Technisches Fachgebiet
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Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von
Ultraschallabbildungsmitteln, die aus proteinartigen Mikrokügelchen bestehen, in denen unlösliche
Gase eingekapselt sind, und Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung.
Stand der Technik
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Die diagnostische Ultraschallabbildung beruht auf dem Prinzip, daß Wellen
mit Schallenergie, die auf einen Bereich von Interesse fokussiert werden, so
reflektiert werden, daß ein Bild erzeugt wird. Ein Ultraschallscanner wird auf die
Körperoberfläche gebracht, die über dem abzubildenden Bereich liegt, und die
Ultraschallenergie in Form von Schallwellen wird auf den Bereich gerichtet. Der Scanner weist
die reflektierten Schallwellen nach und übersetzt die Daten in Videobilder. Wenn
die Ultraschallenergie eine Substanz durchstrahlt, hängt die Menge der
reflektierten Energie von der Fortpflanzungsgeschwindigkeit und den akustischen
Eigenschaften der Substanz ab. Änderungen den akustischen Eigenschaften der
Substanz (z. B. unterschiedliche akustische Impedanzen) sind an den Grenzflächen von
verschiedenen akustischen Dichten am deutlichsten, z. B. von Flüssigkeit-Feststoff
oder Flüssigkeit-Gas. Wenn also Ultraschallenergie durch Gewebe geleitet wird,
erzeugen organische Strukturen Schallreflektionssignale, die mit dem
Ultraschallscanner nachgewiesen werden können. Diese Signale können durch die geeignete
Verwendung eines Kontrastmittels verstärkt werden.
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Besonders wichtig sind Ultraschallabbildungsmittel, bei denen Gas
eingesetzt wird, da dieses als Reflektor von Ultraschall sehr wirksam ist. Resonanz
erzeugende Gasblasen streuen den Schall tausendmal wirksamer als ein festes
Partikel der gleichen Größe. Ophir und Parker beschreiben die folgenden zwei Arten
von Gas enthaltenden Abbildungsmitteln: (1) freie Luftblasen und (2) eingekapselte
Luftblasen (Ultrasound in Medicine and Biology 15 (4) (1989), 319-333). Jedoch
haben freie Gasblasen der geeigneten Größe eine zu kurze Lebensdauer, als daß
sie für die meisten in vivo-Anwendungen nützlich wären (Meltzer et al., Ultrasound
in Medicine and Biology 6 (1980), 263-269). Ophir und Parker weisen darauf hin,
daß die Entwicklung von eingekapselten Gasblasen ein Versuch sein könnte,
dieses Problem zu lösen.
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Die zweite wichtige Klasse von Gas enthaltenden Ultraschall-Kontrastmitteln,
die von Ophir und Parker beschrieben werden, sind die eingekapselten
Mikroblasen, die nachstehend als "Mikrokügelchen" bezeichnet werden. Die Gasblase ist
von einer Hülle umgeben, die aus einem Protein oder einem anderen
biokompatiblen Material besteht. Ein herkömmliches handelsübliches Kontrastmittel aus
Mikrokügelchen ist ALBUNEX® (Molecular Biosystems, Inc., San Diego, CA), das aus
mit menschlichem Serumalbumin eingekapselten, Luft enthaltenden
Mikrokügelchen besteht, vgl. die US-Patente Nr. 4 572 203 und 4 844 882.
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Es wurde gezeigt, daß die Luft enthaltenden Mikrokügelchen rasch ihre
Echofähigkeit verlieren, wenn sie Drücken von 150 mm Hg ausgesetzt werden, die
während der Injektion und im Kreislauf in vivo auftreten (dedong, N., et al., Ultraso-
und Med. Biol. 19 (1993), 279-288). Mit der vorliegenden
Einkapselungstechnologie dagegen soll ein Material hergestellt werden, das als Ultraschallkontrastmittel
geeignet ist und das in vivo für die meisten gewünschten Anwendungen lange
genug überdauert. Tatsächlich muß ein Mittel, das die Myokardwand abbilden kann,
vorübergehenden Druckpulsen von mindestens 250 mm Hg (etwa 5 psig)
standhalten können.
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Bei der Lösung des Problems mit der Druckinstabilität von Mikrokügelchen
hat sich die Lehrmeinung bisher darauf konzentriert, die Hülle zu verbessern, denn
man nahm an, daß die Hüllen oder "Membranen" der Mikrokügelchen unter Druck
zu brüchig oder spröde sind, was in vivo zu einem raschen Zusammenfallen führt.
Giddey (PCT/EP91/01706; PCT 92/05806) stellte fest, daß "die Membranen
aufgrund ihrer Steifigkeit plötzlichen Druckschwankungen nicht standhalten können,
denen die Mikrokügelchen möglicherweise z. B. während ihrer Wanderung durch
den Blutkreislauf ausgesetzt werden, wobei diese Druckschwankungen auf den
Herzschlag zurückzuführen sind". Um die Probleme mit der Steifigkeit der Hülle zu
beheben, schlug er vor, die Luft vorher in einer Proteinlösung zu emulgieren, die
einen großen Prozentsatz an Viskositätsmitteln (40 bis 80% Polyole) enthält, und
das Ganze einer mechanischen Scherung in einem Hochgeschwindigkeitsmischer
zu unterwerfen. Die Blasen mit geeigneter Größe werden gewonnen und mit einem
geeigneten grenzflächenaktiven Stoff beschichtet, wodurch sie in einer weichen
Hülle stabilisiert werden.
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Holmes (PCT WO 92117213) schlug vor, die in vivo-Stabilität von Protein-
Mikrokügelchen zu erhöhen, indem die Hülle mit biologisch abbaubaren
chemischen Vernetzungsmitteln verstärkt wird.
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Bichon et al., (EPA 90/810367) und Schneider et al. (Inv. Radiol. 27 (1992),
134-139) beschreiben die Herstellung von porösen (Porengröße von 5 bis 2000
nm) polymeren "Mikroballons". Sie berichten in der Europäischen
Patentanmeldung, daß "die mikroporöse Struktur der Mikroballon-Hülle einen Elastizitätsfaktor
darstellt, d. h. die Mikrokügelchen können ohne weiteres Druckschwankungen
aushalten ohne aufzubrechen".
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Erbel und Zotz (US-Patent Nr. 5 190 982) beschreiben eine vernetzte
polymere Mikrokapsel, in der Luft eingeschossen ist.
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Schneider et al. (EPA 554 213) zeigen, daß die Widerstandsfähigkeit von
Mikrokügelchen gegenüber Druck verbessert werden kann, indem zumindest ein
Teil des Gases, das eingekapselt wird, ein Gas ist, das einen Sgas/MWgas-Wert
von ≤ 0,0031 aufweist, wobei Sgas die Wasserlöslichkeit des Gases in Liter/Liter
und MWgas das durchschnittliche Molekulargewicht des Gases in Dalton darstellt.
Tabelle 1 der Veröffentlichung führt N&sub2;, SF&sub6;, CBrF&sub3; und CF&sub4; an, die dieses
Kriterium erfüllen. Die Veröffentlichung macht deutlich, daß diese Mikrokügelchen durch
zwei Verfahren hergestellt werden können. Das erste Verfahren ist ein zweistufiges
Verfahren, bei dem Luft-enthaltende Mikrokügelchen durch eine bekannte Methode
hergestellt werden und die Luft durch ein Gasaustausch-Verfahren durch das
unlösliche Gas ersetzt wird, z. B. indem die Luft gefüllten Mikrokügelchen eine
geeignete Zeit in einer Atmosphäre des unlöslichen Gases inkubiert werden.
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Das zweite Verfahren ist ein einstufiges Verfahren, bei dem die
Mikrokügelchen durch die Methode von EP-A 324 938 (vgl. Beispiel 1 der Veröffentlichung)
hergestellt werden, wobei anstelle von Luft ein unlösliches Gas verwendet wird. In
diesem Verfahren wird das Gas über eine Lösung eines die Hülle bildenden
Materials (z. B. eine Albuminlösung) passiert, währenddessen wird ein Beschallungshorn
in das Gefäß abgesenkt und anschließend entfernt.
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Leider ist keines dieser Verfahren in der Praxis anwendbar, um stabile
Suspensionen von Protein-eingekapselten, mit unlöslichem Gas gefüllten
Mikrokügelchen herzustellen. Unter Verwendung des ersten (zweistufigen) Verfahrens kann
lediglich eine kleine Anzahl von Luft gefüllten Albumin-Mikrokügelchen den Kontakt
mit dem unlöslichen Gas in der Umgebung überstehen (die zweite Stufe des
zweistufigen Verfahrens). Das Ausströmen der löslichen Gase (Luft) aus den
Mikrokügelchen ist größer als das Eindringen des unlöslichen Gases in die
Mikrokügelchen, dies führt zu einem vollständigen Zusammenfallen der Mikrokügelchen,
wobei lediglich Trümmer der Hülle zurückbleiben. Dieser Effekt ist bei den stärker
un
löslichen Gasen, wie z. B. Perfluorethan, besonders stark ausgeprägt. Das zweite
Verfahren erzeugt Mikrokügelchen, die beim Anlegen von Druck Volumen verlieren
und die nach dem Ablassen des Drucks keine Erholung zeigen. Es wird
angenommen, daß beide Verfahren Mikrokügelchen geringerer Qualität produzieren, da die
Mikrokügelchen signifikante Mengen von Luft enthalten, und daß das Vorliegen von
Luft während der Erzeugung möglicherweise bewirkt, daß die Vorteile der
Herstellung der Mikrokügelchen in Gegenwart eines unlöslichen Gases alleine
abgeschwächt werden. In diesem Zusammenhang ist anzumerken, daß die Forscher
früher angenommen haben, daß bei der Herstellung von Mikrokügelchen durch
Hohlraumbildung (Kavitation) das Vorliegen von Sauerstoff essentiell ist.
