CZ350895A3

CZ350895A3 - In protein encapsulated micro-spheres containing insoluble gas as well as their preparation and use as ultrasonic diagnostic

Info

Publication number: CZ350895A3
Application number: CZ953508A
Authority: CZ
Inventors: Karel J Lambert; Sheila Benay Podell; Edward G Jablonski; Carl Hulle; Kenneth Hamilton; Rolf Lohrmann
Original assignee: Molecular Biosystems Inc
Priority date: 1993-07-02
Filing date: 1994-07-01
Publication date: 1996-10-16
Also published as: DE69418101D1; KR100218642B1; ES2195247T3; JP2905598B2; AU7218494A; NO955351L; BR9406993A; EP0885615B1; KR960703624A; CN1129910A; EP0633030A1; EP0885615A1; JPH11139995A; CA2166459C; JP3809368B2; DE69432370D1; NO955351D0; ATE179334T1; HU9503977D0; DE69418101T2

Description

Oblast techniky

Předložený vynález se týká ultrazvukových diagnostik, obsahujícíchmikrosféry, obsahující nerozpustný plyn * zapouzdřený proteinem a způsobu jejich přípravy a použiti.

6 JU Z Z

01$ 00 : s .<) i 3 o

Dosavadní stav techniky ! f-3 •

Ultrazvuková diagnostika je založena na principu, že energetické zvukové vlny lze zaměřit na požadovanou oblast a tyto viny mohou být odráženy takovým způsobem, že dojde ke zobrazení požadované oblasti. Na povrch těla se umístí ultrazvukový snímač tak, aby překrýval požadovanou oblast zobrazení a na tuto oblast se nasměruje ultrazvuková energie ve formě zvukových vln. Snímač deteguje odražení zvukové vlny a převádí tyto údaje do obrazového zobrazení. Při průchodu ultrazvukové energie substancí závisí množství odražené energie na rychlosti transmise a akustických vlastnostech substance. Změny akustických vlastností substance (například zn měny akustické impedance) jsou nejvýraznější na rozhraní různých akustických hustot jako jsou rozhraní kapalina-pevná látka nebo kapalina-plyn. Takto, při průchodu ultrazvukové energie tkáněmi, orgánové struktury generují zvukové odrazy pro detekci ultrazvukovým snímačem. Tyto signály lze zesílit vhodným použitím kontrastní látky.

’ί ί

í~i.

Ultrazvuková diagnostika zvlášního významu využívají plyn vzhledem k jeho účinnosti při odrazu ultrazvuku. Bublinky rezonančního plynu rozptylují zvuk tisíckrát účinněji než pevné částice téže velikosti. Ophir a Parker popisují dva typy diagnostik, obsahujících plyn: (1) volné vzduchové bublinky a (2) zapouzdřené vzduchové bublinky (Ultrasound in Medicine and Biology £5,(4):311-333, 1989). Nicméně volné vzduchové bublinky vhodné velikosti mají příliš krátkou životnost pro účinné využití ve většině in vivo aplikací (Meltzer a spol., Ulrasound in Medicine and Biology 6:263-269, 1980). Ophir a Parker uvádějí, že vývoj zapouzdřených plynových bublinek byl pokusem tento problém překonat.

í Druhou hlavní skupinu plyn obsahujících ultrazvukových kontrastních látek, které popisují Ophir a Parker, tvoří i

zapouzdřené mikrokuličky, dále zde označované jako mikrosféry. Bublinka plynu je uzavřena v pouzdérku tvořeném proteinem nebo jiným biokompatibilním materiálem. Současnou komerční kontrastní látkou na bázi mikrosfér je ALBUNEX^R(Molecular Biosystems, Inč., San Diego, CA), který je tvořen vzduchovými mikrosférami zapouzdřenými lidským sérovým albuminem. Viz US patent Č. 4572203 a 4844882.

U vzduchových mikrosfér se ukázalo, že rychle ztrácejí echogenici tu, jsou-li podrobeny tlaku asi 150 mm Hg, kterému * mohou být vystaveny během injekční aplikace a v cirkulaci in * vivo (De Jong N. a kol., Ultrasound Med.Biol.19:279-288,

1993). Současná technologie zapouzdřování již umožňuje výrobu materiálu vhodného jako ultrazvuková kontrastní látka, která má dost dlouhou in vivo životnost pro většinu požadovaných * aplikací. Ve skutečnosti látka schopná zobrazit myokárdiální

Je

Ϊ stěnu musí odolat přechodným tlakovým prvkům nejméně 250 mm Hg (asi 5 psig).

-A

Při úsilí řešit problém tlakové nestability mikrosfér se současné poznatky soustřeďují na zlepšení obalu mikrosfér, protože se předpokládá, Že obal nebo membrány mikrosfér jsou příliš křehké nebo lámavé při vystavení tlaku, což má za následek in vivo zhroucení mikrosfér. Giddey (PCT/EP91/01706;

PCT 92/05806) uvádí, že díky své rigiditě, nemohou tyto membrány odolávat náhlým tlakovým změnám, kterým mohou být vystaveny například při transportu v krevním řečišti, kde tyto tlakové změny jsou vyvolávány srdeční činností. K překonání rigidity obalu mikrosfér-autor navrhl pre-emulgaci vzduchu v j roztoku proteinu, obsahujícím procentuálně velké množství látky, zvyšující vískozitu (40 % až 80 % polyolů) s následným j mechanickým střihem v rychloběžném mísiči. Bublinky vhodné i

velikosti se oddělí a potáhnou vhodnou povrchově aktivní f, £»látkou pro jejich stabilizaci v měkkém obalu. ’

F i

Ϊ ř

Holmes (PCT WO92/17213) navrhl zvýšení stability proteinových mikrosfér in vivo zpevněním obalu pomocí biodegradabilnich chemických zes.í fuj ící ch látek.

___ ♦ Bichon,a spol. (EPA 90/810367) a Schneider a spol. ____ -______ (Inv^J. Radiol. 27 :134-139 , 1992) popisují výrobu porézních (velikost pórů 5 až 200 nm) polymerních.mikrobalonkú. V evropské patentové přihlášce uvádě.j í ,^r že , mikroporézní struktura mikrobal.onkového .obalu je součinitel pružnosti, tj. * <

* >

tyto mikrosféry snadno akceptují změny tlaku bez svého ..... - ₍ ϊ porušení . ’

Erbel«a Zotz (US patent č. 5190982) popisují mikrokapsle ze zesítěného polymeru se zachyceným vzduchem.

Schneider a spol. (EPA 554213) uvádějí, te tlakovou odolnost mikrosfér lze zlepšit tak, Ze alespoň Část plynu, který je zapouzdřen, má hodnotu Spiyn/MWpiyn í 0,0031, kde Spiyn znamená rozpustnost plynu ve vodě v 1 i třech/1 itr a MWpiyti je průměrná molekulová hmotnost plynu v daltonech.

Podle tabulky 1 přílohy tomuto kriteriu vyhovují Nz, SFe,

CBrF3 a CF*. V této práci se uvádí, že tyto míkrosféry lze vyrobit jedním ze dvou způsobů. Prvním je dvoustupňový postup,.

při kterém se připraví známým způsobem mikrosféry.obsahující vzduch a vzduch je pak nahrazen nerozpustným plynem metodou výměny plynů, např. inkubací vzduchem plněných mikrosfér v atmosféře nerozpustného plynu po přiměřenou dobu. í

Druhým způsobem je jednostupňový způsob, při kterém se ‘ mikrosféry vyrobí postupem podle EPA 324938 (viz příklad 1 odkazu) za použití nerozpustného plynu místo vzduchu. Při tomto postupu se plyn ponechává proudit roztokem, obsahujícím materiál, tvořící obal (např. roztokem albuminu), přičemž se hlavice zdroje zvuku nejprve sníží do nádoby a pak se odstraní.

<··

V . ·

Bohužel ani jeden z těchto postupů není prakticky vhodný pro výrobu mikrosfér, obsahujících nerozpustný plyn, p zapouzdřených proteinem. Použitím prvního (dvoustupňového tpostupu) pou2e malý počet aIburainových mikrosfér, obsahujících,^ vzduch odolává vystavení prostředí, obsahujícího nerozpustný _a plyn (druhý stupeň dvoustupňového postupu). Výtok rozpustných^ i

plynů (vzduchu) z mikrosfér je větší než vtok nerozpustných ’ plynů do mikrosfér, což má za následek úplné zhroucení « mikrosfér, takže z nich zůstávají pouhé zlomky obalů. Tento ?

jev je zvláště zřetelný u méně rozpustných plynů jako je |

V perfluorethan. Druhý postup produkuje mikrosféry, které | ί zmenšují svůj objem, jsou—li vystaveny tlaku a po odstranění í

J i tlaku se navracejí do původního stavu. Předpokládá se, že oba ς * tyto způsoby poskytují nekvalitní mikrosféry, protože tyto ^í mikrosféry obsahují významné množství vzduchu a přítomnost vzduchu během jejich tvorby může potlačovat prospěšné stránky * výroby mikrosfér v přítomnosti pouze samotného nerozpustného plynu. Je třeba v tomto ohledu poznamenat, že dříve autoři pokládali přítomnost kyslíku při výrobě mikrosfér kavitací za nezbytnou.

