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Technisches Gebiet
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Diese Erfindung betrifft Verfahren
zur Herstellung von bildgebenden Mitteln für Ultraschall, die aus proteinhaltigen
Mikrokügelchen,
die Gase verkapseln, zusammengesetzt sind.
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Hintergrund
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Diagnostische Ultraschall-Bildzeugung
basiert auf dem Prinzip, dass Wellen von Schallenergie auf einen
Bereich von Interesse fokussiert und in solch einer Art und Weise
reflektiert werden können,
dass sie ein Bild davon erzeugen. Ein Ultraschallscanner wird auf
einer Körperoberfläche, die über dem
abzubildenden Bereich liegt, plaziert, und Ultraschallenergie in
Form von Schallwellen wird auf diesen Bereich gerichtet. Der Scanner
detektiert reflektierte Schallwellen und übersetzt die Daten in Videobilder.
Wenn Ultraschallenergie durch eine Substanz gesendet wird, hängt die
Menge an reflektierter Energie von der Geschwindigkeit der Übertragung
und den akustischen Eigenschaften der Substanz ab. Veränderungen
in den akustischen Eigenschaften der Substanz (z. B. Veränderungen
der akustischen Impedanz) treten hauptsächlich an Grenzschichten verschiedener
akustischer Dichten, wie Flüssigkeit-Feststoff
oder Flüssigkeit-Gas,
auf. Deshalb erzeugen Organstrukturen Schallreflexionssignale zur
Detektion mit dem Ultraschallscanner, wenn Ultraschallenergie durch
Gewebe geleitet wird. Diese Signale können durch die geeignete Verwendung
eines Kontrastmittels verstärkt
werden.
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Bildgebende Mittel für Ultraschall
von spezieller Bedeutung nutzen die Verwendung von Gas wegen seiner
Wirksamkeit als Ultraschallreflektor. Resonanz-Gasblasen streuen
Schall tausend mal wirksamer als ein festes Teilchen der gleichen
Größe. Ophir
und Parker beschreiben zwei Arten von gasenthaltenden bildgebenden
Mitteln, als da sind: (1) freie Luftblasen und (2) verkapselte Luftblasen
(Ultrasound in Medicine and Biology 15 (4) (1989), 319–333). Allerdings
sind freie Gasblasen der geeigneten Größe zu kurzlebig, um für die meisten
in vivo-Anwendungen wirksam zu sein (Meltzer et al., Ultrasound
in Medicine and Biology 6 (1980), 263–269). Ophir und Parker weisen
darauf hin, dass die Entwicklung von verkapselten Gasblasen ein
Versuch war, dieses Problem zu lösen.
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Die zweite Hauptklasse von gasenthaltenden
Ultraschallkontrastmitteln, die von Ophir und Parker beschrieben
werden, sind die verkapselten Mikrobläschen, nachstehend als „Mikrokügelchen"
bezeichnet. Die Gasblase ist von einer Hülle umgeben, die aus einem
Protein oder anderem bioverträglichem
Material besteht. Ein gebräuchliches,
im Handel erhältliches
Mikrokügelchen-Kontrastmittel
ist ALBUNEX® (Molecular
Biosystems, Inc., San Diego, CA), das aus mit Humanserumalbumin
verkapselten Luft-Mikrokügelchen
besteht. Siehe U.S.-Patent Nrn. 4,572,203 und 4,844,882.
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Es zeigt sich, dass Luft-Mikrokügelchen
schnell an Echofähigkeit
verlieren, wenn sie Drücken
von 150 mm Hg, wie man ihnen während
der Injektion und Zirkulation in vivo begegnen würde, ausgesetzt werden (N. deJong
et al., Ultrasound Med. Biol. 19 (1993), 279–288). Die derzeitige Verkapselungstechnologie
hat noch ein als Ultraschallkontrastmittel geeignetes Material herzustellen,
dass in vivo für
die meisten gewünschten
Anwendungen lange genug überlebt.
Tatsächlich
muss ein Mittel, dass die Herzmuskelwand abzubilden vermag, vorübergehenden
Druckpulsen von mindestens 250 mm Hg (etwa 5 psig) widerstehen.
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Im Bemühen, das Druckinstabilitätsproblem
von Mikrokügelchen
zu lösen,
haben sich jüngste
Lehren darauf konzentriert, die Hülle zu verbessern, da man glaubt,
dass die Hüllen
oder – „membranen"
von Mikrokügelchen
unter Druck zu zerbrechlich oder spröde sind, was in vivo zu einem
schnellen Zusammenbruch führt.
Giddey (PCT/EP91/01706; PCT 92/05806) erklärte „Wegen ihrer Starrheit können die
Membranen plötzlichen
Druckänderungen,
denen die Mikrokügelchen
zum Beispiel während
ihrer Reise durch den Blutstrom ausgesetzt sein können, wobei
diese Druckänderungen
von Herzschlägen
herrühren,
nicht standhalten." Um die Starrheit der Hülle zu überwinden, schlug er vor, Luft
in einer Proteinlösung,
die einen großen
Prozentsatz eines Verdickungsmittels (40% – 80% Polyole) enthält, vorzuemulgieren
und sie mechanischer Scherung in einem Hochgeschwindigkeitsmischer
zu unterwerfen. Bläschen
der geeigneten Größe werden
gesammelt und mit einem geeigneten oberflächenaktiven Mittel beschichtet,
um sie in einer weichen Hülle
zu stabilisieren.
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Holmes (PCT WO 92/17213) schlug vor,
die in vivo Stabilität
von Protein-Mikrokügelchen
durch Verstärkung
der Hülle
mit bioabbaubaren chemischen Vernetzungsmitteln zu erhöhen.
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Bichon et al. (EPA 90/810367) und
Schneider et al. (Inv. Radiol. 27 (1992), 134–139) beschreiben die Herstellung
von porösen
(5 bis 2000 nm Porengröße) polymeren „Mikroballons".
Sie berichten in der Europäischen
Patentanmeldung, daß „die mikroporöse Struktur
der Hülle
der Mikroballons ein Faktor von Elastizität ist, d. h. die Mikrokügelchen
können
Druckänderungen
leicht hinnehmen, ohne zu brechen."
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Erbel und Zotz (U.S.-Patent Nr. 5,190,982)
beschreiben eine vernetzte polymere Mikrokapsel, in der Luft eingeschlossen
ist.
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Schneider et al. (EPA 554,213) zeigen
an, dass die Druckbeständigkeit
von Mikrokügelchen
dadurch verbessert werden kann, dass mindestens ein Teil des Gases,
das verkapselt ist, ein Gas ist, das ein Verhältnis SGas/MWGas ≤ 0.0031
aufweist, wobei SGas die Wasserlöslichkeit
des Gases in Liter/Liter ist und MWGas das
mittlere Molekulargewicht des Gases in Dalton ist. Tabelle 1 des
Dokuments listet N2, SF6,
CBrF3 und CF4 als
diese Kriterien erfüllend
auf. Das Dokument lehrt, dass diese Mikrokügelchen auf zwei Weisen hergestellt
werden können.
Die erste ist ein Zweistufenverfahren, bei dem luftenthaltende Mikrokügelchen
mit einem bekannten Verfahren hergestellt werden und die Luft durch
das unlösliche
Gas durch ein Gasaustauschverfahren, z. B. durch Inkubieren der
luftgefüllten
Mikrokügelchen
unter einer Atmosphäre
des unlöslichen
Gases für
eine ausreichende Zeit, ersetzt wird.
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Die zweite ist ein Einstufenverfahren,
bei dem Mikrokügelchen
mit dem Verfahren von EPA 324,938 (siehe Beispiel 1 des Dokuments)
unter Verwendung eines unlöslichen
Gases anstelle von Luft hergestellt werden. Bei diesem Verfahren
wurde das Gas über
eine Lösung
eines hüllenbildenden
Materials (z. B. eine Lösung
von Albumin) geleitet, während
eine Ultraschallspitze in das Gefäß abgesenkt und dann entfernt
wurde.
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Leider ist keines dieser Verfahren
zur Herstellung von stabilen Suspensionen von proteinverkapselten, mit
unlöslichem
Gas gefüllten
Mikrokügelchen
praktisch verwendbar. Unter Verwendung des ersten (Zweistufen)-Verfahrens
kann nur eine kleine Zahl von luftgefüllten Albumin-Mikrokügelchen
den Kontakt mit einer unlöslichen
Gasumgebung überleben
(der zweite Schritt des Zweistufenverfahrens). Der Ausstrom von
löslichen Gasen (Luft)
aus den Mikrokügelchen
ist größer als
der Einstrom von unlöslichem
Gas in die Mikrokügelchen, was
zu einem vollständigen
Zusammenbruch der Mikrokügelchen
führt,
der nur Hüllenbruchstücke zurücklässt. Dieser
Effekt ist bei den unlöslicheren
Gasen, wie Perfluorethan, besonders ausgeprägt. Das zweite Verfahren erzeugt
Mikrokügelchen,
die Volumen verlieren, wenn Druck angewendet wird, und keine Wiederherstellung
nach dem Aufheben des Drucks zeigen. Man glaubt, dass beide Verfahren
minderwertige Mikrokügelchen
erzeugen, da die Mikrokügelchen
deutliche Mengen an Luft enthalten und dass die Gegenwart von Luft während der
Bildung die Vorteile des Herstellens der Mikrokügelchen in Gegenwart von unlöslichem
Gas allein verringern könnte.
