HUT74827A - Protein encapsulated insoluble gas microspheres and their preparation and use as ultrasonic imaging agents - Google Patents
Protein encapsulated insoluble gas microspheres and their preparation and use as ultrasonic imaging agents Download PDFInfo
- Publication number
- HUT74827A HUT74827A HU9503977A HU9503977A HUT74827A HU T74827 A HUT74827 A HU T74827A HU 9503977 A HU9503977 A HU 9503977A HU 9503977 A HU9503977 A HU 9503977A HU T74827 A HUT74827 A HU T74827A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- gas
- microspheres
- protein
- water
- insoluble
- Prior art date
Links
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 title claims abstract description 197
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 71
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 71
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 8
- 239000012216 imaging agent Substances 0.000 title 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 claims abstract description 193
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 39
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 29
- 229960004065 perflutren Drugs 0.000 claims abstract description 26
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 20
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims abstract description 16
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 16
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 79
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 48
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 44
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 claims description 36
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 34
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 32
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 32
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 claims description 18
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 13
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 claims description 12
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 claims description 12
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 11
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 claims description 5
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 claims description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 claims description 2
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 claims description 2
- 238000009392 mechanical decontamination Methods 0.000 claims 2
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 claims 2
- 239000002002 slurry Substances 0.000 claims 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 claims 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 abstract description 7
- 239000003570 air Substances 0.000 description 40
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 32
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 32
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 26
- 239000011257 shell material Substances 0.000 description 18
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 17
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 229910018503 SF6 Inorganic materials 0.000 description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 15
- SFZCNBIFKDRMGX-UHFFFAOYSA-N sulfur hexafluoride Chemical compound FS(F)(F)(F)(F)F SFZCNBIFKDRMGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 229960000909 sulfur hexafluoride Drugs 0.000 description 15
- 239000000463 material Substances 0.000 description 14
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 12
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 9
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 9
- WMIYKQLTONQJES-UHFFFAOYSA-N hexafluoroethane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)F WMIYKQLTONQJES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 4
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 4
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- TXEYQDLBPFQVAA-UHFFFAOYSA-N tetrafluoromethane Chemical compound FC(F)(F)F TXEYQDLBPFQVAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 241001466077 Salina Species 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 3
- 229910001882 dioxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 3
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 3
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 3
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 2
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 102000008192 Lactoglobulins Human genes 0.000 description 2
- 108010060630 Lactoglobulins Proteins 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 2
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 2
- 108010054176 apotransferrin Proteins 0.000 description 2
- CJPQIRJHIZUAQP-MRXNPFEDSA-N benalaxyl-M Chemical compound CC=1C=CC=C(C)C=1N([C@H](C)C(=O)OC)C(=O)CC1=CC=CC=C1 CJPQIRJHIZUAQP-MRXNPFEDSA-N 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 238000005188 flotation Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 238000003801 milling Methods 0.000 description 2
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- KAVGMUDTWQVPDF-UHFFFAOYSA-N perflubutane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F KAVGMUDTWQVPDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229950003332 perflubutane Drugs 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 2
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MTJGVAJYTOXFJH-UHFFFAOYSA-N 3-aminonaphthalene-1,5-disulfonic acid Chemical compound C1=CC=C(S(O)(=O)=O)C2=CC(N)=CC(S(O)(=O)=O)=C21 MTJGVAJYTOXFJH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010056388 Albunex Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- OTMSDBZUPAUEDD-UHFFFAOYSA-N Ethane Chemical compound CC OTMSDBZUPAUEDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 241000238367 Mya arenaria Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000000560 biocompatible material Substances 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- RJCQBQGAPKAMLL-UHFFFAOYSA-N bromotrifluoromethane Chemical compound FC(F)(F)Br RJCQBQGAPKAMLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 229940039231 contrast media Drugs 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000007872 degassing Methods 0.000 description 1
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical group SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000002961 echo contrast media Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 230000020169 heat generation Effects 0.000 description 1
- 229920000140 heteropolymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000005499 meniscus Effects 0.000 description 1
- 231100000324 minimal toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- -1 perfluoro Chemical group 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000035485 pulse pressure Effects 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002310 reflectometry Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000005549 size reduction Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-M tryptophanate Chemical compound C1=CC=C2C(CC(N)C([O-])=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920003176 water-insoluble polymer Polymers 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
- B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/22—Echographic preparations; Ultrasound imaging preparations ; Optoacoustic imaging preparations
- A61K49/222—Echographic preparations; Ultrasound imaging preparations ; Optoacoustic imaging preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, liposomes
- A61K49/223—Microbubbles, hollow microspheres, free gas bubbles, gas microspheres
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
- B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
- B01J13/04—Making microcapsules or microballoons by physical processes, e.g. drying, spraying
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Radiology & Medical Imaging (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Acoustics & Sound (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Manufacturing Of Micro-Capsules (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Description
Fehérjébe kapszulázott vízben nem oldódó gázt tartalmazó mikrogömbök és eljárás azok előállítására, valamint azok ultrahang diagnosztikai szerként történő felhasználása
A találmány tárgyát ultrahang diagnosztikai szerek képezik, amelyeket vízben nem oldódó gázokat bekapszulázó fehérje mikrogömbök alkotnak. A találmány tárgyát képezik továbbá az azok előállítására és alkalmazására szolgáló eljárások.
Az ultrahang diagnosztika arra az alapelvre épül, hogy a hangenergia hullámok az érdeklődés tárgyát képező területre fókuszálhatok és oly módon verődnek vissza, hogy annak a képét rajzolják meg, állítják elő. Az ultrahang vizsgálófejet a vizsgálni kívánt terület feletti test felszínre helyezik és így az ultrahang energia hullámok formájában arra a területre irányul. A vizsgálófej detektálja a visszaverődött hanghullámokat és videoképek formájában továbbítja az adatokat. Amikor az ultrahang energia áthalad az anyagon a visszaverődő energia mennyisége függ egyrészt a transzmisszió (továbbítás) sebességétől, valamint a test anyagának akusztikus tulajdonságaitól. A test anyagának akusztikus tulajdonságaiban végbemenő változások (például az akusztikus impedanciában bekövetkezett változások) a legszembetűnőbbek a különböző akusztikus sűrűségű érintkező felületek közül az olyanok esetében, mint például a folyadék - szilárd vagy folyadék - gáz határfelületek. Ebből következően, amikor ultrahang energiát juttatunk a szöveteken keresztül, a szervek szerkezeti felépítése által generált hangvisszaverődési jeleket az ultrahang berendezés vizsgálófeje detektálja. Ezek a jelek a megfelelő kontrasztanyag alkalmazásával felerősíthetők.
Az ultrahang diagnosztikai szerek közül a gázok alkalmazása különös jelentőséggel bír, mivel azok igen hatékony ultrahang visszaverő képességgel rendelkeznek. A rezonáns gázbuborékok hangszórása ezerszer hatékonyabb, mint az ugyanolyan méretű szilárd részecskéké. Ophir és Parker az Ultrasound in Medicine and Biology 15 (4) : 319-333, 1989 irodalmi helyen kétféle típusú gázt tartalmazó ultrahang diagnosztikai szert ismertetnek (1) szabad levegőt tartalmazó buborékokat és (2) kapszulázott levegő buborékokat. Mindamellett a Meltzer és társai, Ultrasound in Medicine and Biology 6 : 263-269, 1980 irodalmi hely szerint a megfelelő méretű szabad gázbuborékok túl rövid életűek ahhoz, hogy a legtöbb in vivő alkalmazások esetében hatékonyan felhasználhatók legyenek. Ophir és Parker ugyanakkor leszögezik, hogy a gázbuborékok kapszulázásának kifejlesztése e probléma megoldására jelent kísérletet.
Ahogyan az Ophir és Parker által ismertetésre került, a gáz tartalmú ultrahang kontraszt diagnosztikai szerek másik fő csoportját a bekapszulázott mikrobuborékok jelentik, amelyekre a leírás további részében mikrogömbökként hivatkozunk. A gázguborékot körülvevő héj fehérjéből vagy valamely egyéb biokompatibilis anyagból tevődik össze. A kereskedelmi forgalomban kapható hagyományos mikrogömb kontraszt szer az ALBUNEX^ (Molecular Biosystems, Inc., San Diego, CA), amely emberi albumin szérumba kapszulázott levegő mikrogömbökből áll. A megoldást részletesen a 4 572 203 és a 4 844 882 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások ismertetik.
DeJong, N. és társai az Ultrasound in Medicine and Biology 19 : 279-288, 1993 irodalmi helyen ismerteti álláspontja szerint a levegő mikrogömbök in vivő alkalmazásuk során gyorsan elveszítik jel visszaverő képességüket beinjekciózásukkor, illetve a véráramban keringve, amikor is 1.9995 x 10^ N/m3 nyomásnak vannak kitéve. A jelen találmány szerinti kapszulázási technológia olyan anyagok előállítására alkalmas, amelyek ultrahang kontrasztanyagként in vivő körülmények között elég hosszú életűek ahhoz, hogy a legtöbb kívánt alkalmazási célnak megfeleljenek. Gyakorlatilag olyan anyagokról van szó, amelyek a szívizom faláról készült diagnosztikai kép előállítására alkalmasak, ahol is legalább 3.3333 x 10^ N/m^ átmeneti pulzusnyomásnak kell, hogy ellenálljanak.
A mikrogömbök nyomás hatására jelentkező instabilitási problémájának megoldására irányuló törekvések közül a legutóbbi eredmények arra vonatkoznak, hogy a gázokat körülvevő héj anyagát javítsák, miután úgy gondolják, hogy a mikrogömb burkok vagy membránok nyomás hatásának kitéve túl törékenyek, illetve ridegek és in vivő körülmények között a mikrogömbök gyors összeeséséhez vezetnek. Giddey a PCT/EP91/01706 számú valamint a PCT 92/05806 számú nemzetközi szabadalmi bejelentésekben úgy vélik, hogy merevségüknél fogva a membránok nem tudnak ellenállni azoknak a hirtelen nyomás változásoknak, aminek a mikrogömbök ki lehetnek téve, például a szív pulzálásából adódó nyomás ingadozásoknak a véráramban haladva. A gázburok merevségének csökkentésére ő azt javasolja, hogy a levegőt nagy százalékban valamely viszkozitás növelő szert (40 % - 80 % poliolok) tartalmazó fehérje oldatban előemulgeálni kell, valamint mechanikai nyíróhatásnak kell kitenni valamely nagy sebességű keverőben. A megfelelő méretű buborékokat elválasztják és azok felületét lágy héj kialakításával valamely arra alkalmas felületaktív anyaggal stabilizálják.
A PCT WO 92/17213 számú nemzetközi szabadalmai bejelentésben Holmes javasolja a fehérje mikrogömbök stabilitásának in vivő javítására, hogy azok héj szerkezetét biológiailag lebontható térhálós vegyi reagensekkel erősítsék meg.
Bichon és mtsai a EPA 90/810367 valamint Schneider és mtsai a Inv. Rádiói. 27: 134139, 1992 irodalmi helyen 5 - 2000 nm közötti szemcseméretű polimer mikroballonnak előállítására szolgáló eljárást ismertetnek. Az európai szabadalmi bejelentésben azt írják, hogy a mikroballon burkolat mikroszemcsés szerkezetében rejlik a rugalmasság magyarázata, azaz a mikrogömbök könnyebben elviselik a nyomásváltozást anélkül, hogy összetörnének.
A 5 190 982 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban Erbel és Zotz ugyancsak egy olyan térhálósított szerkezetű mikrokapszulát ismertet, amely levegőt foglal magában.
Schneider és mtsai a EPA 554 213 leírásban arra hívják fel a figyelmet, hogy a mikrogömbök külső nyomással szembeni ellenálló képessége javítható, ha a bekapszulázott gázra az Sgáz / MWgáz kisebb vagy egyenlő 0.0031 arány jellemző, amely hányadosban Sgáz a gáz vízoldhatóságát jelenti liter/literben kifejezve, míg MWgáz érték a gáz átlagos molekulatömegét jelenti Dalton-ban kifejezve. A hivatkozott irodalmi hely 1. táblázatában többek között az N2 , a SFg, CBrF3 és a CF4 kerülnek felsorolásra, mint eme kritériumot kielégítő gázok. A szabalmi leírásban szereplő kitanítás szerint ezek a mikrogömbök két különböző eljárással állíthatók elő. Az első, két lépéses eljárás során önmagában ismert módon elkészítik a levegőt tartalmazó mikrogömböket és az azok belsejében található levegőt valamely gázcserélő eljárással, például: a levegővel töltött mikrogömböket megfelelő ideig a vízben nem oldódó gáz atmoszférában inkubálják, vízben nem oldódó gázra cserélik.
A másik egylépéses eljárás során, amely az EPA 324 938 számú szabadalmi leírásban kerül ismertetésre (lásd a szabadalmi leírás 1. kiviteli példáját) a mikrogömböket levegő helyett valamely vízben nem oldódó gáz felhasználásával állítják elő A módszer esetében a gázt a héj alapanyagát képező oldaton (például albumin oldaton) vezették keresztül, miközben egy hangképző tölcsért süllyesztettek az edénybe, majd eltávolították azt.
Sajnos ezen eljárások egyike sem alkalmas a gyakorlatban vízben nem oldódó gázokkal töltött fehérje kapszulázott mikrogömbök előállítására. A sorrendben elsőként említett két lépéses eljárás alkalmazásakor a levegővel töltött mikrogömböknek csupán egy kis száma bírja ki valamely vízben nem oldódó gáz környezeti behatását (lásd a két lépéses eljárás második lépését). Az oldódó gázok (levegő) kiáramlása a mikrogömbökből nagyobb, mint a nem oldódó gázok beáramlása a mikrogömbökbe, amely a mikrogömbök teljes összeomlását eredményezi, amikor is a héjnak csupán a töredékei maradnak vissza. Ez a hatás különösen az olyan leginkább vízben oldhatatlan gázok, mint például a perfluor-etán, esetében nyilvánul meg. A másik eljárás hátránya, hogy olyan mikrogömböket állít elő, amelyek túlnyomás hatására veszítenek térfogatukból és nyomáscsökkenés hatására sem nyerik vissza eredeti alakjukat. Úgy gondoljuk, annak magyarázata, hogy ezekkel az eljárásokkal gyenge minőségű mikrogömbök állíthatók elő az, hogy a mikrogömbök jelentős mennyiségű levegőt tartalmaznak és az előállítás levegő jelenlétében zajlik, ami károsan befolyásolja a mikrogömbök kialakítását, ahhoz képest, mintha az egyedül az oldhatatlan gáz jelenlétében történne. E tekintetben megjegyezzük, hogy a korábbi vizsgálódások során megállapították, hogy az oxigéngáz jelenléte elengedhetetlen a mikrogömbök üregesítéssel történő előállításához.