Suslick uvádí, že kavitace vzniklá ve spojení s ultrazvukem je vhodnou metodou pro výrobu mikrosfér pouze za přítomnosti kyslíku.- V podobné,studii Suslick a spol.

(Proč.Nat1,Acad.Sci. 88:7708-7710, 1991; J.Am.Chem.Soc.112 7807-7809, 1990) uvádějí, že kyslík se zúčastňuje kavitací vyvolaných intramolekulárních přesmykú disulfidických vazeb, potřebných pro tvorbu stabilního proteinového obalu. Suslick prohlašuje zlistili jsme, Ze tvorba mikrokapslí je silně inhibována nepřítomností O2. A pokračuje jestliže reakce probíhá v inertní atmosféře (He,Ar nebo N2) mikrokapsle nevznikají. Experimentálně bylo zjištěno, že vysoké koncentrace mikrobublinek jsou syntetizovány pouze tehdy, jestliže reakce probíhá pod O2 nebo vzduchem. Viz rovněž US

477£958_. Tut_o_drřvějj_í_d_omněnku^ že vzduch je nezbytný pro_____ tvorbu albuminových mikrosfér uvádí rovněž Holmes (PCT WO 92/17213). Ve stejné práci jsou uvedeny výroby mikrosfér, obsahujících různé nízkornolekulární. plyny. Nicméně při popisu výroby albuminových mikrosfér.ultrazvukovými.vibracemi autoři uvádé j í .'dal š í osvědčenou metodu pro tvorbu bublinek, obsahujících plyn uváděnou např.-v US A-4774958 je působení ultrazvukových vibrací na směs za přítomnosti vzduchu (podtržení přidáno).

Podle jednoho aspektu se současný vývoj vztahuje k nečekanému zjištění, že vysoké koncentrace proteinových mikrosfér, uzavírajících poměrně nerozpustný plyn, lze vyrobit ultrazvukovými nebo mechanickými kavitačními postupy v přítomnosti nerozpustného plynu bez přítomnosti kyslíku. Tyto mikrosféry vykazují překvapivě vysokou zlepšenou stabilitu a

3| elasticitu vůči atmosférickému tlaku, s lepší nebo ekvivalentní schopností odezvy zvuku. Proteinový obal zabraňuje shlukování a odolává rozpínání díky difúzi rozpuštěných atmosférických plynu z okolního prostředí.

Podle dalšího aspektu se současný vývoj vztahuje k novému postupu výroby mikrosfér.s proteinovým obalem, který používá mechanickou energii ve formě střihových sil. Tyto sily vyvolávají mechanický střih směsi kapalina-plyn za tvorby suspenze mikrobubl inek a také vyvolávají hydrodynamickou kavitaci, která uvolňuje energii. Tato energie může být absorbována okolní tekutinou s účinkem lokalizované denaturace proteinu a jeho usazením na rozhraní plyn-kapalina za tvorby oddělených mikrosfér. Hydrodynamickou kavitaci lze rozlišit od ultrazvukové (akustické) na základě způsobu, kterým každá z nich produkuje tlakové změny na kapalné systémy, které vedou .k v*.

uvolnění energie. U první jsou tlakové změny poskytovány .1 rychlým tokem kapaliny otvorem nebo průřezem, zatímco u druhé,, formy produkují cykly vysokofrekvenčních zvukových vln rychlé lokální tlakové vlny (viz F.Ron Young 1989 Cavi tati on,str.4-5 , McGraw-Hill Book Co.Londýn). Kromě toho vzniká hydrodynamická_t r'»' kavitace v tekoucí kapalině, tj. v kapalině, která probíhá skrz nebo přes stacionární předmět. Pro srovnání, akustická kavitace vzniká v kapalném systému, který musí zůstat stacionární během dostatečného počtu cyklů zvýšení a snížení tlaku (pozitivní a sací tlak) tak, aby došlo ke.kavitaci. I v <- kontinuálním průtokovém systému s ultrazvukovými vibracemi, €· jaký je popsán v US patentu č. 4957656, činí doba zdrženi v ’ akustickém kavitačním postupu řízení tohoto postupu * obtížnějším než je tomu u správně provedeného jednotahového hydrodynamického kavitačního systému, jaký je popsán v tomto vynálezu.

Suspenze mikrobublinek vyrobené mechanickými střihovými silami se využívají jako takové jako kontrastní látky nebo se dalším zpracováním zpracují na mikrosféry. Například v PCT publikaci č. WO 92/05806 je popsána příprava suspenze mikrobublinek, označovaná jako pěna, filmotvorného proteinu, _ která se připraví šleháním roztoku proteinu, obsahujícího .látky,.zvyšující viskozitu, do hrubé pěny při konstantní teplotě, která je nižší než je teplota, při které by mohlo docházet k denaturaci proteinu. Na výslednou pěnu se pak působí mechanickými střihovými silami pro tvorbu bublin požadované velikosti, které se stabilizují přítomností látek, zvyšujících viskozitu. Tyto bublinky mohou být dále zpracovány do mikrosfér tepelnou denaturaci nebo přídavkem.látek, umožňujících zesítění pro vytvržení proteinového filmu, obklopujícího bublinky.

Evropská patentová přihláška č. 0450745 Al popisuje

... r. .- Τ ι ~Ύ . —— · ť - — - - ·— - - ·—— — — — K - - » — „ . způsob výroby nu kro sfé ř_ tvorbou emulze.. .o.l .e.j_v.e_.v.o.d.ě.. _p.ús.obe.ní m__τ__ mechanických střihových sil a současným nebo následným přídavkem.polymeru nerozpustného ve vodě, který se ukládá na rozhraní. Hydrofobní fáze. se pak odpaří a získají se mikrosféry, obsahující vzduch nebo plyn.

Předložený vynález se rovněž týká zlepšeného způsobu výroby mikrosfér z teplem denaturovatelného proteinu tím, že roztok-proteinu se podrobí působení mechanických střihových sil. účinkem těchto sil vznikne suspenze mikrobublinek, které se současně nebo následně zapouzdří oddělenými obaly. Vzhledem k podstatě, kavitačního zahřívání je denaturace proteinu lokalizovaná a obal se vytváří ukládáním na rozhraní kapalina-pevná látka. Tento nový postup je snadnější pro zvýšení a vede k lepším výtěžkům produktu ve srovnání s dřívějšími postupy výroby mikrosfér na bázi akustických metod.

=t

Podstata vynálezu

Jedním aspektem vynálezu je způsob výroby plyn «-.? obsahujících zapouzdřených mikrosfér vhodných jako ultrazvukové diagnostikům, zahrnující vystavení smési vodného roztoku filmotvorného proteinu a farmakologicky přijatelného ve vodě nerozpustného plynu ultrazvukové nebo mechanické kavitaci za nepřítomnosti kyslíku.

t Dalším aspektem vynálezu je způsob výroby plyn obsahujících zapouzdřených mikrosfér vhodných jako ultrazvukové diagnostikům, zahrnující vystavení směsi vodného roztoku filmotvorného proteinu a farmakologicky přijatelného ve vodě nerozpustného plynu ultrazvukové nebo mechanické kavitaci v zařízení, které je uzavřeno před přístupem atmosféry.

Dalším aspektem vynálezu je ultrazvuková diagnostická směs, obsahující vodnou suspenzi mikrosfér, obsahujících plyn,, zapouzdřených filmotvorným proteinem, nerozpouštějícím se teplem, kde zapouzdřený plyn je plné farmakologicky přijatelný, ve vodě nerozpustný plyn. ,

T i

Dalším aspektem vynálezu je ultrazvuková diagnostická kompozice, obsahující vodnou suspenzi mikrosfér, obsahujících jako plyn perfluorpropan, zapouzdřených filmotvorným proteinem nerozpouštějícím se teplem;

t i Dalším aspektem vynálezu je způsob výroby mikrosfér, i, obsahujících zapouzdřený plyn, vhodných jako ultrazvukové

I *

* diagnostikům, zahrnující:

a) poskytnutí vodného roztoku teplem denaturovatelného proteinu, při teplotě nezbytné pro dosažení teploty počínající denaturace během následující mechanické emuigace;

b) uvedení roztoku do styku s plynem;

c) emulgaci směsi roztoku proteinu a plynu mechanickým střihem směsi za tvorby suspenze plynových mikrobublinek o středním průměru v rozmezí asi 0,1 až asi 10 mikrometrů a

d) zapouzdření plynových mikrobublinek za tvorby mikrosfér pomocí mechanické kavitace suspenze působící denaturaci proteinu a tím jeho ukládání na rozhraní plyn-roztok. , . . .