Es wird in diesem Zusammenhang bemerkt, dass frühere Forscher die Gegenwart
von Sauerstoff für
die Herstellung von Mikrokügelchen
durch Hohlraumbildung als notwendig angesehen haben.
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Suslick berichtete, dass mit Ultraschall
verbundene Hohlraumbildung nur in Gegenwart von Sauerstoff als ein
Verfahren zur Herstellung von Mikrokügelchen geeignet sei. In ausführlichen
Untersuchungen berichteten Suslick et l. (Proc. Natl. Acad. Sci.
88 (1991), 7708–7710;
J. Am. Chem. Soc. 112 (1990), 7807–7809), dass Sauerstoff an
der hohlraumbildungsinduzierten intermolekularen Umlagerung von
Disulfidbrücken
teilhat, die für
eine stabile Proteinhülle
benötigt
werden. Suslick gibt an „Wir
finden, daß Mikrokapselbildung
durch das Fehlen von O2 stark gehemmt wird."
Er erklärt
weiter „Wenn
die Reaktion unter einer inerten Atmosphäre (He, Ar oder N2)
durchgeführt
wird, werden keine Mikrokügelchen
gebildet." „Experimentell
werden nur dann hohe Konzentrationen an Mikrobläschen synthetisiert, wenn die
Reaktion unter O2 oder Luft durchgeführt wird."
Siehe auch U.S. 4,774,958. Die frühere Überzeugung, daß Luft zur
Erzeugung von AlbuminMikrokügelchen
notwendig ist, wurde auch in Holmes erwähnt (PCT WO 92/17213). Darin
wurde die Herstellung von Mikrokügelchen
offenbart, die verschiedene Gase mit niedrigem Molekulargewicht
enthielten. Allerdings gaben die Autoren, als sie die Herstellung
von Albumin-Mikrokügelchen
durch Beschallung beschrieben, an, „Ein weiteres bewährtes beschriebenes
Verfahren, d. h. US-A-4,774,958, zur Herstellung eines gasenthaltenden
Bläschens, besteht
in der Beschallung des Gemisches in Gegenwart von Luft." (Hervorhebung
hinzugefügt).
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Nun wurde gefunden, dass hohe Konzentrationen
von proteinhaltigen Mikrokügelchen,
die relativ unlösliches
Gas einschließen,
durch Ultraschall oder mechanische Hohlraumbildungsverfahren in
Gegenwart des unlöslichen
Gases ohne die Gegenwart von Sauerstoff hergestellt werden können. Solche
Mikrokügelchen zeigen
eine überraschende
und wesentlich verbesserte Stabilität und Elastizität gegenüber angewendetem Druck
bei besserer oder gleichwertiger Echofähigkeit. Die proteinhaltige
Hülle verhindert
die Koaleszenz und widersteht der Ausdehnung aufgrund von Diffusion
von gelösten
atmosphärischen
Gasen aus dem umgebenden Milieu.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
ein neues Verfahren zur Herstellung von proteinumhüllten Mikrokügelchen,
das mechanische Energie in Form von Scherkräften verwendet. Diese Kräfte sind
für das
mechanische Scheren eines Flüssigkeits-Gas-Gemisches
unter Bildung einer Mikrobläschensuspension
verantwortlich und auch für
das Verursachen von hydrodynamischer Hohlraumbildung, die Energie
freisetzt. Diese Energie kann von der umgebenden Flüssigkeit
absorbiert werden, um lokale Proteindenaturierung und Abscheidung an
einer Gas-Flüssigkeits-Grenzfläche zu bewirken,
wobei einzelne Mikrokügelchen
gebildet werden. Hydrodynamische Hohlraumbildung kann von Ultraschall-
(akustischer) Hohlraumbildung auf der Basis der Art unterschieden
werden, in der jede Druckänderungen
in Flüssigkeitssystemen
erzeugt, die zur Freisetzung von Energie führen. Bei der ersteren werden
Druckänderungen
durch den schnellen Fluss einer Flüssigkeit durch eine Öffnung oder über eine
Oberfläche
erzeugt, wohingegen bei der letzteren Zyklen von hochfrequenten Schallwellen
schnelle lokale Druckänderungen
erzeugen. (Siehe F. Ron Young, Cavitation, McGraw-Hill Book Co.
London (1989), S. 4–5.)
Zusätzlich
wird hydrodynamische Hohlraumbildung in einer fließenden Flüssigkeit, d.
h. einer Flüssigkeit,
die durch oder über
ein stationäres
Objekt fließt,
erzeugt. Zum Vergleich wird akustische Hohlraumbildung in einem
Flüssigkeitssystem
erzeugt, das während
genügend
Zyklen zunehmenden und abnehmenden Drucks (positiver und Saugdruck)
stationär
bleiben muß,
um Hohlraumbildung zu zeigen. Sogar in einem Durchflussbeschallungssystem,
wie in dem im U.S.-Patent Nr. 4,957,656 beschriebenen, macht es die
Verweilzeit in einem akustischen Hohlraumbildungsverfahren schwerer,
sie zu steuern, als in einem echten hydrodynamischen Hohlraumbildungssystem
mit Einrichtungsdurchlauf, wie es in der vorliegenden Endung beschrieben
ist.
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Mikrobläschen-Suspensionen, die durch
mechanische Scherkräfte
hergestellt wurden, werden per se als Kontrastmittel verwendet oder
durch weitere Bearbeitung zu Mikrokügelchen geformt. Zum Beispiel
beschreibt PCT Publication Nr. WO 92/05806 die Herstellung einer
Mikrobläschen-Suspension,
die sie als einen „Schaum"
bezeichnen, aus einem filmbildenden Protein, das durch Schlagen
einer Proteinlösung,
die Verdichtungsmittel enthält,
zu einem groben Schaum bei einer konstanten Temperatur unterhalb
der, die das Protein denaturieren würde, hergestellt wird. Der
so erhaltene Schaum wird dann mechanisch geschert, wobei Bläschen einer
gewünschten
Größenordnung
gebildet werden, die durch die Gegenwart des Verdichtungsmittels stabilisiert
werden. Die Bläschen
können
dann durch Wärmedenaturierung
oder durch die Zugabe von Vernetzungsmitteln, um den Proteinfilm,
der die Bläschen
umgibt, zu härten,
weiter zu Mikrokügelchen
verarbeitet werden.
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Die Europäische Patentanmeldung Nr. 0
450 745 A1 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Mikrokügelchen
durch Erzeugen einer Öl-in-Wasser-Emulsion
durch mechanisches Scheren und gleichzeitige oder nachfolgende Zugabe
eines wasserunlöslichen
Polymers, das sich an der Grenzfläche abscheidet. Die hydrophobe
Phase wird dann verdampft, wobei luftoder gasgefüllte Mikrokügelchen gebildet werden.
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So betrifft die vorliegende Erfindung
außerdem
ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Mikrokügelchen
aus wärmedenaturierbarem
Protein, in dem eine Proteinlösung
mechanischen Scherkräften
unterworfen wird. Solche Kräfte
erzeugen eine Suspension aus Mikrobläschen, die gleichzeitig oder
nachfolgend mit einer diskreten Hülle verkapselt werden. Wegen
der Natur des hohlraumbildenden Erwärmens ist die Denaturierung
des Proteins lokalisiert und erzeugt die Hülle durch Abscheiden an der
Flüssigkeits-Gas-Grenzfläche. Dieses
neue Verfahren ist leichter auf größeren Maßstab zu übertragen und führt zu verbesserten
Produktausbeuten verglichen mit den früheren Verfahren auf akustischer
Grundlage zur Herstellung von Mikrokügelchen.