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Suslick berichtete, daß eine Hohlraumbildung mittels Ultraschall nur dann als
Verfahren zur Herstellung von Mikrokügelchen geeignet war, wenn Sauerstoff
vorlag. In ausführlichen Untersuchungen beschrieben Suslick et al. (Proc. Natl. Acad.
Sci. 88 (1991), 7708-7710; J. Am. Chem. Soc. 112 (1990), 7807-7809), daß
Sauerstoff an der die Hohlraumbildung induzierenden zwischenmolekularen Umlagerung
von Disulfidbrücken beteiligt ist, die für eine stabile Proteinhülle erforderlich ist.
Suslick stellt fest: "Wir stellen fest, daß die Erzeugung von Mikrokügelchen durch
die Abwesenheit von O&sub2; stark gehemmt wird". Er fährt fort: "Wenn die Umsetzung in
einer inerten Atmosphäre (He, Ar oder N&sub2;) abläuft, werden keine Mikrokügelchen
erzeugt". "Experimentell werden hohe Konzentrationen an Mikroblasen nur dann
synthetisiert, wenn die Umsetzung in O&sub2; oder Luft abläuft." Vgl. auch US 4 774 958.
Die vorstehende Annahme, daß Luft für die Erzeugung von
Albumin-Mikrokügelchen erforderlich ist, wurde auch in Holmes (PCT WO 92/17213) geäußert. Darin
wurde die Herstellung von Mikrokügelchen beschrieben, die verschiedene Gase mit
niedrigem Molekulargewicht enthalten. Jedoch stellten die Autoren bei der
Beschreibung der Produktion von Albumin-Mikrokügelchen durch Beschallung fest:
"Ein weiteres eingeführtes Verfahren, das für die Herstellung einer Gas
enthaltenden Blase beschrieben wird, d. h. US-A-4 774 958, erfolgt durch Beschallung des
Gemisches in Gegenwart von Luft." (Unterstreichung hinzugefügt).
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In einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die unerwartete
Entdeckung, daß hohe Konzentrationen von proteinartigen Mikrokügelchen, in denen
relativ unlösliches Gas eingeschlossen ist, durch Verfahren der Hohlraumbildung
mittels Ultraschall oder durch mechanische Hohlraumbildung in Gegenwart des
unlöslichen Gases ohne Anwesenheit von Sauerstoff hergestellt werden können. Solche
Mikrokügelchen zeigen eine erstaunliche und deutlich verbesserte Stabilität und
Elastizität gegenüber dem angelegten Druck und weisen gleichzeitig eine bessere
oder gleichwertige Echofähigkeit auf Die proteinartige Hülle verhindert die
Koales
zenz und hält der Ausdehung aufgrund von Diffusion von gelösten
atmosphärischen Gasen aus der Umgebung stand.
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In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein neues
Verfahren zur Herstellung von Mikrokügelchen mit Proteinhülle, bei dem mechanische
Energie in Form von Scherkräften eingesetzt wird. Diese Kräfte bewirken die
mechanische Scherung eines Flüssigkeits-Gas-Gemisches, wodurch eine Suspension
von Mikroblasen erzeugt wird, und sie bewirken außerdem eine hydrodynamische
Hohlraumbildung, die Energie freisetzt. Diese Energie wird durch die umgebende
Flüssigkeit aufgenommen, wodurch eine lokale Denaturierung und Ablagerung von
Protein an einer Gas-Flüssigkeits-Grenzfläche bewirkt wird, so daß getrennte
Mikrokügelchen gebildet werden. Eine hydrodynamische Hohlraumbildung
unterscheidet sich von einer (akustischen) Hohlraumbildung mittels Ultraschall dadurch,
auf welche Art jeweils die Druckunterschiede an den Flüssigkeitssystemen erzeugt
werden, die zur Freisetzung von Energie führen. Im ersten Fall werden die
Druckunterschiede durch das rasche Fließen einer Flüssigkeit durch eine Öffnung
oder über eine Oberfläche erzeugt, während im zweiten Fall die raschen lokalen
Druckunterschiede durch Zyklen hochfrequenter Schallwellen produziert werden
(vgl. F. Ron Young (1989), Cavitation, S. 4-5, McGraw-Hill Book Co., London).
Außerdem wird eine hydrodynamische Hohlraumbildung in einer fließenden
Flüssigkeit bewirkt, d. h. in einer Flüssigkeit, die durch oder über ein stationäres Objekt
fließt. Im Vergleich dazu wird eine akustische Hohlraumbildung in einem
Flüssigkeitssystem, das stationär bleibt, durch ausreichend viele Zyklen von ansteigendem
und abnehmendem Druck (Über- und Unterdruck) erzeugt, so daß eine
Hohlraumbildung entsteht. Auch ist ein Beschallungssystem mit kontinuierlichem Durchfluß,
wie z. B. das in US-Patent Nr. 4 957 656 beschriebene System, durch die
Verweilzeit in dem akustischen Hohlraumbildungs-Verfahren schwieriger zu steuern als ein
echtes hydrodynamisches Hohlraumbildungssystem mit Einmaldurchlauf, wie es in
der vorliegenden Erfindung beschrieben wird.
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Mikroblasen-Suspensionen, die durch mechanische Scherkräfte erzeugt
werden, werden als solche als Kontrastmittel eingesetzt, oder sie werden einer
weiteren Bearbeitung zu Mikrokügelchen unterworfen. Z. B. beschreibt die PCT-
Veröffentlichung Nr. WO 92105806 die Herstellung einer als "Schaum"
bezeichneten Mikroblasen-Suspension eines filmbildenden Proteins, die hergestellt wird,
indem eine Proteinlösung, die Viskositätsmittel enthält, bei einer konstanten
Temperatur unter der Temperatur, die das Protein denaturieren würde, zu einem groben
Schaum geschlagen wird. Der resultierende Schaum wird sodann mechanisch
geschert, so daß Blasen in einem gewünschten Bereich gebildet werden, die durch
das Vorliegen des Viskositätsmittels stabilisiert werden. Anschließend kann eine
Weiterbearbeitung der Blasen zu Mikrokügelchen durch Hitzedenaturierung oder
durch Zusatz von Vernetzungsmitteln erfolgen, wodurch der die Blasen umgebende
Proteinfilm gehärtet wird.
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In der Europäischen Patentanmeldung Veröffentlichung Nr. 0 450 745 A1
wird ein Verfahren zur Herstellung von Mikrokügelchen beschrieben, wobei eine Öl-
in-Wasser-Emulsion durch mechanische Scherung und gleichzeitige oder
anschließende Zugabe eines wasserunlöslichen Polymers erzeugt wird, das sich an
der Grenzfläche ablagert. Die hydrophobe Phase wird sodann verdampft, wodurch
mit Luft oder Gas gefüllte Mikrokügelchen gebildet werden.
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Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein verbessertes Verfahren zur
Herstellung von Mikrokügelchen aus einem Hitze-denaturierbaren Protein, wobei eine
Proteinlösung mechanischen Scherkräften unterworfen wird. Solche Kräfte
erzeugen eine Suspension von Mikroblasen, die gleichzeitig oder anschließend durch
eine getrennte Hülle eingekapselt werden. Aufgrund der Art des Erhitzens bei der
Hohlraumbildung ist die Denaturierung des Proteins örtlich begrenzt, so daß die
Hülle durch Ablagerung an der Flüssigkeits-Gas-Grenzfläche gebildet wird. Dieses
neue Verfahren kann im Vergleich zu den früheren akustischen Verfahren zur
Herstellung von Mikrokügelchen einfacher in einen größeren Maßstab übertragen
werden und führt zu verbesserten Produktausbeuten.
Beschreibung der Erfindung
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Ein Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von
eingekapselten, Gas enthaltenden Mikrokügelchen, die als Ultraschallabbildungsmittel
eingesetzt werden können, wobei das Verfahren umfaßt, daß ein Gemisch aus einer
wäßrigen Lösung eines filmbildenden Proteins und einem pharmakologisch
verträglichen wasserunlöslichen Gas einer Hohlraumbildung mittels Ultraschall oder
einer mechanischen Hohlraumbildung in Abwesenheit von Sauerstoff unterworfen
wird, wobei das Gas eine Löslichkeit von weniger als 0,01 ml Gas pro ml Wasser
(bei 25ºC) besitzt.
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Diese eingekapselten, Gas enthaltenden Mikrokügelchen können als
Ultaschallabbildungsmittel eingesetzt werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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Fig. 1 ist eine auseinandergezogene schematische Darstellung einer
Mühlenart (einer Gaulin-Mühle), die in dem erfindungsgemäßen Verfahren der
mechanischen Hohlraumbildung verwendet werden kann;
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Fig. 2 ist eine auseinandergezogene schematische Darstellung einer
anderen Mühlenart (einer Bematek-Mühle), die in dem erfindungsgemäßen Verfahren
der mechanischen Hohlraumbildung verwendet werden kann;
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Fig. 3 ist eine auseinandergezogene schematische Darstellung einer
weiteren Mühlenart (einer Silverson-Mühle), die in dem erfindungsgemäßen Verfahren
der mechanischen Hohlraumbildung verwendet werden kann;
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Fig. 4a zeigt die Widerstandsfähigkeit gegenüber Druck von mit Luft
gefüllten Albumin-Mikrokügelchen. Eine Mikrokügelchen-Suspension wurde in eine
Spritze gegeben und einem Druck von 40 psig (2,76 bar) ausgesetzt. Die
Partikelverteilungen vor und nach dem Anlegen des Drucks sind dargestellt.