Popis obrázků na přiooienvch výkresech ^; i

= f

Obr. 1 je rozložený schematický nákres jednoho typu mlýna | (Gaulinův mlýn), který lze použít v mechanickém kavitačním; * | způsobu podle vynálezu; £ i

obr. 2 je rozložený schematický nákres jednoho typu mlýna (Bematekův mlýn), který lze použít v mechanickém kavitačním ;

způsobu podle vynálezu;

obr.3 je rozložený schematický nákres jednoho typu mlýna (Silversonův mlýn), který lze použít,v mechanickém kavitačním způsobu podle vynálezu;

obr.4a znázorňuje tlakovou.odolnost albuminových mikrosfér plněných vzduchem. Suspenze mikrosfér byla umístěna do stříkačky a natlakována na částic před vložením tlaku obr.4b znázorňuje tlakovou plněných perfluorpropanem. stříkačky a natlakována na částic před vložením tlaku obr.4c znázorňuje tlakovou psig. Je znázorněna distribuce $

a po vložení tlaku. L odolnost albuminových mikrosfér /

Suspenze mikrosfér byla umístěna do ' j;

psig. Je znázorněna distribuce / a po vložení tlaku. ’ í

odolnost albuminových mikrosfér plněných perfluorethanem. Suspenze mikrosfér byla umístěna do/ stříkačky a natlakována na 40 psig. Je znázorněna distribuce částic před vložením tlaku a po vložení tlaku.

obr.4d znázorňuje tlakovou odolnost albuminových mikrosfér plněných fluoridem sírovým. Suspenze mikrosfér byla umístěna do stříkačky a natlakována na 40 psig. Je znázorněna distribuce částic před vložením tlaku a po vloženi tlaku.

obr.4e znázorňuje tlakovou odolnost albuminových mikrosfér plněných argonem. Suspenze mikrosfér byla umístěna do stříkačky a natlakována na 40 psig. Je znázorněna distribuce částic před vložením tlaku a po vložení tlaku.

obr.5 znázorňuje tlakovou odolnost zředěných suspenzí mikrosfér při tlaku 3,0 psig. Zředěná suspenze mikrosfér byla umístěna do lem kyvety a podrobena tlaku 3,0 psig na dobu t= sekund, údaje jsou uvedeny pro mikrosféry, obsahující perfluorethan, perfluorpropan, fluorid sírový a vzduch.

; . W

Λ ' L ÚÍ obr.6 představuje tlakovou odolnost zředěné suspenze mikrosfér, obsahujících argon, při tlaku 3,0 psig. Zředěné argonové mikrosféry byly umístěny do lem kyvety a podrobeny tlaku 3,0 psig po dobu t= 30 sekund.

obr.7 znázorňuje účinek odplyněného pufru na mikrosféry.

' ' . ... i

Mikrosféry byly přidávány ke zvyšujícím sě množstvím odplyněného plynu za míchání a směs byla uvedena do konstantního objemu pro stanovení koncentrace. Jsou vyneseny údaje pro mikrosféry, obsahující vzduch, perfluorpropan, perfluorethan a fluorid sírový, proti objemu odplyněného pufru.

obr.8 znázorňuje grafy údajů popsaných v příkladu 11, viz dále.

Nové mikrosféry podle vynálezu se vytvoří ve vodných -ΐ roztocích ultrazvukovou nebo mechanickou kavitací vodných ' r'o'z'tbků f i'l mo't vor nýčh šprotě inů za přítomnosti nerozpustného -v plynu a za výrazné nepřítomnosti kyslíku, tj. za anaerobních š podmínek (uzavřený systém). Tyto mikrosféry odrážejí zvuk a mají velikost vhodnou pro transpulmonární průchod se středním í průměrem menším než 10 mikromatrú a větším než 0,1 mikrometru. » í

Rozložení velikosti částic lze měnit frakcionací do skupin ?.

větších nebo menších mikrosfér. Mikrosféry mohou být nebo , j nemusí být zahuštěny tak, že s odstraní přebytek vodné fáze f nebo se oddělí a resuspendují ve druhém vodném roztoku. ^ť

Plyn použitý k výrobě těchtonových¹mikrosfér musí být pouze farmakologicky vhodný a nerozpustný ve vodném prostředí, ve 'kterém' j sou mikrosféry umístěny’ (t j .ne jpřve prostředí 7 've'’' ’ kterém se vyrábějí a pak při aplikaci v krvi). Rozpustnost ve vodé se přibližuje rozpustnosti v těchto prostředích. Výraz plyn se týká-jakékoliv sloučeniny, která je v plynném stavu nebo je schopna být v plynném stavu při teplotě, při které- se zobrazování provádí (obvykle při..běžné fyziologické teplotě).. :

Plyn může obsahovat jednu sloučeninu nebo směs sloučenin. Ϊ

Vhodné plyny-mohou zahrnovat, ale nejsou tak omezeny, plyny, obsahující fluor, jako‘je fluorid sírový, perfluorethan/ | perfluorpropan, pěrfluormethan a perfluorbutan. Rozpustnost fplynu lze definovat stanovením Bunsenova koeficientu daného j plynu. Toto číslo znamená objem plynu,· který se absorbuje v if jednotce objemu rozpouštědla (viz Wen W-Y, Muccitelli, JA, ý

J.Sol.Chem.8:225-240(1979)) . Plyn vhodný pro použití podle ( vynálezu by měl mít Bunsenův koeficient ve vodě při 25 °C menší než 0,01 ml/ml roztoku. V tabulce 1 jsou uvedeny

Bunsenovy koeficienty některých plynu

Tabulka 1
Bunsenovy koeficienty	plynů ve vodě
(1 atmosféra, ml/ml)
Plyn	5 °C	25 °C '
oxid uhličitý.	1,383	0,824
argon	0,047	0,033
kyslík	0,043	0,031
dusík	0,021	0,016
fluorid sírový	0,008	0,0054
perfluormethan	0,0082	0,00504
perfluorethan	0,0027	' 0,00138
perfluorpropan	0,0016	N/A
perfluorbutan	0,0007	N/A _y i
Dalším parametrem	pro plyn obsažený v mikrosférách je,
aby difuzita plynu byla menší než 4	x 10⁵ cm²/s při 25 °C ve.
vodě. Nicméně je třeba	uvést, že se	difuzní koeficienty liší
v různých prostředích	a při různých	teplotách, ale pro účel ty*',
volby plynu by tento plyn měl tomutc	i požadavku vyhovovat.
Farmakologicky vhodný označuje	vlastnost, že vybraný plyn

musí, být biokompatibilni a musí mít minimální toxicitu.

Výhodným plynem je perfluorpropan, protože je plynem nerozpustným, který (1) nekondenzuje při teplotách výroby a použití,(2) nemá isomerní formy, (3) poskytuje mikrosféry, které mají.výbornou odolnost vůči tlaku a (4) je farmakologicky vhodný.

Mikrobublinka plynu se zapouzdřuje obalem f i lmotvorného’ proteinu. Výraz filmotvorný je vztažen ke schopnosti proteinu tvořit obal okolo zachyceného plynu při insolubi1izaci proteinu (způsobené tepelnou denaturací), přičemž hydrofilní skupiny jsou orientovány ven a hydrofobní dovnitř. Protein nutnTmus! m'í t ‘jak' fíyďřóf ΐ'ΐή’ί’ ták hydrofobní am i noky se i i ny. Vhodné proteiny zahrnují přirozené se vyskytující proteiny jako je albumin, gama-globulin (lidský), apotransferrín (lidský), b-laktoglobulin a ureásu. Ačkoliv výhodné jsou přirozeně se vyskytující proteiny, lze rovněž použít syntetické polymery (homopolymery nebo heteropolymery), které mají terciární strukturu a jsou schopny tepelné denaturace. Zvlášť vhodný pro použití podle vynálezu je albumin a to t · zejména lidský albumin. Protein jé obsažen v roztocích v koncentraci v rozmezí asi 0,1 až 10 % hmotn./obj., výhodně asi 1 % až 5 % hmotn./obj. a nejvýhodnéji. asi l % hmotn./obj.

. Proteiny vhodné' pro'použi t í *p'odIe^vyňálezu’ nebo výsΪedné_____

i. mikrosféry mohou být chemicky modifikovány za účelem cílení f/ orgánu nebo potlačení imunogenní aktivity (např. modifikací s polyethylenglykolem). Nicméně tento vynález nezahrnuje í χ·χλ. přídavek chemických zesíťovacích činidel nebo další modifikace proteinů za účelem tvorby mikrosfér. ..........

Mikrosféry podle vynálezu jsou tvořeny nerozpouštějícími se podíly proteinu v roztoku následkem kavitace za přítomnosti í

nerozpustného plynu za nepřítomnosti kyslíku (tj. v uzavřeném jí systému, ve kterém je zamezena kontaminace kyslíkem). Tato .

I insolubi1 izace proteinu je v první řadě charakterizována lokální denaturací proteinu a dále orientací okolo jádra plynu, přičemž tato orientace může být zvýšena přítomností nerozpustného plynu.