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Offenbarung der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung stellt
ein Verfahren zur Herstellung von verkapselten, gasenthaltenden
Mikrokügelchen
bereit, die als bildgebendes Mittel für Ultraschall verwendbar sind,
umfassend:
- a) Bereitstellen einer wässrigen
Lösung
eines wärmedenaturierbaren
Proteins bei einer Temperatur, die erforderlich ist, um die Temperatur
des Beginns der Denaturierung während
nachfolgender mechanischer Emulgierung zu erreichen;
- b) Vereinigung der Lösung
mit einem Gas;
- c) Emulgieren des Proteinlösung-/Gas-Gemischs
durch mechanische Scherung des Gemischs, um eine Suspension von
gasenthaltenden Mikrobläschen
mit einem mittleren Durchmesser im Bereich von etwa 0,1 bis etwa
10 μm zu
bilden; und
- d) Verkapseln der gasenthaltenden Mikrobläschen unter Bildung von Mikrokügelchen
durch mechanische Hohlraumbildung in der Suspension, wodurch das
Protein denaturiert und dadurch an der Gas-Lösungsgrenzfläche abgeschieden
wird.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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1 ist
eine auseinandergezogene schematische Ansicht eines Mühlentyps
(einer Gaulin-Mühle), der
beim erfindungsgemäßen mechanischen
Hohlraumbildungsverfahren verwendet werden kann;
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2 ist
eine auseinandergezogene schematische Ansicht eines anderen Mühlentyps
(einer Bematek-Mühle),
der beim erfindungsgemäßen mechanischen
Hohlraumbildungsverfahren verwendet werden kann;
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3 ist
eine auseinandergezogene schematische Ansicht noch eines anderen
Mühlentyps
(einer Silverson-Mühle),
der beim erfindungsgemäßen mechanischen
Hohlraumbildungsverfahren verwendet werden kann.
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4a zeigt
die Druckbeständigkeit
von luftgefüllten
Albumin-Mikrokügelchen.
Eine Mikrokügelchensuspension
wurde in eine Spritze gegeben und unter einen Druck von 40 psig
gesetzt. Teilchenverteilungen vor und nach der Druckeinwirkung sind
gezeigt.
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4b zeigt
die Druckbeständigkeit
von perfluorpropangefüllten
Albumin-Mikrokügelchen.
Eine Mikrokügelchensuspension
wurde in eine Spritze gegeben und unter einen Druck von 40 psig
gesetzt. Teilchenverteilungen vor und nach der Druckeinwirkung sind
gezeigt.
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4c zeigt
die Druckbeständigkeit
von perfluorethangefüllten
Albumin-Mikrokügelchen.
Eine Mikrokügelchensuspension
wurde in eine Spritze gegeben und unter einen Druck von 40 psig
(2,76 bar) gesetzt. Teilchenverteilungen vor und nach der Druckeinwirkung
sind gezeigt.
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4d zeigt
die Druckbeständigkeit
von schwefelhexafluoridgefüllten
Albumin-Mikrokügelchen.
Eine Mikrokügelchensuspension
wurde in eine Spritze gegeben und unter einen Druck von 40 psig
(2,76 bar) gesetzt. Teilchenverteilungen vor und nach der Druckeinwirkung
sind gezeigt.
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4e zeigt
die Druckbeständigkeit
von argongefüllten
Albumin-Mikrokügelchen.
Eine Mikrokügelchensuspension
wurde in eine Spritze gegeben und unter einen Druck von 40 psig
(2,76 bar) gesetzt. Teilchenverteilungen vor und nach der Druckeinwirkung
sind gezeigt.
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5 zeigt
die Druckbeständigkeit
von verdünnten
Suspensionen von Mikrokügelchen
bei 3,0 psig (0,21 bar). Eine verdünnte Suspension von Mikrokügelchen
wurde in eine 1-cm-Küvette gegeben
und in der Zeit t = 30 s 3,0 psig (0,21 bar) ausgesetzt. Es sind
Daten für
perfluorethan- perfluorpropan-, schwefelhexafluorid- und luftenthaltende
Mikrokügelchen
aufgeführt.
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6 zeigt
die Druckbeständigkeit
einer verdünnten
Lösung
von argonenthaltenden Mikrokügelchen bei
3,0 psig (0,21 bar). Verdünnte
argonenthaltende Mikrokügelchen
wurden in eine 1-cm-Küvette
gegeben und in der Zeit t = 30 s 3,0 psig (0,21 bar) ausgesetzt.
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7 zeigt
die Wirkung von entgastem Puffer auf Mikrokügelchen. Mikrokügelchen
wurden unter Mischen zu steigenden Mengen von entgastem Puffer gegeben
und das Gemisch zur Bestimmung der Konzentration auf ein konstantes
Volumen gebracht. Daten für
Luft-, perfluorpropan-, perfluorethan- und schwefelhexafluoridenthaltende
Mikrokügelchen
sind gegen das Volumen des entgasten Puffers aufgetragen.
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8 zeigt
Graphen der im nachstehenden Beispiel 11 beschriebenen Daten.
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Ausführungsformen der Durchführung der
Erfindung
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Mikrokügelchen können in einer wässrigen
Suspension durch mechanische Hohlraumbildung von wässrigen
Lösungen
aus filmbildenden Proteinen in Gegenwart eines unlöslichen
Gases und in der essentiellen Abwesenheit von Sauerstoff, d. h.
unter anaeroben (geschlossenes System) Bedingungen, erzeugt werden.
Die Mikrokügelchen
sind echoreflektierend und von einer Größe, die zur transpulmonaren
Passage geeignet sind, mit einem mittleren Durchmesser von weniger
als 10 μm
und mehr als 0,1 μm.
Die Größenverteilung
kann durch Fraktionieren in größere oder
kleinere Mikrokügelchen-Populationen
geändert
werden. Die Mikrokügelchen
können
durch Entfernen von überschüssiger wässriger
Phase konzentriert werden oder nicht, oder gesammelt und in einer
zweiten wässrigen
Lösung
resuspendiert werden.
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Das Gas, das verwendet wird, um diese
Mikrokügelchen
herzustellen, braucht nur pharmakologisch verträglich und vorzugsweise in den
wässrigen
Medien, in die sie gegeben werden (d. h. ursprünglich dem Medium, in dem sie
hergestellt werden, und wenn sie verwendet werden, im Blut), unlöslich zu
sein. Löslichkeit
in Wasser ist eine gute Näherung
für Löslichkeit
in solchen Medien. Der Begriff „Gas" bezieht sich auf jede
Verbindung, die ein Gas ist oder bei der Temperatur, bei der die
Bilderzeugung durchgeführt
wird (typischerweise normale physiologische Temperatur), ein Gas
bilden kann. Das Gas kann aus einer einzelnen Verbindung oder einem
Gemisch von Verbindungen zusammengesetzt sein. Geeignete Gase schließen fluorhaltige
Gase, wie Schwefelhexafluorid, Perfluorethan, Perfluorpropan, Perfluormethan
und Perfluorbutan ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Die
Löslichkeit
eines Gases kann durch Bestimmen des Bunsen-Koeffizienten des Gases von
Interesse definiert werden. Dieser Wert ist das Gasvolumen, das
von einem Einheitsvolumen des Lösungsmittels
absorbiert wird (siehe W.-Y. Wen, J. A. Muccitelli, J. Sol. Chem.
8 (1979), 225–240).
Ein Gas, das zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet
ist, sollte vorzugsweise einen Bunsen-Koeffizienten in Wasser bei
25°C von
weniger als 0,01 ml/ml Lösung
besitzen. Tabelle 1 listet die Bunsen-Koeffizienten von einigen
Gasen auf.
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Eine weitere Eigenschaft des in den
Mikrokügelchen
enthaltenen Gases ist, dass das Diffusionsvermögen des Gases vorzugsweise
geringer als 4 × 10–5 cm2/s bei 25°C
in Wasser ist. Es sollte allerdings erwähnt werden, dass sich die Diffusionskonstante
in unterschiedlichen Lösungsmitteln
und bei verschiedenen Temperaturen verändert, aber zum Zweck der Auswahl
eines Gases sollte das Gas dieses Kriterium erfüllen.
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Pharmakologisch verträglich bezieht
sich auf die Eigenschaft, dass das gewählte Gas biokompatibel sein
muss und minimale Toxizität
aufweisen muss.
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Perfluorpropan ist bevorzugt, weil
es ein unlösliches
Gas bereitstellt, dass (1) bei den Herstellungs- und Verwendungstemperaturen
nicht kondensiert, (2) keine isomeren Formen hat, (3) Mikrokügelchen
ergibt, die ausgezeichnete Druckbeständigkeit zeigen und (4) pharmakologisch
verträglich
ist.
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Das gasenthaltende Mikrobläschen wird
von einer filmbildenden Proteinhülle
verkapselt. Der Begriff filmbildend bezieht sich auf die Fähigkeit
des Proteins, beim Unlöslichmachen
des Proteins (hervorgerufen durch Wärmedenaturierung) eine Hülle um das
eingeschlossene Gas zu bilden, wobei die hydrophilen Gruppen nach
außen
angeordnet und die hydrophoben Gruppen nach innen angeordnet sind.
Das Protein besitzt notwendigerweise sowohl hydrophile als auch
hydrophobe Aminosäuren.
Geeignete Proteine schließen
natürlich
vorkommende Proteine, wie Albumin, gamma-Globulin (menschlich),
apo-Transferrin (menschlich), b-Lactoglobulin und Urease ein. Obwohl
natürlich
vorkommende Proteine bevorzugt sind, können synthetische Proteine
(homopolymer oder heteropolymer) verwendet werden, die eine Tertiärstruktur
zeigen und Wärmedenaturierung
zugänglich
sind. Albumin und insbesondere Humanalbumin ist besonders gut geeignet
für die
vorliegende Erfindung. Das Protein liegt in der Lösung in
einer Konzentration im Bereich von etwa 0,1 bis 10% w/v, vorzugsweise
etwa 1 bis 5% w/v und am stärksten
bevorzugt etwa 1% w/v vor.