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Fig. 4b zeigt die Widerstandsfähigkeit gegenüber Druck von mit
Perfluorpropan gefüllten Albumin-Mikrokügelchen. Eine Mikrokügelchen-Suspension wurde in
eine Spritze gegeben und einem Druck von 40 psig (2,76 bar) ausgesetzt. Die
Partikelverteilungen vor und nach dem Anlegen des Drucks sind dargestellt.
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Fig. 4c zeigt die Widerstandsfähigkeit gegenüber Druck von mit
Perfluorethan gefüllten Albumin-Mikrokügelchen. Eine Mikrokügelchen-Suspension wurde
in eine Spritze gegeben und einem Druck von 40 psig (2,76 bar) ausgesetzt. Die
Partikelverteilungen vor und nach dem Anlegen des Drucks sind dargestellt.
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Fig. 4d zeigt die Widerstandsfähigkeit gegenüber Druck von mit
Schwefelhexafluorid gefüllten Albumin-Mikrokügelchen. Eine Mikrokügelchen-Suspension
wurde in eine Spritze gegeben und einem Druck von 40 psig (2,76 bar) ausgesetzt.
Die Partikelverteilungen vor und nach dem Anlegen des Drucks sind dargestellt.
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Fig. 4e zeigt die Widerstandsfähigkeit gegenüber Druck von mit Argon
gefüllten Albumin-Mikrokügelchen. Eine Mikrokügelchen-Suspension wurde in eine
Spritze gegeben und einem Druck von 40 psig (2,76 bar) ausgesetzt. Die
Partikelverteilungen vor und nach dem Anlegen des Drucks sind dargestellt.
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Fig. 5 zeigt die Widerstandsfähigkeit gegenüber Druck von verdünnten
Suspensionen von Mikrokügelchen bei 3,0 psig (0,21 bar). Eine verdünnte Suspension
von Mikrokügelchen wurde in eine 1 cm-Küvette gegeben und zu der Zeit t = 30
Sekunden 3,0 psig (0,21 bar) ausgesetzt. Gezeigt werden die Ergebnisse für die
mit Perfluorethan, Perfluorpropan, Schwefelhexafluorid und Luft gefüllten
Mikrokügelchen.
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Fig. 6 zeigt die Widerstandsfähigkeit gegenüber Druck einer verdünnten
Suspension von mit Argon gefüllten Mikrokügelchen bei 3,0 psig (0,21 bar).
Verdünnte Argon-Mikrokügelchen wurden in eine 1 cm-Küvette gegeben und zu der
Zeit t = 30 Sekunden 3,0 psig (0,21 bar) ausgesetzt.
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Fig. 7 zeigt die Wirkung von entgastem Puffer auf Mikrokügelchen.
Mikrokügelchen wurden zu steigenden Mengen von entgastem Puffer unter Mischen
zugegeben und das Gemisch zur Bestimmung der Konzentration auf ein konstantes
Volumen gebracht. Die Ergebnisse für die mit Luft, Perfluorpropan, Perfluorethan
und Schwefelhexafluorid gefüllten Mikrokügelchen sind gegen das Volumen des
entgasten Puffers aufgetragen.
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Fig. 8 zeigt die graphische Darstellung von Ergebnissen, die im
nachstehenden Beispiel 11 beschrieben werden.
Verfahren zur Durchführung der Erfindung
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Die Mikrokügelchen werden in einer wäßrigen Suspension durch die
Hohlraumbildung mittels Ultraschall oder durch die mechanische Hohlraumbildung
wäßriger Lösungen von filmbildenden Proteinen in Gegenwart eines unlöslichen Gases
und im wesentlichen in Abwesenheit von Sauerstoff erzeugt, d. h. unter anaeroben
Bedingungen (in einem geschlossenen System). Die Mikrokügelchen reflektieren
Echo und weisen eine für die transpulmonale Passage geeignete Größe mit einem
durchschnittlichen Durchmesser von kleiner als 10 um und größer als 0,1 um auf.
Die Größenverteilung kann durch Fraktionierung in größere oder kleinere
Mikrokügelchen-Populationen geändert werden. Die Mikrokügelchen können durch
Entfernung einer überschüssigen wäßrigen Phase eingeengt oder sie können nicht
eingeengt werden, oder sie können gewonnen und in einer zweiten wäßrigen Lösung
resuspendiert werden.
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Das zur Herstellung dieser neuen Mikrokügelchen verwendete Gas muß
lediglich pharmakologisch verträglich und in den wäßrigen Medien unlöslich sein, in
denen sie vorliegen, (d. h. anfangs in dem Medium, in dem sie hergestellt werden,
und bei Verwendung im Blut). Die Löslichkeit in Wasser ist ein enger
Näherungswert für die Löslichkeit in solchen Medien. Der Begriff "Gas" bezieht sich auf eine
beliebige Verbindung, die ein Gas ist oder die fähig ist, bei der Temperatur ein Gas
zu erzeugen, bei der die Abbildung erfolgt (typischerweise bei der normalen
physiologischen Temperatur). Das Gas kann aus einer einzelnen Verbindung oder aus
einem Gemisch von Verbindungen bestehen. Geeignete Gase umfassen, sind
jedoch nicht beschränkt auf Fluor-enthaltende Gase, wie z. B. Schwefelhexafluorid,
Perfluorethan, Perfluorpropan, Perfluormethan und Perfluorbutan. Die Löslichkeit
eines Gases kann definiert werden, indem der Bunsen-Koeffizient des Gases von
Interesse bestimmt wird. Dieser Wert ist das Volumen des Gases, das durch eine
Volumeneinheit Lösungsmittel absorbiert wird (vgl. Wen, W.-Y., Muccitelli, J.A., J.
Sol. Chem. 8 (1979), 225-240). Ein Gas, das in der vorliegenden Erfindung
eingesetzt werden kann, sollte einen Bunsen-Koeffizienten in Wasser bei 25ºC von
weniger als 0,01 ml/ml Lösung aufweisen. In Tabelle 1 sind die Bunsen-Koeffizienten
von verschiedenen Gasen wiedergegeben.
Tabelle 1
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Eine weitere Eigenschaft des in den Mikrokügelchen enthaltenen Gases
besteht darin, daß die Diffusion des Gases bei 25ºC in Wasser weniger als 4 · 10&supmin;&sup5;
cm²/sec beträgt. Es sollte jedoch beachtet werden, daß die Diffusionskonstante in
unterschiedlichen Lösungsmitteln und bei unterschiedlichen Temperaturen
verschieden ist, um jedoch ein Gas auswählen zu können, sollte das Gas dieses
Kriterium erfüllen.
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Pharmakologisch verträglich bezieht sich auf die Eigenschaft, daß das
ausgewählte Gas biokompatibel sein muß und nur eine minimale Toxizität aufweisen
darf.
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Perfluorpropan ist bevorzugt, da es ein unlösliches Gas darstellt, das (1) bei
den Temperaturen der Herstellung und Verwendung nicht kondensiert, (2) keine
isomeren Formen besitzt, (3) Mikrokügelchen erzeugt, die eine ausgezeichnete
Widerstandsfähigkeit gegenüber Druck aufweisen, und (4) pharmakologisch verträglich
ist.
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Die Gas-Mikroblase wird durch eine Hülle aus einem filmbildenden Protein
eingekapselt. Der Begriff filmbildend bezieht sich auf die Fähigkeit des Proteins,
eine Hülle um das eingeschlossene Gas zu bilden, so daß bei der Insolubilisierung
des Proteins (bewirkt durch Hitze-Denaturierung) hydrophile Gruppen nach außen
und hydrophobe Gruppen nach innen angeordnet werden. Es ist erforderlich, daß
das Protein sowohl hydrophile als auch hydrophobe Aminosäuren aufweist.
Geeignete Proteine umfassen natürlich vorkommende Proteine, wie z. B. Albumin,
Gammaglobulin (menschliches), Apo-Transferrin (menschliches), β-Lactoglobulin und
Urease. Obwohl natürlich vorkommende Proteine bevorzugt sind, können auch
synthetische Proteine (homopolymere oder heteropolymere) eingesetzt werden, die
eine Tertiärstruktur zeigen und die gegenüber Hitze-Denaturierung empfindlich
sind. Besonders gut geeignet für die vorliegende Erfindung ist Albumin und
insbesondere menschliches Albumin. Das Protein liegt in der Lösung in einer
Konzentration im Bereich von etwa 0,1 bis 10% (Gew./Vol.), vorzugsweise etwa 1 bis 5%
(Gew./Vol.) und am stärksten bevorzugt etwa 1% (Gew./Vol.), vor.
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Proteine, die für die vorliegende Erfindung geeignet sind, oder die
resultierenden Mikrokügelchen können chemisch modifiziert werden, um bestimmte
Organe anzusteuern oder die immunogene Aktivität zu unterdrücken (z. B. Modifikation
mit Polyethylenglykol). Jedoch umfaßt die vorliegende Erfindung nicht den Zusatz
von chemischen Vernetzungsmitteln oder weitere Modifikationen an den Proteinen
zum Zweck der Erzeugung von Mikrokügelchen.