Systém použitý k tepelné insolubi1 izaci proteinu pro tvorbu mikrosfér podle vynálezu musí být anaerobní, tj. uzavřený vůči atmosféře a označuje se jako uzavřený systém.

Pro srovnání otevřený systém' je takový, který je otevřen vůči atmosféře. Plyn zachycený v mikrosférách vyrobených v takovémto uzavřeném systému nutně obsahuje pouze nerozpustný plyn užitý pro jejich tvorbu. Kontaminaci atmosférickými plyny lze sledovat pomocí O2 elektrody pro měření přítomnosti O2 na výtoku ze systému. Postupem podle vynálezu se vyrábí _t mikrosféry, které původně obsahují pouze plyn, použitý pro jejich výrobu. Nicméně při experimentálním stanovení obsahu

.. plynu je přítomen určitý podíl nežádoucí kontaminace atmosférickými plyny během postupu, což má za následek, že stanovený obsah plynu je menší než 100 %. Podle tohoto výsledky stanoveni plynu vyšší něž 85 % odpovídají mikrosférám, jejichž původní obsah plynu činí pouze nerozpustný plyn.

Po výrobě mikrosfér je třeba se vyhnout během balení expozici atmosféře. Například by mikrosféry měly být utěsněny v lahvičkách nebo jiných vzduchotěsných nádobkách během 5 ažj ,-.,¾ sekund po jejich výstupu z uzavřeného systému. Navíc veškerý volný prostor v lahvičkách by při balení měl být odstraněn anahrazen plynem použitým při výrobě.

Tyto proteinové mikrosféry plněné nerozpustným plynem I < vykazují pozoruhodnou stabilitu, odolávající vystavení tlaku ’ psig (>2000 mmHg) při koncentraci asi 1,0,x 10⁹ mikrosfér na ml. Mikrosféry ve zředěných roztocích také vykazují elasticitu, při tlaku 3-10 psig vykazují stlačování a při uvolnění tlaku návrat na původní objem. Další chemické zesítění by mohlo být nevýhodné, protože vzniklé mikrosféry by měly příliš tuhou strukturu pro prokázání zvýšené tlakové stabi1 i ty.

Mikrosféry podle vynálezu, na rozdíl od volných mikrobublinek, jsou odolné vůči shlukování a expanzi řízené difúzí. Mikrosféry, obsahující nerozpustný plyn, inkubované v rozto'cí'chnas'yceňých vzduchem nebo” kyslíkem při různých ’->

teplotách, nezvyšují svůj střední průměr nebo nezvyšují svůj _έ celkový objem. Proteinový obal, ačkoliv je při vystavení tlaku elestický, je dostatečně silný, aby odolával expanzi nebo _} i

vzniku trhlinek difúzí nebo výměnou plynu. Přítomnost _Λ ?

proteinového obalu zabraňuje shlukování a udržuje plyn v i malých jednotlivých bublinkách až po dobu několika měsíců, < | podobně jako proteinové mikrosféry plněné vzduchem. Nemožnost f zjistit u mikrosfér plněných nerozpustným plynem měřitelnou expanzi způsobenou výměnou s rozpuštěnými atmosférickými plyny je novou a klíčovou vlastností pro použití tohoto materiálu jako ultrazvukového diagnostika.

Proteinem zapouzdřené mikrosféry, obsahující nerozpustný plyn vakazují odolnost vůči zhroucení přivystavení odplyněným vodnýmroztokům. Na rozdíl od volných mikrobublin nebo zapouzdřených mikrosfér, obsahujících vzduch, mikrosféry plněné nerozpustným plynem lze přidávat do. vakuem odplyněné - ........* *

vody.a udržují si zde integritu i při vysokých ředěních. -. .. ;

Vzduchem plněný materiál se hroutí v krvi díky úniku kyslíkové ř

složky z plynné fáze. .Schopnost mikrosfér plněných . . | nerozpustným plynem odolávat zhroucení v částečně odplyněném nebo tlakovém prostředí zvyšuje výrazně trvání ultrazvukového <

kontrastu in vivo.

Mikrosféry podle předloženého vynálezu mohou bý^ vyrobeny ;

ultrazvukovou nebo mechanickou kavitaci. Způsob ultrazvukové produkce vzduchem plněných mikrosfér popsal Cerny (USP

4957656).

Mechanická kavitace je výhodný postup pro výrobu nových mikrosfér plněných plynem podle vynálezu. Může být také použit k výrobě mikrosfér plněných vzduchem nebo plněných rozpustným plynem (například N2, H2, argon).

V novém mechanickém kavitačním postupu podle vynálezu se poskytne vodný roztok teplem denaturovatelného proteinu při takové nezbytné teplotě, umožňující, aby při následné mechanické emulgaci bylo dosaženo počáteční denaturační ;

» teploty. Denaturační teplota proteinu je obvykle v rozmezí 50 f

Ϊ až 100 °C. Lze ji určit z tabulek tepelné proteinové ’ denaturace v literatuře nebo experimentálně kteroukoliv známou metodou. Například k experimentálnímu stanovení denaturační teploty se roztok proteinu zahřívá na vodní lázni za míchání.

Denaturační. teplota je teplota, při které je poprvé pozorován; , / rozpustný materiál. Je třeba upozornit, že denaturační teplota je ovlivněna podstatou, čistotou a zdrojem proteinu, koncentrací proteinu v roztoku, pH, pufrem, iontovou sílou, ' '•-'V’ přítomností stabilizátorů a přítomností chemických denaturantů. .

nebo detergentů. Proto je nezbytné stanovit denaturační \ teplotu proteinu v prostředí, které bude použito k výrobě mikrosfér. Je-li to žádoucí, lze použít aditiva jako jsou detergenty nebo polární rozpouštědla ke změně teploty, kdy denaturace probíhá.. .

Tabulka 2 uvádí denaturační teploty několika přirozeně se ¹ vyskytujících proteinů, které byly stanoveny experimentálně, jak je popsáno výše.

Tabulka 2

Protein i	;oncent race	PH	rozpouštědlo	Td e n .
lidský sérový	50 mg/ml	6,9	0,9% NaCl,	75 °C
a-l-buminv USP....... Swiss Red Cross (Bern, Švýcarsko)			4mM kapryíát sodný, 4mM tryptof an
lidský sérový albumin, UŠP Swiss Red Cross (Bern, Švýcarsko)	10 mg/ml	6,9	0,9% NaCl, lmM kapryíát sodný, lmM tryptofan	78 °C
β-laktoglobulin	25 mg/ml	7,6	USP voda	90 °C

Sigma (St. Louis, MO)

, — —- *	* ..· 1-1 * ·	* - . , -T - ,r	- .:·»Μ	1 . 1U . - - T*- ·· Λ·	'7 *	·.-* » r(- -IR,.
β-gíobin	25 mg/ml	5,0	USP voda	90 °C
Sigma (St.
Louis, MO)
lysozyme	100 mg/ml	. . . . ..7,5	3	mM TRIS*.,	31 °C .	Ϊ ' ' ' Í
Sigma (St.			2	mM DTT***	s tanoveno	a 4
Louis, MO)					ihned po	i
“l					přídavku	í
					ĎTT	1^'
lidský gama	40 mg/ml	5,0	10	mM MES**	66 °C	í il
globulin, metoda			PH	5,0		5 „j.
kys.pH, Sigma						3 r

(St.Louis, MO) lidský gama 40 mg/ml globulin, metoda alk.pH, Sigma (St.Louis, MO) apo-transferin 20 mg/ml Sigma (St.

Louis, MO)

9,8 10 aM TRIS pH 9,8 °C

7,5 10 mM TRIS* oC *TRIS = 2-amino-2-(hydroxymethyl)-l,3-propandiol **MES = 2-(N-morfolino)ethansulfonová kyselina •**DTT = dithiothreitol

Každé zařízení použité ke střihu směsi roztok proteinu/plyn způsobí určité další zahřátí roztoku proteinu díky mechanickým střihovým silám působícím na roztok. Toto teplo musí být dostatčné k tomu, aby způsobilo lokalizovanou . denaturaci proteinu na rozhraní plyn-kapalina. Proto je_;důležité stanovit velikost teplotního zvýšení způsobeného zařízením tak, aby teplota, při které je roztok proteinu zaváděn do zařízení mohla být upravena tak, aby dosáhla této lokální tepelné denaturace. Specificky teplota kapaliny vložené do zařízení musí odpovídat teplotě počínající denaturace bezprostředně před kavitací. Kavitační děj generuje dalši teplo nezbytné k lokální denaturaci proteinu. Teplota počínající denaturace je definována jako teplota, při které je protein na hranici denaturace, ale roztok neobsahuje žádný denaturovaný protein. Tato teplota je právě pod, obvykle 1 až °C pod denaturační teplotou. Je nezbytné, aby výchozí roztok proteinu před zavedením do zařízení byl předem zahřát na teplotu, umožňující dosažení počínající denaturační teploty.