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Proteine, die zur Verwendung in der
vorliegenden Erfindung geeignet sind, oder die daraus erhaltenen Mikrokügelchen
können
zur Zweck der Organselektivität
oder des Unterdrückens
von Immunaktivität
chemisch modifiziert werden (z. B. Modifizierung mit Polyethylenglykol).
Allerdings beinhaltet die vorliegende Erfindung nicht die Zugabe
von chemischen Vernetzungsmitteln oder zusätzliche Modifikationen der
Proteine zum Zweck des Erzeugens der Mikrokügelchen.
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Die Mikrokügelchen werden durch Unlöslichmachen
von Anteilen eines Proteins in Lösung
als Ergebnis von Hohlraumbildung in Gegenwart eines Gases, vorzugsweise
ohne die Gegenwart von Sauerstoff (d. h. in einem geschlossenen
System, in dem Luftkontamination vermieden wird) erzeugt. Solch
ein Unlöslichmachen
von Proteinen ist hauptsächlich
durch lokale Proteindenaturierung und Anordnung um den Gaskern gekennzeichnet,
wobei das letztere in Gegenwart des unlöslichen Gases gefördert werden
kann.
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Das System, das verwendet wird, um
das Protein zur Bildung der Mikrokügelchen der vorliegenden Erfindung
durch Wärme
unlöslich
zu machen, ist anaerob, d. h. gegenüber der Atmosphäre abgeschlossen, und
wird als „geschlossenes
System" bezeichnet. Zum Vergleich ist ein „offenes System" eines, das
zur Atmosphäre
hin offen ist. Das in den Mikrokügelchen,
die in solch einem geschlossenen System hergestellt wurden, eingeschlossene
Gas enthält
notwendigerweise nur das zur Erzeugung verwendete Gas. Kontamination durch
Atmosphären-gase
kann unter Verwendung einer O2-Elektrode
zum Messen des Vorhandenseins von O2 im
Ausstrom des Systems überwacht
werden. In der vorliegenden Erfindung werden Mikrokügelchen
hergestellt, die anfänglich
nur das zur Erzeugung verwendete Gas enthalten. Wenn der Gasgehalt
experimentell bestimmt wird, gibt es allerdings eine gewisse Menge
an unvermeidbarer Kontamination durch die Atmosphärengase
während
des experimentellen Verfahrens, wodurch die Menge an gemessenem
so erhaltenem Gas weniger als 100% beträgt. Demgemäß sind Gasmessungen, die größer als
85% sind, repräsentativ
für Mikrokügelchen,
deren ursprünglicher
Gasgehalt vollständig
aus unlöslichem
Gas bestand.
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Nach der Erzeugung der Mikrokügelchen
sollte während
der Verpackung Kontakt mit der Atmosphäre vermieden werden. Zum Beispiel
sollten die Mikrokügelchen
innerhalb von 5 bis 30 s von dem Zeitpunkt an, an dem sie das geschlossene
System verlassen, in Fläschchen
oder anderen luftdichten Behältern
verschlossen werden. Zusätzlich
sollte während
der Verpackung überstehender
Gasraum in den Fläschchen
entfernt und durch das Gas ersetzt werden, das bei der Erzeugung
verwendet wurde.
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Gefüllt mit einem unlöslichen
Gas zeigen diese Protein-Mikrokügelchen
bemerkenswerte Stabilität,
sie überstehen
40 psig (> 2000 mm
Hg, 2,76 bar) bei einer Konzentration von etwa 1,0 × 109 Mikrokügelchen
pro ml. Die Mikrokügelchen
zeigen außerdem
Elastizität
in einer verdünnten
Suspension, wobei sie unter einem Druck von 3–10 psig (0,21 bis 0,69 bar)
Kompression zeigen, und beim Aufheben des Drucks zu ihrem ursprünglichen
Volumen zurückkehren.
Zusätzliche
chemische Vernetzung wäre
von Nachteil, weil die so erhaltenen Mikrokügelchen eine zu starre Struktur
hätten,
um erhöhte
Druckstabilität
zu zeigen.
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Die Mikrokügelchen sind, im Gegensatz
zu freien Mikrobläschen,
gegenüber
Koaleszenz- und diffusionsgetriebener Ausdehnung resistent. Der
mittlere Durchmesser oder das Gesamtvolumen von unlösliches Gas
enthaltenden Mikrokügelchen,
die in Luft- oder sauerstoffgesättigter
Lösung
bei verschiedenen Temperaturen inkubiert werden, nimmt nicht zu.
Die Proteinhülle
ist, obwohl sie elastisch ist, wenn sie Druck ausgesetzt ist, stark
genug, um Ausdehnung oder Zerreißen durch Gasdiffusion oder
-austausch zu widerstehen. Das Vorhandensein der Proteinhülle verhindert
Koaleszenz und hält
das Gas bis zu mehrere Monate in kleinen, einzelnen Bläschen, ähnlich luftgefüllten Protein-Mikrokügelchen.
Das Unvermögen
von Mikrokügelchen,
die mit unlöslichem
Gas gefüllt
sind, durch Austausch mit solvatisierten Atmosphärengasen messbar zu expandieren, ist
eine neue und Schlüsseleigenschaft
zur Verwendung dieses Materials als Ultraschallkontrastmittel.
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Protein-Mikrokügelchen, die unlösliches
Gas einschließen,
zeigen Beständigkeit
gegenüber
Zusammenbruch beim Kontakt mit entgasten, wässrigen Lösungen. Anders als freie Mikrobläschen oder
verkapselte, mit Luft gefüllte
Mikrokügelchen
können
mit unlöslichem
Gas gefüllte
Mikrokügelchen
zu unter Vakuum entgastem Wasser gegeben werden und in hoher Verdünnung ihre
Unversehrtheit behalten. Luftgefülltes
Material kollabiert in Blut wegen des Ausströmens der Sauerstoffkomponente
der Gasphase. Die Fähigkeit
von mit einem unlöslichen
Gas gefüllten
Mikrokügelchen,
dem Zusammenbruch in einer teilweise entgasten oder unter Druck
gesetzten Umgebung zu widerstehen, erhöht die Lebensdauer von Ultraschallkontrast-mitteln
in vivo dramatisch.
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Die Mikrokügelchen werden durch mechanische
Hohlraumbildung hergestellt. Ein Verfahren für Ultraschallherstellung von
luftgefüllten
Mikrokügelchen
ist von Cerny (USP 4,957,656) beschrieben worden.
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Mechanische Hohlraumbildung wird
in der vorliegenden Erfindung zur Herstellung der erfindungsgemäßen, mit
unlöslichem
Gas gefüllten
Mikrokügelchen
verwendet. Sie kann auch zum Herstellen von mit Luft oder löslichem
Gas (z. B. N2, H2,
Argon) gefüllten
Mikrokügelchen
verwendet werden.
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Im neuen mechanischen Hohlraumbildungsverfahren
der vorliegenden Erfindung wird die wässrige Lösung von wärmedenaturierbarem Protein
bei einer Temperatur bereitgestellt, die erforderlich ist, um die Temperatur
des Beginns der Denaturierung während
der nachfolgenden mechanischen Emulgierung der Lösung zu erreichen. Die Denaturierungstemperatur
des Proteins in Lösung
liegt normalerweise im Bereich von 50 bis 100°C. Sie kann aus Tabellen für thermische
Proteindenaturierung in der Literatur oder experimentell durch ein
beliebiges bekanntes Verfahren erhalten werden. Zum Beispiel kann
zur experimentellen Bestimmung der Denaturierungstemperatur eine
Proteinlösung
in einem Wasserbad unter Rühren
erwärmt
werden. Die Denaturierungstemperatur ist die Temperatur, bei der
zuerst unlösliches
Material beobachtet wird. Man beachte, daß die Denaturierungstemperatur
von der Art, Reinheit und Quelle des Proteins, der Konzentration
des Proteins in der Lösung,
dem pH-Wert, dem Puffer, der Innenstärke, der Gegenwart von Stabilisatoren
und der Gegenwart von chemischen Denaturierungsmitteln oder oberflächenaktiven
Mitteln beeinflusst wird. Deshalb ist es nötig, die Denaturierungstemperatur
des Proteins in der Umgebung zu bestimmen, in der es verwendet wird,
um Mikrokügelchen
herzustellen. Falls gewünscht,
können
Zusatzstoffe, wie oberflächenaktive
Mittel oder polare Lösungsmittel
verwendet werden, um die Temperatur zu ändern, bei der die Denaturierung
stattfindet.