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Die Mikrokügelchen der vorliegenden Erfindung werden durch
Insolubilisierung von Anteilen eines Proteins in Lösung als Ergebnis einer Hohlraumbildung in
Gegenwart eines unlöslichen Gases und ohne Anwesenheit von Sauerstoff
hergestellt (d. h. in einem geschlossenen System, in dem die Verunreinigung mit Luft
vermieden wird). Eine solche Insolubilisierung von Protein ist hauptsächlich durch eine
lokale Denaturierung und Orientierung des Proteins um den Gaskern herum
gekennzeichnet, wobei das Letztere in Gegenwart des unlöslichen Gases verstärkt
sein kann.
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Das System, das zur Hitze-Insolubilisierung des Proteins zur Erzeugung der
erfindungsgemäßen Mikrokügelchen verwendet wird, muß anaerob, d. h. zur
Atmosphäre abgeschlossen sein, und es wird als ein "geschlossenes System"
bezeichnet. Im Vergleich dazu ist ein "offenes System" ein System, das zur Atmosphäre
offen ist. Das Gas, das in den in einem solchen geschlossenen System
hergestellten Mikrokügelchen eingeschlossen ist, enthält notwendigerweise nur das bei der
Herstellung verwendete unlösliche Gas. Eine Verunreinigung mit atmosphärischen
Gasen kann überwacht werden, indem das Vorliegen von O&sub2; in der Abluft des
Systems mit einer O&sub2; Elektrode gemessen wird. In der vorliegenden Erfindung werden
Mikrokügelchen hergestellt, die anfangs nur das bei der Erzeugung verwendete
Gas enthalten. Wenn jedoch der Gasgehalt experimentell bestimmt wird, ist
während des Verlaufs des Experimentes eine bestimmte Menge an Verunreinigung
durch die atmosphärischen Gase nicht zu vermeiden, wodurch eine gemessene
Menge des resultierenden Gases von weniger als 100% zustande kommt.
Demgemäß weisen Meßwerte von mehr als 85% Gas auf Mikrokügelchen hin, deren
anfänglicher Gasgehalt vollständig aus unlöslichem Gas bestand.
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Nach der Erzeugung der Mikrokügelchen sollte während des Verpackens der
Kontakt mit der Atmosphäre vermieden werden. Z. B. sollten die Mikrokügelchen
innerhalb von 5 bis 30 Sekunden nach dem Zeitpunkt, an dem sie das
geschlossene System verlassen, in Gläschen oder anderen luftdichten Gefäßen versiegelt
werden. Außerdem sollte während des Verpackens jeglicher Luftraum in den
Gläschen entfernt und durch das zur Erzeugung verwendete Gas ersetzt werden.
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Diese Protein-Mikrokügelchen, die mit einem unlöslichen Gas gefüllt sind,
zeigen eine bemerkenswerte Stabilität, wobei sie unversehrt bleiben, wenn sie in
einer Konzentration von etwa 1,0 · 10&sup9; Mikrokügelchen pro ml 40 psig (> 2000 mm
Hg, 2,76 bar) ausgesetzt werden. Die Mikrokügelchen zeigen außerdem in einer
verdünnten Suspension eine Elastizität, wobei sie unter einem Druck von 3 bis 10
psig (0,21 bis 0,69 bar) zusammengedrückt werden und nach Ablassen des Drucks
wieder zu ihrem ursprünglichen Volumen zurückkehren. Eine zusätzliche
chemische Vernetzung wäre nicht vorteilhaft, da die resultierenden Mikrokügelchen eine
zu starre Struktur aufweisen würden, um noch eine verbesserte Druckstabilität
zeigen zu können.
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Die Mikrokügelchen der vorliegenden Erfindung sind im Gegensatz zu freien
Mikroblasen widerstandsfähig gegenüber Koaleszenz und einer durch Diffusion
bewirkten Ausdehnung. Die unlösliches Gas enthaltenden Mikrokügelchen, die in
einer Luft- oder Sauerstoff-gesättigten Lösung bei verschiedenen Temperaturen
inkubiert werden, nehmen weder im durchschnittlichen Durchmesser noch im
Gesamtvolumen zu. Die Proteinhülle, die zwar elastisch ist, wenn sie einem Druck
ausgesetzt wird, ist doch stark genug, um einer Ausdehnung oder einem Zerreißen
durch Gasdiffusion oder -austausch standhalten zu können. Das Vorliegen der
Proteinhülle verhindert die Koaleszenz und hält das Gas bis zu mehrere Monaten
in kleinen einzelnen Blasen, ähnlich wie bei den mit Luft gefüllten Protein-
Mikrokügelchen. Die Unfähigkeit der mit unlöslichem Gas gefüllten Mikrokügelchen,
sich durch Austausch mit solvatisierten atmosphärischen Gasen auszudehnen, ist
eine neue Eigenschaft, die für die Verwendung dieses Materials als
Ultraschallmittel entscheidend ist.
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Protein-Mikrokügelchen, in die ein unlösliches Gas eingeschlossen ist, sind
bei Kontakt mit entgasten wäßrigen Lösungen widerstandsfähig gegenüber
Zusammenfallen. Im Gegensatz zu freien Mikroblasen oder zu mit Luft gefüllten
eingekapselten Mikrokügelchen können die mit einem unlöslichen Gas gefüllten
Mikrokügelchen zu Vakuum-entgastem Wasser zugefügt werden und bleiben auch bei
einer hohen Verdünnung unversehrt. Das mit Luft gefüllte Material fällt in Blut
zusammen, da die Sauerstoffkomponente der Gasphase ausläuft. Durch die Fähigkeit
der mit einem unlöslichen Gas gefüllten Mikrokügelchen, in einer teilweise
entga
sten Umgebung oder in einer Umgebung mit erhöhtem Druck widerstandsfähig
gegen ein Zusammenfallen zu sein, wird in vivo die Dauer eines Ultraschallkontrastes
beträchtlich erhöht.
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Die Mikrokügelchen der vorliegenden Erfindung werden durch
Hohlraumbildung mittels Ultraschall oder durch mechanische Hohlraumbildung erzeugt. Ein
Verfahren zur Herstellung mittels Ultraschall von Luft gefüllten Mikrokügelchen
wurde von Cerny beschrieben (USP 4 957 656).
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Die mechanische Hohlraumbildung ist ein Verfahren zur Herstellung der
neuen, mit einem unlöslichen Gas gefüllten Mikrokügelchen der vorliegenden
Erfindung. Es kann auch verwendet werden, um mit Luft gefüllte oder mit einem
löslichen Gas (z. B. N&sub2;, H&sub2;, Argon) gefüllte Mikrokügelchen herzustellen.
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In dem neuen Verfahren der mechanischen Hohlraumbildung der
vorliegenden Erfindung wird die wäßrige Lösung eines Hitze-denaturierbaren Proteins bei
einer Temperatur bereitgestellt, die erforderlich ist, um während der
anschließenden mechanischen Emulgierung der Lösung die die Denaturierung einleitende
Temperatur zu erreichen. Die Denaturierungstemperatur des Proteins in Lösung
liegt normalerweise im Bereich von 50 bis 100ºC. Sie kann aus Tabellen der
thermischen Proteindenaturierung in der Literatur ersehen oder experimentell durch ein
bekanntes Verfahren ermittelt werden. Z. B. kann eine Proteinlösung zur
experimentellen Bestimmung der Denaturierungstemperatur in einem Wasserbad unter
Rühren erhitzt werden. Die Denaturierungstemperatur ist die Temperatur, bei der
erstmals unlösliches Material festgestellt wird. Es ist zu beachten, daß die
Denaturierungstemperatur durch die Art, die Reinheit und die Quelle des Proteins, durch
die Konzentration des Proteins in der Lösung, durch den pH-Wert, den Puffer, die
Ionenstärke, die Anwesenheit von Stabilisatoren und die Anwesenheit von
chemischen Denaturiermittel oder Detergentien beeinflußt wird. Deshalb ist es
erforderlich, die Denaturierungstemperatur des Proteins in der Umgebung zu bestimmen, in
der es bei der Herstellung von Mikrokügelchen verwendet wird. Gewünschtenfalls
können Zusatzstoffe, wie Detergentien oder polare Lösungsmittel, eingesetzt
werden, um die Temperatur, bei der die Denaturierung erfolgt, zu verändern.
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In Tabelle 2 sind die Denaturierungstemperaturen von mehreren natürlich
vorkommenden Proteinen angegeben, die experimentell bestimmt wurden, wie
vorstehend beschrieben.
Tabelle 2
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* TRIS = 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol
-
** MES = 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure
-
*** DTT = Dithiothreit
-
In jeder Apparatur, die zur Scherung des Proteinlösung/Gas-Gemisches
verwendet wird, wird die Proteinlösung aufgrund der auf die Lösung ausgeübten
mechanischen Scherkräfte in einem bestimmten Ausmaß zusätzlich erhitzt. Diese
Hitze muß ausreichend groß sein, so daß sie eine lokale Denaturierung des Proteins
an der Gas-Flüssigkeits-Grenzfläche bewirkt. Deshalb ist es wichtig, das Ausmaß
des durch die Apparatur bewirkten Temperaturanstiegs zu bestimmen, so daß die
Temperatur, mit der die Proteinlösung in die Apparatur eingeführt wird, so
eingestellt werden kann, daß eine solche lokale thermische Denaturierung erreicht wird.