Suslick munkájában azt fejtette ki, hogy az ultrahanggal történő üregesítés mikrogömbök előállítására csak oxigén gáz jelenlétében képzelhető el. Suslick és munkatársai a Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 7708 - 7710, 1991; valamint a J, Am. Chem. Soc. 112: 7807 7809, 1990 irodalmi helyeken leírják, hogy a stabil fehérje héj kialakulásához szükséges diszulfid kötések intermolekuláris átrendeződése által indukált üregesedésben az oxigén szerepet játszik. Suslick leszögezi: Azt találtuk, hogy a mikrokapszula képződést az oxigén távolléte erősen gátolta. Majd így folytatja: Amennyiben a reakciót valamely inért gáz atmoszférában (He, Ar vagy N2) hajtjuk végre, nem alakulnak ki mikrokapszulák. Lásd továbbá a 4 774 958 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást. Az a korábbi meggyőződés, miszerint az albumin mikrogömbök képződéséhez levegő kell, Holmes is megfogalmazta a WO 92/17213 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentésben. Ugyanitt különböző kis molekulatömegü gázt tartalmazó mikrogömb előállítást írtak le. Mindamellett, amikor a hangkeltéssel történő albumin mikrogömbök előállítását ismertetik, a szerzők kijelentik: Az elegyből hangkeltéssel levegő jelenlétében történő gáztartalmú buborék létrehozására egyéb, jól kidolgozott eljárást ismertetnek az A - 4 774 958 számú amerikai szabadalmi bejelentésben.
Egyik aspektusát tekintve a jelen találmány arra a váratlan felismerésre épül, hogy a vízben viszonylag oldhatatlan gázt tartalmazó fehérjetartalmú mikrogömbök nagy koncentrációban állíthatók elő ultrahangos vagy mechanikai üregesítési eljárásokkal az oldhatatlan gáz jelenlétében és oxigén távollétében. Az ily módon előállított mikrogömbök meglepően jó és nagymértékben javult stabilitást mutatnak és az alkalmazott nyomással szembeni rugalmassággal, továbbá azonos vagy jobb visszaverődési képességgel rendelkeznek. A fehérjetartalamú gömbhéj megakadályozza a kémiai reakciót és ellenáll az azt körülvevő környezeti oldott légköri gázok diffúziója révén bekövetkező térfogatnövekedésnek.
A jelen találmány egy másik aspektusát tekintve a fehérje burokkal körülzárt mikrogömbök olyan új előállítási eljárására vonatkozik, amely mechanikai energiát alkalmaz nyíróerők formájában. Ezeknek a mechanikai nyíróerőknek a hatására a folyadék-gáz elegyből mikrobuborék szuszpenzió jön létre és emellett hidrodinamikai üregesedés is zajlik, ami energiafelszabadulással jár. Ez az energia a környező folyadékban abszorbeálható és a lokalizált fehérje denaturációra hatást gyakorolva a gáz-folyadék határfelületeket átrendezve diszkrét mikrogömböket hoz létre. A hidrodinamikai üregesedés az ultrahang (akusztikus) üregesedéstől azon az alapon különböztethető meg, hogy melyik hoz létre nyomásváltozásokat a folyadékrendszerekben, illetve melyik jár energia felszabadulással. Korábbi módszerek esetében a nyomásváltozásokat a folyadéknak egy nyíláson keresztül történő gyors áramoltatásával vagy a folyadék felszínén indukálták. Ez utóbbi esetben nagy frekvenciás hanghullám ciklusok gyors helyi nyomásingadozásokat hoztak létre. Lásd ezzel kapcsolatban: F. Ron Young 1989 Cavitation Pages 4-5, McGraw-Hill Book Co. London irodalmi helyet. Ráadásul a hidrodinamikai üregesítés áramló folyadékban történik, azaz a folyadék valamely stacioner objektumon, illetve azon keresztül áramlik. Ezzel szemben a növekvő és csökkenő nyomásciklus (pozitív nyomás és szívás) által létrejött akusztikus üregesedés olyan folyadék rendszerben zajlik, amely állandó kell, hogy maradjon, elegendő legyen az üregesedési folyamat fenntartásához. Még az olyan folyamatos áramló hangképzési rendszerekben is, mint amilyet a 4 957 656 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás ismertet, • · · • « bonyolultabb az akusztikus üregesítés rezgési idejét szabályozni, mint a jelen találmány szerinti, valóban egy áramú hidrodinamikai üregesítési rendszerben zajló megoldás során.
A mechanikai nyíróerők alkalmazásával előállított mikrobuborék szuszpenziók önmagukban is használatosak kontrasztanyagokként, illetve további feldolgozással mikrogömbökké alakíthatók. Például a WO 92/05806 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentés olyan mikrobuborék szuszpenzió előállítási eljárást ismertet, ahol a mikrobuborék szuszpenzió fogalom olyan filmszerű fehérje hab-ra vonatkozik, amelyet egy viszkozitásnövelő anyagot tartalmazó fehérje oldat durva habbá történő felverésével állítanak elő olyan állandó hőmérsékleten, amely alacsonyabb annál, hogy a fehérje denaturálódjék. Az eljárás eredményeként kapott habot ezután mechanikai nyíróerőnek teszik ki, kívánt mennyiségű buborékot állítva elő, amelyek stabilitását a felhasználásra került viszkozitás növelő anyag biztosítja. A buborékok ezt követően, a buborékokat körülvevő fehérje film megszilárdítása céljából tovább alakíthatók mikrogömbökké melegítéses denaturációval, illetve térhálósító szerek hozzáadásával.
A 0 450 745 Al közzétételi számú európai szabadalmi bejelentés olyan mikrogömbök előállítási eljárását ismerteti, amelynek során mechanikai nyíróerő alkalmazásával valamely olaj a vízben emulziót képeznek és azzal egyidejűleg vagy azt követően vízben nem oldódó polimert adnak hozzá, amely az érintkező határfelületekre rakódik le. A hidrofób fázist ezután betöményítik, ily módon levegővel vagy gázzal töltött mikrogömböket állítva elő.
Mindezek alapján a jelen találmány tárgyát képezi a melegítéssel denaturálható fehérjékből előállítható mikrogömbök készítésére szolgáló javított eljárás is, amelynek során a fehérje oldatot mechanikai nyíróerök hatásának tesszük ki. Ezek a nyíróerök a mikrobuborékok szuszpenzióját hozzák létre, amelyeket egyidejűleg vagy azt követően diszkrét fehérje héjjal kapszulázzuk be. A melegítéssel történő üregesítési eljárás során, az eljárás természeténél fogva a fehérje denaturáció lokalizált és a képződött héj a folyadék - gáz határfelületeken rakódik le. Ennél az új eljárásnál könnyebb a méretnövelést megvalósítani és összehasonlítva az ezt meglőző akusztikus elven alapulú mikrogömb előállítási módszerekkel, növekedett a végtermék kitermelése.
A találmány tárgya egyfelől ultrahang diagnosztikai szerként alkalmazható kapszulázott gáz mikrogömbök előállítására szolgáló eljárás, amelynek során valamely filmképző fehérje vizes oldatának és valamely gyógyszerészetileg elfogadott vízoldhatatlan gáznak az elegyét ultrahang vagy mechanikai behatás alkalmazásával üregesítjük oxigén kizárásával.
Másrészt a találmány tárgya ultrahang diagnosztikai szerként alkalmazható kapszulázott gáz mikrogömbök előállítására szolgáló eljárás, amelynek során valamely filmképző fehérje vizes oldatának és valamely gyógyszerészetileg elfogadott vízoldhatatlan gáznak az elegyét ultrahang vagy mechanikai behatás alkalmazásával üregesítjük olyan készülékben, amely a környező légkörtől elzárt.
Továbbá a találmány tárgyát képezi maga az ultrahang diagnosztikai készítmény, amely hőkezelés hatására vízoldhatatlanná alakuló filmképzö fehérjébe kapszulázott gáz mikrogömbök vizes szuszpenziója, ahol a kapszulázott gáz teljes egészében gyógyszerészetileg elfogadható, vízben nem oldódó gáz.
Ezen túlmenően a találmány tárgyát képezi az az ultrahang diagnosztikai készítmény, amely hőkezelés hatására vízoldhatatlanná alakuló filmképzö fehérjébe kapszulázott perfluorpropán gáz mikrogömbök vizes szuszpenziója.
Mindamellett a találmány tárgyát képezi az ultrahang kép diagnosztikai szerként alkalmazható kapszulázott gáz mikrogömbök előállítására szolgáló eljárás, amely a következő műveleti lépésekből áll:
• · ·
a) a hőfoknövelés hatására denaturálódó fehérje olyan hőmérsékletű vizes oldatát állítjuk elő, amely hőmérséklet szükséges ahhoz, hogy az azt követő mechanikai emulgeálás során a denaturálódás elkezdődjön;
b) az oldatot gázzal elegyítjük;
c) az elegyre mechanikai nyíróerőt fejtve ki, a fehérje oldat és a gáz elegyét emulgeáljuk, ily módon képezve körülbelül 0.1 és körülbelül 10 mikron közötti tartományba eső közepes átmérőjű mikrobuborékok szuszpenziót;
valamint
d) a mikrogömbök előállítása céljából a gázbuborékokat bekapszulázzuk a mikrogömb szuszpenzió mechanikai üregesítésével, amikor is a fehérje denaturációját idézzük elő, amely denaturálódott fehérje a gáz és a folyékony oldat érintkezési határfelületein rakódik le.
A leíráshoz mellékelt rajzok ismertetése
Az 1. ábra egyik őrlőmalom típus darabokra szétszedett sematikus képét mutatja be (Gaulin malom), amely a találmány szerinti mechanikai üregesítési eljárás céljára alkalmazható.
A 2. ábra egy másik őrlőmalom típus darabokra szétszedett sematikus képét mutatja be (Bematek malom), amely a találmány szerinti mechanikai üregesítési eljárás céljára alkalmazható.
A 3. ábra egy további őrlőmalom típus darabokra szétszedett sematikus képét mutatja be (Gaulin malom), amely a találmány szerinti mechanikai üregesítési eljárás céljára alkalmazható.
A 4a ábra levegővel töltött albumin mikrogömbök nyomásállóságát szemlélteti. A mikrogömb szuszpenziót fecskendőbe töltöttük és 2.756 x 10^ Pa túlnyomást hoztunk létre. A • · · ·· · • · · · ·· · ··· « · ··«· • « ·«· ·· diagram az anyag részecskeméret eloszlását mutatja a túlnyomás létesítése előtt és azt követően.
A 4b ábra perfluor-propánnal töltött albumin mikrogömbök nyomásállóságát szemlélteti. A mikrogömb szuszpenziót fecskendőbe töltöttük és 2.756 x 10^ Pa túlnyomást hoztunk létre. A diagram az anyag részecskeméret eloszlását mutatja a túlnyomás létesítése előtt és azt követően.
A 4c ábra perfluor-etánnal töltött albumin mikrogömbök nyomásállóságát szemlélteti. A mikrogömb szuszpenziót fecskendőbe töltöttük és 2.756 x 10^ Pa túlnyomást hoztunk létre. A diagram az anyag részecskeméret eloszlását mutatja a túlnyomás létesítése előtt és azt követően.
A 4d ábra kén-hexafluoriddal töltött albumin mikrogömbök nyomásállóságát szemlélteti. A mikrogömb szuszpenziót fecskendőbe töltöttük és 2.756 x 10^ Pa túlnyomást hoztunk létre. A diagram az anyag részecskeméret eloszlását mutatja a túlnyomás létesítése előtt és azt követően.
A 4e ábra argonnal töltött albumin mikrogömbök nyomásállóságát szemlélteti. A mikrogömb szuszpenziót fecskendőbe töltöttük és 2.756 x 10^ Pa túlnyomást hoztunk létre. A diagram az anyag részecskeméret eloszlását mutatja a túlnyomás létesítése előtt és azt követően.
Az 5. ábra a mikrogömbök hígított szuszpenzióinak nyomással szembeni ellenálló képességét mutatja 2.067 x 10^ Pa nyomás esetében. A mikrogömbök hígított szuszpenzióját minden esetben 1 cm átmérőjű követtákba töltöttük, majd t=30 másodpercnyi ideig 2.067 x 10^ Pa nyomásnak tettük ki. A diagrammon perfluor-etánnal, perfluor-propánnal, kénhexafluoriddal, valamint levegővel töltött mikrogömbök mért adatait mutatjuk be.
• · «
A 6. ábra argonnal töltött mikrogömbök hígított szuszpenziójának nyomással szembeni ellenálló képességét mutatja 2.067 x 10^ Pa nyomás esetében. Az argonnal töltött mikrogömbök hígított szuszpenzióját 1 cm átmérőjű küvettákba töltöttük, majd t=30 másodperc ideig 2.067 x 10^ Pa nyomásnak tettük ki.
A 7. ábra a gázmentesített puffer oldat mikrogömbökre gyakorolt hatását mutatja be. Fokozatosan növekvő mennyiségű gáztalanított pufferhez adtunk mikrogömböket tartalmazó oldatokat és állandó keverés közben az elegyet állandó térfogatra egészítettük ki a koncentráció meghatározása céljából. Levegővel, perfluor-propánnal, perfluor-etánnal, valamint kén-hexafluoriddal töltött mikrogömbök adatait vázoltuk fel a gáztalanított puffer térfogatának függvényében.
A 8. ábra az alábbiakban all. kiviteli példában ismertetett adatok grafikus ábrázolását mutatja be.
A jelen találmány szerinti új mikrogömbök filmképző fehérjék vizes oldatának ultrahangos vagy mechanikai üregesítése útján kerülnek előállításra vizes szuszpenzió oldat formájában, valamely vízben nem oldódó gáz jelenlétében és lényegében oxigén távollétében, azaz anaerob körülmények között (zárt rendszerben). Az előállított mikrogömbök hangvisszaverő képességgel rendelkeznek és miután átlagos szemcseátmérőjük 10 mikronnál kisebb és 0.1 mikronnál nagyobb, méretüket tekintve bejuttathatok a szervezetbe tüdőn keresztül is. A mikrogömbök részecske méreteloszlása frakcionálástól függően változhat. Elkülöníthetők kisebb és nagyobb mikrogömb fajták. A találmány szerinti mikrogömbök a feleslegben lévő vizes fázis eltávolításával betöményíthetők vagy be nem töményíthetők lehetnek, illetve azok elválasztását követően valamely második vizes oldatban újra szuszpendáltathatók.