-
Tabelle 2 listet die Denaturierungstemperaturen
von einigen natürlich
vorkommenden Proteinen auf, die wie vorstehend beschrieben experimentell
bestimmt wurden: Tabelle
2
- *TRIS =
- 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol
- **MES =
- 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure
- ***DTT =
- Dithiothreitol
-
Jedes Gerät, das verwendet wird, um das
Proteinlösung-/Gas-Gemisch
zu scheren, verursacht wegen der mechanischen Scherkräfte, die
auf die Lösung
ausgeübt
werden, eine gewisse Menge zusätzliche
Erwärmung
der Proteinlösung.
Diese Wärme
muss ausreichen, um lokale Denaturierng des Proteins an der Gas-Flüssigkeitsgrenzfläche zu bewirken.
Es ist deshalb wichtig, die durch das Gerät verursachte Temperaturerhöhung zu
bestimmen, so dass die Temperatur, bei der die Proteinlösung in
das Gerät
eingeführt
wird, angepasst werden kann, um solch eine lokale thermische Denaturierng
zu erreichen. Insbesondere muss die Massentemperatur der Flüssigkeit
im Gerät
mit der Temperatur des Beginns der Denaturierung direkt vor der Hohlraumbildung übereinstimmen.
Das Hohlraumbildungsereignis erzeugt die zusätzliche Wärme, die erforderlich ist,
um das Protein lokal zu denaturieren. Die Temperatur des Beginns
der Denaturierng ist als die Temperatur definiert, bei der das Protein
am Rande der Denaturierng steht, aber die Lösung kein denaturiertes Protein
enthält.
Diese Temperatur liegt gerade unterhalb, typischerweise 1 bis 5°C unterhalb,
der Denaturierungstemperatur. Wenn nötig, kann die Ausgangsproteinlösung vor
dem Einführen
in das Gerät
auf eine Temperatur vorgewärmt
werden, die es ermöglicht,
dass die Temperatur des Beginns der Denaturierung erreicht wird.
-
Wenn die geeignete Ausgangstemperatur
der Proteinlösung
erreicht worden ist, wird die Lösung
mit einem geeigneten Gas vereinigt, zum Beispiel durch Einführen des
Gases in die Proteinlösung
vor oder während
des Emulgierungsschrittes in einem Volumen zu Volumen-Verhältnis im
Bereich von etwa 5% bis 200%, vorzugsweise etwa 20% bis 100%, Gas
: Flüssigkeit.
Das geeignete Gas : Flüssigkeitsverhältnis hängt von
der Geometrie des Geräts
und den physikalischen Eigenschaften des Gases (Löslichkeit,
Dichte, Molekulargewicht etc.) ab und kann angepasst werden, um
die Ausbeute zu optimieren.
-
Nachdem das Gas und die Proteinlösung vereinigt
wurden, wird das Gemisch emulgiert und unter Bedingungen, die Mikrokügelchen
erzeugen einer Hohlraumbildung unterworfen. Dies wird unter Verwendung
eines Geräts
erreicht, in dem mechanisches Scheren und hydrodynamische Hohlraumbildung
erzeugt werden können,
wie Hochgeschwindigkeitsmischern, Mühlen, Fluidizern und ähnlichem.
Ein bevorzugtes Gerät
ist eine Kolloidmühle,
die als „eine
Maschine, die aus einem Hochgeschwindigkeitsrotor und einem Stator
besteht, wobei Dispersion oder Emulgierung durch die gegenüberliegenden
Flächen
bewirkt wird" definiert ist, Advanced Filtration and Separation
Technology, S. 108-110.
Beispiele für
spezielle Mühlengeräte, die
verwendet werden können,
sind die nachstehenden:
Modell #2½ – Bematek, Beverly, MA
Modell
W250V – Greerco,
Hudson, NH
Modell 2F – APV
Gaulin, Everett, MA
Modell L4R – Silverson, Chesham, UK
Modell
Polytron
PT3000 – Kinematica,
Littau, Schweiz
-
Wenn sie verwendet werden, um mit
unlöslichem
Gas gefüllte
Mikrokügelchen
herzustellen, sollten die Kolloidmühlen gegenüber der Atmosphäre abgeschlossen
sein, um den Eintrag von Luft in das Gemisch zu verhindern.
-
Die 1–3 liefern weitere Einzelheiten
für einige
Mühlentypen,
die beim mechanischen Hohlraumbildungsverfahren verwendet werden
können.
-
1 zeigt
die wesentlichen Elemente einer Gaulin-Mühle. Diese sind: eine rotierende
Welle (10), die betriebsfähig mit einem Motor (nicht
gezeigt) verbunden ist; ein Scheibenrotor (12), der am
Ende der Welle (10) befestigt ist; und ein Stator (11).
Stator (11) hat eine zentrale Bohrungsöffnung (18) und eine
Senkung (16), in die der Rotor aufgenommen wird. In dieser
Mühle werden
die Proteinlösung
und das Gas durch die Mühle über ein „T-Stück" (15)
zugeführt.
Das Proteinlösung-/Gas-Gemisch
wird emulgiert und bildet zwischen den Oberflächen des Rotors und Stators
Hohlräume.
Der „Spalt"
in dieser Mühle
ist der Raum zwischen radialen Oberfläche (17) der Statorsenkung
und der radialen Umfangsoberfläche
des Rotors. Die Temperatur des Mikrokügelchenprodukts wird gemessen
(z. B. mit einem Thermoelement, nicht gezeigt), wenn das Gemisch hinter
dem Stator (r) austritt.
-
2 zeigt
die wesentlichen Elemente einer Bematek-Mühle. Diese Mühle ist
in Struktur und Funktion der Gaulin-Mühle aus 1 ähnlich – – der Hauptunterschied
besteht in den Anordnungen des Rotors und der Statorsenkung. Sie
beinhaltet eine rotierende Welle (20), die einen kegelstumpfförmigen Rotor
(21) trägt,
der ein Vorderende mit Gewinde aufweist (22), und einen
Stator (23), der eine zentrale zylindrische Öffnung (25)
und eine kegelstumpfförmige
Senkung (24) aufweist, die angepasst ist, um den Rotor
aufzunehmen. Das Proteinlösungs/Gas-Gemisch
wird in diese Mühle über Öffnung (25)
eingeführt.
Das Gas und die Lösung werden
gemischt, wenn sie die Gewindedrehungen (22) der Welle
passieren, und das Gemisch wird emulgiert und einer Hohlraumbildung
unterworfen, wenn es den Spalt der Mühle passiert. Der Spalt ist
definiert als der Raum zwischen den konischen Oberflächen des
Rotors und Stators.
-
3 zeigt
eine Silverson-Mühle.
Die Struktur dieser Mühle
ist von denen der Mühlen
aus 1 und 2 ziemlich verschieden. Die
abgebildete Silverson-Mühle
hat eine rotierende Welle (30), die einen Paddelschaufelrotor
(31) trägt.
Der Rotor wird in einem becherförmigen
perforierten Siebstator (32) aufgenommen. Der Stator ist
auf ein Gehäuse
(33) montiert, das mit einer Einlassarmatur (34)
ausgestattet ist. Die Einlassarmatur (34) erstreckt sich
bis in das Gehäuse
(33), wobei sie sich an der Bodenmitte des perforierten
Siebstators (32) öffnet.
Das Gehäuse
hat eine zentrale Öffnung
(nicht gezeigt), die mit der Einlassarmatur und einer Öffnung (ebenfalls
nicht gezeigt) am Boden des Stators verbunden ist. In dieser Mühle wird
die Lösung/das Gas über die
Einlassarmatur in den Boden des Stators eingeführt und wird zwischen den flachen
Flächen
(35) des Paddelrotors und der inneren zylindrischen Oberfläche des
Stators emulgiert und Hohlraumbildung durchgeführt. Der „Spalt" dieser Mühle kann
als der Raum zwischen dem Rotor (31) und Stator (32)
definiert werden, aber der Einfluss der Spaltgröße auf das Verfahren wird von
der Größe der Perforationen
(36) des Stators beeinflußt.
-
Nach dem Durchlaufen der Mühle kann
das Produkt gekühlt
werden, typischerweise auf 10– 20°C, und durch
Absetzen lassen oder durch Zugabe von bioverträglichen Entschäumungsmitteln,
die die Mikrokügelchen
nicht negativ beeinflussen, entschäumt werden.
-
Beim Durchlaufen des Gemischs durch
solch eine Mühle
oder äquivalente
Vorrichtung kommt es zur Emulgierung und Hohlraumbildung des Gemischs,
wobei Mikrokügelchen
im Bereich von etwa 0,1 bis 10 μm (mittlerer
Durchmesser) gebildet werden. Die Mikrokügelchengröße kann mit einem geeigneten
Teilchenzähler,
zum Beispiel einem Coulter Multisizer II (Coulter Electronics, Hialeah,
Fl) bestimmt werden.
