで加圧した。加圧前後
の粒子分布を示す。
【図５】パーフルオロプロパン充填されたアルブミンマ
イクロスフェアの耐圧性を示すグラフを示す図である。
マイクロスフェア懸濁液を注射器内に入れ、40psigで加
圧した。加圧前後の粒子分布を示す。
イクロスフェアの耐圧性を示すグラフを示す図である。
マイクロスフェア懸濁液を注射器内に入れ、40psigで加
圧した。加圧前後の粒子分布を示す。
【図６】パーフルオロエタン充填されたアルブミンマイ
クロスフェアの耐圧性を示すグラフを示す図である。マ
イクロスフェア懸濁液を注射器内に入れ、40psigで加圧
した。加圧前後の粒子分布を示す。
クロスフェアの耐圧性を示すグラフを示す図である。マ
イクロスフェア懸濁液を注射器内に入れ、40psigで加圧
した。加圧前後の粒子分布を示す。
【図７】六フッ化イオウ充填されたアルブミンマイクロ
スフェアの耐圧性を示すグラフを示す図である。マイク
ロスフェア懸濁液を注射器内に入れ、40psigで加圧し
た。加圧前後の粒子分布を示す。
スフェアの耐圧性を示すグラフを示す図である。マイク
ロスフェア懸濁液を注射器内に入れ、40psigで加圧し
た。加圧前後の粒子分布を示す。
【図８】アルゴン充填されたアルブミンマイクロスフェ
アの耐圧性を示すグラフを示す図である。マイクロスフ
ェア懸濁液を注射器内に入れ、40psigで加圧した。加圧
前後の粒子分布を示す。
アの耐圧性を示すグラフを示す図である。マイクロスフ
ェア懸濁液を注射器内に入れ、40psigで加圧した。加圧
前後の粒子分布を示す。
【図９】マイクロスフェア希釈懸濁液の3.0psigでの耐
圧性を示すグラフを示す図である。マイクロスフェア希
釈懸濁液を１cmキュベット内に入れ、3.0psigでt=30秒
間加圧した。パーフルオロエタン、パーフルオロプロパ
ン、六フッ化イオウおよび空気のマイクロスフェアのデ
ータを示す。
圧性を示すグラフを示す図である。マイクロスフェア希
釈懸濁液を１cmキュベット内に入れ、3.0psigでt=30秒
間加圧した。パーフルオロエタン、パーフルオロプロパ
ン、六フッ化イオウおよび空気のマイクロスフェアのデ
ータを示す。
【図１０】アルゴンマイクロスフェアの希釈懸濁液の3.
0psigでの耐圧性を示すグラフを示す図である。希釈さ
れたアルゴンマイクロスフェアを１cmキュベット内に入
れ、3.0psigでt=30秒間加圧した。
0psigでの耐圧性を示すグラフを示す図である。希釈さ
れたアルゴンマイクロスフェアを１cmキュベット内に入
れ、3.0psigでt=30秒間加圧した。
【図１１】マイクロスフェアに対する脱気された緩衝液
の影響を示すグラフを示す図である。マイクロスフェア
を、脱気された緩衝液の増加量に添加し、混合し、そし
て、この混合物を濃度測定のための一定体積とした。空
気、パーフルオロプロパン、パーフルオロエタン、およ
び六フッ化イオウのマイクロスフェアのデータを、脱気
された緩衝液の体積に対してプロットしている。
の影響を示すグラフを示す図である。マイクロスフェア
を、脱気された緩衝液の増加量に添加し、混合し、そし
て、この混合物を濃度測定のための一定体積とした。空
気、パーフルオロプロパン、パーフルオロエタン、およ
び六フッ化イオウのマイクロスフェアのデータを、脱気
された緩衝液の体積に対してプロットしている。
【図１２】後述の実施例11に記載のデータを示すグラフ
を示す図である。
を示す図である。
10、20、30 回転シャフト 11、23 ステータ 12 ディスクロータ 15 Ｔ字管 16 カウンタボア 17 半径方向表面 18 中央ボア開口部 21 円錐台形ロータ 22 ネジ状前縁 24 円錐台形カウンタボア 25 中央円筒開口部 31 パドルブレードロータ 32 カップ形多孔スクリーンステータ 33 ハウジング 34 入口継手 35 パドルロータの平面 36 ステータの孔
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 エドワード ジー． ジャブロンスキ アメリカ合衆国 カリフォルニア 92029， エスコンディド， エルフィ ン フォレスト ロード 20748 (72)発明者 カール ヒュール アメリカ合衆国 カリフォルニア 92109， サンディエゴ， カス スト リート 4325 (72)発明者 ケネス ハミルトン アメリカ合衆国 カリフォルニア 92007， カーディフ， ウッドグロー ブ ドライブ 950 (72)発明者 ロルフ ローマン アメリカ合衆国 カリフォルニア 92037， ラ ホヤ， リンダ ローザ アベニュー 5531 (56)参考文献 特表 平５−502681（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A61K 49/00
Claims (13)
- 【請求項１】 超音波画像化剤として有用なカプセル化
されたガスのマイクロスフェアの製造方法であって、以
下の工程を包含する、方法： ａ）次に行われる機械的乳化において初期変性温度を達
成するのに必要な温度で熱変性可能なタンパク質の水溶
液を調製する工程、 ｂ）該溶液とガスとを合わせる工程であって、該ガス
が、六フッ化イオウ、パーフルオロメタン、パーフルオ
ロエタン、パーフルオロプロパン、またはパーフルオロ
ブタンである、工程、 ｃ）該タンパク質溶液とガスとの混合物を機械的に剪断
し、０．１ミクロンから１０ミクロンの範囲の平均直径
を有するガスの微小気泡からなる懸濁液を形成すること
により、該混合物を乳化する工程、および ｄ）該懸濁液を機械的キャビテーションに供して該タン
パク質を変性させ、該ガスと該溶液との界面に析出させ
ることにより、該ガスの微小気泡をカプセル化し、マイ
クロスフェアを形成する工程。 - 【請求項２】 前記温度が前記溶液を加熱することによ
り達成される、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 前記温度が、前記溶液中に前記タンパク
質の変性温度を変える添加剤を含めることにより達成さ
れる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 前記タンパク質が天然に存在するタンパ
ク質である、請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 前記タンパク質がヒト血清アルブミンで
ある、請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】 前記タンパク質が合成タンパク質であ
る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項７】 前記溶液中の前記タンパク質の濃度が、
０．１〜１０％ｗ／ｖである、請求項１に記載の方法。 - 【請求項８】 前記溶液中の前記タンパク質の濃度が、
１〜５％ｗ／ｖである、請求項１に記載の方法。 - 【請求項９】 前記溶液中の前記タンパク質の濃度が、
１％ｗ／ｖである、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１０】 タンパク質溶液に対するガスの比が５
％〜２００％ｖ／ｖである、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１１】 タンパク質溶液に対するガスの比が２
０％〜１００％ｖ／ｖである、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１２】 前記工程（ｃ）および（ｄ）が、前記
混合物をミルを通して通過させることにより行われる、
請求項１に記載の方法。 - 【請求項１３】 前記初期変性温度が、前記タンパク質
の変性温度より１°〜５°低い、請求項１に記載の方
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