Insbesondere muß die Temperatur der gesamten Flüssigkeit in der Apparatur
unmittelbar vor der Hohlraumbildung mit der die Denaturierung einleitenden
Temperatur übereinstimmen. Das Ereignis der Hohlraumbildung erzeugt die zusätzliche
Hitze, die für die lokale Denaturierung des Proteins erforderlich ist. Die die
Denaturierung einleitende Temperatur ist als die Temperatur definiert, bei der das Protein
am Übergang zur Denaturierung steht, die Lösung jedoch noch kein denaturiertes
Protein enthält. Diese Temperatur liegt direkt unter, typischerweise 1 bis 5ºC unter
der Denaturierungstemperatur. Sofern erforderlich kann die
Protein-Ausgangslösung vor der Einführung in die Apparatur zuerst auf eine Temperatur erhitzt
werden, die das Erreichen der die Denaturierung einleitenden Temperatur ermöglicht.
-
Sobald die richtige Ausgangstemperatur der Proteinlösung erreicht ist, wird
die Lösung mit einem geeigneten Gas vereinigt, z. B. indem das Gas in die
Proteinlösung vor oder während des Emulgierschrittes mit einem Volumen-zu-Volumen-
Verhältnis im Bereich von etwa 5 bis 200% Gas: Flüssigkeit, vorzugsweise etwa 20
bis 100%, eingeführt wird. Das richtige Verhältnis von Gas: Flüssigkeit hängt ab von
der Bauform der Apparatur und den physikalischen Eigenschaften des Gases
(Löslichkeit, Dichte, Molekulargewicht usw.), und es kann so eingestellt werden, daß
der Ausstoß optimiert wird.
-
Sobald das Gas und die Proteinlösung vereinigt sind, wird das Gemisch
emulgiert und der Hohlraumbildung unter Bedingungen unterworfen, bei denen
Mikrokügelchen erzeugt werden. Dies wird durch Verwendung einer Apparatur
erreicht, in der eine mechanische Scherung und eine hydrodynamische
Hohlraumbildung erzeugt werden können, wie z. B. Hochgeschwindigkeitsmischer, Mühlen,
Fluidisierer und dergleichen. Eine bevorzugte Apparatur ist eine Kolloidmühle, die
definiert ist als "eine Maschine, die aus einem Hochgeschwindigkeitrotor und einem
Stator besteht, wobei die Dispersion oder Emulgierung durch die
entgegengesetzten Flächen bewirkt wird"; Advanced Filtration and Separation Technology, S. 108-
110. Beispiele von spezifischen Mahlapparaturen, die verwendet werden können,
sind die Folgenden:
-
Modell #2 1/2 - Bematek, Beverly, MA
-
Modell W250 V - Greerco, Hudson, NH
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Modell 2F - APV Gaulin, Everett, MA
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Modell L4R - Silverson, Chesham, UK
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Modell Polytron
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PT3000 - Kinematica, Littaw, Schweiz
-
Wenn zur Herstellung von mit einem unlöslichen Gas gefüllten
Mikrokügelchen die Kolloidmühlen verwendet werden, sollten sie zur Atmosphäre hin
abgeschlossen sein, so daß das Eindringen von Luft in das Gemisch verhindert wird.
-
Die Fig. 1 bis 3 zeigen weitere Einzelheiten von verschiedenen
Mühlenarten, die bei dem Verfahren der mechanischen Hohlraumbildung verwendet
werden können.
-
In Fig. 1 sind die wesentlichen Elemente einer Gaulin-Mühle dargestellt.
Diese sind: eine rotierende Welle (10), die mit einem Motor (nicht gezeigt) funktionell
verbunden ist; ein Scheibenrotor (12), der am Ende der Welle (10) fixiert ist; und ein
Stator (11). Der Stator (11) hat eine zentrale Bohrungs-Öffnung (18) und eine
Senkung (16), in der der Rotor aufgenommen wird. Bei dieser Mühle werden die
Proteinlösung und das Gas über ein "T-Stück" (15) in die Mühle eingeführt. Das
Proteinlösung/Gas-Gemisch emulgiert und kavitiert zwischen den Oberflächen von
Rotor und Stator. Der "Zwischenraum" in dieser Mühle ist der Raum zwischen der
Radialoberfläche (17) der Stator-Senkung und der entsprechenden äußeren
Radialoberfläche des Rotors. Die Temperatur des Mikrokügelchenproduktes wird an
der Lösung hinter dem Stator (11) gemessen (z. B. mit einem Thermoelement, nicht
dargestellt).
-
In Fig. 2 sind die wesentlichen Elemente einer Bematek-Mühle dargestellt.
Diese Mühle ähnelt in Aufbau und Funktion der Gaulin-Mühle von Fig. 1, wobei der
Hauptunterschied in der Bauform des Rotors und der Stator-Senkung besteht. Die
Mühle umfaßt eine rotierende Welle (20), die einen Rotor in Form eines
Kegelstumpfes (21) trägt, der ein gewendeltes bzw. mit einem Gewinde versehenes
Führungsende (22) aufweist, und einen Stator (23), der eine zentrale zylindrische
Öffnung (25) und eine Senkung in Form eines abgeschnittenes Kegels (24) besitzt, die
so geformt ist, daß sie den Rotor aufnehmen kann. Das Proteinlösung/Gas-
Gemisch wird in dieser Mühle über die Öffnung (25) eingegeben. Das Gas und die
Lösung werden gemischt, während sie die Wendelungen der Welle (22) passieren,
und das Gemisch wird emulgiert und Kavitation unterworfen, während es durch den
Zwischenraum der Mühle hindurchläuft. Der Zwischenraum ist definiert als der
Raum zwischen den kegelförmigen Oberflächen von Rotor und Stator.
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In Fig. 3 ist eine Silverson-Mühle dargestellt. Die Form dieser Mühle
unterscheidet sich deutlich von den Mühlen der Fig. 1 und 2. Die abgebildete
Silverson-Mühle besitzt eine rotierende Welle (30), auf der ein Schaufelradrotor (31)
angebracht ist. Der Rotor wird in einem becherförmigen, perforierten Sieb-Stator (32)
aufgenommen. Der Stator ist auf einem Gehäuse (33) montiert, das mit einem
Zulauf-Anschlußstück (34) verbunden ist. Das Zulauf-Anschlußstück (34) führt bis in
die Öffnung in der Mitte am Gehäuseboden des perforierten Sieb-Stators (32). Das
Gehäuse hat in der Mitte eine Öffnung (nicht dargestellt), die mit dem Zulauf-
Anschlußstück und mit einer Öffnung (ebenso nicht dargestellt) im Boden des
Stators kommuniziert. In dieser Mühle wird das Lösung/Gas-Gemisch über das Zulauf-
Anschlußstück in den Boden des Stators eingebracht, und die Emulgierung und
Kavitation erfolgen zwischen den flachen Oberflächen (35) des Radrotors und der
inneren zylindrischen Oberfläche des Stators. Der "Zwischenraum" dieser Mühle
kann als der Raum zwischen dem Rotor (31) und dem Stator (32) definiert werden,
wobei jedoch der Effekt der Zwischenraumgröße auf das Verfahren durch die
Größe der Perforationen (36) des Stators beeinflußt wird.
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Nachdem das Gemisch die Mühle durchlaufen hat, kann das Produkt
gekühlt, typischerweise auf 10 bis 20ºC, und entschäumt werden, indem man es
Absetzen läßt oder indem man biokompatible Antischaummittel zugibt, welche keinen
negativen Einfluß auf die Mikrokügelchen haben.
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Das Gemisch wird beim Durchlaufen einer solchen Mühle oder einer
entsprechenden Vorrichtung emulgiert und der Hohlraumbildung unterworfen, wodurch
Mikrokügelchen im Bereich von etwa 0,1 bis 10 um (mittlerer Durchmesser)
gebildet werden. Die Größe der Mikrokügelchen kann durch einen geeigneten
Partikelzähler bestimmt werden, z. B. einen Coulter Multisizer II (Coulter Electonics,
Hialeah, FI).
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Wenn eine der in den Fig. 1 bis 3 beschriebenen Mühlen verwendet
wird, sind die wichtigsten Parameter des Verfahrens, welche die Eigenschaften des
Mikrokügelchenproduktes (durchschnittliche Größe, Größenverteilung und
Konzentration der Mikrokügelchen) beeinflussen, die Rotorgeschwindigkeit, die
Zwischenraumgröße und das Verhältnis von Gas zu Flüssigkeit. Diese Parameter
werden empirisch eingestellt, so daß ein Produkt mit den gewünschten Eigenschaften
entsteht. Für ein bestimmtes Produkt werden die Eigenschaften in der Klinik
definiert. Z. B. können Perfluorpropan-Mikrokügelchen, die für Myokardperfusionen
eingesetzt werden, die folgenden Daten aufweisen: durchschnittliche Größe, 4 um;
Größenverteilung, 90% unter 10 um; Konzentration, 7 · 10&sup8; bis 2 · 10&sup9;
Mikrokügelchen/ml.
-
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert. Diese
Beispiele sollen die Erfindung in keiner Weise einschränken.
BEISPIEL 1
Überwachung der Temperatur und Steuerung eines Verfahrens der mechanischen
Hohlraumbildung für menschliches Serumalbumin
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Wie vorstehend beschrieben wird die Proteinlösung, bevor sie den Prozess
durchläuft, erwärmt, so daß die Prozesstemperatur die Temperatur erreicht, welche
die Denaturierung einleitet, und auf dieser Temperatur bleibt.