-
Wenn eine Mühle, wie die in 1–3 beschriebenen
verwendet wird, sind die Rotorgeschwindigkeit, die Spaltgröße und das
Gas : Flüssigkeits-Verhältnis die
Hauptverfahrens-parameter, die die Eigenschaften (mittlere Größe, Größenverteilung
und Konzentration der Mikrokügelchen)
des Mikrokügelchen-Produkts
beeinflussen. Diese Parameter werden empirisch angepasst, um ein
Produkt mit den gewünschten
Eigenschaften bereitzustellen. Für
jedes gegebene Produkt werden seine Eigenschaften klinisch festgelegt.
Zum Beispiel lauten mutmaßliche
Spezifikationen für
Perfluorpropan-Mikrokügelchen,
die für
Herzmuskel-perfusionen verwendet werden: mittlere Größe, 4 μm; Größenverteilung,
90% unter 10 μm;
Konzentration, 7 × 108 bis 2 × 109 Mikrokügelchen/ml.
-
Die Erfindung wird durch die nachstehenden
Beispiele weiter erläutert.
Diese Beispiele dienen nicht dazu, die Erfindung in irgendeiner
Weise einzuschränken.
-
BEISPIEL 1
-
Temperaturüberwachung
und -Steuerung bei mechanischem Hohlraumbildungsverfahren für Humanserumalbumin
-
Wie vorstehend beschrieben, wird
die Proteinlösung
vor der Bearbeitung vorerwärmt,
so dass die Verfahrenstemperatur die Temperatur des Beginns der
Denaturierung erreichen und halten kann.
-
Ein typisches Praxisverfahren ist
wie nachstehend: Eine Modell 2½''
Bematek-Kolloidmühle
(2; Bematek Systems,
Beverly MA) wurde verrohrt, so dass die Eintrittsöffnung mit
einem Wärmetauscher
verbunden wurde. Es wurde gasundurchlässiger Schlauch verwendet,
um die weichen Verbindungen zwischen den Wärmetauscherschlauchtüllen herzustellen.
-
Die Austrittsöffnung des Prozesshopfes wurde
mit einem dem Verfahren nachgeschaltetem Edelstahl-Kühler verbunden.
-
Die Lösungstemperatur wurde an drei
Stellen (T1, T2 und T3) überwacht.
Das T1-Thermoelement
wurde in einem Swagelok-T-Stück
zwischen dem Vorerwärmungswärmetauscher
und dem Mühlenkopf
montiert, um die Zufuhrtemperatur der Proteinlösung zu messen. Ein zweites
T-Stück
zum Einleiten von Gas wurde ebenfalls an der Zufuhröffnung angebracht.
Das T2-Thermoelement wurde innerhalb des Ausgangs des Prozesshopfes,
ungefähr
1 cm vom Rotor und 2 cm von der Welle angeordnet, so dass die Temperatur
des Verfahrens genau gemessen werden konnte. Auf diese Art können die
beiden Temperaturen, die Zufuhrtemperatur (T1) und die Verfahrenstemperatur
(T2), unabhängig
gemessen und verglichen werden, um die Menge der Erwärmung der
Lösung
während
der Bearbeitung zu bestimmen.
-
Für
dieses Beispiel wurde U.S.P.-Albumin mit normaler Kochsalzlösung zu
einer 1 %igen (w/v) Lösung verdünnt. Die
Denaturierungstemperatur wurde experimentell wie beschrieben zu
78°C bestimmt.
Nach dem Entgasen wurde sie mit 200 ml/min in die Mühle eingeführt, zusammen
mit Perfluorpropan mit 100 ml/min (50% v/v). Es wurden Unterschiede
zwischen T1 und T2 von 10° bis
15°C notiert.
Um eine Verfahrenstemperatur von 77°C (1°C unter der Denaturierungs-temperatur)
zu erhalten, wurde die Zufuhrtemperatur auf einen Bereich von 62°C bis 67°C eingestellt.
Da die erzeugte Wärmemenge
mit unterschiedlichen Mahlparametern variiert, ist es nötig, den
Unterschied zwischen T1 und T2 bei jeder Änderung der Mahlparameter zu
bestimmen (Wahl der Mühle,
Mühleneinstellungen,
Fliessgeschwindigkeit, Gas : Flüssigkeits-Verhältnis etc.),
um die Verfahrenstemperatur zu erzielen, um Massendenaturierung
des Proteins zu verhindern, während
die Gasmikrobläschen
erfolgreich mit einer dünnen
Hülle aus
denaturiertem Protein verkapselt werden.
-
Die Kühleraustrittstemperatur (T3)
wurde ebenfalls überwacht,
und wurde für
die besten Ergebnisse auf 20°C
eingestellt.
-
BEISPIEL 2
-
Mechanisches Hohlraumbildungsverfahren
zur Herstellung von Mikrokügelchen,
die unterschiedliche Gase enthalten Mikrokügelchen, die verschiedene Gase
enthielten, wurden wie nachstehend hergestellt: 5%ige Humanalbuminlösung (USP)
wurde 2 h unter kontinuierlichem Vakuum entgast. Das Vakuum wurde durch
Füllen
des evakuierten Behälters
mit dem Gas von Interesse aufgehoben. Verwendete unlösliche Gase beinhalten
Schwefelhexafluorid, Perfluorethan und Perfluorpropan. Es wurden
auch Mikrokügelchen
hergestellt, die löslichere
Gase, Luft, Stickstoff, Sauerstoff und Argon, enthielten. Die Verwendung
von Argon war repräsentativ
für ein
Gas mit hohem Molekulargewicht, das aber relativ löslich ist.
Die Albuminlösung
wurde über
einen In-Line-Wärmetauscher
auf 68°C
eingestellt und mit 100 ml/min in eine 2 ½'' (63,5 mm) Kolloidmühle (Greerco,
Hudson, NH, Modell W250V oder AF Gaulin, Everett, MA, Modell 2F)
gepumpt. Das spezifische Gas wurde bei Raumtemperatur kurz oberhalb
der Eintrittsöffnung
mit einer Fließgeschwindigkeit
von 120–200 ml/min
zu der Flüssigkeitszufuhr
zugegeben. Der Spalt zwischen dem Rotor und dem Stator wurde auf 2/1000stet
Inch (0,005 cm) eingestellt, und die Albuminlösung wurde kontinuierlich mit
etwa 7000 U/min bei einer Verfahrenstemperatur von 73°C gemahlen.
-
Die so erzeugte dichte, weiße Lösung von
Mikrokügelchen
wurde mit einem Wärmetauscher
sofort auf eine Temperatur von 10°C
gekühlt
und in Glasfläschchen
gesammelt. Die Fläschchen
wurden sofort verschlossen. Das Material wurde unter Verwendung
eines Coulter Counters in Bezug auf Konzentration und Größenverteilung
charakterisiert. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle
3 gezeigt.
-
-
BEISPIEL 3
-
Einfluß von Rotorgeschwindigkeit
und Spaltgröße
-
Eine 1%ige Albuminlösung (200
ml/min) wurde mit Perfluorpropan (100 ml/min) bei einem 50% Gas zu
Flüssigkeit-Verhältnis (v/v)
vereinigt. Gemäß dem in
Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurden unter Verwendung verschiedener
Rotorgeschwindigkeiten und Spaltgrößen Mikrokügelchen hergestellt. Die erhaltenen Daten
sind in Tabelle 4 aufgeführt.
-
-
Diese Ergebnisse zeigen, dass mit
wachsender Rotorgeschwindigkeit die Konzentration zunimmt und die
mittlere Größe abnimmt,
während
zunehmende Spaltgröße die Konzentration
senkt.
-
BEISPIEL 4
-
Einfluss des Gas zu Flüssigkeit-Verhältnisses
-
Eine 0,5%ige Albuminlösung (100
ml/min) wurde unter Verwendung einer Gaulin-Mühle mit einem ungefähren Spalt
von 0,012 und einer Rotorblattspitzengeschwindigkeit von 9950 ft/min
(50,5 m/s) mit Perfluorpropan mit 20, 50, 70 oder 100 ml/min (20,
50, 70 oder 100% Gas zu Flüssigkeit
v/v) vereinigt. Die erhaltenen Daten sind in Tabelle 5 aufgeführt:
-
-
Diese Ergebnisse zeigen, daß sowohl
die Konzentration als auch die mittlere Größe mit wachsendem Gas : Flüssigkeits-Verhältnis zunehmen.
-
BEISPIEL 5
-
Mikroskopische Untersuchung
von Mikrokügelchen
-
Albumin-Mikrokügelchen, die verschiedene Gase
enthielten, wurden wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt. Die
mikroskopische Untersuchung der Produkte ergab eine monodisperse
Suspension aus kugelförmigen
Mikrokügelchen.
Die Mikrokügelchen
wurden durch Anwendung von hohem Druck in einer Spritze zum Zusammenbrechen
gebracht, bis die Suspension klar wurde. In allen Fällen ergab
die erneute mikroskopische Untersuchung das Vorhandensein von durchsichtigen,
membranartigen Hüllen
von den zusammengebrochenen Mikrokügelchen.