Ezeknek az új mikrogömböknek az előállítására használt gáz csak gyógyszerészetileg elfogadott lehet és vizes közegben és ott, abban a közegben, ahová kerülni fog, oldhatatlannak • · · kell lennie (azaz először abban a közegben, amelyben előállítjuk, majd pedig ott ahol használják: a vérben). A vízben való oldhatóság illetve oldhatatlanság jó közelítése az ilyen közegben való oldhatóságnak. A gáz elnevezés olyan vegyületre vonatkozik, amely gáz halmazállapotú vagy azon a hőmérsékleten, amelyen az ultrahang diagnosztikai eljárást végzik (jellegzetesen normál testhőmérsékleten) gáz halmazállapotúvá alakul. A gáz állhat egyetlen vegyületből vagy vegyületek elegyéből. A találmány szerinti megoldás céljára alkalmas gázok sorába tartoznak - de a gázok köre nem korlátozódik csupán ezekre - a fluor tartalmú gázok, mint például a kén-hexafluorid, perfluor-etán, a perfluor-propán, a perfluor-metán, valamint a perfluor-bután. A gáz oldhatósága a kérdéses gáz Bunsen koefficiensének meghatározásával adható meg. Ez az érték azt a gáztérfogatot jelenti, amely valamely oldószer egységnyi térfogatában abszorbeálódik. (Lásd W-Y, Muccitelli, JA, J. Sol. Chem. 8: 225-240 (1979) irodalmi helyen található utalást.) A jelen találmány szerinti célra alkalmas gáz Bunsen koefficiensének vízben 25 °C-on kevesebb, mint 0.01 ml/ml oldat értéknek kell lennie. A következő 1. táblázatban megadtuk néhány gáz Bunsen koefficiensét.
1. táblázat
A gázok Bunsen koefficiense vízben ( 1 atmoszféra, ml/ml)
| gáz | 5 °C | 25°C |
| széndioxid | 1.383 | 0.824 |
| argon | 0.047 | 0.033 |
| oxygén | 0.043 | 0.031 |
| nitrogén | 0.021 | 0.016 |
| kén hexafluorid | 0.008 | 0.0054 |
| perfluorometán | 0.0082 | 0.00504 |
| perfluoroetán | 0.0027 | 0.00138 |
• ·
perfluoropropán
0.0016
N/A perfluorobután
0.0007
N/A
A mikrogömbökben található gáz egy további jellemzője, hogy a gáz diffündáló képessége 4 x 10^ cm2/sec-nál kisebb kell, hogy legyen 25 °C-os vízben. Mindamellett meg kell jegyeznünk, hogy a diffundáló képességet mérő konstans különböző oldószerekben és más-más hőmérsékleteken különböző értékeket vehet fel, változhat, de a gáz kiválasztása céljából a gáznak ki kell elégítenie ezt a kritériumot.
A gyógyszerészetileg elfogadható tulajdonság arra utal, hogy a kiválasztott gáznak biológiailag kompatibilisnek kell lennie és minimális toxicitású kell, hogy legyen.
A találmány szempontjából előnyös a perfluor-propán gáz, mivel az vízben oldhatatlan (1), az előállítás hőmérsékletén nem kondenzálódik (2), nincsenek izomer alakjai (3), és olyan mikrogömböket ad, amelyek kitűnő nyomásállósággal rendelkeznek (4), továbbá farmakológiai szempontból ugyancsak elfogadhatóak (5).
A gáz mikrobuborékot filmképző fehérje héjjal kapszulázzuk be. A filmképző elnevezés a fehérje héjképző képességére, tulajdonságára vonatkozik a bezárt gáz körül, amelynek hidrofil csoportjai kifelé, míg hidrofób csoportjai befelé irányulnak a fehérje oldhatatlanná válása során (hő hatására végbemenő denaturáció). A fehérje molekula szükségszerűen rendelkezik hidrofil és hidrofób aminosavakkal egyaránt. A találmány céljára alkalmas fehérjék sorába tartoznak az olyan természetes, illetve a természetben előforduló fehérjék, mint például az albumin, a γ-globulin (emberi), apo-transzferin (emberi), βlaktoglobulin és az ureáz. Jóllehet a találmány szempontjából a természetben előforduló fehérjék előnyösek, a tercier szerkezetű és melegítve denaturálódó szintetikus fehérjék (homopolimerek vagy heteropolimerek) is felhasználhatók. A jelen találmány céljára
különösen megfelel az albumin, és még előnyösebb az emberi albumin. A fehérje oldat formájában kerül felhasználásra, az oldat koncentrációja körülbelül 0.1 és 10 5 (w/v) % közötti, előnyösen körülbelül 1.0 és 5 (w/v) % közötti és legelőnyösebben körülbelül 1 (w/v) %.
A jelen találmány céljára, illetve az előállítani kívánt mikrogömbök készítésére alkalmas fehérjék lehetnek az élő szervezetben való felhasználás céljára kémiailag módosítottak vagy immunológiai aktivitásukat tekintve kioltottak (például polietilén-glikollal módosítottak). Mindamellett a jelen találmány szerinti megoldás nem foglalja magában kémiai térhálósítószerek hozzáadását, illetve a mikrogömbök képzése céljára használt fehérjék járulékos vagy további módosítását.
A jelen találmány szerinti mikrogömböket a vízben nem oldódó gáz jelenlétében, oxigén kizárásával végzett üregesítés eredményeként az oldatban levő fehérjék egy részének oldhatatlanná tételével állítjuk elő (azaz olyan zárt rendszerben, ahol a levegővel való érintkezést kizárjuk). Az ilyen, fehérje oldhatatlanná tételi eljárás elsősorban helyi fehérje denaturációval jellemezhető, valamint a gáz mag körüli orientációval, mely utóbbi jellemző az oldhatatlan gáz jelenlétében tovább fokozható.
A jelen találmány szerinti mikrogömbök képzését szolgáló, a fehérje hőkezeléssel történő oldhatatlanná tételére alkalmas rendszer, anaerob rendszer kell, hogy legyen; azaz a légkörtől elzárt, amelyre a továbbiakban a zárt rendszer -ként hivatkozunk. Ezzel ellentétben a nyitott rendszer a légköri atmoszférára nyitott. Jelen esetben a mikrogömbökbe zárt gázt egy olyan zárt rendszerben állítjuk elő, amely szükségképpen csak az előállításhoz szükséges vízben oldhatatlan gázt tartalmazza. A légköri gázokkal való szennyeződést oxigén elektród alkalmazásával határozhatjuk meg, az oxigén jelenlétét mérve az áramló rendszerben. A jelen találmány értelmében a mikrogömböket olyan rendszerben állítjuk elő, amely kezdetben csupán a képződéshez szükséges gázt tartalmazza. Amikor azonban a gáz tartalmat kísérleti úton meghatározzuk, a kísérleti eljárás során bizonyos mennyiségű légköri gázokkal való
szennyeződés elkerülhetetlen. Ily módon a méréssel kapott gáz mennyisége kevesebb, mint 100 %. Mindezek alapján azokra a mikrogömbökre, amelyek előállításakor a rendszer kiindulási gáz koncentrációja teljes egészében az oldhatatlan gáz volt, az jellemző, hogy a mért gáz tartalom nagyobb, mint 85 (v/v) %. A mikrogömbök előállítását vagy képződését követően a kiszerelés vagyis a csomagolás során el kell kerülni a levegővel való érintkezést. Például a zárt rendszerből való kivételét követően 5 és 30 másodperc közötti időtartamon belül a mikrogömböket ampullákba vagy egyéb más, levegőtől elzárható tartóedénybe kell csomagolni és úgy forgalomba hozni. Ezen túlmenően az ampullában a folyadékszint és a fedél közötti térfogatot ki kell küszöbölni vagy az előállításra használt gázzal kell kitölteni a csomagolás során.
Vízben oldhatatlan gázzal töltve ezek a fehérje mikrogömbök kiváló stabilitást mutatnak. Körülbelül 1x10^ darabszámú mikrogömb/liter koncentrációban 2.756 x 10$ Pa nagyságú túlnyomást is kibírnak. Ezeknek a mikrogömböknek a rugalmassága is kiváló hígított szuszpenzióban 2.067 x 104 - 6.89 x 10^ Pa kompressziós nyomás hatására, majd pedig a túlnyomás megszűntetését követően visszanyerik eredet térfogatukat. Ezen túlmenően kémiai térhálósító szerek hozzáadása előnytelen lenne, mert akkor a kapott mikrogömbök túl merev szerkezetűvé válnak ahhoz, hogy fokozott nyomásállósággal rendelkezzenek.
A jelen találmány szerinti mikrogömbök a szabad mikrobuborékoktól eltérően ellenállnak a keveredés és diffúzió okozta expanziónak. A levegőn, illetve oxigénnel telített oldatban inkubált, vízben nem oldódó gázt tartalmazó mikrogömböknek különböző hőmérsékleteken nem növekszik a közepes átmérője, illetve nem növekszik azok össztérfogata. A fehérje héj nyomás hatására rugalmasan viselkedik és elég erős ahhoz, hogy ellenálljon a gázok diffúziója vagy cseréje által indukált expanziónak, illetve szakítóerönek. A fehérje héj jelenléte meggátolja a keveredést, valamint a levegővel töltött fehérje mikrogömbökhöz hasonlóan kis méretű egyedi gázbuborékok alakjában tartja néhány hónapig. A szolvatált atmoszférikus gázok vízben nem oldódó gázzal történő kicsrélésével kapott mikrogömböknek az a tulajdonsága, hogy nem képesek mérhető expanzióra, új és az anyagnak • >
ultrahang diagnosztikai szerként történő felhasználása szempontjából kulcsfontosságú tulajdonság.
A vízoldhatatlan gázt magukba záró fehérje mikrogömbök gázmentesített vizes oldatok hatásának kitéve nem omlanak össze. Eltérően a szabad mikrobuborékoktól, illetve a levegővel töltött kapszulázott mikrogömböktól a vízben oldhatatlan gázzal töltött mikrogömbök vákuummal gázmentesített vízhez is hozzáadhatok és nagy hígításnál is megtartják épségüket. A levegővel töltött kontrasztanyag a vérben összeesik a gázfázis oxigén komponensének áramlása következtében. A vízoldhatatlan gázzal töltött mikrogömbök azon tulajdonsága, hogy nem esnek össze a részben gázmentesített vagy nyomás alá helyezett környezetben, igen jelentős mértékben növeli in vivő körülmények között az ultrahang kontraszt időtartamát.
A jelen találmány szerinti mikrogömbök ultrahang vagy mechanikai üregesítés útján állíthatók elő. Levegővel töltött mikrogömbök ultrahangos módszerrel végzett előállítási eljárását ismerteti Cemy a 4 957 656 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban.
A jelen találmány szerinti új vízoldhatatlan gázzal töltött mikrogömbök előállítására szolgáló előnyös eljárás a mechanikai üregesítés. Ez a módszer levegővel töltött vagy oldható gázzal (például nitrogénnel, hidrogénnel vagy argonnal) töltött mikrogömbök előállítására is alkalmazható.
A jelen találmány szerinti új mechanikai üregesítési eljárás során a hőhatásra denaturálódó fehérje vizes oldat hőmérsékletét olyan értékre állítjuk be, amely szükséges ahhoz, hogy az oldat az azt követő mechanikai emulgeálás során elérje a kezdődő denaturálási hőmérsékletet. A fehérje oldat denaturálási hőmérséklete normál esetben 50 °C és 100 °C közötti höfoktartományba esik. A hő fokértékeket az irodalomban közölt termális fehérje denaturációs táblázatokból vagy bármely ismert eljárással, kísérleti úton kaphatjuk meg.
Például a denaturáció hőmérséklete kísérletileg úgy határozható meg, hogy a fehérje oldatot vízfürdőben állandó keverés közben melegítjük. A denaturáció hőfoka az a hőmérsékleti érték, amelynél az oldhatatlan csapadékot először észleljük. Meg kell azonban jegyezni, hogy a denaturáció hőmérséklete függ a fehérje természetétől, tisztaságától és eredetétől, az oldat fehérje koncentrációjától, az oldat pH értékétől, a puffer összetételétől, az ionerősségtől, stabilizálószerek jelenlététől, kémiai denaturálószerek, illetve detergensek jelenlététől. Ezért a fehérje denaturációs hőmérsékletének meghatározása a mikrogömbök előállítási körülményei között szükségszerű. Kívánt esetben olyan adalékanyagok, mint a detergensek vagy a poláros oldószerek alkalmazhatók a denaturálás hőmérsékletének meghatározásához.
Az alábbi 2. táblázat néhány természetben előforduló fehérje a fentiekben ismertetett módon kísérletileg meghatározott denaturációs hőmérsékletét adja meg.
2. táblázat
| Fehérje típus | Koncentráci ó | pH | Oldószer | A denaturáció hőmérséklete (°C) |
| Humán Serum | 0.9% NaCl, 4mM | 75 °C | ||
| Albumin, USP | 50 mg/ml | 6.9 | nátrium kapriát, | |
| Swiss Red Cross | 4mM triptoftanát | |||
| (Bern, Svájc) | ||||
| Humán szérum | 0.9% NaCl, 4mM | |||
| albumin, USP | 10 mg/ml | 6.9 | nátrium kapriát, | 78 °C |
| Swiss Red Cross | ImM triptoftanát | |||
| (Bern, Svájc) |
| β - laktoglobulin, | 25 mg/ml | 7.6 | USP víz | 90 °C |
| Sigma (St.Louis, MO) | ||||
| αβ- Globin, | 25 mg/ml | 5.0 | USP víz | 90 °C |
| Sigma (St.Louis, MO) | ||||
| Lysosime | 5 mM TRIS x , | 31 °C | ||
| Sigma (St.Louis, MO) | 100 mg/ml | 7.5 | 2 mM DTT xxx | a DTT hozzáadását |
| követően azonnal | ||||
| mért | ||||
| Humán Gamma | 10 mM MESXX, | |||
| Globulin | 40 mg/ml | 5.0 | pH 5.0 | 66 °C |
| savas pH beállítás | ||||
| Sigma (St.Louis, MO) | ||||
| Humán Gamma | lOmM TRIS, | |||
| Globulin | 40 mg/ml | 9.8 | pH 9.8 | 69 °C |
| bázikus pH beállítás | ||||
| Sigma (St.Louis, MO) | ||||
| apo-transzferrin | 20 mg/ml | 7.5 | 10mMTRISx | 71 °C |
| Sigma (St.Louis, MO) |
x TRIS = 2-amino-2(hidroxi-metil)-l,3-propándiol xx MES = 2-(N-morfolino)-etán-szulfonsav xxx DTT = ditiothreitol
A fehérje oldatban való gázelosztásra szolgáló készülékek mindegyike a fehérje oldat bizonyos mértékű járulékos felmelegedését okozza az oldatra gyakorolt mechanikai nyíróeröknek köszönhetően. Ez a felszabaduló hőmennyiség elegendő kell legyen ahhoz, hogy a gáz-folyadék határfelületen helyi fehérje denaturációt okozzon. Ily módon fontos, hogy meghatározzuk a készülék által okozott hőmérséklet emelkedés nagyságát, mert a fehérje oldat készülékbe való beviteli hőmérsékletét úgy kell beállítani, hogy a lokális termális denaturációt elérjük. A készülékbe töltött folyadék nagy részének (zömének) hőmérséklete közvetlenül az üregesítés előtt speciálisan egybe kell, hogy essen azzal a hőmérséklettel, amelynél a denaturáció fellép. Az üregesítés folyamata önmagában is járulékos hőfejlődéssel jár együtt, amely a fehérje helyi denaturációjához szükséges. A denaturáció kezdetének hőmérséklete definíciószerűen az a hőmérséklet, amelynél az oldatban levő fehérje a denaturáció határán van, de az oldat még egyáltalán nem tartalmaz denaturálódott fehérjét. Ez a hőmérsékleti érték épp a denaturáció hőmérséklete alatt van, jellegzetesen 1 °C és 5 °C-al alacsonyabb annál. Kívánt esetben a kiindulási fehérjeoldat a készülékbe töltés előtt előmelegíthető arra a hőmérsékletre, amely már lehetővé teszi, hogy az oldat elérje a kezdődő denaturáció hőmérsékletét.