Jakmile bylo dosaženo správné výchozí teploty proteinového roztoku, roztok se kombinuje se vhodným plynem, například zaváděním plynu do roztoku proteinu před nebo během emulgačního stupně v objemovém poměru v rozmezí od asi 5 % do -i

200 % plyn:kapalina, výhodně asi 20 %:100 %. Správný poměr

......plyn: kapalůna^budě záviset “ná geometriCzářížení ’ fyzikálních charakteristikách plynu (rozpustnost, hustota, molekulová hmotnost atd.) a může být upraven k optimalizaci výstupu.

Po spojení plynu a roztoku proteinu se směs emulguje a podrobí kavitaci za podmínek, poskytujících mikrosféry. To se j provede za použití zařízení, které produkuje mechanický střih ' · , 1'

- · . ř a hydrodynamickou kavitaci, jako jsou vysokorychlostní mixéry, | mlýny fluidizéry a podobně. Výhodným zařízením je koloídní mlýn, který je definován jako zařízení, které obsahuje vysokorychlostní rotor a stator,a diapergace a emulgace je prováděna protilehlými plochami. Advanced Filtration and —-- Sě para t i on ’ Techno 1 ogy, - s t r : 108- Γ 10 Ϊ Př í k ladysp ě c i'f ickýčh ™ ~~ mlecích zařízení, která mohou být použita, jsou následující:

Model #2 1/1 - Bematek, Beverly, USA Model W250V - Greerco, Hudson, NH

Model 2F - APV. Gaulin, Everett, MA...... ..........

Model LAR - Silverson, Chesham, UK

Model Polytron

PT3000 . - Kinematica, Littaw, Švýcarsko |

Při použití při výrobě mikrosfér plněných nerozpustným plynem, koloidní mlýny by měly být uzavřeny vůči atmosféře tak, aby se zamezilo vstupu vzduchu do směsi.

Obr.1-3 poskytují další detaily několika typů mlýnů, které lze použít v mechanickém kavitačním postupu.

Obr. 1 představuje základní prvky Gaulinova mlýnu. Jsou to: rotační hřídel 10 operativně připojená k rotoru (neznázorněno), diskový rotor 12 připevněný ke konci hřídele 10 a stator 11. Stator 1 i má středový vrtaný otvor 18 a zahloubení 16. ve kterém je uložen rotor. Do tohoto mlýnu jsou roztok proteinu a plynu napájeny pomocí té 15 . Směs roztok proteinu/plyn je emulgována a kavitována mezi povrchy rotoru a statoru. Mezera v tomto mlýnu je prostor mezi radiálním povrchem 17 statorového zahloubení a obvodovým radiálním povrchem rotoru. Teplota mikrosférového produktu bude měřena (např. termočlánkem, neuvedeno), tak jak směs prochází statorem 11.

Obr. 2 představuje základní prvky Bematekova mlýnu. Tento mlýn má podobnou strukturu a funkci jako Gaulinúv mlýn podle obr.l — hlavní rozdíl je v konfigurací rotorového a „ statorového zahloubení. Zahrnuje rotační hřídel 20, která nese komolý kuželový rotor 21. který má zaváděcí konec 22 opatřený závitel a stator 23, který má centrální válcový otvor 25 a komolé kuželové.zahloubení 24 přizpůsobené k uložení rotoru. Směs roztok proteinu/plyn je zaváděna do mlýnu otvorem 25.

Plyn a roztok se smísí tak, jak procházejí závity na hřídeli 22 a směs je emulgována a podléhá kavitaci tak, jak prochází štěrbinou mlýna. Tato štěrbina je definována prostorem mezi konickými povrchy rotoru a statoru.

Obr. 3 představuje Silversonův mlýn. ‘Struktura tohoto mlýnu je zcela odlišná od mlýnů na obr. 1 a 2. Znázorněný Silversonův mlýn má rotující hřídel 30, která nese lopatkový rotor 3 ί. Rotor je uložen v pohárově tvarovaném perforovaném sítovitém statoru 32· Stator je namontován na kryt 33 opatřený vstupní armaturou 21· Vstupní armatura 34 prochází otvorem krytu 33 na dno středu perforovaného sítového statoru 32.. Kryt má centrální otvor, není znázorněn,který spojuje vstupní armaturu a otvor - také není znázorněn- ve dnu statoru. Do tohoto mlýnu je roztok/plyn zaváděn vstupní armaturou ve dně statoru a je emulgován a kavitován mezi plochami 15 lopatkového rotoru a vnitřním válcovým povrchem statoru.

...... -Stér-b-i-na- tohoto- mlýnu může- -být—definována jako' prostor mez i' rotorem 31 a statorem 12, ale účinek velikosti štěrbiny na postup je ovlivněn velikostí perforací 36 ve statoru.

Po průchodu mlýnem může být produkt ochlazen, obvykle na 10 až 20 °C, odpéněn usazením nebo přídavkem biokompatibilních odpěňovacích činidel, která nežádoucím způsobem neovlivní mikrosféry.

Průchodem směsi takovým mlýnem nebo ekvivalentním zařízením se směs emulguje a kavituje do formy mikrosfér v rozmezí od asi 0,1 do 10 mikrometrů (střední průměr). Velikost mikrosf ér-lze-stanoví t-vhodným- pří stroj em· na-měření “ve li kost i'“ ’ ~ ’ cá'stlc'T'hápř’i’kTáči^_Cóulter tóulťisizer II (Čoulter Electronics,

Hialeah.Fl).

Při použití takových mlýnů jako jsou popsány na obr. 1 až rychlost rotoru, velikost štěrbiny a poměr plyn:kapalina jsou hlavními výrobními parametry, které ovlivňují charakteristiku mikrosférového produktu (průměrná velikost, distribuce částic a koncentrace mikrosfér). Tyto parametry se ' nastaví -empiricky-tak;* aby byl získán produkt, mající jj . * požadované vlastnosti. Pro každý produkt se jeho parametry +5 definují klinicky. Například předpokládané specifikace pro perfluopropanové mikrosféry užívané pro myokardiální perfuze jsou: průměrná velikost 4 mikrometry, distribuce Částic 90 % pod 10 mikrometrů, koncentrace 7 .10⁸ až 2.19⁹ mikrosfér/ml.

Vynález je blíže ilustrován následujícími příklady, které jej však v žádném případě nijak neomezují.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Sledování teploty a kontrola procesu mechanické kavitace u lidského sérového albuminu

Jak je popsáno výše, roztok proteinu se před zpracováním předehřeje tak, aby teplota procesu dosáhla a udržovala se na teplotě počínající denaturace.

Typický praktický postup je následující:

Model 2 1/2 Bematek koloidní mlýn (obr. 2, Bematek Systems, Beverly MA), byl potrubím spojen tak, že vstupní část je napojena k tepelnému výměníku. Pro plyn nepropustný trubkový spoj byl použit pro provedení měkkých spojů mezi hadicemi tepelného výměníku.

Výstupní Část pracovní hlavy byla připojena k výstupnímu chladiči z nerezové oceli.

Teplota roztoku byla sledována na třech místech (TI, T2 a T3). Termočlánek Ti byl umístěn ve Swagelok T mezi předehřívacím tepelným výměníkem a hlavou mlýna pro měření napájecí teploty roztoku proteinu. Druhý T pro zavádění plynu byl rovněž umístěn v napájecí části. Termočlánek T2 byl umístěn uvnitř výstupu pracovní hlavy přibližně 1 cm od rotoru a 2 cm od hřídele tak, aby bylo možno přesně změřit teplotu procesu. Tímto způsobem lze měřit nezávisle dvě teploty napájecí teplotu TI a pracovní teplotu T2 a porovnat pro určení velikosti ohřevu roztoku během zpracování.

V tomto příkladu USP albumin byl zředěn fyziologickým solným roztokem tak, aby vznikl 1% hmotn./obj. roztok. Teplota denaturace byla stanovena experimentálně jak je popsáno a stanoveno 78 °C. Tento roztok byl napájen do mlýnu při průtoku 200 ml/min s následujícím odplyněním a současným zaváděním pe'rf luorp'ropan'ú'v dávce'T00 mT/mÍn'''('50%'óbj”7’obj ·) · Bylý “ pozorovány rozdíly mezi TI a T2 v rozmezí 10 až 15 °C. Za účelem získání teploty zpracování 77 °C (1 % pod teplotou denaturace) byla nastavena napájecí teplota do rozmezí 62 až 67 °C. Protože množství generovaného tepla kolísá s různými , parametry mletí je nutné stanovit rozdíly mezi TI a T2 s « každou změnou parametrů mletí (výběr mlýnu, seřízení mlýnu, „

I průtoková rycnlost, poměr plyn:kapalina atd.) za účelem dosažení teploty zpracování, která by vyloučila hrubou denaturaci proteinu při úspěšné enkapsulaci mikrobublin plynu pomocí tenkého obalu denaturovaného proteinu.'

Výstupnftéplo ta chladí ce'(T3)~by larovnéž’ s ledována ” nejlepších výsledků bylo dosaženo při 20 °C.