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Ein typisches Verfahren für die Praxis sieht folgendermaßen aus:
-
Eine Bematek-Kolloidmühle, Modell 1 1/2" (Fig. 2; Bematek Systems,
Beverly, MA), wurde mit Anschlüssen versehen, so daß die Einlaßöffnung mit einem
Wärmeaustauscher verbunden war. Für die beweglichen Verbindungen zwischen
den Schlauchansätzen des Wärmeaustauschers wurden Gas-undurchlässige
Schläuche verwendet.
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Die Auslaßöffnung des Apparaturkopfes wurde mit einem nachgeschalteten
Kühler aus rostfreiem Stahl verbunden.
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Die Temperatur der Lösung wurde an drei Stellen überwacht (T1, T2 und T3).
Das Thermoelement T1 wurde an einem Swagelok-T-Stück zwischen dem
Wärmeaustauscher zum Vorwärmen und dem Kopf der Mühle angebracht, so daß die
Einlauftemperatur der Proteinlösung gemessen werden konnte. Außerdem wurde an
der Einlaßöffnung ein zweites "T"-Stück zur Einführung von Gas eingebaut. Das
Thermoelement T2 wurde innerhalb des Auslaufs des Apparaturkopfes plaziert,
etwa 1 cm vom Rotor und 2 cm von der Welle entfernt, so daß die Temperatur des
Prozesses genau gemessen werden konnte. Auf diese Weise können die zwei
Temperaturen, die Einlaßtemperatur (T1) und die Prozesstemperatur (T2), unabhängig
voneinander gemessen und miteinander verglichen werden, so daß bestimmt
werden kann, wie stark die Lösung während des Ablauf des Prozesses erwärmt wird.
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Für dieses Beispiel wurde USP-Albumin mit normaler Kochsalzlösung
verdünnt, so daß eine 1% (Gew./Vol.) Lösung hergestellt wurde. Die
Denaturierungstemperatur wurde wie beschrieben experimentell bestimmt, sie betrug 78ºC. Die
Lösung wurde nach Entgasen in die Mühle mit 200 ml/min zusammen mit
Perfluorpropan mit 100 ml/min (50% (Vol./Vol.) eingespeist. Zwischen T1 und T2 wurden
Unterschiede von 10 bis 15ºC festgestellt. Um eine Prozesstemperatur von 77ºC
(1ºC unter der Denaturierungstemperatur) zu erhalten, wurde die Einlauftemperatur
auf einen Bereich von 62 bis 67ºC eingestellt. Da das Ausmaß der erzeugten
Wärme bei unterschiedlichen Parametern des Mahlvorgangs verschieden ist, ist es
erforderlich, den Unterschied zwischen T1 und T2 bei jeder Änderung von
Parametern des Mahlvorgangs (z. B. Auswahl der Mühle, Einstellungen der Mühle,
Durchflußgeschwindigkeit, Gas/Flüssigkeits-Verhältnis usw.) zu bestimmen, so daß die
gewünschte Prozesstemperatur erreicht und damit verhindert werden kann, daß
während der erfolgreichen Einkapselung der Gas-Mikroblasen mit einer dünnen
Hülle von denaturiertem Protein eine Denaturierung des Proteins insgesamt
stattfindet. Außerdem wurde die Temperatur beim Kühler am Auslauf (T3) überwacht,
wobei die besten Ergebnisse erhalten werden, wenn sie 20ºC beträgt.
BEISPIEL 2
Verfahren der mechanischen Hohlraumbildung zur Herstellung von
Mikrokügelchen, die unterschiedliche Gase enthalten
-
Mikrokügelchen, die verschiedene Gase enthalten, wurden folgendermaßen
hergestellt: Eine 5% Lösung von menschlichem Albumin (USP) wurde unter
kontinuierlichem Vakuum zwei Stunden entlüftet. Das Vakuum wurde aufgehoben,
indem das evakuierte Gefäß mit dem Gas von Interesse gefüllt wurde. Die
verwendeten unlöslichen Gase umfassen Schwefelhexafluorid, Perfluorethan und
Perfluorpropan. Außerdem wurden Mikrokügelchen hergestellt, die löslichere Gase,
Luft, Stickstoff, Sauerstoff und Argon enthielten. Die Verwendung von Argon
verkörperte ein Gas mit einem hohen Molekulargewicht, das jedoch relativ gut löslich
ist. Die Albuminlösung wurde mit einem integrierten Wärmeaustauscher auf 68ºC
eingestellt und mit 100 ml/min in eine Kolloidmühle von 2 1/2" (63,5 mm) (Greerco,
Hudson, NH, Modell W250 V, oder AF Gaulin, Everett, MA, Modell 2F) gepumpt.
Das spezifische Gas wurde direkt stromaufwärts der Einlaßöffnung bei
Raumtemperatur zu der einströmenden Flüssigkeit mit einer Fließgeschwindigkeit von 120
bis 220 ml/min zugegeben. Der Zwischenraum zwischen dem Rotor und dem Stator
wurde auf 2/1000tel Inch (0,005 cm) eingestellt und die Albuminlösung
kontinuierlich bei etwa 7000 UpM mit einer Prozesstemperatur von 73ºC vermahlen.
-
Die auf diese Weise erzeugte dichte weiße Lösung von Mikrokügelchen
wurde unmittelbar danach durch einen Wärmeaustauscher auf eine Temperatur
von 10ºC abgekühlt und in Glasgefäßen aufgefangen. Die Gläschen wurden sofort
versiegelt. Das Material wurde unter Verwendung eines Coulter-Counters auf
Konzentration und Größenverteilung untersucht. Die Ergebnisse sind in der
nachstehenden Tabelle 3 dargestellt.
Tabelle 3
BEISPIEL 3
Wirkung von Rotorgeschwindigkeit und Zwischenraumgröße
-
Eine 1% Albuminlösung (200 ml/min) wurde mit Perfluorpropan (100 ml/min)
bei einem Gas/Flüssigkeits-Verhältnis von 50% (Vol./Vol.) vereinigt.
Mikrokügelchen wurden gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt, wobei
unterschiedliche Rotorgeschwindigkeiten und Zwischenraumgrößen eingesetzt
wurden. Die erhaltenen Werte sind in Tabelle 4 dargestellt.
Tabelle 4
-
Diese Ergebnisse zeigen, daß mit steigender Rotorgeschwindigkeit die
Konzentration zunimmt und die durchschnittliche Größe abnimmt, während eine
Vergrößerung des Zwischenraums die Konzentration herabsetzt.
BEISPIEL 4
Wirkung des Gas/Flüssigkeits-Verhältnisses
-
Eine 0,5% Albuminlösung (100 ml/min) wurde mit Perfluorpropan bei 20, 50,
70 oder 100 ml/min (Gas/Flüssigkeits-Verhältnis 20, 50, 70 oder 100%, Vol./Vol.)
vereinigt, wobei eine Gaulin-Mühle mit einem Zwischenraum von ungefähr 0,012
und eine Rotorgeschwindigkeit von 9950 ft/min (50,5 m/sec) verwendet wurden. Die
erhaltenen Werte sind in Tabelle 5 dargestellt.
Tabelle 5
-
Diese Ergebnisse zeigen, daß sowohl die Konzentration als auch die
durchschnittliche Größe mit einem Anstieg des Gas/Flüssigkeits-Verhältnisses zunehmen.
BEISPIEL 5
Verfahren zur Herstellung von mit unlöslichem Gas gefüllten Mikrokügelchen durch
Hohlraumbildung mittels Ultraschall
-
Mit Luft, Schwefelhexafluorid und Perfluorethan gefüllte Mikrokügelchen
wurden sowohl durch Verfahren der Hohlraumbildung mittels Ultraschall in einem
Gesamtansatz als auch durch entsprechende kontinuierliche Verfahren hergestellt.
Eine 5% Lösung von menschlichem Albumin (USP) wurde unter Vakuum entgast
und unter dem spezifischen Gas aufbewahrt. Das Verfahren der kontinuierlichen
Hohlraumbildung wurde durchgeführt, wie von Cerny beschrieben (USP 4 957 656),
wobei anstelle von Luft das unlösliche Gas eingesetzt wurde. Das Verfahren in
einem Gesamtansatz wurde durchgeführt, indem ein 3/4" (1,9 mm)-Horn für Prozesse
in Flüssigkeiten (Sonics and Materials, Danbury, CT) eingesetzt wurde. Das Gas
wurde durch das Horn und in die Albuminlösung geleitet, so daß während des
gesamten Prozesses Luft ausgeschlossen war. Das Albumin wurde auf 73ºC erwärmt
und fünf Sekunden bei 20 kHz mit 60-um-Doppelamplitude beschallt, wobei ein
Piezowandler und eine Energiequelle von Branson (Branson Ultrasonics, Danbury,
CT) eingesetzt wurden. Das Produkt wurde sofort in ein Glasgefäß überführt und
unter Gas versiegelt.
-
Das Produkt bestand aus einer dicken milchigen Suspension von
Mikrokügelchen in Konzentrationen von 1,4 · 10&sup8; bis 1,0 · 10&sup9; Mikrokügelchen/ml mit einer
durchschnittlichen Größe von 2,5 bis 3,3 um.
BEISPIEL 6
Mikroskopische Untersuchung der Mikrokügelchen
-
Albumin-Mikrokügelchen, die verschiedene Gase enthielten, wurden
hergestellt, wie in Beispiel 2 oder 5 beschrieben. Die mikroskopische Untersuchung der
Produkte zeigte eine monodisperse Suspension von kugelförmigen
Mikrokügelchen. Die Mikrokügelchen wurden zum Zusammenfallen gebracht, indem sie in
einer Spritze so lange einem hohen Druck ausgesetzt wurden, bis sich die
Suspension aufklärte. In allen Fällen zeigte sich bei der erneuten mikroskopischen
Untersuchung, daß durchsichtige membranartige Hüllen der zusammengefallenen
Mikrokügelchen vorlagen.