-
BEISPIEL 6
-
Druckbeständigkeit
von Mikrokügelchen
-
Albumin-Mikrokügelchen, die verschiedene Gase
enthielten, wurden wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt. 10
ml jeder Suspension wurden in eine gasdichte 10-ml-Glasspritze (Hamilton,
Reno NV), die mit einem Druckmanometer ausgestattet war, gegeben.
Der gesamte überstehende
Gasraum wurde entfernt, und das Gerät wurde verschlossen. Ein konstanter
Druck von 40 psig (2,76 bar) wurde 3 min lang angewendet. Dann wurde
ein Counter-Counter verwendet, um die Probenteilchenkonzentration
und -verteilung zu messen. Vergleiche der Daten (4a–4e)
vor und nach der Druckanwendung zeigten eine relative Beständigkeit
der unlösliches
Gas enthaltenden Mikrokügelchen
gegenüber
40 psig (2,76 bar).
-
BEISPIEL 7
-
Druckbeständigkeit
von verdünnten
Suspensionen aus Mikrokügelchen
-
Mikrokügelchen, die verschiedene Gase
enthielten, wurden wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt. Jede
Probe von Mikrokügelchen
wurde auf ein gleiches Volumen von verkapseltem Gas pro ml phosphatgepufferter
Kochsalzlösung
(0,15 M) verdünnt,
etwa eine 1 : 60 Verdünnung.
Die verdünnte
Suspension wurde in einem verschlossenen Behälter mit adäquatem Gasraum unmittelbaren
statischen Drücken
von 0,5 psig (0,035 bar) bis 7,5 psig (0,52 bar) ausgesetzt. 5 zeigt den Einfluß von Druck
auf die Mikrokügelchen-Konzentration. Mikrokügelchen,
die die unlöslichen
Gase Perfluorpropan, Perfluorethan und Schwefelhexafluorid enthalten,
sind viel druckbeständiger
als mit Luft oder mit Argon mit hohem Molekulargewicht gefüllte Mikrokügelchen
derselben Konzentration und Größenverteilung
(6). Physiologische
Drücke
im Blutstrom liegen im Bereich eines peripheren venösen Drucks
von 1,5 psig (0,10 bar) bis 2,5 psig (0,17 bar) in der Herzmuskelwand.
-
BEISPIEL 8
-
Einfluss von entgastem Puffer
auf Mikrokügelchen
-
Albumin-Mikrokügelchen, die verschiedene Gase
enthielten, wurden wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt. Phosphatgepufferte
Kochsalzlösung
(PBS) wurde durch Kochen direkt vor der Verwendung entgast. 0,05
ml- bis 1,5 ml-Anteile des heißen
Puffers wurden in 13 × 100
Teströhrchen
gegeben, und man ließ sie
1 min in einem Wasserbad auf Raumtemperatur abkühlen. In jedes Röhrchen wurde
ein konstantes Volumen an Mikrokügelchen
gegeben. Nach dem Mischen wurde das Endvolumen mit PBS auf 3,0 ml gebracht und
die Konzentration der Mikrokügelchen
wurde bestimmt. 7 zeigt,
dass für
die Mikrokügelchen,
die die unlöslichen
Gase Perfluorpropan, Perfluorethan und Schwefelhexafluorid enthielten,
in entgasten Lösungen ein
verbessertes Überleben
erhalten wird.
-
Mikrokügelchen, die Luft, Schwefelhexafluorid
oder Perfluorethan enthielten, wurden in Vollblut verdünnt. Luftgefüllte Mikrokügelchen
zeigten Zusammenbruch. Es zeigte sich, dass die mit unlöslichem
Gas gefüllten
Mikrokügelchen
die Verdünnung
in frischem Vollblut überlebten.
-
BEISPIEL 9
-
Elastizität
-
Mikrokügelchen, die aus verschiedenen
Gasen hergestellt wurden, wurden wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt.
Mikrokügelchen
wurden, wie in Beispiel 7 beschrieben, in phosphatgepufferter Kochsalzlösung verdünnt, und
in eine klare Zelle auf dem Tisch eines Mikroskops gegeben. Die
Zelle wurde mit einer Stickstoffquelle verbunden, die die Beobachtung
der Auswirkungen von schnellem Anwenden und Aufheben von physiologischen
Drücken
auf die Mikrokügelchen
ermöglichte.
-
Die Anwendung von 1,5 psig (0,10
bar) oder mehr auf die Mikrokügelchen,
die lösliches
Gas enthielten, führte
zur Beobachtung des vollständigen
Verlustes der kugelförmigen
Körper.
Die Mikrokügelchen
bildeten sich beim Aufheben des Drucks nicht zurück, was irreversible Zerstörung anzeigte.
Die Anwendung von weniger als 1,5 psig (0,10 bar) führte zur
Verformung und Verschrumpelung der Hülle mit unvollständigem Verlust
von Mikrokügelchen.
Die kugelförmige
Erscheinung oder Population konnte nach Aufheben des angewendeten
Drucks nicht wiederhergestellt werden.
-
Die Anwendung von Druck bis zu mehreren
psig auf eine Suspension von Mikrokügelchen, die die unlöslichen
Perfluorkohlenstoffgase enthielten, führte zu einer Verringerung
des Durchmessers der Mikrokügelchen.
Der Durchmesser der Mikrokügelchen
kehrte beim Aufheben des Drucks zu den originalen Dimensionen zurück Schwefelhexafluoridenthaltende
Mikrokügelchen
zeigten ebenfalls unter angewandtem physiologischen Druck erhöhte Elastizität im Vergleich
zu luftgefüllten
Mikrokügelchen,
aber geringere Elastizität
im Vergleich zu den perfluorkohlenstoffenthaltenden Mikrokügelchen.
-
Diese Beobachtungen zeigen, dass
die Mikrokügelchen,
die unlösliche
Gase enthielten, nicht nur druckbeständig waren, sondern sich auch
nachdem der Druck aufgehoben wurde, erholten. Dies ist bezeichnend
für eine
elastische Proteinhülle.
-
BEISPIEL 10
-
Vergleich von
Mikrokügelchen
die in einem offenen System und in einem geschlossenen System hergestellt wurden
-
VERFAHRENSMETHODEN:
-
A) manuelle Beschallung:
offenes System (äquivalent
zu EPA 554,213 Einstufenverfahren)
-
Das im U.S.-Patent Nr. 4,844,882
und der Europäischen
Patentanmeldung 554,213 beschriebene Verfahren wurde verwendet,
um Mikrokügelchen
wie nachstehend herzustellen: Ein 20 cm3-Spritzenzylinder
wurde mit einem T-artigen Thermoelement, das durch die Spitze eingeführt und
auf einen Trägerständer montiert war,
ausgestattet. Die Spritze wurde bis zur 16 cm3-Marke
mir Schweizer Rotes Kreuz-5% Humanserumalbumin gefüllt. Gas
(Perfluorpropan (CF8) oder Schwefelhexafluorid
(SF6) wurde in das obere Ende des Spritzenzylinders
eingeführt
und über
die Oberfläche
der Flüssigkeit
geleitet. Eine Ultraschallspitze wurde auf die 10 cm3-Marke
abgesenkt, unter die Oberfläche
der Lösung,
und bei 50% Leistung betrieben, bis die Temperatur der Lösung auf
72,8–73°C anstieg;
ungefähr
1 min. Die Spitze wurde sofort zum Meniskus ± 1 mm zurückgezogen und das Leistungsniveau
auf 65% erhöht.
Die Beschallung wurde 5 s fortgesetzt, mit einem zusätzlichen Temperaturanstieg
von 1,2–2°C. Das Produkt
wurde in ein Glasfläschchen
gegossen, bis es voll war, und verschlossen.
-
B) Kontinuierliche Beschallung:
Geschlossenes System
-
Das im U.S.-Patent Nr. 4,957,656
beschriebene Verfahren wurde verwendet, um Perfluorpropan- und schwefelhexafluoridenthaltende
Mikrokügelchen
wie nachstehend herzustellen: Humanserumalbumin wurde mit steriler
Kochsalzlösung
zu einer 1% w/v Lösung
verdünnt.
Die Lösung
wurde bis zum Beginn der Denaturierung erwärmt, ungefähr auf 76°C. Das System wurde gegenüber der äußeren Atmosphäre abgeschlossen und
Perfluorpropan- oder Schwefelhexafluoridgas wurde anstelle von Luft
in den Flüssigkeitsstrom
eingeleitet (1 : 1). Das Produkt wurde durch Vorbeiströmen des
Gas/Albumingemisches an der Ultraschallspitze mit ungefähr 100 ml
Flüssigkeit
min kontinuierlich hergestellt. Das Produkt wurde beim Austritt
aus der Beschallungskammer durch Passieren eines Wärmetauschers
gekühlt
und als eine Massen-Flüssigsuspension
von Mikrokügelchen
gesammelt. Handhabungs- und Lagerungs-bedingungen waren ähnlich denen
für manuell
hergestellte Mikrokügelchen.