Příklad 2

Výroba mikrosfér, obsahujících různé., plyny pomoci metody mechanické kavitace ...........

Mikrosféry, obsahující různé plyny, byly vyráběny následujícím způsobem: 5% roztok lidského albuminu (USP) byl * odvzdušňovárí působením kontinuálního vakua po dobu 2 hodin.

Vakuum pak bylo odstraněno naplněním evakuované nádoby daným *i plynem. Použité nerozpustné plyny zahrnují: fluorid sírový, perfluorethan a perfluorpropan. Byly rovněž vyrobeny mikrosféry, obsahující rozpustnější plyny, vzduch, dusík, kyslík a argon. Argon byl použit jako představitel plynu o vysoké molekulové hmotnosti, který však je relativně rozpustným plynem, Albuminový. roztok byl nastaven na 68 °C pomocí tepelného výměníku in líne a čerpán při průtoku 100 ml za minutu do 2 1/2 koloidního mlýnu (Greerco, Hudson, NH, model W250V nebo AF Gaulin, Everett, MA, model 2F). Specifický plyn při teplotě místnosti byl přidáván do napájecí části vzhůru směřující vstupní části při průtoku 120 až 220 ml/min. Štěrbina mezi rotorem a statorem byla nastavena na 0,005 cm a roztok albuminu byl mlet kontinuálně při asi 7000 ot/min při teplotě zpracování 73 °C.

Hustý bílý roztok mikrosfér získaný tímto způsobem byl ihned ochlazen na teplotu 10 °C tepelným výměníkem a odebrán do skleněných lahviček, které byly ihned uzavřeny. Tento materiál byl pak charakterizován s ohledem na koncentraci a distribuci částic pomocí Coulter Counter. Výsledky jsou uvedeny dále v tabulce 3. *,

ř.<*

Tabulka 3

	koncentrace (usféry/ml)	střední velikost (mikrometry)
perfluorpropan	8,3 x 108	3,8
perfluorethan	10,6 χ 10³	4,0
fluorid sírový	8,4 χ 10⁸	3,9
vzduch	9,2 x IO’	3,4
dusík	5,4 x 10⁷	5.0
kyslík.	6,1 χ 10⁷	3,9
argon	4,1 χ 10⁷	3,5

Příklad 3

Vliv rychlosti rotoru a velikosti štěrbiny

1% roztok albuminu byl kombinován (200 ml/min) s perfluorpropanem (100 ml/min) při poměru 50 % plyn ke kapalině

(obj./obj.). Mikrosféry byly	připraveny podle	postupu
popsaného v příkladu 1 za použití různých rychlostí rotoru a
velikosti štěrbiny.	Z í skané	údaje jsou uvedeny	v tabulce 4. .
Tabulka 4
Rychlost špičky	štěrbina	koncentrace	prům.ve 1.	í
rotoru (ft/min)	(cm)	(psféry/ml)	(mikrometry)
3500	0,01	0,76 χ ΙΟ»	13,4	i
4300	0,01	2,43 x 108	9.6	3 i
4800	0,01	9,38 x 103	3,8	t . í
9700	0,01	20,96 χ 108	4,3	(
5200	0,02	12,87 x 108	5,0	V
7000	0,02	12,50 x 108	3,4
8700	0,02	14,42 x 108	3,0 .
9600	0,02	15,22 x 103	2,9 ,
:« , i. , r.. r- .1-	τ ·- —r* 1* -	W — » - - -	,i- » -* · -v - pWMír

-Výsledky ukazují, že koncentrace stoupá a průměrná velikost klesá se. zvyšujícími se.otáčkami rotoru, zatímco zvyšující se velikost štěrbiny snižuje koncentraci.

Příklad 4 }

.......... ...... {

Vliv poměru plyn ke kapalině í

0,5% roztok albuminu (100 ml/min) byl kombinován s í perfluorpropanem při 20, 50, 70 nebo 100 ml/min (odpovídá 20,

50, 70 nebo 100 % plyn ke kapalině obj./obj.) za použiti

Gaulinova mlýnu s přibližnou velikostí štěrbiny 0,012 a '.j i

rychlostí špičky rotoru 9950 ft/min. Získané údaje jsou <

uvedeny v tabulce 5.

Tabulka 5

Plyn/kapalina %	štěrbina	koncentrace	prúm.vel.
(obj./obj.)	(cm)	(psféry/ml)	(mikrometry)
20	0,03	6,54 x 10⁸	3,6
50	0,03	7,51 x 10⁸	4,3
70	0,03	8,76 x 10⁸	5,0
100	0,03	8,66 x 10⁸	5,9

Tyto výsledky ukazují, že jak koncentrace tak průměrná velikost se zvyšují s poměrem plyn:kapal i na.

Příklad 5

Způsob výroby mikrosfér plněných nerozpustným plynem ultrazvukovou kavitací

Byly připraveny mikrosféry, obsahující vzduch, fluorid sírový a perfluorethan jak dávkovým tak kontinuálním ultrazvukovým kavitačním procesem. 5% roztok . 1idského albuminu USP byl odplyněn za vakua a uchováván pod specifickým plynem., Kontinuální sonifikační proces byl proveden postupem popsaným, Černým, (USP 4957656), s tím, že vzduch byl nahrazen nerozpustnými plyny. Dávkový proces byl proveden za použití 3/4 kapalinové pracovní hlavice (Sonics and Materials,

Danbury CT). Plyn se nechal procházet hlavicí a byl zaváděn do albuminu tak, že během celého procesu byl vyloučen přístup vzduchu. Albumin byl zahřát na 73 °C a sonifikován po dobu 5 s při 20 kHz při zdvojené amlitudě 60 mikrometrů za použití Bronsonova piezoelektrického konvertoru a napěťového zdroje (Branson Ultrasonics, Danbury CT). Produkt byl ihned převeden do skleněných lahviček a uzavřen pod plynem.

Produkt se skládal z husté, mléčné suspenze mikrosfér o koncentracích od 1,4 x 10 ⁸ do 1,0 x 10⁹ mikrosfér na mililitr o průměrné velikosti 2,5 až 3,3 mikrometrů.

Příklad 6

Mikroskopické hodnocení mikrosfér

Albuminové mikrosféry, obsahující různé plyny byly připraveny tak, jak je popsáno v příkladech 2 nebo 5. Mikroskopickým hodnocením produktů byla zjištěna monodisperzní suspenze sférických mikrosfér. Tyto mikrosféry byly zborcený aplikací vysokého tlaku v injekční stříkačce až do vyčeřen.í suspenze. Ve všech případech mikroskopické hodnocení prokázalo přítomnosti hyaíinu, membránových obalů ze zhroucených mikrosfér.

Příklad 7

Tlaková odolnost mikrosfér ^Albuminové mikrosféry, obsahující různé plyny, byly připraveny způsobem popsanaým v příkladu. 2. 10 ml každého roztoku bylo umístěno do'lOml skleněné plynotěsné injekční stříkačky (Hamilton, Feno NV) opatřené tlakovou jehlou.

Všechny volné prostory byly odstraněny a zařízení bylo utěsněno. Po dobu 3 min byl aplikován konstantní tlak 40 psig.

K měření koncentrace částic a distribuce částic byl použit Coulter Counter. Srovnání údajů /obr.4a až 4e/ před tlakovým i ...

zatížením a po něm prokazuje odolnost mikrosfér s nerozpustným plynem do 40 psig.

·.

Příklad 8 |

Tlaková odolnost ředěných suspenzí mikrosfér

Mikrosféry, obsahující různé plyny byly připraveny

Íí f

postupem podle příkladu 2. Každý vzorek mikrosfér byl zředěn na stejný objem zapouzdřeného plynu na ml salínickým fosfátovým pufrem (0,15 M) , ředění asi 1:60. Zředěné suspenze byly podrobeny okamžitým statickým tlakům 0,5 psig až 7,5 psig v utěsněné nádobce s přiměřeným volným prostorem. Obr. 5 znázorňuje vliv tlaku na koncentraci mikrosfér. Mikrosféry, obsahující nerozpustné plyny, perfluorpropan, perfluorethan a i

- ·' - · - f fluorid sírový, jsou mnohem odolnější vůči tlaku než « mikrosféry stejné koncentrace a distribuce částic plněné i ř· vzduchem nebo vysokomolekulárním argonem (obr. 6). j

Fyziologické tlaky v krevním řečišti se pohybují v rozmezí j periferního venozního tlaku od 1,5 psig do 2,5 psig v ř

ť.

myokardiální stěně. ř

Příklad 9

Vliv odplyněného pufru na mikrosféry

Albuminové mikrosféry, obsahující různé plyny, byly připraveny postupem podle příkladu 2. Salinický fosfátový pufr PBS byl odplyněn varem právě před použitím. 0,05 ml až 1,5 ml podíly horkého pufru byly umístěny do 13 x 100 zkumavek a ponechány ochladit 1 minutu na teplotu místnosti na vodní lázni. Ke každé zkumavce byl přidán konstantní objem mikrosfér. Po promísení byl objem doplněn na 3 ml PBS a byla stanovena koncentrace mikrosfér. Obr. 7 znázorňuje, Ze zlepšené zachování mikrosfér v odplyněných roztocích se docílí j u mikrosfér, obsahujících nerozpustné plyny perf luorpropan, . ϊ^:·

f.

perfluorpropan a fluorid sírový. £

Mikrosféry, obsahující vzduch, fluorid sírový nebo perfluorethan, byly zředěny plnou krví. Vzduchem plněné mikrosféry vykázaly zhroucení. Mikrosféry plněné nerozpustným plynem vykázaly odolnost ředění čerstvou plnou krví.