Amikor a fehérje oldat helyes kiindulási hőmérsékletét beállítottuk, az oldatot a megfelelő gázzal elegyítjük, például az emulgeáló lépés során vagy azt megelőzően a gázt adott mennyiségben bevezetjük a protein oldatba. Ez a mennyiség 5 és 200 % gáz : folyadék aránynak, előnyösen körülbelül 20 és 100 % közötti gáz : folyadék aránynak felel meg. A helyes gáz : folyadék arány a készülék geometriai felépítésétől, a gáz fizikai tulajdonságaitól (oldhatóságától, sűrűségétől, molekulatömegétől stb.) függ, mindezek az optimális outputnak megfelelően beállíthatók.
Miután a gáz és fehérje oldat elegyet egyesítettük, az elegyet a mikrogömbök kialakulásához vezető körülmények között és paraméterek mellett emulgeáljuk és üregesítési hatásnak tesszük ki. Az eljárást egy olyan készülékben hajtjuk végre, amelyben a mechanikai nyíróhatás és a hidrodinamikai üregesítés végrehajtható, így például nagy sebességű keverökben, malmokban, fluidizáló berendezésekben és ehhez hasonlókban. A találmány szempontjából előnyös készülék az a kolloid malom, amelyet a következőképpen definiálunk: nagy sebességű forgórészt és egy állórészt tartalmazó gép, amelyben a diszperzió vagy emulgeálás szemben álló felületek együttműködésének hatására következik be. Lásd « «
Advanced Filtration and Separation Technology, p. 108-110. irodalmi hely. A találmány céljára alkalmas őrlökészülékekre példaként az alábbiakat említjük:
Model #2 1/2- Bematek, Beverly, MA
| Model W25OV | - Greerco, Hudson, NH |
| Model 2F | - APV Gaulin, Everett, MA |
| Model L4R | - Silverson, Chesham, UK |
Model Polytron
| PT 3000 | - Kinematica, Littaw, Switzerland |
Amikor vízben oldhatatlan gázzal töltött mikrogömbök előállítására használjuk a kolloid malmokat, azoknak a légkörtől elzártaknak kell lenniük, ily módon elkerülhetjük, hogy az elegy levegővel érintkezzék.
A mellékelt 1-3. ábrák néhány a mechanikai üregesítési eljárásban alkalmazható őrlőgép típus további részleteit mutatják be.
Az első ábra a Gaulin malom lényeges alkotóelemeit ábrázolja. Ezek a következők: forgó 10 tengely, amely működési kapcsolatban van a motorral. A 10 tengely végére rögzítve van egy 12 forgótányér; valamint egy 11 állórész. All állórész rendelkezik egy központi 18 nyitott furattal, valamint egy 16 ellenfurattal, amely a 12 forgótányér befogadására alkalmas. Ebbe az őrlőmalomba a fehérje oldatot és a gázt a 15 T alakú cső elágazáson keresztül tápláljuk be. A fehérje oldatból és gázból álló elegyet a 12 forgótányér és a 11 állórész közötti térben emulgeáljuk és üregesítjük. A malom nyílás-a az állórész 16 ellenfuratának 17 sugárirányú felülete, valamint a forgórész körmenti sugárirányú felülete közötti térköz. A mikrogömb termék hőmérsékletét (például az ábrán nem látható termoelemmel) mérjük, amikor az elegy a 11 állórészen keresztül elhagyja a készüléket.
A 2. ábra a Bematek őrlőmalom lényegi elemeit mutatja be. Ez a malom a szerkezetét és működését tekintve is hasonló az 1. ábrán látható Gaulin malomhoz. A fő különbséget a forgórész és az állórész ellenfuratának kialakítása jelenti. Ennek részét képezi a 20 forgó tengely, amely azt a csonkakúp alakú 21 forgórészt hordozza, amely 22 csavarmenetes elülső tengelyvéggel rendelkezik; valamint egy 25 hengeres nyílással és egy 24 csonkakúp alakú 24 ellenfurattal rendelkező 23 állórészből, amely a forgórész befogadására szolgál. A fehérje oldat/gáz elegyet az őrlőmalomba ezen a 25 nyíláson keresztül tápláljuk be. A 22 tengely csavarmenetei között áthaladva a gáz és az oldat összekeveredik, majd a malom nyílásán áthaladva az elegy emulgeálódik és megtörténik üregesítése. A nyílást a forgórész kúpos felületei és az állórész közötti térrészként definiálhatjuk.
A 3. ábrán a Silverson malmot mutatjuk be. Ennek az őrlőberendezésnek a szerkezeti felépítése meglehetősen eltér az 1. és a 2. ábrán bemutatott malmokétól. A megrajzolt Silverson malom a 31 lapátkereket hordozó a 30 forgótengellyel rendelkezik. A forgórészen található a csésze alakú 32 perforált szűrőként kiképzett állórész. Az állórész egy 34 bevezető nyílás céljára szolgáló szerelvénnyel van ráillesztve a 33 foglalatra. A 34 bevezető nyílás betoldó szerelvény meghosszabítása benyúlik a 33 foglalatba nyílást képezve a 32 perforált szűrő alakú állórész alsó részének a közepén. A 33 foglalat középen rendelkezik egy nyílással (a rajzon nem látható), amely összeköttetést teremt a bevezető szerelvénnyel és az állórész alján levő nyílással (amely az ábrán szintén nem látható). Ebben az őrlőmalomban az oldatot és a gázt az állórész alján található bevezető szerelvényen keresztül tápláljuk be és a 31 lapátkerék 35 sima felületei és az állórész belső hengeres felülete között emulgeálódik és történik az üregesítés. A malom nyílás-a a 31 forgórész (lapátkerék) és a 32 állórész közötti térként határozható meg, de a nyílás méretének hatása függ az állórész 36 perforációinak méretétől.
A termék az őrlőmalmon való áthaladását követően lehűthető, jellegzetesen 10 °C - 20 °C közötti hőmérsékletűre, továbbá habmentesíthető ülepítéssel vagy olyan biológiailag • « · · *« • · · · · · · •·· · ·· ··· • · · · · · · • · ··· · * · lebontható (biokompatibilis) habzásgátló szerek hozzáadásával, amelyek nem hatnak károsan a keletkezett mikrogömbökre.
Ezeken a malmokon vagy ezeken az ekvivalens készülékeken átjuttatva az elegyet, az elegy körülbelül 0.1 és 10 mikron közötti (közepes átmérőjű) tartományba eső mikrogömböket képezve emulgeálódik és üregesedik. A mikrogömbök mérete valamely arra alkalmas részecske számlálóval például a Coulter Multisizer II (Coulter Electronics, Hialeah, FI) alkalmazásával határozható meg.
Amikor az 1-3. ábrákon bemutatott őrlőmalmokat használjuk a forgórész forgási sebessége, a nyílás mérete, valamint a gáz : folyadék aránya azok az alapvető paraméterek, amelyek meghatározzák a mikrogömb termék tulajdonságait (közepes átmérőjét, méreteloszlását, valamint a mikrogömbök koncentrációját). A kívánt tulajdonságokkal rendelkező terméket szolgáltató paramétereket empirikus úton határozzuk meg. Az adott termék jellemzőit klinikai úton a gyakorló orvosok adják meg. Például szívizom perfúziós célokra használt perfluor-propán tartalmú mikrogömbök vélelmezett jellemzői a következők lehetnek: közepes részecskeméret 4 mikron, méreteloszlás 90 %-ban 10 mikron alatti, koncentrációját tekintve 7 x 10^ és 2 x 10^ mikrogömb/ml.
A találmány szerinti megoldást a továbbiakban a következő kiviteli példák segítségével szemléltetjük. Ezeknek a példáknak a bemutatásával nem áll szándékunkban semmilyen módon a találmány oltalmi körének korlátozása.
Kiviteli példák • · *· • · · 4 * · • · · · · « · • · · · · · · • · 4 · 4 4
1. Példa
Mechanikai üregesítési eljárás a hőmérséklet mérésével és szabályozásával emberi albumin szérum alkalmazásával
Ahogyan azt a fentiekben ismertettük, a fehérje oldat a feldolgozás előtt előmeletésre kerül úgy, hogy elérjük és fenn tudjuk tartani a denaturáció megindulásához szükséges hőmérsékletet.
Az eljárás gyakorlati megvalósításának egy jellegzetes módja a következő: az #2 1/2 modellszámú Bematek kolloid malmot (2. ábra; Bematek Systems, Beverly, MA), oly módon szereltük össze, hogy a beömlő nyílást egy hőcserélöhöz csatlakoztattuk. A gáz által áthatolhatatlan vagy a gázt át nem eresztő csövet használtunk arra, hogy hajlékony kapcsolatot alakítsunk ki a hőcserélő kivezető csöveinek végződései között.
Az eljárás végrehajtására szolgáló fej kiömlő nyílását egy rozsdamentes acélból készült utóhütőhöz csatlakoztattuk.
Az oldat hőmérsékletét három helyen (TI, T2 és T3) határoztuk meg. A TI termoelemet a fehérje oldat táplálási hőmérsékletének mérésére egy Swagelock T elembe illesztve az előmelegítésre használt hőcserélő és a malomfej között helyeztük el. Egy a gáz bevezetésére szolgáló második T elemet is elhelyeztünk a beömlő nyílásnál. A T2 termoelemet az eljárás során használt malomfej kivezetésének belsejébe helyeztük el körülbelül 1 cm-re a forgórésztől és 2 cm-re a tengelytől, ily módon az eljárás hőmérsékletét pontosan mérni tudtuk. Ezen az úton a két hőmérséklet, a betáplálás hőmérsékletéte (TI), valamint az eljárás hőmérséklete (T2) egymástól függetlenül is mérhető volt és azokat összehasonlítva meg tudtuk határozni azt a hőmennyiséget, amelyet az oldattal közölni kellett az eljárás során.
Ebben a példában U. S. P. albumint oldottunk normál salina oldatban 1 (w/v) %-os oldatot álltva elő. A denaturáció hőmérsékletét a fentiekben ismertetett módon kísérleti úton határoztuk meg, a mérés eredményeként 78 °C-ot kaptunk. A fehérje oldatot 200 ml/perc sebességgel tápláltuk be a malomba, amelyet perfluor-propán gáz 100 ml/perc sebességgel történő adagolása követett (50 (v/v) % ). A TI és T2 hőmérsékletek között mért különbség 10 - 15 °C közötti volt. Ahhoz, hogy 77 °C-os eljárási hőmérsékletet kapjunk (1 °C-al alcsonyabbat a denaturáció hőmérsékleténél), a táplálási hőfokot 62 °C és 67 °C közötti tartományba állítottuk be. Mivel a fejlődő hő mennyisége meg változtatja a különböző őrlési paramétereket, szükségszerű, hogy minden egyes őrlési paraméter változásnál meghatározzuk a TI és T2 közötti hőmérséklet különbséget (malom kiválasztás, malom beállítás, áramlási arány, gáz : folyadék arány, stb. beállítás) abból a célból, hogy be tudjuk állítani azt az eljárási hőmérsékletet, amelyen még elkerülhető a fehérje teljes tömegének denaturációja és sikeresen végbemegy a gáz mikrogömbök denaturált fehérje héjjal történő bekapszulázása.
A külső hűtő hőmérsékletét (T3) ugyancsak folyamatosan mértük és a legjobb eredmények esetén 20 °C körüli értéket állítottunk be.
2. Példa
Mechanikai üregesítési eljárás különböző gázokat tartalmazó mikrogömbök előállítására
Különböző gázokat tartalmazó mikrogömböket állítottunk elő az alábbiak szerint: 5 tömeg % emberi albumint tartalmazó oldatot (U.S.P.) vákuum segítségével 2 órán keresztül levegőtlenítettünk. A vákuumot a gáztalanított edényzetnek az adott gázzal történő feltöltésével szüntettük meg. A vízoldhatatlan gázok közül a kén-hexafluoridot, a perfluor25 • · * etánt és a perfluor-propánt használtuk fel. Emellett vízoldható gázokat, levegőt, nitrogént, oxigént és argont tartalmazó mikrogömböket is előállítottunk. Az argon gáz alkalmazása a nagy molekulatömegű, de viszonylag jól oldódó gázra szolgál példaként. Az albumin oldat hőmérsékletét egy sorbakapcsolt hőcserélőn keresztül 68 °C-ra állítottuk be, majd 100 ml/perc sebességgel beszivattyúztuk a #2 l/2-es kolloid malomba (Greerco, Hudson, NH, model W250V vagy AF Gaulin, Everett, MA, model 2F). Az adott gázt szobahőmérsékleten adtuk hozzá a folyadékhoz éppen a bemeneti nyílás felső szakaszánál 120 - 220 ml/ perc áramlási sebességgel. A forgórész és az állórész közötti nyílást 2/100 inch= 0.005 cm-re állítottuk be és az albumin oldatot 73 °C-os hőmérsékleten folyamatosan aprítottuk 7000/perc forgási sebességgel.
Az ily módon előállított sűrű fehér mikrogömb oldatot azonnal 10 °C-os hőmérsékletűre hűtöttük le egy hőcserélő segítségével és ampullákba töltöttük. Az ampullákat azonnal lezártuk. Az anyagot a koncentrációja és a Coulter Számláló segítségével szemcsméter eloszlása szempontjából minősítettük. A kapott eredményeket az alábbi 3. táblázatban mutatjuk be.