BEISPIEL 7
Widerstandsfähigkeit gegenüber Druck der Mikrokügelchen
-
Albumin-Mikrokügelchen, die verschiedene Gase enthielten, wurden
hergestellt, wie in Beispiel 2 beschrieben. 10 ml von jeder Suspension wurden in eine
gasdichte 10-ml-Glasspritze (Hamilton, Reno, NV) gefüllt, die mit einem
Druckmessgerät verbunden war. Jeglicher Luftraum wurde entfernt und die Apparatur
versiegelt. Ein konstanter Druck von 40 psig (2,76 bar) wurde für drei Minuten
angelegt. Anschließend wurde ein Coulter Counter verwendet, um die
Partikelkonzenetration und -verteilung in der Probe zu messen. Die Vergleiche der Werte vor
und nach dem Anlegen des Drucks (Fig. 4a bis 4e) zeigten eine relative
Widerstandsfähigkeit der mit einem unlöslichen Gas gefüllten Mikrokügelchen gegenüber
40 psig (2,76 bar).
BEISPIEL 8
Widerstandsfähigkeit gegenüber Druck von verdünnten Suspensionen der
Mikrokügelchen
-
Mikrokügelchen, die verschiedene Gase enthielten, wurden hergestellt, wie
in Beispiel 2 beschrieben. Jede Probe von Mikrokügelchen wurde auf ein gleiches
Volumen von eingekapseltem Gas pro ml Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung
(0,15 M) verdünnt, etwa auf eine Verdünnung von 1 : 60. Die verdünnte Suspension
wurde anhaltenden statischen Drücken von 0,5 psig (0,035 bar) bis 7,5 psig (0,52
bar) in einem versiegelten Gefäß mit entsprechendem Luftraum unterworfen. Fig.
5 zeigt die Wirkung des Drucks auf die Konzentration der Mikrokügelchen.
Mikrokügelchen, die die unlöslichen Gase Perfluorpropan, Perfluorethan und
Schwefelhexafluorid enthalten, sind viel widerstandsfähiger gegenüber Druck als mit Luft
oder mit dem hochmolekularen Argon gefüllte Mikrokügelchen der gleichen
Kon
zentration und Größenverteilung (Fig. 6). Die physiologischen Drücke im
Blutstrom reichen von einem peripheren Venendruck von 1,5 psig (0,10 bar) bis zu 2,5
psig (0,17 bar) in der Myokardwand.
BEISPIEL 9
Wirkung von entgastem Puffer auf die Mikrokügelchen
-
Albumin-Mikrokügelchen, die verschiedene Gase enthielten, wurden
hergestellt, wie in Beispiel 2 beschrieben. Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)
wurde direkt vor der Verwendung durch Kochen entgast. Aliquots des heißen
Puffers von 0,05 ml bis 1,5 ml wurden in 13 · 100 Teströhrchen gegeben und eine
Minute bei Raumtemperatur in einem Wasserbad zu Abkühlen stehengelassen. Zu
jedem Röhrchen wurde ein konstantes Volumen von Mikrokügelchen zugegeben.
Nach dem Mischen wurde das Endvolumen mit PBS auf 3,0 ml gebracht und die
Konzentration der Mikrokügelchen bestimmt. Fig. 7 zeigt, daß die Mikrokügelchen,
die die unlöslichen Gase Perfluorpropan, Perfluorethan und Schwefelhexafluorid
enthalten, in entgasten Lösungen besser bestehen bleiben.
-
Die Luft, Schwefelhexafluorid oder Perfluorethan enthaltenden
Mikrokügelchen wurden in Vollblut verdünnt. Die mit Luft gefüllten Mikrokügelchen fielen
zusammen. Bei den mit einem unlöslichen Gas gefüllten Mikrokügelchen wurde
gezeigt, daß sie die Verdünnung in frischem Vollblut überstanden.
BEISPIEL 10
Elastizität
-
Mikrokügelchen, die mit verschiedenen Gase hergestellt wurden, wurden
erzeugt, wie in Beispiel 2 beschrieben. Die Mikrokügelchen wurden in
Phosphatgepufferter Kochsalzlösung verdünnt, wie in Beispiel 8 beschrieben, und in eine
durchsichtige Zelle gebracht, die sich auf dem Objekttisch eines Mikroskops
befand. Die Zelle war mit einer Stickstoffquelle verbunden, so daß es möglich war, die
Effekte eines raschen Anlegens und Ablassens von physiologischen Drücken auf
die Mikrokügelchen zu beobachten.
-
Das Anlegen von 1,5 psig (0,10 bar) oder mehr an die ein lösliches Gas
enthaltenden Mikrokügelchen führte dazu, daß das vollständige Verschwinden von
kugelförmigen Körpern beobachtet wurde. Die Mikrokügelchen nahmen nach
Ablassen des Drucks ihre Form nicht wieder ein, dies weist auf eine irreversible
Zerstörung hin. Das Anlegen von weniger als 1,5 psig (0,10 bar) führte zur Verformung
und Schrumpfung der Hülle, wobei die Mikrokügelchen nicht vollständig
verschwanden. Wenn der angelegte Druck wieder abgelassen wurde, konnte die
kugelförmige Erscheinung oder Population nicht wiederhergestellt werden.
-
Das Anlegen eines Drucks von bis zu mehreren psig an eine Suspension von
Mikrokügelchen, die die unlöslichen Perfluorkohlenstoff-Gase enthielten, führte
da
zu, daß der Durchmesser der Mikrokügelchen abnahm. Der Durchmesser der
Mikrokügelchen ging bei Ablassen des Drucks wieder auf die ursprüngliche Größe zurück.
-
Auch die mit Schwefelhexafluorid gefüllten Mikrokügelchen zeigten im
Vergleich zu Luft gefüllten Mikrokügelchen bei angelegtem physiologischem Druck
eine erhöhte Elastizität, jedoch war die Elastizität geringer als bei den
Perfluorkohlenstoff-enthaltenden Mikrokügelchen.
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Diese Beobachtungen machen deutlich, daß die unlösliche Gase
enthaltenden Mikrokügelchen nicht nur widerstandsfähig gegenüber Druck waren, sondern
daß sie sich nach Ablassen des Drucks wieder erholten. Dies weist auf eine
elastische Proteinhülle hin.
EINGESETZTE VERFAHREN
A) Manuelle Beschallung: Offenes System (äquivalent zu EPA 554 213,
einstufiges Verfahren)
-
Das in dem US-Patent Nr. 4 844 882 und in der Europäischen
Patentanmeldung Nr. 554 213 beschriebene Verfahren wurde für die Herstellung der
Mikrokügelchen folgendermaßen eingesetzt:
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Ein 20 ml-fassender Spritzenzylinder wurde mit einem durch die Spitze
eingefügten T-Typ-Thermoelement verbunden und auf einem Ständer befestigt. Die
Spritze wurde bis zur 16-ml-Markierung mit 5% menschlichem Serumalbumin des
Schweizer Roten Kreuzes gefüllt. Gas (Perfluorpropan (C&sub3;F&sub8;) oder
Schwefelhexafluorid (SF&sub6;)) wurde oben in den Spritzenzylinder eingespeist und strömte über die
Oberfläche der Flüssigkeit. Ein Beschallungshorn wurde zur 10 ml-Markierung unter
die Oberfläche der Lösung abgesenkt und so lange bei 50% Leistung
laufengelassen, bis die Temperatur der Lösung auf 72,8 bis 73ºC angestiegen war; dies
erfolgte in etwa einer Minute. Das Horn wurde unmittelbar danach zum Meniskus ± 1
mm zurückgezogen und die Leistungsstufe auf 65% erhöht. Die Beschallung wurde
weitere fünf Sekunden fortgesetzt, wobei die Temperatur noch um 1,2 bis 2ºC
anstieg. Das Produkt wurde in ein Glasgefäß bis zum Fassungsvermögen
eingegossen und versiegelt.
B) Kontinuierliche Beschallung: Geschlossenes System
-
Das im US-Patent Nr. 4 957 656 beschriebene Verfahren wurde zur
Herstellung von mit Perfluorpropan und mit Schwefelhexafluorid gefüllten
Mikrokügelchen wie folgt eingesetzt:
-
Menschliches Serumalbumin wurde mit steriler Kochsalzlösung auf eine
Lösung von 1% (Gew./Vol.) verdünnt. Die Lösung wurde auf die die Denaturierung
einleitende Temperatur, etwa 76ºC, erhitzt. Das System wurde gegen die äußere
Atmosphäre abgeschlossen und Perfluorpropan- oder Schwefelhexafluorid-Gas
anstelle von Luft in den Flüssigkeitsstrom (1 : 1) eingeführt. Das Produkt wurde
kon
tinuierlich erzeugt, indem das Gas/Albumin-Gemisch am Beschallungshorn mit
etwa 100 ml Flüssigkeit pro Minute vorbeigeleitet wurde. Das Produkt wurde beim
Ausfluß aus der Beschallungskammer mittels Durchlaufen eines
Wärmeaustauschers abgekühlt und insgesamt als flüssige Suspension von Mikrokügelchen
gewonnen. Die Bedingungen der Bearbeitung und Lagerung waren genauso wie bei
den manuell hergestellten Mikrokügelchen.