Příklad 10 Elast ici ta

-Mikrosféry připravené z různých plynúbyly získány - ,, postupem podle příkladu 2. Mikrosféry byly zředěny salinickým _ --------------f-₀ s-f-á-tovým^- pufrem“ j ák j é popsáno' v př í kladu 8 a umí stěny do čiré kyvety umístěné na podložce mikroskopu. Kyveta byla spojena se zdrojem dusíku tak, aby bylo umožněno pozorování účinku rychlé aplikace a uvolnění fyziologických tlaků na mikrosféry. * f

Aplikace tlaku 1,5 psig nebo větších na mikrosféry, „ ' obsahující rozpustný plyn měly za následek úplnou ztrátu sférických těles. Tyto mikrosféry se po uvolnění tlaku r nevracely do původního stavu, což indikuje irreverzibilni destrukci. Aplikace tlaků menších než 1,5 psig vede k deformaci a svraštění obalu s neúplnou ztrátou mikrosfér.

— Sfér_?ický*vzhled~nebo'populácé 'se''nevracej'í^po^uvolnění __ __

1’. aplikovaného tlaku do původního stavu.

Aplikace tlaku až několika psig na suspenzi mikrosfér, _iZ~ obsahujících nerozpustné perf luoruhl íkové plyny, měly za následek snížení průměru mikrosfér. Průměr.mikrosfér se vracel

...... · ....

na původní rozměry po uvolnění tlaku, ϊ

Mikrosféry, obsahující fluorid sírový, rovněž vykazují | zvýšenou elasticitu při aplikaci fyziologických tlaků vzhledem .1 k mikrosférám plněným vzduchem, ale vykazují menší elasticitu $

vzhledem k mikrosférám plněným perfluoruhlikatýrai plyny.

a . ’ . r.

Tato pozorování indikují, že mikrosféry, obsahující nerozpustné plyny jsou nejen odolné vůči tlaku, ale po * uvolnění tlaku se navracejí na původní rozměry. To indikuje elestický proteinový obal.

Příklad 11

Srovnání mikrosfér vyrobených v otevřeném systému a v uzavřeném systému .Způsoby výroby ,

A) Manuální sonikacě: otevřený systém (ekvivalentní jednostupňové metodě EPA 554213)

Metoda popsaná v US patentu č. 4844882 a evropské patentové přihlášce 554213 byla použita k přípravě mikrosfér následujícím způsobem:

cm³ válec injekční stříkačky byl opatřen termočlánkemtypu T zasunutým přes špičku a namontovaným na držák. j

Stříkačka byla naplněna po značku 16 cm³ 5% sérovým lidským albuminem od Swiss Red Cross. Plyn (perflurpropan (C3F6) nebo fluorid sírový (SF&)) byl zaveden do horní části- válce injekční stříkačky a ponechán protékat nad kapalinou.

Sonikační hlava byla snížena na značku 10 cm³ pod povrch roztoku a ponechána pracovat na 50% výkon, dokud teplota roztoku nevzrostla na 72,8 až 73 °C; přibližně 1 minuta. Hlava pak byla ihned vytažena na meniskus + 1 mm a výkon byl zvýšen na 65 %. Sonikacě pak pokračovala po dobu 5 sekund s dalším tepelným zvýšením 1,2 až 2 °C. Produkt byl nalit do skleněné lahvičky vhodné kapacity a utěsněn.

B) Kontinuální sonifikace: uzavřený systém

Byla použita metoda popsaná v US patentu č. 4957656 pro přípravu perfluorpropanových mikrosfér a mikrosfér, obsahujících fluorid sírový následujícím způsobem:

Lidský sérový albumin byl zředěn na 1 % hmotn./obj. roztok sterilním fyziologickým solným roztokem. Roztok byl zahřát na teplotu počínající denaturace, přibližně 76 °C. Systém byl uzavřen vůči vnější atmosféře a plyn perfluorpropan nebo fluorid sírový - byl zaváděn do toku 'kápá'l'iný~”(Ίnnsťo vždučhuT’Produkt byl vyráběn kontinuálně průtokem směsi plyn/albumin kolem sonikátorové hlavy při průtoku přibližně 100 ml kapaliny/min. Produkt byl chlazen na výstupu ze sonikační komory průchodem tepelným výměníkem a shromaždován jako surová kapalná suspenze mikrosfér. Další zpracování á skladování bylo podobné jako u ručně zpracovaných mikrosfér.

C) Mechanická kavitace: uzavřený systém

Alburainové mikrosféry, obsahující perfluorpropan nebo plynný fluorid sírový byly také připraveny v uzavřeném systému ’~mletímsměsi l%'ridškéhó”serovéKd*aítíumi’hu a’ plynu podobným způsobem, jak je popsáno v příkladu 2. Roztok albuminu, který byl zahřát na teplotu, umožňující tvorbu mikrosfér mechanickou kavitací v daném mlýnu, byl míšen 1:1 obj./obj. s plynem a zaváděn do koloidního mlýnu. Průtok kapaliny byl závislý na kapacitě nebo velikosti mlýnu, obvykle . 1.00 až. 500 ml/min. Pro toto hodnocení byly použity Silverson L4R mlýn a Bematek 3 koloidní mlýn. Výstup z mlýnu byl ochlazován průchodem tepelným .výměnným systémem a výsledná suspenze albuminových mikrosfér byla oddělována do hrubého produktu. Produkt byl plněn do skleněných lahviček podobně jako vostatních postupech.

Analatické metody

A) Dynamika částic

Dynamiky částic byly hodnoceny pomocí Coulter Multisizer II za použití 50 50 mikrometrového otvoru. Alouminové mikrosféry připravené postupem popsaným ve způsobu přípravy, byly ředěny 1:10000 Isotonem a 500 μΐ vzorku bylo analyzováno. Byly získány hodnoty koncentrace, průměrné velikosti a objemu zapouzdřeného plynu na ml původní suspenze mikrosfér.

B) Obsah plynu

Procenta perfluorpropanu zachyceného ve dvou šaržích mikrosfér připravených jak je popsáno ve způsobech přípravy byla stanovena plynovou chromatografií na přístroji Hewlett Packard 5890. Vzorek mikrosfér byl odebrán do plynotešné injekční stříkačky. Plyn byl uvolněn z mikrosfér použitím proti pěnivého činidla v ethanolu a zachycený plyn byl detegován tepelně-vodivostně.

C) Tlaková odolnost

Tlaková odolnost albuminových mikrosfér byla hodnocena způsobem podobným způsobu uváděnému Sintetica v evropské patentové přihlášce 554213. Mikrosféry byly ředěny v provzdušněném salinickém fosfátovém pufru na přibližně 1 jednotku absorbance při 600 nm ve 3ml tlakové kyveté. Hrdlo bylo připojeno ke tlakovému zdroji a kyveta byla umístěna do záznamového spektrofotometru. Tlak v kyvetě byl zvyšován lineárně' od 0 na 5 nebo 10 psig během 150 sekund, načež byl tlak uvolněn. Tlakový zdroj byl tvořen proporcionálním solenoidním ventilem (Honeywell) a tlakovým převaděčem (Omega), které byly umístěny mezí 20 psi tlakový zdroj (zásobník N2) a 5 litrový zásobník z nerezové oceli.

Kyveta byla připojena k zásobníku z nerez oceli digitální tlakovou jehlou. Počítač PC-typu (National Instrument) i

fcI

ί.

opatřený konvertorem analogového výstupu na digitální a digitálního na analogový řídil otevírání ventilu a odečet tlakového převaděče. Zásobník a kyveta byly tlakována zvolenou rychlostí až do dosaženi požadovaného tlaku. Optická hustota mikrosférové suspenze byla sledována jako funkce času a tlaku.

úda-je byly kor řgovány na -při rozenou-rychl os t -f-řo t ac e -mrk r osf-ér - - —’ — v kyvetě. _t

Výsledky:

A) Dynamika částic <

• I- '

Mikrosféry vyrobené metodou manuální sonikace, * kontinuální soňikace a mechanické kavitace bylý analyzovány ná koncentraci, průměrnou velikost, objem zapouzdřeného plynu a distribuci částic během 24 hodin po výrobě. Všechny měření byla provedena nejméně dvakrát a jsou uváděna jako průměr.

Výs 1 edky‘měření-j sou-uvedeny-v-tabulce-6,¹· — ^-- —·— .?