3. táblázat
| koncentráció (mikrogömb/ml) | középméret (mikron) | |
| perfluoropropán | 8.3 χ 108 | 3.8 |
perfluoroetán
10.6 χ 108
4.0
| hexafluorid | 8.4 x ΙΟ» | 3.9 |
| levegő | 9.2 x 108 | 3.4 |
| nitrogén | 5.4 x 108 | 5.0 |
| oxigén | 6.1 x 108 | 3.9 |
| argon | 4.1 x 108 | 3.5 |
3. Példa
A forgórész sebessége és a nyílás méretének hatása
200 ml/perc sebességgel betáplált 1 tömeg %-os albumin oldatot 100 ml/perc sebességgel beáramoltatott perfluor-propán gázzal elegyítettünk 50 (v/v) %-os gáz-folyadék arányban. Az 1. kiviteli példában ismertetett eljárás szerint mikrogömböket állítottunk elő különböző forgórész sebesség és nyílásméret alkalmazásával. A kapott adatokat a 4. táblázatban foglaltuk össze:
4. táblázat
| A forgó rész | Rés (cm) | Koncentráció | Átlagos méret |
| forgási sebessége (m/perc) | (pgömb/ml) | (μ) | |
| 13.4 | |||
| 1066.8 | 0.01 | 0.76 x 108 | 9.6 |
| 1310.6 | 0.01 | 2.43 x 108 | 3.8 |
| 1463.0 | 0.01 | 9.38 xlO8 | 4.3 |
| 2956.6 | 0.01 | 20.96 xlO8 | 5.0 |
| 1584.9 | 0.02 | 12.87xl08 | 3.4 |
| 2133.6 | 0.02 | 12.50 xlO8 | 3.0 |
| 2651.8 | 0.02 | 14.42xl08 | 2.9 |
| 2926.1 | 0.02 | 15.22 x 108 |
A kapott eredmények azt mutatják, hogy a forgórész sebességének növekedésével a koncentráció növekszik, a közepes méret pedig csökken, miközben a nyílásméret növekedésével csökken a koncentráció.
4. Példa
A gáz : folyadék arány hatása
Egy 0.5 tömeg %-os albumin oldatot (áramlási sebessége: 100 ml/perc) 20, 50, 70 vagy 100 ml/perc áramlási sebességű perfluor-propánnal (20, 50, 70 vagy 100 % (v/v) gáz :
folyadék arány beállításával) elegyítettünk körülbelül 0.012-es nyílásméretű, valamint 3033 m/perc csúcs sebességű Gaulin malom alkalmazásával. Az eljárás eredményeként kapott adatokat az alábbi 5. táblázatban mutatjuk be.
5. táblázat
| Gáz/folyadék (v/v)% | Nyílás (cm) | Koncentráció pgömb/ml | Közepes méret pgömb/ml |
| 20 | 0.03 | 6.54xl08 | 3.6 |
| 50 | 0.03 | 7.51 xlO8 | 4.3 |
| 70 | 0.03 | 8.76 x 108 | 5.0 |
| 100 | 0.03 | 8.66 x 108 | 5.9 |
| Az eredményekből | kitűnik, hogy | a gáz : folyadék arány | növelésével mind a |
koncentráció, mind pedig a közepes szemcseméret növekszik.
5. Példa
Vízoldhatatlan gázzal töltött mikro gömbök előállítási eljárása hanghullámokkal történő üregesítéssel
I
·.' .:. -:· ..·
Levegő, kén-hexafluorid és perfluor-etán tartalmú mikrogömböket állítottunk elő folyamatos adagolási és ultrahangos üregesítési eljárással. Emberi albumin (U.S.P.) 5 tömeg %-os oldatát vákuum alatt gázmentesítettük és az adott töltő gáz alatt tároltuk. A folyamatos hangkeltéses eljárást a 4 957 656 lajstromszámú amerikai szabadalmi bejelentésben Cerny által leírt módon hajtottuk végre a levegőt vízben nem oldódó gázzal helyettesítve. Az adagolási eljárást 3/4-es folyadék hullámkeltő kürt alkalmazásával (Sonics and Materials, Danbury CT) hajtottuk végre. Gázt áramoltattunk keresztül a körtön az albumin oldatba oly módon, hogy közben a művelet során a rendszer egészében kizártuk a levegővel való érintkezés lehetőségét. Az albumin oldatot és 5 másodperc alatt 73 °C-ra melegítettük fe, majd 20 KHz frekvenciás, 60 mikronos dupla amplitúdójú Branson-féle piezoelektromos konverter és energiaforrás segítségével (Branson Ultrasonics, Danbury CT) keltett hanghullámokkal üregesítettük. A terméket azonnal üveg ampullákba töltöttük és gáz alatt lezártuk.
Az eljárás eredményeként sűrű, tejszerű 1.4 x 10^ és 1.0 x 10^ mikrogömb/ml koncentrációjú szuszpenzió terméket kaptunk, amelyben a mikrogömbök közepes részecskemérete 2.5 és 3.3 mikron közötti.
6. Példa
A mikrogömbök mikroszkopikus vizsgálata
A különböző gázokat tartalmazó albumin mikrogömböket a 2. vagy 5. kiviteli példában ismertetett eljárás szerint állítottuk elő. A termékek mikroszkópos vizsgálatát a gömbalakú mikrogömbök valamely monodiszperz szuszpenzióival hajtottuk végre. A mikrogömböket nagy túlnyomás alkalmazásával Toppantottuk össze egy fecskendőben ameddig a szuszpenzió oldat ki nem tisztult. A mikroszkopikus vizsgálattal minden esetben kimutattuk az összeesett mikrogömbökböl származó üvegszerüen átlátszó membránszerű héjak jelenlétét.
7. Példa
A mikrogömbök nyomásállóságának vizsgálata
A különböző gázokat tartalmazó albumin mikrogömböket a 2. kiviteli példában ismertetett eljárás szerint állítottuk elő. Valamennyi szuszpenzió 10 ml-ét egy 10 ml térfogatú gázzáró (gáz át nem eresztő) üveg fecskendőbe (Hamilton, Reno NV) töltöttük és nyomásadagolóval lezártuk. 2.756 x 10$ Pa állandó túlnyomást alkalmaztunk 3 percig. Ezt követően Coulter Számlálóval megmértük a minta részecske koncentrációját és részecskeméret eloszlását. A 4a - 4e ábrákon hasonlítjuk össze a túlnyomás alkalmazása előtti és utáni adatokat. Amint látható a vízben nem oldódó gázokkal töltött mikrogömbök 2.756 x 105 Pa nyomásig viszonylagos nyomásállósággal rendelkeznek.
8. Példa
A mikrogömbök hígított szuszpenzióinak nyomásállóság vizsgálata
A különböző gázokat tartalmazó albumin mikrogömböket a 2. kiviteli példában ismertetett eljárás szerint állítottuk elő. Valamennyi mintát a bekapszulázott gáz/foszfátpufferezett salina oldattal (0.15 mólos) egyenlő térfogatra hígítottuk, körülbelül 1 : 60 arányú hígítással. A hígított szuszpenziókat 3.445 x 10^ Pa és 5.168 x 10^ Pa instant statikus nyomásnak tettük ki zárt edényben a megfelelő folyadék és zárókupak közötti tér figyelembevételével. Az 5. ábra szemlélteti a nyomás mikrogömb koncentrációra gyakorolt hatását. A vízben oldhatatlan gázként perfluor-propánt, perfluor-etánt és kén-hexafluoridot tartalmazó mikrogömbök sokkal inkább nyomásállóak, mint az ugyanolyan koncentrációjú és méreteloszlású levegővel vagy nagy molekulatömegü argonnal töltött mikrogömbök (6. ábra). A véráram 1.033 x 10^ Pa és 1.723 x 10^ Pa közötti perifériás vénás nyomás tartományába eső fiziológiai nyomást fejt ki a szívizom falra.
9. Példa
A gázmentesített puffer mikrogömbökre gyakorolt hatásának vizsgálata
A különböző gázokat tartalmazó albumin mikrogömböket a 2. kiviteli példában ismertetett eljárás szerint állítottuk elő. Foszfáttal pufferezett salina oldatot (PBS=phosphate buffered salina) gázmentesítettünk közvetlenül a felhasználás előtti forralással. A forró puffer oldatok 0.05 ml és 1.5 ml közötti aliquot mennyiségeit 13 x 100-as teszt kémcsövekbe töltve hagytuk 1 percig vízfürdőben szobahőmérsékletűre hűlni. Minden kémcsőbe a mikrogömbök azonos mennyiségeit töltöttük. Az összekeverést követően az oldatok végső térfogata a PBS-el együtt 3.0 ml tett ki, amikor is a mikrogömbök koncentrációit meghatároztuk. A 7. ábra mutatja, hogy a gázmentesített oldatokban a javított túlélését tapasztaltuk azoknak a mikrogömböknek az esetében, amelyek vízben nem oldódó gázként perfluor-propánt, perfluor-etánt és kén-hexafluoridot tartalmaztak.
A levegőt, kén-hexafluoridot vagy perfluor-etánt tartalmazó mikrogömb termékeket hígítottunk teljes emberi vérrel. A levegővel töltött mikrogömbök összeestek. A vízoldhatatlan gázzal töltött mikrogömbök a friss teljes emberi vérben hígítva megtartották alakjukat.
10. Példa
Rugalmasság
A különböző gázokat tartalmazó albumin mikrogömböket a 2. kiviteli példában ismertetett eljárás szerint állítottuk elő. Foszfáttal pufferezett salina oldattal hígítottuk a mikrogömböket, ahogyan azt a 8. kiviteli példában ismertettük, majd mikroszkóp tárgyasztalára helyezhető, átlátszó cellába töltöttük azokat. A cella nitrogén gáz forrással volt összeköttetésben, amely a mikrogömbökre gyakorolt fiziológiai nyomáscsökkenések és nyomás ráhatások gyors megfigyelését tette lehetővé.
Az 1.033 x 104 Pa vagy annál nagyobb nyomás alkalmazása esetén a vízoldható gázokat tartalmazó mikrogömbök a megfigyelés során teljesen elveszítették gömb alakjukat. A mikrogömbök nem képződtek újra a túlnyomás megszűntetésével, amely irreverzibilis szerkezet szétesésre vagy romlásra utal. Az 1.033 x 104 Pa-nál kisebb túlnyomás alkalmazása esetében a mikrogömbök nem vesztették el teljes egészében az alakjukat, az csupán bizonyos mértékű deformációt és gyűrődést eredményezett a héj szerkezetben. Sem a gömbalakú külső megjelenési formát sem az eredeti darabszámot nem lehetett visszaállítani az alkalmazott túlnyomás megszűntetésével.
Néhány ... Pa-ig a túlnyomás alkalmazása a vízben nem oldódó perfluor-szénhidrogén gázokat tartalmazó nem mikrogömb szuszpenzió esetében a mikrogömbök átmérőjének csökkenését eredményezi. A túlnyomás megszűntetésének hatására a mikrogömbök visszanyerték eredeti térbeli alakjuknak megfelelő átmérőjüket.
A kén-hexafluorid mikrogömbök a levegővel töltött mikrogömbökhöz viszonyítva fokozott ruggalmasságot mutattak az alkalmazott fiziológiai nyomás hatására, azonban a perfluor-szénhidrogénnel töltött mikrogömbökhöz képest azok rugalmassága kisebb mértékűnek bizonyult.
Ezek a megfigyelések arra utalnak, hogy a vízben nem oldódó gázokat tartalmazó mikrogömbök nemcsak nyomásállóak, de a túlnyomás megszűntetését követően vissza is nyerik eredeti alakjukat. Mindez valóban rugalmas fehérje héj létrejöttét bizonyítja.
11. Példa
Nyitott és zárt rendszerben előállított mikrogömbök összehasonlítása
ELŐÁLLÍTÁSI ELJÁRÁSOK:
A) Kézi hanghullámkeltéssel: Nyitott rendszer (Az 554 213 lajstromszámú európai szabadalom szerinti eljárással ekvivalens egylépéses eljárás.)
Az alábbi a 4 844 882 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli és az 554 213 lajstromszámú szabadalmi leírásokban ismertetett eljárásokat alkalmaztuk a mikrogömbök előállítására:
ml ürtartalmú fecskendőt illesztettünk hozzá egy T-tipusú termoelemhez csúcsán keresztül egy támasztó oszlopra rögítve. A fecskendőt a 16 ml-es jelig töltöttük meg 5 tömeg %-os emberi albumin szérummal (Swiss Red Cross/Svájci Vörös Kereszt/). A gázt (jelen esetben perfluor-propánt (C3F8) vagy a kén-hexafluoridot (SFg) a fecskendő tetején vezettük be és a folyadék felszínén áramoltattuk. A hangkeltő kürtöt a 10 ml-es jelig süllyesztettük a folyadék felszíne alá és 50 %-os teljesítménnyel üzemeltettük körülbelül 1 percig, azaz mindaddig, amíg az oldat hőmérséklete nem emelkedett 72.8 °C - 73 °C közötti
hőmérsékletig. Ekkor a kürtöt azonnal a meniszkusz (folyadék határfelület) szintjéig emeltük ki +/- 1 mm-es eltéréssel és a teljesítményét 65 %-osra növeltük. A hangkeltést további 5 másodpercig folytattuk, miközben az elegy hőmérséklete további 1.2 °C - 2 °C-al emelkedett. A terméket üveg ampullába öntöttük teljes kapacitását kitöltve és lezártuk.
B) Folyamatos hangkeltésű eljárás: Zárt rendszer
A következő 4 957 656 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett eljárást alkalmaztuk perfluor-propán és kén-hexafluorid tartalmú mikrogömbök előállítására:
Emberi albumin szérumot hígítottunk 1 (w/v) % koncentrációig steril salina oldattal. Az oldatot a fehérje denaturáció megindulási hőmérsékletére, körülbelül 76 °C-ra melegítettük fel. A külső környezeti hőmérséklettől elzárt rendszert hoztunk létre, majd a levegő helyére a folyadékáramba perfluor-propán vagy kén-hexafluorid gázt vezettünk (1:1 gáz/folyadék arány). A terméket folyamatos eljárással, a gáz/albumin elegynek a hangkeltö kürtön körülbelül 100 ml folyadék/perc áramlási sebességgel történő átáramoltatásával állítottuk elő. A terméket a hangkeltő kamrából való kilépéskor egy hőcserélőn juttatva keresztül lehütöttük, ezután a sűrű folyékony mikrogömb szuszpenziót elválasztottuk. A termék kezelési és tárolási körülményei hasonlóak voltak a kézi úton előállított mikrogömb szuszpenzióknál ismertetett jellemzőkhöz.