C) Mechanische Hohlraumbildung: Geschlossenes System
-
Albumin-Mikrokügelchen, die Perfluorpropan- oder Schwefelhexafluorid-Gas
enthielten, wurden auch in einem geschlossenen System hergestellt, indem ein
Gemisch aus 1% menschlichem Serumalbumin und Gas vermahlen wurde, ähnlich
wie in Beispiel 2 beschrieben. Die Albuminlösung, die auf eine Temperatur erhitzt
wurde, die ausreichend war, um die Herstellung von Mikrokügelchen durch
mechanische Hohlraumbildung in einer bestimmten Mühle zu ermöglichen, wurde mit dem
Gas im Verhältnis 1 : 1 (Vol./Vol.) gemischt und in eine Kolloidmühle eingeführt. Die
Durchflußgeschwindigkeit der Flüssigkeit war abhängig von der Kapazität oder der
Größe der Mühle und betrug typischerweise 100 bis 500 ml/min. Für diese
Untersuchung wurden eine Silverson L4R-Mühle und eine Bematek-Kolloidmühle von 3"
(76,2 mm) eingesetzt. Der Ausfluß aus der Mühle wurde mittels Durchlaufen eines
Wärmeaustauschersystems gekühlt und die resultierende Suspension von
Albumin-Mikrokügelchen im Ganzen gewonnen. Das Produkt wurde wie bei den
anderen Verfahren in Glasgefäße gefüllt.
ANALYTISCHE VERFAHREN
A) Populationsdynamik
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Die Populationsdynamik wurde mit einem Coulter Multisizer II mit einer
Öffnung von 50 um ermittelt. Die Albumin-Mikrokügelchen, die hergestellt wurden, wie
in EINGESETZTE VERFAHREN beschrieben, wurden in Isoton 1 : 10 000 verdünnt
und eine 500-ul-Probe davon analysiert. Die Konzentration, die durchschnittliche
Größe und das eingekapselte Gasvolumen pro ml der ursprünglichen
Mikrokügelchen-Suspension wurden bestimmt.
B) Gasgehalt
-
Der prozentuale Anteil von eingeschlossenem Perfluorpropan wurde bei
Mikrokügelchen-Chargen in doppelter Ausführung, die hergestellt wurden, wie in
EINGESETZTE VERFAHREN beschrieben, durch Gaschromatographie auf einem
Hewlett Packard 5890 bestimmt. Eine Probe der Mikrokügelchen-Suspension
wurde in einer gasdichten Spritze aufgenommen. Das Gas wurde aus den
Mikrokügelchen freigesetzt, indem ein Antischaummittel in Ethanol verwendet wurde, und das
eingeschlossene Gas wurde durch die thermische Leitfähigkeit bestimmt.
C) Widerstandsfähigkeit gegenüber Druck
-
Die Widerstandsfähigkeit gegenüber Druck von Albumin-Mikrokügelchen
wurde durch ein ähnliches Verfahren bestimmt, wie das Verfahren, das von
Sintetica in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 554 213 beschrieben wird. Die
Mikrokügelchen wurden in einer entlüfteten Phosphat-gepufferten Kochsalzlösung bis zu
etwa 1 Extinktions-Einheit bei 600 nm in einer 3 ml-Druckküvette verdünnt. Der
Hals wurde mit einer Druckquelle verbunden und die Küvette in ein
Spektrophotometer mit Aufzeichnungsfunktion gestellt. Der Druck in der Küvette wurde innerhalb
von 150 Sekunden linear von 0 auf 5 oder 10 psig (0,35 bis 0,69 bar) erhöht,
anschließend wurde der Druck abgelassen. Der Druckanstieg wurde durch ein
dosierendes Magnetventil (Honeywell) und einen Druck-Transducer (Omega) erzeugt,
die zwischen eine Druckquelle von 20 psig (1,38 bar) (N2 Tank) und ein 5-I-
Reservoir aus rostfreiem Stahl geschaltet waren. Die Küvette war mit dem
Stahlreservoir über ein digitales Druckmeßgerät verbunden. Ein PC-ähnlicher Computer,
der mit einer Analog-Digital-Wandler- und einer Digital-Analog-Wandler-Karte
(National Instruments) ausgestattet war, steuerte die Öffnung des Ventils und las den
Druck-Transducer aus. Das Reservoir und die Küvette wurden mit einer
ausgewählten Rate solange unter Druck gesetzt, bis der gewünschte Druck erreicht war.
Die optische Dichte der Mikrokügelchen-Suspension wurde als Funktion von Zeit
und Druck überwacht. Die Werte wurden um die natürliche Flotationsrate von
Mikrokügelchen in der Küvette korrigiert.
ERGEBNISSE
A) Populationsdynamik
-
Albumin-Mikrokügelchen, die durch die Verfahren der manuellen
Beschallung, kontinuierlichen Beschallung und mechanischen Hohlraumbildung erzeugt
wurden, wurden innerhalb von 24 Stunden nach der Herstellung auf Konzentration,
durchschnittliche Größe, eingekapseltes Gasvolumen und Größenverteilung
untersucht. Alle Messungen erfolgten in mindestens doppelter Ausführung und sind als
durchschnittliche Werte wiedergegeben. Die Ergebnisse dieser Meßwerte sind in
Tabelle 6 dargestellt.
Tabelle 6
-
Die durch alle Verfahren produzierten Mikrokügelchen waren für die Dauer
dieser Studie, mindestens mehrere Wochen, bei 4ºC stabil.
B) Gasgehalt
-
Die Analysen der Zusammensetzung des eingeschlossenen Perfluorpropan-
Gases in doppelten Chargen von Mikrokügelchen sind in Tabelle 7 dargestellt.
Tabelle 7
-
Verfahren* % C&sub3;F&sub8;
-
Manuelle Beschallung 70,0
-
Kontinuierliche Beschallung 89,5
-
Mechanische Hohlraumbildung 95,5
-
* Durchschnittliche Ergebnisse von Chargen in doppelter Ausführung
-
Diese Ergebnisse zeigen, daß in den Mikrokügelchen, die in dem offenen
System durch mechanische Beschallung hergestellt wurden, viel weniger des zur
Bildung der Mikrokügelchen eingesetzten Gases eingekapselt war als in den in
ge
schlossenen Systemen erzeugten Mikrokügelchen (durch kontinuierliche
Beschallung und mechanische Hohlraumbildung). Die in dem geschlossenen System
hergestellten Mikrokügelchen wurden in Abwesenheit von Sauerstoff erzeugt, dies
wurde durch eine Sauerstoffelektrode bestimmt. Die durch alle drei Verfahren
hergestellten Mikrokügelchen wurden während der Bearbeitung und
Probenzubereitung in gleichem Ausmaß der Atmosphäre ausgesetzt (was dafür verantwortlich ist,
daß in den Mikrokügelchen, die durch die zwei Verfahren im geschlossenen
Systemen hergestellt wurden, weniger als 100% Perfluorpropan-Gas gemessen
wurde), somit war es der während der Herstellung in dem offenen System vorliegende
Sauerstoff (und andere atmosphärischen Gase), der die Effizienz der Gas-
Einkapselung verminderte.
C) Widerstandsfähigkeit gegenüber Druck
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Die optische Dichte einer Suspension von Gas gefüllten Mikrokügelchen
wird mit steigendem Druck abnehmen, dies beruht auf einer Abnahme der Größe
und einer damit zusammenhängenden Änderung der Fläche der Oberfläche. Die
Schrumpfung beruht auf zwei Faktoren: einer reversiblen Komprimierung gemäß
den Gasgesetzen und einem irreversiblen Verlust des Gaskerns an die umgebende
Flüssigkeit aufgrund einer gesteigerten Löslichkeit gemäß dem Gesetz von Henry.
Beim Ablassen des angelegten Drucks wird nur diejenige Fraktion
wiederhergestellt, bei der der Volumenverlust auf Komprimierung beruht, dies kann durch eine
Zunahme der optischen Dichte festgestellt werden. Das eingeschlossene Gas, das
an die umgebende Lösung verloren geht, kann beim Ablassen des Drucks nicht
wieder in die Mikrokügelchen eintreten, sondern es verschwindet im Luftraum über
der Lösung.
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Fig. 8 zeigt das Ergebnis, wenn ein linearer Druckgradient bis zu 10 psi
(0,69 bar) an 1-OD-Suspensionen von Albumin-Mikrokügelchen angelegt wird, die
mit Perfluorpropan-Gas durch das Verfahren der manuellen Beschallung (offenes
System) und durch die Verfahren der kontinuierlichen Beschallung und der
mechanischen Hohlraumbildung (geschlossenes System) hergestellt wurden. Die beiden
Verfahren in geschlossenen Systemen ergaben Mikrokügelchen, die bei erhöhtem
Druck eine Komprimierung zeigten, bei denen beim Ablassen des Drucks am Ende
des Gradienten das Volumen vollständig wiederherstellt wurde. Es wurde kein
Verlust von eingeschlossenem Gas an die umgebende Lösung festgestellt. Die in
dem offenen System (Verfahren mit manueller Beschallung) hergestellten Albumin-
Mikrokügelchen zeigten bei dem angelegten Druck eine stärkere Komprimierung,
und beim Ablassen des Drucks erfolgte nur zum Teil eine Wiederherstellung des
Volumens, dies beruhte auf dem irreversiblen Verlust des Gaskerns, welcher zu
einer 40%igen Zerstörung der Mikrokügelchen führte.