Tabulka 6

Plyn	způsob	konc. (103/ml)	prům.ve 1. (pm)	obj em (ml/ml)
SFs	manuální son.	8,7	3,2	0,046
SF&	kontinuální son.	12,7	2,7	0,034
SF₆	mechanická kavitace	20,0	3,8	0,054
C₃F₈	manuální son.	13,4	2,8	0,033
C₃Fs	manuální son.	17,7	2,8	0,058
c₃f₃	kontinuální son.	20 ’ 1	3,0	0,050
C₃Fs	kontinuální son.	6,7	4,3	0,127
c₃f₈	mechanická kavitace (Bematek mlýn)	31,0	3,0	0,23
c₃f₈	mechanická ka-.	6,9	5,0	0,34

vi táce (Silverson mlýn)

Mikrosféry vyrobené všemi metodami byly stabilní po dobu trvání této studie, nejméně několik týdnů při 4 °C.

B) Obsah plynu

Analýzy složení zapouzdřeného plynného perfluorpropanu ve dvou šaržích mikrosfér jsou uvedeny v tabulce 7.

Tabulka 7

Metoda*	% C3F8
manuální sonifikace	70,0
kontinuální sonikace	' 8975·^__
mechanická kavitace	95,5

* průměrné výsledky ze dvou šarží.

Tyto výsledky demonstrují, Ze mikrosféry vyrobené v otevřeném systému za použiti manuální sonikace zapouzdřuji mnohem méně plynu použitého pro vytvoření mikrosfér než ty, které byly vyrobeny v uzavřených systémech (kontinuální sonikace a mechanická kavitace). Mikrosféry vyrobené v uzavřeném systému byly vyrobeny za nepřítomnosti kyslíku, jak. bylo stsnoveno kyslíkovou elektrodou. Mikrosféry vyrobené všemitřemCzpusoby'“výroby*byly podrobeny~stejné· expozici’™-atmosféře během zpracování a vzorkování (což má za následek méně než 100% obsah plynného perfluorpropanu - naměřeno u mikrosfér vyrobených ve dvou uzavřených systémech), kde byl kyslík (a jiné atmosférické plyny) přítomen během tvorby v otevřeném systému, který potlačuje účinnost zapouzdřování plynu.

C) Tlaková odolnost .. ·. ,. , i*·· ‘.3 - ¹ * ~ .* l*. ,. ' -, · , ^Λ , -j; . >

Suspenze plynem plněných mikrosfér bude snižovat optickou hustotu se zvyšujícím se tlakem diky snížení velikosti a souvisejících změn plochy povrchu. Smršťování je způsobeno dvěma faktory; reverzibilní kompresí podle plynových zákonů a irreverzibilni ztrátou plynového jádra do okolní kapalni díky zvýšené rozpustnosti podle Henryho zákona. Při uvolněni aplikovaného tlaku pouze frakce, odpovídající objemové ztrátě Ί se znovu obnoví a může být pozorováno zvýšení optické hustoty.

Ztráta zachyceného plynu do okolního roztoku není pro mikrosféry při odtlakování vratná, ale je to ztráta volného prostoru nad roztokem.

Obr. 8 znázorňuje výsledky vloženi lineárního tlakového gradientu až do 10 psi na 1 OD suspenze albuminových mikrosfér připravených s plynným perfluorpropanem metodou manuální šonikace (otevřený systém) rovněž jako i metodou kontinuální šonikace a mechanické kavitace (uzavřené systémy).

Oba uzavřené systémy poskytly mikrosféry, vykazující stlačitelnost se zvyšujícím se tlakem s úplným návratem na původní objem při uvolnění tlaku ke konci gradientu. Ztráta zachyceného plynu do okolního roztoku nebyla pozorována.

Albuminové mikrosféry připravené v otevřeném systému (manuální sonikačni metoda) vykázaly větší kompresi při aplikaci tlaku a . .. j-s pouze’ částečnou návratnost objemu při uvolněni tlaku díky i rreverzi.bi lním ztrátám plynového jádra, majicím za následek. .

40% destrukci mikrosfér. - 4

'. ·.·*

« i' ·* ·*'< -i i ' ·&.

ι Τ'ω

I. . l-l- » ‘ JAiOINiSVlA . OH3AO'S aW 0«d avy o

Claims

PATENTOVÉ i I I 6 ΗΛ 6 L Y 0150a í: L 3 z s o •f-3 , Λ T I

. . 1 4 ' > * ΛΓ • r^r .·* ¹ » J «. . 1. ·' - . . -j . . . a - - r..... _r 4' r· * 4 . „ . . _ ____ k. ' .. . .f* ·. *

/ který je teplem insolubilizován, za přítomnosti zapouzdřeného plynu a za nepřítomnosti kyslíku, kde zapouzdřený piyn je zcela fařmakologicky přijatelný, ve vodě nerozpustný plyn.

8. Kompozice podle nároku 1, vyznačující se t í m, že rozpustnost plynu ve vodě při 25 °C je menší než 0,01 mi plynu na ml vody.

9. Kompozice podle nároku 7,vyznačující se t 1 d, že protein je lidský sérový.albumin.

10. Způsob výroby mikrosfér, obsahujících zapouzdřený plyn, vhodných jako ultrazvukové zobrazovací činidlo, vyznačující se tím, Že zahrnuje podrobení směsi vodného roztoku filmotvorného proteinu a fařmakologicky vhodného nerozpustného plynu, ultrazvukové nebo mechanické kavitaci za nepřítomnosti kyslíku.

11. Způsob výroby mikrosfér, obsahujících zapouzdřený plyn, vhodných jako ultrazvukové zobrazovací činidlo, vyznačující se tím, ie zahrnuje podrobení směsi vodného roztoku filmotvorného proteinu a fařmakologicky vhodného nerozpustného plynu, ultrazvukové nebo mechanické kavitaci v zařízení uzavřeném vůči atmosféře.

12. Způsob podle nároku 10 nebo 11,vyznačuj íc í se t í m, že protein je lidský sérový a plyn je perfluorpropan.

13. Způsob výroby mikrosfér, obsahujících zapouzdřený plyn, vhodných jako ultrazvukové diagnostikům, vyznačující se tím, že zahrnuje

a) poskytnutí vodného roztoku teplem denaturovatelného proteinu, při teplotě nezbytné pro dosaženi teploty počínající bS denaturace během následující mechanické emulgace:

b) uvedení roztoku do styku s plynem:

c) emulgaci směsi roztoku oroteinu a plvnu mechanickvm střihem '1 ' % směsi za tvorby suspenze plynových mikrobublinek o středním '2 průměru v rozmezí asi 0,1 až asi 10 mikrometrů a .

d) zapouzdření plynových mikrobublinek za tvorby mikrosfér pomocí mechanické kavitace suspenze působící denaturaci proteinu a tím jeho ukládáni na rozhraní plyn-roztok.

14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se t i n, že proteinem je lidský sérový albumin a plynem je perfluorpropan.

15. Způsob podle nároku 13 nebo 14, vyznačující se t í' m, že stupně (c) a (d) se provádějí průchodem směsi mlýnem.

16. Mikrosféry se zapouzdřeným plynem vyrobené způsobem podle nároku 10, II, 12, 13, 14 nebo 15.

ÍZÍ2

JALO i Ή3VIA

Ο'πϊΛ'Γ 3 ΛΛ ýd-á cvy O

1. Kompozice ultrazvukového diagnostika, v y značující se C í m. Ze obsahuje vodnoi suspenzi mikrosfér plynu, zapouzřeného v teplem insolubi1izovaném filmotvorném proteinu, kde zapouzdřený plyn je zcela farmakologicky přijatelný, ve vodě nerozpustný plyn.
2. Kompozice podle nároku 1,vyznačuj ící se t í m,že rozpustnost plynu ve vodě při 25 °C je menší než 0,01 ml plynu na ml vody.
3/12 i ’ i ‘ýw I

I 1

J? i j . .·! i$7-\ OHjA.l ' !

3. Kompozice podle nároku l,vyznačuj ící se t í m, že protein je lidský sérový albumin.
4. Kompozice podle nároku 1,vyznačuj ící se t i m. že protein je lidský sérový albumin a rozpustný piýn je perfluorpropan.
5 .11! '1 Z

015 c a ί ΐ v, S !) ΐ 6 0

U i.

> C.

5. Kompozice ultrazvukového diagnostika, vyznačující se tím, že obsahuje vodnou suspenzi mikrosfér perfluorpropanového plynu, zapouzdřeného v teplem insolubilizovaném filmotvorném proteinu.

6. Kompozice podle nároku 3, vyznačující se t í m, že proteinem je lidský sérový albumin.

7. Kompozice ultrazvukového diagnostika, vyzn,ačující se tím, že obsahuje vodnou suspenzi mikrosfér plynu zapouzdřeného filmotvorným proteinem,

I l··
6 li! Z Z

OISOQ

Γ, S !i ΐ 6 ^! vstup kapalinv výstup produktu