C) Mechanikai üregesítés: Zárt rendszer
Perfluor-propán vagy kén-hexafluorid gázt tartalmazó albumin mikrogömböket állítottunk elő ugyancsak zárt rendszerben az 1 tömeg %-os emberi albumin szérum és a gáz őrlésével hasonlóan a 2. kiviteli példában ismertetett eljáráshoz. Az albumin oldatot, amelyet olyan hőmérsékletűre melegítettük, amely elegendő ahhoz, hogy lehetővé tegye a mechanikai üregesítéssel való mikrogömb képződést egy adott őrlőmalomban, 1 : 1 (v/v) arányban • * · · · ·* · · · • · · elegyítettük a gázzal és az elegyet betápláltuk a kolloid malomba. A folyadék áramlási sebességét természetesen a malom mérete és kapacitása határozta meg, ez esetben jellegzetesen 100 és 500 ml/perc közötti volt. A művelet megvalósításához Silverson L4R malmot és Bematek 3 kolloid malmokat használtunk. A malomból kilépő elegyet egy hőcserélő rendszeren átjuttatva hűtöttük le és a kapott albumin mikrogömb szuszpenziót egy tömegben választottuk el. A terméket üveg ampullákba töltöttük, hasonlóan egyéb, a fentiekben ismertetett eljárásokhoz.
ANALITIKAI ELJÁRÁSOK
A) A keletkezés dinamikája
A mikrogömbök keletkezésének dinamikáját vizsgáltuk Coulter Multisizer II-vel 50 mikronos nyílást alkalmazva. Az ELŐÁLLÍTÁSI ELJÁRÁSOK bármelyikével előállított albumin mikrogömböket tartalmazó szuszpenziókat hígítottunk izotóniásan 1 : 10 000 arányban, és ennek 500 μΙ-es mintáit elemeztük. Az eljárás során a koncentrációt, a közepes méretet, valamint az eredeti mikrogömb szuszpenzió 1 ml-ére eső kapszulázott gáz térfogatot határoztuk meg.
B) Gáz tartalom
Az ELŐÁLLÍÁSI ELJÁRÁSOK bármelyikével előállított mikrogömbök kétszeres mennyiségébe zárt perfluor-propán gáz százalékát határoztuk meg Hewlett Packard 5890 gázkromatográffal. Gázzáró fecskendőben mikrogömb szuszpenzió mintát vettünk. Valamely a habot megszüntető szer etanolos oldatának alkalmazásával a mikrogömbökből felszabadítottuk a gázt és a bezárt gáz hővezető képességét mértük.
C) Nyomásállóság • · · · • · · · · • · · · · · • · ♦ · · · *·♦ · ·«
Az albumin mikrogömbök nyomásállóságát a Sintetica által tett 554 213 lajstromszámú európai szabadalmi bejelentésben ismertetett eljáráshoz hasonlóan határoztuk meg. A mikrogömböket levegőztetett foszfáttal pufferezett sóoldattal 600 nm-es hullámhossznál 1 abszorbancia egységűre hígítottuk egy 3 ml térfogatú nyomásálló küvettában. A nyakat egy túlnyomást biztosító egységhez csatlakoztattuk, majd a küvettát a mérésre szolgáló spektrofotométerbe helyeztük. A küvettában a nyomást lineárisan emeltük 0tól 3.445 x 1θ4 Pa-ra, majd 6.68 x 10^ Pa-ra 150 másodpercet meghaladó ideig, amikor is a túlnyomást megszüntettük. A megemelt nyomást szolenoid szelepes adagolással (Honeywell), valamint egy nyomás transzducer (Omega) segítségével hoztuk létre, amelyeket egy 1.378 x 10^ Pa nagyságú nyomásforrás (nitrogéngáz tartály) és egy 5 literes rozsdamentes acél tartály közé helyeztünk el. A küvettát az acél tartályhoz egy digitális nyomásmérő műszeren keresztül csatlakoztattuk. A digitális konverterhez kapcsolt analóg személyi számítógép és egy digitális analóg konverter vezérlőmű (National Instruments) szabályozta a szelep nyitását és olvasta le a transzducer nyomását. A tárolóedény és a küvetta mindaddig nyomás alá volt helyezve egy adott túlnyomás biztosításával, amíg azokban a kívánt nyomást el nem értük. A mikrogömb szuszpenzió optikai sűrűségét az idő és a nyomás függvényében határoztuk meg. Az adatokat a mikrogömböknek a küvettában való természetes flotációs (lebegtetési) tényezőjével korrigáltuk.
EREDMÉNYEK
A kézi úton történő hangkeltéssel, a folyamatos hangkeltéssel és mechanikai üregesítéssel végzett eljárásokkal előállított albumin mikrogömbök esetében az előállítást követően 24 órán belül mértük meg a koncentrációt, az átlagos részecskeméretet, a bekapszulázott gáz térfogatot és a méreteloszlást. Minden egyes mérést minimum kétszer megismételtünk és az adatok átlagát közöljük. Ezeknek a méréseknek az eredményeit az alábbi 6. táblázatban adtuk meg:
6. táblázat
| Gáz | Módszer | Koncentráció 108 /ml | Közepes méret (μιη) | Térfogat (ml/rnl) |
| sf6 | kézi hangkeltés | 8.7 | 3.2 | 0.046 |
| sf6 | folyamatos hangkeltés | 12.7 | 2.7 | 0.034 |
| sf6 | mehanikai üregesítés | 10.0 | 3.8 | 0.054 |
| c3f8 | kézi hangkeltés | 13.4 | 2.8 | O.O33 |
| c3f8 | kézi hangkeltés | 17.7 | 2.8 | 0.056 |
| c3f8 | folyamatos hangkeltés | 10.1 | 3.0 | 0.050 |
| C3F8 | folyamatos hangkeltés | 6.7 | 4.3 | 0.127 |
| c3f8 | mehanikai üregesítés (Bematek malom) | 31.0 | 3.0 | 0.23 |
| C3F8 | mehanikai üregesítés | 6.9 | 5.0 | 034 |
(Silverson malom)
A vizsgálat szerint 4 °C-os hőmérsékleten valamennyi eljárási móddal előállított mikrogömb stabil volt legalább néhány hétig .
• · ·
B) Gáz tartalom
Az előállított mikrogömbök kétszeres mennyiségébe zárt perfluor-propán gáz analitikailag meghatározott mennyiségeit az alábbi 7. táblázatban adjuk meg:
7. táblázat
| Módszer + | % C3F8 |
| kézi hangkeltés | 70.0 |
| folyamatos hangkeltés | 89.5 |
| mehanikai üregesítés | 95.5 |
+A kétszeres mennyiség átlagos eredményei
Ezek az eredmények azt bizonyítják, hogy a nyitott rendszerben kézi hangkeltéssel előállított kapszulázott mikrogömbök esetében sokkal kevesebb gáz kerül felhasználásra a mikrogömb előállításhoz, mint azoknál, amelyeket zárt rendszerben állítottunk elő (folyamatos hangkeltéssel és mechanikai üregesítéssel). A zárt rendszerben előállított mikrogömböket oxigén gáz kizárásával hoztuk létre, amit oxigén elektród felhasználásával ellenőriztünk. Mind a háromféle eljárással készített mikrogömböket ugyanolyan mennyiségű levegő hatásának tettük ki a kezelés és mintavétel során (ez azt jelenti, hogy kevesebb, mint 100 % perfluor-propán gáz jelenlétét mértük a két, zárt rendszerben zájló eljárással előállított • ♦ mikrogömbökben), ily módon oxigén (és egyéb légköri) gázok voltak jelen a nyitott rendszerben, amely minimalizálta a gáz kapszulázás hatékonyságát.
C) Nyomásállóság
A gázzal töltött mikrogömbök szuszpenziójának optikai sűrűsége a külső nyomás növekedésével csökkenni fog a méretcsökkenésnek köszönhetően és a felszín területének változásával összefüggésben. A térfogatcsökkenés két tényezővel magyarázható; egyrészt a gáztörvények értelmében reverzibilis kompresszió történik, ugyanakkor a Henry törvény értelmében a növekvő oldhatóságnak köszönhetően a gázmag irreverzibilis vesztesége jelentkezik a környező folyadékban. Az alkalmazott túlnyomás csökkentése, illetve megszüntetése hatására a kompresszióból adódó térfogatveszteségnek csak egy része alakul vissza, amelyet az optikai sűrűség növekedése útján követhetünk nyomon. A héjba zárt gáz környező folyadékba került vesztesége nem tér vissza ismételten a mikrogömb belsejébe a túlnyomás megszüntetésével, hanem elveszik a tárolóedény folyadék feletti zárt térrészében.
A 8. ábra mutatja a legfeljebb 6.89 x 10^ Pa lineáris nyomás gradiens hatását a kézi hangkeltéssel (nyitott rendszerben) és folyamatos hangkeltéssel, valamint mechanikai üregesítéssel (zárt rendszerekben) előállított perfluor-propán gázzal készített albumin mikrogömbök egységnyi optikai sűrűségű (OD=Optical Density) szuszpenzióira. Mindkét zárt rendszerben zajló eljárás esetében olyan mikrogömböket kapunk, amelyek nyomásnövekedés hatására összenyomódnak, a gradiens befejezésekor pedig a túlnyomást megszüntetve az eredeti térfogatukat teljes egészében visszanyerik. A héj szerkezetbe bezárt gáznak a környező folyadékba távozó vesztesége sem volt megfigyelhető. A nyitott rendszerben (manuális hangkeltési eljárással) előállított albumin mikrogömbök az alkalmazott nyomás hatására nagyobb mértékű összenyomódást mutattak és a túlnyomás megszüntetésekor csak részben nyerték vissza térfogatukat. A gázmag irreverzibilis veszteségének köszönhetően a mikrogömbök mérete 40 %-al csökkent.
Az ábrák jelöléseinek hivatkozási jegyzéke
1. ábra tengely állórész forgó tányér
T alakú csöelágazás ellenfurat sugárirányú felület központi nyitott furat
2. ábra tengely csonkakúp alakú forgó rész csavarmenetes elülső tengely vég állórész csonkakúp alakú ellenfurat hengeralakú nyílás
3. ábra * · · ·9» • · · · · * · ··· * ····« • ······ ·· ««· · «· tengely lapátkerék perforált szűrő alakú állórész foglalat bevezető nyílás betoldó szerelvény sima felület perforáció
Claims (17)
- Szabadalmi igénypontok1. Ultrahang diagnosztikai készítmény azzal jellemezve, hogy hőkezelés hatására vízoldhatatlanná alakuló filmképző fehérjébe kapszulázott gáz mikrogömbök vizes szuszpenziójából áll, ahol a kapszulázott gáz teljes egészében gyógyszerészetileg elfogadható, vízben nem oldódó gáz.
- 2. Az 1. igénypont szerinti készítmény azzal jellemezve, hogy a gáz oldhatósága vízben 25 °C-os hőmérsékleten kisebb, mint 0.01 ml gáz/ml víz.
- 3. Az 1. igénypont szerinti készítmény azzal jellemezve, hogy a fehérje emberi albumin szérum.
- 4. Az 1. igénypont szerinti készítmény azzal jellemezve, hogy a fehérje emberi albumin szérum, a vízben nem oldódó gáz pedig perfluor-propán.
- 5. Ultrahang diagnosztikai készítmény azzal jellemezve, hogy hőkezelés hatására vízoldhatatlanná alakuló filmképző fehérjébe kapszulázott perfluor-propán gázt tartalmazó mikrogömbök vizes szuszpenziójából áll.
- 6. Az 5. igénypont szerinti készítmény azzal jellemezve, hogy a fehérje emberi albumin szérum.
- 7. Ultrahang diagnosztikai készítmény azzal jellemezve, hogy filmképző fehérjébe kapszulázott gáz mikrogömbök vizes szuszpenziójából áll, ahol a fehérjét a kapszulázott gáz jelenlétében és oxigén kizárásával hőkezelés útján alakítjuk vízoldhatatlanná, a gáz pedig teljes egészében gyógyszerészetileg elfogadható, vízben nem oldódó gáz.
- 8. A 7. igénypont szerinti készítmény azzal jellemezve, hogy a gáz oldhatósága vízben 25 °C-os hőmérsékleten kisebb, mint 0.01 ml gáz/ml víz.
- 9. A 7. igénypont szerinti készítmény azzal jellemezve, hogy a fehérje emberi albumin szérum.
- 10. Eljárás ultrahang diagnosztikai szerként alkalmazható kapszulázott mikrogömbök előállítására azzal jelemezve, hogy filmképző fehérje vizes oldatából és valamely gyógyszerészetileg elfogadható vízben oldhatatlan gázból álló elegyet ultrahangos vagy mechanikai üregesítési eljárásnak vetünk alá oxigén kizárásával.
- 11. Eljárás ultrahang diagnosztikai szerként alkalmazható kapszulázott mikrogömbök előállítására azzal jelemezve, hogy filmképző fehérje vizes oldatából és valamely gyógyszerészetileg elfogadható vízben oldhatatlan gázból álló elegyet ultrahangos vagy mechanikai üregesítési eljárásnak vetünk alá valamely a légkörtől elzárt készülékben.
- 12. A 10. és 11. igénypont szerinti eljárások azzal jellemezve, hogy a fehérje emberi albumin szérum, a vízben nem oldódó gáz pedig perfluor-propán.
- 13. Eljárás ultrahang diagnosztikai szerként alkalmazható kapszulázott mikrogömbök előállítására azzal jelemezve, hogya) a hőfoknövelés hatására denaturálódó fehérje olyan hőmérsékletű vizes oldatát állítjuk elő, amely hőmérséklet szükséges ahhoz, hogy az azt követő mechanikai emulgeálás során a denaturálódás elkezdődjön;b) az oldatot gázzal elegyítjük;c) az elegyre mechanikai nyíróerőt fejtve ki, a fehérje oldat és a gáz elegyét emulgeáljuk, ily módon képezve körülbelül 0.1 és körülbelül 10 mikron közötti tartományba eső közepes átmérőjű mikrobuborékok szuszpenziót;valamintd) a mikrogömbök előállítása céljából a gázbuborékokat bekapszulázzuk a mikrogömb szuszpenzió mechanikai üregesítésével, amikor is a fehérje denaturációját idézzük elő, amely denaturálódott fehérje a gáz és a folyékony oldat érintkezési határfelületein rakódik le.
- 14. A 13. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a fehérje emberi albumin szérum, a vízben nem oldódó gáz pedig perfluor-propán.
- 15. A 13. és 14. igénypont szerinti eljárások azzal jellemezve, hogy a (c) és (d) eljárási lépések folyamatai az elegynek valamely malmon keresztül történő átvezetésével mennek végbe.