-
C) Mechanische Hohlraumbildung:
Geschlossenes System
-
Albumin-Mikrokügelchen, die Perfluorpropan-
oder Schwefelhexafluoridgas enthielten, wurden auch in einem geschlossenen
System durch Mahlen eines Gemisches aus 1%igen Humanserum-albumin
und Gas, vergleichbar mit dem in Beispiel 2 beschriebenen, hergestellt.
Albuminlösung,
die auf eine Temperatur erwärmt wurde,
die ausreicht, um Mikrokügelchen
durch mechanische Hohlraumbildung einer gegebenen Mühle zu erzeugen,
wurde 1 : 1 (v : v) mit Gas gemischt und in eine Kolloidmühle eingeführt. Die
Flüssigkeitsfliessgeschwindigkeit
hing von der Kapazität
oder Größe der Mühle, typischerweise
100 bis 500 ml/min, ab. Eine Silverson-L4R-Mühle und eine Bematek-3'' (76,2
mm)-Produktionskolloidmühle
wurden für
diese Auswertung verwendet. Der Ausstrom aus der Mühle wurde
durch Passieren eines Wärmetauschersystems
gekühlt
und die so erhaltene Albumin-Mikrokügelchensuspension wurde in
der Menge gesammelt. Das Produkt wurde, ähnlich wie bei den anderen
Verfahren, in Glasfläschchen
gefüllt.
-
ANALYTISCHE
VERFAHREN
-
A) Populationsdynamik
-
Die Populationsdynamik wurde mit
einem Coulter Multiziser II unter Verwendung einer 50 μm-Blende ausgewertet.
Die wie in VERFAHRENSMETHODEN hergestellten Albumin-Mikrokügelchen
wurden 1 : 10000 in Isoton verdünnt,
und eine 500 μl-Probe
wurde analysiert. Konzentration, mittlere Größe und verkapseltes Gasvolumen
pro ml der originalen Mikrokügelchensuspension
wurden erhalten.
-
B) Gasgehalt
-
Der Prozentsatz an Perfluorpropan,
das in Doppelproben von Mikrokügelchen,
die wie in VERFAHRENSMETHODEN beschrieben hergestellt worden waren,
eingeschlossen war, wurde mit Gaschromatographie an einem Hewlett
Packard 5890 bestimmt. Eine Probe der Mikrokügelchensuspension wurde in
eine gasdichte Spritze aufgenommen. Das Gas wurde unter Verwendung
eines Antischaummittels in Ethanol aus den Mikrokügelchen
freigesetzt, und das eingeschlossene Gas wurde per Wärmeleitfähigkeit
delektiert.
-
C) Druckbeständigkeit
-
Die Druckbeständigkeit von Albumin-Mikrokügelchen
wurde mit einem Verfahren, das dem glich, von dem Sintetica in der
Europäischen
Patentanmeldung 554,213 berichtete, ausgewertet. Mikrokügelchen
wurden in einer 3 ml-Druckküvette
in belüfteter,
phosphatgepufferter Kochsalzlösung
bis zu ungefähr
1 Absorptionseinheit bei 600 nm verdünnt. Der Hals wurde mit einer
Druckquelle verbunden, und die Küvette
in ein Aufnahmespektrophotometer gestellt. Der Druck in der Küvette wurde
linear über
150 s von 0 bis 5 oder 10 psig (0,35 bis 0,69 bar) erhöht, dann
wurde der Druck aufgehoben. Die Druckrampe wurde durch ein proportionierendes
Magnetspulenventil (Honeywell) und einen Druckübersetzer (Omega), die zwischen
einer 20 psi (1,38 bar)-Druckquelle (N2-Tank)
und einem 5-Liter-Edelstahlreservoir angeordnet war, erzeugt. Die
Küvette
wurde durch ein digitales Manometer mit dem Stahlreservoir verbunden.
Ein PC-Computer mit einem Analog-Digitalwandler
und einem Digital-Analogwandlerboard (National Instruments) steuerte
das Öffnen
des Ventils und las den Druckübersetzer.
Das Reservoir und die Küvette
wurden mit einer gewählten
Geschwindigkeit unter Druck gesetzt, bis der gewünschte Druck erreicht war.
Die optische Dichte der Mikrokügelchensuspension
wurde als Funktion von Zeit und Druck aufgezeichnet. Die Daten wurden
um die natürliche
Flotationsrate von Mikrokügelchen
in der Küvette
korrigiert.
-
ERGEBNISSE
-
A) Populationsdynamik
-
Albumin-Mikrokügelchen, die mit den Verfahren
der manuellen Beschallung, kontinuierlichen Beschallung und mechanischen
Hohlraumbildung hergestellt worden waren, wurden auf ihre Konzentration,
mittlere Größe, verkapseltes
Gasvolumen und Größenverteilung
innerhalb von 24 h nach der Herstellung untersucht. Als Messungen
wurden mindestens im Doppel durchgeführt und sind als Mittelwert
aufgeführt.
Die Ergebnisse dieser Messungen sind in Tabelle 6 aufgeführt.
-
-
Mit allen Verfahren hergestellte
Mikrokügelchen
waren für
die Dauer dieser Untersuchung stabil, mindestens einige Wochen bei
4°C.
-
B) Gasgehalt
-
Analysen der Zusammensetzung von
eingeschlossenem Perfluorpropangas in Doppelproben von Mikrokügelchen
sind in Tabelle 7 aufgeführt.
-
Tabelle
7
Verfahren | %
C3F8 |
manuelle
Beschallung | 70,0 |
kontinuierliche
Beschallung | 89,5 |
mechanische
Hohlraumbildung | 95,5 |
-
Diese Ergebnisse zeigen, daß Mikrokügelchen,
die in einem offenen System unter Verwendung von manueller Beschallung
hergestellt wurden, viel weniger des Gases verkapseln, das verwendet
wurde, um die Mikrokügelchen
zu erzeugen als jene, die in geschlossenen Systemen (kontinuierliche
Beschallung und mechanische Hohlraumbildung) hergestellt wurden.
Die Mikrokügelchen,
die im geschlossenen System hergestellt wurden, wurden in Abwesenheit
von Sauerstoff hergestellt, wie unter Verwendung einer Sauerstoffelektrode
bestimmt wurde. Mikrokügelchen,
die mit allen drei Verfahren hergestellt wurden, wurden während der Handhabung
und Probeannahme gleichlang der Atmosphäre ausgesetzt (was für das Messen
von weniger als 100% Perfluorpropangas in den Mikrokügelchen,
die unter Verwendung der zwei in geschlossenen System durchgeführten Verfahren
hergestellt wurden, verantwortlich ist), folglich war Sauerstoff
(und andere atmosphärische
Gase) während
der Erzeugung in dem offenen System vorhanden, was die Wirksamkeit
der Gasverkapselung herabsetzte.
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C) Druckbeständigkeit
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Die optische Dichte einer Suspension
aus gasgefüllten
Mikrokügelchen
nimmt wegen einer Abnahme der Größe und der
damit verbundenen Änderung
der Oberfläche
mit zunehmendem Druck ab. Das Schrumpfen beruht auf zwei Faktoren;
reversibler Kompression gemäß der Gasgesetze
und irreversiblem Verlust des Gaskerns an die umgebende Flüssigkeit
wegen erhöhter
Löslichkeit
gemäß Henry's
Gesetz. Beim Aufheben eines angewandten Drucks wird nur der Kompressionsbedingte
Anteil des Volumenverlustes wiederhergestellt, und dies kann durch
eine Zunahme der optischen Dichte beobachtet werden. Der Verlust
von eingeschlossenem Gas an die umgebende Flüssigkeit tritt beim Aufheben
des Drucks nicht wieder in die Mikrokügelchen ein, sondern geht an
den überstehenden
Gasraum über
der Lösung
verloren.
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8 zeigt
das Ergebnis des Auferlegens eines linearen Druckgradienten bis
zu 10 psi (0,69 bar) auf 1 OD-Suspensionen von Albumin-Mikrokügelchen,
die mit Perfluorpropangas durch das manuelle Beschallungverfahren
(offenes System) sowie auch das kontinuierliche Beschallungs- und
mechanische Hohlraumbildungsverfahren (geschlossene Systeme) hergestellt
wurden. Beide im geschlossenen System durchgeführte Verfahren ergaben Mikrokügelchen,
die mit zunehmendem Druck Kompression zeigten, mit einer vollständigen Wiederherstellung
des Volumens beim Aufheben des Drucks am Ende des Gradienten. Verlust
von eingeschlossenem Gas an die umgebende Lösung wurde nicht beobachtet.
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Albumin-Mikrokügelchen, die im offenen System
(manuelles Beschallungsverfahren) hergestellt wurden, zeigten eine
höhere
Kompression mit angewandtem Druck und nur eine teilweise Wiederherstellung
des Volumens beim Aufheben des Drucks wegen des irreversiblen Verlustes
des Gaskerns, was zu einer 40%igen Zerstörung von Mikrokügelchen
führte.