- 16. A 10. 11. 12. 13. 14. és 15. igénypontok bármelyike szerinti kapszulázott mikrogömb előállítási eljárás.
- 17. A betegek szöveteinek és/vagy szerveinek ultrahang diagnosztikai vizsgálata során a látott kép kontrasztosságának javítására szolgáló eljárás azzal jellemezve, hogy (a) az 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. és 16. igénypontok bármelyike szerinti készítményt vagy mikrogömböket a beteg szervezetébe injektáljuk;(b) az ultrahang hullámokat a vizsgálandó szövetekre és/vagy szervekre irányítjuk;(c) a szövetekről és/vagy szervekről visszaverődő ultrahang hullámokat detektáljuk; valamint (d) a visszaverődött ultrahanghullámok energiáját képpé alakítjuk.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US8671793A | 1993-07-02 | 1993-07-02 | |
| US18765694A | 1994-01-26 | 1994-01-26 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9503977D0 HU9503977D0 (en) | 1996-03-28 |
| HUT74827A true HUT74827A (en) | 1997-02-28 |
Family
ID=26775071
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9503977A HUT74827A (en) | 1993-07-02 | 1994-07-01 | Protein encapsulated insoluble gas microspheres and their preparation and use as ultrasonic imaging agents |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5552133A (hu) |
| EP (2) | EP0633030B1 (hu) |
| JP (3) | JP2905598B2 (hu) |
| KR (1) | KR100218642B1 (hu) |
| CN (1) | CN1129910A (hu) |
| AT (1) | ATE179334T1 (hu) |
| AU (1) | AU683485B2 (hu) |
| BR (1) | BR9406993A (hu) |
| CA (1) | CA2166459C (hu) |
| CZ (1) | CZ350895A3 (hu) |
| DE (2) | DE69432370T2 (hu) |
| ES (2) | ES2195247T3 (hu) |
| FI (1) | FI956312A (hu) |
| HU (1) | HUT74827A (hu) |
| IL (1) | IL110185A (hu) |
| NO (1) | NO955351L (hu) |
| NZ (1) | NZ268826A (hu) |
| PL (1) | PL312387A1 (hu) |
| TW (1) | TW283646B (hu) |
| WO (1) | WO1995001187A1 (hu) |
Families Citing this family (139)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5469854A (en) | 1989-12-22 | 1995-11-28 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Methods of preparing gas-filled liposomes |
| US6146657A (en) | 1989-12-22 | 2000-11-14 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Gas-filled lipid spheres for use in diagnostic and therapeutic applications |
| US5773024A (en) | 1989-12-22 | 1998-06-30 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Container with multi-phase composition for use in diagnostic and therapeutic applications |
| US6088613A (en) | 1989-12-22 | 2000-07-11 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Method of magnetic resonance focused surgical and therapeutic ultrasound |
| US5922304A (en) | 1989-12-22 | 1999-07-13 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Gaseous precursor filled microspheres as magnetic resonance imaging contrast agents |
| US5656211A (en) | 1989-12-22 | 1997-08-12 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Apparatus and method for making gas-filled vesicles of optimal size |
| US6551576B1 (en) | 1989-12-22 | 2003-04-22 | Bristol-Myers Squibb Medical Imaging, Inc. | Container with multi-phase composition for use in diagnostic and therapeutic applications |
| US5580575A (en) | 1989-12-22 | 1996-12-03 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Therapeutic drug delivery systems |
| US6001335A (en) | 1989-12-22 | 1999-12-14 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Contrasting agents for ultrasonic imaging and methods for preparing the same |
| US5776429A (en) | 1989-12-22 | 1998-07-07 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Method of preparing gas-filled microspheres using a lyophilized lipids |
| US5733572A (en) | 1989-12-22 | 1998-03-31 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Gas and gaseous precursor filled microspheres as topical and subcutaneous delivery vehicles |
| US5585112A (en) | 1989-12-22 | 1996-12-17 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Method of preparing gas and gaseous precursor-filled microspheres |
| US5305757A (en) | 1989-12-22 | 1994-04-26 | Unger Evan C | Gas filled liposomes and their use as ultrasonic contrast agents |
| US5542935A (en) | 1989-12-22 | 1996-08-06 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Therapeutic delivery systems related applications |
| US6613306B1 (en) | 1990-04-02 | 2003-09-02 | Bracco International B.V. | Ultrasound contrast agents and methods of making and using them |
| USRE39146E1 (en) | 1990-04-02 | 2006-06-27 | Bracco International B.V. | Long-lasting aqueous dispersions or suspensions of pressure-resistant gas-filled microvesicles and methods for the preparation thereof |
| US7083778B2 (en) * | 1991-05-03 | 2006-08-01 | Bracco International B.V. | Ultrasound contrast agents and methods of making and using them |
| US5445813A (en) * | 1992-11-02 | 1995-08-29 | Bracco International B.V. | Stable microbubble suspensions as enhancement agents for ultrasound echography |
| IN172208B (hu) | 1990-04-02 | 1993-05-01 | Sint Sa | |
| US20040208826A1 (en) * | 1990-04-02 | 2004-10-21 | Bracco International B.V. | Ultrasound contrast agents and methods of making and using them |
| US6989141B2 (en) * | 1990-05-18 | 2006-01-24 | Bracco International B.V. | Ultrasound contrast agents and methods of making and using them |
| US5578292A (en) | 1991-11-20 | 1996-11-26 | Bracco International B.V. | Long-lasting aqueous dispersions or suspensions of pressure-resistant gas-filled microvesicles and methods for the preparation thereof |
| US20010024638A1 (en) * | 1992-11-02 | 2001-09-27 | Michel Schneider | Stable microbubble suspensions as enhancement agents for ultrasound echography and dry formulations thereof |
| AU636481B2 (en) * | 1990-05-18 | 1993-04-29 | Bracco International B.V. | Polymeric gas or air filled microballoons usable as suspensions in liquid carriers for ultrasonic echography |
| US20030194376A1 (en) * | 1990-05-18 | 2003-10-16 | Bracco International B.V. | Ultrasound contrast agents and methods of making and using them |
| US5205290A (en) | 1991-04-05 | 1993-04-27 | Unger Evan C | Low density microspheres and their use as contrast agents for computed tomography |
| US5874062A (en) | 1991-04-05 | 1999-02-23 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Methods of computed tomography using perfluorocarbon gaseous filled microspheres as contrast agents |
| MX9205298A (es) | 1991-09-17 | 1993-05-01 | Steven Carl Quay | Medios gaseosos de contraste de ultrasonido y metodo para seleccionar gases para usarse como medios de contraste de ultrasonido |
| US6875420B1 (en) | 1991-09-17 | 2005-04-05 | Amersham Health As | Method of ultrasound imaging |
| US6723303B1 (en) | 1991-09-17 | 2004-04-20 | Amersham Health, As | Ultrasound contrast agents including protein stabilized microspheres of perfluoropropane, perfluorobutane or perfluoropentane |
| US5409688A (en) * | 1991-09-17 | 1995-04-25 | Sonus Pharmaceuticals, Inc. | Gaseous ultrasound contrast media |
| IL104084A (en) * | 1992-01-24 | 1996-09-12 | Bracco Int Bv | Sustainable aqueous suspensions of pressure-resistant and gas-filled blisters, their preparation, and contrast agents containing them |
| IL108416A (en) | 1993-01-25 | 1998-10-30 | Sonus Pharma Inc | Colloids with phase difference as contrast ultrasound agents |
| CA2154590C (en) * | 1993-01-25 | 2001-06-12 | Steven C. Quay | Phase shift colloids as ultrasound contrast agents |
| US5362478A (en) * | 1993-03-26 | 1994-11-08 | Vivorx Pharmaceuticals, Inc. | Magnetic resonance imaging with fluorocarbons encapsulated in a cross-linked polymeric shell |
| US5701899A (en) * | 1993-05-12 | 1997-12-30 | The Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Perfluorobutane ultrasound contrast agent and methods for its manufacture and use |
| US5695740A (en) * | 1993-05-12 | 1997-12-09 | The Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Perfluorocarbon ultrasound contrast agent comprising microbubbles containing a filmogenic protein and a saccharide |
| JP3559849B2 (ja) | 1993-07-30 | 2004-09-02 | アイエムシーオーアール ファーマシューティカル カンパニー | 超音波技術のための安定化された微小気泡組成物 |
| US5798091A (en) | 1993-07-30 | 1998-08-25 | Alliance Pharmaceutical Corp. | Stabilized gas emulsion containing phospholipid for ultrasound contrast enhancement |
| DK0682530T3 (da) * | 1993-12-15 | 2003-07-14 | Bracco Research Sa | Gasblandinger, der kan anvendes som ultralydkontrastmidler |
| DE4406474A1 (de) * | 1994-02-23 | 1995-08-24 | Schering Ag | Gas enthaltende Mikropartikel, diese enthaltende Mittel, deren Verwendung in der Ultraschalldiagnostik, sowie Verfahren zur Herstellung der Partikel und Mittel |
| US5736121A (en) | 1994-05-23 | 1998-04-07 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Stabilized homogenous suspensions as computed tomography contrast agents |
| US5965109A (en) * | 1994-08-02 | 1999-10-12 | Molecular Biosystems, Inc. | Process for making insoluble gas-filled microspheres containing a liquid hydrophobic barrier |
| US5730955A (en) * | 1994-08-02 | 1998-03-24 | Molecular Biosystems, Inc. | Process for making gas-filled microspheres containing a liquid hydrophobic barrier |
| US5540909A (en) * | 1994-09-28 | 1996-07-30 | Alliance Pharmaceutical Corp. | Harmonic ultrasound imaging with microbubbles |
| US6743779B1 (en) | 1994-11-29 | 2004-06-01 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Methods for delivering compounds into a cell |
| US5830430A (en) | 1995-02-21 | 1998-11-03 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Cationic lipids and the use thereof |
| US5997898A (en) | 1995-06-06 | 1999-12-07 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Stabilized compositions of fluorinated amphiphiles for methods of therapeutic delivery |
| US6521211B1 (en) | 1995-06-07 | 2003-02-18 | Bristol-Myers Squibb Medical Imaging, Inc. | Methods of imaging and treatment with targeted compositions |
| US5897851A (en) * | 1995-06-07 | 1999-04-27 | Sonus Pharmaceuticals, Inc. | Nucleation and activation of a liquid-in-liquid emulsion for use in ultrasound imaging |
| US5674469A (en) * | 1995-06-07 | 1997-10-07 | Molecular Biosystems, Inc. | Gas-exchange method of making gas-filled microspheres |
| US6231834B1 (en) | 1995-06-07 | 2001-05-15 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Methods for ultrasound imaging involving the use of a contrast agent and multiple images and processing of same |
| US6033645A (en) | 1996-06-19 | 2000-03-07 | Unger; Evan C. | Methods for diagnostic imaging by regulating the administration rate of a contrast agent |
| US6139819A (en) | 1995-06-07 | 2000-10-31 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Targeted contrast agents for diagnostic and therapeutic use |
| US5648098A (en) * | 1995-10-17 | 1997-07-15 | The Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Thrombolytic agents and methods of treatment for thrombosis |
| US6245747B1 (en) | 1996-03-12 | 2001-06-12 | The Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Targeted site specific antisense oligodeoxynucleotide delivery method |
| CA2252617A1 (en) | 1996-05-01 | 1997-11-06 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Methods for delivering compounds into a cell |
| US5976501A (en) * | 1996-06-07 | 1999-11-02 | Molecular Biosystems, Inc. | Use of pressure resistant protein microspheres encapsulating gases as ultrasonic imaging agents for vascular perfusion |
| CN1042700C (zh) * | 1996-06-25 | 1999-03-31 | 谢峰 | 含有全氟化碳或六氟化硫的右旋糖酐白蛋白声学造影剂及其制作方法 |
| US5849727A (en) * | 1996-06-28 | 1998-12-15 | Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Compositions and methods for altering the biodistribution of biological agents |
| US6414139B1 (en) | 1996-09-03 | 2002-07-02 | Imarx Therapeutics, Inc. | Silicon amphiphilic compounds and the use thereof |
| DE69718519T2 (de) | 1996-09-11 | 2003-11-06 | Imarx Pharmaceutical Corp., Tucson | Verbesserte verfahren zur diagnostischen bilderzeugung unter verwendung eines kontrastmittels und eines vasodilators |
| US5846517A (en) | 1996-09-11 | 1998-12-08 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Methods for diagnostic imaging using a renal contrast agent and a vasodilator |
| US6083484A (en) | 1996-10-17 | 2000-07-04 | Molecular Biosystems, Inc. | Microparticles stabilized by polynuclear chromium complexes and their use as ultrasound contrast agents |
| US6120751A (en) | 1997-03-21 | 2000-09-19 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Charged lipids and uses for the same |
| US6143276A (en) | 1997-03-21 | 2000-11-07 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Methods for delivering bioactive agents to regions of elevated temperatures |
| US6090800A (en) | 1997-05-06 | 2000-07-18 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Lipid soluble steroid prodrugs |
| US6537246B1 (en) | 1997-06-18 | 2003-03-25 | Imarx Therapeutics, Inc. | Oxygen delivery agents and uses for the same |
| US6416740B1 (en) | 1997-05-13 | 2002-07-09 | Bristol-Myers Squibb Medical Imaging, Inc. | Acoustically active drug delivery systems |
| AU7702798A (en) | 1997-05-30 | 1998-12-30 | Alliance Pharmaceutical Corporation | Methods and apparatus for monitoring and quantifying the movement of fluid |
| CN1265045A (zh) | 1997-07-04 | 2000-08-30 | 奈科姆成像有限公司 | 从微粒状药物产品中筛选具有预选粒径粒子的方法 |
| JP4808842B2 (ja) * | 1997-08-18 | 2011-11-02 | ジーイー・ヘルスケア・アクスイェ・セルスカプ | 小胞の調製方法 |
| GB9717476D0 (en) * | 1997-08-18 | 1997-10-22 | Nycomed Imaging As | Process |
| US6548047B1 (en) | 1997-09-15 | 2003-04-15 | Bristol-Myers Squibb Medical Imaging, Inc. | Thermal preactivation of gaseous precursor filled compositions |
| US20110075507A1 (en) * | 1997-10-24 | 2011-03-31 | Revalesio Corporation | Diffuser/emulsifier |
| US6386751B1 (en) | 1997-10-24 | 2002-05-14 | Diffusion Dynamics, Inc. | Diffuser/emulsifier |
| US7654728B2 (en) * | 1997-10-24 | 2010-02-02 | Revalesio Corporation | System and method for therapeutic application of dissolved oxygen |
| US7128278B2 (en) | 1997-10-24 | 2006-10-31 | Microdiffusion, Inc. | System and method for irritating with aerated water |
| US6702949B2 (en) | 1997-10-24 | 2004-03-09 | Microdiffusion, Inc. | Diffuser/emulsifier for aquaculture applications |
| US6123923A (en) | 1997-12-18 | 2000-09-26 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Optoacoustic contrast agents and methods for their use |
| US20010003580A1 (en) | 1998-01-14 | 2001-06-14 | Poh K. Hui | Preparation of a lipid blend and a phospholipid suspension containing the lipid blend |
| US20010021372A1 (en) * | 1998-08-18 | 2001-09-13 | Tore Omtveit | Apparatus having partially gold-plated surface |
| CZ20012328A3 (cs) * | 1998-12-23 | 2001-11-14 | Unilever N. V. | Emulze |
| US6444192B1 (en) | 1999-02-05 | 2002-09-03 | The Regents Of The University Of California | Diagnostic imaging of lymph structures |
| US20050150618A1 (en) * | 2000-05-17 | 2005-07-14 | Bijan Kazem | Methods of processing lignocellulosic pulp with cavitation |
| US6627784B2 (en) * | 2000-05-17 | 2003-09-30 | Hydro Dynamics, Inc. | Highly efficient method of mixing dissimilar fluids using mechanically induced cavitation |
| JP5078212B2 (ja) | 2000-06-02 | 2012-11-21 | ブラッコ・スイス・ソシエテ・アノニム | 内皮細胞を標的とするための化合物、それを含む組成物およびその使用方法 |
| JP3819845B2 (ja) | 2001-04-06 | 2006-09-13 | ブラッコ・リサーチ・ソシエテ・アノニム | 流体で充填された空洞内の局所物理パラメータの改善された測定方法 |
| US7087212B2 (en) * | 2001-08-17 | 2006-08-08 | Mallinckrodt, Inc | Multicomponent assemblies having enhanced binding properties for diagnosis and therapy |
| US7261876B2 (en) | 2002-03-01 | 2007-08-28 | Bracco International Bv | Multivalent constructs for therapeutic and diagnostic applications |
| ES2506142T3 (es) | 2002-03-01 | 2014-10-13 | Dyax Corp. | Péptidos de unión a KDR y a VEGF/KDR y su uso en diagnóstico |
| US7794693B2 (en) | 2002-03-01 | 2010-09-14 | Bracco International B.V. | Targeting vector-phospholipid conjugates |
| US8623822B2 (en) | 2002-03-01 | 2014-01-07 | Bracco Suisse Sa | KDR and VEGF/KDR binding peptides and their use in diagnosis and therapy |
| US7211240B2 (en) | 2002-03-01 | 2007-05-01 | Bracco International B.V. | Multivalent constructs for therapeutic and diagnostic applications |
| EP1587944A4 (en) | 2002-03-01 | 2007-03-21 | Dyax Corp | KDR AND VEGF / KDR BINDING PEPTIDES AND THEIR USE FOR DIAGNOSTIC AND THERAPEUTIC PURPOSES |
| US20040126400A1 (en) * | 2002-05-03 | 2004-07-01 | Iversen Patrick L. | Delivery of therapeutic compounds via microparticles or microbubbles |
| US6823820B2 (en) | 2002-12-03 | 2004-11-30 | Christian Helmut Thoma | Apparatus for heating fluids |
| ES2396368T3 (es) | 2003-03-03 | 2013-02-21 | Dyax Corporation | Péptidos que se unen específicamente al receptor del HGF (CMET) y usos de los mismos |
| US7771582B2 (en) * | 2003-05-19 | 2010-08-10 | Hydro Dnamics, Inc. | Method and apparatus for conducting a chemical reaction in the presence of cavitation and an electrical current |
| US6910448B2 (en) | 2003-07-07 | 2005-06-28 | Christian Thoma | Apparatus and method for heating fluids |
| WO2005021050A1 (en) * | 2003-08-22 | 2005-03-10 | Hydro Dynamics, Inc. | Method and apparatus for irradiating fluids |
| US8076117B2 (en) * | 2004-03-18 | 2011-12-13 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Microbial biofilm removal methods and systems |
| US7316501B2 (en) * | 2004-05-20 | 2008-01-08 | Christian Thoma | Apparatus and method for mixing dissimilar fluids |
| US8012457B2 (en) | 2004-06-04 | 2011-09-06 | Acusphere, Inc. | Ultrasound contrast agent dosage formulation |
| US8883865B2 (en) | 2006-09-05 | 2014-11-11 | Cerion Technology, Inc. | Cerium-containing nanoparticles |
| US10435639B2 (en) | 2006-09-05 | 2019-10-08 | Cerion, Llc | Fuel additive containing lattice engineered cerium dioxide nanoparticles |
| CA2662765A1 (en) * | 2006-09-05 | 2008-03-13 | Cerion Technology, Inc. | Cerium dioxide nanoparticle-containing fuel additive |
| US8597689B2 (en) | 2006-10-25 | 2013-12-03 | Revalesio Corporation | Methods of wound care and treatment |
| US8784897B2 (en) | 2006-10-25 | 2014-07-22 | Revalesio Corporation | Methods of therapeutic treatment of eyes |
| US8609148B2 (en) | 2006-10-25 | 2013-12-17 | Revalesio Corporation | Methods of therapeutic treatment of eyes |
| US8784898B2 (en) | 2006-10-25 | 2014-07-22 | Revalesio Corporation | Methods of wound care and treatment |
| EP2083876A4 (en) | 2006-10-25 | 2012-09-19 | Revalesio Corp | WOUND CARE AND TREATMENT METHOD |
| US8445546B2 (en) | 2006-10-25 | 2013-05-21 | Revalesio Corporation | Electrokinetically-altered fluids comprising charge-stabilized gas-containing nanostructures |
| US7919534B2 (en) | 2006-10-25 | 2011-04-05 | Revalesio Corporation | Mixing device |
| US8465642B2 (en) * | 2007-05-04 | 2013-06-18 | Hydro Dynamics, Inc. | Method and apparatus for separating impurities from a liquid stream by electrically generated gas bubbles |
| US20090036856A1 (en) * | 2007-07-31 | 2009-02-05 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Triggerable self-generating liquid foam barrier/interceptor |
| US9523090B2 (en) | 2007-10-25 | 2016-12-20 | Revalesio Corporation | Compositions and methods for treating inflammation |
| US10125359B2 (en) | 2007-10-25 | 2018-11-13 | Revalesio Corporation | Compositions and methods for treating inflammation |
| US9745567B2 (en) | 2008-04-28 | 2017-08-29 | Revalesio Corporation | Compositions and methods for treating multiple sclerosis |
| US8430968B2 (en) | 2008-01-22 | 2013-04-30 | Hydro Dynamics, Inc. | Method of extracting starches and sugar from biological material using controlled cavitation |
| WO2009134929A2 (en) | 2008-05-01 | 2009-11-05 | Revalesio Corporation | Compositions and methods for treating digestive disorders |
| WO2010067059A1 (en) | 2008-12-12 | 2010-06-17 | The University Of Birmingham | Low fat food containing gas bubbles |
| US8846063B2 (en) * | 2008-12-16 | 2014-09-30 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Personal care composition containing a volatile and a terpene alcohol |
| US8815292B2 (en) | 2009-04-27 | 2014-08-26 | Revalesio Corporation | Compositions and methods for treating insulin resistance and diabetes mellitus |
| RU2562263C9 (ru) | 2009-12-22 | 2016-04-27 | Евоник Корпорейшн | Способ и рабочий узел для приготовления микрочастиц с использованием эмульсии |
| KR20130114581A (ko) | 2010-05-07 | 2013-10-18 | 레발레시오 코퍼레이션 | 생리적 수행능력 및 회복 시간의 향상을 위한 조성물 및 방법 |
| CN101926821B (zh) * | 2010-07-12 | 2012-01-25 | 四川大学华西医院 | 一种靶向释放微量元素的药物组合物及制备方法和应用 |
| CN102302507B (zh) * | 2010-07-12 | 2014-02-05 | 四川大学华西医院 | 定向控释微量元素的药物组合物及制备方法和应用 |
| EP2603202A4 (en) | 2010-08-12 | 2016-06-01 | Revalesio Corp | COMPOSITIONS AND METHOD FOR THE TREATMENT OF TAUOPATHIES |
| CZ303992B6 (cs) * | 2010-11-04 | 2013-08-07 | Student Science, S.R.O. | Nanovlákenné nosice s fotoafinne vázanými mikrosférami a zpusob jejich výroby |
| CN103534014B (zh) * | 2011-05-27 | 2016-04-13 | M技术株式会社 | 微小气泡发生装置、微小气泡发生方法及使用了其的气液反应方法 |
| KR20120140290A (ko) * | 2011-06-21 | 2012-12-31 | 주식회사 퍼시픽시스템 | 기능성 물질의 전달을 촉진하는 기포 제조 방법 및 이를 이용하는 기능성 물질 전달 장치 |
| RU2631800C2 (ru) | 2012-04-30 | 2017-09-26 | ДжиИ Хелткер АС | Способ заполнения контейнера вспениваемой композицией |
| BR112014032254B1 (pt) * | 2012-06-26 | 2022-11-01 | Ge Healthcare As | Processo para a preparação de uma composição, aparelho, e, uso de um aparelho |
| US10143661B2 (en) | 2013-10-17 | 2018-12-04 | Cerion, Llc | Malic acid stabilized nanoceria particles |
| CN105233308B (zh) * | 2015-11-02 | 2018-10-30 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | 一种用于hifu的超声造影剂及其制备方法与应用 |
| US11007287B2 (en) | 2016-02-25 | 2021-05-18 | King Abdullah University Of Science And Technology | Acoustically excited encapsulated microbubbles and mitigation of biofouling |
| EP3525678A1 (en) | 2016-10-11 | 2019-08-21 | Thomas Jefferson University | Non-invasive method for pressure measurement |
| CN107519502B (zh) * | 2017-08-20 | 2019-01-15 | 湖南康润药业有限公司 | 超声造影微泡的制备方法及超声造影微泡 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4718433A (en) * | 1983-01-27 | 1988-01-12 | Feinstein Steven B | Contrast agents for ultrasonic imaging |
| US4572203A (en) * | 1983-01-27 | 1986-02-25 | Feinstein Steven B | Contact agents for ultrasonic imaging |
| IE61591B1 (en) * | 1987-12-29 | 1994-11-16 | Molecular Biosystems Inc | Concentrated stabilized microbubble-type ultrasonic imaging agent and method of production |
| US4957656A (en) * | 1988-09-14 | 1990-09-18 | Molecular Biosystems, Inc. | Continuous sonication method for preparing protein encapsulated microbubbles |
| AU636481B2 (en) * | 1990-05-18 | 1993-04-29 | Bracco International B.V. | Polymeric gas or air filled microballoons usable as suspensions in liquid carriers for ultrasonic echography |
| ATE123953T1 (de) * | 1990-10-05 | 1995-07-15 | Bracco Int Bv | Verfahren zur herstellung von stabilen suspensionen von hohlen mit gasgefüllten mikrosphären zur verwendung in ultraschallechographie. |
| GB9107628D0 (en) * | 1991-04-10 | 1991-05-29 | Moonbrook Limited | Preparation of diagnostic agents |
| US5409688A (en) * | 1991-09-17 | 1995-04-25 | Sonus Pharmaceuticals, Inc. | Gaseous ultrasound contrast media |
| AU679428C (en) * | 1991-09-17 | 2006-07-13 | Ge Healthcare As | Gaseous ultrasound contrast media and method for selecting gases for use as ultrasound contrast media |
| IL104084A (en) * | 1992-01-24 | 1996-09-12 | Bracco Int Bv | Sustainable aqueous suspensions of pressure-resistant and gas-filled blisters, their preparation, and contrast agents containing them |
-
1994
- 1994-07-01 JP JP7503679A patent/JP2905598B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1994-07-01 PL PL94312387A patent/PL312387A1/xx unknown
- 1994-07-01 CA CA002166459A patent/CA2166459C/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-07-01 WO PCT/US1994/007533 patent/WO1995001187A1/en not_active Application Discontinuation
- 1994-07-01 NZ NZ268826A patent/NZ268826A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-07-01 HU HU9503977A patent/HUT74827A/hu unknown
- 1994-07-01 AU AU72184/94A patent/AU683485B2/en not_active Ceased
- 1994-07-01 KR KR1019960700002A patent/KR100218642B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1994-07-01 BR BR9406993A patent/BR9406993A/pt not_active Application Discontinuation
- 1994-07-01 CN CN94193227A patent/CN1129910A/zh active Pending
- 1994-07-01 CZ CZ953508A patent/CZ350895A3/cs unknown
- 1994-07-01 IL IL11018594A patent/IL110185A/xx not_active IP Right Cessation
- 1994-07-04 DE DE69432370T patent/DE69432370T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-07-04 ES ES98116817T patent/ES2195247T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-07-04 EP EP94304902A patent/EP0633030B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-07-04 EP EP98116817A patent/EP0885615B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-07-04 DE DE69418101T patent/DE69418101T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-07-04 AT AT94304902T patent/ATE179334T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-07-04 ES ES94304902T patent/ES2134321T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-08-01 TW TW083107084A patent/TW283646B/zh active
- 1994-08-12 US US08/290,022 patent/US5552133A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-12-29 NO NO955351A patent/NO955351L/no unknown
- 1995-12-29 FI FI956312A patent/FI956312A/fi not_active Application Discontinuation
-
1998
- 1998-09-11 JP JP25901998A patent/JP3285544B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-11-20 JP JP2001355407A patent/JP3809368B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HUT74827A (en) | Protein encapsulated insoluble gas microspheres and their preparation and use as ultrasonic imaging agents | |
| US5855865A (en) | Method for making encapsulated gas microspheres from heat denatured protein in the absence of oxygen gas | |
| US4957656A (en) | Continuous sonication method for preparing protein encapsulated microbubbles | |
| Suslick et al. | Characterization of sonochemically prepared proteinaceous microspheres | |
| EP0504340B1 (en) | Method for the preparation of stable suspensions of hollow gas-filled microspheres suitable for ultrasonic echography | |
| US4844882A (en) | Concentrated stabilized microbubble-type ultrasonic imaging agent | |
| EP0324938A1 (en) | Concentrated stabilized microbubble-type ultrasonic imaging agent and method of production | |
| JPH09509612A (ja) | 画像診断用造影剤として有用な気体含有微小カプセル | |
| AU722742B2 (en) | Methods for making encapsulated microspheres from heat denatured protein using mechanical cavitation | |
| NZ515147A (en) | Multi-stage method for producing gas-filled microcapsules |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFD9 | Temporary protection cancelled due to non-payment of fee |